KR101681574B1 - 인자 ⅷ 중합체 접합체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인자 Ⅷ의 당질 부분을 통해 수용성 중합체에 접합되어 있는 인자 Ⅷ 분자를 포함하는 단백질성 구조물, 및 상기 단백질성 구조물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리시알산 (PSA) 및 덱스트란으로 구성된 군으로부터 선택된다.

Description

인자 Ⅷ 중합체 접합체 {FACTOR Ⅷ POLYMER CONJUGATES}
본 출원은, 각각 2006년 6월 6일 및 2006년 3월 31일 출원된 미국 가출원 번호 제60/790,239호 및 제60/787,968호에 대한 우선권을 주장하는 것인, 2007년 3월 29일 출원된 미국 출원 번호 제11/729,625호의 일부 계속 출원이다.
본 발명은 폴리(알킬렌 옥시드), 예로서, 폴리에틸렌 글리콜을 비롯한 하나 이상의 수용성 중합체에 결합되어 있는 응고 인자 Ⅷ (FⅧ)을 포함하는 단백질성 구조물에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 FⅧ의 기능적 결손 또는 결핍과 관련된 출혈성 질병을 앓는 포유동물의 혈액에서 FⅧ의 생체내 반감기를 연장시키는 방법에 관한 것이다.
응고 인자 Ⅷ (FⅧ)은 매우 낮은 농도로 혈장 중에서 순환하며, 폰 빌레브란트 인자 (VWF)에 비공유적으로 결합한다. 지혈시, FⅧ는 VWF로부터 분리되어 칼슘 및 인지질 또는 세포막의 존재하에서 활성화 속도를 증진시킴으로써 활성화된 인자 Ⅸ (FⅨa)-매개 인자 Ⅹ (FⅩ) 활성화를 위한 보조인자로서의 역할을 한다.
FⅧ은 도메인 구조식이 A1-A2-B-A3-C1-C2이고, 대략 270-330 kD인 단일-쇄 전구체로서 합성된다. 혈장으로부터 정제되었을 때 (예로서, "혈장-유래의" 또는 "혈장의"), FⅧ은 중쇄 (A1-A2-B) 및 경쇄 (A3-C1-C2)로 구성되어 있다. 경쇄의 분자량은 80 kD인 반면, 중쇄의 경우에는 B 도메인 내의 단백질 분해로 인해 90-220 kD 범위이다.
FⅧ은 또한 출혈성 질병에서 치료학적 용도로 사용될 수 있는 재조합 단백질로서 합성된다. 치료학적 의약으로서의 재조합 FⅧ (rFⅧ)의 잠재적인 효능을 측정하기 위한 각종의 시험관내 분석법이 고안되었다. 이러한 분석법은 내인성 FⅧ의 생체내 효과를 모사한다. 시험관내 분석법에 의해 측정한바, 시험관내에서 FⅧ을 트롬빈으로 처리하면 그의 전구응고제 활성은 신속하게 증가한 후, 이어서 감소한다. 이러한 활성화 및 불활성화는 중쇄 및 경쇄, 둘 모두에서 일어나는 특이적인 제한적 단백질 분해와 부합되는데, 이는 FⅧ 중 여러 결합 에피토프의 이용가능성을 변경시키며, 예를 들면, FⅧ를 VWF로부터 해리시켜 인지질 표면에 결합할 수 있게 하거나, 또는 특정 모노클로날 항체에 결합할 수 있는 결합 능력을 변경시킬 수 있다.
FⅧ의 결여 또는 기능장애는 가장 빈번하게 발생하는 출혈성 질병인 A형 혈우병과 관련이 있다. A형 혈우병의 관리를 위한 최선의 치료법은 혈장 유래의 또는 rFⅧ 농축물을 사용한 대체 요법이다. FⅧ 수준이 1% 미만인 중증의 A형 혈우병을 앓는 환자는 일반적으로 투약과 투약 사이에 FⅧ가 1%보다 높게 유지될 수 있도록 하기 위해 예방학적 요법을 받는다. 각종 FⅧ 제품의 순환 중 평균 반감기를 고려할 때, 상기 예방학적 요법은 일반적으로 1주당 2 내지 3회에 걸쳐 FⅧ을 제공받음으로써 달성될 수 있다.
A형 혈우병 치료용으로서 시판중인 농축물에는 다수가 존재한다. 이들 농축물 중 하나는 재조합 제품인 애드베이트(Advate)®인데, 이는 CHO-세포에서 생산된 것이며, 박스터 헬쓰케어 코포레이션(Baxter Healthcare Corporation)에 의해 제조된 것이다. 인간 또는 동물의 어떤 혈장 단백질 또는 알부민도 상기 제품의 세포 배양 과정, 정제, 또는 최종 제조에서 첨가되지 않는다.
FⅧ 농축물 및 치료학적 폴리펩티드 약물을 제조하는 수많은 제조업체의 목표는, 모든 기타 다른 제품의 특징들은 유지하면서 약력학적 특성 및 약동학적 특성이 증진된 차세대 제품을 개발하는 것이다.
치료학적 폴리펩티드 약물은 단백질 분해 효소에 의해 신속하게 분해되고, 항체에 의해 중화된다. 이는 상기 약물의 반감기와 순환 시간을 감소시킴으로써 그의 치료학적 효능을 제한한다. 가용성 중합체 또는 당질을 폴리펩티드에 첨가하였을 때, 이는 폴리펩티드의 분해를 방해하고 폴리펩티드의 반감기를 증가시키는 것으로 나타났다. 예를 들면, 폴리펩티드 약물의 PEG화는 폴리펩티드를 보호하고, 그의 약력학적 프로파일 및 약동학적 프로파일을 개선시킨다 (문헌 [Harris J M et Chess R B, Nat Rev Drug Discov 2003;2:214-21]). PEG화 과정은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 반복 유니트를 폴리펩티드 약물에 부착시킨다. 분자의 PEG화를 통해 효소 분해에 대한 약물의 내성은 증가될 수 있고, 생체내 반감기는 증가될 수 있으며, 투약 빈도는 감소될 수 있고, 면역원성은 감소될 수 있으며, 물리적 및 열적 안정성은 증가될 수 있고, 가용성은 증가될 수 있으며, 액체 안정성은 증가될 수 있고, 응집은 감소될 수 있다.
따라서, 예를 들면, PEG화를 통한 가용성 중합체의 첨가가 FⅧ 제품의 특성을 개선시킬 수 있는 한가지 접근법이다. 본 분야의 상태는 상이한 특허 및 특허 출원에 의해 보고되어 있다:
미국 특허 번호 제6,037,452호에는 단백질이 FⅧ의 카르보닐기를 통해 폴리(알킬렌 옥시드)에 공유결합되어 있는, 폴리(알킬렌 옥시드)-FⅧ 또는 FⅨ 접합체가 기술되어 있다.
EP1258497B1에는 FⅧ 및 생체적합성 중합체의 접합체를 제조하는 방법이 기술되어 있다. 상기 특허는 문헌 [Roestin et al. (Bioconj Chem 2000;11:387-96)]의 공개에 의해 보충되었다. 접합체는 모노메톡시 폴리에틸렌 글리콜로 변형된, B-도메인 결실 재조합 FⅧ을 포함한다. 접합체는 FⅧ 작용을 감소시켰고, 변형 정도에 따라 응고제 활성도 신속하게 감소하였다.
WO04075923A3에는, 각 접합체가 FⅧ 분자에 공유적으로 부착된 1 내지 3개의 수용성 중합체를 포함하는, 복수 개의 접합체를 포함하는 중합체-FⅧ 분자 접합체가 기술되어 있다. FⅧ 분자는 B-도메인이 결실된 것이다.
미국 특허 번호 제4,970,300호에는 FⅧ 활성을 갖는 단백질을 포함하는 불용해성 접합체가 비항원성 리간드에 공유적으로 연결되어 있는 변형된 FⅧ이 기술되어 있다.
미국 특허 번호 제6,048,720호에는 폴리펩티드 및 생체적합성 중합체의 접합체가 기술되어 있다.
WO94/15625에는 5,000 달톤 이하의 바람직한 분자량을 가진 폴리에틸렌 글리콜에 결합된 FⅧ이 기술되어 있다.
기능적 활성은 보유하면서 비PEG화된 FⅧ와 비교하였을 때 생체내 반감기가 연장되어 있는 것으로서, FⅧ의 생체내 반감기를 연장시키기 위해 가용성 중합체가 부착되어 있는 FⅧ, 예를 들면, PEG화된 FⅧ, 예로서, 10,000 달톤 초과의 PEG가 그에 접합되어 있는 것인 전장의 FⅧ가 여전히 요구되고 있다.
본 발명의 요약
본 발명은 인자 Ⅷ의 당질 부분(carbohydrate moiety)을 통해 수용성 중합체에 접합되어 있는 인자 Ⅷ 분자를 포함하는 단백질성 구조물, 및 상기 단백질성 구조물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 접합을 허용하는 조건하에서, 산화된 당질 부분을 활성화된 수용성 중합체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 수용성 중합체를 FⅧ의 산화된 당질 부분에 접합시키는 방법을 제공한다. 관련된 측면에서, 수용성 중합체는 PEG, PSA 및 덱스트란으로 구성된 군으로부터 선택된다. 추가의 또 다른 측면에서, 활성화된 수용성 중합체는 PEG-히드라지드, PSA-히드라진 및 알데히드-활성화된 덱스트란으로 구성된 군으로부터 선택된다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 당질 부분은 NaIO4를 포함하는 완충액 중에서 인큐베이션시킴으로써 산화된다. 본 발명의 추가의 또 다른 측면에서, FⅧ의 산화된 당질 부분은 FⅧ의 B 도메인에 위치한다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 상기 언급한 방법들 중 어느 것에 따른 방법에 의해 제조된 변형된 FⅧ을 제공한다. 추가의 또 다른 실시태양에서, (a) 인자 Ⅷ 분자; 및 (b) 상기 인자 Ⅷ 분자에 결합되어 있는 적어도 하나의 수용성 중합체를 포함하며, 여기서, 수용성 중합체는 인자 Ⅷ의 B 도메인에 위치하는 하나 이상의 당질 부분을 통해 인자 Ⅷ에 부착되어 있는 단백질성 구조물을 제공한다. 본 발명의 관련된 측면에서, 수용성 중합체는 PEG, PSA 및 덱스트란으로 구성된 군으로부터 선택된다.
