CN104645347A - 凝血因子viii聚合物偶联物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种蛋白质构建体，其包含经由凝血因子VIII中的碳水化物部分而被偶联至水溶性聚合物的凝血因子VIII分子，本发明还涉及其制备方法。在本发明的一个实施方式中，水溶性聚合物选自下组：聚乙二醇(PEG)、多聚唾液酸(PSA)或者葡聚糖。

Description

凝血因子VIII聚合物偶联物
本申请是申请日为2009年7月29日、申请号为200980130950.3(国际申请号为PCT/US2009/052103)、名称为凝血因子VIII聚合物偶联物的发明专利申请的分案申请。
本申请为于2007年3月29日申请的美国专利申请11/729,625的部分后续申请，美国专利申请11/729,625要求分别在2006年6月6日及2006年3月21日申请的美国临时专利申请60/790,239及60/787,968的优先权。
技术领域
本发明涉及一种包含与至少一种水溶性聚合物(包括聚环氧烷，例如聚乙二醇)相结合的凝血因子VIII(FVIII)的蛋白质构建体。此外，本发明还涉及用于延长患有与FVIII功能缺陷或缺乏相关的出血性疾病的哺乳动物的血液中FVIII的体内半衰期的方法。
背景技术
血浆中的凝血因子VIII(FVIII)以很低的浓度循环并且非共价地结合于冯威勒布兰特因子(von Willebrand factor，VWF)。在止血期间，FVIII与VWF分开，并作为协同因子，在钙和磷脂或者细胞膜存在的情况下，通过提高活化速度，用于受被活化的凝血因子IX(FIXa)调节的凝血因子X(FX)的活化。
FVIII被合成为具有结构域A1-A2-B-A3-C1-C2的大约270-330kD的单链前体。当FVIII被从血浆中纯化时(比如是“来源于血浆的”或者“血浆的”)，FVIII由重链(A1-A2-B)和轻链(A3-C1-C2)组成。轻链分子量是80kD，然而由于B结构域内的蛋白质水解，重链分子量在90-220kD的范围内。
FVIII也可被合成为重组蛋白质用于出血性疾病的治疗使用。已经设计了不同的体外试验来确定重组体FVIII(rFVIII)作为治疗药物的潜在有效性。这些试验模拟内源性FVIII的体内效果。正如体外分析所测定的那样，FVIII的体外凝血酶处理导致它的促凝血活性急剧增加和随后的减少。活化和失活与重链和轻链两者中的特异的限制性蛋白质水解一致，限制性蛋白质水解可改变FVIII中的不同结合表位的可用性，比如允许FVIII与VWF分离并且结合至磷脂表面、或者改变与某些单克隆抗体的结合能力。
FVIII的缺乏或者功能障碍与最常见的出血性疾病即甲型血友病相关。甲型血友病的治疗手段选择是采用来源于血浆的浓缩物或者rFVIII浓缩物的替代疗法。FVIII水平低于1％的重症甲型血友病患者通常采用预防性疗法，目的是在给药之间保持FVIII在1％以上。考虑到血液循环中不同的FVIII产物的平均半衰期，该目的通常通过每周给药两至三次FVIII来实现。
在市场上有许多浓缩物用于甲型血友病的治疗。这些浓缩物之一是重组体产物其在CHO细胞中被生产出来，并且由巴克斯特保健公司制造。在细胞培养工艺、纯化、或该产品的最终配制中没有加入人或动物血浆蛋白或者白蛋白。
目前许多FVIII浓缩物和治疗性多肽类药物的制造商的目标是开发下一代产品，该产品具有增强的药效和药物动力学特性，同时保持所有其他的产品特征。
治疗性多肽类药物可被蛋白水解酶快速降解并被抗体中和。这降低了它们的半衰期和循环时间，因此限制了它们的疗效。已经有研究显示，添加可溶性聚合物或者碳水化合物至多肽可以抑制降解并延长多肽的半衰期。例如，将多肽类药物聚乙二醇化可保护它们并且增强它们的药效和药物动力学特性(Harris J M et Chess R B,Nat Rev Drug Discov2003；2:214-21)。聚乙二醇化方法可将聚乙二醇(PEG)的重复单元连接至多肽药物。分子的聚乙二醇化可以导致药物对酶降解的抗性增加、体内半衰期增加、给药频率降低、免疫原性降低、物理和热稳定性增加、溶解性增加、液体稳定性增加和凝聚减少。
因此，比如通过聚乙二醇化，添加可溶性聚合物是提高FVIII产物性能的一种方法。现有技术状况已有不同的专利和专利申请记载：
美国专利申请6,037,452描述了聚(环氧烷)FVIII或者FIX偶联物，其中蛋白质通过所述FVIII的羰基被共价连接至聚(环氧烷)上。
EP1258497B1描述了一种制备FVIII与生物相容性聚合物的偶联物的方法。该专利被等人的出版物(Bioconj Chem 2000；11:387-96)进行了补充。偶联物包括被删除的且被单甲氧基聚乙二醇修饰的重组FVIII。偶联物降低了FVIII功能，并且促凝血活性随着修饰度的增加而快速地降低。
WO 4075923 A3描述了一种共聚物-FVIII分子偶联物，其包含多个偶联物，其中每个偶联物都有一至三个被共价连接至FVIII分子上的水溶性聚合物。该FVIII分子的B结构域已被删除。
美国专利4,970,300描述一种被修饰的FVIII，其中包含具有FVIII活性的蛋白质的不溶性偶联物被共价连接至无抗原性配体。
美国专利6,048,720描述了多肽和生物相容性聚合物的偶联物。
WO94/15625描述了连接于聚乙二醇的FVIII，该聚乙二醇具有不超过5000道尔顿的优选分子量。
仍需要一种含有被连接的可溶性聚合物以便延长FVIII体内半衰期的FVIII，比如聚乙二醇化的FVIII，如含有被偶联的大于10000道尔顿的PEG的全长FVIII，与非聚乙二醇化的FVIII相比，其保留了功能活性同时提供延长的体内半衰期。
发明内容
本发明涉及一种蛋白质构建体，其包含经由凝血因子VIII中的碳水化物部分而偶联至水溶性聚合物的凝血因子VIII分子。本发明还涉及其制备方法。
在本发明的一个实施方式中，提供一种将水溶性聚合物偶联至FVIII中被氧化的碳水化物部分的方法，包括在允许偶联的条件下将被氧化的碳水化物部分与被活化的水溶性聚合物相接触。在一个相关的方面，所述水溶性聚合物选自下组：PEG、PSA和葡聚糖。在另一方面，所述被活化的水溶性聚合物选自下组：PEG-酰肼、PSA-肼和醛活化的葡聚糖。在本发明的另一方面，所述碳水化物部分是通过在包含NaIO4的缓冲液中温育被氧化的。而在另一方面，所述FVIII中被氧化的碳水化物部分位于FVIII的B结构域。
在本发明的另一个实施方式中，提供根据如上所述方法中的任一方法所产生的被修饰的FVIII。而在另一个实施方式中，提供一种蛋白质构建体，其包含：(a)凝血因子VIII分子；和(b)至少一个连接至所述凝血因子VIII分子的水溶性聚合物，其中所述水溶性聚合物通过一个以上位于凝血因子VIII的B结构域中的碳水化物部分而被连接于凝血因子VIII。在本发明的一个相关的方面，所述水溶性聚合物选自下组：PEG、PSA和葡聚糖。
附图说明
图1显示用SDS-PAGE及随后的免疫印迹法测定的rFVIII与PEG偶联后的条带变宽和质量增加。
图2显示在血友病小鼠中PEG-rFVIII偶联物与未偶联FVIII相比的药物动力学。空心正方形：PEGrFVIII，200IU FVIII/kg剂量。实心菱形：天然rFVIII，200IU FVIII/kg剂量。
图3显示通过使用不同抗FVIII抗体的SDS-PAGE进行的聚乙二醇化位点的详细分析。
图4显示凝血酶诱导的天然rFVIII和聚乙二醇化rFVIII的活化和失活。
图5显示表示天然rFVIII和聚乙二醇化rFVIII的结构域的条带。
图6显示天然rFVIII和聚乙二醇化rFVIII的不同结构域的聚乙二醇化程度。
图7显示天然rFVIII和聚乙二醇化rFVIII的凝血酶失活速度。
具体实施方式
本发明是一种蛋白质构建体，其包含含有至少一部分完整B结构域的FVIII分子，该FVIII分子连接至水溶性聚合物上，水溶性聚合物包括：聚环氧烷、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚噁唑啉、聚丙烯酰基吗啉或者碳水化合物如聚唾液酸(PSA)或者葡聚糖。在本发明的一个实施方式中，水溶性聚合物是分子量大于10000道尔顿的聚乙二醇分子。在另一个实施方式中，水溶性聚合物的分子量从大于10000道尔顿至大约125000道尔顿，大约15000道尔顿至20000道尔顿，或者大约18000道尔顿至大约25000道尔顿。在一个实施方式中，构建体保留了标准的治疗性FVIII产品的全部功能活性，并且与标准治疗性FVIII产品相比较，体内半衰期得到延长。在另一个实施方式中，相对于天然凝血因子VIII，构建体保留至少50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140或150百分比(％)的生物活性。在一个相关方面，构建体和天然凝血因子VIII的生物活性通过显色活性与FVIII抗原值的比值(FVIII:Chr:FVIII:Ag)来确定。在本发明的另一个实施方式中，相对于天然凝血因子VIII的体内半衰期，构建体的半衰期减少或者增加0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。
