KR20180088727A

KR20180088727A - 연장된 반감기 및 감소된 리간드-결합 특성을 가진 인자 viii

Info

Publication number: KR20180088727A
Application number: KR1020187018942A
Authority: KR
Inventors: 페터 투레첵; 게럴트 쉬렝크; 위르겐 지크만
Original assignee: 박스알타 인코퍼레이티드; 박스앨타 게엠베하
Priority date: 2015-12-03
Filing date: 2016-12-05
Publication date: 2018-08-06
Also published as: SG10202004031WA; US20170349644A1; MX2018006738A; AU2016362606A1; BR112018011259A2; SG11201804666QA; US20190240295A1; CA3007364A1; EP3383895A1; CN108884146A; PH12018501174A1; AR106914A1; WO2017096383A1; IL259760A; TW201731869A; EA201891333A1; JP2019510022A

Abstract

본 발명은 콘주게이션을 허용하는 조건하에 활성화된 수용성 폴리머와 산화된 탄수화물 모이어티의 접촉을 포함하는 치료 단백질의 산화된 탄수화물 모이어티에 수용성 폴리머의 콘주게이션 물질 및 방법에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 연장된 반감기 및 감소된 리간드-결합 특성을 가진 변형된, 재조합 인자 VIII (FVIII)에 관한 것이다.

Description

연장된 반감기 및 감소된 리간드-결합 특성을 가진 인자 VIII

관련 출원에 대한 교차 참조

본원은 하기에 우선권을 주장한다: 미국 특허 가출원 번호 62/262,674 (2015년 12월 3일 출원, 이로써 참고로 편입됨).

발명의 분야

본 발명은 인자 VIII (FVIII)의 반감기 연장용 물질 및 방법에 관한 것이다.

A형 혈우병 및 B형 혈우병을 가진 사람에서 출혈의 인식된 치료 및/또는 예방은 인자 대체 요법을 종종 포함한다. 이것은 혈액 응고 단백질 예컨대 인자 VIII (FVIII) 및 인자 IX (FIX)의 주입 (혈류속으로 주사)를 포함한다. 이들 단백질은 전형적으로 2개의 공급원에서 나온다: 인간 혈장으로부터 단리 및 유전자적으로-조작된 세포주에서 발현. 누락 응고 인자의 대체가 영구적이지 않기 때문에, 상기 요법을 받는 환자는 인자로 반복적으로 주입되어야 한다.

치료 단백질 예컨대 FVIII의 약리적 및 면역학적 특성은 화학적 변형 및 폴리머 화합물과 콘주게이션에 의해 개선될 수 있다. 콜로민산 (CA)로서도 지칭된, 폴리시알산 (PSA)는 자연 발생 다당류이다. α(2→8) 케토시드 연결을 가진 N-아세틸뉴라민산의 호모폴리머이고 그것의 비-환원 단부에서 근접 디올기를 함유한다. 폴리머는 음으로 하전되고 인체의 천연 구성요소이다. 큰 양으로 박테리아로부터 그리고 사전-결정된 물리적 특징으로 쉽게 생산될 수 있다 (미국 특허 번호 5,846,951). 박테리아성으로-생산된 PSA는 인체에서 생산된 PSA와 동일한 시알산 모노머로서 구성된다. 일부 폴리머와 달리, PSA는 생분해성이다.

카탈라제 및 아스파라기나제에 콜로민산의 공유결합은 단백분해 효소 또는 혈장의 존재하에 효소 안정성을 증가시키는 것으로 나타났다. 폴리시알릴화된 및 미변형된 아스파라기나제로 비교 생체내 연구는 폴리시알릴화가 효소의 반감기를 증가시켰다는 것을 드러냈다 (Fernandes and Gregoriadis, Int J Pharm. 2001, 217, 215-24).

다양한 시약과 관련된 비용을 최소화하고 환자 수령체에 건강 위험을 최소화하면서 단백질의 약력학적 및/또는 약동학적 특성을 개선하는 단백질에 수용성 폴리머를 콘주게이션하는 물질 및 방법 개발의 요구가 남아 있다.

본 발명은 단백질의 생체내 반감기, 약력학적 및/또는 약동학적 특성을 개선하기 위해 단백질에 폴리머를 콘주게이션하는 물질 및 방법을 제공한다.

일 구현예에서, 변형된 인자 VIII (FVIII)은 제공된다. 변형된 FVIII은 FVIII 반감기를 증가시키는 및 리간드 결합 FVIII에 변형된 FVIII의 결합을 감소시키는 변형을 포함한다. 예시적 리간드는 폰빌레브란트 인자 (VWF) 및 저밀도 지단백질 (LDL)-수용체-관련 단백질 1 (LRP1)로부터 선택된다. 예시적 변형은 본 명세서에서 논의되고, 예를 들어, 화학적 변형 예컨대 수용성 폴리머의 부착을 포함한다.

예시적 구현예에서, 변형된 FVIII은 혈장-유래된다. 예시적 구현예에서, FVIII은 조작된 숙주 세포로부터 재조합으로 생산된다. 다양한 구현예에서, 변형된 FVIII은 원상태 B 도메인을 포함한다. 다양한 구현예에서, FVIII은 전장 FVIII이고 원상태 B 도메인을 포함한다.

예시적 구현예에서, 변형된 FVIII은 미변형된 FVIII에 비교된 더 낮은 친화도 (KD)로 VWF 및 LRP1에 결합한다.

예시적 구현예에서, 변형된 FVIII은 거기에 콘주게이션된 폴리시알산 (PSA)를 포함한다. 상기 구현예에서 사용하는 예시적 PSA 모이어티는 약 20 kDa의 평균 분자량을 갖는다. 예시적 구현예에서, PSA는 약 5, 약 10, 약 15, 약 20, 약 25, 약 30, 약 35, 약 40, 또는 약 50 kDa로부터 선택된 평균 분자량을 갖는다. 예시적 구현예에서, PSA는 저 다분산도를 갖는다. 예시적 PSA 콘주게이트는 PSA와 FVIII 분자 사이 아미노옥시 링커를 포함한다. 예시적 아미노옥시 링커는 변형된 FVIII의 산화된 탄수화물에 부착된다.

본 발명은 또한 약제학적 조성물을 제공한다. 예시적 약제학적(pharmaceutical) 제형은 상기 언급된 변형된 FVIII 및 약제학적으로 허용가능한 캐리어, 희석제, 염, 버퍼, 및/또는 부형제를 포함한다.

다양한 구현예에서, 상기 언급된 변형된 FVIII은 페길화된 FVIII보다 더 긴 생체내 반감기를 갖는다. 다양한 구현예에서, 상기 언급된 변형된 FVIII은 더 긴 생체내 반감기를 가진 콘주게이션된 FVIII의 PSA의 평균 분자량과 약 동일한 평균 분자량의 PEG 모이어티에 콘주게이션되는, 페길화된 FVIII보다 더 긴 생체내 반감기를 갖는다. 예시적 구현예에서, PSA 변형된 FVIII은 약 20 kDa의 평균 분자량을 갖는 PSA 모이어티에 콘주게이션되고, 약 20 kDa의 평균 분자량을 갖는 PEG 모이어티에 콘주게이션되는, 페길화된 FVIII보다 더 긴 생체내 반감기를 갖는다. 다양한 구현예에서, 반감기는 약 1-, 약 2- 또는 약 3-배의 인수만큼 더 길다. 더욱 다른 다양한 구현예에서, 반감기는 약 1-, 약 2-, 약 3-, 약 4-, 약 5-, 약 6-, 약 7-, 약 8-, 약 9-, 또는 약 10-배의 인수만큼 더 길다.

예시적 구현예에서, 상기 언급된 PSA 변형된 FVIII은 양쪽 종의 결합이 비교할만한 조건하에 측정되는 경우 VWF 또는 LRP1에 페길화된 FVIII의 결합에 비교된 경우 더 낮은 결합 친화도로 VWF 또는 LRP1에 결합한다. 예시적 구현예에서, 상기 언급된 PSA 변형된 FVIII은 양쪽 종의 결합이 비교할만한 조건하에 측정되고, PEG 및 PSA가 약 동일한 평균 분자량인 경우 VWF 또는 LRP1에 페길화된 FVIII의 결합에 비교된 경우 더 낮은 결합 친화도로 VWF 또는 LRP1에 결합한다. 다양한 구현예에서, VWF 또는 LRP1에 결합은 VWF 또는 LRP1에 페길화된 FVIII의 결합에 비교된 경우 약 0.5-배의 인수만큼 더 낮다. 더욱 다른 구현예에서, VWF 또는 LRP1에 결합은 VWF 또는 LRP1에 페길화된 FVIII의 결합에 비교된 경우 약 0.1-, 약 0.2-, 약 0.3-, 약 0.4-, 약 0.5-, 약 0.6-, 약 0.7-, 약 0.8-, 약 0.-9, 약 1-, 약 2-, 약 3-, 약 4-, 약 5-, 약 6-, 약 7-, 약 8-, 약 9-, 또는 약 10- 의 인수만큼 더 낮다.

일 구현예에서, FVIII 반감기를 증가시키고 VWF 및 LRP1로 구성되는 군으로부터 선택되는 리간드에 상기 변형된 FVIII의 결합을 감소시키는 변형을 포함하는 변형된, 재조합 FVIII은 제공되고, 여기서 상기 변형은 아미노옥시 링커를 통해 FVIII에 부착된 PSA를 포함한다. 예시적 구현예에서, 아미노옥시 링커는 변형된 FVIII의 산화된 탄수화물에 부착되고, 여기서 변형된, 재조합 FVIII의 상기 생체내 반감기는 미변형된, 재조합 FVIII 및/또는 페길화된, 재조합 FVIII보다 더 길고 여기서 변형된, 재조합 FVIII의 VWF 또는 LRP1에의 결합 친화도는 미변형된, 재조합 FVIII 및/또는 페길화된, 재조합 FVIII에 의한 VWF 또는 LRP1의 결합에 비교된 경우 더 낮다. 예시적 구현예에서, 비교의 종은 약 동일한 평균 분자량의 PSA 및 PEG 모이어티를 포함한다.

본 발명은 추가로 본 발명의 변형된 FVIII로 그와 같은 치료가 필요한 대상체의 치료 방법을 제공한다. 예시적 구현예에서, 개시된 변형된 FVIII을 포함하는, 본 발명의 약제학적 조성물은 FVIII 결핍, 또는 하기의 결핍과 관련된 질환 또는 장애로 진단된 포유동물에 투여된다: 또 다른 인자 (예를 들면, FVII, FIX).

예시적 구현예에서, 본 발명은 포유동물 대상체에서 출혈성 결함의 치료 방법을 제공한다. 예시적 방법은, 출혈성 결함의 하나 이상의 증상을 감소 또는 제거하기 위해 효과적인 양으로, 상기 치료가 필요한, 상기 대상체에게 상기 언급된 변형된 FVIII 또는 이의 약제학적 조성물 투여를 포함한다. 예시적 구현예에서, 약제학적 제형의 투여는 매 4 일 1회 이하, 매 5 일 1회 이하, 매 6 일 1회 이하, 매 7 일 1회 이하, 매 8 일 1회 이하, 매 9 일 1회 이하, 또는 매 10 일 1회 이하 상기 대상체에 투여된 경우 출혈성 결함의 하나 이상의 증상을 감소 또는 제거하는데 효과적인 양을 달성한다.

도 1은, 센서-칩-고정된 VWF의 3개의 상이한 밀도에서 PSA-rFVIII 그룹 및 재완충된 rFVIII에 대하여, 포화에서 계산된 최대 결합인, R_max로서 표현된 결합 신호를 보여준다.
도 2는 PSA-rFVIII에 대하여 그리고 재완충된 rFVIII에 대하여 LRP1에 FVIII 단백질-농도-의존적 결합용 결과를 보여준다.
도 3은 rFVIII이 LRP1에 강하게 결합하고, PEG-rFVIII이 LRP1과 잔류 회합을 표시하였고, PEG-rFVIII이 사실상 LRP1과 회합할 수 없었다는 것을 보여준다.
도 4는 트롬빈에 의한 FVIII의 활성화후 경시적으로 FXa 생성을 보여준다.
도 5는 재완충된 rFVIII 및 PSA-rFVIII에 대하여 피크 트롬빈 생성 곡선의 평가의 결과를 보여준다.
도 6은 재완충된 rFVIII 및 PSA-rFVIII에 대하여 총 트롬빈 생성 곡선을 보여준다.
도 7은 페길화된 및 폴리시알릴화된 rFVIII이 마우스에서 rFVIII에 비교된 개선된 PK 파라미터를 보여주었다는 것을 나타낸다.
도 8은 페길화된 및 폴리시알릴화된 rFVIII이 랫트에서 rFVIII에 비교된 개선된 PK 파라미터를 보여주었다는 것을 나타낸다 나타낸다.
도 9는 페길화된 및 폴리시알릴화된 rFVIII이 마카크에서 rFVIII에 비교된 개선된 PK 파라미터를 보여주었다는 것을 나타낸다 나타낸다.

치료 단백질의 약리적 및 면역학적 특성은 화학적 변형 및 폴리머 화합물 예컨대 폴리시알산 (PSA)와 콘주게이션에 의해 개선될 수 있다. 수득한 콘주게이트의 특성은 폴리머의 구조 및 크기에 일반적으로 강하게 의존한다. 따라서, 한정된 및 좁은 크기 분포를 가진 폴리머는 당해 분야에서 일반적으로 바람직하다. PEG같은 합성 폴리머는 좁은 크기 분포로 쉽게 제조될 수 있고, 한편 PSA는 좁은 크기 분포를 가진 최종 PSA 제조를 초래하는 그와 같은 방식으로 정제될 수 있다.

본 명세서에서 기재된 바와 같이, 예컨대 폴리시알릴화를 통해, 가용성 폴리머의 첨가는 치료 단백질 예컨대 FVIII의 특성을 개선하기 위한 하나의 접근법이다.

치료 단백질

혈액 응고 단백질

일 측면에서, 본 발명의 개시 물질은, 인간 혈장으로부터 유래될 수 있거나, 하기에서 기재된 바와 같이, 재조합 공학 기술에 의해 생산될 수 있는, 혈액 응고 단백질이다: 특허 미국 특허 번호 4,757,006; 미국 특허 번호 5,733,873; 미국 특허 번호 5,198,349; 미국 특허 번호 5,250,421; 미국 특허 번호 5,919,766; 및 EP 306 968.추가의 최근 예는 하기를 포함한다: 미국 특허 번호 7,645,860; 미국 특허 번호 8,637,640; 미국 특허 번호 8,642,737; 및 미국 특허 번호 8,809,501.

치료 폴리펩타이드 예컨대 인자 IX (FIX), 인자 VIII (FVIII), 인자 VIIa (FVIIa), 폰빌레브란트 인자 (VWF), 인자 FV (FV), 인자 X (FX), 인자 XI (FXI), 인자 XII (FXII), 트롬빈 (FII), 단백질 C, 단백질 S, tPA, PAI-1, 조직 인자 (TF) 및 ADAMTS 13 프로테아제를 포함하는 혈액 응고 단백질은 단백분해 효소에 의해 빠르게 분해되고 항체에 의해 중화된다. 이것은 그것의 반감기 및 순환 시간을 감소시키고, 이로써 그것의 치료 유효성을 제한한다. 상대적으로 높은 용량 및 빈번한 투여는 이들 응고 단백질의 원하는 치료적 또는 예방적 효과를 달성 및 지속하는데 필요하다. 그 결과, 적절한 용량 조절은 수득하기 어렵고 빈번한 정맥내 투여의 필요성은 환자의 생활 방식에 제한을 둔다.

본 명세서에서 기재된 바와 같이, 비제한적으로, 인자 IX (FIX), 인자 VIII (FVIII), 인자 VIIa (FVIIa), 폰빌레브란트 인자 (VWF), 인자 FV (FV), 인자 X (FX), 인자 XI, 인자 XII (FXII), 트롬빈 (FII), 단백질 C, 단백질 S, tPA, PAI-1, 조직 인자 (TF) 및 ADAMTS 13 프로테아제를 포함하는 혈액 응고 단백질은 본 발명에 의해 고려된다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 “혈액 응고 단백질”은 그 특정한 원상태 혈액 응고 단백질과 관련되는 생물학적 활성을 나타내는 임의의 인자 IX (FIX), 인자 VIII (FVIII), 인자 VIIa (FVIIa), 폰빌레브란트 인자 (VWF), 인자 FV (FV), 인자 X (FX), 인자 XII (FXII), 트롬빈 (FII), 단백질 C, 단백질 S, tPA, PAI-1, 조직 인자 (TF) 및 ADAMTS 13 프로테아제를 지칭한다.

혈액 응고 캐스케이드는 3개의 구별되는 분절로 분할된다: 고유, 외적, 및 통상 경로 (Schenone 등, Curr Opin Hematol. 2004, 11, 272-7). 캐스케이드는 일련의 세린 프로테아제 효소 (자이모겐) 및 단백질 보조인자를 포함한다. 필요한 경우에, 불활성 자이모겐 전구체는, 캐스케이드에서 다음의 효소를 결과적으로 전환시키는, 활성 형태로 전환된다.