도 1은 SDS-PAGE 이후, 이어서 면역블로팅을 수행하여 측정한바, PEG와의 접합 후에 rFⅧ의 폭 및 질량이 증가되었다는 것을 나타낸다.
도 2는 혈우병을 앓는 마우스에서 PEG-rFⅧ 접합체의 약동학적 성질을 접합되지 않은 FⅧ과 비교하여 나타낸다. 흰색 사각형 모양 표시(Open square): PEG-rFⅧ, 투여량 200 IU FⅧ/kg. 검은색 다이아몬드 모양 표시(Closed diamond): 천연 rFⅧ, 투여량 200 IU FⅧ/kg.
도 3은 각종의 항-FⅧ 항체를 사용하여 SDS-PAGE를 수행함으로써 PEG화 부위를 상세하게 분석한 것을 보여준다.
도 4는 트롬빈에 의해 유도되는, 천연 및 PEG화된 rFⅧ의 활성화 및 불활성화를 보여준다.
도 5는 천연 및 PEG화된 rFⅧ의 도메인을 나타낸 밴드를 보여준다.
도 6은 천연 및 PEG화된 rFⅧ의 다양한 도메인의 PEG화 정도를 보여준다.
도 7은 천연 및 PEG화된 rFⅧ의 트롬빈 불활성화 속도를 보여준다.
본 발명은 온전한 B 도메인의 적어도 일부가, 폴리알킬렌 옥시드, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리비닐 알코올, 폴리옥사졸린, 폴리 아크릴로일모르폴린 또는 당질, 예로서, 폴리시알산 (PSA) 또는 덱스트란을 포함하는 수용성 중합체에 결합되어 있는 FⅧ 분자를 포함하는 단백질성 구조물이다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 수용성 중합체는 분자량이 10,000 달톤 초과인 폴리에틸렌 글리콜 분자이다. 또 다른 실시태양에서, 수용성 중합체의 분자량은 10,000 Da 초과 내지 약 125,000 Da, 약 15,000 Da 내지 20,000 Da, 또는 약 18,000 Da 내지 약 25,000 Da이다. 하나의 실시태양에서, 이 구조물은 표준 치료학적 FⅧ 제품의 전체 기능적 활성을 보유하며, 표준 치료학적 FⅧ 제품과 비교할 때 연장된 생체내 반감기를 제공한다. 또 다른 실시태양에서, 이 구조물은 천연 인자 Ⅷ과 비교하여 적어도 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 또는 150퍼센트(%)의 생물학적 활성을 보유한다. 관련된 측면에서, 구조물 및 천연 인자 Ⅷ의 생물학적 활성은 FⅧ 항원값에 대한 발색 활성의 비 (FⅧ:Chr:FⅧ:Ag)에 의해 측정된다. 본 발명의 추가의 또 다른 실시태양에서, 구조물의 반감기는 천연 인자 Ⅷ의 생체내 반감기와 비교하여 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10배 감소 또는 증가하게 된다.
본 발명의 출발 물질은 FⅧ인데, 이는 인간 혈장으로부터 유래될 수 있거나, 특허 문헌인 미국 특허 번호 제4,757,006호; 미국 특허 번호 제5,733,873호; 미국 특허 번호 제5,198,349호; 미국 특허 번호 제5,250,421호; 미국 특허 번호 제5,919,766호; EP 306 968에 기재되어 있는 바와 같이, 재조합 공학처리 기법에 의해 생산될 수 있다.
본원에서, "인자 Ⅷ" 또는 "FⅧ"이라는 용어는 온전한 B 도메인의 적어도 일부를 가지며, 천연 FⅧ과 관련된 생물학적 활성을 나타내는, 임의의 FⅧ 분자를 지칭하는 것이다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, FⅧ 분자는 전장의 인자 Ⅷ이다. FⅧ 분자는 인자 Ⅷ:C를 코딩하는 DNA에 혼성화될 수 있는 DNA 서열에 의해 코딩되는 단백질이다. 그러한 단백질은 도메인 A1-A2-B-A3-C1-C2 사이에 또는 그 내부의 다양한 부위에 아미노산 결실을 함유할 수 있다 (미국 특허 번호 제4,868,112호). FⅧ 분자는 또한 하나 이상의 아미노산 잔기가 부위-지정 돌연변이유발법에 의해 대체된, 천연 FⅧ의 유사체일 수도 있다.
본 발명에 유용한 FⅧ 분자로는 본원 하기에서 기술하는 바와 같이, 전장의 단백질, 상기 단백질의 전구체, 생물학적으로 활성을 띠거나 또는 기능적인 상기 단백질의 서브유니트 또는 단편, 및 그의 기능적 유도체 뿐만 아니라, 그의 변이체를 포함한다. FⅧ의 언급은 상기 단백질의 잠재적인 형태들 모두를 포함하는 것이며, 각각의 FⅧ 형태는 온전한 천연 B 도메인 서열의 적어도 일부를 또는 그 전부를 포함한다.
본 발명에 따라, "재조합 인자 Ⅷ" (rFⅧ)이라는 용어는 재조합 DNA 기술을 통해 수득된, 이종성 또는 천연적으로 발생된 임의의 rFⅧ, 또는 그의 생물학적으로 활성을 띠는 유도체를 포함할 수 있다. 특정 실시태양에서, 상기 용어는 상기 기술된 단백질 및 본 발명의 rFⅧ을 코딩하는 핵산을 포함한다. 그러한 핵산으로는 예를 들면, 제한 없이, 유전자, 프리-mRNA, mRNA, 다형성 변이체, 대립유전자, 합성 및 천연적으로 발생된 돌연변이체를 포함한다. rFⅧ이라는 용어에 의해 포함되는 단백질로는 예를 들면, 제한 없이, 본원 상기에 기술되어 있는 단백질 및 폴리펩티드, 상기에 기술되어 있는 핵산에 의해 코딩되는 단백질, 종간 상동체, 및 (1) 적어도 약 25개, 약 50개, 약 100개, 약 200개, 약 300개, 약 400개 이상의 아미노산으로 구성된 영역에 걸쳐 (성숙한 천연 단백질의 경우, 406개의 아미노산으로 이루어진 전장의 서열까지) 기준이 되는 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 본원에 기술된 바와 같은 아미노산 서열에 대해 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 이상보다 큰 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖고/거나; (2) 본원에 기술된 바와 같은 기준이 되는 아미노산 서열을 포함하는 면역원, 그의 면역원성 단편, 및/또는 보존적으로 변형된 그의 변이체에 대해 생성된 항체, 예로서, 폴리클로날 또는 모노클로날 항체에 특이적으로 결합하는 것인 기타 다른 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명의 rFⅧ을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 제한 없이 (1) 엄격한 혼성화 조건하에서 본원에 기술된 바와 같은 기준이 되는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산, 및 보존적으로 변형된 그의 변이체에 특이적으로 혼성화되고; (2) 적어도 약 25개, 약 50개, 약 100개, 약 150개, 약 200개, 약 250개, 약 500개, 약 1000개 이상의 뉴클레오티드로 구성된 영역에 걸쳐 (성숙한 단백질의 경우, 1218개의 뉴클레오티드로 이루어진 전장의 서열까지) 본원에 기술된 바와 같은 기준이 되는 핵산 서열에 대해 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 이상보다 큰 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본원에서 사용된 "내인성 FⅧ"은 치료를 받고자 하는 포유동물로부터 기원하는 FⅧ을 포함한다. 상기 용어는 또한 트랜스진 또는 상기 포유동물에 존재하는 임의의 기타 다른 외래 DNA로부터 전사된 FⅧ를 포함한다. 본원에서 사용된 "외인성 FⅧ"은 상기 포유동물로부터 기원된 것이 아닌 FⅧ을 포함한다.
변이체 (또는 유사체) 폴리펩티드는, 하나 이상의 아미노산 잔기가 본 발명의 FⅧ 아미노산 서열에 첨가되어 있는 것인 삽입 변이체를 포함한다. 삽입은 단백질의 한쪽 말단 또는 양쪽 말단 모두에 위치할 수 있고/있거나, FⅧ 아미노산 서열의 내부 영역 내에 위치할 수 있다. 한쪽 말단 또는 양쪽 말단 모두에 추가 잔기를 포함하는 삽입 변이체의 예로는 융합 단백질, 및 아미노산 태그 또는 기타 다른 아미노산 표지를 포함하는 단백질을 포함한다. 하나의 측면에서, 특히, FⅧ 분자가 세균 세포, 예로서, E. 콜라이(E. coli)에서 재조합적으로 발현될 때 상기 분자는 임의로 N-말단 Met를 함유할 수 있다.