本发明的起始物质是FVIII，可以来源于人血浆或者通过重组工程技术产生，如同在美国专利4,757,006、5,733,873、5,198,349、5,250,421、5,919,766、EP306968中所描述的那样。
此处，术语“凝血因子VIII”或者“FVIII”指的是含有至少一部分完整B结构域的任何FVIII分子，并且可展示出与天然FVIII相关的生物活性。在本发明的一个实施方式中，FVIII分子是全长凝血因子VIII。FVIII分子是蛋白质，被能与编码因子VIIIC的DNA杂交的DNA序列所编码。这种蛋白质可以在A1-A2-B-A3-C1-C2结构域之间或者域内的不同位点处含有氨基酸缺失(美国专利4,868,112)。FVIII分子也可以是天然FVIII的类似物，其中一个以上的氨基酸残基通过定点突变而被替代。
用于本发明的FVIII分子包括全长蛋白质、蛋白质的前体、蛋白质生物活性或功能性的亚基或片断、它们功能性衍生物、以及如下所述的它们的变体。提及的FVIII指的是包括这种蛋白质的所有可能形式，并且其中FVIII的每个形式含有至少一部分或者完整的天然B结构域序列。
根据本发明，术语“重组凝血因子VIII”(rFVIII)可以包括任何通过重组DNA技术获得的异源的或者天然产生的rFVIII，或者它们的生物活性衍生物。在某些实施方式中，该术语包括如上所述的蛋白质和编码本发明rFVIII的核酸。这种核酸包括，比如但不限于：基因、前mRNA、mRNA、多态性变体、等位基因、合成的和自然产生的突变体。术语rFVIII包含的蛋白质包括，比如但不限于：上述那些蛋白质和多肽、被上述核酸编码的蛋白质、种间同源物和如下的其它多肽：(1)在至少约25、约50、约100、约200、约300、约400个或者更多个氨基酸的范围内(直至成熟的天然蛋白质的406个氨基酸的全长序列)，含有的氨基酸序列相较于此处描述的标准核酸编码的多肽或者氨基酸序列具有约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或者更大的氨基酸序列一致性；和/或(2)特异性结合抗体，比如多克隆或者单克隆抗体，该抗体是针对包含此处描述的引用的氨基酸序列的免疫原、它的免疫原片断和/或它的保守修饰的变体而产生的抗体。
本发明的编码rFVIII的聚核苷酸，包括但不限于：(1)在严格杂交条件下可与编码此处描述的引用的氨基酸序列进行特异性杂交的聚核苷酸和它的保守修饰变体；(2)在至少约25、约50、约100、约150、约200、约250、约500、约1000个或者更多个核苷酸的范围内(直至成熟蛋白质的1218个核苷酸的全长序列)，含有的核酸序列相较于此处描述的引用的核酸序列具有约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或者更高的核苷酸序列一致性。
此处使用的术语“内源性FVIII”包括来源于准备接受治疗的哺乳动物的FVIII。该术语还包括由存在于所述哺乳动物中的转基因或者其它任何外源DNA转录而来的FVIII。此处使用的“外源性FVIII”包括并非来源于所述哺乳动物的FVIII。
变体(或者类似物)多肽包括插入型变体，其中一个以上氨基酸残基被添加至本发明的FVIII氨基酸序列中。插入可以位于蛋白质的任一末端或者两个末端，并且/或者可以位于FVIII氨基酸序列的内部区域内。在任一末端或者两个末端具有附加的残基的插入型变体，包括比如，融合蛋白质或者包括氨基酸标记物或者其他氨基酸标签的蛋白质。在一个方面，FVIII分子可以任选地含有N-末端蛋氨酸，尤其是当分子在细菌细胞比如大肠杆菌(E.coli)中被重组表达时。
在缺失型变体中，去除此处所描述的FVIII多肽中一个以上氨基酸残基。缺失可以在FVIII多肽的一个末端或者两个末端发生，并且/或者在FVIII氨基酸序列内去除一个以上的残基。因此缺失型变体包括FVIII多肽序列的所有片段。
在取代型变体中，FVIII多肽中一个或多个氨基酸残基被去除并且用可选的残基来取代。在一个方面，取代实际上是保守性的，并且这种保守性取代在本领域中是已知的。可选择地，本发明还包括那些非保守性的取代。典型的保守性取代在Lehninger[Biochemistry,第2版；Worth Publishers公司,New York(1975),第71-77页]中被描述，并且列在下文中。
保守性取代
侧链特征                        氨基酸
非极性(疏水性)：
非荷电的极性：
可选择地，示例的保守性取代列在下文中。
保守性取代II
“天然存在的”聚核苷酸或多肽序列典型地来自于哺乳动物，包括但不限于：灵长类如人；啮齿类如大鼠、小鼠、仓鼠；牛，猪，马，羊或者任何哺乳动物。本发明的核酸和蛋白质可以是重组分子(如异源的和编码野生型序列或者其变体的，或者非天然存在的)。引用的聚核苷酸和多肽序列包括，比如文献UniProtKB/Swiss-Prot P00451(FA8_人)；Gitschier J等人，人凝血因子VIII基因的鉴定，Nature,312(5992):326-30(1984)；Vehar GH等人，人凝血因子VIII的结构，Nature,312(5992):337-42(1984)；和Thompson AR.凝血因子VIII基因和蛋白质的结构和功能，Semin Thromb Hemost,2003:29；ll-29(2002)中所述的(参考文献全部并入本文)。
此处使用的术语“生物活性衍生物”或者“生物活性变体”包括基本上含有与所述分子相同功能和/或生物性质如结合性质的、和/或相同结构基础如肽主链或基本聚合物单元的分子的任何衍生物或者变体。
此处使用的术语“来源于血浆的FVIII”或者“血浆的”包括从哺乳动物获得的血液中发现的具有活化凝血途径的蛋白质的所有形式。
在不同的方面，rFVIII的生产包括本领域中已知的任意方法，该方法(i)通过基因工程技术产生重组DNA，(ii)通过比如但不限于转染、电穿孔或者显微注射将重组DNA引入原核或者真核细胞，(iii)培养所述被转化的细胞，(iv)组成性地或者诱导性地表达rFVIII，以及(v)从培养基分离所述rFVIII或者通过收获被转化的细胞以便(vi)得到纯化的rFVIII。
在其它方面，通过在经表征是能生产药理学上可接受的rFVIII分子的合适的原核或者真核寄主系统中表达来生产rFVIII。真核细胞的例子有哺乳动物细胞，比如CHO、COS、HEK293、BHK、SK-Hep和HepG2。
在另一方面，很宽范围内的载体可被用于制备rFVIII，它们选自真核和原核表达载体。用于原核表达的载体的例子包括质粒，比如但不限于，pRSET、pET和pBAD，其中用于原核表达载体中的启动子包括但不限于，一种以上lac、trc、trp、recA或者araBAD。用于真核表达的例子包括：(i)对于在酵母中表达，载体比如是但不限于pAO、pPIC、pYES或者pMET，使用的启动子比如是但不限于AOXl、GAP、GAL1或者AUG1；(ii)对于在昆虫细胞中表达，载体比如是但不限于pMT、pAc5、pIB、pMIB或者pBAC，使用的启动子比如是但不限于PH、p10、MT、Ac5、OpIE2、gp64或者polh；和(iii)对于在哺乳动物细胞中表达，载体比如是但不限于pSVL、pCMV、pRc/RSV、pcDNA3或者pBPV，并且在一个方面，载体是来源于病毒系统比如但不限于牛痘病毒、腺相关病毒、疱疹病毒或者逆转录酶病毒的载体，使用的启动子比如是但不限于CMV、SV40、EF-I、UbC、RSV、ADV、BPV和β-肌动蛋白。
在某些方面，可通过多种化学方法(Roberts JM等人,Advan Drug Delivery Rev2002；54:459-76)中的任何一种将FVIII分子偶联至水溶性聚合物上。比如，在一个实施方式中，通过使用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯将PEG偶联至蛋白质上游离氨基基团，使FVIII聚乙二醇化。在另一个实施方式中，水溶性聚合物比如PEG，通过利用马来酰亚胺的化学性质将PEG偶联至游离SH基团，或者在事先氧化后使PEG酰肼或PEG胺偶联至FVIII的碳水化合物部分。
在另一个实施方式中，FVIII可被偶联至其他的水溶性聚合物，其中水溶性聚合物比如是聚环氧烷、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚噁唑啉、聚丙烯酰基吗啉、碳水化合物或者多糖如聚唾液酸(PSA)或者葡聚糖。水溶性聚合物的偶联可以通过直接偶联至蛋白质或者经由连接物分子来进行。化学连接物的一个例子是MBPH(4-[4马来酰亚胺基苯基]丁酸肼)，其包含碳水化合物选择性的酰肼和具巯基反应性的马来酰亚胺基团(Chamow等人,J Biol Chem 1992；267:15916-22)。