고유 경로는 응고 인자 VIII, IX, X, XI, 및 XII를 요구한다. 고유 경로의 개시는 프리칼레크레인, 고-분자-중량 키니노겐, 인자 XI (FXI) 및 인자 XII (FXII)이 음으로 하전된 표면에 노출되는 경우 발생한다. 혈소판으로부터 분비된 칼슘 이온 및 인지질은 또한 요구된다.

외적 경로는 혈관의 혈관 내강이 손상되는 경우 개시된다. 막 당단백질 조직 인자는 노출되고 그 다음 순환 인자 VII (FVII)에 그리고 그것의 활성화된 형태 FVIIa의 작은 기존의 양에 노출한다. 상기 결합은 FVII의 FVIIa로의 전체 전환 및 후속적으로, 칼슘 및 인지질의 존재하에, 인자 IX (FIX)의 인자 IXa (FIXa)로의 그리고 인자 X (FX)의 인자 Xa (FXa)로의 전환을 용이하게 한다. 조직 인자와 FVIIa의 회합은 기질 (FIX 및 FX)에 대하여 FVII의 결합 부위를 더욱 근접시킴으로써 그리고 형태적 변화를 유도함으로써 단백분해 활성을 향상시키고, 이는 FVIIa의 효소 활성을 향상시킨다.

FX의 활성화는 2개 경로의 통상 지점이다. 인지질 및 칼슘과 함께, 인자 Va (FVa) 및 Xa는 프로트롬빈을 트롬빈 (프로트롬빈분해효소 복합체)로 전환시키고, 그 다음 피브리노겐을 절단시켜 피브린 모노머를 형성한다. 모노머는 중합하여 피브린 가닥을 형성한다. 인자 XIIIa (FXIIIa)는 이들 가닥을 서로에 공유적으로 결합시켜 강성 메쉬를 형성한다.

FVII의 FVIIa로의 전환은, 트롬빈, FIXa, FXa, 인자 XIa (FXIa), 및 인자 XIIa (FXIIa)를 포함하는, 수많은 프로테아제에 의해 또한 촉매접촉된다. 캐스케이드의 초기 단계의 억제를 위하여, 조직 인자 경로 억제제는 FVIIa/조직 인자/FXa 생성물 복합체를 표적한다.

인자 VIII

응고 인자 VIII (FVIII)은 매우 저농도로 혈장에서 순환하고 폰빌레브란트 인자 (VWF)에 비-공유적으로 결합된다. 지혈 동안, FVIII은 VWF로부터 분리되고 칼슘 및 인지질 또는 세포 막의 존재하에 활성화의 속도 향상에 의해 활성화된 인자 IX (FIXa)-매개된 FX 활성화용 보조인자로서 작용한다.

트롬빈에 의해 활성화된 FVIII은 저밀도 지단백질 수용체 단백질 (이하에서 "LRP"로 칭함)에 결합에서 연루되어 왔다 (Yakhyaev, A. 등, Blood, vol. 90 (Suppl.1), 1997, 126-I, 본 명세서에서 참고로 편입됨). 비-활성화된 FVIII이 다작용성 세포내이입 수용체 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 (LRP)와 상호작용한다는 것이 또한 실증되어 왔다 (Lenting, P.J., Neels, J.G., van den Berg, B.M.M., Clijsters, P.P. F.M., Meijerman, D.W.E., Pannekoek, H., van Mourik, J.A., Mertens, K., 및 van Zonneveld, A., -J.J. Biol. Chem. 1999, 274, 23734-23739; WO 00/28021; Saenko, E.L., Yakhyaev, A.V., Mikhailenko, I., Strickland, D.K., 및 Sarafanov, A.G.J. Biol. Chem. 1999, 274, 37685-37692; 본 명세서에서 참고로 편입됨). 상기 수용체가 순환으로부터 FVIII의 청소능에서 역할을 한다는 것이 제안된다 (Saenko, E.L., 등, 상동; Schwarz, H.P., Lenting, P.J., Binder, B., Mihaly, J., Denis, C., Domer, F., 및 Turecek, P.L.Blood 2000 , 95, 1703-1708; 본 명세서에서 참고로 편입됨).

LRP는 LDL 수용체, 초저밀도 지단백질 수용체, 아포지질단백질 E 수용체 2, 및 메갈린을 또한 포함하는 저밀도 지단백질 (LDL) 수용체 계열의 구성원이다 (검토를 위하여 참고 Neels J.G., Horn, I.R., van den Berg, B.M.M., Pannekoek, H., 및 van Zonneveld, A.-J. Fibrinolysis Proteolysis 1998 , 12, 219-240; Herz, J., 및 Strickland, D.K.J.Clin.Invest. 2001, 108, 779-784; 본 명세서에서 참고로 편입됨). 간, 폐, 태반, 및 뇌를 포함하는, 다양한 조직에서 발현된다 (Moestrup, S.K., Gliemann, J., 및 Pallesen, G.Cell Tissue Res. 1992 , 269, 375-382; 본 명세서에서 참고로 편입됨). 수용체는, 막관통 85-kDa .베타.-사슬에 비-공유결합되는, 세포외 515-kDa 알파 사슬로 구성된다 (Herz, J., Kowal, R.C., Goldstein, J.L., 및 Brown, M.S.EMBO J. 1990, 9, 1769-1776; 본 명세서에서 참고로 편입됨). 알파-쇄는 많은 구조적으로 및 기능적으로 관련없는 리간드의 결합을 매개하는 보체-유형 반복부의 다양한 수의 4개 클러스터를 함유한다 (Moestrup, S.K., Hotlet, T.L., Etzerodt, M., Thogersen, H.C., Nykjaer, A., Andreasen, P.A., Rasmussen, H.H., Sottrup-Jensen, L., 및 Gliemann, J.J. Biol. Chem. 1993 , 268, 13691-13696; Willnow, T.E., Orth, K., 및 Herz, J.J. Biol. Chem. 1994 , 269, 15827-15832; Neels, J.G., van den Berg, B.M.M., Lookene, A., Olivecrona, G., Pannekoek, H., 및 van Zonneveld, A.-J.J. Biol. Chem. 1999, 274, 31305-31311; 본 명세서에서 참고로 편입됨).

베타-쇄는 막관통 도메인 그리고 세포내이입에 필수적인 짧은 세포질성 테일을 포함한다. 알파-쇄는 큰 도메인외로서 기능하고 하기 반복부의 3 유형을 포함한다: 표피 성장-인자-유사 도메인, Tyr-Trp-Thr-Asp 서열 및 LDL-수용체-부류 A 도메인. 리간드 결합에 연루된, 이들 부류 A 도메인은, 클러스터 I (2 도메인), 클러스터 II (8 도메인), 클러스터 III (10 도메인) 및 클러스터 IV (11 도메인)으로 불리는, 4 별개의 클러스터에서 존재한다.

LRP는 또한 활성화된, 비-효소적 보조인자 인자 VIIIa를 결합시킨다 (Yakhyaev, A. 등., Blood, vol. 90, (Suppl.1), 1997, 126-I). FVIII 경쇄는 재조합 LRP 클러스터 II 및 IV와 상호작용하는 것으로 실증되었고, 반면에 LRP 클러스터 I 및 III에 결합은 관측되지 않았다 (Neels, J.G., 등 1999 상동).

FVIII은 도메인 구조 A1-A2-B-A3-C1-C2를 가진 대략 270-330 kD의 단일-사슬 전구체로서 합성된다. 하기로부터 정제된 경우: 혈장 (예를 들면, “혈장-유래된” 또는 “혈장성”), FVIII은 중쇄 (A1-A2-B) 및 경쇄 (A3-C1-C2)로 구성된다. 경쇄의 분자량은 80 kD이고 반면에, B 도메인 이내 단백질분해로 인해, 중쇄는 90-220 kD의 범위이다.

FVIII은 출혈성 장애에서 치료 용도를 위하여 재조합 단백질로서 또한 합성된다. 다양한 시험관내 검정은 치료 의약으로서 재조합 FVIII (rFVIII)의 잠재적인 효능을 결정하도록 고안되었다. 이들 검정은 내인성 FVIII의 생체내 효과를 모방한다. FVIII의 시험관내 트롬빈 치료는, 시험관내 검정에 의해 측정된 바와 같이, 그것의 응혈원 활성에서 급속 증가 및 후속적인 감소를 초래한다. 상기 활성화 및 불활성화는 양쪽 중쇄 및 경쇄에서 특이적인 제한된 단백질분해와 일치하고, 이는 FVIII, 예를 들면 하기에서 상이한 결합 에피토프의 이용가능성을 변경시킨다: FVIII을 VWF로부터 해리시키고 인지질 표면에 결합시키거나 특정 단클론성 항체에 결합 능력을 변경시킴.

FVIII의 부족 또는 기능이상은 가장 빈번한 출혈성 장애, A형 혈우병과 관련된다. A형 혈우병의 관리를 위한 선택적 치료는 혈장 유래된 또는 rFVIII 농축물을 가진 대체 요법이다. 1 % 아래 FVIII 수준으로 중증 A형 혈우병을 가진 환자는 일반적으로 용량 사이 1% 초과 FVIII 유지의 목표로 예방적 요법 중이다. 순환에서 다양한 FVIII 생성물의 평균 반감기를 고려하여, 상기 결과는 일반적으로 1주 2 내지 3회 FVIII 제공에 의해 달성될 수 있다.

참조 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 서열은, 예를 들면, 하기를 포함한다: UniProtKB/Swiss-Prot P00451 (FA8_HUMAN); Gitschier J 등, Characterization of the human Factor VIII gene, Nature, 1984, 312(5992), 326-30; Vehar GH 등, Structure of human Factor VIII, Nature, 1984 , 312(5992), 337-42; Thompson AR.Structure and Function of the Factor VIII gene and protein, Semin Thromb Hemost, 2002 , 2003:29, 11-29.

폴리펩타이드

일 측면에서, 본 발명의 개시 물질은 단백질 또는 폴리펩타이드이다. 본 명세서에서 기재된 바와 같이, 용어 치료 단백질은 치료 단백질과 관련되는 생물학적 활성을 나타내는 임의의 치료 단백질 분자를 지칭한다. 본 발명의 일 구현예에서, 치료 단백질 분자는 전장 단백질이다. 일 구현예에서, 치료(therapetuci) 단백질은 반감기를 연장시키기 위해 변형된 FVIII이다.

고려된 치료 단백질 분자는 전장 단백질, 전장 단백질의 전구체, 전장 단백질의 생물학적 활성 하위단위 또는 단편, 뿐만 아니라 치료 단백질의 임의의 이들 형태의 생물학적 활성 유도체 및 변이체를 포함한다. 따라서, 치료 단백질은 하기인 것을 포함한다: (1) 본 명세서에서 기재된 언급된 핵산 또는 아미노산 서열에 의해 인코딩된 폴리펩타이드에 적어도 약 25, 약 50, 약 100, 약 200, 약 300, 약 400, 또는 초과 아미노산의 영역에 걸쳐, 약 60% 초과, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 또는 초과 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것; 및/또는 (2) 본 명세서에서 기재된 바와 같이 언급된 아미노산 서열을 포함하는 면역원에 대해 생성된, 항체, 예를 들면, 다클론성 또는 단클론성 항체, 이의 면역원성 단편, 및/또는 이의 보존적으로 변형된 변이체에 특이적으로 결합하는 것.

본 발명에 따르면, 용어 "재조합 치료 단백질"은 재조합 DNA 기술을 통해 수득된 임의의 치료 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 용어는 본 명세서에서 기재된 바와 같은 단백질을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, “내인성 치료 단백질”은 치료를 받도록 의도된 포유동물에서 기원하는 치료 단백질을 포함한다. 상기 용어는 또한 상기 포유동물에서 존재하는 이식유전자 또는 임의의 다른 외래 DNA로부터 전사된 치료 단백질을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, “외인성 치료 단백질”은 치료를 받도록 의도된 포유동물에서 기원하지 않는 혈액 응고 단백질을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, “혈장-유래된”, “혈장-유래된 혈액 응고 단백질” 또는 "혈장성"은 응고 경로에 참여하는 특성을 갖는 포유동물로부터 수득된 혈액에서 발견된 단백질의 모든 형태를 포함한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이 “생물학적 활성 유도체” 또는 “생물학적 활성 변이체”는 상기 분자의 실질적으로 동일한 기능성 및/또는 생물학적 특성, 예컨대 결합 특성, 및/또는 동일한 구조적 기반, 예컨대 펩타이드 골격 또는 기초 폴리머 단위를 갖는 분자의 임의의 유도체 또는 변이체를 포함한다.

“유사체”, 예컨대 “변이체” 또는 “유도체”는, 비록 특정 사례에서 상이한 정도라도, 자연 발생 분자에 동일한 생물학적 활성을 갖는 그리고 구조에서 실질적으로 유사한 화합물이다. 예를 들어, 폴리펩타이드 변이체는 참조 폴리펩타이드로서 동일한 생물학적 활성을 갖는 및 실질적으로 유사한 구조를 공유하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 변이체 또는 유사체는, 하기를 포함하는 하나 이상의 돌연변이에 기반된, 유사체가 유래되는 자연 발생 폴리펩타이드에 비교된 그것의 아미노산 서열의 조성물에서 상이하다: (i) 폴리펩타이드의 하나 이상의 말단 및/또는 자연 발생 폴리펩타이드 서열의 하나 이상의 내부 영역 (예를 들면, 단편)에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 결실, (ii) 폴리펩타이드의 하나 이상의 말단 (전형적으로 “부가” 또는 “융합”)에서 및/또는 자연 발생 폴리펩타이드 서열의 하나 이상의 내부 영역 (전형적으로 “삽입”)에서 하나 이상의 아미노산의 삽입 또는 첨가 또는 (iii) 자연 발생 폴리펩타이드 서열에서 하나 이상의 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환. 예로써, “유도체”는 유사체의 한 유형이고, 예를 들면, 화학적으로 변형된 참조 폴리펩타이드로서 동일한 또는 실질적으로 유사한 구조를 공유하는 폴리펩타이드를 지칭한다.

변이체 폴리펩타이드는 유사체 폴리펩타이드의 한 유형이고 삽입 변이체를 포함하고, 여기서 하나 이상의 아미노산 잔기는 본 발명의 치료 단백질 아미노산 서열에 부가된다. 삽입은 단백질의 어느 한쪽 또는 양쪽 말단에 위치할 수 있고/있거나, 치료 단백질 아미노산 서열의 내부 영역 안에서 배치될 수 있다. 어느 한쪽 또는 양쪽 말단에서 추가의 잔기를 가진, 삽입 변이체는, 예를 들어, 아미노산 태그 또는 다른 아미노산 라벨을 포함하는 단백질 및 융합 단백질을 포함한다. 일 측면에서, 특히 분자가 박테리아 세포 예컨대 E. 콜리에서 재조합으로 발현되는 경우, 혈액 응고 단백질 분자는 N-말단 Met를 선택적으로 함유한다.

결실 변이체에서, 본 명세서에서 기재된 바와 같이 치료 단백질 폴리펩타이드에서 하나 이상의 아미노산 잔기는 제거된다. 결실은 치료 단백질 폴리펩타이드의 한쪽 또는 양쪽 말단에서, 및/또는 치료 단백질 아미노산 서열 안에서 하나 이상의 잔기의 제거로 영향받을 수 있다. 결실 변이체는, 따라서, 치료 단백질 폴리펩타이드 서열의 단편을 포함한다.

치환 변이체에서, 치료 단백질 폴리펩타이드의 하나 이상의 아미노산 잔기는 제거되고 대안적 잔기로 재배치된다. 일 측면에서, 치환은 사실상 보존적이고 상기 유형의 보존적 치환은 당해 기술에 공지되어 있다. 대안적으로, 본 발명은 또한 비-보존적인 치환을 포함한다. 예시적 보존적 치환은 하기에서 기재되고: Lehninger, [Biochemistry, 2nd Edition; Worth Publishers, Inc., New York (1975), pp.71-77] 및 즉시 아래 설명된다.

대안적으로, 예시적 보존적 치환은 즉시 아래 설명된다.

폴리뉴클레오타이드

본 발명의 치료 단백질을 인코딩하는 핵산은, 예를 들어 및 제한 없이, 유전자, pre-mRNAs, mRNAs, cDNAs, 다형성 변이체, 대립유전자, 합성 및 자연 발생 돌연변이체를 포함한다.

본 발명의 치료 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 또한, 제한 없이, 하기를 포함한다: (1) 본 명세서에서 기재된 바와 같이 언급된 아미노산 서열, 및 이의 보존적으로 변형된 변이체를 인코딩하는 핵산에 엄격한 하이브리드화 조건하에 구체적으로 하이브리드화하는 것; (2) 본 명세서에서 기재된 바와 같이 참조 핵산 서열에 적어도 약 25, 약 50, 약 100, 약 150, 약 200, 약 250, 약 500, 약 1000, 또는 초과 뉴클레오타이드 (성숙한 단백질의 1218 뉴클레오타이드의 최대 전장 서열)의 영역에 걸쳐, 약 95% 초과, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 더 높은 뉴클레오타이드 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는 것. 예시적 “엄격한 하이브리드화” 조건은 50% 포름아미드, 5X SSC, 20 mM NaㆍPO4, pH 6.8내 42 ℃에서 하이브리드화; 및 30 분 동안 55oC에서 1X SSC내 세정을 포함한다. 이들 예시적 조건에서 변동은 하이브리드화되는 서열의 GC 뉴클레오타이드 함량 및 길이에 기반하여 실시되는 것이 이해된다. 당해 분야에서 식 표준은 적절한 하이브리드화 조건 결정에 적절하다. 참조 Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Second ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) §§ 9.47-9.51.

