JPH03503759A - ポリマーとコロニー刺激因子‐１との接合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は生物学的に活性なコロニー刺激因子−１（Ｃ５Ｆ−１）の化学修飾に関 し、この化学修飾はこの蛋白質の化学的及び／又は生理学的性質を変更するもの である。さらに詳しくは、本発明はポリマーへのＣ３Ｆ−１の選択的接合による 哺乳類での該蛋白質の循環半減期の増加に関する。

コロニー刺激因子−１（Ｃ５Ｆ−１）　（？’ｌ　−Ｃ５Ｆとしても知られてい る）は、半固体培地中にプレートされた骨髄細胞によるコロニーの形成を刺激す ることができる幾つかの蛋白質の内の１つである。Ｃ５Ｆ−１は、主としてマク ロファージコロニーの形成を刺激するその能力により他のコロニー刺激因子から 区別される。他のＣ３Ｆは、好中顆粒球とマクロファージ、もっばら好中顆粒球 、又は好中顆粒球及び好酸顆粒球並びにマクロファージ、から成るコロニーの生 産を刺激する。これらのＣ３Ｆの総説はＤｅｘｔｅｒ、　Ｔ、Ｍ、Ｎａｔｕｒｅ 　（１９８４）　３０９　：　７４６＋及びＶａｂａｓ、　Ｍ、八、Ｊ、Ｉｍｍ ｕｎｏｌ、　（１９８３）　１３０　：　７９３により発表されている。現在、 Ｃ５Ｆ−１活性に特異的であることが知られている日常的インビボ測定は存在し ない。

Ｃ３Ｆ−１は天然源から精製されている〔例えば、Ｃ５ｅｊｔｅｙ、１ら、Ｂｉ ｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、Ｒｅｓ、ｃｏｒａｒｓ、　（１９８６）　１３８ 　：　２３８　；及び部、１分的アミノ酸決定を可能にする天然Ｃ５Ｆ−１のイ ムノアフィニティークロマトグラフィーに関する１９８６年８月１４日に公開さ れたＰＣＴ公開Ｎａ罰８６１０４５８７を参照のこと〕。ＣＳＦ　−１はまた、 ２つの見かけ上関連しているｃＤＮＡクローン、すなわち（１）３２個のアミノ 酸のシグナル配列により先行される２２４個のアミノ酸のモノマー蛍白質をコー ドする「短い」形（Ｋａｗａｓａｋｉら、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８５）　２３ ０　：　２９２−２９６）　　；及び（２）やはり３２個のアミノ酸のシグナル 配列により先行される５２２個のアミノ酸のモノマー蛋白質をコードする「長い 」形を用いて組換ＤＮＡから製造されている。この長い形は、１９８８年６月２ ９日に公開されたヨーロッパ特許出願公開Ｎα０２７２７７９及びＬａｄｎｅｒ らＥＭＢＯＪ、　（１９８７）　６　：　２６９３　（それぞれ引用により本明 細書に組み入れる）；並びにｗｏｎｇら５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８７）　２３５ 　：１５０４−１５０９及び１９８７年１１月９日に公開されたＰＣＴ　ＮＯ８ ７１０６９５４に開示されているように、２つのグループによりクローニングさ れそして発現されている。（これらの２つのクローンのＤＮＡ及びアミノ酸配列 はそれぞれ第１図及び第２図に示される。）Ｃ５Ｆ−１の長い形及び短い形の両 者はＣ１ａｒｋ及びＫａＩＩＩｅｎ、　　５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８７）　２３ ６：１２２９　１２３７により記載されている。３２個のアミノ酸のシグナル配 列により先行される４０６個のアミノ酸のモノマー蛋白質をコードする「中間ｊ 形も最近報告されている（Ｃｅｒｒｅｔｔｉら（１９８８）　Ｍｏ１．Ｉｍｍｕ ｎｏｌ、　２５ニア６１−７７０　）。

ＣＳＦ　−１の長い形及び短い形をコードするＤＮＡは、ゲノム性Ｃ３Ｆ−１コ ードＤＮＡのエクソン６の上流部分の可変的スプライシング連結から生ずるらし い。Ｃ５Ｆ−１がある種の真核細胞において長いか又は短いｃＤＮＡ形から発現 される場合、このものはダイマー糖蛋白質として分泌され、そしてＣ−末端にお いて多様にプロセシングされ、そして／又は多様にグリコジル化されるようであ る。従って、還元されたモノマー形がウェスタン分析にかけられる時、種々の分 子量のＣ５Ｆ　−１蛋白質が見出される。

長い形及び短い形のアミノ酸配列は、単離されたクローンのＤＮＡ配列から及び それらとゲノム配列との関連性により予想されるように、シグナルペプチドの開 裂の後のＮ−末端における最初の１４９アミノ酸において同一であり、そしてそ の後、アミノ酸１５０をコードするコドンの前の追加の８９４ｂｐ断片（２９８ 個の追加のアミノ酸をコードする）の長いクローンにおける挿入の結果として異 る。従って、遺伝子の短い形及び長い形の両者は、Ｃ−末端及びＮ−末端におい て同一の配列の領域をコードする。成熟短形の最初の１４５又は１４７個のアミ ノ酸（１９８８年３月３０日に公開されたヨーロッパ特許出願公開に０２６１５ ９２　；　Ｃｅｒｒｅｔｔｉら、前掲）１、又は成熟長形の最少の１９０又は２ ２１アミノ酸、のみをコードする短縮されたｃＤＮＡが真核細胞中で発現される 場合、生物学的に活性な蛋白質が回収されている。

