BRPI0916675B1 - Método de conjugar um polímero solúvel em água a uma porção de carboidrato oxidada de fator viii, e, construto proteináceo - Google Patents

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Abstract

método de conjugar um polímero solúvel em água a uma porção de carboidrato oxidada de fator viii, fator viii modificado, construto proteináceo. a invenção é um construto proteináceo compreendendo uma molécula de fator viii que é conjugado a um polímero solúvel em água via porções de carboidrato de fator viii, métodos de fator viii e métodos de preparar o mesmo.

Description

[0001] Este pedido é uma continuação em parte de pedido U.S. 11/729.625, depositado em 29 de março de 2007, que reivindica a prioridade para pedido provisório U.S. 60/790.239 e 60/787.968, que foram depositados em 6 de junho de 2006 e 31 de março de 2006, respectivamente.
[0002] A presente invenção refere-se a um construto proteináceo compreendendo o fator de coagulação VIII (FVIII) sendo ligado a pelo menos um polímero solúvel em água, incluindo um poli (óxido de alquileno) como polietileno glicol. Além disso, a presente invenção refere-se aos métodos para prolongar a meia-vida in vivo de FVIII no sangue de um mamífero tendo um distúrbio de sangramento associado com defeitos funcionais ou deficiências de FVIII.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0003] Fator de coagulação VIII (FVIII) circula no plasma em uma concentração muito baixa e é ligado não covalentemente ao fator von Willebre (VWF). Durante hemóstase, FVIII é separado de VWF e age como um co-fator para ativação do fator X (FX) mediado por fator IX ativado (FIXa) por melhora da taxa de ativação na presença de cálcio e fosfolipídeos ou membranas celulares.
[0004] FVIII é sintetizado como um precursor de cadeia única de aproximadamente 270-330 kD com a estrutura de domínio A1-A2-B-A3-C1- C2. Quando purificado a partir de plasma (por exemplo, "derivado de plasma" ou "plasmático"), FVIII é composto de uma cadeia pesada (A1-A2-B) e uma cadeia leve (A3-C1-C2). A massa molecular da cadeia leve é 80 kD enquanto, devido à proteólise dentro do domínio B, a cadeia pesada está na faixa de 90220 kD.
[0005] FVIII é também sintetizado como uma proteína recombinante para uso terapêutico em distúrbios de sangramento. Vários testes in vitro foram projetados para determinar a eficácia potencial de FVIII (rFVIII) recombinante como um remédio terapêutico. Estes testes imitam os efeitos in vivo de FVIII endógeno. In vitro, o tratamento com trombina de FVIII resulta em um rápido aumento e subsequente diminuição em sua atividade procoagulante, como medido por teste in vitro. Esta ativação e inativação coincidem com proteólise limitada específica tanto nas cadeias pesadas como nas leves, que altera a disponibilidade de epítopos de ligação diferente em FVIII, por exemplo, permitindo FVIII dissociar de VWF e ligar a uma superfície de fosfolipídeo ou alterar a capacidade de ligação para certos anticorpos monoclonais.
[0006] A falta ou disfunção de FVIII é associada com o distúrbio de sangramento mais frequente, hemofilia A. O tratamento de escolha para o controle de hemofilia A é a terapia de substituição com o plasma derivado ou concentrados de rFVIII. Pacientes com hemofilia A grave com níveis de FVIII abaixo de 1%, geralmente estão em terapia profilática com o objetivo de manter FVIII acima 1% entre as doses. Levando em conta a meia-vida média dos vários produtos de FVIII na circulação, isto geralmente pode ser obtido administrando FVIII duas a três vezes por semana.
[0007] Existem muitos concentrados no mercado para o tratamento de hemofilia A. Um destes concentrados é o produto recombinante Advate®, que é produzido em células CHO e fabricado por Baxter Healthcare Corporation. Não são adicionadas proteínas de plasma humano ou animal ou albumina no processo de cultura de células, purificação, ou formulação final deste produto.
[0008] O objetivo de muitos fabricantes de concentrados de FVIII e dos fármacos de polipeptídeo terapêuticos é para desenvolver um produto de futura geração com propriedades farmacodinâmicas e farmacocinéticas melhoradas, enquanto mantendo todas as outras características do produto.
[0009] Fármacos de polipeptídeos terapêuticos são rapidamente degradados por enzimas proteolíticas e neutralizados por anticorpos. Isto reduz sua meia-vida e o tempo de circulação, assim limitando sua eficácia terapêutica. A adição de um polímero ou carboidrato solúvel para um polipeptídeo foi mostrada para evitar a degradação e aumentar a meia-vida dos polipeptídeos. Por exemplo, PEGuilação de fármacos de polipeptídeo protege os mesmos e melhora seus perfis farmacodinâmicos e farmacocinéticos (Harris J M et Chess R B, Nat Rev Drug Discov 2003;2: 214-21). O processo de PEGuilação fixa unidades de repetição de polietileno glicol (PEG) para um fármaco de polipeptídeo. PEGuilação de moléculas pode levar à resistência aumentada de fármacos à degradação enzimática, aumentar a meia-vida in vivo, reduzir a freqüência de dosagem, diminuir a imunogenicidade, aumentar a estabilidade física e térmica, aumentar a solubilidade, aumentar a estabilidade líquida, e reduzir a agregação.
[0010] Assim, a adição de um polímero solúvel, como através da PEGuilação é uma abordagem para melhorar as propriedades de um produto de FVIII. O estado da arte é documentado por patentes diferentes e pedidos de patente:
[0011] Patente U.S. 6.037,452 descreve um poli (óxido de alquileno)- FVIII ou conjugado FIX, onde a proteína é covalentemente ligada a um poli (óxido alquileno) através de grupos carbonila de referido FVIII.
[0012] EP1258497B1 descreve um método para preparar osconjugados de FVIII e um polímero biocompatível. Esta patente foi suplementada por uma publicação de Rostin et al. (Bioconj Chem 2000; 11: 387-96). Os conjugados compreendem um FVIII recombinante deletado no domínio B modificado com monometóxi polietileno glicol. O conjugado tem uma função FVIII reduzida e a atividade coagulante diminui rapidamente com o grau de modificação.
[0013] WO 04075923A3 descreve conjugado molecular FVIII - polímero compreendendo uma pluralidade de conjugados em que cada conjugado tem de um a três polímeros solúveis em água covalentemente fixados em uma molécula de FVIII. A molécula de FVIII é deletada no domínio B.
[0014] Patente U.S. 4.970.300 descreve um FVIII modificado, em que um conjugado infusível compreendendo uma proteína tendo atividade FVIII foi covalentemente ligado em um ligando não antigênico.
[0015] Patente U.S. 6.048.720 descreve os conjugados de um polipeptídeo e um polímero biocompatível.
[0016] WO 94/15625 descreve FVIII ligado para polietileno glicol tendo um peso molecular preferido de não mais do que 5.000 Daltons.
[0017] Permanece uma necessidade para um FVIII tendo um polímero solúvel fixado para prolongar a meia-vida do FVIII in vivo, por exemplo, um FVIII PEGuilado, como FVIII de comprimento completo tendo PEG maior do que 10.000 Daltons conjugado ao mesmo, que retém a atividade funcional enquanto provendo uma meia-vida estendida in vivo, como comparado a um FVIII não PEGuilado.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0018] A presente invenção refere-se a um construto proteináceo compreendendo uma molécula de fator VIII que é conjugada a um polímero solúvel em água via porções de carboidrato de fator VIII, e métodos de preparar o mesmo.