“자연 발생” 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열은, 비제한적으로, 영장류, 예를 들면, 인간을 포함하는 포유동물; 설치류, 예를 들면, 랫트, 마우스, 햄스터; 소, 돼지, 말, 양, 또는 임의의 포유동물로부터 전형적으로 유래된다. 본 발명의 핵산 및 단백질은 (예를 들면, 이종성이고 야생형 서열 또는 이의 변이체를 인코딩하거나, 비-자연 발생인) 재조합 분자일 수 있다.

치료 단백질의 생산

치료 단백질의 생산은, 정제된 치료 단백질을 수득하기 위해, (i) 유전공학에 의한 재조합 DNA의 생산, (ii) 예를 들어 및 제한 없이, 형질감염, 전기천공 또는 미세주입에 의해 원핵 또는 진핵 세포 속에 재조합 DNA 도입, (iii) 상기 전환된 세포 배양, (iv) 예를 들면 구성적으로 또는 유도시, 치료 단백질 발현, 및 (v) 예를 들면 배양 배지로부터 또는 전환된 세포 수확에 의해, 상기 혈액 응고 단백질 단리에 대하여 당해 분야에서 공지된 임의의 방법을 포함한다.

다른 측면에서, 치료 단백질은 약리적으로 허용가능한 혈액 응고 단백질 분자 생산을 특징으로 하는 적합한 원핵 또는 진핵생물 숙주 시스템에서 발현에 의해 생산된다. 진핵 세포의 예는 포유동물 세포, 예컨대 CHO, COS, HEK 293, BHK, SK-Hep, 및 HepG2이다.

다양한 벡터는 치료 단백질의 제조에 사용되고 진핵 및 원핵 발현 벡터로부터 선택된다. 원핵 발현용 벡터의 예는 플라스미드 예컨대, 및 제한 없이, pRSET, pET, 및 pBAD를 포함하고, 여기서 원핵 발현 벡터에서 사용된 상기 프로모터는 하나 이상의, 및 제한 없이, lac, trc, trp, recA, 또는 araBAD를 포함한다. 진핵 발현용 벡터의 예는 하기를 포함한다: (i) 효모에서 발현을 위하여, 프로모터 예컨대, 및 제한 없이, AOX1, 갭, GAL1, 또는 AUG1을 이용하는, 벡터 예컨대, 및 제한 없이, pAO, pPIC, pYES, 또는 pMET; (ii) 곤충 세포에서 발현을 위하여, 프로모터 예컨대 및 제한 없이 PH, p10, MT, Ac5, OpIE2, gp64, 또는 polh를 이용하는, 벡터 예컨대 및 제한 없이, pMT, pAc5, pIB, pMIB, 또는 pBAC, 및 (iii) 포유동물 세포에서 발현을 위하여, 프로모터 예컨대 및 제한 없이 CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV, 및 -액틴을 이용하는, 벡터 예컨대 및 제한 없이 pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3, 또는 pBPV, 및, 일 측면에서, 바이러스성 시스템 예컨대 및 제한 없이 백시니아 바이러스, 아데노-관련된 바이러스, 헤르페스 바이러스, 또는 레트로바이러스로부터 유래된 벡터.

추가의 최근 예는 하기를 포함한다: 미국 특허 번호 7,645,860; 미국 특허 번호 8,637,640; 미국 특허 번호 8,642,737; 및 미국 특허 번호 8,809,501.

투여

일 구현예에서 본 발명의 콘주게이션된 치료 단백질은 주사, 예컨대 정맥내, 근육내, 또는 복강내 주사에 의해 투여될 수 있다.

인간 또는 시험 동물에 본 발명의 콘주게이션된 치료 단백질을 포함하는 조성물을 투여하기 위해, 일 측면에서, 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 캐리어를 포함한다. 용어 “약제학적으로” 또는 "약리적으로 허용가능한"은 안정적이고, 단백질 열화 예컨대 생성물 응집 및 절단을 억제시키고, 게다가 아래 기재된 바와 같이 당해 분야에서 공지된 경로를 이용하여 투여된 경우 알러지성, 또는 다른 부정적인 반응을 생산하지 않는 분자 독립체 및 조성물을 지칭한다. “약제학적으로 허용가능한 캐리어”는, 상기 개시된 제제들을 포함하여, 임의의 및 모든 임상적으로 유용한 용매, 분산매, 코팅물, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 및 기타 동종을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, “유효량”은 질환 또는 장애의 치료 또는 질환 또는 장애의 증상 완화에 적합한 용량을 포함한다. 일 구현예에서, “유효량”은 본 명세서에서 기재된 바와 같이 출혈성 장애를 갖는 포유동물 치료에 적합한 용량을 포함한다.

조성물은 경구로, 국소적으로, 경피로, 비경구로, 흡입으로 스프레이, 질로, 직장으로, 또는 두개내 주사로 투여될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 비경구는 피하 주사, 정맥내, 근육내, 낭내 주사, 또는 주입 기술을 포함한다. 정맥내, 진피내, 근육내, 유선내, 복강내, 척추강내, 안구뒤 투여, 폐내 주사 및 또는 특정한 부위에서 수술적 이식은 또한 고려된다. 일반적으로, 조성물은 발열원, 뿐만 아니라 수령체에 유해할 수 있는 다른 불순물이 본질적으로 없다.

조성물의 단일 또는 다중 투여는 치료 의사에 의해 선택된 용량 수준 및 패턴으로 수행될 수 있다. 질환의 예방 또는 치료를 위하여, 적절한 투약량은, 상기 기재된 바와 같이, 치료받는 질환의 유형, 질환의 중증도 및 과정, 약물이 예방적 또는 치료적 목적을 위하여 투여되는지 여부, 이전의 요법, 약물에 대한 환자의 임상 이력 및 반응, 그리고 주치의의 재량에 의존할 것이다.

본 발명은 또한 본 명세서에서 정의된 바와 같이 유효량의 콘주게이션된 치료 단백질을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 캐리어, 희석제, 염, 버퍼, 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 약제학적 조성물은 상기-정의된 출혈성 장애 치료에 사용될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 용액 또는 동결건조된 생성물일 수 있다. 약제학적 조성물의 용액은 임의의 적합한 동결건조 공정으로 처리될 수 있다.

추가의 측면으로서, 본 발명은 대상체에 투여를 위하여 그것의 용도를 용이하게 하는 방식으로 포장된 본 발명의 조성물을 포함하는 키트를 포함한다. 일 구현예에서, 그와 같은 키트는, 컨테이너에 부착된 또는 방법 실시에서 화합물 또는 조성물의 용도를 기재하는 패키지에서 포함된 라벨을 가진, 컨테이너 예컨대 밀봉된 병 또는 용기에서 포장된, 본 명세서에서 기재된 화합물 또는 조성물 (예를 들면, 콘주게이션된 치료 단백질을 포함하는 조성물)을 포함한다. 일 구현예에서, 키트는 콘주게이션된 치료 단백질을 포함하는 조성물을 갖는 제1 컨테이너 및 제1 컨테이너에서 조성물에 대하여 생리적으로 허용가능한 재구성 용액을 갖는 제2 컨테이너를 함유한다. 일 측면에서, 화합물 또는 조성물은 단위 투약량 형태로 포장된다. 키트는 추가로 특이적인 투여 경로에 따라 조성물 투여에 적합한 디바이스를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 키트는 치료 단백질 또는 펩타이드 조성물의 용도를 기재하는 라벨을 함유한다.

수용성 폴리머

일 측면에서, 제공된 치료 단백질 유도체 (즉, 콘주게이션된 치료 단백질) 분자는, 비제한적으로, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 분지형 PEG, 폴리시알산 (PSA), 하이드록시알킬 전분 (HAS), 하이드록실에틸 전분 (HES), 탄수화물, 다당류, 풀루란, 키토산, 하이알루론산, 콘드로이틴 설페이트, 더마탄 설페이트, 전분, 덱스트란, 카복시메틸-덱스트란, 폴리알킬렌 옥사이드 (PAO), 폴리알킬렌 글리콜 (PAG), 폴리프로필렌 글리콜 (PPG) 폴리옥사졸린, 폴리 아크릴로일모폴린, 폴리비닐 알코올 (PVA), 폴리카복실레이트, 폴리비닐피롤리돈, 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린, 폴리에틸렌-코-말레산 무수물, 폴리스티렌-코-말레산 무수물, 폴리(1-하이드록시메틸에틸렌 하이드록시메틸포르말) (PHF), 2-메타크릴로일옥시-2’-에틸트리메틸암모늄포스페이트 (MPC)를 포함하는 수용성 폴리머에 결합된다. 본 발명의 일 구현예에서, 수용성 폴리머는 350 내지 120,000 Da, 500 내지 100,000 Da, 1000 내지 80,000 Da, 1500 내지 60,000 Da, 2,000 내지 45,000 Da, 3,000 내지 35,000 Da, 및 5,000 내지 25,000 Da의 분자량 범위를 갖는 시알산 분자로 구성되어 있다. 수용성 폴리머의 커플링은 단백질에 직접적인 커플링에 의해 또는 링커 분자를 통해 수행될 수 있다. 화학적 링커의 하나의 예는 탄수화물-선택적 하이드라자이드 및 설프하이드릴-반응성 말레이미드 기를 함유하는 MBPH (4-[4-N-말레이미도페닐]부티르산 하이드라자이드)이다 (Chamow 등, J Biol Chem 1992, 267, 15916-22). 다른 예시적 및 바람직한 링커는 아래 기재된다.

동종이중작용성 링커

예시적 구현예에서, 수용성 폴리머의 커플링은 동종이중작용성 링커를 통해 수행된다. 예시적 구현예에서, 동종이중작용성 링커는 가교결합제의 스페이서 아암의 반대편 단부에서 동일한 반응성 기를 보유하고 식 Y-L-Y를 갖는다. 예시적 구현예에서, 동종이중작용성 링커는 하기이다: NH₂[OCH₂CH₂]_n’ONH₂ 식중 n’=1-10. 예시적 구현예에서, 동종이중작용성 링커는 하기이다: NH₂[OCH₂CH₂]₂ONH₂. 예시적 구현예에서, 동종이중작용성 링커는 하기이다: NH₂[OCH₂CH₂]₄ONH₂. 예시적 구현예에서, 동종이중작용성 링커는 하기이다: NH₂[OCH₂CH₂]₆ONH₂. 예시적 구현예에서, 동종이중작용성 링커는 하기이다: NH₂[OCH₂CH₂]₈ONH₂. 예시적 구현예에서, 동종이중작용성 링커는 하기이다: NH₂[OCH₂CH₂]₁₀ONH₂.

일 구현예에서, 유도체는 원상태 치료 단백질 생성물의 전체 기능적 활성을 보유하고, 원상태 치료 단백질 생성물에 비교된 경우, 생체내 연장된 반감기를 제공한다. 예시적 구현예에서, 유도체는 원상태 혈액 응고 단백질에 비해 적어도 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 약 30, 약 31, 약 32, 약 34, 약 35, 약 36, 약 37, 약 38, 약 39, 약 40, 약 41, 약 42, 약 43, 약 44, 약 45, 약 46, 약 47, 약 48, 약 49, 약 50, 약 51, 약 52, 약 53, 약 54, 약 55, 약 56, 약 57, 약 58, 약 59, 약 60, 약 61, 약 62, 약 63, 약 64, 약 65, 약 66, 약 67, 약 68, 약 69, 약 70, 약 71, 약 72, 약 73, 약 74, 약 75, 약 76, 약 77, 약 78, 약 79, 약 80, 약 81, 약 82, 약 83, 약 84, 약 85, 약 86, 약 87, 약 88, 약 89, 약 90, 약 91, 약 92, 약 93, 약 94, 약 95, 약 96, 약 97, 약 98, 약 99, 약 100, 110, 약 120, 약 130, 약 140, 또는 약 150 퍼센트 (%) 생물학적 활성을 보유한다. 예시적 구현예에서, PSA-rFVIII 콘주게이트는 원상태 rFVIII에 비해 약 70 % 더 큰 비활성을 수득한다. 예시적 구현예에서, 유도체 및 원상태 혈액 응고 단백질의 생물학적 활성은 하기의 비에 의해 결정된다: 발색 활성 대 혈액 응고 인자 항원 값 (혈액 응고 인자:Chr:혈액 응고 인자:Ag). 본 발명의 예시적 구현예에서, 작제물의 반감기는 원상태 치료 단백질의 생체내 반감기에 비해 약 1.0, 약 1.1, 약 1.2, 약 1.3, 약 1.4, 약 1.5, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 또는 약 10-배 감소 또는 증가된다.

예시적 구현예에서, 유도체, 예를 들면, 본 명세서에서 기재된 바와 같이 PSA를 포함하는 변형된 FVIII은 하나 이상의 리간드 예컨대 VWF 또는 LRP1에 상호작용하는 (예를 들면, 결합하는) 변형된 FVIII의 능력을 감소 또는 달리 제한하기 위한 그와 같은 방식으로 변형된다. 예를 들어, 본 개시내용 따른 변형된 FVIII은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 초과 PSA 모이어티가 어느 한쪽으로 FVIII의 별개의 아미노산에 직접적으로 또는, 예를 들어, FVIII에서 탄수화물 모이어티에 부착되는 FVIII을 포함한다. 본 명세서에서 개시된 바와 같이, 아미노옥시 링커는 부착이 FVIII 탄수화물 모이어티를 통해 발생하는 경우 고려된다.

다양한 구현예에서, 예를 들어 변형된 FVIII의 VWF 및/또는 LRP1에의 결합 친화도는 변형된(modofoed) FVIII의 반감기와 직접적으로 상관관계가 있다. 예를 들어, VWF에 결합이 더 강할수록, 반감기는, 예를 들어, 수용성 폴리머가 아닌, VWF에 의해 더욱 제어된다. 이런 식으로, VWF 결합을 더욱 심하게 감소시키는 변형은 VWF와는 대조적으로 수용성 폴리머에 의해 부여된 청소능-방지 특성을 기준으로 하여 반감기 연장을 제어할 것이다.

시알산 및 PSA

PSAs는 N-아세틸뉴라민산의 폴리머 (일반적으로 호모폴리머)로 구성된다. 2차 아미노 기는 정상적으로 아세틸 기를 보유하지만, 대신 글라이콜릴 기를 보유할 수 있다. 하이드록실 기에서 가능한 치환체는 아세틸, 락틸, 에틸, 설페이트, 및 포스페이트 기를 포함한다.

N-아세틸뉴라민산

Neu5Ac

시알산 (N-아세틸뉴라민산)의 구조

PSAs 및 mPSAs는 일반적으로 2,8- 또는 2,9- 글리코시드 연결 또는 이들의 조합 (예를 들면 교대 2,8- 및 2,9- 연결)에 의해 연결된 N-아세틸뉴라민산 모이어티로 본질적으로 구성되는 선형 폴리머를 포함한다. 특히 바람직한 PSAs 및 mPSAs에서, 글리코시드 연결은 -2,8이다. 상기 PSAs 및 mPSAs는 콜로민산으로부터 편리하게 유래되고, 본 명세서에서 “CAs” 및 “mCAs”로서 지칭된다. 전형적인 PSAs 및 mPSAs는 적어도 2, 바람직하게는 적어도 5, 더 바람직하게는 적어도 10 및 가장 바람직하게는 적어도 20 N-아세틸뉴라민산 모이어티를 포함한다. 따라서, 이들은 2 내지 300 N-아세틸뉴라민산 모이어티, 바람직하게는 5 내지 200 N-아세틸뉴라민산 모이어티, 또는 가장 바람직하게는 10 내지 100 N-아세틸뉴라민산 모이어티를 포함할 수 있다. PSAs 및 CAS는 바람직하게는 본질적으로 N-아세틸뉴라민산과 다른 당 모이어티가 없다. 따라서 PSAs 및 CAS는 바람직하게는 적어도 90 %, 더 바람직하게는 적어도 95 % 및 가장 바람직하게는 적어도 98 % N-아세틸뉴라민산 모이어티를 포함한다.

모이어티의 산화

PSAs 및 CAS가 (예를 들어, mPSAS 및 mCAs에서처럼) N-아세틸뉴라민산과 다른 모이어티를 포함하는 경우 이들은 바람직하게는 폴리머 사슬의 단부의 한쪽 또는 양쪽에 위치한다. 상기 “다른” 모이어티는, 예를 들어, 산화 또는 환원에 의해 말단 N-아세틸뉴라민산 모이어티로부터 유래된 모이어티일 수 있다.

예를 들어, WO-A-0187922는 비-환원 말단 N-아세틸뉴라민산 단위가 나트륨 퍼아이오데이트와 반응에 의해 알데하이드 기로 전환되는 상기 mPSAs 및 mCAs를 기재한다. 추가로, WO 2005/016974는 환원 말단 N-아세틸뉴라민산 단위가 환원 말단 N-아세틸뉴라민산 단위에서 고리를 환원적으로 개방시키기 위해 환원 처리되어, 이로써 근접 디올 기가 형성되고, 이어서 산화되어 근접 디올 기를 알데하이드 기로 전환시키는 상기 mPSAs 및 mCAs를 기재한다.