ｌ）生来のＮ−末端及び成熟蛋白質のアミノ酸１５０におけるＣ−末端、並びに ２）Ｎ−末端の最初のアミノ酸を除去するための短縮及び成熟蛋白質のアミノ酸 １５０におけるＣ−末端、を含む蛋白質をコードするように、最初Ｋａｗａｓａ ｋｉら、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８５）　２３０　：　２９１により記載された 短クローンｃＤＮＡを変更することにより、組換Ｃ３Ｆ−１が大腸菌で発現され た。

これらの蛋白質は精製されそしてホモダイマーを形成するように再生（ｒｅｆｏ ｌｄ）され、そしてサイズ排除高速液体クロマトグラフィーにおいてそれぞれ約 ４３，０００及び４０，０００の見かけ分子量を有することが見出された。発現 された蛋白質のＣ−末端がアミノ酸１５０又は１５８でありそしてＮ−末端の３ 個までのアミノ酸が除去されるよう―変形されたＣ５Ｆ−１蛋白質も調製されて いる。

小蛋白質（約７０ｋｄ未満）はしばしば、静脈内注射の後血中で比較的短い半減 期を有する。薬物の循環からの急速なりリアランスはしばしばその効力を低下せ しめる。所望の療法効果を維持しながらより少量のポリペプチド又はより低頻度 の注射が投与されるように循環ペプチドの半減期を延長することがしばしば望ま しい。その生体内半減期を変更し、その免疫原性を低下せしめ、又はそれが生体 内に導入された場合に生ずるかもしれない蛋白質の凝集減少もしくは除去するで あろうＣ５Ｆ−１蛋白質の修飾が望ましいであろう。この様な修飾には、実質的 に直鎖のポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）　、ポリプロピレ ングリコール（ＰＰＧ）　、デキストラン又はポリビニルアルコールによる修飾 が含まれる。

例えば、米国特許Ｎｏ、４．２６１　、９７３は、免疫原性アレルゲン分子と非 免疫原性水溶性ポリマー、例えばＰＥＧ又はポリビニルアルコールによる該アレ ルゲンの免疫原性を減少することを記載している。米国特許Ｎα４，３０１．１ ４４は、ヘモクロビンのＰＥＧ、　ＰＰＧ、エチレングリコールとプロピレング リコールとのコポリマー、又はこのようなポリマーのエーテル、エステルもしく は脱水生成物への接合による該ヘモグロビン分子の酸素運搬能力の増加を記載し ている。米国特許Ｎα４，６０９，５４６はペプチド又は糖蛋白質例えばコロニ ー刺激因子とポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーとの接合が 生理的活性の持続を増加させ得ることを記載している。この態様において試験さ れた蛋白質は、易水溶性の酵素類及び生来のインターフェロンのみである。１９ ８６年７月１７日に公開されたＰＣＴ　ｗｏ　８６１０４１４５は、Ｆｃ受容体 への結合を減少せしめるための抗体のＰＥＧ修飾を記載している。米国特許Ｔｈ ４．１７９．９３７は、所望の生理活性を実質的に維持しながらポリペプチドの 免疫原性を低下せしめるために、酵素及びインシュリンのごとき水溶性ポリペプ チドとＰＥＧ又はＰＰＧとの接合を記載している。１９８５年９月１１日に公開 された式日薬品工業のＥＰ１５４．３１６は、リンホカインの少なくとも１個の 一級アミノ基に直接結合したＰＥＧを含有するＩ　Ｌ−２のごとき化学的に修飾 されたリンホカインを開示し、そしてクレームしている。

さらにＫａ　ｔｒｅら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　（１９８７ ）　８４　：　１４８７はＰＥＧによるＩ　Ｌ−２の修飾を記載している。

他の多くの参考文献が、蛋白質、例えばα−１−プロテイナーゼインヒビター、 アスパラギナーゼ、ウリカーゼ、スーパーオキサイドディスムターゼ、ストレプ トキナーゼ、プラスミノーゲン活性化因子、ＩｇＧ、アルブミン、リポプロティ ンリパーゼ、西洋ワサビパーオキシダーゼ、カタラーゼ、アルギノーゼ及びアス パラギナーゼ、並びにペプチドのＰＥＧ誘導体化の概念を開示している。リジン を介してのこれらの誘導体化は、半減期を改善し、免疫原性を低下せしめ、溶解 度を上昇せしめ、そして一般に効力を増強する（これは少い頻度の投与を可能に する）ものとして報告されている。はとんどの場合、生体内での改善された成能 を達成するために蛋白質は分子当り複数の修飾を必要とし、そして生体外活性は この棒な修飾により有意に低下した。

ポリペプチドのシスティン残基を介してのＰＥＧによるＩＬ−２，１ＦＮ−β及 びイムノトキシンの修飾が１９８７年１月１５日に公開されたＰＣＴ　Ｗｏ　８ ７１０００５６に記載されている。

これらの特許又は特許公開に加えて、幾つかの論文が酵素、ＩｇＧ及びアルブミ ンのごとき蛋白質のための修飾剤としての活性化されたＰＥＧ又はＰＰＧの使用 の概念を記載している。例えば、Ｉｎａｄａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、ａｎｄ　Ｂｉ ｏ　ｈ　ｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、。

１２２８４５−８５０　（１９８４）は、ＰＥＧと接合するためにシアヌル酸塩 化物を使用することにより水溶性リボプロティンリパーゼを修飾してそれをベン ゼンのごとき有機溶剤に可溶性にすることを記載している。Ｔｏｋａｈａｓｈｉ ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、ａｎｄ　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ。

Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、　１２１２６１　２６５　（１９８４）は、シアヌル酸塩化 トリアジンを用いてＰＥＧにより西洋ワサビパーオキシダーゼを修飾して、該水 溶性酵素をベンゼン中で活性で且つ可溶性にすることを記載している。

蛋白質接合反応においてポリビニルアルコール（ＰＶＡ）の使用を開示している 特許及び特許公開には、ベンジルペニシリンとＰＶＡとの接合に関する米国特許 Ｎα４，２９６，０９７及び随４．４３０，２６０　、　α−１−ブロテイナー ゼインヒビターとヘパリン、ＰＶＡ又はＰＥＧのごときポリマーとの接合に関す る米国特許Ｎｏ、４，４９６，６８９　（ＥＰ　１４７，７６１）　；　ヘモグ ロビンとキャリヤーとしてのＰＶＡとの非共有結合を開示している１９８５年５ 月２２日に公開されたＥＰ　１４２，１２５　、蛋白質にカップリングした架橋 されていない水不溶性ＰＶＡに関するＤＥ　２３１２６１５（Ｅｘｐｌｏａ−ｔ ｅｒｉｎｇｓ　ＡＢ　ＴＢＦ）　；並びにＰＶＡとヒトヘモグロビンＡとの接合 に関する１９８５年５月２３日に公開されたＤＨ３，３４０，５９２が含まれる 。

蛋白質とＰＶＡとの接合体に関する論文には５ａｂｅｔら、Ｉｎｄｉａｎ　Ｊ、 Ｃｈｅｗ、　Ｓｅｃ、Ａ　（１９８４）　２３Ａ　（５）　（ＰＶＡと蛋白質と の相互作用を開示する）、Ｗｅｉら、■ｍＬｌｌｕｎ０１．（１９８４）　５１ 　（４）　：　６８７−６９６　（ＰＶＡに接合したトリメリチルを開示する） 、Ｌｅｅら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　（１９８１）　１２６　：　４１４　４ １８及びＨｕｂｂａｒｄら、Ｊ、　Ｉ＋＊ｍｕｎｏｌ。

（１９８１）月沃：　４０７−４１３　（いずれもＰＶＡに接合したＤＮＰを開 示する）、ＬｅｅらＩｎｔ、Ａｒｃｈ、ＡＩＩｅｒ　　Ａ　　１．１　ｍｕｎｏ ＋、（１９８０）６３　：　１−１３（ＰＶＡに接合したアンチベンジルベニシ ロイルＩｇＥを開示する）　、５ｅｈｏｎ、　ＰＬＥ、Ａ］ユ旦ロＪ（１９８２ ）　３２　：　１６１−２０２（ＰＶＡを介して接合したアレルゲン及びハプテ ンを開示する）、Ｈｏ１ｆｏｒｄ−５ｔｒｅｖｅｎｓら、　Ｉｎｔ、、八ｒｃｈ 、Ａ１１ｅｒ　　　　Ａつ　、Ｉｍｍｕｎｏｌ、（１９８２）６７　：　１０９ −１１６（ＰＶＡと抗原／ハブ−ｉ−７ト（７）接合ヲ開示スル）、並びに５ｅ ｈｏｎ及びＬｅｅ、　Ｉｎｔ、Ａｒｃｈ、ＡＩＩｅｒ　Ｌ人別ユムＬｕｎｏｉ、 （１９８１）６６　（Ｓｅｐｐ、１）、　　３９−４２頁（ＰＶＡに接合したハ ブテン／アレルゲンを開示する）が含まれる。

ＰＣＴ公開Ｎα−０８６１０４６０７及び−０８７１０３２０４並びにＲａ１ｐ ｈら、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ、　（１９８６）　１７２　：　１９４は、抗−感 染剤、抗−腫瘍剤又は創傷治癒剤としての使用を含む、Ｃ５Ｐ−１の種々の潜在 的用途を開示している。

しかしながら、これらの文献はいずれも、その循環半減期又は効力を増加しなが らその生物活性を保持するようにポリマー、例えばＰＥＧ又はポリビニルアルコ ールによすＣ３Ｆ−１をいかに修飾するかについての詳細は開示していない。さ らに、幾つかの蛋白質は特に接合を介しての相互作用に一層感受性であるから、 望ましい反応条件の種類又は蛋白質修飾の程度を推定することは一般的に不可能 である。

従って本発明は、有用な生物活性を保持しながら生体内半減期を延長するために コロニー刺激因子を修飾することを提供する。この修飾されたＣ５Ｆ−１は、未 修飾Ｃ３Ｆ−１に比べて減少したそして／又は低頻度の投与において生体内で細 胞を刺激するために使用することができる。

第二の利点として、この修飾はＣ３Ｆ−１の免疫原性を低下せしめることができ （特に異種において使用される場合、例えばヒトのＣ３Ｆ−１をウシに使用する 場合）そして／又は起こるかもしれない蛋白質の凝集を減少せしめることができ る。

さらに具体的には、本発明は、生物学的に活性な組成物に関し、この組成物は哺 乳類において延長された生体内半減期を有し、インビトロコロニー刺激因子−１ 測定において一層マクロファージコロニーの形成を刺激する蛋白質を含んで成り 、この蛋白質はポリエチレングリコール又はポリプロピレングリコールホモポリ マー、ポリオキシエチル化ポリオール及びポリビニルアルコールから成る群から 選択された水溶性ポリマーに共有結合により接合しており、ここで該ホモポリマ ーはその一端においてアルキル基により置換されているが又は置換されていない 。Ｃ５Ｆ−１蛋白質は、（１）リジン残基及びＮ−末端アミノ酸を含めての遊離 アミノ基（好ましくは１〜３部位）、（２）真核細胞で発現されたグリコジル化 されたＣ５Ｆ−１の炭水化物成分（１又は複数）、又はＣ５Ｆ　−１に人為的に 作られた遊離スルヒドリル基、を介してポリマーに接合させることができる。