결실 변이체에서는 본원에 기술된 FⅧ 폴리펩티드 중 하나 이상의 아미노산 잔기가 제거된다. 결실은 FⅧ 폴리펩티드의 한쪽 말단 또는 양쪽 말단 모두에서 수행될 수 있고/있거나, FⅧ 아미노산 서열 내의 하나 이상의 잔기를 제거함으로써 이루어질 수 있다. 따라서, 결실 변이체는 FⅧ 폴리펩티드 서열의 모든 단편을 포함한다.
치환 변이체에서는 FⅧ 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산 잔기가 제거되고, 대체 잔기로 치환된다. 하나의 측면에서, 치환은 사실상 보존적이며, 이러한 유형의 보존적 치환은 당업계에 주지되어 있다. 별법으로, 본 발명은 또한 비보존적인 치환도 포함한다. 예시적인 보존적 치환은 문헌 [Lehninger, [Biochemistry, 2nd Edition; Worth Publishers, Inc., New York (1975), pp.71-77]에 기재되어 있고, 바로 하기에 기술되어 있다.
보존적 치환
측쇄 특징 아미노산
비극성(소수성):
A. 지방족 A L I V P
B. 방향족 F W
C. 황-함유 M
D. 경계선 G
비하전된-극성:
A. 하이드록실 S T Y
B. 아미드 N Q
C. 설프하이드릴 C
D. 경계선 G
양으로 하전된 것(염기성) K R H
음으로 하전된 것(산성) D E
별법으로, 예시적인 보존적 치환은 바로 하기에 기술되어 있다.
Figure 112011014373611-pct00001
"천연적으로 발생된" 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열은 전형적으로 영장류, 예로서, 인간; 설치류, 예로서, 래트, 마우스, 햄스터; 소, 돼지, 말, 양 또는 임의의 포유동물을 포함하나 이에 한정되지 않는 포유동물로부터 유래된 것이다. 본 발명의 핵산 및 단백질은 재조합 분자 (예로서, 이종성이며, 야생형 서열 또는 그의 변이체를 코딩하는 것, 또는 비천연적으로 발생된 것)일 수 있다. 기준 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열은 예로서, UniProtKB/Swiss-Prot P00451 (FA8_HUMAN) (문헌 ([Gitschier J et al., Characterization of the human Factor Ⅷ gene, Nature, 312(5992): 326-30 (1984)]; [Vehar GH et al., Structure of human Factor Ⅷ, Nature, 312(5992):337-42 (1984)]; 및 [Thompson AR. Structure and Function of the Factor Ⅷ gene and protein, Semin Thromb Hemost, 2003:29;11-29 (2002)]) (상기 문헌의 전체가 본원에 참조로 포함됨))을 포함한다.
본원에서 사용된 "생물학적으로 활성을 띠는 유도체" 또는 "생물학적으로 활성을 띠는 변이체"는 결합 특성과 같은, 해당 분자의 기능적 및/또는 생물학적 특성, 및/또는 펩티드 골격 또는 기본 중합체 유니트와 같은 구조적 기반이 실질적으로 동일한, 분자의 임의의 유도체 또는 변이체를 포함한다.
본원에서 사용된 "혈장 유래의 FⅧ" 또는 "혈장의"는 응고 경로를 활성화시키는 특성을 가진, 포유동물로부터 수득되는 혈액 중에서 발견되는 모든 형태의 단백질을 포함한다.
다양한 측면에서, rFⅧ을 제조하는 것은 (i) 유전공학 처리에 의해 재조합 DNA를 제조하는 것, (ii) 예를 들면, 제한 없이, 형질감염, 전기천공 또는 미세주사에 의해 재조합 DNA를 원핵생물 또는 진핵생물 세포에 도입하는 것, (iii) 상기 전사된 세포를 배양하는 것, (iv) 예를 들면, 구성적으로 또는 유도시에 rFⅧ을 발현시키는 것, 및 (v) 정제된 rFⅧ을 수득하기 위해 예를 들면, 배양 배지로부터 또는 전사된 세포를 수거함으로써 상기 rFⅧ을 단리시키는 것, (vi) 정제된 rFⅧ를 수득하는 것을 위한 당업계에 공지된 임의의 방법을 포함한다.
다른 측면에서, rFⅧ은 약물학적으로 허용가능한 rFⅧ 분자를 생산하는 것을 특징으로 하는 적합한 원핵생물 또는 진핵생물 숙주계에서의 발현에 의해 제조된다. 진핵생물 세포의 예로는 포유동물 세포, 예로서, CHO, COS, HEK 293, BHK, SK-Hep, 및 HepG2가 있다.
추가의 다른 측면에서, 매우 다양한 벡터가 rFⅧ 제조에 사용되며, 원핵생물 또는 진핵생물 발현 벡터로부터 선택된다. 원핵생물 발현을 위한 벡터의 예로는 플라스미드를 포함하고, 그 예로는 제한 없이, pRSET, pET, 및 pBAD를 포함하는데, 여기서, 원핵생물 발현 벡터에 사용되는 프로모터는 제한 없이, lac, trc, trp, recA, 또는 araBAD 중 하나 이상을 포함한다. 진핵생물 발현을 위한 벡터의 예로는 (i) 효모에서의 발현을 위하여, 예로서, 제한 없이, AOⅩ1, GAP, GAL1 또는 AUG1 등과 같은 프로모터를 사용하는, 예로서, 제한 없이, pAO, pPIC, pYES 또는 pMET와 같은 벡터; (ii) 곤충 세포에서의 발현을 위하여, 예로서, 제한 없이, PH, p10, MT, Ac5, OpIE2, gp64, 또는 polh와 같은 프로모터를 사용하는, 예로서, 제한 없이, pMT, pAc5, pIB, pMIB, pBAC와 같은 벡터; 및 (iii) 포유동물 세포에서의 발현을 위하여, 예로서, 제한 없이, CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV 및 β-액틴과 같은 프로모터를 사용하는, 예로서, 제한 없이, pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3 또는 pBPV와 같은 벡터, 및 하나의 측면에서, 예로서, 제한 없이, 백시니아 바이러스, 아데노-결합 바이러스, 헤르페스 바이러스 또는 레트로바이러스와 같은 바이러스 시스템으로부터 유래된 벡터를 포함한다.
특정 측면에서, FⅧ 분자는 다양한 화학적 방법들 중 임의의 방법에 의해 수용성 중합체에 접합된다 (문헌 [Roberts JM et al., Advan Drug Delivery Rev 2002;54:459-76]). 예를 들면, 하나의 실시태양에서, N-하이드록시숙신이미드 (NHS) 에스테르를 사용하여 단백질의 유리 아미노기에 PEG를 접합시킴으로써 FⅧ은 PEG화된다. 또 다른 실시태양에서, 수용성 중합체, 예를 들면, PEG를 말레이미드 화학 물질을 사용하여 유리 SH기에 커플링시키거나, 사전 산화 이후에 PEG 히드라지드 또는 PEG 아민을 FⅧ의 당질 부분에 커플링시킨다.
다른 실시태양에서, FⅧ는 기타 다른 수용성 중합체에 접합될 수 있는데, 여기서, 수용성 중합체는 예를 들면, 폴리알킬렌 옥시드, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리비닐 알코올, 폴리옥사졸린, 폴리 아크릴로일모르폴린, 당질 또는 다당류, 예로서, 폴리시알산 (PSA) 또는 덱스트란이다. 수용성 중합체를 커플링시키는 것은 단백질에 직접 커플링시키는 것에 의해 또는 링커 분자를 통해 수행될 수 있다. 화학적 링커의 일례로는 당질-선택성 히드라지드기 및 설프하이드릴-반응성 말레이미드기를 함유하는 MBPH (4-[4-N-말레이미도페닐]부티르산 히드라지드)가 있다 (문헌 [Chamow et al., J Biol Chem 1992;267:15916-22]).
안정한 결합 형성하에 수용성 중합체를 인자 Ⅷ에 직접 커플링시킴으로써 (또는 링커 시스템을 통해 커플링시킴으로써) 접합을 수행할 수 있다. 추가로, 본 발명에서는, 분해될 수 있거나, 유리될 수 있거나, 또는 가수분해될 수 있는 링커 시스템이 사용될 수 있다 (문헌 ([Tsubery et al. J Biol Chem 2004;279:38118-24], [Greenwald et al., J Med Chem 1999;42:3657-67], [Zhao et al., Bioconj Chem 2006;17:341-51], WO2006/138572A2, US7259224B2, US7060259B2).
본원에서 논의된 바와 같이, 본 발명의 한 실시태양은 활성화된 가용성 중합체를 FⅧ의 산화된 당질 부분에 커플링시키는 것이다. 본원에서 사용된 "활성화된 수용성 중합체"라는 용어는, 수용성 중합체가 링커에 또는 직접적으로 FⅧ (활성 알데히드기를 함유함)에 화학적으로 접합될 수 있도록 하는 활성 작용기를 가진, FⅧ에 커플링하는데 사용되는 수용성 중합체를 지칭한다. 본원에서 사용된 "산화된 당질 부분"이라는 용어는, NaIO4와 같은 산화제에 의해 생성된 유리 알데히드기를 함유하는 FⅧ을 지칭한다. 본 발명의 하나의 측면에서, (활성 알데히드기를 함유하는) 알데히드-활성화된 덱스트란은 디히드라지드 링커를 통해 FⅧ의 알데히드기에 커플링된다.