[0019] Em uma forma de realização da invenção, um método de conjugar um polímero solúvel em água em uma porção de carboidrato oxidada de FVIII é provido compreendendo contatar a porção de carboidrato oxidado com um polímero solúvel ativado em água sob condições que permitem a conjugação. Em um aspecto relacionado, o polímero solúvel em água é selecionado dentre o grupo consistindo de PEG, PSA e dextrano. Em ainda outro aspecto, o polímero solúvel ativado em água é selecionado dentre o grupo consistindo de PEG-hidrazida, PSA-hidrazina e dextrano ativado por aldeído. Em outro aspecto da invenção, a porção de carboidrato é oxidada por incubação em um tampão compreendendo NaIO4. Em ainda outro aspecto da invenção, a porção de carboidrato oxidada de FVIII é localizada no domínio B de FVIII.
[0020] Em outra forma de realização da invenção, um FVIII modificado produzido pelo método de acordo com qualquer um dos métodos acima mencionados é provido. Em ainda outra forma de realização, um construto proteináceo é provido compreendendo (a) uma molécula de fator VIII; e (b) pelo menos um polímero solúvel em água ligado à referida molécula de fator VIII, em que o polímero solúvel em água é fixado no fator VIII via uma ou mais porções de carboidrato localizadas no fator VIII de domínio B. Em um aspecto relacionado da invenção, o polímero solúvel em água é selecionado dentre o grupo consistindo de PEG, PSA e dextrano.
FIGURAS
[0021] FIG. 1 mostra a ampliação e o aumento da massa de rFVIII após conjugação com PEG medido por SDS-PAGE com immunoblotting subsequente.
[0022] FIG. 2 mostra a farmacocinética de conjugado PEG-rFVIII comparado ao FVIII não conjugado em camundongos hemofílicos. quadrados abertos: PEGrFVIII, dose 200 IU FVIII/kg. diamantes fechados: nativo rFVIII, dose 200 IU FVIII/kg.
[0023] FIG. 3 mostra a análise detalhada dos sítios de PEGuilação por SDS-PAGE usando vários anticorpos anti FVIII.
[0024] FIG. 4 mostra a ativação induzida por trombina e a inativação de rFVIII nativo e PEGuilado.
[0025] FIG. 5 mostra as bandas demonstrando os domínios de rFVIII nativo e PEGuilado.
[0026] FIG. 6 mostra a extensão de PEGuilação de vários domínios de rFVIII nativo e PEGuilado.
[0027] FIG. 7 mostra a taxa de inativação de trombina de rFVIII nativo e PEGuilado.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0028] A invenção é um construto proteináceo compreendendo uma molécula FVIII tendo pelo menos uma porção do domínio B intacto, ligado a um polímero solúvel em água que inclui, um óxido de polialquileno, polivinil pirrolidona, álcool polivinílico, polioxazolina, uma poli acriloilmorfolina ou um carboidrato, como ácido polissiálico (PSA) ou dextrano. Em uma forma de realização da invenção, o polímero solúvel em água é uma molécula de polietileno glicol tendo um peso molecular maior do que 10.000 Daltons. Em outra forma de realização, o polímero solúvel em água tem um peso molecular maior do que 10.000 Da a cerca de 125.000 Da, cerca de 15.000 Da a 20.000 Da, ou cerca de 18.000 Da e a cerca de 25.000 Da. Em uma forma de realização, o construto retém a atividade funcional completa de produtos FVIII terapêuticos padrões, e provê uma meia-vida estendida in vivo, como comparado aos produtos FVIII terapêuticos padrões. Em outra forma de realização, o construto retém pelo menos 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56,57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, ou 150 por cento (%) atividade biológica relativa ao fator VIII nativo. Em um aspecto relacionado, as atividades biológicas do construto e do fator VIII nativo são determinadas pelas relações de atividade cromogênica para o valor de antígeno FVIII (FVIII:Chr:FVIII:Ag). Em ainda outra forma de realização da invenção, a meia-vida do construto é diminuída ou aumentada 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 vezes relativo a meia-vida in vivo de fator VIII nativo.
[0029] O material de partida da presente invenção é FVIII, que pode ser derivado de plasma humano, ou produzido por técnicas de engenharia recombinante, como descrito nas patentes US 4.757.006; patente US 5.733.873; patente US 5.198.349; patente U.S. número 5.250.421; patente US 5.919.766; EP 306 968.
[0030] Aqui, o termo "fator VIII" ou "FVIII" refere-se a qualquer molécula de FVIII que tem pelo menos uma porção do domínio B intacta, e que exibe a atividade biológica que é associada com FVIII nativo. Em uma forma de realização da invenção, a molécula FVIII é um fator VIII de comprimento completo.A molécula de FVIII é uma proteína que é codificada pelas sequências de DNA capazes de hibridizar o fator VIILC de DNA codificado. Como uma proteína pode conter deleções de aminoácido em vários sítios entre ou dentro dos domínios A1-A2-B-A3- C1-C2 (patente US 4.868.112). A Molécula de FVIII também pode ser um análogo de FVIII nativo em que um ou mais resíduos e aminoácido foram substituídos pela mutagênese sítio dirigida.
[0031] As moléculas de FVIII utilizáveis para a presente invenção incluem a proteína de comprimento completo, precursores da proteína, subunidades biologicamente ativas ou funcionais ou fragmentos da proteína, e derivados funcionais dos mesmos, assim como, variantes dos mesmos como descrito aqui abaixo. Referência para FVIII significa incluir todas as formas potenciais de tais proteínas e em que cada uma das formas de FVIII tem pelo menos uma porção ou todos da sequência de domínio B nativo intacta.
[0032] De acordo com a presente invenção, o termo "fator VIII recombinante" (rFVIII) pode incluir qualquer rFVIII, heterólogo ou de ocorrência natural, obtido via a tecnologia de DNA recombinante, ou um derivado biologicamente ativo dos mesmos. Em certas formas de realização, o termo engloba as proteínas como descrito acima e ácidos nucléicos, codificando um rFVIII da invenção. Tais ácidos nucléicos incluem, por exemplo, e sem limitação, genes, pre-mRNAs, mRNAs, variantes polimórficas, alelos, mutantes sintéticos e de ocorrência natural. Proteínas englobadas pelo termo rFVIII incluem, por exemplo, e sem limitação, as proteínas e polipeptídeos descritos acima, proteínas codificadas por um ácido nucléico descrito acima, homólogos entre espécies e outros polipeptídeos que: (1) têm uma sequência de aminoácido que tem mais do que cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99% ou maior identidade da sequência de aminoácido, sobre uma região de pelo menos cerca de 25, cerca de 50, cerca de 100, cerca de 200, cerca de 300, cerca de 400, ou mais aminoácidos (até a sequência de comprimento completo de 406 aminoácidos para a proteína de natureza nativa), para um polipeptídeo codificado por um ácido nucléico referenciado ou uma sequência de aminoácido descrita aqui; e/ou (2) especificamente liga aos anticorpos, por exemplo, anticorpos policlonais ou monoclonais, gerados contra um imunógeno compreendendo uma sequência de aminoácido referenciada como descrito aqui, um fragmento imunogênico do mesmo, e/ou uma variante conservativamente modificada dos mesmos.
[0033] Polinucleotídeos codificando um rFVIII da invenção incluem, sem limitação, os que (1) especificamente hibridizam sob condições de hibridização estringentes para um ácido nucléico codificado uma sequência de aminoácido referenciada como descrito aqui, e variantes conservativamente modificadas dos mesmos; (2) tem uma sequência de ácido nucléico que tem maior do que cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou identidade de sequência de nucleotídeo maior, sobre uma região de pelo menos cerca de 25, cerca de 50, cerca de 100, cerca de 150, cerca de 200, cerca de 250, cerca de 500, cerca de 1000, ou mais nucleotídeos (até a sequência de comprimento completo de 1218 nucleotídeos da proteína madura), para uma sequência de ácido nucléico de referência como descrito aqui.
[0034] Como usado aqui, "FVIII endógeno" inclui FVIII que se origina do mamífero destinado a receber tratamento. O termo também inclui FVIII transcrito a partir de um transgene ou qualquer outro DNA estrangeiro presente no referido mamífero. Como usado aqui, "FVIII exógeno" inclui FVIII que não se origina do referido mamífero.