好ましくは、ポリマーは非置換ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）　、モノメチ ルＰＥＧ（＋ｎＰＥＧ）　、又はポリオキシエチル化グリセロール（ＰＯＧ）で あり、これらは（１）ＰＥＧ、　ｍＰＥＧ又はＰＯＧカルボン酸又は炭酸の活性 エステル（好ましくはＮ−ヒドロキシサクシンイミドエステル又はバラニトロフ ェニルエステル）から形成されるアミド又はウレタン結合を介してＣ３Ｆ−１の りジン残基に連結され：　（２）アミン、ヒドラジン又はヒドラジド結合を介し てＣ５Ｆ−１の炭水化物成分に連結され；あるいは（３）マレイミド基又はハロ アセチル基（ここでハロゲンは、Ｂｒ、ＣＩ又はＩである）を介し７てＣ５Ｆ− １のシスティン残基に連結される。

本発明の他の観点は前記の接合した蛋白質の製造方法に関し、この方法は、 （ａ）少なくとも１個の末端反応基を有する水溶性ポリマーを用意し、該ポリマ ーはポリエチレン又はポリプロピレングリコールホモポリマー及びポリオキシエ チル化ポリオール並びにポリビニルアルコールから成る群から選択されたちので あり、該ホモポリマーはアルキル基により一端において置換されているか又は置 換されておらず；（ｂ）蛋白質を前記ポリマーの反応性基と反応せしめることに より該蛋白質を生物学的に活性にしそして選択に接合せしめ；そして （Ｃ）接合した蛋白質を精製する； ことを含んで成る。

他の観点において、本発明は、医薬として許容される水性キャリヤー媒体に溶解 した接合したＣ５Ｆ−１蛋白質を含んで成る医薬製品の有効量を哺乳類に投与す ることを含んで成る、哺乳類における感染性疾患もしくは癌の予防的又は治療的 処置のための方法、及び哺乳類における癌治療、創傷治癒、骨粗鬆症治療、コレ ステロール低下又は抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）のために効果的な方法に関 する。

第１図は、ｐＣＳＦ−１７のｃＤＮＡ及び推定されるアミノ酸配列（３４アミノ 酸リ一ダー配列及びアミノ酸１〜２２４）を示す。

第２図は、Ｃ５Ｆ−４のｃＤＮＡ及び推定されるアミノ酸配列（部分的アミノ酸 リーダー配列及びアミノ酸１−５２２）を示す。

第３Ａ図は、誘導体化されていないＣ３Ｆ−１（ｒＣＳＦ−１）　（ＳＣＳＦ／ Ｎ２Ｃ１５０）のサイズ排除ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。第３Ｂ図は、平均 分子１１７０００のＰＥＧ　−Ｎ）Ｉｓにより誘導体化された同じｒｃｓＦ　　 １のＨＰＬＣ−クロマトグラムを示す。

第４図は、平均分子量１１　、０００のＰＥＧ　−ＮＨＳにより誘導体化された ｒＣＳＦ−１（ＳＣＳＦ　／　Ｃ１５０）のサイズ排除ＨＰＬＣクロマトグラム を示す。

第５図は、Ｅ、コリｒｃｓＦ−１（ＳＣ５Ｆ　／　Ｃ１５０）　、第２図中の配 列を有するｒＣＳＦ　　１に由来する二量体生成物〔リーダー配列及びＣ−末端 配列を欠くが、しかしＥ、コリ構成物中に存在する末端メチオニンの本質上すべ てを保持している〕、グリコジル化された５２２−アミノ酸前駆体（ＬＣＳＦ） から生ずる哺乳類細胞（ＣＯＳ）中で発現されたｒＣＳＦ　−１、及びＰＥＧ− １１，０００で誘導体化されたＥ、コリｒＣＳＦ−１（ＳＣＳＦ　／　Ｃ１５０ ）について、ラット血漿中Ｃ５Ｆ−１濃度対時間のグラフを示す。

第６図は、ＰＥＧ−１１，０００で誘導体化されたｒｃｓＦ−１（ＳＣＳＦ　／ Ｃ１５０）の静脈内注射の後１２０分でのう・ノド血漿のサイズ排除ＨＰ　ｌ、 Ｃクロマトグラムを示す。ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及び２８０ｎｍにお ける吸光度がプロットされている。

第７図は、Ｅ、コリｒＣＳＦ−１（ＳＣＳＦ　／　Ｎ３Ｃ１５８）及び１１．０ ００ＰＧＨにより誘導体化された同じ蛋白質について、ラット血漿中Ｃ５Ｆ−１ ｉ１１度対時間のグラフを示す。

第８図は、ＰＥＧ−１１，０００で誘導体化されたｒＣＳＦ−１（ＳＣ５Ｆ　／ Ｃ１５０）のＳＯ５−ＰＡＧＥ分析を示す。クマツシーブルーにより蛋白質につ いて染色されたゲル（１０％）は、ジスルフィド結合の還元を伴う又は伴わない 、第５図において使用したサンプルについてである。