FⅧ의 당화 패턴에 따라 (문헌 [Lenting et al; Blood, 92:3983-96(1998)]), 당질 부분을 통한 FⅧ의 접합은 FⅧ의 B 도메인에서 이루어질 가능성이 높다. B 도메인은 FⅧ의 활성에서 중요한 역할을 하지 않기 때문에, 상기와 같은 접합 반응을 위해 B 도메인을 표적화하는 것이 바람직하다. 효소적 당접합이 US 2008/00700275에 기술되어 있다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 활성 N-하이드록시숙신이미드 에스테르 (NHS), 예로서, 숙신이미딜 숙시네이트, 숙신이미딜 글루타레이트 또는 숙신이미딜 프로피오네이트를 함유하는 폴리에틸렌 글리콜 유도체를 사용함으로써 리신 잔기를 통해 FⅧ를 변형시켰다. 이러한 유도체는 안정한 아미드 결합을 형성함으로써 온화한 조건하에서 FⅧ의 리신 잔기와 반응을 한다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, PEG 유도체의 쇄 길이는 5,000 Da이다. 선형 및 분지형 구조를 포함하는, 500 Da 내지 2,000 Da, 2,000 Da 내지 5,000 Da, 5,000 Da 초과 10,000 Da 이하, 또는 10,000 Da 초과 20,000 Da 이하, 또는 20,000 Da 초과 150,000 Da 이하인 쇄 길이를 가진 기타 다른 PEG 유도체가 다양한 실시태양에서 사용된다.
아미노기를 PEG화시키는 대체 방법은 우레탄 결합을 형성함으로써 수행되는 PEG 당질과의 화학적 접합, 또는 제2 아미드 결합을 형성하는 환원성 아미노화에 의한 알데히드 또는 케톤과의 반응이다.
본 발명에서, FⅧ 분자는 상업적으로 이용가능한 PEG 유도체를 사용함으로써 화학적으로 변형된다. 이러한 PEG 유도체는 선형 또는 분지형 구조를 가질 수 있다. NHS기를 함유하는 PEG-유도체의 예를 하기에 열거한다.
하기의 PEG 유도체들은 넥타 쎄라퓨틱스(Nektar Therapeutics) (앨라배마주 헌츠빌 소재; www.nektar.com/PEG reagent catalog; Nektar Advanced PEGylation, price list 2005-2006 참조)로부터 상업적으로 이용가능한 것들의 일례이다:
mPEG-숙신이미딜 프로피오네이트 (mPEG-SPA)
Figure 112011014373611-pct00002
mPEG-숙신이미딜 α-메틸부타노에이트 (mPEG-SMB)
Figure 112011014373611-pct00003
mPEG-CM-HBA-NHS (CM=카르복시메틸; HBA=하이드록시 부티르산)
Figure 112011014373611-pct00004
분지형 PEG-유도체 (넥타 쎄라퓨틱스)의 구조식:
분지형 PEG N-하이드록시숙신이미드 (mPEG2-NHS)
Figure 112011014373611-pct00005
분지형 구조를 갖는 상기와 같은 반응물은 문헌 [Kozlowski et al. (BioDrugs 2001;5:419-29)]에 더욱 상세히 기술되어 있다.
PEG 유도체의 기타 다른 예는 NOF 코포레이션(NOF Corporation) (일본 도쿄 소재; www.nof.co.jp/english: Catalogue 2005 참조)으로부터 상업적으로 이용가능하다.
선형 PEG-유도체 (NOF 코포레이션)의 일반 구조식:
Figure 112011014373611-pct00006
Ⅹ=카르복시메틸
Figure 112011014373611-pct00007
Ⅹ=카르복시펜틸
Figure 112011014373611-pct00008
x=숙시네이트
Figure 112011014373611-pct00009
x=글루타레이트
Figure 112011014373611-pct00010
분지형 PEG-유도체 (NOF 코포레이션)의 구조식: 2,3-비스(메틸폴리옥시에틸렌-옥시)-1-(1,5-디옥소-5-숙신이미딜옥시, 펜틸옥시)프로판
Figure 112011014373611-pct00011
2,3-비스(메틸폴리옥시에틸렌-옥시)-1-(숙신이미딜 카르복시펜틸옥시)프로판
Figure 112011014373611-pct00012
이러한 프로판 유도체는 1,2 치환 패턴을 가진 글리세롤 골격을 나타낸다. 본 발명에서는 1,3 치환을 가진 글리세롤 구조에 기반한 분지형 PEG 유도체 또는 US2003/0143596A1에 기술되어 있는 기타 다른 분지형 구조체 또한 사용될 수 있다.
문헌 ([Tsubery et al. (J Biol Chem 2004;279:38118-24)] 및 WO04089280A3 (쉑터 등(Shechter et al.)))에 기술되어 있는 것과 같은, 분해될 수 있는 것 (예를 들면, 가수분해될 수 있는 링커)을 포함하는 PEG 유도체가 또한 본 발명에서도 사용될 수 있다.
놀랍게도, 본 발명의 PEG화된 FⅧ은 생체내에서 연장된 FⅧ 반감기와 함께 완전한 기능적 활성을 나타낸다. 또한, PEG화된 rFⅧ은 트롬빈 불활성화에 대하여 더욱 강한 내성을 띠는 것으로 보인다. 이는 다양한 시험관내 및 생체내 방법에 의해서 나타났고, 하기 실시예에서 예시적으로 설명된다.
본원에서 사용된 "시알산 부분"은 수성 용액 또는 수성 현탁액 중에서 가용성을 띠고, PSA-FⅧ-접합체가 약제학적 유효량으로 포유동물에게 투여되었을 때, 부작용과 같은 부정적 영향은 거의 없거나 전혀 없는, 시알산 단량체 또는 중합체 ("다당류")를 포함한다. 본 발명에 따라 사용되는 시알산 유니트에 특별한 제한은 없다. 하나의 측면에서, 중합체는 1 내지 4개의 유니트를 갖는 것을 특징으로 한다. 특정 측면에서 다른 시알산 유니트가 하나의 쇄로 조합된다.
본 발명의 다양한 측면에서, 예를 들면, 미국 특허 번호 제4,356,170호 (본원에서 참조로 포함됨)에 기술되어 있는 방법에 의해 시알산 부분이 FⅧ에 결합된다. 본 발명의 다양한 실시태양에서, 다당류 화합물은 천연적으로 발생된 다당류, 천연적으로 발생된 다당류의 유도체, 또는 천연적으로 발생된 다당류 유도체이다. 일반적으로 본 화합물 중 당류 잔기 모두 시알산 잔기이다.
PSA를 폴리펩티드에 커플링시키는 기타 다른 기법 또한 공지되어 있다. 예를 들면, 미국 공개 번호 제2007/0282096호에는 예로서, PSA의 아민 또는 히드라지드 유도체를 단백질에 접합시키는 것이 기술되어 있다. 또한, 미국 공개 번호 제2007/0191597호에는 환원 말단 종단에서 기질 (예로서, 단백질)과 반응시키기 위해 알데히드기를 함유하는 PSA 유도체가 기술되어 있다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 다당류 화합물의 폴리시알산 부분은 고도로 친수성이고, 또 다른 실시태양에서는, 전체 화합물이 고도로 친수성이다. 친수성은 시알산 유니트의 펜던트형(pendant) 카르복실기 뿐만 아니라, 하이드록실기에 의해서 주로 부여받은 것이다. 당류 유니트는 기타 다른 작용기, 예로서, 아민, 하이드록실기 또는 설페이트기, 또는 이들의 조합물을 함유할 수 있다. 이러한 기들은 천연적으로 발생된 당류 화합물 상에 존재할 수 있거나, 유도체 다당류 화합물 내로 도입될 수 있다.
하나의 측면에서, 본 발명에서 특정 용도의 다당류 화합물은 세균에 의해 생산된 것이다. 이들 천연적으로 발생된 다당류들 중 일부는 당지질로서 알려져 있다. 하나의 실시태양에서, 다당류 화합물에는 실질적으로 말단 갈락토스 유니트가 존재하지 않는다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 단백질성 구조물의 생체내 반감기는 연장된다. 관련된 실시태양에서, 수용성 중합체에 결합되어 있지 않은 FⅧ과 비교하였을 때, 단백질성 구조물의 생체내 반감기는 2배 이상 연장되며, 또 다른 실시태양에서는, 생체내 반감기가 3배 이상 연장된다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 단백질성 구조물은 주사에 의해, 예로서, 정맥내, 근육내, 복강내 주사에 의해 투여될 수 있다.
하나의 측면에서, 본 발명의 단백질성 구조물을 포함하는 조성물을 인간 또는 시험 동물에게 투여하기 위해서 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. "약제학적으로" 또는 "약물학적으로 허용가능한"이라는 용어는 안정적이며, 예로서, 응집 및 절단 생성물과 같은 단백질 분해를 저해하며, 추가로 하기 기술하는 바와 같이, 당업계에 주지되어 있는 경로를 통해 투여되었을 때, 알레르기 반응 또는 기타 다른 유해한 반응을 일으키지 않는, 분자 실체 및 조성물을 지칭한다. "약제학적으로 허용가능한 담체"로는, 상기 개시된 제제들을 비롯하여, 임의의 모든 임상적으로 유용한 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 및 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다.
본원에서 사용된 "유효량"은 상기 제시된 출혈성 질병을 앓는 포유동물을 치료하는 데 적합한 용량을 포함한다.
본 조성물은 경구적으로, 국소적으로, 경피적으로, 비경구적으로, 흡입 분무에 의해, 질내로, 직장으로, 또는 두개내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본원에서 사용된 비경구적이라는 것은 피하 주사, 정맥내, 근육내, 수조내 주사, 또는 주입 기법을 포함한다. 정맥내, 진피내, 근육내, 유방내, 복강내, 경막내, 안구뒤, 폐내 주사 및/또는 특정 부위의 외과적 이식에 의한 투여가 또한 고려된다. 일반적으로, 조성물에는 본질적으로 발열원 뿐만 아니라, 수혜자에게 유해할 수 있는 기타 다른 불순물은 포함되어 있지 않다.