[0035] Polipeptídeos variantes(ou análogos) incluem variantes de inserção, em que um ou mais resíduos de aminoácido são adicionados em uma sequência de aminoácido FVIII da invenção. As inserções podem ser localizadas em cada um ou ambos os terminais da proteína, e/ou podem estar posicionadas dentro das regiões internas da sequência de aminoácido FVIII. Variantes de inserção, com resíduos adicionais em cada um ou ambos os terminais, incluem, por exemplo, proteínas de fusão e proteínas incluindo etiquetas de aminoácido ou outros rótulos de aminoácido. Em um aspecto, a molécula FVIII pode opcionalmente conter um Met N-terminal, especialmente quando a molécula é recombinantemente expressa em uma célula bacteriana como E. coli.
[0036] Em variantes de deleção, um ou mais resíduos de aminoácido em um polipeptídeo FVIII como descrito aqui são removidos. As deleções podem ser efetuadas em cada um ou ambos terminais do polipeptídeo FVIII, e/ou com remoção de um ou mais resíduos dentro da sequência de aminoácido FVIII. Variantes de deleção, assim, incluem todos os fragmentos de uma sequência de polipeptídeo FVIII.
[0037] Em variantes de substituição, um ou mais resíduos de aminoácido de um polipeptídeo FVIII são removidos e substituídos com resíduos alternativos. Em um aspecto, as substituições são conservativas na natureza e substituições conservativas deste tipo são bem conhecidos na arte. Alternativamente, a invenção engloba substituições que também não são conservativas. As substituições conservativas exemplares são descritas em Lehninger, [Biochemistry, 2a. edição; Worth Publishers, Inc., New York (1975), pp.71-77] e especificadas imediatamente abaixo. Substituições conservativasCADEIA LATERAL AMINOÁCIDOCARACTERÍSTICASNão polar(hidrofóbico): A. Alifático A L I V PB. Aromático F WC. Contendo enxofre MD. Linha de borda GPolar não carregado: A. Hidroxila S T YB. Amidas N QC. Sulfidrila CD. Linha de borda GCarregado K R Hpositivamente (básico) Carregado D Enegativamente (acídico)
[0038] Alternativamente, substituições conservativas exemplares sãoespecificadas imediatamente abaixo.Substituições conservativas IIResíduo original Substituição exemplarAla (A) Val, Leu, IleArg (R) Lys, Gln, AsnAsn (N) Gln, His, Lys, ArgAsp (D) GluCys (C) SerGln (Q) AsnGlu (E) Asp His (H) Asn, Gln, Lys, ArgIle (I) Leu, Val, Met, Ala, Phe,Leu (L) Ile, Val, Met, Ala, PheLys (K) Arg, Gln, AsnMet (M) Leu, Phe, IlePhe (F) Leu, Val, Ile, AlaPro (P) GlySer (S) ThrThr (T) SerTrp (W) TyrTyr (Y) Trp, Phe, Thr, SerVal (V) He, Leu, Met, Phe, Ala
[0039] Uma "ocorrência natural" sequência de polinucleotídeos ou polipeptídeos é tipicamente de um mamífero incluindo, mas não limitada para, primatas, por exemplo, humano; roedor, por exemplo, rato, camundongo, hamster; vaca, porco, cavalo, ovelha, ou qualquer mamífero. Os ácidos nucléicos e proteínas da invenção podem ser moléculas recombinantes (por exemplo, heterólogos e codificando a sequência do tipo selvagem ou uma variante dos mesmos, ou ocorrência não natural). Sequências de polinucleotídeo e polipeptídeo de referência incluem, por exemplo, UniProtKB/Swiss-Prot P00451 (FA8_HUMAN); Gitschier J et al., Characterization of the human Factor VIII gene, Nature, 312(5992): 326-30 (1984); Vehar GH et al., Structure of human Factor VIII, Nature, 312(5992): 337-42 (1984); e Thompson AR. Structure and Function of the Factor VIII gene and protein, Semin Thromb Hemost, 2003:29; 11-29 (2002), (incorporados aqui por referência em suas totalidades).
[0040] Como usado aqui "derivado biologicamente ativo" ou "variante biologicamente ativa" inclui qualquer derivado ou variante de uma molécula tendo substancialmente as mesmas propriedades funcionais e/ou biológicas da referida molécula, como propriedades de ligação, e/ou a mesma base estrutural, como uma estrutura dorsal peptídica ou uma unidade polimérica básica.
[0041] Como usado aqui, "FVIII derivado do plasma" ou "plasmático" inclui todas as formas da proteína encontrada no sangue obtido de um mamífero tendo a propriedade de ativar a via de coagulação.
[0042] Em vários aspectos, a produção de rFVIII inclui qualquer método conhecido na arte para (i) produzir DNA recombinante por engenharia genética, (ii) introduzir o DNA recombinante nas células procarióticas ou eucarióticas por, por exemplo, e sem limitação, transfecção, eletroporação ou microinjeção, (iii) cultivar referidas células transformadas, (iv) expressar rFVIII, por exemplo, constitutivamente ou quando da indução, e (v) isolar referido rFVIII, por exemplo, do meio de cultura ou por coleta das células transformadas, a fim de (vi) obter rFVIII purificado.
[0043] Em outros aspectos, o rFVIII é produzido pela expressão em um sistema hospedeiro procariótico ou eucariótico apropriado caracterizado por produzir uma molécula rFVIII farmacologicamente aceitável. Exemplos de células eucarióticas são as células de mamíferos, como CHO, COS, HEK 293, BHK, SK-Hep, e HepG2.
[0044] Em ainda outros aspectos, uma variedade ampla de vetores são usados para a preparação do rFVIII e são selecionados dentre os vetores de expressão eucarióticos e procarióticos. Exemplos de vetores para a expressão procariótica incluem plasmídeos como, e sem limitação, pRSET, pET, e pBAD, em que os promotores usados nos vetores de expressão procarióticos incluem um ou mais de, e sem limitação, lac, trc, trp, recA, ou araBAD. Exemplos de vetores para a expressão eucariótica incluem: (i) para a expressão em levedura, vetores como, e sem limitação, pAO, pPIC, pYES, ou pMET, usando os promotores como, e sem limitação, AOX1, GAP, GAL1, ou AUG1; (ii) para a expressão em células de inseto, vetores como e sem limitação, pMT, pAc5, pIB, pMIB, ou pBAC, usando promotores como e sem limitação PH, p10, MT, Ac5, OpIE2, gp64, ou polh, e (iii) para a expressão em células de mamíferos, vetores como e sem limitação pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3, ou pBPV, e vetores derivados de, em um aspecto, sistemas virais como e sem limitação vírus de vacínia, vírus adeno-associado, vírus do herpes, ou retrovírus, usando promotores como e sem limitação CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV, e β-actina.
[0045] Em certos aspectos, as moléculas FVIII são conjugadas para um polímero solúvel em água por qualquer de uma variedade de métodos químicos (Roberts JM et al., Advan Drug Delivery Rev 2002;54: 459-76). Por exemplo, em uma forma de realização FVIII é PEGuilado pela conjugação de PEG para grupos amino livre da proteína usando ésteres N- hidroxisuccinimida (NHS). Em outra forma de realização o polímero solúvel em água, por exemplo, PEG, é copulado para grupos SH livres usando química de maleimida ou a copulação de hidrazidas PEG ou aminas PEG para porções de carboidrato do FVIII após a oxidação anterior.
[0046] Em outras formas de realização, FVIII é conjugado para outros polímeros solúveis em água, onde os polímeros solúveis em água são, por exemplo, óxido de polialquileno, polivinil pirrolidona, álcool polivinílico, polioxazolina, um poli acriloilmorfolina, carboidrato ou um polissacarídeo como ácido polissiálico (PSA) ou dextrano. A copulação do polímero solúvel em água pode ser realizada por copulação direta para a proteína ou via moléculas de ligante. Um exemplo de um ligante químico é MBPH (hidrazida de ácido 4-[4-N-maleimidofenil] butírico) contendo uma hidrazida seletiva para carboidrato e um grupo maleimida sulfidril reativo (Chamow et al., J Biol Chem 1992;267: 15916-22).