冗二」１ 「コロニー刺激因子−１」というのは、Ｍｅｔｃａｌｆ、　Ｊ、Ｃｅ１ｌＰｈ　 ５ｉｏ１．　（１９７０）　、７６　：　８９の標準的な１体五コロニー刺激ア ッセイ（このアッセイにおいてはポリペプチドが一次的にマクロファージコロニ ーの形成を刺激する）においてＣ３Ｆ　−１に対する生物活性をもつ２量体（ダ イマー）タンパク質又は糟タンパク質化合物のことである。［生物活性Ｃ５Ｆ　 −Ｉ　Ｊは、同じＣ５Ｆ−１の非接合形態のものと基本的に同じ比活性をマウス の骨髄コロニー形成アッセイにおいて有するか或いはその比活性の約１０％以上 を有する接合体Ｃ５Ｆ−１の化合物を意味する。「天然の（生来の）ＪＣ５Ｆ− １は、非組換え型Ｃ５Ｆ−１である。マウスのＣ５Ｆ−１は、欧州特許公開第０ ２７２７７９号、Ｒａｊａｖａｓｈｉｓｔｈ他、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ　Ａｃ　ｄ 、ｓｃｉ、ＵｓＡ　（１９８７年）８４　ｉ　１１５７及びＤｅＬａｍａｒｔｅ ｒ他著のＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ、（１９８７年）１５　：　２３８９ 内に記述されている。

「臨床的に純粋な４ｃｓｐ−ｉというのは、ＲＰ　−ＨＰＬＣによるか又は還元 的又は非還元的なＳＯＳ　−ＰＡＧＥ分析により少なくとも９５％のＣ５Ｆ−１ を含み、約１．０　ｎｇ／　ｍｇ　ＣＳＦ　−１未満の内毒素（エンドトキシン ）を有する細菌内で組換えにより生成される生物活性をもつヒ）Ｃ５Ｆ−１の調 製剤を意味する。

「選択的に接合された」というのは、タンパク質の遊離アミノ基（好ましくは、 最大の生物活性を保持するため１つ又は２つの遊離アミノ基）を介して、又は遊 離スルフヒドリル基（もしあれば）を介して、或いはタンパク質中に存在する炭 水化動部成分（もしあれば）を介して共有結合されたタンパク質のことである。

「有効量」及び「免疫療法上の有効量」は、腫瘍の削減を促進するため或いは又 感染性疾病を予防又は治療するためといった特定の機能を行なうのに有効な量を 意味する。

「療法的処置」は、「予防的処置」が疾病の罹患を予防するだめの処置を表わす のに対して、疾病に罹患した後に処置することを表わす。

「哺乳動物」というのは、あらゆる哺乳類種を表わし、ウサギ、マウス、イヌ、 ネコ、ウシ、ヒツジ、霊長類及びヒトを含み、好ましくはヒトのことである。

「ミューティン」というのは、サイト特異性突然変異誘発といった技法を用いて 変性させられた核酸配列から発現された遺伝子操作により作られたタンパク質で ある。かかる遺伝的変性は、親タンパク質のアミノ酸配列に対する１又は複数の 置換、付加及び／又は欠失を結果しとてひき起こすように設計されている。

「医薬として許容される」というのは、盲動成分の生物活性の有効性と干渉さす 、安定性があり、しかもそれが投与される宿主にとって有毒でないような担体媒 体に関する。

「ホモダイマー」とは、それが、組換え型タンパク質の生成又はプロセシングに 際して場合によって生じるわずかな微変異性をもつ２量体タンパク質をも含むが 、その２つのサブユニットについて基本的に同一である２量体タンパク質のこと である。

「ヘテロダイマー」というのは、アミノ酸配列、アミノ酸の数又はその両方にお いて異なっているサブユニットをもつ２量体タンパク質である。換言すると、ヘ テロダイマーは２つの同一でないサブユニットを有している。

Ｃ３Ｆ−１−ンパク 背景の節で記載したとおり、Ｃ３Ｆ−１はその２量体形態で生物活性を有する。

ここで用いられるＣ３Ｆ−１は「天然の」２量体であっても組換えにより生成さ れた２量体であってもよい。天然の２量体Ｃ５Ｆ−１種は、ヒトの尿、培養され た単核細胞及びいくつかの細胞系の培養上澄み液から得られたものである。さま ざまなアミノ酸配列及び長さから成るＣ５Ｆ　−１単量体をコード化する組換え 型ＤＮＡを得ることが可能であった。第１図及び第２図は、両者共にそのＮ末端 に３２−アミノ酸シグナル配列を含んでいる、それぞれ最大長、プロセシングさ れていない短形及び長形前に対するＤＮＡ配列及びそのＤＮＡ配列から予測され たアミノ酸配列を示している。

単量体Ｃ５Ｆ−１タンパク質の配列はここでは便宜上、リーダー配列無しの２２ ４−アミノ酸短形態配列（ここでは５ＣＳＦと呼ぶ）及びリーダー配列無しの５ ２２−アミノ酸長形態配列（ここではＬＣＳＦと呼ぶ）であるものとみなされて いる。点突然変異、挿入、欠失及び／又は転座（トランスロケーション）によっ て変更されたＤＮＡ配列から生成されたその他のＣＳＦ　−に量体も同様に、そ れらが生物活性を有する場合に本発明の化学的変更から恩恵を受けるものと期待 されている。

真核生物であれ原核生物であれあらゆる宿主の中で生成される組換え型Ｃ３Ｆ− １は、選択されたアミノ酸側基好ましくは遊離アミノ基を介して重合体へと接合 されうる。好ましくは、Ｃ３Ｆ　−１をコードするＤＮＡは細菌内で発現され、 結果として得られるＣ５Ｆ−１は、純化及び再生の後のホモダイマーである。接 合が炭水化物部分を介したものである場合、宿主は真核生物であってよく、或い は又、生体外でグリコシル化が行なわれる可能性もある。