치료의가 선택하는 투여량 수준 및 패턴을 사용하여 조성물을 단일 또는 다중 투여할 수 있다. 질병의 예방 또는 치료를 위해, 적절한 투여량은 상기 기술된 바와 같이, 치료하고자 하는 질환의 유형, 상기 질환의 중증도 및 진행 과정, 예방 또는 치료 목적으로 약물을 투여받고 있는지 여부, 이전 요법, 환자의 병력 및 약물에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 따라 달라질 것이다.
본 발명은 또한 상기 정의된 바와 같은 유효량의 단백질성 구조물을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 염, 완충액, 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 약제학적 조성물은 상기 정의된 출혈성 질병을 치료하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 용액 또는 동결건조된 제품일 수 있다. 약제학적 조성물의 용액을 임의의 적합한 동결건조 공정으로 처리할 수 있다.
추가의 측면으로서, 본 발명은 조성물을 피험체에게 투여하기 위해 사용될 때 그의 사용을 용이하게 하는 방식으로 패킹된, 본 발명의 조성물을 포함하는 것인 키트를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기와 같은 키트는, 본 발명을 실시하는 데 있어서 화합물 또는 조성물의 용도가 기술되어 있는 라벨이 용기에 부착되어 있거나, 패키지 내에 포함되어 있는 것인, 예로서, 실링된 병 또는 베쓸과 같은 용기 내에 패킹된 본원에 기술된 화합물 또는 조성물 (예로서, 단백질성 구조물을 포함하는 조성물)을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 키트는 단백질성 구조물을 포함하는 조성물을 갖는 제1 용기, 및 제1 용기 중의 조성물을 위한 생리학적으로 허용가능한 재구성 용액을 갖는 제2 용기를 포함한다. 하나의 측면에서, 화합물 또는 조성물은 단위 투여 형태로 패킹될 수 있다. 키트는 특정 투여 경로에 따라 조성물을 투여하는 데 적합한 장치를 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 키트는 치료학적 단백질 또는 펩티드 조성물의 용도가 기술되어 있는 라벨을 함유한다.
실시예
실시예 1
mPEG 숙신이미딜 숙시네이트를 사용한 rFⅧ 중의 리신 잔기의 PEG화
0.5% 수크로스 및 0.1% 폴리소르베이트 80을 함유하는 20 mM Hepes 완충액, 150 mM NaCl (pH 7.4)을 사용하여 이코노-팩(Econo-Pac) 10DG 칼럼 (바이오-래드(Bio-Rad))을 이용함으로써 애드베이트 제조 공정으로부터 유래된 rFⅧ 벌크 용액 (3,400 U/ml)을 겔 여과법으로 처리하였다. 이어서, 완만하게 교반시키면서 상기 용액에 쇄 길이가 5,000 Da인 mPEG 숙신이미딜 숙시네이트 (PEG-SS 5000) (문헌 [Abuchowski et al. Cancer Biochim Biophys 1984;7:175-86])를 첨가하고 (단백질 1 mg당 5 mg의 PEG-SS), 0.5 M NaOH를 적가하여 pH 값이 7.4가 되도록 조정하였다. 이어서, 완만하게 교반시키면서 실온에서 1시간 동안 PEG화시켰다.
이어서, 0.5% 수크로스 및 0.1% 폴리소르베이트 80을 함유하는 20 mM Hepes 완충액, 150 mM NaCl (pH 7.4) 중 평형화된 이온-교환 크로마토그래피 수지 (프락토겔(Fractogel) EMD TMAE 650M/파마시아(Pharmacia) ⅩK-10 칼럼, 상 높이: 15.0 cm) 상에 반응 혼합물을 적용시켰다. 이어서, 칼럼을 20 CV 평형 완충액으로 세척하여 과량의 반응물을 제거하고, PEG화된 rFⅧ을 용리 완충액 (20 mM Hepes, 1.0 M NaCl, 0.5% 수크로스, 0.1% 폴리소르베이트 80 (pH 7.4))으로 용리시켰다. 재생 셀룰로스로 구성되고 분자량 컷-오프가 30 kD인 막을 사용하고, 20 mM Hepes, 150 mM NaCl, 0.5% 수크로스 (pH 7.4)로 구성된 완충액 시스템을 이용하여 한외여과/정용여과를 수행함으로써 용리액을 농축시켰다.
실시예 2
시험관내에서의 PEG화된 rFⅧ의 생화학적 특징 규명
애드베이트 제조 공정으로부터 유래된 rFⅧ을 실시예 1에 따라 PEG화시키고, PEG화된 FⅧ 생성물의 생화학적 특징을 규명하였다. FⅧ 발색 분석법 (문헌 [Rosen S, Scand J Haematol 1984;33 (Suppl 40):139-45])을 사용하여 PEG-rFⅧ의 기능적 활성을 측정하였다. 상기 방법은 문헌 [Ph. Eur. 5th edition (5.05) 2.7.4 Assay of Blood Coagulation Factor Ⅷ]을 기초로 한다.
인자 Ⅷ을 함유하는 샘플 (FⅧ:C)을, 칼슘을 함유하는 완충액 중 트롬빈, 활성화된 인자 Ⅸ (FⅨa), 인지질 및 인자 Ⅹ (FⅩ)와 혼합한다. FⅧ은 트롬빈에 의해 활성화된 후, 이어서, 인지질, FⅨa 및 칼슘 이온과 복합체를 형성한다. 상기 복합체는 인자 Ⅹ를 인자 Ⅹa로 활성화시키고, 이는 다시 발색 기질인 FⅩa-1 (AcOH*CH3OCO-D-CHA-Gly-Arg-pNA)을 절단시킨다. 시간 경과에 따른 유리된 파라-니트로아닐린 (pNA)을 405 nm에서 마이크로플레이트를 사용하여 측정하였다. 반응 경사는 샘플 중 인자 Ⅷ 농도에 비례하였다. 상업적으로 이용가능한 ELISA 시스템 (캐나다 온타리오 혼비 소재의 씨더레인(Cedarlane))을 조금 변형시켜 그를 이용함으로써 FⅧ 항원값을 측정하였다. 상기 값으로부터 FⅧ 발색원/FⅧ 항원의 비를 산출하였다. 280 nm에서의 광학 밀도를 측정함으로써 상기 시료 중 단백질의 함량을 측정하였다. 상기 데이타로부터 단백질 함량을 산출하고 (문헌 [Hoyer LW in: Human Protein Data. Installments 1-6; Heberli Ed.; Wiley V C H, Weinheim, Germany, 1998]), (mg/ml)로 표시하였다.
Figure 112011014373611-pct00013
표 1의 데이타로 알 수 있는 바와 같이, PEG화된 rFⅧ 시료에서 생물학적 활성 (FⅧ 항원에 대한 FⅧ 발색 활성의 비로 표시)은 천연 rFⅧ의 생물학적 활성 (100%)과 비교하였을 때 90% 초과로 회복된 것으로 나타났다.
실시예 3
SDS-PAGE 및 면역블로팅 기법에 의한 PEG화된 rFⅧ의 특징 규명
제조사의 설명에 따라 인비트로겐(Invitrogen) (미국 캘리포니아주 칼즈배드 소재)으로부터 입수한 4-12% 폴리아크릴아미드 구배 겔을 사용하여 환원 조건하에 SDS-PAGE에 의해서 천연 rFⅧ의 특징을 규명하였다. 분자량 마커 (MW)로서는 바이오-래드(미국 캘리포니아주 허큘리스 소재)로부터 입수한 프리시즌 플러스 마커(Precision Plus marker) (10 kD-250 kD)를 사용하였다. 이어서, 단백질을 전기블로팅에 의해 바이오-래드(미국 캘리포니아주 허큘리스 소재)로부터 입수한 PVDF 막 위로 옮긴 후, 씨더레인 (캐나다 온타리오 혼비 소재)로부터 입수한 폴리클로날 양 항인간 FⅧ:C 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 면역 염색 방법의 마지막 단계로서 어큐레이트(Accurate) (미국 뉴욕주 웨스트버리 소재)로부터 입수한 알칼리성 포스파타제 (ALP)에 접합된 항-양 항체와 함께 인큐베이션시킨 후, 이어서, ALP 기질 키트 (미국 캘리포니아주 허큘리스 소재의 바이오-래드)를 사용하여 최종적으로 가시화를 수행하였다. 본 결과는 도 1에 요약되어 있다. 블롯이 천연 및 PEG화된 rFⅧ의 도메인 구조를 보여준다. PEG화된 rFⅧ이 천연 재조합 단백질보다 밴드의 폭이 더 넓고, 고분자량을 갖는 것으로 나타났다.