偶联可以通过在形成稳定的键的条件下将水溶性聚合物直接偶联(或者通过连接物系统偶联)至凝血因子VIII而进行。此外，可降解的、可释放的、可水解的连接物系统可以被用于本发明(Tsubery等人J Biol Chem 2004；279:38118-24/Greenwald等人,J Med Chem1999；42:3657-67/Zhao等人,Bioconj Chem 2006；17:341-51/WO2006/138572A2/US7259224B2/US7060259B2)。
正如此处所讨论的，本发明的一个实施方式是将被活化的水溶性聚合物偶联至FVIII中被氧化的碳水化合物部分。此处使用的术语“被活化的水溶性聚合物”指的是用于与FVIII偶联的具有活性功能性基团的水溶性聚合物，该活性功能基团允许水溶性聚合物化学偶联至连接物或者直接偶联至FVIII(含有活性醛基)。此处使用的术语“被氧化的碳水化合物部分”指的是含有游离醛基的FVIII，游离醛基通过氧化剂如NaIO4产生。在本发明的一个方面，醛活化的葡聚糖(含有活性醛基)通过二酰肼连接物被偶联至FVIII的醛基。
根据FVIII的糖基化模式(Lenting等人；Blood,92:3983-96(1998))，FVIII通过碳水化合物部分的偶联应当很可能发生在FVIII的B结构域。将B结构域作为这种偶联反应的目标是期望的，因为B结构域在FVIII的活性中不起作用。酶促糖基偶联被描述在美国专利2008/00700275中。
在本发明的一个实施方式中，通过利用包含活性N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)例如琥珀酰亚胺琥珀酸酯、琥珀酰亚胺戊二酸酯或者琥珀酰亚胺丙酸酯的聚乙二醇衍生物，经由赖氨酸残基来修饰FVIII。这些衍生物在温和条件下与FVIII中的赖氨酸残基反应形成一种稳定的酰胺键。在本发明的一个实施方式中，PEG衍生物的链长是5,000道尔顿。链长是500至2000道尔顿、2000至5000道尔顿、大于5000至10000道尔顿或者大于10000直至20000道尔顿、或者大于20000直至150000道尔顿的其他PEG衍生物，包括线性和支链的结构，被用于不同的实施方式。
用于氨基聚乙二醇化的另一个方法是与PEG碳酸酯通过形成氨基甲酸乙酯键的化学偶联，或者通过还原胺化形成第二个酰胺键的与醛类或者酮类的反应。
在本发明中，FVIII分子是使用市场上可买到的PEG衍生物而被化学修饰的。这些PEG衍生物可以具有线性或者支链结构。包含NHS基团的PEG衍生物例子列于下文中。
下列PEG衍生物是购自内科塔治疗公司(NektarTherapeutics)(Huntsville,Ala.；参见www.nektar.com/PEG试剂目录；Nektar Advanced PEGylation,价格表2005-2006)的例子：
mPEG-丙酸琥珀酰亚胺酯(mPEG-SPA)
mPEG-α-甲基丁酸琥珀酰亚胺酯(mPEG-SMB)
mPEG-CM-HBA-NHS(CM＝羧甲基；HBA＝羟基丁酸)
支链PEG衍生物(内科塔治疗公司)的结构：
支链PEG N-羟基琥珀酰亚胺(mPEG2-NHS)
具有支链结构的试剂被Kozlowski等人详细描述(BioDrugs 2001；5:419-29)。
PEG衍生物的其他例子可购自NOF公司(东京，日本；参见www.nof.co.jp/english:Catalogue 2005)
线性PEG衍生物(NOF公司)的通用结构：:
X＝羧甲基
X＝羧戊基
X＝琥珀酸酯
mPFG琥珀酸琥珀酰亚胺酯
X＝戊二酸酯
mPEG戊二酸琥珀酰亚胺酯
支链PEG衍生物(NOF公司)的结构：2,3-双(甲基聚氧乙烯-氧基)-1-(1,5-二氧代-5-琥珀酰亚胺氧基，戊氧基)丙烷
2,3-双(甲基聚氧乙烯-氧基)-1-(琥珀酰亚胺羧基戊氧基)丙烷
这些丙烷衍生物显示一种具有1,2取代型式的丙三醇主链。在本发明中，也可以使用基于具有1,3取代的丙三醇结构的支链PEG衍生物或者在美国2003/0143596A1中描述的其它支链结构。
可以被降解的PEG衍生物(比如可水解的连接物)，如Tsubery等人(J Biol Chem2004；279:38118-24)和Shechter等人(WO04089280A3)所描述的那些，也可以被用于本发明。
令人惊奇的是，本发明的聚乙二醇化的FVIII呈现了全部的功能性活性，以及延长了的FVIII体内半衰期。另外聚乙二醇化的rFVIII似乎是更加抗凝血酶失活。这通过多种体外和体内方法显示出来，并且通过下列实施例显示出来。
此处使用的“唾液酸部分”包括唾液酸单体或者聚合物(“多糖”)，可溶于水溶液或者悬浮液，并且在PSA-FVIII偶聚物以药物有效量被给药后，对哺乳动物有很少或者没有负面影响比如副作用。这里对本发明使用的唾液酸单元没有特定的限制。在一个方面，该聚合物的特征是具有1至4个单元。在某些方面，不同的唾液酸单元被组合于一条链中。
在本发明的多个方面，唾液酸部分比如通过美国专利4,356,170描述的方法(被并入本文以供参考)被连接至FVIII。在本发明的不同的实施方式中，多糖化合物是一种天然存在的多糖、天然存在的多糖的衍生物、或者一种天然存在的多糖衍生物。通常，化合物中的所有的糖类残基是唾液酸残基。
偶联PSA至多肽的其他技术也是已知的。比如美国公布号2007/0282096描述了比如将PSA的胺类或者酰肼衍生物偶联至蛋白质。此外，美国公布号2007/0191597描述了包含醛基的PSA衍生物用于在还原末端与底物(比如蛋白质)发生反应。
在本发明的一个实施方式中，多糖化合物中的多聚唾液酸部分是高度亲水性的，并且在另一个实施方式中，整个化合物是高度亲水性的。亲水性主要是通过唾液酸单元的侧位羧基以及羟基被赋予的。糖类单元可以包含其它官能团，比如胺类、羟基或者硫酸酯基、或它们的组合物。这些基团可以存在于天然存在的糖类化合物上，或者被引入至衍生的多糖化合物中。
在一个方面，特别可用于本发明的多糖化合物是那些通过细菌生成的多糖化合物。这些天然存在的多糖中的一些已知是糖脂。在一个实施方式中，多糖化合物基本上不含末端半乳糖单元。
在本发明的一个实施方式中，蛋白质的构建体的体内半衰期被延长。在一个相关的实施方式中，与没有连接水溶性聚合物的FVIII相比，蛋白质构建体的体内半衰期被延长至少两倍；而在另一个实施方式中，体内半衰期被延长至少三倍。
在一个实施方式中，本发明的蛋白质构建体可以通过注射比如静脉内、肌肉内或者腹膜内注射被给药。
在一个方面，为了将包含本发明的蛋白质构建体的组合物给药于人或者试验用动物，组合物可包含一种以上药学上可接受的载体。术语“药学上”或者“药学上可以接受的”指的是稳定的分子实体和组合物，可以抑制蛋白质降解例如凝聚和裂解产物，另外当采用如下所述的本领域中已知的途径被给药时没有产生过敏或者其它不良反应。“药学上可接受的载体”包括任何临床使用的溶剂、分散介质、涂层、抗菌和抗真菌的试剂、等渗试剂和吸收延迟试剂及其类似物，包括上述公开的那些试剂。
此处使用的“有效量”包括适用于治疗如上所述具有出血性疾病的哺乳动物的剂量。
组合物可以经口服、局部、经皮、肠胃外、喷雾吸入、阴道、直肠或者颅内注射被给药。此处使用的术语肠胃外包括皮下注射、静脉内、肌肉内、脑内注射或者输液技术。也预期采用静脉内、皮内、肌肉内、乳房内、腹膜内、鞘内注射、眼球后、肺内注射和或在特定位置的外科手术植入的给药。一般来讲，组合物基本不含热原以及其它对接受者有害的杂质。
组合物的单次或者多次给药可以根据治疗医生选择的剂量水平和模式来进行。对于预防或者治疗疾病，适当的剂量取决于如上所述治疗的疾病类型、严重程度和疾病过程、药物是否是被给药用于预防目的或者治疗目的、先前疗法、病人临床病史和对药物的反应和主治医师的判断。
本发明还涉及一种包含上述有效量蛋白质构建体的药物组合物。药物组合物可以进一步包含一种药学上可以接受的载体、稀释剂、盐、缓冲剂或者赋形剂。药物组合物可以被用于治疗上述出血性疾病。本发明的药物组合物可以是一种溶液或者一种冻干制品。药物组合物溶液可以经受任何适当的冻干处理。
作为附加的方面，本发明包括包含本发明组合物的试剂盒，以一种便于向个体给药的方式被包装。在一个实施方式中，这种试剂盒包括此处描述的化合物或者组合物(比如包含蛋白质构建体的组合物)，该化合物或组合物被包装在一个容器比如密封瓶或者器皿中，有标签粘贴在容器上或者被包括在包装内，该标签描述了在实施该方法中化合物或者组合物的使用。在一个实施方式中，试剂盒包含具有包含蛋白质构建体的组合物的第一容器和具有用于复配第一容器中组合物的生理学上可以接受溶液的第二容器。在一个方面，化合物或者组合物以单位剂量的形式被包装。试剂盒可以进一步包括适用于根据特定给药途径将组合物给药的装置。优选地，试剂盒包含描述治疗用蛋白质或者肽组合物的使用的标签。
实施例
实施例1
用mPEG琥珀酸琥珀酰亚胺酯进行rFVIII中赖氨酸残基的聚乙二醇化
把来源于Advate生产方法的rFVIII主体溶液(3400U/ml)通过使用含有0.5％蔗糖和0.1％吐温80的20mM Hepes缓冲剂、150mM NaCl(pH 7.4)用Econo-Pac 10DG柱(伯乐公司)进行凝胶过滤。然后在温和搅拌下将链长是5000道尔顿的mPEG琥珀酸琥珀酰亚胺酯(Abuchowski等人.Cancer Biochim Biophys 1984；7:175-86)(PEG-SS 5000))加至溶液中(5mg PEG-SS/mg蛋白质)，通过滴加0.5M的NaOH，pH值调至7.4。然后在温和搅拌下在室温下进行聚乙二醇化1小时。