[0047] A conjugação pode ser realizada por copulação direta (ou copulação via sistemas de ligantes) do polímero solúvel em água para o fator VIII sob a formação de ligações estáveis. Além disso, sistemas de ligantes degradáveis, liberáveis ou hidrolisáveis podem ser usados na presente invenção (Tsubery et al. J Biol Chem 2004;279: 38118-24 / Greenwald et al., J Med Chem 1999;42: 3657-67 / Zhao et al., Bioconj Chem 2006;17: 341-51 / WO 2006/138572A2 / US7259224B2 / US7060259B2).
[0048] Como discutido aqui, uma forma de realização da invenção é a copulação do polímero solúvel ativado para a porção de carboidrato oxidada de FVIII. O termo "polímero solúvel em água ativado" é usado aqui para referir-se ao polímero solúvel em águas usado para copulação em FVIII tendo um grupo funcional ativo, que permite a conjugação química do polímero solúvel em água para um ligante ou diretamente para FVIII (que contém um grupo aldeído ativo). O termo "porção de carboidrato oxidado" como usado aqui refere-se a FVIII contendo grupos aldeído livre, que são gerados por um agente oxidante como NaIO4. Em um aspecto da invenção, dextrano ativado por aldeído (contendo um grupo aldeído ativo) é copulado para os grupos aldeído de FVIII via um ligante de di-hidrazida.
[0049] De acordo com o padrão de glicosilação de FVIII (Lenting et al; Blood, 92: 3983-96 (1998)), conjugação de FVII via as porções de carboidrato deve provavelmente ocorrer no domínio B de FVIII. A marcação do domínio B para tais reações de conjugação é desejada desde o domínio B não desempenhe um papel na atividade de FVIII. A glicoconjugação enzimática é descrita em US 2008/00700275.
[0050] Em uma forma de realização da invenção, FVIII foi modificado via resíduos de lisina pelo uso de derivados de polietileno glicol contendo um éster N-hidroxisuccinimida ativo (NHS) como sucinto de succinimidila, glutarato de succinimidila ou propionato de succinimidila. Estes derivados reagem com os resíduos de lisina de FVIII sob condições suaves por formar uma ligação amida estável. Em uma forma de realização da invenção, o comprimento de cadeia do derivado PEG é 5.000 Da. Outros derivados PEG com comprimentos de cadeia de 500 a 2.000 Da, 2.000 a 5.000 Da, maior do que 5.000 até 10.000 Da ou maior do que 10.000 até 20.000 Da, ou maior do que 20.000 até 150.000 Da são usados em várias formas de realização, incluindo estruturas linear e ramificada.
[0051] Métodos alternativos para a PEGuilação de grupos amino são a conjugação química com carbonatos PEG por formação de ligações uretano, ou a reação com aldeídos ou cetonas por aminação redutora formando ligações amina secundárias.
[0052] Na presente invenção uma molécula FVIII é quimicamente modificada usando derivados PEG que são comercialmente disponíveis. Estes derivados PEG podem ter estruturas lineares ou ramificadas. Exemplos de derivados PEG contendo grupos NHS são listados abaixo.
[0053] Os seguintes derivados PEG são exemplos dos comercialmentedisponíveis de Nektar Therapeutics (Huntsville, Ala.; ver www.nektar.com/PEG reagent catalog; Nektar Advanced PEGuilação, lista de preços 2005-2006): mPEG-Propionato de succinimidila (mPEG-SPA)
Figure img0001
[0054] Estrutura de um derivado PEG ramificado (Nektar Therapeutics):
Figure img0002
[0055] Este reagente com estrutura ramificada é descrito em maiores detalhes por Kozlowski et al. (BioDrugs 2001;5: 419-29).
[0056] Outros exemplos de derivados PEG são comercialmente disponíveis de NOF Corporation (Tokyo, Japan; ver www.nof.co.jp/english: Catalogue 2005)
[0057] Estrutura geral de derivados PEG linear (NOF Corp.):
Figure img0003
Figure img0004
[0058] Estruturas de derivados PEG ramificados (NOF Corp.): 2,3-Bis (metilpolioxietileno-óxi)-1-(1,5-dioxo-5-succinimidilóxi, pentilóxi)propano
Figure img0005
[0059] Estes derivados de propano mostram uma estrutura dorsal deglicerol com um padrão 1,2 de substituição. Na presente invenção derivados PEG ramificados com base em estruturas de glicerol com 1,3 substituição ou outras estruturas ramificadas descritos em US2003/0143596A1 também podem ser usados.
[0060]Derivados PEG com ligantes degradáveis (por exemplo, hidrolisáveis) como descritos por Tsubery et al. (J Biol Chem 2004;279: 38118-24) e Shechter et al. (WO 04089280A3) também podem ser usados na presente invenção.
[0061] Surpreendentemente, o FVIII PEGuilado desta invenção exibe atividade funcional completa, combinado com uma meia-vida in vivo de FVIII estendida. Além disso, o rFVIII PEGuilado parece ser mais resistente contra a inativação da trombina. Isto foi mostrado por uma variedade de métodos in vitro e in vivo, e é ilustrado pelos seguintes exemplos.
[0062] Como usado aqui, "porções de ácido siálico" incluem monômeros de ácido siálico ou polímeros ("polissacarídeos") que são solúveis em uma solução aquosa ou suspensão e tem pouco ou nenhum impacto negativo, como efeitos laterais, para os mamíferos quando da administração do conjugado PSA- FVIII em uma quantidade farmaceuticamente eficaz. Não existe nenhuma limitação particular para a unidade de ácido siálico usada de acordo com a presente invenção. Os polímeros são caracterizados, em um aspecto, como tendo de 1 a 4 unidades. Em certos aspectos, as unidades de ácido siálico diferentes são combinadas em uma cadeia.
[0063] Em vários aspectos da invenção, porções de ácido siálico são ligadas a FVIII, por exemplo, pelo método descrito na patente US 4.356.170, que é incorporado aqui por referência. Em várias formas de realização da invenção, o composto polissacarídeo é um polissacarídeo de ocorrência natural, um derivado de um polissacarídeo de ocorrência natural, ou um derivado de polissacarídeo de ocorrência natural. Geralmente, todos dos resíduos sacarídeos no composto são resíduos de ácido siálico.
[0064] Outras técnicas para copular PSA em polipeptídeos também são conhecidas. Por exemplo, publicação US 2007/0282096 descreve conjugação de uma amina ou derivado de hidrazida de, por exemplo, PSA, para proteínas. Além disso, publicação US 2007/0191597 descreve derivados de PSA contendo um grupo aldeído para reação com substratos (por exemplo, proteínas) na extremidade terminal de redução.
[0065] Em uma forma de realização da invenção, a porção de ácido polissiálico do composto polissacarídeo é altamente hidrofílica, e em outra forma de realização o composto completo é altamente hidrofílico. A hidrofilicidade é conferida primariamente pelos grupos carboxila pendentes das unidades de ácido siálico, assim como, os grupos hidroxila. A unidade de sacarídeo pode conter outros grupos funcionais, como, grupos amina, hidroxila ou sulfato, ou combinações dos mesmos. Estes grupos podem estar presentes em compostos de sacarídeos de ocorrência natural, ou introduzidos nos compostos derivados de polissacarídeo.
[0066] Compostos de polissacarídeo de uso particular para a invenção são, em um aspecto, os produzidos por bactérias. Alguns destes polissacarídeos de ocorrência natural são conhecidos como glicolipídeos. Em uma forma de realização os compostos de polissacarídeo são substancialmente livres de unidades de galactose terminais.