실시예 4
FⅧ이 결핍된 넉 아웃 마우스 모델에서 PEG화된 rFⅧ의 약동학적 성질
문헌 [Bi et al. (Nat Genet 1995;10:119-21)]에 상세히 기술되어 있는, FⅧ이 결핍된 마우스를 중증의 인간 A형 혈우병을 앓는 모델로서 사용하였다. 실시예 1에 따라 제조된 PEG-rFⅧ (PEG-SS, 5K) 또는 천연 rFⅧ을 체중 1 kg당 200 IU FⅧ의 투여량으로 하여 군을 구성하는 5마리의 마우스의 꼬리 정맥에 볼루스 주사 (10 ml/kg)하였다. 주사 후 5분, 3시간, 6시간, 9시간 및 24시간이 경과하였을 때 마취 후 심장 천자에 의해 각 군으로부터 시트레이트 혈장을 제조하였다. 혈장 샘플 중 FⅧ 활성 수준을 측정하였다. 본 실험의 결과는 도 2에 요약되어 있다. 평균 반감기는 1.9시간 (천연 rFⅧ에 대한 값)으로부터 4.9시간 (PEG화된 rFⅧ에 대한 값)으로 증가하였다. 곡선하 면적 (AUC)은 13.0시간*IU/ml으로부터 25.2시간*IU/ml로 증가하였다. (미국 미주리주 세인트루이스 소재의 마이크로매쓰(MicroMath)) 산하의) 약동학 실험실로부터 입수한 마이크로매쓰 사이언티스트(MicroMath Scientist), 모델 1을 사용하여 반감기를 산출하였다.
실시예 5
SDS-PAGE 및 면역블로팅 기법에 의한 rFⅧ의 PEG화에 대한 상세한 분석
60℃에서 60분 동안 1 nM 트롬빈으로 천연 및 PEG화된 rFⅧ을 분해시켜, FⅧ 분자를 특이적으로 절단시킴으로써 잘 정의된 분해 생성물을 수득하였다. 실시예 3에 기술된 바와 같이, SDS-PAGE에 의해 상기 중쇄 및 경쇄 단편을 분리시킨 후 전기블로팅을 수행하였다. 절단된 단편을 가시화하기 위해, 중쇄 A1 및 A2 도메인, B 도메인 및 경쇄 N-말단 A3 도메인에 대한 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체를 적용시켰다.
도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 비록 그 정도는 다르기는 하지만, 도메인들 모두 PEG화되었다. B 도메인이 강하게 PEG화되었다. 중쇄의 A1 및 A2 도메인, 둘 모두 부분적으로 PEG화되었다. 경쇄 A3-도메인에서는 다양한 정도의 PEG화 (모노-, 디-, 트리- 등)를 관찰할 수 있었다. 실시예 6과 일관되게, PEG화된 FⅧ은 트롬빈에 대한 내성이 더 큰 것으로 보였다.
실시예 6
PEG화된 rFⅧ의 트롬빈에 대한 내성
시험관내에서 FⅧ을 트롬빈으로 처리하면 그의 전구응고제 활성은 신속하게 증가한 후, 이어서 감소한다. 트롬빈 농도와 FⅧ의 완전성에 따라 결정되는 활성화 및 불활성화 속도를 하기와 같이, FⅨa 보조인자 분석법에 의해서 모니터링하였다:
FⅧ을 37℃에서 0.5 또는 1 nM 트롬빈과 함께 인큐베이션시켰다. 0.5 내지 40분 사이의 시간 간격으로 서브샘플을 채취하고, 트롬빈에 의해 매개되는 추가 반응을 막기 위해 특이적인 트롬빈 저해제도 또한 함유하는, FⅨa, FⅩ, PL-소포체 및 CaCl2로 이루어진 혼합물에 상기 서브샘플을 첨가하고, 3분 동안 인큐베이션시켰다. FⅩa에 의해서 선택적으로 절단되는 발색 기질에 서브샘플을 첨가하고, 추후의 Ⅹa 활성화를 막기 위해 EDTA를 포함시켰다. 15분 동안 인큐베이션시킨 후, 아세트산에 의해 반응을 종결시켰다. FⅩa 농도에 비례하는 흡광도 (A405) 값을 ELISA 판독기에서 측정하고, 정제된 FⅩa 기준 곡선을 사용하여 상기 흡광도 값을 FⅩa 농도로 전환하였다. 생성된 FⅩa 농도를 트롬빈과의 인큐베이션 시간에 대해서 플롯팅하였다.
곡선의 감쇠부를 단순 지수 피트로 피팅하여 FⅧ의 유사-1차(pseudo-first order) 불활성화 속도를 측정하였다.
Figure 112011014373611-pct00014
도 4 및 표 2에 나타난 바와 같이, PEG화된 rFⅧ은 적용된 트롬빈 농도 둘 모두에서 보다 저속화된 불활성화 속도를 나타내었다.
실시예 7
분지형 2,3-비스(메틸폴리옥시에틸렌-옥시)-1-(1,5-디옥소-5-숙신이미딜옥시, 펜틸옥시)프로판을 사용한 rFⅧ 중의 리신 잔기의 PEG화
489 IU FⅧ/ml를 함유하는, 애드베이트 제조 공정으로부터 유래된 벌크 물질로부터 150 mM NaCl, 0.5% 수크로스 및 0.1% 폴리소르베이트 80을 함유하는 20 mM Hepes 완충액 (pH 7.4) 중 rFⅧ 용액을 제조하였다. 완만하게 교반시키면서 NOF 코포레이션(일본 도쿄 소재)으로부터 입수한, 분자량이 20 kD인 분지형 PEG 숙신이미딜 글루타레이트 (PEG-SG) 반응물 (2,3-비스(메틸폴리옥시에틸렌-옥시)-1-(1,5-디옥소-5-숙신이미딜옥시, 펜틸옥시)프로판)을 153 ml의 상기 용액에 첨가하고 (단백질 1 mg당 5 mg의 반응물), 10분 후에 0.5 M NaOH를 적가하여 pH 값이 7.4가 되도록 조정하였다. 이어서, 완만하게 교반시키면서 실온에서 1시간 동안 rFⅧ를 PEG화시켰다.
이어서, 1 cm/분의 선형 유속을 사용하여 0.5% 수크로스 및 0.1% 폴리소르베이트 80을 함유하는 20 mM Hepes 완충액, 150 mM NaCl (pH 7.4) 중 평형화된 이온-교환 크로마토그래피 수지 (프락토겔 EMD TMAE 650M/파마시아 ⅩK-50 칼럼, 상 높이: 14.5 cm) 상에 반응 혼합물을 적용시켰다. 칼럼을 25 CV 평형 완충액으로 세척하여 과량의 반응물을 제거하고 (선형 유속: 2 cm/분), PEG화된 rFⅧ을 0.5 cm/분의 선형 유속으로 용리 완충액 (20 mM Hepes, 1.0 M NaCl, 0.5% 수크로스, 0.1% 폴리소르베이트 80 (pH 7.4))을 사용하여 용리시켰다. 이어서, 재생 셀룰로스로 구성되고 분자량 컷-오프가 30 kD인 막을 사용하고, 20 mM Hepes, 150 mM NaCl, 0.5% 수크로스 (pH 7.4)로 구성된 완충액 시스템을 이용하여 한외여과/정용여과를 수행함으로써 용리액을 농축시켰다.
실시예 8
시험관내에서의 분지형 PEG-SG 20 kD로 PEG화된 rFⅧ의 특징 규명
애드베이트 제조 공정으로부터 유래된 rFⅧ을 실시예 7에 따라 분지형 PEG-SG 반응물을 사용하여 리신 잔기를 통해 PEG화시키고, 실시예 2에 기술된 바와 같이, PEG화된 rFⅧ 생성물의 생화학적 특징을 규명하였다.
Figure 112011014373611-pct00015
표 3의 데이타로 알 수 있는 바와 같이, PEG화된 rFⅧ 시료에서 생물학적 활성 (FⅧ 항원에 대한 FⅧ 발색 활성의 비로 표시)은 천연 rFⅧ의 생물학적 활성 (100%)과 비교하였을 때 완전하게 회복된 것으로 나타났다.
실시예 3에 기술된 바와 같이, 4-12% 폴리아크릴아미드 구배 겔을 사용하여 환원 조건하에 SDS-PAGE 및 면역블로팅 기법에 의해서 PEG화된 rFⅧ의 특징을 규명하였다. 본 결과는 도 5에 요약되어 있다. 블롯이 천연 및 PEG화된 rFⅧ의 도메인 구조를 보여준다. PEG화된 rFⅧ이 천연 재조합 단백질보다 밴드의 폭이 더 넓고, 고분자량을 갖는 것으로 나타났다.
SDS-PAGE 및 면역블로팅 기법에 의한 rFⅧ 시료의 PEG화에 대한 보다 상세한 분석을 위해, 실시예 5에 기술된 바와 같이, 60℃에서 60분 동안 1 nM 트롬빈으로 천연 및 PEG화된 rFⅧ을 분해시켜, FⅧ 분자를 특이적으로 절단시킴으로써 잘 정의된 분해 생성물을 수득하였다. SDS-PAGE를 함으로써 단편을 분리시키고, 이어서 전기블로팅을 하고 상이한 항-FⅧ 항체에 의해 가시화하였다. 도 6에서 알 수 있는 바와 같이, 비록 그 정도는 다르기는 하지만, 도메인들 모두 PEG화되었다. B 도메인이 강하게 PEG화되었다. 경쇄 A3-도메인에서는 다양한 정도의 PEG화 (모노-, 디-, 트리-PEG화)를 관찰할 수 있었다. 본 결과를 통해 PEG화된 rFⅧ은 트롬빈에 대한 내성이 더 큰 것으로 나타났다.
트롬빈에 의한 활성화 및 불활성화 속도를 실시예 6에 기술된 바와 같이, FⅨa 보조인자 분석법에 의해서 모니터링하였다. 곡선의 감쇠부를 단순 지수 피트로 피팅하여 FⅧ의 유사-1차 불활성화 속도를 측정하였다.
Figure 112011014373611-pct00016
도 7 및 표 4에 나타난 바와 같이, PEG화된 rFⅧ은 적용된 트롬빈 농도 둘 모두에서 보다 저속화된 불활성화 속도를 나타내었다.