随后反应混合物被加至存在于含有0.5％蔗糖和0.1％吐温80的20mM Hepes缓冲剂、150mM NaCl(pH 7.4)中的已预平衡的离子交换色谱树脂上(Fractogel EMD TMAE 650M/Pharmacia XK-10柱,床高15.0cm)。然后用20CV的平衡缓冲液洗涤柱子以便去除多余的试剂，用洗脱缓冲液(20mM Hepes、1.0M NaCl、0.5％蔗糖、0.1％吐温80，pH 7.4)洗脱聚乙二醇化的rFVIII。利用由截断分子量为30kD的再生纤维素组成的膜，使用由20mM Hepes、150mM NaCl、0.5％蔗糖(pH 7.4)组成的缓冲体系，通过超滤/渗滤来浓缩洗脱物。
实施例2
体外进行聚乙二醇化rFVIII的生物化学表征
来源于Advate生产方法的rFVIII按实施例1进行聚乙二醇化，对聚乙二醇化FVIII产物进行生化表征。PEG-rFVIII的功能活性通过利用FVIII显色试验(Rosen S,Scand JHaematol 1984；33(增刊l 40):139-45)进行测定。该方法是基于Ph.Eur.第5版(5.05)2.7.4，“凝血因子VIII的凝血试验”。
在含钙的缓冲液中，将包含凝血因子VIII(FVIII:C)的样品与凝血酶、被活化的凝血因子(FIXa)、磷脂和凝血因子X(FX)相混合。FVIII被凝血酶激活，随后与磷脂、FIXa和钙形成一种复合体。这个复合体激活凝血因子X成凝血因子Xa，凝血因子Xa反过来切割显色底物FXa-1(AcOH*CH3OCO-D-CHA-Gly-Arg-pNA)。利用微酶标仪(micro platereader)在405nm处测定对位硝基苯胺(pNA)的释放时间过程。反应的斜率与样品中的凝血因子VIII浓度成正比。利用市售的ELISA系统(Cedarlane,Hornby,Ontario,加拿大)稍加修改来测定FVIII抗原值。由这些数值计算FVIII生色团/FVIII抗原的比值。通过在280nm处测定吸光度来确定制品中的蛋白质含量。由这些数据计算蛋白质含量(Hoyer LWin:人类蛋白质数据.Installments 1-6；Heberli Ed.；Wiley V C H,Weinheim,德国,1998)并被表示为mg/ml。
表1
表1的数据显示，在聚乙二醇化rFVIII制品中，与天然rFVIII的生物活性(100％)相比，生物活性(通过FVIII显色活性与FVIII抗原的比值表示)恢复至大于90％。
实施例3
通过SDS-PAGE和免疫印迹法表征聚乙二醇化的rFVIII
根据厂商说明书，使用购自Invitrogen公司(Carlsbad,Calif.,美国)的4-12％聚丙烯酰胺梯度凝胶，在还原条件下用SDS PAGE表征天然rFVIII。使用购自伯乐公司(Bio-Rad)(Hercules，Calif.，美国)Precision Plus标称物(10kD-250kD)作为分子量标记物。然后通过电印迹，蛋白质被转移至购自伯乐公司(Hercules，Calif.，美国)的PVDF膜上，随后与购自Cedarlane公司(Hornby,Ontario,加拿大)的多克隆的羊抗人FVIII:C抗体一起温育。免疫染色程序的最后的步骤是与购自Accurate公司(Westbury,N.Y.，美国)的偶联碱性磷酸酶(ALP)的抗羊抗体一起温育，继之以通过利用ALP底物试剂盒(伯乐，Hercules,Calif.,美国)进行最终的显现。结果被总结在图1中。印迹图显示了天然的和聚乙二醇化rFVIII的域结构。研究表明，聚乙二醇化的rFVIII比天然的重组蛋白质条带更宽，且分子量更高。
实施例4
在FVIII缺陷型小鼠敲除模型中聚乙二醇化rFVIII的药代动力学
Bi等人(Nat Genet 1995；10:119-21)详细描述的FVIII缺陷型小鼠被用作严重人类甲型血友病的模型。以200IU FVIII/kg体重的剂量，每组5只小鼠的各组通过尾静脉通过弹丸注射(bolus injection)(10ml/kg)接受根据实施例1制备的PEG-rFVIII(PEG-SS，5K)或者天然的rFVIII。注射后5分钟、3、6、9和24小时，在麻醉之后通过心穿刺术由各个组制备柠檬酸盐血浆。测定血浆样品中FVIII活性水平。这个实验的结果总结在表2中。平均半衰期从1.9小时(天然rFVIII)增加至4.9小时(聚乙二醇化的rFVIII)，曲线下面积(AUC)从13.0小时增加至25.2小时*IU/ml。利用来自药代动力学文库(pharmacokineticlibrary)(MicroMath,Saint Louis,Mo.,美国)的MicroMath Scientist 1型进行半衰期的计算。
实施例5
通过SDS-PAGE和免疫印迹法技术对rFVIII聚乙二醇化的详细分析
在60℃下，用1nM凝血酶消化天然的和聚乙二醇化的rFVIII60分钟，导致FVIII分子特异性裂解产生很好限定的裂解产物。按照在实施例3中所述的方法，通过SDS-PAGE、继之以电印迹法分开这些重链和轻链片段。使用抗重链A1和A2结构域、B结构域和轻链N-末端A3结构域的多克隆抗体和单克隆抗体，以显示裂解产物。
如图3所示，所有的结构域都被聚乙二醇化，虽然程度不同。B结构域被高度聚乙二醇化。重链的A1和A2结构域两者均被部分聚乙二醇化。在轻链A3结构域中可以观察到不同的聚乙二醇化程度(单聚乙二醇化、二聚乙二醇化、三聚乙二醇化......)。与实施例6一致，聚乙二醇化FVIII似乎更加耐受凝血酶。
实施例6
聚乙二醇化rFVIII的凝血酶抗性
FVIII的体外凝血酶处理导致它的促凝血活性急剧增加和随后的减少。活化和失活速度取决于凝血酶浓度和FVIII的完整性，可通过如下FIXa辅助因子实验监测：
在37℃下FVIII和0.5nM或1nM凝血酶一起被温育。在0.5至40分钟之间的时间间隔内抽取子样品，并被添加至还含有特异性凝血酶抑制剂的FIXa、FX、PL-微脂粒(vesicle)和CaCl2的混合物中以便终止进一步的受凝血酶调节的反应，并保温3分钟。子样品被添加至显色底物，显色底物被FXa选择性切割并含有EDTA以终止进一步的Xa活化。在15分钟温育后，用乙酸终止反应。与FXa浓度成比例的吸光度(A405)数值，在酶联免疫检测仪上被测定并通过使用被纯化的FXa参考曲线而被换算为FXa浓度。产生的FXa浓度相对于用凝血酶温育的时间而绘图。
通过用单指数拟合来拟合曲线的下降部分来确定FVIII的准一级失活速度。
表2
如在图4和表2中所示，聚乙二醇化的rFVIII在两个被应用的凝血酶浓度下都显示了更慢的失活速度。
实施例7
用支链的2,3-二(甲基聚氧乙烯基-氧基)-1-(1,5-二氧代-5-琥伯酰亚胺氧基，戊氧基)丙烷聚乙二醇化rFVIII中的赖氨酸残基
由来源于Advate生产方法的含有489IU FVIII/ml的母液制备出在含有150mM NaCl、0.5％蔗糖和0.1％吐温80的20mM Hepes缓冲液(pH 7.4)中的rFVIII溶液。支链PEG戊二酸琥珀酰亚胺酯(PEG-SG)试剂(2,3-双(甲基聚乙氧基-氧基-1-(1,5-二氧代-5-琥伯酰亚胺氧基，戊氧基)丙烷)购自NOF公司(东京，日本)，具有20KD的分子量，在温和搅拌下被添加至153ml的这个溶液中(5mg试剂/mg蛋白质)，10分钟后通过逐滴加入0.5M的NaOH，pH值被调至7.4。然后在温和搅拌下，在室温下进行rFVIII的聚乙二醇化1小时。
随后反应混合物以1厘米/分钟的线性流速被加至在含有0.5％蔗糖和0.1％吐温80的20mM Hepes缓冲剂(pH 7.4)、150mM NaCl中的已预平衡的离子交换色谱树脂上(Fractogel EMD TMAE 650M/Pharmacia XK-50柱,床高14.5cm)。然后用25CV的平衡缓冲液洗涤柱子以便去除多余的试剂(线性流速：2厘米/分钟)，用洗脱缓冲液(20mMHepes、1.0M NaCl、0.5％蔗糖0.1％吐温80，pH 7.4)以0.5厘米/分钟的线性流速洗脱聚乙二醇化的rFVIII。利用由截断分子量为30kD的再生纤维素组成的膜，使用由20mMHepes、150mM NaCl、0.5％蔗糖(pH 7.4)组成的缓冲体系，通过超滤/渗滤来浓缩洗脱物。
实施例8
用支链PEG-SG 20KD聚乙二醇化的rFVIII的体外表征
根据实施例7，使用支链PEG-SG试剂对来源于Advate生产方法的rFVIII经由赖氨酸残基进行聚乙二醇化，并且被聚乙二醇化的FVIII产物按照实施例2所述方法进行生化表征。
表3
表3的数据显示，在聚乙二醇化的rFVIII制品中，与天然rFVIII的生物活性(100％)相比，生物活性(通过FVIII显色活性与FVIII抗原的比值表示)被完全恢复。