[0067] Em uma forma de realização da presente invenção, a meia- vida in vivo é prolongada do construto proteináceo é prolongado. Em uma forma de realização relacionada, a meia-vida in vivo do construto proteináceo é prolongada por pelo menos um fator de dois, enquanto em outra forma de realização a meia-vida in vivo é prolongada por pelo menos um fator de três, como comparado ao FVIII que não está ligado em um polímero solúvel em água.Em uma forma de realização o construto proteináceo da presente invenção pode ser administrado por injeção, como injeção intravenosa, intramuscular, ou intraperitoneal.
[0068] Para administrar as composições compreendendo um construto proteináceo da presente invenção para humano ou animais de teste, em um aspecto, as composições compreendem um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis. Os termos "farmaceuticamente" ou "farmacologicamente aceitável" referem-se para entidades moleculares e composições que são estáveis, inibem a degradação de proteína como agregação e produtos de clivagem, e, além disso, não produzem reações alérgicas ou outras adversas quando administrados usando vias bem conhecidas na técnica, como descrito abaixo. "Veículos farmaceuticamente aceitáveis" incluem qualquer e todos os solventes clinicamente utilizáveis, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardo da absorção e outros, incluindo os agentes descritos acima.
[0069] Como usado aqui, "quantidade eficaz" inclui uma dose apropriada para tratar um mamífero tendo um distúrbio de sangramento como descrito acima.
[0070] As composições podem ser administradas oralmente, topicamente, transdermicamente, parenteral, por pulverização de inalação, vaginalmente, retalmente, ou por injeção intracraniana. O termo parenteral como usado aqui inclui injeções subcutâneas, intravenosa, intramuscular, injeção intracisternal, ou técnicas de infusão. Administração por injeção intravenosa, intradérmica, intramuscular, intramamária, intraperitoneal, intratecal, retrobulbar, intrapulmonar e/ou implantação cirúrgica em um sítio particular é contemplada também. Geralmente, as composições são essencialmente livres de pirogênios, assim como, outras impurezas que podem ser prejudiciais para o recipiente.
[0071] Administrações únicas ou múltiplas das composições podem ser realizadas com os níveis de dose e padrão sendo selecionadas pelo médico assistente. Para a prevenção ou tratamento de doenças, a dosagem apropriada irá depender do tipo de doença a ser tratada, como descrito acima, a gravidade e a fonte da doença, se o fármaco é administrado para os propósitos preventivos ou terapêuticos, terapia prévia, o histórico clínico do paciente e resposta ao fármaco, e de acordo com o médico atendente.
[0072] A presente invenção também refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de um construto proteináceo como definido acima. A composição farmacêutica pode ainda compreender um veículo farmaceuticamente aceitável, diluente, sal, tampão, ou excipiente. A composição farmacêutica pode ser usada para tratar os distúrbios de sangramento acima definidos. A composição farmacêutica da invenção pode ser uma solução ou um produto liofilizado. Soluções da composição farmacêutica podem ser submetidas a qualquer processo de liofilização apropriado.
[0073] Como um aspecto adicional, a invenção inclui kits que compreendem uma composição da invenção embalada em um modo que facilita seu uso para administração para os indivíduos. Em uma forma de realização, este kit inclui um composto ou composição descritos aqui (por exemplo, uma composição compreendendo um construto proteináceo), embalado em um recipiente como um frasco selado ou vaso, com um rótulo afixado no recipiente ou incluído no pacote que descreve o uso do composto ou composição na prática do método. Em uma forma de realização, o kit contém um primeiro recipiente tendo uma composição compreendendo um construto proteináceo e um segundo recipiente tendo uma solução de reconstituição fisiologicamente aceitável para a composição no primeiro recipiente. Em um aspecto, o composto ou composição é embalado em uma forma de dosagem unitária. O kit pode ainda incluir um dispositivo apropriado para administrar a composição de acordo com uma via específica de administração.Preferivelmente, o kit contém um rótulo que descreve o uso da proteína terapêutica ou composição de peptídeos.ExemplosExemplo 1
[0074] PEGuilação de resíduos de lisina em rFVIII com mPEG sucinato de succinimidila
[0075] Uma solução de um rFVIII em volume derivado do processo de fabricação Advate (3.400 U/ml) foi filtrada em gel pelo uso de colunas Econo-Pac 10DG (Bio-Rad) usando 20 mM de tampão Hepes, 150 mM de NaCl, pH 7,4, contendo 0,5% de sacarose e 0,1% de Polysorbate 80. Então mPEGsucinato de succinimidila (Abuchowski et al. Cancer Biochim Biophys 1984;7: 175-86) com um comprimento de cadeia de 5.000 Da (PEG-SS 5000) foi adicionado a esta solução sob agitação suave (5 mg de proteína PEG- SS/mg) e o valor de pH foi ajustado a 7,4 por adição em gotas de 0,5 M de NaOH. Então a PEGuilação foi realizada sob agitação suave durante 1 hora em temperatura ambiente.
[0076] Subsequentemente, a mistura de reação foi aplicada sobre uma resina de cromatografia de troca iônica equilibrada (coluna Fractogel EMD MAE 650M/ Pharmacia XK-10, altura do leito: 15,0 cm) em 20 mM de tampão Hepes, 150 mM de NaCl, pH 7,4, contendo 0,5% de sacarose e 0,1% de Polysorbate 80. Então a coluna foi lavada com 20 CV de tampão de equilíbrio para remover o excesso de reagente e o rFVIII PEGuilado foi eluído com tampão de eluição (20 mM de Hepes, 1,0 M de NaCl, 0,5% de sacarose, 0,1% de Polysorbate 80, pH 7,4). O eluado foi concentrado por ultrafiltração/diafiltração com uma membrana consistindo de celulose regenerada e com um corte de peso molecular de 30 kD usando um sistema de tampão consistindo de 20 mM de Hepes, 150 mM de NaCl, 0,5% de sacarose, pH 7,4.Exemplo 2
[0077] Caracterização bioquímica de PEGuilado rFVIII in vitro
[0078] RFVIII derivado do processo de fabricação Advate foi PEGuilado de acordo com o exemplo 1 e o produto PEGuilado FVIII foi caracterizado bioquimicamente. A atividade funcional do PEG-rFVIII foi determinada pelo uso do teste cromogênico FVIII (Rosen S, Scand J Haematol 1984;33 (Suppl 40): 139-45). O método é baseado em Ph. Eur. 5a. edição (5.05) 2.7,4 Teste de fator VIII de coagulação do sangue.
[0079] Uma amostra, contendo o fator VIII (FVIILC) é misturada com trombina, fator IX (FIXa) ativado, fosfolipídeos e fator X (FX) em um tampão contendo cálcio. FVIII é ativado por trombina e subsequentemente forma um complexo com fosfolipídeos, FIXa e íons cálcio. Este complexo ativa o fator X para o fator Xa, que por sua vez cliva o substrato cromogênico FXa-I (AcOH*CH3OCO-D-CHA-Gly-Arg-pNA). O curso do tempo de para- nitroanilina (pNA) liberada é medido m uma leitora de microplaca a 405 nm. A curva da reação é proporcional à concentração do fator VIII na amostra. O valor do antígeno FVIII foi medido pelo uso de um sistema ELISA comercialmente disponível (Cedarlane, Hornby, Ontario, Canadá) com modificações menores. A partir desses valores as relações cromogene de FVIII / antígeno de FVIII foram calculadas. O teor de proteína nas preparações foi determinado por medição da densidade óptica a 280 nm. A partir destes dados o teor de proteína foi calculado (Hoyer LW in: Human Protein Data. Installments 1-6; Heberli Ed.; Wiley V C H, Weinheim, Alemanha, 1998) ed expresso em mg/ml.