시알산 풍부 당단백질은 인간 및 다른 유기체에서 셀렉틴을 결합시킨다. 이들은 인간 인플루엔자 감염에서 중요한 역할을 한다. 예를 들면, 시알산은 만노스-결합 렉틴으로부터 숙주 세포 또는 박테리아의 표면에서 만노스 항원을 숨길 수 있다. 이것은 보체의 활성화를 예방한다. 시알산은 또한 끝에서 두 번째 갈락토오스 잔기를 숨기고 따라서 간 실질 세포에서 갈락토오스 수용체에 의해 당단백질의 급속 청소능을 예방한다.

콜로민산 (N-아세틸뉴라민산의 호모폴리머)의 구조

콜로민산 (PSAs의 하위-부류)는 α (2→8) 케토시드 연결을 가진 N-아세틸뉴라민산 (NANA)의 호모폴리머이고, 특히, K1 항원을 보유하는 에스케리치아 콜리의 특정한 균주에 의해 생산된다. 콜로민산은 많은 생리적 기능을 갖는다. 이들은 약물 및 화장품용 원료로서 중요하다.

폴리시알릴화된 및 미변형된 아스파라기나제로 생체내 비교 연구는 폴리시알릴화가 효소의 반감기를 증가시켰다는 것을 드러냈다 (Fernandes 및 Gregoriadis, Biochimica Biophysica Acta 1997, 1341, 26-34).

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "시알산 모이어티"는 수용액 또는 현탁액에서 가용성이고 약제학적 유효량으로 PSA-혈액 응고 단백질 콘주게이트의 투여시 포유동물에 부정적 영향, 예컨대 부작용이 거의 없는 시알산 모노머 또는 폴리머 (“다당류”)를 포함한다. 폴리머는, 일 측면에서, 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 10, 약 20, 약 30, 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 200, 약 300, 약 400, 또는 약 500 시알산 단위를 갖는 것으로서 특성규명된다. 예시적 구현예에서, 폴리시알산은 폴리머가 약 20 kD의 분자량을 갖는 정도로 수많은 시알산 단위를 포함한다. 특정 측면에서, 상이한 시알산 단위는 쇄에서 조합된다.

본 발명의 일 구현예에서, 다당류 화합물의 시알산 부분은 고도로 친수성이고, 예시적 구현예에서 전체 화합물은 고도로 친수성이다. 친수성은 시알산 단위의 현수 카복실 기, 뿐만 아니라 하이드록실 기에 의해 주로 부여된다. 당류 단위는 다른 작용기, 예컨대, 아민, 하이드록실 또는 설페이트 기, 또는 이들의 조합을 함유할 수 있다. 이들 기는 자연 발생 당류 화합물에서 존재할 수 있거나, 유도체 다당류 화합물 속에 도입될 수 있다.

자연 발생 폴리머 PSA는 하기를 보여주는 다분산 제제로서 이용가능하다: 넓은 크기 분포 (예를 들면Sigma C-5762) 및 고 다분산도 (PD). 다당류가 내독소 동시정제의 고유한 위험을 갖는 박테리아에서 일반적으로 생산되기 때문에, 시알산 폴리머 장쇄의 정제는 증가된 내독소 함량의 개연성을 상승시킬 수 있다. 1-4 시알산 단위를 가진 짧은 PSA 분자는 또한 합성으로 제조될 수 있고 (Kang SH 등, Chem Commun. 2000; 227-8; Ress DK 및 Linhardt RJ, Current Organic Synthesis.2004; 1:31-46), 따라서 고 내독소 수준의 위험을 최소화한다. 그러나, 또한 내독소가 없는, 좁은 크기 분포 및 저 다분산도를 가진 PSA 제제는 현재 제조될 수 있다. 본 발명을 위하여 특정 용도의 다당류 화합물은, 일 측면에서, 박테리아에 의해 생산된 것이다. 이들 자연 발생 다당류의 일부는 당지질로서 공지된다. 일 구현예에서, 다당류 화합물은 실질적으로 말단 갈락토오스 단위가 없다.

부착의 방법

치료 단백질은 당해 분야의 숙련가에 공지된 임의의 다양한 기술에 의해 다당류 화합물에 공유결합될 수 있다. 본 발명의 다양한 측면에서, 시알산 모이어티는 하기에 결합된다: 치료 단백질, 예를 들면, FIX, FVIII, FVIIa 또는 VWF, 예를 들어 하기에서 기재된 방법에 의해: 미국 특허 번호 4,356,170, 본 명세서에서 참고로 편입됨. 추가의 최근 예는 하기를 포함한다: 미국 특허 번호 7,645,860; 미국 특허 번호 8,637,640; 미국 특허 번호 8,642,737; 및 미국 특허 번호 8,809,501, 본 명세서에서 참고로 편입됨.

폴리펩타이드에 PSA 커플링용 다른 기술은 또한 공지되고 본 발명에 의해 고려된다. 예를 들어, 미국 공개 번호2007/0282096은 하기의 아민 또는 하이드라자이드 유도체의 콘주게이션을 기재한다: 예를 들면, PSA, 단백질로의.또한, 미국 공개 번호2007/0191597은 환원 단부에서 기질 (예를 들면, 단백질)과 반응을 위하여 알데하이드 기를 함유하는 PSA 유도체를 기재한다. 이들 참고문헌은 그 전체가 참고로 편입된다.

다양한 방법은 하기의 칼럼 7, 라인 15 내지 칼럼 8, 라인 5에서 개시된다: 미국특허 번호 5,846,951 (참고로 그 전문이 편입됨). 예시적 기술은 어느 한쪽 혈액 응고 단백질 또는 다당류 중 하나에서 카복실 기와 혈액 응고 단백질 또는 다당류의 아민 기 사이 펩타이드 연결, 또는 혈액 응고 단백질 또는 다당류의 카복실 기와 치료 단백질 또는 다당류의 하이드록실 기 사이 에스테르 연결을 통한 연결을 포함한다. 치료 단백질이 다당류 화합물에 공유결합되는 또 다른 연결은 퍼아이오데이트 산화에 의해 다당류의 비-환원 단부에서 형성된 알데하이드 기와 반응된 혈액 응고 단백질에서 자유 아미노 기 사이, 쉬프 염기를 통해서이다 (Jennings HJ 및 Lugowski C, J Immunol. 1981; 127:1011-8; Fernandes AI 및 Gregoriadis G, Biochim Biophys Acta. 1997; 1341; 26-34). 생성된 쉬프 염기는 일 측면에서 NaCNBH₃으로 특정 환원에 의해 안정화되어 2차 아민을 형성한다. 대안적 접근법은 선행 산화 후 NH₄Cl로 환원성 아미노화에 의해 PSA에서 말단 자유 아미노 기의 생성이다. 이중작용성 시약은 2 아미노 또는 2 하이드록실 기 연결에 사용될 수 있다. 예를 들어, 아미노 기를 함유하는 PSA는 BS3 (비스(설포석신이미딜)우베레이트 / Pierce, Rockford, IL)같은 시약으로 단백질의 아미노 기에 커플링된다. 게다가 설포-EMCS (N-ε-말레이미도카프로일옥시) 설포석신이미드 에스테르 / Pierce)같은 이종이중작용성 가교 시약은 예를 들어 아민 및 티올 기를 연결하는데 사용된다.

예시적 구현예에서, PSA 하이드라자이드는 제조되고 알데하이드 기능의 생성 및 이전 산화 후 단백질의 탄수화물 모이어티에 커플링된다.

상기 기재된 바와 같이, 치료 단백질의 유리 아민 기는 시알산 잔기의 1-카복실 기와 반응하여 펩티딜 연결을 형성하거나 에스테르 결합은 혈액 응고 단백질에서 1-카복실산 기와 하이드록실 또는 다른 적합한 활성 기 사이 형성된다. 대안적으로, 카복실 기는 탈아세틸화된 5-아미노 기와 펩타이드 연결을 형성하거나, 치료 단백질의 분자의 알데하이드 기는 시알산 잔기의 N-탈아세틸화된 5-아미노 기와 쉬프 염기를 형성한다.

대안적으로, 다당류 화합물은 비-공유 방식으로 치료 단백질과 관련된다. 예를 들어, 다당류 화합물 및 약제학적으로 활성 화합물은 일 측면에서 소수성 상호작용을 통해 연결된다. 다른 비-공유 회합은 서로 유인하는 반대 전하 이온과 정전 상호작용을 포함한다.

다양한 구현예에서, 치료 단백질은 하기로 다당류 화합물에 연결되거나 상기와 관련된다: 화학양론적 양 (예를 들면, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:7, 1:8, 1:9, 또는 1:10, 등). 다양한 구현예에서, 1-6, 7-12 또는 13-20 다당류는 혈액 응고 단백질에 연결된다. 더욱 다른 구현예에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 초과 다당류는 혈액 응고 단백질에 연결된다.

다양한 구현예에서, 치료 단백질은 당화 부위 (즉, 원상태 당화 부위와 다른 부위)를 도입하기 위해 변형된다. 상기 변형은 당해 분야에서 공지된 표준 분자 생물학적 기술을 이용하여 달성될 수 있다. 또한, 하나 이상의 탄수화물 모이어티를 통해 수용성 폴리머에 콘주게이션에 앞서, 치료 단백질은 생체내 또는 시험관내 당화될 수 있다. 이들 당화된 부위는 수용성 폴리머와 단백질의 콘주게이션용 표적으로서 작용할 수 있다 (미국 특허 출원 번호20090028822, 미국 특허 출원 번호2009/0093399, 미국 특허 출원 번호2009/0081188, 미국 특허 출원 번호2007/0254836, 미국 특허 출원 번호2006/0111279, 및 DeFrees S. 등, Glycobiology, 2006, 16, 9, 833-43). 예를 들어, 생체내 자연적으로 당화되지 않는 단백질 (예를 들면, 당단백질이 아닌 단백질)은 상기 기재된 바와 같이 변형될 수 있다.

아미노옥시 연결

본 발명의 일 구현예에서, 옥심 기를 형성하기 위해 (예를 들면, 나트륨 퍼아이오데이트에 의해 산화 이후 탄수화물 모이어티에서) 알데하이드와 하이드록실아민 또는 하이드록실아민 유도체의 반응은 혈액 응고 단백질의 콘주게이트의 제조에 적용된다. 예를 들어, 당단백질 (예를 들면, 본 발명에 따른 치료 단백질)은 하기로 먼저 산화된다: 산화제 예컨대 나트륨 퍼아이오데이트 (NaIO₄) (Rothfus JA et Smith EL., J Biol Chem 1963, 238, 1402-10; 및 Van Lenten L 및 Ashwell G., J Biol Chem 1971, 246, 1889-94). 당단백질의 퍼아이오데이트 산화는, 활성 알데하이드 기를 형성하기 위한 퍼아이오데이트와 근접 디올의 산화인, 1928년에 기재된 고전적 말라프레이드 반응에 기반된다 (Malaprade L., Analytical application, Bull Soc Chim France, 1928, 43, 683-96). 그와 같은 산화제를 위한 추가의 예는 하기이다: 납 테트라아세테이트 (Pb(OAc)4), 망간 아세테이트 (MnO(Ac)3), 코발트 아세테이트 (Co(OAc)2), 탈륨 아세테이트 (TlOAc), 세륨 설페이트 (Ce(SO4)2) (US 4,367,309) 또는 칼륨 퍼루테네이트 (KRuO4) (Marko 등., J Am Chem Soc 1997,119, 12661-2). “산화제”는 탄수화물에서 근접 디올을 산화시켜, 이로써 생리적 반응 조건하에 활성 알데하이드 기를 생성할 수 있는 온화한 산화 화합물을 의미한다.

제2 단계는 옥심 결합을 형성하기 위해 아미노옥시 기를 함유하는 폴리머의 산화된 탄수화물 모이어티에의 커플링이다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 단계는 친핵성 촉매 아닐린 또는 아닐린 유도체의 촉매적 양의 존재하에 수행될 수 있다 (Dirksen A et Dawson PE, Bioconjugate Chem. 2008; Zeng Y 등, Nature Methods 2009, 6, 207-9). 아닐린 촉매작용은 시약의 초저농도의 사용을 허용하는 옥심 결찰을 극적으로 촉진시킨다. 본 발명의 예시적 구현예에서 옥심 연결은 알콕시아민 연결을 형성하기 위해 NaCNBH₃와 환원에 의해 안정화된다. 추가의 촉매는 아래 기재된다.

아미노옥시 기술에 관한 추가의 정보는 다음과 같은 참고문헌에서 발견될 수 있고, 이들 각각은 그 전체가 편입된다: EP 1681303A1 (HASylated 에리트로포이에틴); WO 2005/014024 (옥심 연결 기에 의해 연결된 단백질 및 폴리머의 콘주게이트); WO96/40662 (아미노옥시-함유 링커 화합물 및 콘주게이트에서 그것의 적용); WO 2008/025856 (변형된 단백질); Peri F 등, Tetrahedron 1998, 54, 12269-78; Kubler-Kielb J et. Pozsgay V., J Org Chem 2005, 70, 6887-90; Lees A 등, Vaccine 2006, 24(6), 716-29; 및 Heredia KL 등., Macromoecules 2007, 40(14), 4772-9.

아미노옥시 링커에 수용성 폴리머의 수많은 커플링 방법은 본 개시내용에 의해 고려된다. 예를 들어, 어느 한쪽 수용성 폴리머 예컨대 PSA의 환원 또는 비-환원 단부에 링커의 커플링은 본 명세서에서 기재된다. 커플링 부위 (예를 들면, 환원 단부 대 비-환원 단부)는 커플링 공정의 하나 이상의 조건 (예를 들면, 시간 및 온도) 뿐만 아니라 수용성 폴리머의 (예를 들면, 원상태 대 산화된) 상태에 의해 결정된다. 일 구현예에서, 산화된 수용성 폴리머 예컨대 PSA는 환원된 온도 (예를 들면, 2-8 ℃)에서 커플링 반응 수행에 의해 아미노옥시 링커에 그것의 비-환원 단부에서 커플링된다. 예시적 구현예에서, 원상태 (예를 들면, 비-산화된) 수용성 폴리머 예컨대 PSA는 더 높은 온도 (예를 들면, 22-37^oC)에서 커플링 반응 수행에 의해 아미노옥시 링커에 이의 환원 단부에서 커플링된다. 상기 언급된 구현예는 아래 및 실시예에서 더 상세히 기재된다.

본 명세서에서 기재된 바와 같이, 디아미노옥시 링커와 산화된 PSA의 반응은 2개의 반응을 보여준다: 비-환원 단부에서 알데하이드 기의 “신속 반응”, 및 환원 단부에서 “저속 반응”. (산화되지 않고 활성 알데하이드 기를 함유하지 않는) 원상태 PSA가 실온에서 환원 단부와 반응되면, 유도된 PSA는 관측될 수 있다. 따라서, 다양한 구현예에서, 수용성 폴리머 예컨대 PSA의 환원 단부에서 원치않는 부 반응을 최소화하기 위해, PSA-아미노옥시 링커 시약 제조는 2-8 ℃ 사이 온도에서 수행된다.

본 개시내용의 예시적 구현예에서, 환원 단부에서 원상태 PSA의 유도체화는 제공된다. 본 명세서에서 기재된 바와 같이, (NaIO₄에 의해 산화되지 않고 따라서 그것의 비-환원 단부에서 자유 알데하이드 기를 함유하지 않는) 원상태 PSA는 실온에서 디아미노옥시 링커와 반응되고, 그것의 환원 단부에서 PSA의 유도체화는 관측될 수 있다. 상기 커플링은 환원 단부에서 개환 및 후속적인 옥심 형성을 통해 발생한다 (상기 기재된 실제 부 반응 및 아미노옥시-PSA 시약에서 부산물의 존재에 대한 원인). 예시적 구현예에서, 반응은 최대 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 약 30, 약 31, 약 32, 약 34, 약 35, 약 36, 약 37, 약 38, 약 39, 약 40, 약 41, 약 42, 약 43, 약 44, 약 45, 약 46, 약 47, 약 48, 약 49, 약 50, 약 51, 약 52, 약 53, 약 54, 약 55, 약 56, 약 57, 약 58, 약 59, 약 60, 약 61, 약 62, 약 63, 약 64, 약 65, 약 66, 약 67, 약 68, 약 69, 약 70, 약 71, 약 72, 약 73, 약 74, 약 75, 약 76, 약 77, 약 78, 약 79, 약 80, 약 81, 약 82, 약 83, 약 84, 약 85, 약 86, 약 87, 약 88, 약 89, 약 90, 약 91, 약 92, 약 93, 약 94, 약 95, 약 96, 약 97, 약 98 또는 약 99 퍼센트 (%)의 변형의 정도로 수득하는 원상태 PSA로 수행된다. 예시적 구현예에서 반응은 최대 약 70 %의 변형을 수득하는 원상태 PSA로 수행된다.