按照实施例3所述的方法，通过SDS-PAGE和免疫印迹法技术在还原条件下通过使用4-12％聚丙烯酰胺梯度凝胶来表征聚乙二醇化rFVIII。结果被总结在图5中。印迹图显示了天然的和聚乙二醇化的rFVIII的域结构。结果表明，聚乙二醇化rFVIII比天然的重组蛋白质条带更宽，且分子量更高。
为了通过SDS-PAGE和免疫印迹法更加详细地分析rFVIII制品的聚乙二醇化，按照实施例5中所描述的方法，在60℃下用1nM凝血酶消化天然的和聚乙二醇化的rFVIII 60分钟，导致FVIII分子特异性裂解成很好限定的裂解产物。通过SDS-PAGE、继之以电印迹分开各片段，通过不同的抗FVIII抗体来显示。如图6所示，所有的结构域都被聚乙二醇化，虽然程度不同。B结构域被高度聚乙二醇化。在轻链A3结构域中，可以观察到不同的聚乙二醇化程度(单聚乙二醇化、二聚乙二醇化、三聚乙二醇化)。结果显示，聚乙二醇化的FVIII似乎更加耐受凝血酶。
凝血酶的活化和失活速度，通过实施例6所述的FIXa辅助因子试验进行检测。通过用单指数拟合来拟合曲线的下降部分来确定FVIII的准一级失活速度。
表4
如在图7和表4中所示，聚乙二醇化的rFVIII在两个被应用的凝血酶浓度下都显示了更慢的失活速度。
实施例9
rFVIII通过碳水化物部分的聚乙二醇化
为通过碳水化合物残基制备PEG-rFVIII偶联物，在25mM磷酸缓冲液(pH6.7)中制备出rFVIII溶液(最终浓度：1.2mg/ml)。添加NaIO4(最终浓度0.3mM)使碳水化合物残基氧化(Roberts等人；Advanced Drug Del Rev.；54:459-76(2002)；Meir and Wilchek；Meth Enzymol；l38:429-42(1987))。通过添加丙三醇至最终浓度10％来猝灭反应，并且使用Amicon Micron-10装置(Amicon,Billerica,MA)重复离心来分离多余试剂。添加PEG-酰肼(MW 3300Da/Nektar,Huntsville,阿拉巴马州)至最终浓度1.5mM。然后在室温下进行聚乙二醇化2小时。随后，获得的偶联物和多余试剂通过使用25mM磷酸缓冲液在Amicon Micron-10装置上重复离心而被分离。
实施例10
用PSA-肼使rFVIII聚唾液酸化
为通过碳水化合物残基制备PSA-rFVIII偶联物，在20mM醋酸钠缓冲液(pH6.0)中制备出rFVIII溶液(最终浓度：1mg/ml)。添加NaIO4(最终浓度0.25mM)使碳水化合物残基氧化。氧化在4℃下，在黑暗中进行60分钟。添加亚硫酸氢钠(最终浓度25mM)以便中止反应。多余过碘酸钠通过在DG-10柱子(伯乐公司)上凝胶过滤被分离。随后，添加链长是20kD的PSA-肼(根据WO 2006/016168制备)(最终浓度10mM)。聚唾液酸化步骤在室温下进行2小时。通过HIC在丁基琼脂糖凝胶(通用电气医疗集团(GE-Healthcare))上纯化聚唾液酸化的rFVIII。添加5M的NaCl溶液至混合物中至最终浓度3M NaCl。这个混合物被加至装填了丁基-琼脂糖凝胶(通用电气医疗集团)的柱子上，并且用含有6.7mM CaCl2的50mM的Hepes缓冲液(pH7.4)进行rFVIII-PSA偶联物的洗脱。在偶联物洗脱后，pH被调至6.9。
实施例11
聚唾液酸的纯化和衍生化
按照在WO06016161A1中所描述的方法，通过在Q-琼脂糖凝胶FF上的阴离子交换色谱法来纯化聚唾液酸。5克PSA被溶解在50ml含有25mM NaCl的10mM三乙醇胺缓冲液(pH7.4)(＝起始缓冲液)中。此溶液被加至装填了Q-琼脂糖凝胶FF(通用电气医疗集团，慕尼黑，德国)的PharmaciaXK50柱子上，柱子已用起始缓冲液平衡。接着柱子用8个柱体积(CV)的起始缓冲液洗涤，用3CV分别含有200mM NaCl、350mM NaCl、500mM NaCl的起始缓冲液中逐步地洗脱被结合的PSA。SDS凝胶电泳显示了用350mMNaCl洗脱的组分具有20kDa的分子量。使用由再生纤维素制成的5kD的膜(Millipore,Billerica,MA)进行超滤来浓缩该组分，并且用50mM(pH 7.2)的磷酸缓冲液进行渗滤。用NaIO4氧化PSA，并且按照WO05016973A1所描述的方法通过还原胺化反应而引入末端伯胺基团。为了进行还原胺化反应，11mL的2M NH4Cl溶液被添加至20mL的含有58mg/ml氧化PSA的50mM磷酸缓冲液(pH 7.2)溶液中。然后添加含有5M NaCNBH3的1M NaOH溶液至最终浓度是75mM。反应在室温、pH 8.0下进行5天。
然后混合物用含有10mM NaCl的(NH4)2CO3溶液(50mg/L)透析随后用含有5mMEDTA的50mM磷酸缓冲液(pH8.0)透析。接着通过末端伯胺基团与2-亚氨基硫杂环戊烷(iminothiolane)(Traut's试剂/Pierce,Rockford,伊利诺伊州)进行反应而引入氢硫基。在室温下在含有5mM EDTA的50mM磷酸缓冲液(pH8.0)中与20倍摩尔过量的试剂进行反应1小时。最终的含末端游离SH基的PSA溶液，使用截断分子量为5kD的由再生纤维素(Millipore,Billerica,MA)制成的膜进行超滤/渗滤。
实施例12
利用异双官能交联剂的rFVIII的聚唾液酸化
为了偶联PSA-SH至rFVIII，使用包含碳水化合物选择性的酰肼和巯基反应性的马来酰亚胺基团的异双官能交联剂MBPH(4-[4-N-马来酰亚胺基苯基]丁酸肼盐酸盐，Pierce,Rockford,伊利诺伊州)(Chamow等人,J Biol Chem；267:15916-22(1992))。根据实施例11制备含有活性巯基的PSA-SH。
根据厂商说明书，使用脱盐柱子(伯乐公司，Econopac 10DG)将2ml rFVIII(638mg，3.856mg/ml蛋白质浓度)转移至氧化缓冲液(50mM乙酸钠，pH 6)中。然后用0.25mMNaIO4(默克公司)氧化蛋白质(在黑暗中在4℃下1小时)。用最终浓度10％的丙三醇猝灭氧化反应。根据厂商说明书，使用脱盐柱子(伯乐公司，Econopac 10DG)去除丙三醇和NaIO4，并将蛋白质转移至反应缓冲液(50mM磷酸钠，pH6.5)中。含有1mg MBPH/mg蛋白质和PSA-SH(对蛋白质而言200倍摩尔过量)的混合物接着在室温、pH6.5下温育2小时。根据厂商说明书，使用脱盐柱子(伯乐公司Econopac 10DG)去除多余连接物并且将连接物-PSA偶联物转移至反应缓冲液中。
MPBH-PSA偶联物被加至被氧化的rFVIII(0.105mg/ml蛋白质)中，反应混合物在室温下温和摇动温育2小时。rFVIII-PSA偶联物通过使用预装的丁基琼脂糖凝胶柱子(通用电气医疗基团，丁基HiTrapFF 5ml)的HIC进行纯化。为使偶联物和丁基琼脂糖凝胶间形成疏水性相互作用，样品被冷却至2-8℃，并添加含有5M NaCl的缓冲液(50mM Hepes、5M NaCl、6.7mM CaCl2、0.01％吐温，pH 6.9)来将反应混合物的离子浓度增加至电导率大约为185mS/cm。反应混合物以1.2厘米/分钟的流速被加载至用平衡缓冲液(pH6.9)(含有50mM Hepes、3M NaCl、6.7mM CaCl2、0.01％吐温80)平衡的柱子上。用10个柱体积(CV)的平衡缓冲液洗出未结合的样品。用低离子强度的缓冲剂(pH7.4)(50mMHepes、6.7mM CaCl2)以1.2厘米/分钟的流速洗脱偶联物。在色谱分离过程期间，使用冰浴冷却样品和缓冲液。最终，洗脱物的pH被调至6.9。
实施例13
rFVIII与葡聚糖的偶联
对于rFVIII与葡聚糖的偶联，根据厂商说明书，使用脱盐柱子(伯乐公司，Econopac10DG)，将2ml rFVIII(638mg，3.4mg/ml蛋白质)转移至氧化缓冲液(50mM乙酸钠，pH 6)中。然后用0.25mM NaIO4氧化蛋白质(在黑暗中在4℃下1小时)。根据厂商说明书，首先用30kDa截留分子量(MWCO)的Vivaspin超滤离心柱(Sartorius Stedim BiotechGmbH)浓缩被氧化的蛋白质。接着用反应缓冲液(50mM磷酸钠，pH 7)在4℃下透析样品过夜。
在透析之后，添加26.58mg己二酸二酰肼(ADH)(Sigma)(500倍摩尔过量)，并将反应混合物在室温、pH 7下温和摇动温育2小时。根据厂商说明书，使用脱盐柱子(伯乐公司Econopac 10DG)去除ADH。添加10mg的醛活化的葡聚糖(Pierce)(对蛋白质而言17倍摩尔过量)，并且混合物在室温、pH7下温育2小时。
在Q-琼脂糖凝胶HP(通用电气医疗基团)上通过IEX色谱分离法纯化偶联物。样品以0.5ml/分钟的流速被加载至柱子(6.4mm x 3cm,V＝1ml))上，该柱子预先用缓冲液A(50mM磷酸钠，pH 6.8)平衡。用5CV的缓冲剂A洗出未结合的样品。最终，用线性盐梯度(10CV的0-100％缓冲剂B[50mM磷酸钠pH 6.8+1M NaCl])以0.5ml/分钟的流速洗脱偶联物。

Claims (18)