실시예 9
당질 부분을 통한 rFⅧ의 PEG화
당질 잔기를 통한 PEG-rFⅧ 접합체를 제조하기 위해, 25 mM 포스페이트 완충액 (pH 6.7) 중에서 rFⅧ 용액 (최종 농도: 1.2 mg/ml)을 제조하였다. 당질 잔기를 산화시키기 위해 NaIO4 (최종 농도: 0.3 mM)를 첨가하였다 (문헌 ([Roberts et al.; Advanced Drug Del Rev.; 54:459-76 (2002)]; [Meir and Wilchek; Meth Enzymol;l38: 429-42(1987)])). 최종 농도 10%로 글리세롤을 첨가하여 반응을 켄칭시키고, 아미콘 마이크론-10(Amicon Micron-10) 장치 (매사추세츠주 빌러리카 소재의 아미콘(Amicon))를 사용하여 원심분리를 반복적으로 수행함으로써 과량의 반응물을 분리시켰다. PEG-히드라지드 (MW 3300 Da/앨라배마주 헌츠빌 소재의 넥타)를 첨가하여 반응물의 최종 농도가 1.5 mM이 되도록 하였다. 이어서, 실온에서 2시간 동안 PEG화시켰다. 이어서, 아미콘 마이크론-10 장치 상에서 25 mM 포스페이트 완충액 (pH 6.7)을 사용하여 원심분리를 반복적으로 수행함으로써 수득된 접합체 및 과량의 반응물을 분리시켰다.
실시예 10
PSA-히드라진을 사용한 rFⅧ의 폴리시알릴화
당질 잔기를 통한 PSA-rFⅧ 접합체를 제조하기 위해, 20 mM 아세트산나트륨 완충액 (pH 6.0) 중에서 rFⅧ 용액 (최종 농도: 1 mg/ml)을 제조하였다. 당질 잔기를 산화시키기 위해 NaIO4 (최종 농도: 0.25 mM)를 첨가하였다. 암실하에 4℃에서 60분 동안 산화시켰다. 아황산수소나트륨 (최종 농도: 25 mM)을 첨가하여 반응을 종결시켰다. DG-10 칼럼 (바이오-래드) 상에서 겔 여과를 수행하여 과량의 과요오드산나트륨을 분리시켰다. 이어서, 쇄 길이가 20 kD인 PSA-히드라진 (WO2006/016168에 따라 제조)을 첨가하였다 (최종 농도: 10 mM). 실온에서 2시간 동안 폴리시알릴화 과정을 수행하였다. 부틸-세파로스(Butyl-Sepharose) (GE 헬쓰케어(GE-Healthcare)) 상에서 HIC에 의해 폴리시알릴화된 rFⅧ을 정제하였다. 5 M NaCl 용액을 혼합물에 첨가하여 NaCl의 최종 농도가 3 M이 되도록 하였다. 부틸-세파로스 (GE 헬쓰케어)로 충전된 칼럼에 상기 혼합물을 적용시키고, 6.7 mM CaCl2를 함유하는 50 mM Hepes-완충액 (pH 7.4)을 사용하여 rFⅧ-PSA 접합체를 용리시켰다. 상기 접합체를 용리시킨 후, pH를 pH 6.9로 조정하였다.
실시예 11
폴리시알산의 정제 및 유도체화
WO06016161A1에 기술된 바와 같이, Q-세파로스 FF(Q-Sepharose FF) 상에서의 음이온-교환 크로마토그래피에 의해 폴리시알산을 정제하였다. 25 mM NaCl을 함유하는 50 mL의 10 mM 트리에탄올아민 완충액 (pH 7.4) (=출발 완충액)에 5 g의 PSA를 용해시켰다. 출발 완충액으로 평형화된, Q-세파로스 FF로 충전된 파마시아(Pharmacia) ⅩK50 칼럼 (독일 뮌헨 소재의 GE 헬쓰케어) 상에 상기 용액을 적용시켰다. 이어서, 칼럼을 8 칼럼 부피 (CV)의 출발 완충액으로 세척하고, 출발 완충액 중 3 CV의 200 mM NaCl, 350 mM NaCl 및 500 mM NaCl을 사용하여 단계별로 결합된 PSA를 용리시켰다. SDS 겔 전기영동에 의해 나타난바, 350 mM NaCl을 사용하여 용리된 분획의 분자량은 20 kDa인 것으로 밝혀졌다. 재생 셀룰로스로 제조된 5 kD 막 (매사추세츠주 빌러리카 소재의 밀리포어(Millipore))을 사용하여 한외여과시킴으로써 상기 분획을 농축시킨 후, 50 mM 포스페이트 완충액 (pH 7.2)에 대하여 정용여과시켰다. NaIO4를 사용하여 PSA를 산화시키고, WO05016973A1에 기술된 바와 같이, 환원성 아미노화에 의해 말단의 1차 아미노기를 도입하였다. 환원성 아미노화를 위해, 50 mM 포스페이트 완충액 (pH 7.2) 중 1 ml당 58 mg의 산화된 PSA를 함유하는 용액 20 mL에 2 M NH4Cl 용액 11 mL를 첨가하였다. 이어서, 1M NaOH 중 5 M NaCNBH3 용액을 첨가함으로써 최종 농도가 75 mM이 되도록 하였다. pH 8.0 및 실온에서 5일 동안 반응을 수행하였다.
이어서, 10 mM NaCl을 함유하는 (NH4)2CO3 용액 (50 mg/L)에 대하여 혼합물을 투석시키고, 이어서, 5 mM EDTA를 함유하는 50 mM 포스페이트 완충액 (pH 8.0)에 대하여 혼합물을 투석시켰다. 그 다음, 말단의 1차 아미노기와 2-이미노티올란 (트라우트 반응물(Traut's reagent)/일리노이주 록퍼드 소재의 피어스(Pierce))의 반응에 의해 설프하이드릴기를 도입하였다. 5 mM EDTA를 함유하는 50 mM 포스페이트 완충액 (pH 8.0) 중에서 20배 몰 과량의 반응물을 사용함으로써 실온에서 1시간 동안 반응을 수행하였다. 최종적으로, 재생 셀룰로스로 제조되고, 컷-오프가 5 kD인 막 (매사추세츠주 빌러리카 소재의 밀리포어)을 사용하여 말단의 유리 SH기를 함유하는 PSA 용액을 한외여과/정용여과시켰다.
실시예 12
이종이작용성 교차-링커를 사용한 rFⅧ의 폴리시알릴화
PSA-SH를 rFⅧ에 커플링시키기 위해, 당질-선택성 히드라지드기 및 설프하이드릴-반응성 말레이미드기를 함유하는 이종이작용성 교차-링커 MBPH (4-[4-N-말레이미도페닐]부티르산 히드라지드-HCl/일리노이주 록퍼드 소재의 피어스)를 사용하였다 (문헌 [Chamow et al., J Biol Chem; 267:15916-22(1992)]). 실시예 11에 따라 활성 설프하이드릴기를 함유하는 PSA-SH를 제조하였다.
제조사의 설명에 따라 탈염 칼럼 (바이오-래드 이코노팩 10 DG)을 사용하여 2 ml rFⅧ (638 mg, 3.856 mg/ml 단백질 농도)을 산화 완충액 (50 mM 아세트산나트륨 (pH 6))으로 옮겼다. 이어서, (암실하에 4℃에서 1시간 동안) 0.25 mM NaIO4 (머크(Merck))를 사용하여 단백질을 산화시켰다. 최종 농도 10%로 글리세롤을 첨가하여 반응을 켄칭시켰다. 글리세롤 및 NaIO4를 제거하고, 제조사의 설명에 따라 탈염 칼럼 (바이오-래드 이코노팩 10 DG)을 사용하여 단백질을 반응 완충액 (50 mM 아세트산나트륨 (pH 6.5))으로 옮겼다. 이어서, 1 mg MBPH/mg 단백질 및 PSA-SH (단백질에 대하여 200배 몰 과량)을 함유하는 혼합물을 pH 6.5하에 실온에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 제조사의 설명에 따라 탈염 칼럼 (바이오-래드 이코노팩 10 DG)을 사용하여 과량의 링커를 제거하고, 링커-PSA 접합체는 반응 완충액으로 옮겼다.
MPBH-PSA 접합체를 산화된 rFⅧ (0.105 mg/ml 단백질)에 첨가하고, 완만하게 교반시키면서 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 사전 충전된 부틸 세파로스 칼럼 (GE 헬쓰케어, 부틸 하이트랩 FF(Butyl HiTrap FF) 5 ml)을 사용하여 HIC에 의해 rFⅧ-PSA 접합체를 정제하였다. 접합체가 부틸 세파로스와 소수성 상호작용을 할 수 있도록 하기 위해 샘플을 2-8℃로 냉각시키고, 5 M NaCl을 함유하는 완충액 용액 (50 mM Hepes, 5 M NaCl, 6.7 mM CaCl2, 0.01% Tween (pH 6.9))을 첨가하여 반응 혼합물의 이온 강도를 대략 185 mS/cm의 전도도로 증가시켰다. 1.2 cm/분의 유속을 사용하여 평형 완충액 (pH 6.9) (50 mM Hepes, 3 M NaCl, 6.7 mM CaCl2, 0.01% Tween 80 함유)으로 평형화된 칼럼 상에 반응 혼합물을 로딩하였다. 비결합 샘플은 10 칼럼 부피 (CV)의 평형 완충액으로 세척하였다. 1.2 cm/분의 유속을 사용하여 이온 강도가 낮은 완충액 (50 mM Hepes, 6.7 mM CaCl2 (pH 7.4))으로 접합체를 용리시켰다. 크로마토그래피 공정을 수행하는 동안, 얼음 배쓰를 사용하여 샘플 및 완충액을 냉각시켰다. 마지막으로, 용리액의 pH는 6.9로 조정하였다.