예시적 구현예에서, 반응은 약 20 % 내지 약 99 %의 변형의 정도로 수득하는 원상태 PSA로 수행되고 PSA-rFVIII 콘주게이트는 원상태 rFVIII에 약 20 % 내지 약 150 % 비해 더 큰 비활성을 수득한다. 예시적 구현예에서, 반응은 약 30 % 내지 약 90 %의 변형의 정도로 수득하는 원상태 PSA로 수행되고 PSA-rFVIII 콘주게이트는 원상태 rFVIII에 비해 약 30 % 내지 약 140 % 더 큰 비활성을 수득한다. 예시적 구현예에서, 반응은 약 30 % 내지 약 80 %의 변형의 정도로 수득하는 원상태 PSA로 수행되고 PSA-rFVIII 콘주게이트는 원상태 rFVIII에 비해 약 40 % 내지 약 130 % 더 큰 비활성을 수득한다. 예시적 구현예에서, 반응은 약 30 % 내지 약 70 %의 변형의 정도로 수득하는 원상태 PSA로 수행되고 PSA-rFVIII 콘주게이트는 원상태 rFVIII에 비해 약 50 % 내지 약 120 % 더 큰 비활성을 수득한다. 예시적 구현예에서, 반응은 약 30 % 내지 약 60 %의 변형의 정도로 수득하는 원상태 PSA로 수행되고 PSA-rFVIII 콘주게이트는 원상태 rFVIII에 비해 약 40 % 내지 약 110 % 더 큰 비활성을 수득한다. 예시적 구현예에서, 반응은 최대 약 35 %의 변형의 정도로 수득하는 원상태 PSA로 수행되고 PSA-rFVIII 콘주게이트는 원상태 rFVIII에 비해 약 50 % 내지 약 120 % 더 큰 비활성을 수득한다. 예시적 구현예에서, 반응은 약 54 %의 변형의 정도로 수득하는 원상태 PSA로 수행되고 PSA-rFVIII 콘주게이트는 원상태 rFVIII에 비해 약 50 % 내지 약 120 % 더 큰 비활성을 수득한다. 예시적 구현예에서, 반응은 최대 약 58 %의 변형의 정도로 수득하는 원상태 PSA로 수행되고 PSA-rFVIII 콘주게이트는 원상태 rFVIII에 비해 약 50 % 내지 약 120 % 더 큰 비활성을 수득한다. 예시적 구현예에서, 반응은 최대 약 70 %의 변형의 정도로 수득하는 원상태 PSA로 수행되고 PSA-rFVIII 콘주게이트는 원상태 rFVIII에 비해 약 70 % 더 큰 비활성을 수득한다.

주요 생성물로서 다음과 같은 구조는 13C NMR 분광법에 의해 결정되었다.

예시적 구현예에서, PSAs 및 mPSAs는 적어도 2, 바람직하게는 적어도 5, 더 바람직하게는 적어도 10 및 가장 바람직하게는 적어도 20 N-아세틸뉴라민산 모이어티 (n)을 포함한다. 예시적 구현예에서, n은 2 내지 300 N-아세틸뉴라민산 모이어티를 포함할 수 있다. 예시적 구현예에서, n은 5 내지 200 N-아세틸뉴라민산 모이어티를 포함할 수 있다. 예시적 구현예에서, n은 10 내지 100 N-아세틸뉴라민산 모이어티를 포함할 수 있다. 예시적 구현예에서, 폴리시알산은 폴리머가 약 20 kD의 분자량을 갖는 정도로 수많은 시알산 단위를 포함한다. 반응은 덱스트란 및 전분 같은 다른 탄수화물 또는 환원 말단 기를 함유하는 다른 다당류에 전달될 수 있다. m-톨루이딘 또는 아닐린 같은 친핵성 촉매의 용도는 또한 고려된다. 따라서, 그 다음 치료 단백질의 화학적 변형을 위하여 사용될 수 있는, 원상태 PSA를 이용하는 (즉 선행 산화 없이) 아미노옥시-PSA 시약의 제조는 본 명세서에서 제공된다.

따라서, 본 개시내용의 다양한 구현예에서, 하기인 방법은 제공된다: 하기 커플링의 조건: (예를 들면, 2-8 ℃ 인큐베이션 온도) 수용성 폴리머 예컨대 산화된 PSA에 디아미노옥시 링커는 어느 한쪽 비-환원 단부에 커플링을 선호하거나, 하나의 대안에서, 수용성 폴리머 예컨대 원상태, 비-산화된 PSA에 디아미노옥시 링커 커플링의 조건 (예를 들면, 실온 인큐베이션)은 어느 한쪽 환원 단부에 커플링을 선호한다.

본 발명의 다양한 구현예에서, 하기의 산화된 탄수화물 모이어티에 본 명세서에서 기재된 아미노옥시 기술에 따라 연결되는 수용성 폴리머는: 치료 단백질 (예를 들면, FVIII, FVIIa, 또는 FIX), 비제한적으로 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 분지형 PEG, 폴리시알산 (PSA), 탄수화물, 다당류, 풀루란, 키토산, 하이알루론산, 콘드로이틴 설페이트, 더마탄 설페이트, 전분, 덱스트란, 카복시메틸-덱스트란, 폴리알킬렌 옥사이드 (PAO), 폴리알킬렌 글리콜 (PAG), 폴리프로필렌 글리콜 (PPG) 폴리옥사졸린, 폴리 아크릴로일모폴린, 폴리비닐 알코올 (PVA), 폴리카복실레이트, 폴리비닐피롤리돈, 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린, 폴리에틸렌-코-말레산 무수물, 폴리스티렌-코-말레산 무수물, 폴리(1-하이드록시메틸에틸렌 하이드록시메틸포르말) (PHF), 2-메타크릴로일옥시-2’-에틸트리메틸암모늄포스페이트 (MPC)를 포함한다.

친핵성 촉매

본 명세서에서 기재된(decribed) 바와 같이, 치료 단백질에 수용성 폴리머의 콘주게이션은 아닐린에 의해 촉매접촉될 수 있다. 아닐린은 아민과 알데하이드 및 케톤의 수성 반응을 강하게 촉매접촉시켜 안정적인 이민 예컨대 하이드라존 및 옥심을 형성한다. 다음과 같은 다이어그램은 미촉매접촉된 대 아닐린-촉매접촉된 옥심 결찰 반응을 비교한다 (Kohler JJ, Chem Bio Chem 2009,10, 2147-50):

그러나, 아닐린과 관련된 수많은 건강 위험을 고려하여, 대안적 촉매가 바람직하다. 본 발명은 아닐린 유도체를 대안적 옥심 결찰 촉매로서 제공한다. 상기 아닐린 유도체는, 비제한적으로, o-아미노 벤조산, m-아미노 벤조산, p-아미노 벤조산, 설파닐산, o-아미노벤즈아미드, o-톨루이딘, m-톨루이딘, p-톨루이딘, o-아니시딘, m-아니시딘, 및 p-아니시딘을 포함한다.

본 발명의 일 구현예에서, (메타-톨루이딘, m-메틸아닐린, 3-메틸아닐린, 또는 3-아미노-1-메틸벤젠으로도 알려진) m-톨루이딘은 본 명세서에서 기재된 콘주게이션 반응을 촉매접촉하는데 사용된다. m-톨루이딘 및 아닐린은 하기를 갖는다: 유사한 물리적 특성 및 본질적으로 동일한 pKa 값 (m-톨루이딘:pKa 4.73, 아닐린:pKa 4.63).

본 발명의 친핵성 촉매는 (예를 들어, 아미노옥시 연결을 이용하는) 옥심 결찰 또는 (예를 들면, 하이드라자이드 화학을 이용하는) 하이드라존 형성에 유용하다. 본 발명의 다양한 구현예에서, 친핵성 촉매는 콘주게이션 반응에서 약 0.1, 약 0.2, 약 0.3, 약 0.5, 약 0.6, 약 0.7, 약 0.8, 약 0.9, 약 1.0, 약 1.5, 약 2.0, 약 2.5, 약 3.0, 약 3.5, 약 4.0, 약 4.5, 약 5.0, 약 5.5, 약 6.0, 약 6.5, 약 7.0, 약 7.5, 약 8.0, 약 8.5, 약 9.0, 약 9.5, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 25, 약 30, 약 35, 약 40, 약 45, 또는 약 50 mM의 농도로 제공된다. 일 구현예에서, 친핵성 촉매는 약 1 mM 내지 약 10 mM 양으로 제공된다. 본 발명의 다양한 구현예에서, 콘주게이션 반응 혼합물의 pH는 약 4.5, 약 5.0, 약 5.5, 약 6.0, 약 6.5, 약 7.0 및 약 7.5이다. 일 구현예에서, pH는 약 5.5 내지 약 6.5이다.

콘주게이션된 단백질의 정제

다양한 구현예에서, 본 개시내용에 따라 수용성 폴리머로 콘주게이션된 치료 단백질 및/또는 산화제로 인큐베이션된 단백질의 정제는 바람직하다. 수많은 정제 기술은 당해 기술에 공지되어 있고, 제한 없이, 하기를 포함한다: 크로마토그래피 방법 예컨대 이온교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 및 친화도 크로마토그래피 또는 이들의 조합, 여과 방법 (예를 들면, UF/DF), 및 침전 방법 뿐만 아니라 투석 절차 및 상기 언급된 기술의 임의의 조합 (Guide to Protein Purification, Meth. Enzymology Vol 463 (Burgess RR 및 Deutscher MP 편집), 2^nd edition, Academic Press 2009).

효능

다양한 구현예에서, 쥣과 모델은 반감기 효능을 평가하는데 사용될 수 있다. 다양한 구현예에서, 쥣과 모델은 반감기 효능을 평가하는데 사용될 수 있다. 예시적 구현예에서, 쥣과 모델은 PSA 변형된 FVIII이 페길화된 FVIII보다 더 긴 생체내 반감기를 갖는지를 결정하는데 사용된다. 예시적 구현예에서, 쥣과 모델은 약 20 kDa의 평균 분자량을 갖는 PSA 모이어티에 콘주게이션된 변형된 FVIII이, 약 20 kDa의 평균 분자량을 갖는 PEG 모이어티에 콘주게이션되는, 페길화된 FVIII보다 더 긴 생체내 반감기를 갖는지를 결정하는데 사용된다. 예시적 구현예에서, FVIII KO 마우스에서 테일-클립 출혈 모델은 PSA 변형된 FVIII이 페길화된 FVIII보다 더 긴 생체내 반감기를 갖는지를 결정하는데 사용된다. 예시적 구현예에서, FVIII KO 마우스에서 경동맥 폐색 모델은 PSA 변형된 FVIII이 페길화된 FVIII보다 더 긴 생체내 반감기를 갖는지를 결정하는데 사용된다. 예시적 구현예에서, 혈우병 관절 출혈 (관절내 천자)의 쥣과 모델은 PSA 변형된 FVIII이 페길화된 FVIII보다 더 긴 생체내 반감기를 갖는지를 결정하는데 사용된다.

다음과 같은 예는 본 발명의 특이적인 구현예를 제한하는 의도가 아니고 단지 예시적이다.

실시예

실시예 1

동종이중작용성 링커 NH ₂ [OCH ₂ CH ₂ ] ₂ ONH ₂ 의 제조

동종이중작용성 링커 NH₂[OCH₂CH₂]₂ONH₂

(3-옥사-펜탄-1,5-디옥시아민) (2개의 활성 아미노옥시 기 함유)는 하기에 따라 합성되었다: Boturyn 등(Tetrahedron 1997,53,5485-92) 일차 아민의 변형된 가브리엘-합성을 사용하는 2 단계 유기 반응에서.제1 단계에서, 1 분자의 2,2-클로로디에틸에테르는 2 분자의 엔도-N-하이드록시-5-노르보르넨-2,3-디카복시미드와 디메틸포름아미드 (DMF)에서 반응되었다. 원하는 동종이중작용성 생성물은 에탄올내 하이드라진분해에 의해 수득한 중간체로부터 제조되었다.

실시예 2

동종이중작용성 링커 NH ₂ [OCH ₂ CH ₂ ] ₄ ONH ₂ 의 제조

동종이중작용성 링커 NH₂[OCH₂CH₂]₄ONH₂

(3,6,9-트리옥사-운데칸-1,11-디옥시아민) (2개의 활성 아미노옥시 기 함유)는 하기에 따라 합성되었다: Boturyn 등(Tetrahedron 1997,53,5485-92) 일차 아민의 변형된 가브리엘-합성을 사용하는 2 단계 유기 반응에서.제1 단계에서 1 분자의 비스-(2-(2-클로르에톡시)-에틸)-에테르는 2 분자의 엔도-N-하이드록시-5-노르보르넨-2,3-디카복시미드와 DMF에서 반응되었다. 원하는 동종이중작용성 생성물은 에탄올내 하이드라진분해에 의해 수득한 중간체로부터 제조되었다.

실시예 3

동종이중작용성 링커 NH ₂ [OCH ₂ CH ₂ ] ₆ ONH ₂ 의 제조

동종이중작용성 링커 NH₂[OCH₂CH₂]₆ONH₂

(3,6,9,12,15-펜나트옥사-헵타데칸-1,17-디옥시아민) (2개의 활성 아미노옥시 기 함유)는 하기에 따라 합성되었다: Boturyn 등(Tetrahedron 1997,53,5485-92) 일차 아민의 변형된 가브리엘-합성을 사용하는 2 단계 유기 반응에서.제1 단계에서 1 분자의 헥사에틸렌 글리콜 이염화물은 2 분자의 엔도-N-하이드록시-5-노르보르넨-2,3-디카복시미드와 DMF에서 반응되었다. 원하는 동종이중작용성 생성물은 에탄올내 하이드라진분해에 의해 수득한 중간체로부터 제조되었다.

실시예 4

아미노옥시-PSA 시약의 상세한 합성

3-옥사-펜탄-1,5 디옥시아민은 실시예 1에서 설명된 바와 같이 2 단계 유기 합성에서 Botyryn 등 (Tetrahedron 1997; 53:5485-92)에 따라 합성되었다.

단계 1:

700 mL 무수 N,N-디메틸포름아미드내 엔도-N-하이드록시-5-노르보넨-2,3- 디카복시이미드 (59.0 g; 1.00 eq)의 용액에 무수 K₂CO₃ (45.51 g; 1.00 eq) 및 2,2-디클로로디에틸에테르 (15.84 mL; 0.41 eq)는 첨가되었다. 반응 혼합물은 22 h 동안 50°C에서 교반되었다. 혼합물은 감소된 압력 하에 증발 건조되었다. 잔기는 2 L 디클로로메탄에 현탁되었고 2회 포화된 NaCl-수용액 (각각의 1 L)로 추출되었다. 디클로로메탄 층은 Na₂SO₄상에서 건조되었고 그 다음 감소된 압력 하에 증발 건조되었고 고진공에서 건조되어 64.5 g의 3-옥사펜탄-1,5-디옥시-엔도-2',3'-디카복시디이미드노르보르넨을 백색-황색 고체 (중간체 1)로서 제공하였다.

단계 2:

800 mL 무수 에탄올내 중간체 1 (64.25 g; 1.00 eq)의 용액에, 31.0 mL 하이드라진 수화물 (4.26 eq)는 첨가되었다. 반응 혼합물은 그 다음 2시간 동안 환류되었다. 혼합물은 감소된 압력 하에 용매 증발에 의해 개시 용적의 절반으로 농축되었다. 발생 침전물은 여과 제거되었다. 잔존 에탄올 층은 감소된 압력 하에 증발 건조되었다. 조 생성물 3-옥사-펜탄 -1,5-디옥시아민을 함유하는 잔기는 진공에서 건조되어 46.3 g을 수득하였다. 조 생성물은 칼럼 크로마토그래피 (실리카겔 60; 디클로로메탄/메탄올 혼합물, 9/1로 등용매 용출)로 추가로 정제되어 11.7 g의 순수한 최종 생성물 3-옥사-펜탄 -1,5-디옥시아민을 수득하였다.

실시예 5

아미노옥시-PSA의 제조

Serum Institute of India (Pune, India)로부터 수득된1000 mg의 산화된 PSA (MW = 20 kD)는 16 mL 50 mM phospate 버퍼 pH 6.0에 용해되었다. 그 다음 170 mg 3-옥사-펜탄-1,5-디옥시아민은 반응 혼합물에 제공되었다. 2시간 동안 RT에서 진탕후 78.5 mg 나트륨 시아노보로하이드라이드는 첨가되었고 반응은 18시간 동안 밤새 수행되었다. 반응 혼합물은 그 다음 재생된 셀룰로오스 (50 cm², Millipore)로 제조된 5 kD 컷-오프를 가진 막을 이용하여 한외여과/정용여과 절차 (UF/DF)에 적용되었다.