1.一种组合物，其包含含有天然凝血因子VIII的偶联物，所述天然凝血因子VIII通过连接水溶性聚合物而被修饰，所述水溶性聚合物经由被氧化的碳水化物部分而连接于被修饰后的凝血因子VIII。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述修饰后的凝血因子VIII保留了至少50％的天然凝血因子VIII活性，优选保留了至少80％的天然凝血因子VIII活性。
3.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述组合物基本不含白蛋白。
4.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述水溶性聚合物经由连接物而连接于被氧化的碳水化物部分，所述连接物优选为可释放的或可水解的，更优选为4-[4-N-马来酰亚胺基苯基]丁酸肼(MBPH)。
5.如前述权利要求任一项所述的组合物，其中所述碳水化物部分位于天然凝血因子VIII的B结构域中。
6.如前述权利要求任一项中所述的组合物，其中所述水溶性聚合物选自于由聚乙二醇(PEG)、聚唾液酸(PSA)和葡聚糖构成的组。
7.如前述权利要求任一项中所述的组合物，其中所述凝血因子VIII是重组凝血因子VIII或血浆凝血因子VIII。
8.如前述权利要求任一项所述的组合物，其进一步包含未偶联的凝血因子VIII部分。
9.一种用于治疗出血性疾病的组合物，其中所述组合物包含：
(i)如权利要求1至8任一项中所述的组合物；和
(ii)药学上可接受的赋形剂。
10.如权利要求9所述的组合物在制备治疗出血性疾病的药物中的应用。
11.如权利要求10所述的应用，其中所述治疗包含：
(i)根据出血性疾病的类型和个体临床病史确定组合物的剂量；和
(ii)给药组合物。
12.使得凝血因子VIII分子在患有出血性疾病个体内有效维持在至少1％水平的药物组合物的单位剂量，其包含：
(i)如权利要求1至8任一项中所述的组合物；
(ii)药学上可接受的赋形剂。
13.如权利要求8所述的组合物或如权利要求10所述的应用或如权利要求11所述的单位剂量，其中所述出血性疾病是血友病A。
14.如权利要求12所述的单位剂量，其中所述药物组合物呈适于注射的形式。
15.如权利要求12所述的单位剂量，其中所述药物组合物被包装在器皿中。
16.一种包含药物组合物的一种试剂盒，其包含：
(i)如权利要求1至8任一项中所述的组合物；和
(ii)药学上可接受的赋形剂，
被包装在含有标签的容器内，该标签描述了所述药物组合物的用途。
17.一种包含第一容器的试剂盒，包含：
(i)如权利要求1至8任一项中所述的组合物；和
(ii)药学上可接受的赋形剂；
和包含用于复配第一容器中组合物的生理学上可以接受的溶液的第二容器，其中所述试剂盒和描述所述组合物用途的标签一起被包装。
18.如权利要求16或17所述的试剂盒，其特征在于所述药物组合物以单位剂量的形式被包装。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108267590A (zh) * 2016-12-31 2018-07-10 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 Peg修饰蛋白的peg结合数检测方法
WO2019219049A1 (zh) * 2018-05-18 2019-11-21 北京辅仁瑞辉生物医药研究院有限公司 改进的fviii融合蛋白及其应用

Families Citing this family (60)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2004236174B2 (en) 2001-10-10 2011-06-02 Novo Nordisk A/S Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
US9005625B2 (en) * 2003-07-25 2015-04-14 Novo Nordisk A/S Antibody toxin conjugates
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
US20080300173A1 (en) 2004-07-13 2008-12-04 Defrees Shawn Branched Peg Remodeling and Glycosylation of Glucagon-Like Peptides-1 [Glp-1]
DK2586456T3 (en) 2004-10-29 2016-03-21 Ratiopharm Gmbh Conversion and glycopegylation of fibroblast growth factor (FGF)
MX350293B (es) 2004-11-12 2017-09-04 Bayer Healthcare Llc Modificacion dirigida al sitio del factor viii.
EP1858543B1 (en) * 2005-01-10 2013-11-27 BioGeneriX AG Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
EP2386571B1 (en) * 2005-04-08 2016-06-01 ratiopharm GmbH Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants
US20070105755A1 (en) * 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
US20090048440A1 (en) 2005-11-03 2009-02-19 Neose Technologies, Inc. Nucleotide Sugar Purification Using Membranes
US7985839B2 (en) * 2006-03-31 2011-07-26 Baxter International Inc. Factor VIII polymer conjugates
US7645860B2 (en) * 2006-03-31 2010-01-12 Baxter Healthcare S.A. Factor VIII polymer conjugates
KR20080108147A (ko) 2006-03-31 2008-12-11 백스터 인터내셔널 인코포레이티드 페질화된 인자 ｖｉｉｉ
US7982010B2 (en) * 2006-03-31 2011-07-19 Baxter International Inc. Factor VIII polymer conjugates
EP2049144B8 (en) * 2006-07-21 2015-02-18 ratiopharm GmbH Glycosylation of peptides via o-linked glycosylation sequences
US20100075375A1 (en) * 2006-10-03 2010-03-25 Novo Nordisk A/S Methods for the purification of polypeptide conjugates
LT2068907T (lt) * 2006-10-04 2018-01-10 Novo Nordisk A/S Glicerolio sujungti pegilinti sacharidai ir glikopeptidai
ES2521490T3 (es) 2006-12-15 2014-11-12 Baxter International Inc. Conjugado de factor VIIa - ácido (poli)siálico con una vida media in vivo prolongada.
CN101796063B (zh) * 2007-04-03 2017-03-22 拉蒂奥法姆有限责任公司 使用糖聚乙二醇化g‑csf的治疗方法
ES2551123T3 (es) 2007-06-12 2015-11-16 Ratiopharm Gmbh Proceso mejorado para la producción de azúcares de nucleótido
CA2711503A1 (en) * 2008-01-08 2009-07-16 Biogenerix Ag Glycoconjugation of polypeptides using oligosaccharyltransferases
MX2010009154A (es) 2008-02-27 2010-09-09 Novo Nordisk As Moleculas conjugadas del factor viii.
