PT2318050E - Conjugados de polímero com fator viii - Google Patents

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PT2318050E
PT2318050E PT97909352T PT09790935T PT2318050E PT 2318050 E PT2318050 E PT 2318050E PT 97909352 T PT97909352 T PT 97909352T PT 09790935 T PT09790935 T PT 09790935T PT 2318050 E PT2318050 E PT 2318050E
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peg
rfviii
psa
factor viii
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PT97909352T
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Peter Turecek
Juergen Siekmann
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Baxter Healthcare Sa
Baxter Int
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Description

1
DESCRIÇÃO "CONJUGADOS DE POLÍMERO COM FATOR VIII"
CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a uma construção proteica compreendendo fator de coagulação VIII (FVIII) que está ligada a pelo menos um polímero solúvel em água, incluindo um poli(óxido de alquileno), tal como
polietilenoglicol. A presente invenção refere-se ainda a métodos para prolongar a semivida in vivo de FVIII no sangue de um mamífero que tenha um distúrbio hemorrágico associado a defeitos ou deficiências funcionais de FVIII. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 fator de coagulação VIII (FVIII) circula no plasma numa concentração muito baixa e está ligado não covalentemente ao fator de von Willebrand (VWF). Durante a hemóstase, o FVIII separa-se do VWF e atua como um cofator para a ativação de fator X (FX) mediada por fator IX (FIXa) ativado aumentando a taxa de ativação na presença de cálcio e fosfolipídeos ou membranas celulares. 0 FVIII é sintetizado como um precursor de cadeia única de aproximadamente 270-330 kD com a estrutura de domínio A1-A2-B-A3-C1-C2. Quando purificado a partir de plasma (por exemplo, "derivado de plasma" ou "plasmático"), o FVIII é composto por uma cadeia pesada (A1-A2-B) e uma cadeia leve (A3-C1-C2). A massa molecular da cadeia leve é 80 kD enquanto, devido a proteólise dentro do domínio B, a da cadeia pesada está no intervalo de 90-220 kD. O FVIII é também sintetizado como uma proteína recombinante para utilização terapêutica em distúrbios hemorrágicos. Vários ensaios in vitro têm sido concebidos para determinar a potencial eficácia do FVIII recombinante (rFVIII) como uma medicina terapêutica. Estes ensaios imitam os efeitos in vivo de FVIII endógeno. O tratamento 2 com trombina in vitro de FVIII resulta num aumento rápido e subsequente diminuição da sua atividade pró-coagulante, como medido por um ensaio in vitro. Esta ativação e inativação coincidem com proteólise limitada específica tanto na cadeia pesada como na cadeia leve, que altera a disponibilidade de diferentes epitopos de ligação no FVIII, por exemplo, permitindo que o FVIII se dissocie do VWF e se ligue a uma superfície fosfolipídea ou alterando a capacidade de ligação a determinados anticorpos monoclonais. A falta ou disfunção de FVIII está associada ao distúrbio hemorrágico mais frequente, hemofilia A. 0 tratamento de eleição para a gestão de hemofilia A é uma terapia de substituição com derivados de plasma ou concentrados de rFVIII. Pacientes com hemofilia A grave com níveis de FVIII abaixo de 1%, estão geralmente em terapia profilática com o objetivo de manter o FVIII acima de 1% entre doses. Tendo em conta as semividas médias dos vários produtos de FVIII na circulação, estas podem ser normalmente alcançadas dando FVIII duas ou três vezes por semana.
Existem muitos concentrados no mercado para o tratamento de hemofilia A. Um destes concentrados é o produto recombinante Advate®, o qual é produzido em células de CHO e fabricado por Baxter Healthcare Corporation. Proteínas plasmáticas ou albumina humanas ou animais não são adicionadas no processo de cultura celular, purificação, ou formulação final deste produto. 0 objetivo de muitos fabricantes de concentrados de FVIII e fármacos de polipéptidos terapêuticos é desenvolver um produto de próxima geração com propriedades farmacodinâmicas e farmacocinéticas melhoradas, enquanto se mantêm todas as outras características do produto.
Os fármacos de polipéptidos terapêuticos são rapidamente degradados por enzimas proteolíticas e 3 neutralizados por anticorpos. Isto reduz as suas semividas e tempos de circulação, limitando, deste modo, as suas eficácias terapêuticas. A adição de um polímero solúvel ou carboidrato a um polipéptido foi mostrado prevenir a degradação e aumentar a semivida dos polipéptidos. Por exemplo, a peguilação de fármacos de polipéptidos protege-os e melhora os seus perfis farmacodinâmicos e farmacocinéticos (Harris J M et Chess R B, Nat Rev Drug Discov 2003; 2:214-21). O processo de peguilação vincula unidades de repetição de polietilenoglicol (PEG) a um fármaco de polipéptidos. A peguilação de moléculas pode levar a resistência aumentada de fármacos a degradação enzimática, semivida aumentada in vivo, frequência de dosagem reduzida, imunogenicidade diminuída, estabilidade física e térmica aumentada, solubilidade aumentada, estabilidade líquida aumentada, e agregação reduzida.
Assim, a adição de um polímero solúvel, tal como através de peguilação, é uma abordagem para melhorar as propriedades de um produto de FVIII O estado da técnica é documentado por diferentes patentes e pedidos de patentes: A Pat. U.S. N°. 6.037.452 descreve um conjugado poli(óxido de alquileno)-FVIII ou FIX, onde a proteína está covalentemente ligada a um poli(óxido de alquileno) através de grupos carbonilo do dito FVIII. O documento WO 2008025856 descreve um FVIII com domínio B deletado ligado a polietilenoglicol através de frações de carboidrato oxidadas. O documento EP 1258497B1 descreve um método para preparar conjugados de FVIII e um polímero biocompatível. Esta patente foi suplementada por uma publicação de Rõstin et al. (Bioconj Chem 2000; 11:387-96). Os conjugados compreendem um FVIII recombinante com o domínio B deletado modificado com monometoxipolietilenoglicol. O conjugado tinha função FVIII reduzida e a atividade coagulante diminuiu rapidamente com o grau de modificação. 4 0 documento WO 04075923A3 descreve um conjugado molecular polimero-FVIII compreendendo uma pluralidade de conjugados em que cada conjugado tem um a três polímeros solúveis em água covalentemente ligados a uma molécula de FVIII. A molécula de FVIII tem o domínio B deletado. A Pat. U.S. N°. 4.970.300 descreve um FVIII modificado, em que um conjugado infusível compreendendo uma proteína com atividade FVIII foi covalentemente ligado a um ligando não antigénico. A Pat. U.S. N°. 6.048.720 descreve conjugados de um polipéptido e um polímero biocompatível. O documento WO 94/15625 descreve FVIII ligado a polietilenoglicol tendo um peso molecular preferido não maior do que 5 000 Daltons.
Continua a existir a necessidade de um FVIII com um polímero solúvel para alargar a semivida do FVIII in vivo, por exemplo, um FVIII peguilado, tal como FVIII de comprimento total com PEG maior que 10 000 Daltons conjugado a si, o qual conserva atividade funcional ao mesmo tempo que proporciona uma semivida alargada in vivo, em comparação com FVIII não peguilado.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um método de conjugar PEG, ácido polissiálico (PSA) ou dextrano a uma fração de carboidrato oxidada de Fator VIII de acordo com a reivindicação 1. A presente invenção também se refere a uma molécula proteínica de acordo com a reivindicação 6.
De acordo com a presente invenção, um método de conjugar um polímero solúvel em água a uma fração de carboidrato oxidada de FVIII é proporcionado compreendendo contactar a fração de carboidrato oxidada com um polímero solúvel em água ativado sob condições que permitam a conjugação. O polímero solúvel em água é selecionado a partir do grupo que consiste em PEG, ácido polissiálico (PSA) e dextrano. O polímero solúvel em água ativado é 5 selecionado a partir do grupo que consiste em PEG-hidrazida, PSA-hidrazina e dextrano ativado por aldeído. Noutro aspeto da invenção, a fração de carboidrato é oxidada por incubação num tampão compreendendo NaI04. Ainda noutro aspeto da invenção, a fração de carboidrato oxidada de FVIII está localizada no domínio B de FVIII.