실시예 6

크로마토그래피 정제 단계를 사용하는 아미노옥시-PSA의 제조

Serum Institute of India (Pune, India)로부터 수득된 1290 mg의 산화된 PSA (MW = 20 kD)는 25 mL 50 mM 포스페이트 버퍼 pH 6.0 (버퍼 A)에 용해되었다. 그 다음 209 mg 3-옥사-펜탄-1,5-디옥시아민은 반응 혼합물에 제공된다. 1시간 동안 RT에서 진탕후 101 mg 나트륨 시아노보로하이드라이드는 첨가되었고 반응은 3시간 동안 수행되었다. 그 다음 혼합물은 그 다음 하기를 사용하는 약 음이온 교환 크로마토그래피 단계에 적용되었다: Fractogel EMD DEAE 650-M 크로마토그래피 겔 (칼럼 치수: XK26/135). 반응 혼합물은 110 mL 버퍼 A로 희석되었고 1 cm/min의 유량에서 버퍼 A로 사전-평형화된 DEAE 칼럼상에 장입되었다. 그 다음 칼럼은 20 CV 버퍼 B (20 mM Hepes, pH 6.0)으로 세정되어 자유 3-옥사-펜탄-1,5-디옥시아민 및 시아나이드를 2 cm/min의 유량에서 제거하였다. 아미노옥시-PSA 시약은 그 다음 67% 버퍼 B 및 43% 버퍼 C (20 mM Hepes, 1M NaCl, pH 7.5)로 구성되는 단계 구배로 용출되었다. 용출액은 폴리에테르 설폰 (50 cm², Millipore)로 만들어진 5 kD 막을 이용하여 UF/DF에 의해 농축되었다. 최종 정용여과 단계는 버퍼 D (20mM Hepes, 90mM NaCl, pH 7.4)에 대해 수행되었다. 제제는 변형의 정도를 결정하기 위해 총 PSA (레조르시놀 검정) 및 총 아미노옥시 기 (TNBS 검정) 측정을 분석적으로 특징으로 하였다. 더욱이 다분산도 뿐만 아니라 자유 3-옥사-펜탄-1,5-디옥시아민 및 시아나이드는 결정되었다.

실시예 7

환원 단계 없이 아미노옥시-PSA의 제조

Serum Institute of India (Pune, India)로부터 수득된 573 mg의 산화된 PSA (MW = 20 kD)는 11.3 mL 50mM 포스페이트 버퍼 pH 6.0 (버퍼 A)에 용해되었다. 그 다음 94 mg 3-옥사-펜탄-1,5-디옥시아민은 반응 혼합물에 제공되었다. 5시간 동안 RT에서 진탕후 혼합물은 그 다음 하기를 사용하는 약 음이온 교환 크로마토그래피 단계에 적용되었다: Fractogel EMD DEAE 650-M 크로마토그래피 겔 (칼럼 치수: XK16/105). 반응 혼합물은 50 mL 버퍼 A로 희석되었고 1 cm/min의 유량에서 버퍼 A로 사전-평형화된 DEAE 칼럼상에 장입되었다. 그 다음 칼럼은 20 CV 버퍼 B (20 mM Hepes, pH 6.0)으로 세정되어 자유 3-옥사-펜탄-1,5-디옥시아민 및 시아나이드를 2 cm/min의 유량에서 제거하였다. 아미노옥시-PSA 시약은 67 % 버퍼 B 및 43 % 버퍼 C (20 mM Hepes, 1 M NaCl, pH 7.5)로 구성되는 단계 구배로 용출되었다. 용출액은 폴리에테르 설폰 (50 cm², Millipore)로 만들어진 5 kD 막을 이용하여 UF/DF에 의해 농축되었다. 최종 정용여과 단계는 버퍼 D (20 mM Hepes, 90 mM NaCl, pH 7.4)에 대해 수행되었다. 제제는 변형의 정도를 결정하기 위해 총 PSA (레조르시놀 검정) 및 총 아미노옥시 기 (TNBS 검정) 측정을 분석적으로 특징으로 하였다. 더욱이 다분산도 뿐만 아니라 자유 3-옥사-펜탄-1,5-디옥시아민은 결정되었다.

실시예 8

친핵성 촉매 m-톨루이딘의 존재하에 환원 단계 없이 아미노옥시-PSA의 제조

Serum Institute of India (Pune, India)로부터 수득된 573 mg의 산화된 PSA (MW = 20 kD)는 9 mL 50 mM 포스페이트 버퍼 pH 6.0 (버퍼 A)에 용해되었다. 그 다음 94 mg 3-옥사-펜탄-1,5-디옥시아민은 상기 용액에 제공된다. 후속적으로 2.3 mL의 50 mM m-톨루이딘 모액은 상기 반응 혼합물에 첨가된다. 2시간 동안 RT에서 진탕후 혼합물은 그 다음 하기를 사용하는 약 음이온 교환 크로마토그래피 단계에 적용된다: Fractogel EMD DEAE 650-M 크로마토그래피 겔 (칼럼 치수: XK16/105). 반응 혼합물은 50 mL 버퍼 A로 희석되고 1 cm/min의 유량에서 버퍼 A로 사전-평형화된 DEAE 칼럼상에 장입된다. 그 다음 칼럼은 20CV 버퍼 B (20 mM Hepes, pH 6.0)으로 세정되어 자유 3-옥사-펜탄-1,5-디옥시아민 및 시아나이드를 2 cm/min의 유량에서 제거하였다. 아미노옥시-PSA 시약은 67 % 버퍼 B 및 43 % 버퍼 C (20 mM Hepes, 1 M NaCl, pH 7.5)로 구성되는 단계 구배로 용출된다. 용출액은 폴리에테르 설폰 (50 cm², Millipore)로 만들어진 5 kD 막을 이용하여 UF/DF에 의해 농축된다. 최종 정용여과 단계는 버퍼 D (20 mM Hepes, 90 mM NaCl, pH 7.4)에 대해 수행된다. 제제는 변형의 정도를 결정하기 위해 총 PSA (레조르시놀 검정) 및 총 아미노옥시 기 (TNBS 검정) 측정을 분석적으로 특징으로 한다. 더욱이 다분산도 뿐만 아니라 자유 3-옥사-펜탄-1,5-디옥시아민은 결정된다.

실시예 9

아미노옥시-PSA 시약의 제조

아미노옥시 - PSA 시약은 실시예 4 - 8에 따라 제조되었다. 정용여과후, 생성물은 -80°C에서 냉동되었고 동결건조되었다. 동결건조후 시약은 적절한 용적의 물에 용해되었고 탄수화물 변형을 통해 PSA-단백질 콘주게이트의 제조에 사용되었다.

실시예 10

친핵성 촉매로서 아미노옥시-PSA 및 m-톨루이딘을 이용하는 rFVIII의 폴리시알릴화

방법 1:

50 mg rFVIII은 반응 버퍼 (50 mM Hepes, 350 mM 염화나트륨, 5 mM 염화칼슘, pH 6.0) 속에 전달되고 희석되어 1 mg/mL의 단백질 농도를 수득하였다. 상기 용액에, NaIO₄는 첨가되어 200 μM의 최종 농도를 제공하였다. 산화는 부드러운 진탕하에 암실에서 30분 동안 RT에서 실시되었다. 그 다음 반응은 하기로 켄칭되었다: 시스테인 (최종 농도: 10 mM) 60 min 동안 RT에서. 용액은 버퍼 A (20 mM Hepes, 5 mM CaCl_2, pH 7.0)으로 평형화된 20 mL (Merck EMD TMAE (M))의 용적을 가진 IEX 칼럼에 적용되었다. 칼럼은 5 CV 버퍼 A로 평형화되었다. 그 다음 산화된 rFVIII은 버퍼 B (20 mM Hepes, 5 mM CaCl_2, 1M NaCl, pH 7.0)으로 용출되었다. rFVIII 함유 분획은 수집되었다. 단백질 함량은 결정되었고 (Coomassie, Bradford) 반응 버퍼로 1 mg/mL로 조정되었고 0.5 M HCl의 적가에 의해 pH 6.0으로 조정되었다. 그 다음 (상기 기재된) 20 kD의 MW를 가진 50-배 몰 과잉의 아미노옥시-PSA 시약은 하기로서 m-톨루이딘에 이어서 첨가되었다: 친핵성 촉매 (최종 농도: 10 mM). 커플링 반응은 실온에서 부드러운 진탕하에 암실에서 2시간 동안 수행되었다. 과잉의 아미노옥시-PSA 시약은 HIC에 의해 제거되었다. 반응 혼합물의 전도도는 암모늄 아세테이트 (50 mM Hepes, 350 mM 염화나트륨, 5 mM 염화칼슘, 8 M 암모늄 아세테이트, pH 6.9)를 함유하는 버퍼 첨가에 의해 130 mS/cm로 상승되었고 50 mM Hepes, 2.5 M 암모늄 아세테이트, 350 mM 염화나트륨, 5 mM 염화칼슘, pH 6.9로 사전-평형화된 80 mL 페닐 세파로오스 FF (GE Healthcare, Fairfield, CT)로 채워진 칼럼상에 장입되었다. 후속적으로, 콘주게이트는 5 mM CaCl₂를 함유하는 50 mM Hepes 버퍼 pH 7.5로 용출되었다. 마지막으로, PSA-rFVIII 함유 분획은 수집되었고 재생된 셀룰로오스 (88cm², Millipore)로 만들어진 30 kD 막의 이용에 의해 UF/DF에 적용되었다. 제제는 총 단백질 (Coomassie, Bradford) 및 FVIII 발색 활성 측정을 분석적으로 특징으로 하였다. PSA-rFVIII 콘주게이트는 원상태 rFVIII과 비교로 > 70%의 비활성이 결정된 것을 보여주었다.

방법 2:

Hepes 버퍼 (50 mM HEPES, ~350 mM 염화나트륨, 5 mM 염화칼슘, 0.1 % 폴리소르베이트 80, pH 7.4)내 58 mg의 재조합 인자 VIII (rFVIII)은 반응 버퍼 (50 mM Hepes, 350 mM 염화나트륨, 5 mM 염화칼슘, pH 6.0)에 용해되어 1.0 +/- 0.25 mg/mL의 최종 단백질 농도를 얻는다. 그 다음 용액의 pH는 0.5 N HCl 수용액의 적가에 의해 6.0으로 정정된다. 후속적으로, 40 mM 나트륨 퍼아이오데이트 수용액은 10 분 내에 첨가되어 200 μM의 농도를 제공한다. 산화 반응은 30 +/- 5 min 동안 T= +22 +/- 2 ℃의 온도 (T)에서 수행된다. 그 다음 반응은 T= +22 +/- 2 ℃에서 15 분 내에 L-시스테인 수용액 (1 M)의 첨가에 의해 중단되어 반응 혼합물 및 60 +/- 5 min 동안 인큐베이션에서 10 mM의 최종 농도를 제공한다.

산화된 rFVIII은 EMD TMAE (M) (Merck)상에서 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제된다. 혼합물은 버퍼 A (20 mM Hepes, 5 mM CaCl₂, pH 6.5)로 희석되어 5 ms/cm의 전도도를 제공한다. 상기 용액은 하기상에 장입된다: IEX 칼럼 (층 높이: 5.4 cm) (1.5 cm/min의 유량을 이용하는 10 mL의 칼럼 용적을 가짐). 상기 칼럼은 후속적으로 세정된다: (유량: 1.5 cm/min) (버퍼 A 및 버퍼 B (20 mM Hepes, 5 mM CaCl₂, 1.0 M NaCl, pH 7.0)의 92:8 혼합물 (w/w)의 5 CV로). 그 다음 산화된 rFVIII은 버퍼 A 및 버퍼 B의 50:50 (w/w) 혼합물로 용출되고 버퍼 B의 5 CV로 사후 용출 단계로 이어진다. 용출 단계는 1.0 cm/min의 유량의 이용에 의해 수행된다.

후속적으로, 아미노옥시-폴리시알산 (PSA-ONH₂) 시약은 부드러운 교반 하에 15 분의 최대 기간 (t)내에 정제된 산화된 rFVIII을 함유하는 용출액에 50-배 몰 과잉으로 첨가된다. 그 다음 m-톨루이딘 수용액 (50 mM)은 15 분 내에 첨가되어 10 mM의 최종 농도를 얻는다. 반응 혼합물은 부드러운 진탕하에 T= +22 +/- 2 ℃의 온도 (T)에서 암실에서 120 +/- 10 min. 동안 인큐베이션된다.

수득된 PSA-rFVIII 콘주게이트는 15 cm의 층 높이 (h) 및 81 mL의 수득한 칼럼 용적 (CV)를 가진 GE Healthcare에 의해 제조된 칼럼 속에 패킹된 페닐 세파로오스 FF 저 서브 레진 (GE Healthcare)를 이용하여 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)에 의해 정제된다.

반응 혼합물은, 350 mM 염화나트륨, 8 M 암모늄 아세테이트, 5 mM 염화칼슘, pH 6.9를 함유하는, 50 mM Hepes 버퍼 첨가에 의해 암모늄 아세테이트로 스파이킹된다. 2 용적의 반응 혼합물은 1 용적의 암모늄 아세테이트 함유 버퍼 시스템과 혼합되고 pH 값은 0.5 N NaOH 수용액의 적가에 의해 pH 6.9로 정정된다. 상기 혼합물은 1 cm/min의 유량에서 HIC 칼럼상에 장입되고 > 3 CV 평형 버퍼 (50 mM Hepes, 350 mM 염화나트륨, 2.5 M 암모늄 아세테이트, 5 mM 염화칼슘, pH 6.9)를 이용하여 세정 단계로 이어진다.

반응 부산물 및 항-무질서유발 염의 제거를 위하여 제2 세정 단계는 2 cm/min의 유량에서 상향류 방식으로 > 5 CV 세정 버퍼 1 (50 mM Hepes, 3 M 염화나트륨, 5 mM 염화칼슘, pH 6.9)로 수행된다. 그 다음 정제된 PSA-rFVIII 콘주게이트의 용출은 1 cm/min의 유량에서 40 % 세정 버퍼 2 (50 mM Hepes, 1.5 M 염화나트륨, 5 mM 염화칼슘, pH 6.9) 및 60 % 용출 버퍼 (20 mM Hepes, 5 mM 염화칼슘, pH 7.5)의 단계 구배를 이용하여는 하향류 방식으로 수행된다. PSA-rFVIII 콘주게이트의 용출은 UV 280 nm에서 모니터링되고 콘주게이트를 함유하는 용출액은 < 4 CV 내에 수집된다. 사후 용출 단계는 주요 생성물로부터 별개의 소수 및/또는 비 변형된 rFVIII에 동일한 조건 하에 > 3 CV 용출 버퍼로 수행된다.

마지막으로 정제된 콘주게이트는 분자량 컷오프 30kD (88cm², Millipore)를 가진 재생된 셀룰로오스로 만들어진 막을 이용하여 한외여과/정용여과 (UF/DF)에 의해 농축된다.

상기 절차의 이용에 의해 제조된 콘주게이트는 총 단백질 측정, FVIII 발색 활성 및 PSA 함량 (레조르시놀 검정) 측정에 의한 폴리시알화도의 결정을 분석적으로 특징으로 한다. 수득된 콘주게이트에 대하여 비활성 > 50% 및 PSA 도 > 5.0은 계산된다.

방법 3:

50 mg rFVIII은 반응 버퍼 (50 mM Hepes, 350 mM 염화나트륨, 5 mM 염화칼슘, pH 6.0) 속에 전달되고 희석되어 1 mg/mL의 단백질 농도를 수득하였다. (상기 기재된) 20 kD의 MW를 가진 50-배 몰 과잉의 아미노옥시-PSA 시약은 하기로서 m-톨루이딘에 이어서 첨가되었다: 친핵성 촉매 (최종 농도: 10 mM) 및 NaIO₄ (최종 농도: 400 μM). 커플링 반응은 실온에서 부드러운 진탕하에 암실에서 2시간 동안 수행되었다. 후속적으로, 반응은 60 min 동안 RT에서 시스테인으로 켄칭되었다 (최종 농도: 10 mM). 그 다음 반응 혼합물의 전도도는 암모늄 아세테이트 (50 mM Hepes, 350 mM 염화나트륨, 5 mM 염화칼슘, 8 M 암모늄 아세테이트, pH 6.9)를 함유하는 버퍼 첨가에 의해 130 mS/cm로 상승되었고 50 mM Hepes, 2.5 M 암모늄 아세테이트, 350 mM 염화나트륨, 5 mM 염화칼슘, 0.01 % Tween 80, pH 6.9로 사전-평형화된 80 mL 페닐 세파로오스 FF (GE Healthcare, Fairfield, CT)로 채워진 칼럼상에 장입되었다. 후속적으로, 콘주게이트는 50 mM Hepes, 5 mM 염화칼슘, pH 7.5로 용출되었다. 마지막으로, PSA-rFVIII 함유 분획은 수집되었고 재생된 셀룰로오스 (88cm², Millipore)로 만들어진 30 kD 막의 이용에 의해 UF/DF에 적용되었다. 제제는 총 단백질 (Bradford) 및 FVIII 발색 활성 측정을 분석적으로 특징으로 하였다. PSA-rFVIII 콘주게이트에 대하여 원상태 rFVIII에 비교로 ≥ 70%의 비활성은 결정되었다.

방법 4:

50 mM Hepes 버퍼 (50 mM HEPES, ~350 mM 염화나트륨, 5 mM 염화칼슘, 0.1 % 폴리소르베이트 80, pH 7.4)내 50 mg 재조합 인자 VIII (rFVIII)은 반응 버퍼 (50 mM Hepes, 350 mM 염화나트륨, 5 mM 염화칼슘, pH 6.0)에 용해되어 1.0 +/- 0.25 mg/mL의 최종 단백질 농도를 얻었다. 그 다음 용액의 pH는 0.5 N HCl 수용액의 적가에 의해 6.0으로 정정되었다.