Figure img0006
[0080] Os dados na tabela 1 mostram que na preparação de rFVIII PEGuilado, a atividade biológica (expressa pela relação de atividade cromogênica de FVIII para o antígeno FVIII) é recuperada a mais do que 90% em comparação à atividade biológica do rFVIII nativo (100%).Exemplo 3
[0081] Caracterização de rFVIII PEGuilado por SDS-PAGE e técnicas de immunoblotting
[0082] rFVIII nativo foi caracterizado por SDS PAGE sob condições de redução por uso de um gel gradiente de poliacrilamida de 4-12% obtido de Invitrogen (Carlsbad, Calif., USA) de acordo com as instruções do fabricante. Como marcadores de peso molecular (MW) marcadores Precision Plus (10 kD-250 kD) obtidos de Bio-Rad (Hercules, Calif., USA) foram usados. Então as proteínas foram transferidas em uma membrana PVDF obtida de Bio-Rad (Hercules, Calif., USA) por electroblotting e subsequentemente incubadas com um anticorpo de FVIILC anti-humano de ovelha policlonal obtido de Cedarlane (Hornby, Ontario, Canadá). As últimas etapas do procedimento de imuno-coloração foram a incubação com o anticorpo anti-ovelha conjugado a fosfatase alcalina (ALP) obtido de Accurate (Westbury, N. Y., USA) seguido pela visualização final pelo uso de um kit de substrato ALP (Bio-Rad, Hercules, Calif., USA). Os resultados são resumidos na FIG. 1. O blot demonstra a estrutura de domínio de rFVIII nativo e PEGuilado. É mostrado que o rFVIII PEGuilado tem bandas mais amplas e massas moleculares elevadas que a proteína recombinante nativa.Exemplo 4
[0083] Farmacocinética de rFVIII PEGuilado em um modelo de camundongo de nocaute deficiente em FVIII
[0084] Camundongos FVIII deficientes descritos em detalhe por Bi et al. (Nat Genet 1995;10:119-21) foram usados como um modelo de hemofilia A humana severa. Grupos de 5 camundongos receberam uma injeção de bolo (10 ml/kg) via a veia da cauda com ou PEG-rFVIII (PEG-SS, 5K) preparado de acordo com exemplo 1 ou rFVIII nativo em uma dose de 200 IU FVIII/kg de peso corporal. Plasma com citrato por punção cardíaca após anestesia foi preparado a partir dos respectivos grupos, 5 minutos, 3, 6, 9 e 24 horas após injeção. Níveis de atividade FVIII foram medidos nas amostras de plasmas. Os resultados deste experimento são resumidos na FIG. 2. A meia-vida media aumentou de 1,9 horas (para rFVIII nativo) para 4,9 horas (para rFVIII PEGuilado), área sob a curva (AUC) aumentou de 13,0 para 25,2 horas*IU/ml. Cálculo da meia-vida foi realizado com MicroMath Scientist, modelo 1 de biblioteca framacocinética (MicroMath, Saint Louis, Mo., USA).Exemplo 5
[0085] Análise detalhada de PEGuilação de rFVIII por SDS-PAGE e técnicas de immunoblotting
[0086] rFVIII nativo e PEGuilado foi digerido com 1 nM de trombina durante 60 minutos a 60oC, que resultou na clivagem específica da molécula FVIII com produtos de degradação bem definidos. Estes fragmentos de cadeia pesada e leve foram separados por SDS-PAGE seguido por electroblotting, como descrito no exemplo 3. Para visualizar os fragmentos clivados, um anticorpo policlonal e anticorpos monoclonais contra os domínios A1 e A2 de cadeia pesada, o domínio B e o domínio A3 N-terminal da cadeia leve foram aplicados.
[0087] Como visto na FIG. 3 todos os domínios foram PEGuilados, apesar de em uma extensão diferente. O domínio B foi fortemente PEGuilado. Ambos os domínios A1 e A2 da cadeia pesada foram parcialmente PEGuilados. Vários graus de PEGuilação (mono-, di-, tri- . . .) podem ser observados no domínio A3 de cadeia leve. De acordo com o exemplo 6, o FVIII PEGuilado parecei ser mais resistente para trombina.Exemplo 6
[0088] Resistência à trombina de rFVIII PEGuilado
[0089] No tratamento com trombina in vitro de FVIII resulta em um rápido aumento e subseqüente diminuição de sua atividade pro-coagulante. A taxa de ativação e de inativação, que depende sobre a concentração de trombina e sobre a integridade de FVIII, foi monitorada por um teste de cofator FIXa, como a seguir:
[0090] FVIII foi incubado a 37oC com 0,5 ou 1 nM de trombina. Subamostras foram retiradas em intervalos de tempo entre 0,5 a 40 minutos e adicionadas na mistura de FIXa, FX, PL-vesículas e CaCl2 também contendo um inibidor de trombina específico para parar as outras reações mediadas por trombina e incubadas durante 3 minutos. Uma subamostra foi adicionada em um substrato cromogênico, que é seletivamente clivado por FXa e continha EDTA para parar ainda a ativação Xa. Após uma incubação de 15 min, a reação foi terminada por ácido acético. Os valores (A405) de absorbância, que são proporcionais para as concentrações FXa, foram medidos em um leitor ELISA e convertidos para as concentrações FXa usando uma curva de referência FXa purificada. As concentrações FXa geradas foram traçadas em gráfico contra o tempo de incubação com trombina.
[0091] A taxa de inativação de pseudo-primeira ordem de FVIII foi determinada por configuração da parte declinante das curvas com um ajuste exponencial único.
Figure img0007
[0092] Como mostrado na FIG. 4 e tabela 2, rFVIII PEGuilado mostrou uma taxa de inativação mais lenta em ambas as concentrações de trombina aplicadas.Exemplo 7
[0093] PEGuilação de resíduos de lisina em rFVIII com 2,3- bis(metilpolioxietileno-óxi)-1-(1,5-dioxo-5-succinimidilóxi, pentilóxi) propano ramificado
[0094] Uma solução de rFVIII em 20 mM de tampão Hepes pH 7,4 contendo 150 mM de NaCl, 0,5% de sacarose e 0,1% de Polysorbate 80 foi preparada de material em volume derivado do processo de fabricação Advate contendo 489 IU FVIII/ml. Um reagente de glutarato de succinimidila PEG (PEG-SG) (2,3-bis(metilpolioxietileno-óxi)- 1-(l,5- dioxo-5-succinimidilóxi, pentilóxi) propano) ramificado obtido a partir de NOF Corporation (Tokyo, Japão) com um peso molecular de20 kD foi adicionado a 153 ml desta solução sob agitação suave (5 mg de reagente/mg de proteína) e o valor de pH foi ajustado a 7,4 por adição em gotas de 0,5 M de NaOH após 10 minutos. Então a PEGuilação de rFVIII foi realizada sob agitação suave durante 1 hora em temperatura ambiente.
[0095] Subsequentemente a mistura de reação foi aplicada sobre uma resina de cromatografia de troca iônica equilibrada (coluna Fractogel EMD TMAE 650M/Pharmacia XK-50, altura do leito: 14,5 cm) em 20 mM de tampão Hepes, 150 mM de NaCl, pH 7,4, contendo 0,5% de sacarose e 0,1% de Polysorbate 80 usando uma taxa de fluxo linear de 1 cm/min. A coluna foi lavada com 25 CV tampão de equilíbrio para remover o excesso de reagente (taxa de fluxo linear: 2 cm/min) e o rFVIII PEGuilado foi eluído com tampão de eluição (20 mM de Hepes, 1,0 M de NaCl, 0,5% de sacarose, 0,1% de Polysorbate 80, pH 7,4) em uma taxa de fluxo linear de 0,5 cm/min. Então o eluado foi concentrado por ultrafiltração/diafiltração com uma membrana consistindo de celulose regenerada e com um corte de peso molecular de 30 kD usando um sistema de tampão consistindo de 20 mM de Hepes, 150 mM de NaCl, 0,5% de sacarose, pH 7,4.Exemplo 8
[0096] Caracterização in vitro de rFVIII PEGuilado com PEG-SG 20 kD ramificado
[0097] RFVIII derivado do processo de fabricação Advate foi PEGuilado via resíduos de lisina usando um reagente PEG-SG ramificado de acordo com o exemplo 7 e o produto PEGuilado rFVIII foi caracterizado bioquimicamente como descrito no exemplo 2.