Noutra forma de realização da invenção, um FVIII modificado produzido pelo método de acordo com qualquer dos métodos anteriormente mencionados é proporcionado. De acordo com a presente invenção, uma molécula proteínica é proporcionada compreendendo (a) uma molécula de Fator VIII; e (b) um, pelo menos, polímero solúvel em água ligado à dita molécula de Fator VIII, em que o polímero solúvel em água é ligado ao Fator VIII através de uma ou mais frações de carboidrato localizadas no domínio B do Fator VIII. 0 polímero solúvel em água é selecionado a partir do grupo que consiste em PEG, PSA e dextrano.
FIGURAS
A FIG. 1 mostra a ampliação e aumento da massa do FVIII após conjugação com PEG medidos por SDS-PAGE com subsequente imunotransferência. A FIG. 2 mostra a farmacocinética do conjugado PEG-rFVIII comparativamente a FVIII não conjugado em ratinhos hemofílicos. Quadrados abertos: PEG-rFVIII, dose de 200 UI FVIII/kg. Diamantes fechados: rFVIII nativa, dose de 200 UI FVIII/kg. A FIG. 3 mostra a análise detalhada de locais de peguilação por SDS-PAGE usando vários anticorpos anti-FVIII. A FIG. 4 mostra a ativação e inativação induzidas por trombina do rFVIII nativo e peguilado. A FIG. 5 mostra as bandas demonstrando os domínios do rFVIII nativo e peguilado. A FIG. 6 mostra o grau de peguilação de vários domínios do rFVIII nativo e peguilado. 6 A FIG. 7 mostra a taxa de inativação de trombina do rFVIII nativo e peguilado.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A invenção é uma construção proteica compreendendo uma molécula de FVIII com pelo menos uma porção do dominio B intacta, ligada a um polímero solúvel em água o qual inclui PEG, ácido polissiálico (PSA) ou dextrano. Numa forma de realização da invenção, o polímero solúvel em água é uma molécula de polietilenoglicol com um peso molecular maior que 10 000 Daltons. Noutra forma de realização, o polímero solúvel em água tem um peso molecular maior do que 10 000 Da a 125 000 Da, cerca de 15 000 Da a 20 000 Da, ou cerca de 18 000 Da a cerca de 25 000 Da. Numa forma de realização, a construção mantém a atividade funcional completa de produtos terapêuticos de FVIII padrão, e proporciona uma semivida in vivo alargada, em comparação aos produtos terapêuticos de FVIII padrão. Noutra forma de realização, a construção mantém pelo menos 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56,57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 , 110, 120 , 130, 140, ou 150 po: r cento (%) de atividade biológica relativamente ao Fator VIII nativo. Numa aspeto relacionado, as atividades biológicas da construção e do Fator VIII nativo são determinadas pelos rácios de atividade cromogénea para valor antigénico de FVIII (FVIII:Chr:FVIII:Ag). Ainda noutra forma de realização da invenção, a semivida da construção é diminuída ou aumentada 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 vezes em relação à semivida in vivo do Fator VIII nativo. O material de iniciação da presente invenção é FVIII, o qual pode ser derivado de plasma humano, ou produzido por técnicas de engenharia de recombinação, como descrito nas patentes Pat. U.S. N°. 4.757.006; Pat. U.S. N°. 5.733.873; 7
Pat. U.S. N°. 5.198.349; Pat. U.S. N°. 5 250 421; Pat. U.S. N° . 5.919.766; documento EP 306 968.
Aqui, o termo "Fator VIII" ou "FVIII" refere-se a qualquer molécula de FVIII a qual tem pelo menos uma porção do domínio B intacta, e a qual exibe atividade biológica que está associada ao FVIII nativo. Numa forma de realização da invenção, a molécula de FVIII é Fator VIII de comprimento completo. A molécula de FVIII é uma proteína que é codificada por sequências de ADN capazes de hibridizar com ADN que codifica Fator VIII:C. Tal proteína pode conter deleções de aminoácidos em vários locais entre ou dentro dos domínios A1-A2-B-A3-C1-C2 (Pat. U.S. N°. 4.868.112). A molécula de FVIII pode também ser um análogo do FVIII nativo em que um ou mais resíduos de aminoácidos foram substituídos por mutagénese dirigida.
As moléculas de FVIII úteis para a presente invenção incluem a proteína inteira, precursores da proteína, subunidades ou fragmentos da proteína biologicamente ativos ou funcionais, e derivados funcionais desta, bem como variantes desta, como descrito abaixo. Em referência ao FVIII, pretende-se incluir todas as potenciais formas de tais proteínas e em que cada das formas de FVIII tem pelo menos uma porção ou todas do domínio B nativo intactas.
De acordo com a presente invenção, o termo "Fator VIII recombinante" (rFVIII) pode incluir qualquer rFVIII, heterólogo ou de ocorrência natural, obtido através de tecnologia de ADN recombinante, ou um derivado biologicamente ativo deste. Em determinadas formas de realização, o termo engloba proteínas como descritas acimas e ácido nucleicos, codificando um rFVIII da invenção. Tais ácidos nucleicos incluem, por exemplo, genes, pré-mARNs, mARNs, variantes polimórficas, alelos, mutantes sintéticos e de ocorrência natural. As proteínas abrangidas pelo termo rFVIII incluem, por exemplo, aquelas proteínas e polipéptidos descritos aqui acima, proteínas codificadas por um ácido nucleico descrito acima, homólogos interespécies e outros polipéptidos que: (1) têm uma sequência de aminoácidos que tem maior do que cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de : 98% ou cerca de 99% ou maior identidade da sequência de aminoácidos, ao longo de uma região de pelo menos 25, cerca de 50, cerca de 100, cerca de 200 , cerca de 300, cerca de 400, ou mais aminoácidos (até à sequência de comprimento total de 406 aminoácidos para a proteína nativa madura), para um polipéptido codificado por um ácido nucleico referenciado ou uma sequência de aminoácidos aqui descrita; e/ou (2) que se ligam especificamente a anticorpos, por exemplo, anticorpos policlonais ou monoclonais, gerados contra um imunogénio compreendendo uma sequência de aminoácidos referenciada como aqui descrita, um fragmento imunogénico desta, e/ou uma variante modificada de forma conservadora desta.
Os polinucleótidos codificando um rFVIII da invenção incluem aqueles que (1) hibridizam especificamente sob condições de hibridização restringentes num ácido nucleico codificando uma sequência de aminoácidos referenciada aqui descrita, e variantes modificadas de forma conservadora desta; (2) têm uma sequência de ácido nucleicos que tem maior do que cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou maior identidade da sequência de nucleótidos, ao longo de uma região de pelo menos 25, cerca de 50, cerca de 100, cerca de 150, cerca de 200, cerca de 250, cerca de 500, cerca de 1000, ou mais nucleótidos (até à sequência de comprimento total de 1218 nucleótidos da proteína matura), para uma sequência de ácidos nucléicos de referência como aqui descrita.
Como aqui utilizado, "FVIII endógeno" inclui FVIII com origem no mamífero que pretende receber tratamento. O termo 9 também inclui FVIII transcrito a partir de um transgene ou qualquer outro ADN exógeno presente no dito mamífero. Como aqui utilizado, "FVIII exógeno" inclui FVIII que não tem origem no dito mamífero.
Os polipéptidos variantes (ou análogos) incluem variantes de inserção, em que um ou mais resíduos de aminoácidos são adicionados a uma sequência de aminoácidos do FVIII desta invenção. As inserções podem estar localizadas em qualquer ou ambos os terminais da proteína, e/ou podem estar posicionadas dentro de regiões internas da sequência de aminoácidos do FVIII. As variantes de inserção, com resíduos adicionais em qualquer ou ambos os terminais, incluem, por exemplo, proteínas de fusão e proteínas incluindo etiquetas de aminoácidos e outros marcadores de aminoácidos. Num aspeto, a molécula de FVIII pode conter opcionalmente uma Met N-terminal, especialmente quando a molécula é expressa de forma recombinante numa célula bacteriana tal como E. coli.