후속적으로, 아미노옥시-폴리시알산 (PSA-ONH₂) 시약은 부드러운 교반하에 15 분의 최대 기간 (t)내에 상기 rFVIII 용액에 50-배 몰 과잉으로 첨가되었다. 그 다음 m-톨루이딘 수용액 (50 mM)은 15 분 내에 첨가되어 10 mM의 최종 농도를 얻었다. 마지막으로, 40 mM 나트륨 퍼아이오데이트 수용액은 첨가되어 400 μM의 농도를 제공하였다.

반응 혼합물은 부드러운 진탕하에 T= +22 +/- 2 ℃의 온도 (T)에서 암실에서 120 +/- 10 min. 동안 인큐베이션되었다. 그 다음 반응은 L-시스테인 수용액 (1 M)의 첨가에 의해 중단되어 반응 혼합물 및 60 +/- 5 min 동안 인큐베이션에서 10 mM의 최종 농도를 제공하였다.

수득된 PSA-rFVIII 콘주게이트는 15 cm의 층 높이 (h) 및 81 mL의 수득한 칼럼 용적 (CV)를 가진 GE Healthcare에 의해 제조된 칼럼 속에 패킹된 페닐 세파로오스 FF 저 서브 레진 (GE Healthcare)를 이용하는 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)에 의해 정제되었다.

반응 혼합물은, 350 mM 염화나트륨, 8 M 암모늄 아세테이트, 5 mM 염화칼슘, pH 6.9를 함유하는, 50 mM Hepes 버퍼의 첨가에 의해 암모늄 아세테이트로 스파이킹되었다. 2 용적의 반응 혼합물은 1 용적의 암모늄 아세테이트 함유 버퍼 시스템과 혼합되었고 pH 값은 0.5 N NaOH 수용액의 적가에 의해 pH 6.9로 정정되었다. 상기 혼합물은 1 cm/min의 유량을 이용하여 HIC 칼럼상에 장입되었고 > 3 CV 평형 버퍼 (50 mM Hepes, 350 mM 염화나트륨, 2.5 M 암모늄 아세테이트, 5 mM 염화칼슘, pH 6.9)를 이용하여 세정 단계로 이어졌다.

반응 부산물 및 항-무질서유발 염의 제거를 위하여 제2 세정 단계는 2 cm/min의 유량에서 상향류 방식으로 > 5CV 세정 버퍼 1 (50 mM Hepes, 3 M 염화나트륨, 5 mM 염화칼슘, pH 6.9)로 수행되었다. 그 다음 정제된 rFVIII 콘주게이트의 용출은 1 cm/min의 유량에서 40 % 세정 버퍼 2 (50 mM Hepes, 1.5 M 염화나트륨, 5 mM 염화칼슘, pH 6.9) 및 60 % 용출 버퍼 (20 mM Hepes, 5 mM 염화칼슘, pH 7.5)의 단계 구배를 이용하여 하향류 방식으로 수행되었다. PSA-rFVIII 콘주게이트의 용출은 UV 280 nm에서 모니터링되었고 콘주게이트를 함유하는 용출액은 < 4 CV 내에 수집되었다. 사후 용출 단계는 주요 생성물로부터 별개의 소수 및/또는 비 변형된 rFVIII에 동일한 조건 하에 > 3 CV 용출 버퍼로 수행되었다.

마지막으로, 정제된 콘주게이트는 분자량 컷오프 30kD (88cm², Millipore)를 가진 재생된 셀룰로오스로 만들어진 막을 이용하여 한외여과/정용여과 (UF/DF)에 의해 농축되었다.

상기 절차의 이용에 의해 제조된 콘주게이트는 총 단백질 측정, FVIII 발색 활성 및 PSA 함량 (레조르시놀 검정) 측정에 의한 폴리시알화도의 결정을 분석적으로 특징으로 하였다.

분석적 데이터 (6 연속 배치의 평균):

공정 수율 (Bradford): 58.9%

공정 수율 (FVIII chrom.): 46.4%

비활성:(FVIII chrom./ mg 단백질): 4148 IU/mg

비활성 (출발 물질의 %): 79.9 %

PSA 도 (mol/mol): 8.1

실시예 11

원상태 PSA에 디아모노옥시 링커의 커플링

상기 실시예는, 치료 단백질의 화학적 변형에 사용될 수 있는, 원상태 PSA를 사용하는 (즉 선행 산화 없이) 아미노옥시-PSA 시약을 제조하는 절차를 기재한다.

a) 주위 온도에서 커플링

Serum Institute of India (Pune, India)로부터 수득된 52.2 mg의 원상태 PSA (MW = 20 kD)는 1.05 mL 50mM 포스페이트 버퍼 pH 6.0에 용해되었다. 그 다음 10.3 mg 3-옥사-펜탄-1,5-디옥시아민 (링커 분자)는 반응 혼합물에 적가되었다. 반응은 암실에서 부드러운 교반하에 실온에서 2시간 동안 인큐베이션되었다.

b) 상승 온도에서 커플링

Serum Institute of India (Pune, India)로부터 수득된 52.2 mg의 원상태 PSA (MW = 20 kD)는 1.05 mL 50mM 포스페이트 버퍼 pH 6.0에 용해되었다. 그 다음 10.3 mg 3-옥사-펜탄-1,5-디옥시아민 (링커 분자)는 반응 혼합물에 적가되었다. 반응은 암실에서 부드러운 교반하에 실온에서 2시간 동안 인큐베이션되었다. 그 다음 온도는 32-37 ℃로 증가되었고 반응 혼합물은 또 다른 14 h 동안 인큐베이션되었다.

c) 상승 온도 및 증가된 링커 과잉에서 커플링

Serum Institute of India (Pune, India)로부터 수득된 52.2 mg의 원상태 PSA (MW = 20 kD)는 1.05 mL 50 mM 포스페이트 버퍼 pH 6.0에 용해되었다. 그 다음 10.3 mg 3-옥사-펜탄-1,5-디옥시아민 (링커 분자)는 반응 혼합물에 적가되었다. 반응은 암실에서 부드러운 교반하에 실온에서 2시간 동안 인큐베이션되었다. 그 다음 26.3 mg 3-옥사-펜탄-1,5-디옥시아민은 반응에 적가되었고, 온도는 32-37 ℃로 증가되었고 반응 혼합물은 또 다른 14 h 동안 인큐베이션되었다.

d) PSA 유도체의 정제

인큐베이션이 완료된 후, 지점 a-c 하에 생성된 반응 혼합물은 광범위한 투석에 의해 정제되었다. 따라서 반응 혼합물의 샘플은 Slide-A-Lyzer 투석 카셋트 (0-5-3 mL, MWCO 3.5kD, reg. 셀룰로오스, Pierce) 속에 장입되었고 다음과 같은 패턴에 따라 10 mM 포스페이트 버퍼 pH 8.0에 대해 투석되었다:

실온에서 500 mL 버퍼에 대해 2 h

4 ℃에서 500 mL 버퍼에 대해 12 h

초기 샘플 용적으로 농도에 대하여 실온에서 50 mL ‘투석용 Slide-A-Lyzer 농축 용액’에 대해 1h

정제된 아미노옥시-PSA는 따라서, 예를 들어, 상기 실시예 11, 12, 14, 및 17-31에 따라 단백질 콘주게이션 반응에서 사용될 준비가 된다. 마찬가지로, 본 명세서에서 기재된 임의의 수용성 폴리머는 상기 실시예에서 기재된 바와 같이 아미노옥시 링커에 커플링될 수 있고 그 다음 상기 실시예에서 설명된 바와 같이 단백질에 콘주게이션될 수 있다.

제제는 변형의 정도를 결정하기 위해 총 PSA (레조르시놀 검정) 및 총 아미노옥시 기 (TNBS 검정) 측정을 분석적으로 특징으로 하였다. 제제 (a)에 대하여 0.35의 변형도 (MD), (b)에 대하여 MD=0.54 및 (c)에 대하여 MD = 0.58은 결정되었다. 더욱이 다분산도 뿐만 아니라 자유 3-옥사-펜탄-1,5-디옥시아민은 측정되었다. 다분산도는 전체 제제에 대하여 1.15 미만이었고 자유 링커의 함량은 PSA 농도의 0.15 mol % 미만이었다.

환원 단부에서 변형된 PSA에 대하여 다음과 같은 구조는 ¹³C NMR 분광법에 의해 결정되었다.

실시예 12

크로마토그래피 정제 단계를 사용하여 4 ℃에서 아미노옥시-PSA의 제조

실온에서 제조된 아미노옥시-PSA 시약의 상세한 분석적 특성규명 동안, NMR 연구 (참조, 예를 들면, 미국 가출원 번호61/647,814, 참고로 그 전체가 편입됨)는 디아미노옥시 링커로 산화된 PSA의 유도체화가 2개의 구별되는 반응으로 구성되는 것을 드러냈다: PSA의 비-환원 단부에서 알데하이드 기의 신속 반응 및 PSA의 환원 단부에서 (헤미케탈의 형태로) 알데하이드 기의 저속 반응.후자 반응은 시약 생산 동안 피해야 되는 원치않는 부 반응으로 고려될 수 있다.

따라서, 아미노옥시-PSA 시약의 제조 방법은 본 실시예에서 기재된 바와 같이 최적화되어 왔다. 환원 단부는 공정이 실온에서 수행되면 상당한 정도로 단지 발생한다. 그러므로, 공정은 조정되었고 2-8 ℃에서 수행된다. 2-8 ℃에서 전체의 공정 (IEX에 의한 PSA 시약의 화학적 반응 및 정제) 수행에 의해, PSA의 환원 단부에서 부 반응은 실질적으로 감소되었다. 상기 공정 변화는 따라서 더 높은 품질의 시약으로 이어진다.

절차

Serum Institute of India (Pune, India)로부터 수득된 1290 mg의 산화된 PSA (MW = 20 kD)는 25 mL 50 mM 포스페이트 버퍼 pH 6.0 (버퍼 A)에 용해되었다. 그 다음 209 mg 3-옥사-펜탄-1,5-디옥시아민은 반응 혼합물에 첨가되었고 암실에서 부드러운 교반하에 2-8 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션되었다.

인큐베이션후, 혼합물은 하기를 사용하여 약 음이온 교환 크로마토그래피 단계에 적용되었다: Fractogel EMD DEAE 650-M 크로마토그래피 겔 (칼럼 치수: XK26/135) (2-8 ℃의 온도에 냉장실에서 수행됨). 반응 혼합물은 사전-냉각된 버퍼 A (110 mL)로 희석되었고 1 cm/min의 유량에서 버퍼 A로 사전-평형화된 DEAE 칼럼상에 장입되었다. 그 다음 칼럼은 2 cm/min의 유량에서 20 CV 버퍼 B (20 mM Hepes, pH 6.0)으로 세정되어 자유 3-옥사-펜탄-1,5-디옥시아민을 제거하였다. 아미노옥시-PSA 시약은 그 다음 67% 버퍼 B 및 43% 버퍼 C (20 mM Hepes, 1M NaCl, pH 7.5)로 구성되는 단계 구배로 용출되었다. 용출액은 폴리에테르 설폰 (50 cm2, Millipore)로 만들어진 5 kD 막을 이용하여 UF/DF에 의해 농축되었다. 제제는 변형의 정도를 결정하기 위해 총 PSA (레조르시놀 검정) 및 총 아미노옥시 기 (TNBS 검정) 측정을 분석적으로 특징으로 하였다. 최종 제제에서 PSA 농도는 46.0 mg/mL이었고 변형도는 83.5 %이었다. 더욱이, 1.131의 다분산도 값은 결정되었다. 게다가 0.22 μg/mL의 농도 (PSA의 0.07 mol %)는 자유 3-옥사-펜탄-1,5-디옥시아민에 대하여 측정되었다.

정제된 아미노옥시-PSA는 따라서, 상기 실시예 11, 12, 14, 및 17-31에 따라 콘주게이션 반응에서 사용될 준비가 된다.

실시예 13

폴리시알릴화된 rFVIII (대규모)의 합성

rFVIII은 소수의 변형으로 실시예 9에서 설명된 바와 같은 방법에 따라 대규모로 폴리시알릴화되었다. 이러한 목적을 위해, 1.5 g rFVIII은 Hepes 버퍼 (50 mM Hepes, 350 mM 염화나트륨, 5 mM 염화칼슘, pH 6.0)에서 기재된 바와 같이 폴리시알릴화되었다 (단백질 농도: 1.1 mg/mL / 형광 검정에 의해 결정됨). 그 다음 생성물은 페닐 세파로오스 FF 저 서브 레진 (GE Healthcare)를 이용하여 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 그 다음 용출액은 30kD의 분자량 컷오프를 가진 재생된 셀룰로오스로 만들어진 막을 이용하여 한외여과/정용여과 (UF/DF)에 의해 농축되었다. 그 다음 농축물은 크기 배제 크로마토그래피 칼럼 (Superose 6 prep 등급 / GE Healthcare)에 적용되었다. 상기 절차는 생성물로부터 잠재적인 불순물을 분리시키기 위해 최종 폴리싱 단계로서 사용된다. 마지막으로, 정제된 콘주게이트 (“PSA-rFVIII”)은 UF/DF (재생된 셀룰로오스 / 분자량 컷오프 30kD)에 의해 재차 농축되었다. 상기 방법을 이용하여 BDS는 임상 I 기 연구에 사용된 물질을 제조하기 위한 GMP 조건하에 제조되었다: 로트 D, 로트 E, 및 로트 F.

실시예 14

표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 의한 VWF-FVIII 결합 친화도의 결정

VWF-FVIII 결합 친화도는 아래와 같이 Biacore 기기 (GE Healthcare, Uppsala, Sweden)을 이용하여 분석되었다.

혈장-유래된 VWF (pdVWF, Diagnostica Stago, Asnieres sur Seine, France)는 CM5 바이오센서 칩의 유동 세포상의 3개 밀도에서 고정되었다. 조사의 FVIII 샘플은 작동하는 버퍼 (10 mM Hepes, 150 mM NaCl, 0.05 % 계면활성제 P20, pH 7.4)를 가진 일련의 5 희석 (주어진 단백질 값에 따른 0.18 내지 5 nM FVIII)로 희석되었고, 그 다음 50 μL/min의 일정한 유량을 가진 "단일 사이클" 방식을 이용하여 칩에 적용되었다. 회합용 시간은 4 min이었고 해리용 시간은 10 min이었다. 각각의 사이클후, FVIII은 칩 ("재생")으로부터 제거되었고 실험은 신규한 FVIII 샘플로 반복되었다. 회합 및 해리 상수는 ‘생물평가’ 프로그램의 랑뮤어 모델을 이용하여 결정되었다. 다음과 같은 동력학 파라미터는 결정되었다: 결합 속도 상수 ka, 해리 속도 상수 kd 및 평형 해리 상수 KD. 결합은, 포화에서 계산된 최대 결합인, Rmax 평가에 의해 또한 결정되었다. 동력학 결과는 3개의 상이한 VWF 고정화 수준의 평균으로부터 계산되었다.

Biacore 기술은 VWF와 FVIII 사이 착물 형성의 동력학을 결정하는데 사용되었다. 이러한 목적을 위해, 혈장-유래된 VWF는 상기, 실시예 13에서 기재된 버퍼 속에 재완충된 rFVIII (“재완충된 FVIII”) 및 조사의 PSA-rFVIII 및 센서 칩 표면에서 3개의 상이한 수준으로 고정되었다. 샘플은 단일 사이클 방식으로 5개의 상이한 농도에서 주사되었다. 회합 및 해리 상수는, Biacore T200 설비의 "생물평가" 프로그램의 랑뮤어 모델을 이용하는, 고정된 VWF와 FVIII 사이 균질한 1:1 상호작용을 추정하여, 결정되었다.

표 1은 VWF-FVIII 상호작용을 기재하는 동력학 파라미터를 요약하고, 여기에서 ka는 결합 속도 상수이고, kd는 해리 속도 상수이고 KD는 평형 해리 상수 (=kd/ka)이다. 추가 평가 및 데이터 비교를 위하여, 다양한 샘플 그룹의 평균 및 3 SD는 KD에 대하여 계산되었다.

상호작용 동력학은 전임상 BDS 배치 (평균 KD 0.28 nM)와 임상 1 기 BDS 배치 (평균 KD 0.28 nM) 사이, 그리고 전임상 FDP 배치 (평균 KD 0.31 nM)와 임상 1 기 FDP 로트 (KD 0.37 nM) 사이 유사하였다. 재완충된 rFVIII에 대하여, KD 값은 0.26 내지 0.37 nM 범위이었고 따라서 PSA-rFVIII에 비교할만한 하였다.

도 1은, 센서-칩-고정된 VWF의 3 상이한 밀도에서 PSA-rFVIII 그룹 및 재완충된 rFVIII에 대하여, 포화에서 계산된 최대 결합인, Rmax로서 표현된 결합 신호를 보여준다. 양쪽 PSA-rFVIII 및 재완충된 rFVIII은 PSA-rFVIII 전임상과 임상 기 BDS 및 FDP 배치 사이 관련된 차이가 없는 VWF 농도-의존적 상호작용을 보여주었다. 재완충된 rFVIII과 비교하여, PSA-rFVIII의 결합은 대략 50%만큼 현저하게 감소되었다. 이것은, VWF용 특이적 결합 에피토프가 PSA에 의해 보호되는 경우 rFVIII 콘주게이트를 산출하는, rFVIII의 PSA 변형의 결과인 것으로 고려되었다.