KR101929641B1 (ko) * 2008-10-17 2018-12-14 박스알타 인코퍼레이티드 낮은 수준의 수용성 중합체를 포함하는 개질된 혈액 인자
LT2393828T (lt) 2009-02-03 2017-01-25 Amunix Operating Inc. Prailginti rekombinantiniai polipeptidai ir juos apimančios kompozicijos
US8809501B2 (en) * 2009-07-27 2014-08-19 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
US8642737B2 (en) 2010-07-26 2014-02-04 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
KR101832937B1 (ko) 2009-07-27 2018-02-28 박스알타 인코퍼레이티드 혈액 응고 단백질 복합체
SG10201401194VA (en) * 2009-07-27 2014-07-30 Lipoxen Technologies Ltd Glycopolysialylation of non-blood coagulation proteins
ES2590679T3 (es) 2009-07-27 2016-11-23 Lipoxen Technologies Limited Glicopolisialilación de proteínas diferentes a proteínas de coagulación de la sangre
EP2470559B1 (en) * 2009-08-24 2017-03-22 Amunix Operating Inc. Coagulation factor ix compositions and methods of making and using same
CN102770449B (zh) * 2010-02-16 2016-02-24 诺沃—诺迪斯克有限公司 具有降低的vwf结合的因子viii分子
CN103370082A (zh) 2010-07-30 2013-10-23 巴克斯特国际公司 用于肟键联的亲核性催化剂
EP2616486B1 (en) 2010-09-15 2019-01-02 Stichting Sanquin Bloedvoorziening Factor viii variants having a decreased cellular uptake
EA032056B1 (ru) 2010-12-22 2019-04-30 Баксалта Инкорпорейтид Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты, способы получения конъюгата терапевтического белка и производного жирной кислоты (варианты)
CA2836478A1 (en) 2011-05-27 2012-12-06 Baxter International Inc. Therapeutic protein conjugated to water-soluble polymers via reduced cysteine sulfhydryl group
TWI596110B (zh) 2011-09-23 2017-08-21 諾佛 儂迪克股份有限公司 新穎升糖素類似物
CN102584933A (zh) * 2012-02-13 2012-07-18 汪志友 一种利用亲和双水相系统提高凝血因子ⅷ及其类似物分离效率、纯度与生物比活性的方法
RS63870B1 (sr) 2012-02-15 2023-01-31 Bioverativ Therapeutics Inc Sastavi faktora viii i postupci za pravljenje i upotrebu istih
WO2013123457A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Biogen Idec Ma Inc. Recombinant factor viii proteins
EP3184542A1 (en) * 2012-05-14 2017-06-28 Novo Nordisk A/S Stabilised protein solutions
AU2013204754C1 (en) 2012-05-16 2018-10-11 Takeda Pharmaceutical Company Limited Nucleophilic Catalysts for Oxime Linkage
GB201210770D0 (en) * 2012-06-18 2012-08-01 Polytherics Ltd Novel conjugation reagents
AU2014255608B2 (en) 2013-04-18 2018-01-25 Novo Nordisk A/S Stable, protracted GLP-1/glucagon receptor co-agonists for medical use
TWI667255B (zh) 2013-08-14 2019-08-01 美商生物化學醫療公司 因子ｖｉｉｉ－ｘｔｅｎ融合物及其用途
CN106536547A (zh) 2014-06-04 2017-03-22 诺和诺德股份有限公司 用于医疗用途的glp‑1/胰高血糖素受体共激动剂
DK3177317T3 (en) 2014-08-04 2020-06-15 Csl Ltd Factor viii formulation
CN107406493B (zh) 2015-03-06 2021-08-13 康诺贝林伦瑙有限公司 具有改善的半衰期的经修饰的血管性血友病因子
JP2015155469A (ja) * 2015-06-01 2015-08-27 バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッドＢａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃｏｒｐ０Ｒａｔｅｄ 第ｆｖｉｉｉ因子ポリマー結合体
UA126016C2 (uk) 2015-08-03 2022-08-03 Біовератів Терапеутікс Інк. Злитий білок фактора іх
CN108884146A (zh) 2015-12-03 2018-11-23 百深公司 具有延长的半衰期及降低的配体结合性质的因子viii
MA45473A (fr) 2016-04-04 2019-02-13 Shire Human Genetic Therapies Inhibiteur de c1 estérase conjugué et ses utilisations
WO2018013525A1 (en) 2016-07-11 2018-01-18 Translate Bio Ma, Inc. Nucleic acid conjugates and uses thereof
CN107349459B (zh) * 2017-06-16 2019-11-26 大连理工大学 一种葡聚糖基止血抗菌促愈合材料及其制备方法
KR20190086269A (ko) * 2018-01-12 2019-07-22 재단법인 목암생명과학연구소 체내 지속형 재조합 당단백질 및 이의 제조방법
JP2018115170A (ja) * 2018-03-02 2018-07-26 バクスアルタ ゲーエムベーハー 第ｆｖｉｉｉ因子ポリマー結合体
TW202015723A (zh) 2018-05-18 2020-05-01 美商百歐維拉提夫治療公司 治療ａ型血友病的方法
US20220023430A1 (en) 2018-11-13 2022-01-27 Lipoxen Technologies Limited Glycopolysialylation of blinatumomab
WO2021001522A1 (en) 2019-07-04 2021-01-07 CSL Behring Lengnau AG A truncated von willebrand factor (vwf) for increasing the in vitro stability of coagulation factor viii
US20220348637A1 (en) 2019-11-11 2022-11-03 CSL Behring Lengnau AG Polypeptides for inducing tolerance to factor viii
WO2023170680A1 (en) 2022-03-08 2023-09-14 Equashield Medical Ltd Fluid transfer station in a robotic pharmaceutical preparation system

Family Cites Families (87)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4356170A (en) 1981-05-27 1982-10-26 Canadian Patents & Development Ltd. Immunogenic polysaccharide-protein conjugates
US4757006A (en) * 1983-10-28 1988-07-12 Genetics Institute, Inc. Human factor VIII:C gene and recombinant methods for production
US4965199A (en) 1984-04-20 1990-10-23 Genentech, Inc. Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection
US4970300A (en) * 1985-02-01 1990-11-13 New York University Modified factor VIII
EP0218692A4 (en) 1985-04-11 1988-03-22 Childrens Medical Center VON WILLEBRAND FACTOR.
EP0218712B1 (en) 1985-04-12 1992-02-26 Genetics Institute, Inc. Novel procoagulant proteins
US5198349A (en) * 1986-01-03 1993-03-30 Genetics Institute, Inc. Method for producing factor VIII:C and analogs
US5250421A (en) * 1986-01-03 1993-10-05 Genetics Institute, Inc. Method for producing factor VIII:C-type proteins
CA1339946C (en) 1987-03-31 1998-07-07 Michael J. Griffith Ultrapurification process for polypeptides
JPH0387173A (ja) 1987-09-10 1991-04-11 Teijin Ltd ヒト活性化天然型ファクター８ｃの製造方法及びそれに用いる形質転換体
US5605884A (en) 1987-10-29 1997-02-25 Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. Factor VIII formulations in high ionic strength media
US4877608A (en) 1987-11-09 1989-10-31 Rorer Pharmaceutical Corporation Pharmaceutical plasma protein formulations in low ionic strength media
US5153265A (en) * 1988-01-20 1992-10-06 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
US5252421A (en) * 1988-07-18 1993-10-12 Fuji Xerox Co., Ltd. Electrophotographic toner
US5122614A (en) * 1989-04-19 1992-06-16 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
SE465222C5 (sv) 1989-12-15 1998-02-10 Pharmacia & Upjohn Ab Ett rekombinant, humant faktor VIII-derivat och förfarande för dess framställning
DE4001451A1 (de) 1990-01-19 1991-08-01 Octapharma Ag Stabile injizierbare loesungen von faktor viii und faktor ix
SE466754B (sv) * 1990-09-13 1992-03-30 Berol Nobel Ab Saett att kovalent binda biopolymerer till hydrofila ytor
US5492821A (en) * 1990-11-14 1996-02-20 Cargill, Inc. Stabilized polyacrylic saccharide protein conjugates
WO1992016555A1 (en) 1991-03-18 1992-10-01 Enzon, Inc. Hydrazine containing conjugates of polypeptides and glycopolypeptides with polymers
US5595732A (en) 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
DE4111393A1 (de) 1991-04-09 1992-10-15 Behringwerke Ag Stabilisierte faktor viii-praeparationen
US5846951A (en) 1991-06-06 1998-12-08 The School Of Pharmacy, University Of London Pharmaceutical compositions
WO1993000357A1 (en) 1991-06-28 1993-01-07 Rhone-Poulenc Rorer International (Holdings) Inc. Therapeutic polypeptides based on von willebrand factor
US6037452A (en) * 1992-04-10 2000-03-14 Alpha Therapeutic Corporation Poly(alkylene oxide)-Factor VIII or Factor IX conjugate
WO1994005332A2 (en) 1992-09-01 1994-03-17 Berlex Laboratories, Inc. Glycolation of glycosylated macromolecules
WO1994007510A1 (en) * 1992-10-02 1994-04-14 Kabi Pharmacia Ab Composition comprising coagulation factor viii formulation, process for its preparation and use of a surfactant as stabilizer
NZ250375A (en) 1992-12-09 1995-07-26 Ortho Pharma Corp Peg hydrazone and peg oxime linkage forming reagents and protein derivatives
US5298643A (en) * 1992-12-22 1994-03-29 Enzon, Inc. Aryl imidate activated polyalkylene oxides
FR2700268B1 (fr) 1993-01-13 1995-03-31 Lvmh Rech Composition cosmétique ou pharmaceutique, notamment dermatologique, contenant un extrait de Vismia.