便宜上、記述されているさまざまなｃＤＮＡ構成概念によりコード化されるタン パク質サブユニットの一次構造は、ここでは以下のような短縮記号を用いて呼ぶ ことにする。すなわち、ＬＣＳＦは、完全なシグナル配列無しで第２図に示され ている上述の欧州特許公開第０２７２７７９号に記載の、クローンＣ５Ｆ−４に ついて開示された５２２−アミノ酸配列を表わす。５ＣＳＦは、本書に同様に参 考文献として内含されている上述のカワサキ論文（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５年 ＞　２３０８２９２−２９６　）内に記述され、シグナル配列無しの、第１図に 示されている、クローンｐＣＳＦ　−１７について開示された２２４−アミノ酸 配列を表わす。

１つの特定のｐＣ５Ｆ−１７クロ一ン誘導体が、位置５９においてアスパラギン 酸残基を有していることがわかるだろう。開示されているＬＣ３Ｆクローンは同 様に１、位置５９においてＡｓｐをコード化する。第１図及び第２図に示されて いる配列内のアミノ酸置換に相応するミューティンは、位置と共に指定されてい る置換によってそれ相応して呼称される６　ｃｓｐ−ｉのミューティン形態は、 １９８８年６月２９日に公開された欧州特許公開第０２７２７７９号内に開示さ れており、かかる開示は本書中に参考文献として内含される。これらのタンパク 質をコードする構成物が細菌内で発現される場合、最終生成物は、さまざまなレ ヘルでＮ末端メチオニンを保持することも可能である。

Ｎ末端メチオニンの除去の程度は高い信顧性で予測できないことから、この可能 性は表記中には含み入れられていない。

これらの基本的５ＣＳＦ及びＬＣ５Ｆ配列のＣ末端及びＮ末端の切形は、それぞ れＣ又はＮと呼ばれる。Ｃ末端の欠失の後には、残っている天然（未変性）構造 のアミノ酸の数を表わす数字が続く：すなわち、Ｎ末端欠失については、Ｎの後 にはＮ末端から欠失されたアミノ酸の数が続くことになる。

従って例えば、ＬＣＳＦ／Ｃ１５０は、長いＣ３Ｆ配列の最初の１５０のアミノ 酸残基を含むタンパク質をコードする構成物を表わす。又５Ｃ５Ｆ／Ｃ１５８は 、短形前の最初の１５８のアミノ酸残基を含むタンパク質をコード化する構成物 を表わしている。さらに、５Ｃ５Ｆ／Ｎ２は、２つのＮ末端アミノ酸が欠失させ られた状態での短形前をコードする構成物を表わしている。

（前述のとおり、ＬＣＳＦ及び５Ｃ５Ｆは、位置１５０から始まって発散し、Ｌ ＣＳＦクローン内の２９８のアミノ酸の後に再収束する）。

ＬＣＳＦ／Ｎ２Ｃ１５０は、２つのＮ末端グルタミン酸残基が欠失させられてい るという点を除いて、ＬＣ５Ｆ／Ｃ１５０と同じものである１形態を表わしてい る。

さまざまなＣ５Ｆ　−１形態をコードするプラスミドが現在使用可能であり、細 菌系内で発現されうる。Ｃ５Ｆ−１の長形態をコードするプラスミドの一形態は 、真核生物細胞内で発現される可能性があり、この場合、真核細胞はクローンを 「プロセシングし」、Ｃ末端で切断されたタンパク質を分泌し、Ｎ末端からリー ダー配列が除去されている。代替的には、クローンを切断して、真核細胞又は原 核細胞内で特異的なＣ末端欠失された形態を発現することも可能である。さらに 、大腸菌（Ｅ、Ｃｏ１１）内で発現された結果として得たタンパク質がより相同 であるように、最初の２つ又は３つのＮ末端コドンを欠失させることも可能であ る。限定的に言うと、大腸菌構成物内の成熟した天然配列Ｎ末端のすぐ上流でコ ードされたＮ末端メチオニン（これは、翻訳後プロセシングにより除去されてい ないかぎり、タンパク質内に「Ｎ末端Ｍ　ｅ　ｔ　」とし２て保持されている） は、これらのＮ末端欠失構成物からより容易に除去される。ざらに、逆相）ＩＰ Ｌｃ　（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を用いて検出できる有意な不均一性は、「天然の」Ｎ 末端配列をコードする遺伝子（例えば、短形前のもの、ミニティン５ＣＳＦ／Ｃ Ｊ５０）が大腸菌内で発現され、精製された生成物が特徴づけされる場合に、見 い出される。この不均一性は、２つのＮ末端コドンが欠けた相応するＣ３Ｆ−１ 遺伝了（グルタミン酸）が発現される場合に、無くなる。従−て、その他の短い 及び長いＣ５Ｆ−１遺伝子構成物のＮ末端切除形も同様に用いることができる。