Em variantes de deleção, um ou mais resíduos de aminoácidos num polipéptido de FVIII como aqui descrito são removidos. As deleções podem ser efetuadas em um ou ambos os terminais do polipéptido de FVIII, e/ou com remoção de um ou mais resíduos dentro da sequência de aminoácido de FVIII. As variantes de deleção incluem, deste modo, todos os fragmentos de uma sequência polipeptídica de FVIII.
Em variantes de substituição, um ou mais resíduos de aminoácidos de um polipéptido de FVIII são removidos e substituídos por resíduos alternativos. Num aspeto, as substituições são conservadoras em natureza e substituições conservadoras deste tipo são bem conhecidas na técnica. Alternativamente, a invenção abrange substituições que são também não conservadoras. Substituições conservadoras exemplificativas são descritas em Lehninger, [Biochemistry, 2a Edição; Worth Publishers, Inc., Nova York (1975), pp. 71-77] e definidas imediatamente abaixo. 10
SUBSTITUIÇÕES CONSERVADORAS
CARACTERÍSTICA DA CADEIA LATERAL AMINOÁCIDO Não polar (hidrofóbico): A. Alifática A L I V P B. Aromática F W C. Contendo enxofre M D. Limítrofe G Polar descarregada: A. Hidroxilo S T Y B. Amidas N Q C. Sulfidrilo C D. Limítrofe G Carregada positivamente (básica) K R H Carregada negativamente (ácida) D E
Alternativamente, substituições conservadoras exemplificativas são definidas imediatamente abaixo.
SUBSTITUIÇÕES CONSERVADORAS II RESÍDUO ORIGINAL SUBSTITUIÇÃO EXEMPLIFICATIVA
Ala (A) Vai, Leu, Ile Arg (R) Lys, Gin, Asn Asn (N) Gin, His, Lys, Arg Asp (D) Glu Cys (C) Ser Gin (Q) Asn Glu (E) Asp His (H) Asn, Gin, Lys, Arg Ile (I) Leu, Vai, Met, Ala, Phe, Leu (L) Ile, Vai, Met, Ala, Phe Lys (K) Arg, Gin, Asn Met (M) Leu, Phe, Ile Phe (F) Leu, Vai, Ile, Ala Pro (P) Gly Ser (S) Thr Thr (T) Ser 11
RESÍDUO ORIGINAL SUBSTITUIÇÃO EXEMPLIFICATIVA
Trp (W) Tyr (Y) Vai (V)
Tyr
Trp, Phe, Thr, Ser Ile, Leu, Met, Phe, Ala
Um polinucleótido ou sequência polipeptídica de "ocorrência natural" deriva tipicamente de um mamífero incluindo um primata, por exemplo, ser humano; roedor, por exemplo, ratazana, ratinho, hamster; vaca, porco, cavalo ovelha, ou qualquer mamífero. Os ácidos nucleicos e proteínas da invenção podem ser moléculas recombinantes (por exemplo, heterólogos e codificar a sequência de tipo selvagem ou uma variante desta, ou de ocorrência natural). Os polinucleótidos e sequências polipeptídicas de referências incluem, por exemplo, Uni-ProtKB/Swiss-Prot P00451 (FA8_HUMAN); Gitschier J et al., Characterization of the human Factor VIII gene, Nature, 312(5992): 326-30 (1984); Vehar GH et al., Structure of human Factor VIII, Nature, 312(5992):337-42 (1984); e Thompson AR. Structure and Function of the Factor VIII gene and protein, Semin Thromb Hemost, 2003:29; 11-29 (2002).
Como aqui utilizado, "derivado biologicamente ativo" ou "variante biologicamente ativa" inclui qualquer derivado ou variante de uma molécula tendo substancialmente as mesmas propriedades funcionais e/ou biológicas da dita molécula, tais como propriedade de ligação, e/ou a mesma base estrutural, tal como uma estrutura central peptídica ou uma unidade polimérica básica.
Como aqui utilizado, "FVIII derivado de plasma" ou "plasmático" inclui todas as formas da proteína encontradas no sangue obtidas de um mamífero tendo a propriedade de ativação da via da coagulação.
Em vários aspetos, a produção de rFVIII inclui qualquer método conhecido na técnica para (i) a produção de ADN recombinante por engenharia genética, (ii) introdução do ADN 12 recombinante em células procariotas ou eucariotas através de, por exemplo, transfeção, eletroporação ou microinjeção, (iii) cultura das ditas células transformadas, (iv) expressão do rFVIII, por exemplo, constitutivamente ou após indução, e (v) isolamento do dito rFVIII, por exemplo, a partir do meio de cultura ou por recolha das células transformadas, de modo a (vi) obter rFVIII purificado.
Noutros aspetos, o rFVIII é produzido por expressão num sistema hospedeiro procariota ou eucariota adequado caracterizado por produzir uma molécula de rFVIII farmacologicamente aceitável Os exemplos de células eucariotas são células de mamíferos, tais como CHO, COS, HEK 293, BHK, SK-Hep e HepG2.
Ainda noutros aspetos, uma ampla variedade de vetores são usados para a preparação do rFVIII e são selecionados de vetores de expressão eucariótica e procariótica. Os exemplos de vetores para expressão procariótica incluem plasmídeos tais como pRSET, pET e pBAD, em que os promotores usados nos vetores de expressão procariótica incluem um ou mais de lac, trc, trp, recA, ou araBAD. Os exemplos de vetores para expressão eucariótica incluem: (i) para expressão em leveduras, vetores tais como, pAO, pPIC, pYES ou pMET, usando promotores tais como, A0X1, GAP, GALl ou AUG1; (ii) para expressão em células de insetos, vetores tais como pMT, pAc5, pIB, pMIB ou pBAC, usando promotores tais como PH, plO, MT, Ac5, 0pIE2, gp64 ou polh, e (iii) para expressão em células de mamíferos, vetores tais como pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3 ou pBPV, e vetores derivados de, num aspeto, sistemas víricos tais como vírus da vaccinia, vírus adeno-associados, herpesvírus ou retrovírus, usando promotores tais como CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV e β-actina.
As moléculas de FVIII podem ser conjugadas com um polímero solúvel em água através de qualquer de uma variedade de métodos químicos (Roberts JM et al. , Advan 13
Drug Delivery Rev 2002; 54:459-76). Por exemplo, o FVIII pode ser peguilado pela conjugação de PEG com grupos de aminoácidos da proteína usando ésteres de N-hidroxisuccinimida (NHS). O polímero solúvel em água, por exemplo, PEG, pode ser acoplado para estar livre de grupos SH usando guímica da maleimida ou o acoplamento de hidrazidas de PEG ou aminas de PEG a frações de carboidrato do FVIII depois de oxidação prévia. O FVIII pode ser conjugado com outros polímeros solúveis em água, onde os polímeros solúveis em água são, por exemplo, óxido de poliaguileno, polivinilpirrolidona, álcool polivinílico, polioxazolina, um poli(acriloil morfolina) , carboidrato ou um polissacárido tal como ácido polissiálico (PSA) ou dextrano. O acoplamento do polímero solúvel em água pode ser levado a cabo por acoplamento direto à proteína ou através de moléculas vinculativas. Um exemplo de um linker guímico é MBPH (ácido 4-[4-N-maleimido-fenil]butírico hidrazida) contendo uma hidrazida seletiva de carboidrato e um grupo maleimida reativo a sulfidrilo (Chamow et al., J Biol Chem 1992;267:15916-22). A conjugação pode ser realizada por acoplamento direto (ou acoplamento através de sistemas vinculativos) do polímero solúvel em água ao Fator VIII sob formação de ligações estáveis. Em adição, sistemas vinculativos degradáveis, removíveis ou hidrolisáveis podem ser usados na presente invenção (Tsubery et al. J Biol Chem 2004; 279:38118-24 / Greenwald et al., J Med Chem 1999; 42:3657-67 / Zhao et al., Bioconj Chem 2006; 17:341-51 / documento WO 2006/138572A2 / documento US 7259224B2 / documento US 7060259B2) .