Figure img0008
[0098] Os dados na tabela 3 mostram que na preparação de rFVIII PEGuilado a atividade biológica (expressa pela relação de atividade cromogênica de antígeno FVIII a FVIII) completamente recuperado em comparação com a atividade biológica do rFVIII nativo (100%).
[0099] O rFVIII PEGuilado foi caracterizado por SDS-PAGE e técnicas de immunoblotting sob condições de redução usando um gel gradiente de poliacrilamida de 4-12% como descrito no exemplo 3. Os resultados são resumidos na FIG. 5. O blot demonstra a estrutura de domínio de rFVIII nativo e PEGuilado. É demonstrado que o rFVIII PEGuilado tem bandas mais amplas e massas moleculares elevadas que a proteína recombinante nativa.
[00100] Para análise mais detalhada de PEGuilação da preparação de rFVIII por SDS-PAGE e técnicas de immunoblotting, o rFVIII nativo e PEGuilado foi digerido com 1 nM de trombina durante 60 minutos a 60°, que resultou na clivagem específica da molécula FVIII com produtos de degradação bem definidos, como descrito no exemplo 5. Os fragmentos foram separados por SDS-PAGE seguido por electroblotting e visualizados por anticorpos anti-FVIII diferentes. Como visto na FIG. 6, todos os domínios foram PEGuilados, apesar de em uma extensão diferente. O domínio B foi fortemente PEGuilado. Vários graus de PEGuilação (mono-, di-, tri- PEGuilação) podem ser observados no domínio A3 de cadeia leve. Os resultados indicam que o rFVIII PEGuilado pareceu ser mais resistente para trombina.
[00101] A taxa de ativação e inativação por trombina foi monitorada por um teste de co-fator de FIXa como descrito no exemplo 6. A taxa de inativação de pseudo-primeiro ordem de FVIII foi determinada por configuração da parte declinante das curvas com um ajuste exponencial único.
Figure img0009
[00102] Como mostrado na FIG. 7 e tabela 4, o rFVIII PEGuilado mostrou uma taxa de inativação mais lenta em ambas as concentrações de trombina aplicadas.Exemplo 9
[00103] PEGuilação de rFVIII via porção de carboidrato
[00104] Para a preparação de um conjugado PEG-rFVIII via resíduos de carboidrato, uma solução de rFVIII (concentração final: 1,2 mg/ml) é preparada em 25 mM de tampão fosfato, pH 6,7. NaIO4 é adicionado (concentração final 0,3 mM) para a oxidação de resíduos de carboidrato (Roberts et al.; Advanced Drug Del Rev.; 54: 459-76 (2002); Meir e Wilchek; Meth Enzymol; 138: 429-42(1987)). A reação foi resfriada bruscamente por adição de glicerol em uma concentração final de 10%, e o excesso de reagentes foi separado por repetição da centrifugação usando dispositivos Amicon Micron-10 (Amicon, Billerica, MA). PEG-hidrazida (MW 3300 Da / Nektar, Huntsville, Alabama) foi adicionada para dar uma concentração final de 1,5 mM de reagente. A PEGuilação foi então realizada durante 2h em temperatura ambiente. Subsequentemente, o conjugado obtido e o excesso de reagente foi separado por repetir a centrifugação em dispositivos Amicon Micron-10 usando 25 mM de tampão fosfato, pH 6,7.Exemplo 10
[00105] Polissialilação de rFVIII com PSA-hidrazina
[00106] Para a preparação de um conjugado PSA-rFVIII via resíduos de carboidrato, uma solução de rFVIII (concentração final: 1 mg/ml) é preparada em 20 mM de tampão de acetato de sódio, pH 6.0. NaIO4 é adicionado (concentração final 0,25 mM) para a oxidação de resíduos de carboidrato. A oxidação é realizada durante 60 min a 4oC no escuro. Bissulfito de sódio (concentração final 25 mM) é adicionado para parar a reação. O excesso de periodato de sódio é separado por filtração com gel em colunas DG-10 (Bio-Rad). Subsequentemente, PSA-hidrazina com um comprimento de cadeia de 20 kD (preparado de acordo com WO 2006/016168) é adicionado (concentração final 10 mM). O procedimento de polissialilação é realizado durante 2 h em temperatura ambiente. O rFVIII polissialilado é purificado por HIC em Butil-Sepharose (GE- Healthcare). Uma solução de 5 M de NaCl é adicionada na mistura para dar uma concentração final de 3M de NaCl. Esta mistura é aplicada na coluna carregada com Butil-Sepharose (GE-Healthcare) e a eluição do conjugado rFVIII-PSA é realizada com 50 mM de tampão Hepes, pH 7,4, contendo 6,7 mM de CaCl2. Após eluição do conjugado, o pH é ajustado a pH 6,9.Exemplo 11
[00107] Purificação e derivatização de ácido polissiálico
[00108] Ácido polissiálico foi purificado por cromatografia de troca aniônica em Q- Sepharose FF como descrito em WO 06016161A1. Cinco gramas de PSA foram dissolvidos em 50 mL de 10 mM de tampão de trietanolamina, pH 7,4 contendo 25 mM de NaCl (= tampão de partida). Esta solução foi aplicada sobre uma coluna de Pharmacia XK50 carregada com Q- Sepharose FF (GE Healthcare, Munich, Alemanha), que foi equilibrada com tampão de partida. A coluna foi depois lavada com tampão de partida de 8 volumes de coluna (CV) e a ligação de PSA foi eluída em etapas com 3CV 200 mM de NaCl, 350 mM de NaCl e 500 mM de NaCl em tampão de partida. A fração eluída com 350 mM de NaCl mostrou um peso molecular de 20 kDa como indicado por SDS eletroforese em gel. Esta fração foi concentrada por ultrafiltração usando uma membrana 5 kD feita de celulose regenerada (Millipore, Billerica, MA) e subsequentemente diafiltrada contra 50 mM de tampão fosfato, pH 7.2. O PSA foi oxidado com NaIO4 e um grupo amino primário terminal foi introduzido por aminação redutiva como descrito em WO 05016973A1. Para aminação redutiva, 11 mL de uma solução de 2 M de NH4Cl foram adicionados a 20 mL de uma solução contendo 58 mg de PSA oxidado / ml em 50 mM de tampão fosfato, pH 7.2. Uma solução de 5M de NaCNBH3 em 1M de NaOH foi então adicionada para dar uma concentração final de 75 mM. A reação foi realizada durante 5d em temperatura ambiente a pH 8,0.
[00109] A mistura foi então dialisada contra uma solução de (NH4)2CO3 (50 mg/L) contendo 10 mM de NaCl e subsequentemente contra 50 mM de tampão fosfato, pH 8,0, contendo 5 mM de EDTA. Um grupo sulfidrila foi depois introduzido por reação do grupo amino primário terminal com 2-iminotiolano (reagente de Traut / Pierce, Rockford, IL). A reação foi realizada em 50 mM de tampão fosfato, pH 8,0, contendo 5 mM de EDTA com 20 vezes o excesso molar de reagente durante 1h em temperatura ambiente. Finalmente a solução de PSA contendo um grupo SH livre terminal foi submetida para ultrafiltração/diafiltração usando uma membrana com um corte de 5 kD e feito de celulose regenerada (Millipore, Billerica, MA). Exemplo 12
[00110] Polissialilação de rFVIII pelo uso de um ligante de reticulação heterobifuncional
[00111] Para a copulação de PSA-SH para rFVIII, o ligante de reticulação heterobifuncional MBPH (hidrazida de ácido 4-[4-N- maleimidofenil] butírico-HCl/Pierce, Rockford, IL) contendo uma hidrazida seletiva para carboidrato em um grupo maleimida sulfidril-reativo foi usado (Chamow et al., J Biol Chem; 267:15916-22 (1992)). PSA-SH contendo um grupo sulfidrila ativo foi preparado de acordo com o exemplo 11.