AU6029594A (en) 1993-01-15 1994-08-15 Enzon, Inc. Factor viii - polymeric conjugates
US5621039A (en) * 1993-06-08 1997-04-15 Hallahan; Terrence W. Factor IX- polymeric conjugates
US5919455A (en) 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
DE4435485C1 (de) 1994-10-04 1996-03-21 Immuno Ag Verfahren zur Gewinnung von hochreinem von Willebrand-Faktor
US5700873A (en) * 1995-03-07 1997-12-23 Adhesives Research, Inc. Method of preparation of water-soluble copolymer
US6127153A (en) 1995-06-07 2000-10-03 Neose Technologies, Inc. Method of transferring at least two saccharide units with a polyglycosyltransferase, a polyglycosyltransferase and gene encoding a polyglycosyltransferase
WO1996040731A1 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Pegylated modified proteins
SE9503380D0 (sv) 1995-09-29 1995-09-29 Pharmacia Ab Protein derivatives
US6005077A (en) 1995-11-10 1999-12-21 Immuno Aktiengesellschaft Use of von willebrand factor and pharmaceutical formulation
US6562781B1 (en) 1995-11-30 2003-05-13 Hamilton Civic Hospitals Research Development Inc. Glycosaminoglycan-antithrombin III/heparin cofactor II conjugates
US6214966B1 (en) 1996-09-26 2001-04-10 Shearwater Corporation Soluble, degradable poly(ethylene glycol) derivatives for controllable release of bound molecules into solution
AT405740B (de) 1996-12-13 1999-11-25 Immuno Ag Von willebrand-faktor-derivat sowie ein verfahren zur isolierung von proteinen
AT406867B (de) 1997-02-27 2000-10-25 Immuno Ag Verfahren zur gewinnung von hochreinem vwf oder faktor viii/vwf-komplex
EP0979102A4 (en) * 1997-04-30 2005-11-23 Enzon Inc DETAILED POLYPEPTIDE MODIFIED BY POLYALKYLENE OXIDE
US6183738B1 (en) * 1997-05-12 2001-02-06 Phoenix Pharamacologics, Inc. Modified arginine deiminase
AT405485B (de) 1997-05-28 1999-08-25 Immuno Ag Eine das vwf-propeptid enthaltende pharmazeutische präparation
ES2332435T3 (es) * 1997-06-04 2010-02-04 Oxford Biomedica (Uk) Limited Vector dirigido a tumores.
DK0985697T3 (da) 1998-03-24 2006-05-15 Nof Corp Oxiranderivater og fremgangsmåde til fremstilling deraf
EP2599503B1 (en) 1998-10-16 2017-05-17 Biogen MA Inc. Polymer conjugates of interferon beta-1A and uses thereof
DE19852729A1 (de) * 1998-11-16 2000-05-18 Werner Reutter Rekombinante Glycoproteine, Verfahren zu ihrer Herstellung, sie enthaltende Arzneimittel und ihre Verwendung
AT407750B (de) 1999-02-19 2001-05-25 Immuno Ag Verfahren zur herstellung einer vwf-präparation
JP5149470B2 (ja) 1999-02-22 2013-02-20 バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド 新規のアルブミンを含有していない第ｖｉｉｉ因子処方物
AU6357900A (en) 1999-07-20 2001-02-05 Amgen, Inc. Hyaluronic acid-protein conjugates, pharmaceutical compositions and related methods
US6531122B1 (en) * 1999-08-27 2003-03-11 Maxygen Aps Interferon-β variants and conjugates
CN1309423C (zh) * 1999-11-12 2007-04-11 马克西根控股公司 干扰素γ偶联物
SE515295C2 (sv) 1999-11-23 2001-07-09 Medicarb Ab Förfarande för framställning av konjugat av en biologiskt aktiv polysackarid och ett fast substrat, samt sådana konjugat
US7074878B1 (en) 1999-12-10 2006-07-11 Harris J Milton Hydrolytically degradable polymers and hydrogels made therefrom
US6413507B1 (en) 1999-12-23 2002-07-02 Shearwater Corporation Hydrolytically degradable carbamate derivatives of poly (ethylene glycol)
AU783512B2 (en) * 2000-02-11 2005-11-03 Bayer Healthcare Llc Factor VII or VIIa-like molecules
US6586398B1 (en) * 2000-04-07 2003-07-01 Amgen, Inc. Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
US7118737B2 (en) * 2000-09-08 2006-10-10 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Polymer-modified synthetic proteins
JP5170931B2 (ja) 2000-10-16 2013-03-27 中外製薬株式会社 Ｐｅｇ修飾エリスロポエチン
AUPR610501A0 (en) 2001-07-04 2001-07-26 Smart Drug Systems Inc Treatment of parasitic disease
US6913915B2 (en) * 2001-08-02 2005-07-05 Phoenix Pharmacologics, Inc. PEG-modified uricase
US7265084B2 (en) 2001-10-10 2007-09-04 Neose Technologies, Inc. Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
US7157277B2 (en) 2001-11-28 2007-01-02 Neose Technologies, Inc. Factor VIII remodeling and glycoconjugation of Factor VIII
CN102180944A (zh) * 2001-10-10 2011-09-14 诺和诺德公司 肽的重构和糖缀合
MXPA04004336A (es) 2001-11-07 2005-05-16 Nektar Therapeutics Al Corp Polimeros ramificados y sus conjugados.
US6473908B1 (en) * 2002-01-09 2002-11-05 Thomas A. Bontems Garment having a buttocks cleavage revealing feature
LT1596887T (lt) * 2003-02-26 2022-04-25 Nektar Therapeutics Polimero-faktoriaus viii fragmento konjugatai
US20050176108A1 (en) 2003-03-13 2005-08-11 Young-Min Kim Physiologically active polypeptide conjugate having prolonged in vivo half-life
CA2521784C (en) 2003-04-08 2012-03-27 Yeda Research And Development Co. Ltd. Reversible pegylated drugs
RU2333223C2 (ru) 2003-08-12 2008-09-10 Лайпоксен Текнолоджиз Лимитед Альдегидные производные сиаловой кислоты, способы их получения, конъюгаты альдегидных производных сиаловой кислоты и фармацевтическая композиция на их основе
ES2294535T3 (es) 2003-08-12 2008-04-01 Lipoxen Technologies Limited Derivados del acido polisialico.
EP1673453A2 (en) 2003-10-07 2006-06-28 Novo Nordisk Health Care AG Hybrid molecules having factor vii/viia activity
CA2549011A1 (en) 2003-12-10 2005-06-30 Nektar Therapeutics Al, Corporation Compositions comprising two different populations of polymer-active agent conjugates
ES2593318T3 (es) 2004-08-12 2016-12-07 Lipoxen Technologies Limited Derivados de ácido siálico
US8652334B2 (en) 2004-08-12 2014-02-18 Lipoxen Technologies Limited Fractionation of charged polysaccharide
US7884075B2 (en) * 2004-12-27 2011-02-08 Baxter International Inc. Polymer-factor VIII-von Willebrand factor-conjugates
AU2006259225B2 (en) 2005-06-16 2012-05-31 Nektar Therapeutics Conjugates having a degradable linkage and polymeric reagents useful in preparing such conjugates
KR20080108147A (ko) * 2006-03-31 2008-12-11 백스터 인터내셔널 인코포레이티드 페질화된 인자 ｖｉｉｉ
US7645860B2 (en) * 2006-03-31 2010-01-12 Baxter Healthcare S.A. Factor VIII polymer conjugates
EP2059527B1 (en) * 2006-09-01 2014-12-03 Novo Nordisk Health Care AG Modified glycoproteins
ES2521490T3 (es) * 2006-12-15 2014-11-12 Baxter International Inc. Conjugado de factor VIIa - ácido (poli)siálico con una vida media in vivo prolongada.
US8642737B2 (en) 2010-07-26 2014-02-04 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
CN108884146A (zh) 2015-12-03 2018-11-23 百深公司 具有延长的半衰期及降低的配体结合性质的因子viii

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108267590A (zh) * 2016-12-31 2018-07-10 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 Peg修饰蛋白的peg结合数检测方法
CN108267590B (zh) * 2016-12-31 2021-05-11 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 Peg修饰蛋白的peg结合数检测方法
WO2019219049A1 (zh) * 2018-05-18 2019-11-21 北京辅仁瑞辉生物医药研究院有限公司 改进的fviii融合蛋白及其应用

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EP2318050A2 (en) 2011-05-11
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