Como agui utilizado, uma forma de realização da invenção é o acoplamento do polímero solúvel ativado à fração de carboidrato oxidada de FVIII. O termo "polímero solúvel em água ativado" é aqui utilizado para referir-se aos polímeros solúveis em água para acoplamento ao FVIII 14 que têm um grupo funcional ativo, o qual permite a conjugação química do polímero solúvel em água com um linker ou diretamente ao FVIII (o qual contém um grupo aldeído ativo). 0 termo "fração de carboidrato oxidada" como aqui utilizada refere-se a FVIII contendo grupos aldeído livres, os quais são gerados por um agente oxidante tal como NalCq. Num aspeto da invenção, o dextrano ativado por aldeído (contendo grupos aldeído ativos) é acoplado aos grupos aldeído de FVIII através de um linker dihidrazida.
De acordo com o padrão de glicosilação de FVIII (Lenting et al; Blood, 92:3983-96(1998)), a conjugação de FVIII através de frações de carboidrato deveria provavelmente ter lugar no domínio B de FVIII. Apontar o domínio B para tais reações de conjugação é desejado, uma vez que o domínio B não desempenha um papel na atividade de FVIII. A glicoconjugação é descrita no documento WO 2008/00700275. É também aqui divulgada a modificação de FVIII através de resíduos de lisina por utilização de derivados de polietilenoglicol contendo um éster de N-hidroxisuccinimida (NHS) ativo, tal como succinato de succinimidilo, glutarato de succinimidilo ou propionato de succinimidilo. Estes derivados reagem com os resíduos de lisina de FVIII sob condições suaves formando uma ligação amida estável. O comprimento da cadeia do derivado de PEG pode ser 5 000 Da. Outros derivados de PEG com comprimentos de cadeia de 500 a 2 000 Da, 2 000 a 5 000 Da, maior do que 5 000 até 10 000 Da ou maior do que 10 000 até 20 000 Da, ou maior do que 20 000 até 150 000 Da podem ser usados incluindo estruturas lineares ou ramificadas.
Os métodos alternativos para a peguilação de grupos amino são a conjugação química com carbonatos de PEG formando ligações uretano, ou a reação com aldeídos ou cetonas por aminação redutiva formando ligações amida secundárias. 15
Uma molécula de FVIII pode ser quimicamente modificada usando derivados de PEG que estão comercialmente disponíveis. Estes derivados de PEG podem ter estruturas lineares ou ramificadas. Os exemplos de derivados de PEG contendo grupos NHS são listados abaixo.
Os seguintes derivados de PEG são exemplos daqueles comercialmente disponíveis em Nektar Therapeutics (Hunts-ville, Ala.; veja-se o catálogo de reagentes em www.nektar.com/PEG; Nektar Advanced PEGylation, lista de preços 2005-2006): mPEG-Propionato de succinimidilo (mPEG-SPA).
mPEG-a-Metilbutanoato de succinimidilo (mPEG-SMB) \\
mPEG-CHjCHjCH—C—O—N CH-: carboximetilo; HBA = ácido mPEG-CM-HBA-NHS (CM hidroxibutírico)
o
II mPEG-ÇH>C—
Estrutura de um derivado de PEG ramificado (Nektar Therapeutics): PEG com N-Hidroxisuccinimida ramificado (mPEG2-NHS) 16
Este reagente com estrutura ramificada é descrito em mais detalhe por Kozlowski et al. (BioDrugs 2001; 5:419- 29) .
Outros exemplos de derivados de PEG estão comercialmente disponíveis em NOF Corporation (Tóguio, Japão; veja-se www.nof.co.jp/english: Catálogo de 2005)
Estrutura geral de derivados de PEG lineares (NOF Corp.): O,
CH30íCH2CH;0)a—X— N
X = carboximetilo
CHí0(CH3CH20)„—CH>—C—O—N X = carboxipentilo
CHj0(CH2CH20)„-(CH;)5—C—O—N x = succinato O Ó
II II
CHjOíCHíCHiOh,-C—CH2CHí—C—O—N
O iuPEG-S ttcciaato de succiBÍBíidilo x = glutarato 17ο.
*0—N
u u
CHjOfCHjCKjOV
x !J —C—(CHVl-j—C— 0 mPEG-Gtuíarato de succiaiarálito
Estrutura de derivados de PEG ramificados (NOF Corp.): 2.3- Bis(metilpolioxietileno-oxi)-1-(1,5-dioxo-5-succinimidiloxi, pentiloxi)propano
H'iC—(ÕCH7—CH 2)„—O—ÇHi D
Ηι0-(0αΗ-,-0Ηί)η—O-CH 0 0 'V ' I II I) /^)
CH2-0-C-CH;CHjCH2—C-O-N I σ 2.3- Bis(metilpolioxietileno-oxi)-1-(succinimidil carboxipentiloxi)propano
HjC—{OCH;—CH_>)„—0—CH.
HiC—iQCHj——0—CH 0
I II CHi—0—CHiCHiCHíCHjCH;—C—
Estes derivados de propano mostram uma estrutura central de glicerol com um padrão de substituição 1,2. Derivados de PEG ramificados baseados em estruturas de glicerol com substituição 1,3 ou outras estruturas ramificadas descritas no documento US 2003/0143596A1 podem também ser utilizados.
Derivados de PEG com degradáveis (por exemplo, linkers hidrolisáveis) como descritos por Tsubery et al. (J Biol Chem 2004; 279:38118-24) e Shechter et al. (documento WO 04089280A3) podem também ser utilizados.
Surpreendentemente, o FVIII peguilado desta invenção exibe atividade funcional completa, combinada com uma semivida in vivo de FVIII alargada. Em adição, o rFVIII peguilado parece ser mais resistente contra a inativação de trombina. Isto foi demonstrado por uma variedade de métodos in vitro e in vivo, e é ilustrado pelos seguintes exemplos.
Como aqui utilizado, "frações de ácido siálico" inclui 18 monómeros ou polímeros de ácido siálico ("polissacáridos") que são solúveis numa solução ou suspensão aquosa e têm pouco ou nenhum impacto negativo, tal como efeitos secundários, em mamíferos após a administração do conjugado PSA-FVIII numa quantidade farmaceuticamente eficaz. Não existe uma limitação particular para a unidade de ácido siálico usada de acordo com a presente invenção. Os polímeros são caracterizados, num aspeto, como tendo de 1 a 4 unidades. Em determinados aspetos, diferentes unidades de ácido siálico são combinadas numa cadeia.
Frações de ácido siálico podem ser ligadas a FVIII, por exemplo, pelo método descrito na Patente U.S. N°. 4.356.170. Em várias formas de realização da invenção, o composto polissacarídeo é um polissacárido de ocorrência natural, um derivado de um polissacárido de ocorrência natural, ou um derivado polissacarídeo de ocorrência natural. Geralmente, todos os resíduos sacarídeos no composto são resíduos de ácido siálico.
Outras técnicas para acoplar PSA a polipéptido são também conhecidas. Por exemplo, a Publicação U.S. N°. 2007/0282096 descreve a conjugação de um derivado de amina ou hidrazida de, por exemplo, PSA, a proteínas. Em adição, a Publicação U.S. N°. 2007/0191597 descreve derivados de PSA contendo um grupo aldeído para reação com substratos (por exemplo, proteínas) na extremidade terminal redutora.
Numa forma de realização da invenção, a porção de ácido polissiálico do composto polissacarídeo é altamente hidrofílica, e noutra forma de realização o composto inteiro é altamente hidrofílico. A hidrofilia é conferida principalmente pelos grupos carboxilo pendentes das unidades de ácido siálico, bem como pelos grupos hidroxilo. A unidade sacarídea pode conter outros grupos funcionais, tais como, grupos amina, hidroxilo ou sulfato, ou combinações destes. Estes grupos podem estar presentes nos compostos sacarídeos de ocorrência natural, ou ser 19 introduzidos em compostos polissacarídeos derivados.