흥미롭게도 그리고 재완충된 rFVIII에 비교된 PSA-rFVIII로 관측된 상기 결합 특성과 달리, PEG-rFVIII (페길화된 rFVIII 단백질)은 또한 VWF에 감소된 결합을 보여주었고 PSA-rFVIII만큼 확연하지 않았다.

실시예 15

표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 의한 FVIII-LRP1 수용체 상호작용의 결정

LRP1 (α2-매크로글로불린 수용체/ CD91) 수용체 (BioMac, Leipzig, Germany)는 제조자의 지침에 따라 일정한 수준으로 Biacore 기기 (GE Healthcare, Uppsala, Sweden)의 CM4 센서 칩의 유동 세포 상에 고정되었다. 조사된 FVIII 샘플의 일련의 희석 (21 내지 357 nM, 주어진 단백질 값에 따름)은 그 다음, FVIII의 회합에 대하여 10 min 및 해리에 대하여 5 min을 허용하는, "kinject" 방식을 이용하는 칩에 적용되었다. 각각의 사이클후, FVIII은 칩 ("재생")으로부터 제거되었고 실험은 신규한 FVIII 샘플로 반복되었다. 회합 및 해리 상수는, 균질한 1:1 상호작용을 추정하는, ‘생물평가’ 프로그램의 랑뮤어 모델을 이용하여 결정되었다. 다음과 같은 동력학 파라미터는 결정되었다: 결합 속도 상수 ka, 해리 속도 상수 kd 및 평형 해리 상수 KD. 결합은 회합 기 후 신호 (반응 단위) 결정에 의해 또한 평가되었다. 동력학 결과는 3 상이한 유동 세포의 평균으로부터 계산되었다.

청소능 수용체 LRP1에 PSA-rFVIII의 결합 친화도는 상기 기재된 바와 같이 Biacore 기술을 이용하여 결정되었다. 결합은, (21 내지 357 nM에 상응하는) 10 내지 100 μg/mL 희석된, 샘플의 희석 시리즈에서 시험되었다. 분석은 따라서 PSA-rFVIII BDS 배치 및 재완충된 rFVIII에 대하여 가능하였지만, 이들 샘플의 낮은 단백질 농도로 인해 FDP 로트에 대해서는 아니었다. 다음과 같은 파라미터는 결정되었다: Ka는 결합 속도 상수이고, kd는 해리 속도 상수이고 KD는 평형 해리 상수 (=kd/ka)이다. 추가 평가 및 데이터 비교를 위하여, 다양한 샘플 그룹의 평균 및 3 SD는 KD에 대하여 계산되었다.

표 2는 PSA-rFVIII 전임상과 임상 1 기 BDS 사이 상호작용 및 LRP1 수용체를 가진 재완충된 rFVIII의 동력학 파라미터를 요약한다. 상호작용 동력학은 전임상 (평균 KD)와 임상 1 기 BDS 배치 (평균 KD) 사이 유사하였다. 또한, 결합 동력학은 PSA-rFVIII과 재완충된 rFVIII 사이 유사하였다. 일반적으로 표면 플라즈몬 공명 검정의 더 높은 가변성 및 동력학 결합 파라미터의 평가로 인해, 몇 개의 샘플 사이 KD에서 변동은 생물학적으로 관련된 것으로 간주되지 않고 요약해서 PSA-rFVIII 전임상 및 임상 1 기 배치가 유사한 특성을 갖는다는 것을 확인하였다.

도 2는 PSA-rFVIII 대하여 그리고 재완충된 rFVIII에 대하여 LRP1에 FVIII 단백질-농도-의존적 결합에 대한 결과를 보여준다. FVIII 단백질 농도는, 반응 단위로서 표현된, 결합 신호에 대해 플롯팅되었다. 양쪽 PSA-rFVIII 및 재완충된 rFVIII은 PSA-rFVIII의 전임상 및 임상 1 기 BDS 배치 사이 관련된 차이가 없는 FVIII 농도-의존적 상호작용을 보여주었다. 재완충된 rFVIII에 비교하여, PSA-rFVIII의 결합은 현저하게 감소되었다. 이것은 LRP1에 대하여 특이적 결합 에피토프가 PSA에 의해 보호되는 경우 rFVIII 콘주게이트를 산출하는 rFVIII의 PSA 변형의 결과인 것으로 고려되었다.

흥미롭게도, rFVIII, PEG-rFVIII 및 PSA-rFVIII의 결합 활성 비교는 rFVIII이 LRP1에 강하게 결합하고, PEG-rFVIII이 LRP1과 잔류 회합을 표시하였고, PEG-rFVIII이 사실상 LRP1과 회합할 수 없었다는 것을 보여준다 (도 3)

실시예 16

FIXa-보조인자 활성의 결정

PSA-rFVIII의 테나제-복합체 내에 FVIII의 FIXa-보조인자 활성은 FIXa-보조인자 활성 검정을 이용하여 시험관내 평가되었다. 상기 검정은 FXa 생성의 동력학 특성에 상세한 통찰력을 제공한다. 샘플은 그것의 주어진 효력에 따라 FVIII 활성의 1.0 IU/mL로 희석되었고 트롬빈 활성화후 FXa 생성의 시간 경과는 측정되었다.

도 4는 트롬빈에 의한 FVIII의 활성화후 경시적으로 FXa 생성을 보여준다. 모든 PSA-rFVIII 및 재완충된 rFVIII 배치는, 배치 (도 4, 패널 A-D) 사이 단지 소수의 차이로, 시간-의존적 FXa 생성을 보여주었다. 그룹 평균 (도 4, 패널 E)의 비교는 PSA-rFVIII 전임상 및 임상 1 기 BDS 및 FDP 배치가 유사한 특성을 갖는다는 것을 확인하였다. FXa 생성 곡선에서 일부 차이는 재완충된 rFVIII과 PSA-rFVIII (도 4, 패널 E) 사이 관측되었고, 예를 들면 재완충된 rFVIII은 약간 더 낮은 최대 FXa 생성을 보여주었다.

정량적 기준으로 다양한 샘플 그룹 사이 비교가능성을 평가하기 위해, FX 활성화의 최대 속도는 곡선의 선형 일부의 경사 결정에 의해 계산되었다. 결과는 표 3에서 보여진다. 직접적인 비교를 위하여 전임상 BDS 또는 FDP 배치의 개별 배치와 산술 평균 사이 상대 차이 (표 4). 개별 임상 1 기 BDS 배치와 전임상 BDS 배치의 평균 사이 상대 차이는 ≤11%이었고, 이는 2 샘플 그룹의 비교가능성을 확인한다. 임상 1 기 PSA-rFVIII FDP와 전임상 FDP의 평균 사이 차이는 ≤11%이었고, 그것의 유사한 특징을 재차 입증하였다. 다양한 PSA-rFVIII 그룹과 재완충된 rFVIII의 평균 사이 상대 비교는 표 5에서 보여진다. 차이는 ≤6%이었고, 따라서 PSA-rFVIII 및 재완충된 rFVIII이 FXa 생성의 유사한 동력학 특성을 갖는다는 것을 입증하였다.

실시예 17

트롬빈 생성 검정 (TGA)

TGA는 A형 혈우병 환자내 상황을 닮은 환경에서 트롬빈 생성을 연구하는 특정 방법이다. <1%의 FVIII을 함유하는 인간 FVIII-결핍된 혈장은 PSA-rFVIII의 증가량 (0.01 내지 1 IU/mL, 그것의 주어진 효력에 기반됨)으로 보충되었다. 반응은 작은 혈관 벽 손상을 시뮬레이션하기 위해 혈장에 인지질 교질입자로 복합화된 소량의 재조합 인간 조직 인자 첨가에 의해 개시되었다.

트롬빈 생성은 곡선의 피크 트롬빈의 농도-의존적 증가 비교에 의해 평가되었다 (도 5). 양쪽 PSA-rFVIII 및 재완충된 rFVIII은 개별 배치 (도 5, 패널 A 내지 D) 사이 단지 최소 변동을 가진 피크 트롬빈에서 FVIII-농도-의존적 증가를 보여주었다. 그룹 평균 (도 5, 패널 E)의 비교는 PSA-rFVIII 전임상 및 임상 1 기 BDS 및 FDP 배치가 유사한 특성을 가졌다는 것을 확인하였다. 피크 트롬빈 생성에서 차이는 재완충된 rFVIII과 PSA-rFVIII (도 5, 패널 E) 사이 관측되었다.

더욱 철저한 평가를 위하여, 정량적 비교는 실시되었다. 표 6은 시험된 상이한 FVIII 농도에서 측정된 피크 트롬빈 값을 요약한다. 샘플은 각각의 것에 대하여 피크 트롬빈의 곡선하 면적 (AUC) 계산에 의해 비교적으로 분석되었다. 또한, 개별 PSA-rFVIII 임상 1 기 BDS/FDP 배치의 피크 트롬빈 값의 AUC 및 전임상 BDS/FDP 배치의 산술 평균에서 상대 차이는 계산되었다.

개별 임상 1 기 BDS 배치용 값과 전임상 BDS 배치용 평균 사이 상대 차이는 ≤9%이었고, 2 샘플 그룹 사이 비교가능성을 확인한다. 임상 1 기 FDP에 대하여, 전임상 FDP용 평균에 대한 차이는 ≤4%이었고, 고도로 유사한 특징을 재차 보여주었다.

피크 트롬빈 생성 곡선 (도 5)의 평가는 PSA-rFVIII보다 재완충된 rFVIII에 대하여 약간 더 높은 트롬빈 생성을 보여주었다. 몇 개의 PSA-rFVIII 그룹의 계산된 AUC 및 재완충된 rFVIII용 평균에서 상대 차이가 ≤14%이었기 때문에, 상기 결과는 소수의 관련성인 것으로 간주되었고 실제의 생리적 관련된 차이보다 고유한 검정 변동에 더욱 관련되었다.

트롬빈 생성은 총 트롬빈 생성 결정에 의해 추가로 평가되었다. 조사된 PSA-rFVIII 및 재완충된 rFVIII BDS의 모든 샘플은, 그룹 사이 최소 차이로, 총 트롬빈 생성에서 유사한 FVIII-농도 의존적 증가를 보여주었다 (도 6). 피크 트롬빈 생성과 비교하여, PSA-rFVIII 및 재완충된 rFVIII 사이 차이는 심지어 더 낮았다.

실시예 18

혈우병 마우스에서 PSA-rFVIII, PEG-rFVIII 및 rFVIII의 약동학의 비교

PSA-rFVIII, PEG-rFVIII 및 rFVIII의 약동학은 FVIII 넉아웃 마우스에서 측정되었다. 200 IU FVIII/kg 체중의 주사는 꼬리 정맥을 통해 주사되었다. 6 마우스의 그룹은 정의된 시점후 희생되었고 시트레이트화된 혈장은 제조된다. 혈장내 FVIII 활성은 발색 활성 검정으로 측정된다. 도 7 및 표 9에서 나타낸 바와 같이, 페길화된 및 폴리시알릴화된 rFVIII은 rFVIII에 비교된 개선된 PK 파라미터 (~2의 HL 증가)를 보여주었다. 유사한 결과는 랫트 (도 8)에서 그리고 마카크 (도 9)에서 관측되었다. (상이한 연구 사이 비교하기 위해, 데이터는 1 U/kg의 통상 용량으로 정규화되었다).

실시예 19

PSA-rFVIII 생체내 효능

PSA-rFVIII의 효능은 FVIII KO 마우스에서 테일-클립 출혈 모델에서 측정되었다. 200 IU FVIII 활성/kg의 적용은 PSA-rFVIII의 주사후 18 - 54 시간에서 꼬리 끝의 절개로 이어졌다. 혈액 손실은 측정되었고, 데이터는 PK 연구로부터 기대된 대로 PSA-rFVIII에 대하여 더 긴 효능을 확인하였다. PSA-rFVIII은 rFVIII만큼 대략 2배 출혈을 제어한다.

효능은 FVIII KO 마우스내 경동맥 폐색 모델에서 또한 측정되었다. 200 IU FVIII 활성/kg의 적용은 페리클로라이드를 가진 경동맥의 병변으로 이어졌다. 혈관 폐색까지 시간은 측정되었고, 상기 결과와 일치하는, 데이터는 PK 연구로부터 기대된 대로 PSA-rFVIII에 대하여 더 긴 효능을 확인하였다. FVIII KO 마우스내 rFVIII보다 PSA-rFVIII의 대략 2배 더 긴 생존은 관측되었다.

마지막으로, 혈우병 관절 출혈 (관절내 천자)의 쥣과 모델에서 PEG-rFVIIII 및 PSA-rFVIII의 효과는 평가되었다. 하기로 치료는: 변형된 rFVIII (즉PEG-rFVIII 및 PSA-rFVIII) 쥣과 모델에서 rFVIII에 대하여 적어도 2배만큼 오래 지속하는 것으로 나타났다.

Claims

FVIII 반감기를 증가시키고 폰빌레브란트 인자 (VWF) 및 저밀도 지단백질 (LDL)-수용체-관련 단백질 1 (LRP1)로 구성된 군으로부터 선택되는 리간드에 상기 변형된 FVIII의 결합을 감소시키는 변형을 포함하는, 변형된 인자 VIII (FVIII).
청구항 1에 있어서 상기 변형된 FVIII이 혈장-유래되는, 변형된 FVIII.
청구항 1에 있어서 상기 변형된 FVIII이 재조합인, 변형된 FVIII.
청구항 3에 있어서 상기 변형된 FVIII이 전장 FVIII이고 원상태 B 도메인을 포함하는, 변형된 FVIII.
청구항 1에 있어서 상기 FVIII이 미변형된 FVIII에 비교된 더 낮은 친화도 (KD)로 VWF 및 LRP1에 결합하는, 변형된 FVIII.
청구항 1에 있어서 상기 변형이 폴리시알산 (PSA)를 포함하는, 변형된 FVIII.
청구항 6에 있어서 상기 PSA가 대략 20 kDa로 구성된 군으로부터 선택되는 평균 분자 크기를 갖는, 변형된 FVIII.
청구항 6 또는 7에 있어서 상기 PSA가 낮은 다분산도를 갖는, 변형된 FVIII.
청구항 6 내지 8 중 어느 한 항에 있어서 상기 PSA가 아미노옥시 링커를 포함하는, 변형된 FVIII.
청구항 9에 있어서 상기 아미노옥시 링커가 상기 변형된 FVIII의 산화된 탄수화물에 부착되는, 변형된 FVIII.
청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 따른 상기 변형된 FVIII 및 약제학적으로 허용가능한 캐리어, 희석제, 염, 버퍼, 또는 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물.
청구항 6 내지 10 중 어느 한 항에 있어서 상기 반감기가 페길화된 FVIII보다 더 긴, 변형된 FVIII.
청구항 12에 있어서 상기 반감기가 대략 1, 2 또는 3-배의 인수만큼 더 긴, 변형된 FVIII.
청구항 6 내지 10 중 어느 한 항에 있어서 VWF 또는 LRP1에 상기 결합이 VWF 또는 LRP1에 페길화된 FVIII의 결합에 비교된 경우 더 낮은, 변형된 FVIII.
청구항 11에 있어서 VWF 또는 LRP1에 상기 결합이 VWF 또는 LRP1에 페길화된 FVIII의 결합에 비교된 경우 0.5의 인수만큼 더 낮은, 변형된 FVIII.
FVIII 반감기를 증가시키고 VWF 및 LRP1로 구성되는 군으로부터 선택되는 리간드에 상기 변형된 FVIII의 결합을 감소시키는 변형을 포함하는 변형된, 재조합 FVIII에 있어서, 상기 변형이 아미노옥시 링커를 가진 PSA를 포함하고, 상기 아미노옥시 링커가 상기 변형된 FVIII의 산화된 탄수화물에 부착되고;
상기 변형된, 재조합 FVIII의 상기 반감기가 미변형된, 재조합 FVIII 및/또는 페길화된, 재조합 FVIII보다 더 길고;
상기 변형된, 재조합 FVIII에 의해 VWF 또는 LRP1에 상기 결합이 미변형된, 재조합 FVIII 및/또는 페길화된, 재조합 FVIII에 의해 VWF 또는 LRP1의 결합에 비교된 경우 더 낮은, 변형된, 재조합 FVIII.
청구항 1 내지 10 및 12 내지 16 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 FVIII이 FVIII 결핍과 관련된 질환 또는 장애로 진단된 포유동물에 투여되는, 변형된 FVIII.
청구항 1 내지 10 및 12 내지 16 중 어느 한 항에 따른 상기 변형된 FVIII, 또는 청구항 11에 따른 상기 약제학적 조성물을 상기 포유동물(mamal)에 상기 출혈성 결함의 하나 이상의 증상을 감소 또는 제거하는데 효과적인 양으로 투여하는 상기 단계를 포함하는, 포유동물에서 출혈성 결함의 치료 방법.