실시예 13
rFⅧ과 덱스트란의 접합
rFⅧ을 덱스트란에 접합시키기 위해, 제조사의 설명에 따라 탈염 칼럼 (바이오-래드 이코노팩 10 DG)을 사용하여 2 ml rFⅧ (638 mg, 3.4 mg/ml 단백질)을 산화 완충액 (50 mM 아세트산나트륨 (pH 6))으로 옮겼다. 이어서, (암실하에 4℃에서 1시간 동안) 0.25 mM NaIO4를 사용하여 단백질을 산화시켰다. 먼저, 제조사의 설명에 따라, MWCO가 30 kDa인 비바스핀 한외여과 스핀 칼럼 (사토리우스 스테딤 바이오테크 게엠베하(Sartorius Stedim Biotech GmbH))을 사용하여 산화된 단백질을 농축시켰다. 이어서, 4℃에서 밤새도록 샘플을 반응 완충액 (50 mM 인산나트륨 (pH 7))에 대하여 투석시켰다.
투석 후, 26.58 mg 아디프산 디히드라지드 (ADH) (시그마(Sigma)) (500배 몰 과량)를 첨가하고, 완만하게 교반시키면서 반응 혼합물을 pH 7하에 실온에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 제조사의 설명에 따라 탈염 칼럼 (바이오-래드 이코노팩 10 DG)을 사용하여 ADH를 제거하였다. 10 mg 알데히드-활성화된 덱스트란 (피어스) (단백질에 대하여 17배 몰 과량)을 첨가하고, 혼합물을 pH 7하에 실온에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다.
Q-세파로스 HP (GE 헬쓰케어) 상에서 IEⅩ 크로마토그피에 의해 접합체를 정제시켰다. 0.5 ml/분의 유속을 사용하여 완충액 A (50 mM 인산나트륨 (pH 6.8))로 평형화된 칼럼 (6.4 mm x 3 cm, V = 1 ml) 상에 샘플을 로딩하였다. 비결합 샘플은 5 CV의 완충액 A로 세척하였다. 마지막으로, 0.5 ml/분의 유속을 사용하여 선형 염 구배 (10 CV 중 0-100% 완충액 B [50 mM 인산나트륨 (pH 6.8) + 1 M NaCl])로 접합체를 용리시켰다.

Claims (35)

  1. (a) 인자 Ⅷ 분자; 및
    (b) 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리시알산 (PSA) 및 덱스트란으로 구성된 군으로부터 선택되고, 상기 인자 Ⅷ 분자에 결합되어 있는 수용성 중합체를 포함하는 단백질성 분자로서,
    상기 수용성 중합체는 인자 Ⅷ의 B 도메인에 위치하는 당질 부분(carbohydrate moieties)을 통해 인자 Ⅷ에 부착되고,
    상기 단백질성 분자는 50% 이상의 천연 FⅧ 활성을 보유하는 단백질성 분자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단백질성 분자가 80% 이상의 천연 FⅧ 활성을 보유하는 단백질성 분자.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, 수용성 중합체가 링커를 통해 당질 부분에 부착되고, 상기 링커는 4-[4-N-말레이미도페닐]부티르산 히드라지드 (MBPH)인 단백질성 분자.
  7. 제1항에 있어서, 인자 Ⅷ이 재조합 인자 Ⅷ 또는 혈장 인자 Ⅷ인 단백질성 분자.
  8. (i) 제1항의 단백질성 분자; 및
    (ii) 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는,
    인자 Ⅷ의 기능적 결손 또는 결핍과 관련된 출혈성 질병의 치료에 사용하기 위한 조성물.
  9. (i) 인자 Ⅷ의 기능적 결손 또는 결핍과 관련된 출혈성 질병의 유형 및 대상체의 병력에 기초하여 조성물의 투여량을 결정하고,
    (ii) (a) 제1항의 단백질성 분자; 및
    (b) 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는,
    인자 Ⅷ의 기능적 결손 또는 결핍과 관련된 출혈성 질병의 치료에 사용하기 위한 조성물.
  10. (i) 제1항의 단백질성 분자; 및
    (ii) 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는,
    인자 Ⅷ의 기능적 결손 또는 결핍과 관련된 출혈성 질병을 겪는 환자에게서 인자 Ⅷ 분자를 1% 이상의 수준으로 유지시키도록 하는 유효한 단위 용량을 갖는 약제학적 조성물.
  11. 제8항에 있어서, 인자 Ⅷ의 기능적 결손 또는 결핍과 관련된 출혈성 질병이 A형 혈우병인 조성물.
  12. 제10항에 있어서, 주사에 적합한 형태인 조성물.
  13. 약제학적 조성물의 용도가 기술되어 있는 설명을 포함하는 용기 내에 패킹된,
    (i) 제1항의 단백질성 분자; 및
    (ii) 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 포함하는
    부품의 키트.
  14. 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리시알산 (PSA) 및 덱스트란으로 구성된 군으로부터 선택되는 수용성 중합체를 인자 Ⅷ의 B 도메인에 위치하는 당질 부분을 통해 인자 Ⅷ에 접합시키는 것을 포함하고, 단백질성 분자가 50% 이상의 천연 FⅧ 활성을 보유하는, 제1항에 따라 정의된 단백질성 분자의 제조 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 단백질성 분자가 80% 이상의 천연 FⅧ 활성을 보유하는 방법.
  16. 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리시알산 (PSA) 및 덱스트란으로 구성된 군으로부터 선택되는 수용성 중합체가 결합되어 변형된 인자 Ⅷ를 포함하고,
    상기 수용성 중합체는 산화된 당질 부분(oxidised carbohydrate moiety)을 통해 상기 변형된 인자 Ⅷ에 부착되고, 상기 변형된 인자 Ⅷ이 50% 이상의 천연 FⅧ 활성을 보유하는 접합체.
  17. 제16항에 있어서, 상기 변형된 인자 Ⅷ이 80% 이상의 천연 FⅧ 활성을 보유하는 접합체.
  18. 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 알부민이 없는 조성물.
  19. 제16항 또는 제17항에 있어서, 수용성 중합체가 링커를 통해 상기 산화된 당질 부분에 부착되고, 상기 링커는 4-[4-N-말레이미도페닐]부티르산 히드라지드 (MBPH)인 접합체.
  20. 제16항 또는 제17항에 있어서, 산화된 당질 부분이 인자 Ⅷ의 B 도메인에 위치하는 접합체.
  21. 삭제
  22. 제16항 또는 제17항에 있어서, 인자 Ⅷ이 재조합 인자 Ⅷ 또는 혈장 인자 Ⅷ인 접합체.
  23. 삭제
  24. (i) 제16항의 접합체; 및
    (ii) 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는,
    인자 Ⅷ의 기능적 결손 또는 결핍과 관련된 출혈성 질병의 치료에 사용하기 위한 조성물.
  25. (i) 인자 Ⅷ의 기능적 결손 또는 결핍과 관련된 출혈성 질병의 유형 및 대상체의 병력에 기초하여 조성물의 투여량을 결정하고,
    (ii) (a) 제16항의 접합체; 및
    (b) 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는,
    인자 Ⅷ의 기능적 결손 또는 결핍과 관련된 출혈성 질병의 치료에 사용하기 위한 조성물.
  26. (i) 제16항의 접합체; 및
    (ii) 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는,
    인자 Ⅷ의 기능적 결손 또는 결핍과 관련된 출혈성 질병을 겪는 환자에게서 인자 Ⅷ 분자를 1% 이상의 수준으로 유지시키도록 하는 유효한 단위 용량을 갖는 약제학적 조성물.
  27. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 인자 Ⅷ의 기능적 결손 또는 결핍과 관련된 출혈성 질병이 A형 혈우병인 조성물.
  28. 제26항에 있어서, 주사에 적합한 형태인 조성물.
  29. 약제학적 조성물의 용도가 기술되어 있는 설명을 포함하는 용기 내에 패킹된,
    (i) 제16항 또는 제17항의 접합체; 및
    (ii) 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 포함하는
    부품의 키트.
  30. 인자 Ⅷ의 산화된 당질 부분을 활성화된 수용성 중합체와 접촉시키는 단계를 포함하고,
    상기 수용성 중합체가 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리시알산 (PSA) 및 덱스트란으로 구성된 군으로부터 선택되고, 수용성 중합체에 접합된 인자 Ⅷ이 50% 이상의 천연 FⅧ 활성을 보유하는,
    수용성 중합체를 인자 Ⅷ의 산화된 당질 부분에 접합시키는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 수용성 중합체에 접합된 인자 Ⅷ이 80% 이상의 천연 FⅧ 활성을 보유하는 방법.
  32. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 접합되지 않은 인자 Ⅷ 부분을 추가로 포함하는 조성물.
  33. 제30항에 있어서, 활성화된 수용성 중합체가 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)-히드라지드, 폴리시알산 (PSA)-히드라진 및 알데히드-활성화된 덱스트란으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  34. 제30항에 있어서, 당질 부분이 NaIO4를 포함하는 완충액 중에서의 인큐베이션에 의해 산화되는 방법.
  35. 제30항에 있어서, 인자 Ⅷ의 산화된 당질 부분이 인자 Ⅷ의 B 도메인에 위치하는 방법.
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