Os compostos polissacarídeos de utilização particular para a invenção são, num aspeto, aqueles produzidos por bactérias. Alguns destes polissacáridos de ocorrência natural são conhecidos como glicolipidos. Numa forma de realização, os compostos polissacarídeos estão substancialmente livres de unidades de galactose terminais.
Numa forma de realização da presente invenção, a semivida in vivo da construção proteica é prolongada. Numa forma de realização relacionada, a semivida in vivo da construção proteica é prolongada por pelo menos um fator de dois, enquanto noutra forma de realização a semivida in vivo é prolongada por pelo menos um fator de três, em comparação com o FVIII que não está ligado a um polímero solúvel em água.
Numa forma de realização a construção proteica da presente invenção pode ser administrada por injeção, tal como injeção intravenosa, intramuscular e intraperitonial.
Para administrar composições compreendendo uma construção proteica da presente invenção a um ser humano ou animais de teste, num aspeto, as composições compreendem um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis. Os termos "farmaceuticamente" ou "farmacologicamente aceitável" referem-se a entidades e composições moleculares que são estáveis, inibem a degradação proteica tal como produtos de agregação e clivagem, e em adição não produzem reações alérgicas ou outras reações adversas quando administrados usando vias bem conhecidas na técnica, como descrito abaixo. Os "veículos farmaceuticamente aceitáveis" incluem qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotónicos e de atraso da absorção e semelhantes clinicamente úteis, incluindo aqueles agentes divulgados acima.
Como aqui utilizado, "quantidade eficaz" inclui uma 20 dose adequada para tratar um mamífero que tenha um distúrbio hemorrágico como delineado acima.
As composições podem ser administradas de forma oral, tópica, transdérmica, parentérica, por pulverização para inalação, vaginal, retal, ou por injeção intracranial. O termo parentérico, como aqui utilizado, inclui injeções subcutâneas, intravenosa, intramuscular, injeção intracisternal, ou técnicas de infusão. A administração por injeção intravenosa, interdérmica, intramuscular, intramamária, intraperitonial, intratecal, retrobulbar, intrapulmonar e ou implantação cirúrgica num local particular é também contemplada. Geralmente, as composições estão essencialmente livres de pirógenos, bem como de outras impurezas que poderiam ser prejudiciais para o recetor.
Administrações únicas ou múltiplas das composições podem ser levadas a cabo com os níveis e padrão de dose sendo selecionados pelo médico responsável. Para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagem apropriada dependerá do tipo de doença a ser tratada, como descrito acima, da gravidade e curso da doença, se o fármaco é administrado para fins preventivos ou terapêuticos, terapia anterior, historial clínico do paciente e resposta ao fármaco, e do critério do médico assistente. É também aqui descrita uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de uma construção proteica como definido acima. A composição farmacêutica pode compreender ainda um veículo, diluente, sal, tampão ou excipiente farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica pode ser usada para tratar os distúrbios hemorrágicos acima definidos. A composição farmacêutica da invenção pode ser uma solução ou um produto liofilizado. As soluções da composição farmacêutica podem ser sujeitas a qualquer processo de liofilização adequado. São também aqui descritos kits que compreendem uma 21 composição da invenção embalada de uma forma que facilita a sua utilização para a administração a sujeitos. Tal kit inclui um composto ou composição aqui descritos (por exemplos, uma composição compreendendo uma construção proteica), embalados num recipiente tal como um frasco ou vaso vedados, com um rótulo afixado no recipiente ou incluído na embalagem que descreve a utilização do composto ou composição em prática no método. Numa forma de realização, o kit contém um primeiro recipiente com uma composição compreendendo uma construção proteica e um segundo recipiente com uma solução de reconstituição fisiologicamente aceitável para a composição no primeiro recipiente. Num exemplo, o composto ou composição é embalado numa forma farmacêutica unitária. 0 kit pode ainda incluir um dispositivo adequado para administrar a composição de acordo com uma via de administração específica. Preferivelmente, o kit contém um rótulo que descreve a utilização da composição terapêutica de proteína ou péptido.
EXEMPLOS
Exemplo de Referência 1
Peguilação de resíduos de lisina em rFVIII com mPEG-succinato de succinimidilo
Uma solução de um volume de rFVIII derivada do processo de fabrico de Advate (3 400 U/ml) foi filtrada em gel utilizando colunas Econo-Pac 10DG (Bio-Rad) usando tampão HEPES a 20 mM, NaCl a 150 mM, pH 7,4, contendo sacarose a 0,5% e polissorbato 80 a 0,1%. Em seguida mPEG-Succinato de succinimidilo (Abuchowski et al. Câncer Biochim Biophys 1984; 7:175-86) com um comprimento de cadeia de 5 000 Da (PEG-SS 5000) foi adicionado a esta solução sob agitação suave (5 mg de PEG-SS/mg de proteína) e o valor de pH foi ajustado para 7,4 por adição gota a gota de NaOH a 0,5 M. Em seguida, a peguilação foi levada a cabo sob agitação suave durante 1 hora à temperatura 22 ambiente.
Subsequentemente a mistura de reação foi aplicada sobre uma resina de cromatografia de troca iónica equilibrada (Fractogel EMD TMAE 650M/coluna Pharmacia XK-1.0, altura do leito: 15,0 cm) em tampão Hepes a 20 mM, NaCl a 150 mM, pH 7,4, contendo sacarose a 0,5% e polissorbato 80 a 0,1%. Em seguida a coluna foi lavada com 20 CV de tampão de equilíbrio para remover o reagente em excesso e o rFVIII peguilado foi eluído com tampão de eluição (Hepes a 20 mM, NaCl a 1,0 M, sacarose a 0,5%, polissorbato 80 a 0,1%, pH 7,4). O eluído foi concentrado por ultrafiltração/diafiltração com uma membrana que consiste de celulose regenerada e com um peso molecular de corte de 30 kD usando um sistema tampão consistindo de Hepes a 20 mM, NaCl a 150 mM, sacarose a 0,5%, pH 7,4. Exemplo de Referência 2
Caracterização bioquímica de rFVIII peguilado in vitro RFVIII derivado do processo de fabrico de Advate foi peguilado, de acordo com o Exemplo 1, e o produto de FVIII peguilado foi caracterizado bioquimicamente. A atividade funcional do PEG-rFVIII foi determinada pela utilização do ensaio cromogéneo de FVIII (Rosen S, Scand J Haematol 1984; 33 (Suppl 40):139-45). Este método está baseado na Ph. Eur. 5a edição (5.05) 2.7.4 Assay of Blood Coagulation Factor VIII.
Uma amostra, contendo fator VIII (FVIII:C) é misturada com trombina, fator IX ativado (FIXa), fosfolipídeos e fator X (FX) num tampão contendo cálcio. FVIII é ativado por trombina e subsequentemente forma um complexo com os fosfolipídeos, FIXa e iões de cálcio. Este complexo ativa o fator X a fator Xa o qual, por sua vez, cliva o substrato cromogéneo de FXa-1 (Ac0H*CH30C0-D-CHA-Gly-Arg-pNA). O curso de tempo de para-nitroanilina (pNA) libertada é medido com um leitor de microplacas a 405 nm. A inclinação da reação é proporcional à concentração do fator VIII na 23 amostra. 0 valor antigénico de FVIII foi medido utilizando um sistema ELISA comercialmente disponível (Cedarlane, Hornby, Ontario, Canadá) com pequenas modificações. A partir destes valores os rácios FVIII cromogéneo/FVIII antigénico foram calculados. O teor proteico nas preparações foi determinado medindo a densidade ótica a 280 nm. A partir destes dados o teor proteico foi calculado (Hoyer LW em: Human Protein Data. Installments 1-6; Heberli Ed.; Wiley V C H, Weinheim, Alemanha, 1998) e expresso em mg/ml. QUADRO 1 rFVIII PEG-rFVIII PEG-SS 5K (5 nativa mg por mg de proteína) Atividade de FVIII:Chr [U/ml] 3,430 64 FVIII:Ag [U/ml] 4,067 81 Rácio FVIII:Chr/FVIII:Ag 0,84 0,79 Recuperação de atividade biológica (%) 100 94
Os dados no Quadro 1 mostram que na preparação de rFVIII peguilado, a atividade biológica (expressa pelo rácio atividade cromogénea de FVIII para antigénica de FVIII) é recuperada para mais de 90% em comparação à atividade biológica do rFVIII nativo (100%).