好ましい構成は、タンパク質が基本的に、ＬＣ５Ｆ／Ｃ１５０からＣ４６４，ｔ ｙｒｓＪＣＳＦ／Ｃ１５０からＣ４６４；　ａｓｐｓｗｓｃｓＦ／　Ｃ１５０か らＣ１６６から成るグループの中から選ばれた１つのアミノ酸配列で構成されて いるようなものである。さらに好ましいのは、基本的に、ＬＣＳＦ／Ｃ１５０； 　ＬＣＳＦ／Ｃ１９０；　ＬＣＳＦ／Ｃ＼７２２１　；　ＬＣＳＦ／Ｃ２２３； 　ＬＣ５Ｆ／Ｃ２３６；　ＬＣ５Ｆ／Ｃ２３８；ＬＣ５Ｆ／Ｃ２４９；　ＬＣ５ Ｆ／Ｃ２５８；　ＬＣＳＦ／Ｃ４０６；　ＬＣＳＦ／Ｃ４１１：　１．Ｃ３Ｆ／ Ｃ４６４；　ａｓｐｓｑｓｃｓＦ／ＣＶ１５０　；　ａｓｐｓｗｓｃｓＦ／’Ｃ １５３；及びａｓｐｓ、５ｃｓＦ　／　Ｃ１５８から成るグループの中から選択 された１つのアミノ酸配列で構成されたＣ５Ｆ−１タンパク質である。

本書において変更のためのＣ５Ｆ−１タンパク質を結果としてもたらす特に好ま しい構成には、ＬＣＳＦ／Ｃ１９０，ＬＣ５Ｆ／Ｃ２２１＋　ａｓｐｓ、＋５ｃ ｓＦ／Ｃ１５８，ａｓｐｓｑｓｃｓＦ／Ｃ１５０及びこれらに相応するＮ２及び Ｎ３形態をコード化するクローンが含まれている。

最も好ましい出発物質は、ａｓｐ、、５ＣＳＦ／　Ｃ１５０；　ａｓｐｓｖｓｃ ｓＦ、／Ｃ１５８；　ＬＣ５Ｆ／Ｃ２２１及びその相応するＮ３形態をコードす るクローンの生成物である。

あるいは、Ｃ５Ｆ−１は、特にＣ５Ｆ−１ヘテロダイマーの反応性システィン残 基を通して接合が行なわれる場合、Ｃ５Ｆ　−１のさまざまな単量体ユニットの 中から調製されたヘテロダイマーの形をしていてもよい。プロセシングの差異又 はクローン構成上の差異によるＣ末端配列の変化によって形成された数多くのＣ ５Ｆ−１タンパク質は、ヘテロダイマー形成に用いることのできるさまざまな出 発物質を提供する。従って、再生により新奇のへテロダイマーを形成することが できる。

例えば、５Ｃ５Ｆ／Ｃ１５０の単量体形態は、ＬＣ３Ｆ／Ｃ１５７の単量体形態 と共に、本書中に参考文献として内含されている１９８８年１０月２０日に公示 されたＰＣＴ公報−０８８１０８００３号の方法に従って、混合及び処理されう る。次に、ヘテロダイマーを、さまざまなりロマトグラフィ及びその他の方法に よりホモダイマー及びオリゴマー副生成物から分離することができる。ヘテロダ イマー（特に５ＣＳＦ／Ｃ１５０及びＬＣＳＦ／Ｃ１５７）は、１５７位置にお いて１つのサブユニット上で終結させることができ、、こうして、複合重合体と の反応のだめの潜在的に遊離したスルフヒドリル基を提供する。本発明の方法を 受けた同様の混合物は、アミノ酸置換を有する成分のへテロダイマー（例えばｇ ｌｕｓｚＬｃｓＦ／Ｃ２２１及びＬＣＳＦ／Ｃ１９０）に導く可能性がある。

菌内で生成させることもできる。同一細胞内で生成される場合には、各々の単量 体の発現のための構成物が、同じ宿主内へ導入される。かかる実施態様において は、各々の構成物が異なる標識（例えば、テトラサイクリン耐性（Ｔｃ”　）及 びアンピシリン耐性（Ａｍｐ”　））を持ち、そのため同時形質転換された宿主 が選択されるようにすることが好ましい。次に、同時形質転換された細胞は増殖 させられ、２つの形態の混合物を得るべく誘導される。

さらに、分子が生物活性を保持することを条件として、ＰＥＧ反応のためシステ ィン残基上に遊離スルフヒドリル基を含むｒＣＳＦ　　１の構成物を生成するた め、自然でない場所での単一のシスティン残基をＣ５Ｆ　−１に誘導することも できる。

２つサブユニットのうちの片方の中にのみ一定の与えられたシスティンの置換を 含むヘテロダイマー構成物も又同様に遊離スルフヒドリルの生成に役立ちうる。

同様に、炭水化物部分を、真核系からの発現によって又は酵素での生体外グリコ ジル化によってＣ３Ｆ−１タンパク買上に置くこともできる。

組換え型Ｃ５Ｆ　−１タンパク質は、宿主によるプロセシングのため、クローン により規定された正確な長さを保持している場合もあれば保持していない場合も ある。従って、出発物質であるタンパク質は同じ呼称で呼ばれるが、実際にはこ れらの呼称はクローンの盈炭立を表わしており、本書中に開示されている方法の ための出発物質の実際の長さは、Ｃ末端アミノ酸の数により規定されるものより も長い場合も短かい場合もある（それがＮ末端Ｍｅｔを有する場合）ということ を理解しておかなくてはならない。