[00112] Dois ml de rFVIII (638 mg, 3,856 mg/ml de concentração de proteína) foram transferidos para o tampão de oxidação (50 mM de acetato de sódio, pH 6) usando colunas de dessalinização (Bio- Rad Econopac 10 DG) de acordo com as instruções do fabricante. A proteína foi então oxidada com 0,25mM de NaIO4 (Merck) (1h a 4oC no escuro). A reação de oxidação foi resfriada bruscamente com glicerol em uma concentração final de 10%. Glicerol e NaIO4 foram removidos e a proteína foi transferida no tampão de reação (50 mM de fosfato de sódio a pH 6.5) usando colunas de dessalinização (Bio-Rad Econopac 10 DG) de acordo com as instruções do fabricante. Uma mistura contendo 1 mg de MBPH/mg proteína e PSA-SH (200 vezes de excesso molar para proteína) foram a seguir incubados durante 2h a RT a pH 6.5. O excesso de ligante foi removido usando colunas de dessalinização (Bio-Rad Econopac 10 DG) de acordo com as instruções do fabricante e o conjugado ligante-PSA foi transferido em um tampão de reação.
[00113] O conjugado MPBH-PSA foi adicionado no rFVIII oxidado (0,105 mg/ml de proteína) e a mistura de reação foi incubada durante 2h a RT sob agitação suave. O conjugado rFVIII-PSA foi purificado por HIC usando uma coluna Butyl Sepharose pré-carregada (GE Healthcare, Butyl HiTrap FF 5 ml). Para permitir as interações hidrofóbicas do conjugado com Butyl Sepharose a amostra foi resfriada a 2-8oC e a potência iônica da mistura de reação foi aumentada para uma condutividade de aproximadamente 185 mS/cm por adicionar uma solução de tampão contendo 5 M de NaCl (50 mM de Hepes, 5 M de NaCl, 6,7 mM de CaCl2, 0,01% de Tween, pH 6,9). A mistura de reação foi carregada sobre a coluna que foi equilibrada com tampão de equilíbrio pH 6,9 (contendo 50 mM de Hepes, 3 M de NaCl, 6,7 mM de CaCl2, 0,01% de Tween 80) com uma taxa de fluxo de 1,2 cm/min. Amostra não ligada foi lavada com 10 volumes de coluna (CV) de tampão de equilíbrio. O conjugado foi eluído com um tampão de potência iônica baixa, pH 7,4 (50 mM de Hepes, 6,7 mM de CaCl2) com uma taxa de fluxo de 1,2 cm /min. Durante o processo de cromatografia, as amostras e os tampões foram resfriados usando um banho de gelo. Finalmente, o pH do eluado foi ajustado a 6,9.Exemplo 13
[00114] Conjugação de rFVIII com dextrano
[00115] Para a conjugação de rFVIII com dextrano, 2 ml de rFVIII (638 mg, 3,4 mg/ml de proteína) foram transferidos para o tampão de oxidação (50 mM de acetato de sódio, pH 6) usando colunas de dessalinização (Bio-Rad Econopac 10 DG) de acordo com a instrução do fabricante. A proteína foi então oxidada com 0,25mM de NaIO4 (1h a 4oC no escuro). A proteína oxidada foi primeiro concentrada usando colunas giratórias de ultrafiltração vivaspin (Sartorius Stedim Biotech GmbH) com um MWCO de 30 kDa de acordo com as instruções do fabricante. A amostra foi a seguir dialisada contra o tampão de reação (50 mM de fosfato de sódio a pH 7) durante a noite a 4oC.
[00116] Após diálise, 26,58 mg de di-hidrazida de ácido adípico (ADH) (Sigma) foram adicionados (500 vezes do excesso molar) e a mistura de reação foi incubada 2 h a RT a pH 7 sob agitação suave. ADH foi removido usando colunas de dessalinização (Bio-Rad Econopac 10 DG) de acordo com as instruções do fabricante. Dez mg de dextrano aldeído ativado (Pierce) foram adicionados (17 vezes de excesso molar para a proteína) e a mistura foi incubada durante 2 h a RT, pH 7.
[00117] O conjugado foi purificado por cromatografia de IEX em Q- Sepharose HP (GE-Healthcare). A amostra foi carregada sobre uma coluna (6,4 mm x 3 cm, V = 1ml) que foi equilibrada com tampão A (50 mM de fosfato de sódio a pH 6,8) com uma taxa de fluxo de 0,5 ml/min. A amostra não ligada foi lavada com 5 CV de tampão A. Finalmente, o conjugado foi eluído com um gradiente de sal linear (0-100% de tampão B [50 mM de fosfato de sódio a pH 6,8 + 1M de NaCl] em 10 CV) com uma taxa de fluxo de 0,5 ml/min.

Claims (18)

1. Método de conjugar um polímero solúvel em água a uma porção de carboidrato oxidada de fator VIII, caracterizado pelo fato de compreender contatar uma porção de carboidrato oxidada com um polímero solúvel ativado em água sob condições que permitem a conjugação,em que o polímero solúvel em água é selecionado do grupo consistindo de PEG, PSA e dextrano,e em que a porção de carboidrato oxidada de fator VIII está localizada no domínio B do fator VIII.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polímero solúvel em água ativado é selecionado dentre o grupo consistindo de PEG-hidrazida, PSA-hidrazina e dextrano ativado com aldeído.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a porção de carboidrato é oxidada por incubação em um tampão compreendendo NaIO4.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o produto do método retém pelo menos 60% da atividade biológica do FVIII nativo.
5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o produto do método retém pelo menos 70% da atividade biológica do FVIII nativo.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o produto do método retém pelo menos 80% da atividade biológica do FVIII nativo.
7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o PEG, PSA ou dextrano tem um peso molecular superior a 10.000 Da a cerca de 125.000 Da.
8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o PEG, PSA ou dextrano tem um peso molecular de cerca de 18.000 Da a cerca de 25.000 Da.
9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o PEG, PSA ou dextrano está ligado à fração de carboidrato por meio de um ligante, de preferência em que o ligante é liberável ou hidrolisável e, mais preferencialmente, em que o ligante é hidrazida de ácido 4- [4-N-maleimidofenil] butírico.
10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o Fator VIII é um Fator VIII recombinante ou é um Fator VIII plasmático.
11. Construto proteináceo, caracterizado pelo fato de compreender:(a) uma molécula de fator VIII; e(b) pelo menos um polímero solúvel em água ligado na referida molécula de fator VIII, em que referido polímero solúvel em água é fixado ao fator VIII via uma ou mais porções de carboidrato localizadas no fator VIII de domínio Bem que o polímero solúvel em água é selecionado do grupo consistindo de PEG, PSA e dextrano,(c) em que a construção proteica retém pelo menos 50% da atividade biológica do fator VIII nativo.
12. Construto proteináceo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o produto do método retém pelo menos 60% da atividade biológica do FVIII nativo.
13. Construto proteináceo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o produto do método retém pelo menos 70% da atividade biológica do FVIII nativo.
14. Construto proteináceo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o produto do método retém pelo menos 80% da atividade biológica do FVIII nativo.
15. Construto proteináceo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o PEG, PSA ou dextrano tem um peso molecular superior a 10.000 Da a cerca de 125.000 Da.
16. Construto proteináceo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o PEG, PSA ou dextrano tem um peso molecular de cerca de 18.000 Da a cerca de 25.000 Da.
17. Construto proteináceo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o PEG, PSA ou dextrano está ligado à fração de carboidrato por meio de um ligante, de preferência em que o ligante é liberável ou hidrolisável e, mais preferencialmente, em que o ligante é hidrazida de ácido 4- [4-N-maleimidofenil] butírico.
18. Construto proteináceo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o Fator VIII é um Fator VIII recombinante ou é um Fator VIII plasmático.
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