Exemplo de Referência 3
Caracterização de rFVIII peguilado por SDS-PAGE e técnicas de imunotransferência O rFVIII nativo foi caracterizado por SDS-PAGE sob condições de redução usando um gel de gradiente de poliacrilamida de 4-12% obtido de Invitrogen (Carlsbad, Calif., USA) de acordo com as instruções do fabricante. Como marcadores de peso molecular (PM) marcadores Precision Plus (10 kD - 250 kD) obtidos de Bio-Rad (Hercules, Calif., USA) foram usados. Em seguida as proteínas foram 24 transferidas numa membrana de PVDF obtida de Bio-Rad (Hercules, Calif., USA) por eletro transferência e subsequentemente incubadas com um anticorpo policlonal de ovelha anti FVIII:C humano obtido de Cedarlane (Hornby, Ontário, Canadá). As últimas etapas do procedimento de imunocoloração foram incubação com um anticorpo anti-ovelha conjugado com fosfatase alcalina (ALP) obtido de Accurate (Westbury, N.Y., USA) seguida pela visualização final através da utilização de um kit de substrato de ALP (Bio-Rad, Hercules, Calif., USA). Os resultados são sumarizados na FIG. 1. A mancha demonstra a estrutura de domínio de rFVIII nativo e peguilado. É mostrado que o rFVIII peguilado tem bandas mais amplas e massas moleculares maiores que a proteína recombinante nativa Exemplo de Referência 4
Parâmetros farmacocinéticos de rFVIII peguilado num modelo de ratinhos knockout deficientes em FVIII
Ratinhos deficientes em FVIII descritos em detalhe por Bi et al. (Nat Genet 1995; 10:119-21) foram usados como um modelo de hemofilia A humana grave. Grupos de 5 ratinhos receberam uma injeção em bólus (10 ml/kg) através da veia da cauda ou com PEG-rFVIII (PEG-SS, 5K) preparado de acordo com o Exemplo 1 ou com rFVIII nativo numa dose de 200 UI FVIII/kg de peso corporal. Plasma em citrato por punção do coração após anestesia foi preparado a partir dos respetivos grupos, 5 minutos, 3, 6, 9 e 24 horas após a injeção. Os níveis de atividade de FVIII foram medidos em amostras de plasma. Os resultados desta experiência estão sumarizados na FIG. 2. A semivida média aumentou de 1,9 horas (para rFVIII nativo) a 4,9 horas (para rFVIII peguilado) , a área sob a curva (AUC) aumentou de 13,0 a 25,2 horas*UI/ml. O cálculo da semivida foi realizado com MicroMath Scientist, modelo 1 de uma biblioteca farmacocinética (MicroMath, Saint Louis, Mo., USA).
Exemplo de Referência 5 25
Análise detalhada da peguilação de rFVIII por SDS-PAGE e técnicas de imunotransferência rFVIII nativo e peguilado foi digerido com trombina a 1 nM durante 60 minutos a 60 °C, o qual resultou em clivagem especifica da molécula de FVIII com produtos de degradação bem definidos. Estes fragmentos de cadeia pesada e leve foram separados por SDS-PAGE seguido por eletrotransferência, como descrito no Exemplo 3. Para visualizar os fragmentos clivados, um anticorpo policlonal e anticorpos monoclonais contra os domínios Al e A2 da cadeia pesada, o domínio B e o domínio A3 N-terminal da cadeia leve foram aplicados.
Como visto na FIG. 3 todos os domínios foram peguilados, embora em diferentes extensões. O domínio B foi fortemente peguilado. Tanto o domínio Al como ο A2 da cadeia pesada foram parcialmente peguilados. Vários graus de peguilação (mono-, di-, tri-,...) puderam ser observados no domínio A3 da cadeia leve. De acordo com o Exemplo 6, o FVIII peguilado parece ser mais resistente à trombina. Exemplo de Referência 6
Resistência à trombina de rFVIII peguilado O tratamento com trombina in vitro de FVIII resulta num aumento rápido e subsequente diminuição da sua atividade pró-coagulante. A taxa de ativação e inativação, a qual depende da concentração de trombina e da integridade de FVIII, foi monitorizada por um ensaio do cofator FIXa, como se segue: O FVIII foi incubado a 37 °C com trombina a 0,5 ou 1 nM. Subamostras foram retiradas em intervalos de tempo entre 0,5 a 40 minutos e adicionadas a uma mistura de vesículas de FIXa, FX, PL e CaCl2 contendo também um inibidor específico de trombina para interromper as reações mediadas por trombina adicionais e incubadas durante 3 minutos. Uma subamostra foi adicionada a um substrato cromogéneo, o qual é seletivamente clivado por FXa e 26 continha EDTA para interromper a ativação de Xa adicional. Após 15 min de incubação, a reação foi terminada por ácido acético. Os valores de absorvância (A405), os quais foram proporcionais às concentrações de FXa, foram medidos num leitor de ELISA e convertidos a concentrações de FXa usando uma curva referência de FXa purificado. As concentrações de FXa geradas foram representadas graficamente contra o tempo de incubação com trombina. A taxa de inativação de pseudo-primeira ordem de FVIII foi determinada ajustando a parte em declínio das curvas com um ajuste exponencial único. QUADRO 2
Taxa de inativação de primeira ordem k' (1/min) k' relativo a Trombina FVIII nativo PEG-FVIII PEG/nativo C LO O 0,14 0,08 0,57 1 nM 0,24 0,14 0,58
Como mostrado na FIG. 4 e no Quadro 2, o rFVIII peguilado mostrou uma taxa de inativação mais lenta a ambas as concentrações de trombina aplicadas.
Exemplo de Referência 7
Peguilação de resíduos de lisina em rFVIII com 2,3-Bis(metilpolioxietileno-oxi)-1-(1, 5-dioxo-5-succinimidiloxi, pentiloxi)propano ramificado
Uma solução de rFVIII em tampão Hepes a 20 mM pH 7,4 contendo NaCl a 150 mM, sacarose a 0,5% e polissorbato 80 a 0, 1% foi preparada a partir de material a granel derivado do processo de fabrico de Advate contendo 489 UI de FVIII/ml. Um reagente de PEG-glutarato de succinimidilo (PEG-SG) ramificado (2,3-Bis(metilpolioxietileno-oxi)-1-(1,5-dioxo-5-succinimidiloxi, pentiloxi)propano) obtido de NOF Corporation (Tóquio, Japão) com um peso molecular de 20 kD foi adicionado a 153 ml desta solução sob agitação suave (5 mg de reagente/mg de proteína) e o valor de pH foi 27 ajustado a 7,4 por adição gota a gota de NaOH a 0,5 M após 10 minutos. Em seguida, a peguilação de rFVIII foi realizada sob agitação suave durante 1 hora à temperatura ambiente.
Subsequentemente a mistura de reação foi aplicada sobre uma resina de cromatografia de troca iónica equilibrada (Fractogel EMD TMAE 650M/coluna Pharmacia XK-50, altura do leito: 14,5 cm) em tampão Hepes a 20 mM, NaCl a 150 mM, pH 7,4, contendo sacarose a 0,5% e polissorbato 80 a 0,1% usando uma taxa de fluxo linear de 1 cm/min. A coluna foi lavada com 25 CV de tampão de equilíbrio para remover o reagente em excesso (taxa de fluxo linear: 2 cm/min) e o rFVIII peguilado foi eluído com tampão de eluição (Hepes a 20 mM, NaCl a 1,0 M, sacarose a 0,5%, polissorbato 80 a 0,1%, pH 7,4) a uma taxa de fluxo linear de 0,5 cm/min. Em seguida, o eluído foi concentrado por ultrafiltração/diafiltração com uma membrana que consiste de celulose regenerada e com um peso molecular de corte de 30 kD usando um sistema tampão consistindo de Hepes a 20 mM, NaCl a 150 mM, sacarose a 0,5%, pH 7,4.
Exemplo de Referência 8
Caracterização in vitro de rFVIII peguilado com PEG-SG ramificado de 20 kD O rFVIII derivado do processo de fabrico de Advate foi peguilado através de resíduos de lisina usando um reagente de PEG-SG ramificado de acordo com o Exemplo 7, e o produto de rFVIII peguilado foi caracterizado bioquimicamente como descrito no Exemplo 2. QUADRO 3 rFVIII PEG-rFVIII PEG-SG 20K (5 nativo mg por mg de proteína) Atividade de FVIII:Chr [U/ml] 9, 950 1, 040 FVIII:Ag [U/ml] 20,807 1,763 Rácio O 00 0,59 28 rFVIII nativo PEG-rFVIII PEG-SG 20K (5 mg por mg de proteína) FVIII:Chr/FVIII:Ag Recuperação de atividade biológica 100 120 (%)
Os dados no Quadro 3 mostram que na preparação de rFVIII peguilado a atividade biológica (expressa pelo rácio atividade cromogénea de FVIII para antigénica de FVIII) recuperou completamente em comparação à atividade biológica do rFVIII nativo (100%). O rFVIII peguilado foi caracterizado por SDS-PAGE e técnicas de imunotransferência sob condições de redução usando um gel de gradiente de poliacrilamida de 4-12% como descrito no Exemplo 3. Os resultados são sumarizados na FIG. 5. A mancha demonstra a estrutura de domínio de rFVIII nativo e peguilado. É mostrado que o rFVIII peguilado tem bandas mais amplas e massas moleculares maiores que a proteína recombinante nativa
Para uma análise mais detalhada de peguilação da preparação de rFVIII por SDS-PAGE e técnicas de imunotransferência, o rFVIII nativo e peguilado foi digerido com trombina a 1 nM durante 60 minutos a 60 °C, o que resultou em clivagem específica da molécula de FVIII com produtos de degradação bem definidos, como descrito no Exemplo 5. Os fragmentos foram separados por SDS-PAGE seguido por eletrotransferência e visualizados por diferentes anticorpos anti-FVIII. Como visto na FIG. 6, todos os domínios foram peguilados, embora em diferentes extensões. 0 domínio B foi fortemente peguilado. Vários graus de peguilação (mono-, di-, tri-peguilação) puderam ser observados no domínio A3 da cadeia leve. Os resultados indicam que o rFVIII peguilado parece ser mais resistente a trombina. 29 A taxa de ativação e inativação por trombina foi monitorizada por um ensaio com cofator FIXa como descrito no Exemplo 6. A taxa de inativação de pseudo-primeira ordem de FVIII foi determinada ajustando a parte em declínio das curvas com um ajuste exponencial único. __QUADRO 4_
Trombina Taxa de inativação de primeira ordem k' (1/min) _FVIII nativo PEG-FVIII k' relativa a PEG/nativo 0,5 nM 0, 13 0, 09 0, 67 1 nM 0,21 0,15 0,71
Como mostrado na FIG. 7 e no Quadro 4, o rFVIII peguilado mostrou uma taxa de inativação mais lenta a ambas as concentrações de trombina aplicadas.
Exemplo 9
Peguilação de rFVIII através de fração de carboidrato
Para preparação de um conjugado PEG-rFVIII através de resíduos de carboidrato, uma solução de rFVIII (concentração final: 1,2 mg/ml) é preparada em tampão fosfato a 25 mM, pH 6,7. NaI04 é adicionado (concentração final de 0,3 mM) para a oxidação de resíduos de carboidrato (Roberts et al.; Advanced Drug Del Rev.; 54:459-76 (2002); Meir e Wilchek; Meth Enzy-mol;138: 429-42 (1987)). A reação foi extinta por adição de glicerol numa concentração final de 10%, e os reagentes em excesso foram separados por centrifugação repetida usando dispositivos Amicon Micron-10 (Amicon, Billerica, MA) . PEG-hidrazida (3300 Da de PM / Nektar, Huntsville, Alabama) foi adicionado para dar uma concentração final de 1,5 mM de reagente. A peguilação foi, em seguida, realizada durante 2 h à temperatura ambiente. Subsequentemente, o conjugado obtido e o reagente em excesso foram separados por centrifugação repetida em dispositivos Amicon Micro-10 usando tampão fosfato a 25 mM, pH 6,7. 30
Exemplo 10
Polissialilação de rFVIII com PSA-hidrazina
Para preparação de um conjugado PSA-rFVIII através de resíduos de carboidrato, uma solução de rFVIII (concentração final: 1 mg/ml) é preparada em tampão acetato de sódio a 20 mM, pH 6,0. NaI04 é adicionado (concentração final de 0,25 mM) para a oxidação de resíduos de carboidrato. A oxidação é levada a cabo durante 60 min a 4 °C no escuro. Bissulfito de sódio (concentração final de 25 mM) é adicionado para interromper a reação. O periodato de sódio em excesso é separado por filtração em gel em colunas DG-10 (Bio-Rad). Subsequentemente, PSA-hidrazina com um comprimento de cadeia de 2 0 kD (preparado de acordo com o documento WO 2006/016168) é adicionado (concentração final de 10 mM) . O processo de polissialilação é levado a cabo durante 2 h à temperatura ambiente. O rFVIII polissialilado é purificado por HIC em Butyl-Sepharose (GE-Healthcare). Uma solução de NaCl a 5 M é adicionada à mistura para dar uma concentração final de NaCl a 3 M. Esta mistura é aplicada à coluna preenchida com Butyl-Sepharose (GE-Healthcare) e a eluição do conjugado rFVIII-PSA é levada a cabo com tampão Hepes a 50 mM, pH 7,4, contendo CaCl2 a 6,7 mM. Após eluição do conjugado, o pH é ajustado para pH 6,9. Exemplo 11
Purificação e derivatização de ácido polissiálico O ácido polissiálico foi purificado por cromatografia de troca aniónica em Q-Sepharose FF como descrito no documento WO 06016161A1. Cinco gramas de PSA foram dissolvidos em 50 ml de tampão trietanolamina a 10 mM, pH 7,4 contendo NaCl a 25 mM (= tampão de iniciação) . Esta solução foi aplicada numa coluna Pharmacia XK50 preenchida com Q-Sepharose FF (GE Healthcare, Munique, Alemanha), que foi equilibrada com tampão de iniciação. A coluna foi em seguida lavada com 8 volumes de coluna (CV) de tampão de iniciação e o PSA ligado foi eluído, etapa a etapa, com 3 31 CV de NaCl a 200 mM, NaCl a 350 mM e NaCl a 500 mM em tampão de iniciação. A fração eluída com NaCl a 350 mM mostrou um peso molecular de 20 kDa como indicado por eletroforese em gel com SDS. Esta fração foi concentrada por ultrafiltração usando uma membrana de 5 kD feita de celulose regenerada (Millipore, Billerica, MA) e subsequentemente diafiltrada contra tampão fosfato a 50 mM, pH 7,2. O PSA foi oxidado com NalCd e um grupo amino primário terminal foi introduzido por aminação redutiva como descrito no documento WO 05016973A1. Para aminação redutiva, 11 ml de uma solução de NH4C1 a 2 M foram adicionados a 20 ml de uma solução contendo 58 mg de PSA oxidado/ml em tampão fosfato a 50 mM, pH 7,2. Uma solução de NaCNBH3 a 5 M em NaOH a 1 M foi, em seguida, adicionada para dar uma concentração final de 75 mM. A reação foi realizada durante 5 d à temperatura ambiente a pH 8,0. A mistura foi, em seguida, dialisada contra uma solução de (NH4)2C03 (50 mg/1) contendo NaCl a 10 mM e subsequentemente contra tampão fosfato a 50 mM, pH 8,0, contendo EDTA a 5 mM. Um grupo sulfidrilo foi depois introduzido por reação do grupo amino primário terminal com 2-iminotiolano (reagente de Traut / Pierce, Rockford, IL). A reação foi levada a cabo em tampão fosfato a 50 mM, pH 8,0, contendo EDTA a 5 mM com excesso molar de 20 vezes de reagente durante 1 h à temperatura ambiente. Finalmente a solução de PSA contendo um grupo SH livre terminal foi sujeita a ultrafiltração/diafiltração usando uma membrana com um corte de 5 kD e feita de celulose regenerada (Millipore, Billerica, MA).
Exemplo 12
Polissialilação de rFVIII utilizando um reticulador heterobifuncional
Para acoplamento de PSA-SH a rFVIII, o reticulador heterobifuncional MBPH (cloridrato de ácido 4-[4-N-maleimidofenil]butírico hidrazida / Pierce, Rockford, IL) 32 contendo uma hidrazida seletiva de carboidrato e um grupo maleimida reativo a sulfidrilo foi usado (Chamow et ai., J Biol Chem 267;15916-22 (1992)). PSA-SH contendo um grupo sulfidrilo ativo foi preparado de acordo com o Exemplo 11.
Dois ml de rFVIII (638 mg, concentração proteica de 3, 856 mg/ml) foram transferidos para tampão de oxidação (acetato de sódio a 50 mM, pH 6) usando colunas de dessalinização (Bio-Rad Econopac 10 DG) de acordo com as instruções do fabricante. A proteína foi, em seguida, oxidada com NalCb a 0,25 mM (Merck) (1 h a 4 °C no escuro). A reação de oxidação foi extinta com glicerol a uma concentração final de 10%. O glicerol e NaI04 foram removidos e a proteína foi transferida para tampão de reação (fosfato de sódio a 50 mM, pH 6,5) usando colunas de dessalinização (Bio-Rad Econopac 10 DG) de acordo com as instruções do fabricante. A mistura contendo 1 mg de MBPH/mg de proteína e PSA-SH (excesso molar de 200 vezes para proteína) foi depois incubada durante 2 h à RT a pH 6,5. O excesso de reticulador foi removido usando colunas de dessalinização (Bio-Rad Econopac 10 DG) de acordo com as instruções do fabricante e o conjugado reticulador-PSA foi transferido para tampão de reação. O conjugado MPBH-PSA foi adicionado ao rFVIII oxidado (proteína a 0,105 mg/ml) e a mistura de reação foi incubada durante 2 h à RT sob agitação suave. O conjugado rFVIII-PSA foi purificado por HIC usando uma coluna com Butyl-Sepharose pré-embalada (GE Healthcare, Butyl HiTrap FF 5 ml) . Para permitir interações hidrofóbicas do conjugado com Butyl-Sepharose a amostra foi arrefecida até 2-8 °C e a força iónica da mistura de reação foi aumentada para uma condutividade de aproximadamente 185 mS/cm por adição de uma solução tampão contendo NaCl a 5 M (Hepes a 50 mM, NaCl a 5 M, CaCl2 a 6,7 mM, Tween a 0,01%, pH 6,9). A mistura de reação foi carregada na coluna que foi equilibrada com tampão de equilíbrio pH 6,9 (contendo Hepes a 50 mM, NaCl a 33 3 M, CaCl2 a 6,7 mM, Tween 80 a 0,01%) com uma taxa de fluxo de 1,2 cm/min. A amostra não ligada foi removida por lavagem com 10 volumes de coluna (CV) de tampão de equilíbrio. O conjugado foi eluído com um tampão de baixa força iónica, pH 7,4 (Hepes a 50 mM, CaCl2 a 6,7 mM) com uma taxa de fluxo de 1,2 cm/min. Durante o processo de cromatografia, as amostras e tampões foram arrefecidos usando um banho de gelo. Finalmente, o pH do eluído foi ajustado para 6,9.
Exemplo de Referência 13 Conjugação de rFVIII com dextrano
Para conjugação de rFVIII com dextrano, 2 ml de rFVIII (638 mg, proteína a 3,4 mg/ml) foram transferidos para tampão de oxidação (acetato de sódio a 50 mM, pH 6) usando colunas de dessalinização (Bio-Rad Econopac 10 DG) de acordo com as instruções do fabricante. A proteína foi, em seguida, oxidada com NaI04 a 0,25 mM (1 h a 4 °C no escuro). A proteína oxidada foi, em primeiro lugar, concentrada usando colunas rotativas para ultrafiltração Vivaspin (Sartorius Stedim Biotech GmbH) com um MWCO de 30 kDa de acordo com as instruções do fabricante. A amostra foi depois dialisada contra tampão de reação (fosfato de sódio a 50 mM, pH 7) durante a noite a 4 °C.
Após diálise, 26,58 mg de ácido adípico dihidrazida (ADH) (Sigma) foram adicionados (excesso molar de 500 vezes) e a mistura de reação foi incubada 2 h à RT a pH 7 sob agitação suave. O ADH foi removido usando colunas de dessalinização (Bio-Rad Econopac 10 DG) de acordo com as instruções do fabricante. Dez mg de dextrano ativado por aldeído (Pierce) foram adicionados (excesso molar de 17 vezes para proteína) e a mistura foi incubada durante 2 h à RT, pH 7. O conjugado foi purificado por cromatografia de troca iónica em Q-Sepharose HP (GE-Healthcare). A amostra foi carregada numa coluna (6,4 mm x 3 cm, V = 1 ml) que foi 34 equilibrada com tampão A (fosfato de sódio a 50 mM, pH 6,8) com uma taxa de fluxo de 0,5 ml/min. A amostra não ligada foi removida por lavagem com 5 CV de tampão A. Finalmente, o conjugado foi eluido com um gradiente de sal linear (tampão B de 0-100% [fosfato de sódio a 50 mM, pH 6,8 + NaCl a 1 M] em 10 CV) com uma taxa de fluxo de 0,5 ml/min. 35
REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO
Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para a conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento de Patente Europeia. Embora tenha sido tomado muito cuidado na compilação das referências, não se poderão excluir erros e omissões e o IEP não assume qualquer responsabilidade neste sentido.
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Claims (7)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um método de conjugar PEG, ácido polissiálico (PSA) ou dextrano com uma fração de carboidrato oxidada de Fator VIII compreendendo colocar em contacto a fração de carboidrato oxidada com PEG, PSA e dextrano ativados sob condições que permitam a conjugação; em que o dito FVIII que foi conjugado com PEG, PSA ou dextrano mantém pelo menos 50% da atividade biológica do FVIII nativo.
2. O método de acordo com a reivindicação 1 em que o PEG, PSA e dextrano ativados são selecionados a partir do grupo que consiste em PEG-hidrazida, PSA-hidrazina ou dextrano ativado por aldeído.
3. O método de acordo com a reivindicação 1 em que a fração de carboidrato é oxidada por incubação num tampão compreendendo NalCg.
4. O método de acordo com a reivindicação 1 em que a fração de carboidrato oxidada de FVIII está localizada no domínio B de FVIII.
5. Um Fator VIII modificado produzido pelo método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
6. Uma molécula proteica compreendendo: (a) uma molécula de Fator VIII; e (b) pelo menos um de PSA, PEG ou dextrano ligado à dita molécula de Fator VIII, em que o dito PSA, PEG ou dextrano é ligado ao Fator VIII através de uma ou mais frações de carboidrato localizadas no domínio B do Fator VIII, em que a dita molécula mantém pelo menos 50% da atividade biológica do FVIII nativo. 2 7. 0 método de acordo com a reivindicação 1 em que o dito FVIII que foi conjugado com o polímero solúvel em água mantém pelo menos 80% da atividade biológica do FVIII nativo.
8. A molécula de acordo com a reivindicação 6 em que a dita molécula mantém pelo menos 80% da atividade biológica do FVIII nativo.
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