上述のように、Ｃ５Ｆ−１は、例えば哺乳動物、昆虫又は酵母菌の細胞といった 真核性細胞の中で生成できる。哺乳動物の細胞内での生産については、ＰＣＴ特 許公開ｗｏ　８６１０４６０７号に記述されている。Ｃ５Ｆ−１は、本書中にそ の開示が参考文献として包含されているＬｕｃｋｏｗ他著のＢｉｏｔｅｃｈｎｏ ｌ、　（１９８８年）ｉ：４７中に記述されているように、バキュロウィルスベ クターを用いて、昆虫の細胞から生成することができる。このタイプのＣ３Ｆ− ］生産のその他の記述は、ｌ１ｅａνｅｒ他著のＷＴｅｃｈｎｏｌｏ■（１９８ ８年）　６　：　２８７内に含まれている。昆虫の細胞で生産されたＣ３Ｆ−１ （ＳＣ３Ｆ／Ｃ１５０）は、非常に短かい生体内半減期を有することがわかった グリコジル化された２Ｍ体である。５Ｃ５Ｆのアミノ酸配列内の２つのＮ一連鎖 グリコシル化シグナル（Ａｓｎ１２２及びＡｓｎ１４０）は、グリコジル化され た生物活性ある昆虫細胞で生産されたＣ３Ｆ−１タンパク質（Ｇ１ｎ１４０、　 Ｇ１ｎ１４０）を生成すべく、サイト指向性の突然変異誘発を用いてＤＮＡ内で 変更されうる。この後、このタンパク質を、その生体内半減期を増大するため原 核生物にて発現されたｒＣＳＦ−１について行なわれたように１つの重合体とそ のリジン又はシスティン残基を介して反応させることができる。

例えばＰＥＧ−アミン、ＰＥＧ−ヒドラジン又はＰＥＧ−ヒドラジドを、糖のビ シナルジオールをアルデヒドに変換すべく過ヨウ素酸塩で酸化されたＣ３Ｆ−１ タンパク質と反応させることにより、炭水化物上のグリコジル化されたＣ３Ｆ− １に対し重合体を共有結合させることができる。ＰＥＧ−アミンは、ＰＥＧ　− ＯＨをまずＰＥＧ−）シル化物にそして次にＰＥＧ−フタルイミドに変換するこ とによって調製でき、フタルイミドはヒドラジンで開裂されて、ガブリエル合成 でＰＥＧ　−ＮＨｚを生成する。ＰＥＧ−ヒドラジン及びＰＥＧ−ヒドラジンは 当業者にとっては周知の方法で調製することができる。

Ｐ　Ｅ　Ｇｍ導体は、ビシナルジオールがアルデヒドに変換された炭水化物サイ トでカップリングする。

Ｃ３Ｆ−１が細菌宿主内で細胞内生産される場合には、ＰＣＴ公開−０８８１０ ８００３以前に記されているように、高い収量で活性二量体を形成すべく、再生 されなくてはならない。要するに、この手順においては、成熟タンパク質又は融 合タンパク質のいずれとして分泌又は生産されたかに関わらず可溶化された単量 体は、還元的条件の下でカオトロピック環境内に保たれる。かかる保持には、β −メルカプトエタノール又はジチオスレイトール（ＤＴＴ）といった適当な還元 剤の使用が関与している。可溶化されたタンパク質は、標準的に、約２〜１００ ｍＭのチオール化合物が存在する中で約７〜８．６のｐＨで８Ｍの尿素又は７Ｍ の塩酸グアニジウムといったもの中に維持される。この可溶化された形態から出 発して、単量体を直接再生することもできるし、或いは又吸収性ゲル上のクロマ トグラフィ、イオン交換カラムを用いたクロマトグラフィ又はゲル透過クロマト グラフィといった適当な純化手順により再生の前に残りのタンパク質から純化さ せることもできる。

ゲル透過クロマトグラフィは、異なる分子量の不純物から一般に予め分かってい る望ましい単量体長さの容易なサイズ分離を可能にするため、有用である。尿素 中のＤＥＡＥセファローズクロマトグラフィは、濃縮すると同時に精製し、選別 以上に容易にスケールアップできることから、さらに有用である。

Ｓ−５結合した集合体の形成を防ぐため、還元的条件下で精製を行なうことが好 ましい。

従って、使用されるクロマトグラフィ手順の如何に関わらず、クロマトグラフィ 用カラム又はバッチに装入するのに用いられる溶液及び溶離用溶液中には、適当 な還元剤が含み入れられる。いくつかの例においては、基本的に低いｐＨがジス ルフィド結合の形成を防ぎいくつかのクロマトグラフィシステムと適合性がある ことから、還元剤の代わりに低いｐＨを用いてもよい。さらに、低濃度のキレー ト剤の含有は、タンパク質の還元された形態を保持する助けとなりうる。

次に部分的に精製された単量体は、二量体の形成のため再生条件に付される。こ の段階中のタンパク質濃度は、きわめて重要である。一般に、Ｃ５Ｆ−１再生反 応の体積に対する最終百分率収量は、タンパク質濃度がＣ５Ｆ−１タンパク質Ｉ Ｉｄあたり約２■未満になると増大する。０．０３〜１．０■／ｄという濃度範 囲が好ましい。再生条件には、適当な時間（通常数時間）にわたるカオトロープ 環境の漸進的な除去、或いは又タンパク質及びカオトロープ剤の望ましい濃度に 至るまでの試料の希釈が含まれるであろう。同様に可能であるのは、カオトロー プがゆっくりと除去されていく間の透析又は中空ファイバーダイアフィルトレー ジョンといった、一定のタンパク賞濃度を与える方法である。このプロセスの終 りに、カオトロープが逓減された時点で、比較的非変性のレベルが達成される。

例えば、塩酸グアニジンがカオトロープとして用いられた場合、約２Ｍ未満好ま しくは０．１〜ＩＭの最終濃度が達成され、尿素がカオトロープとして用いられ た場合には、約１Ｍ未満好ましくは０．１〜０．５Ｍの最終濃度が達成される。

Ｃ３Ｆ−１の場合ジスルフィド結合の形成（そのうちの単数又は複数は２つの鎖 を結合する）を必要とするような生物活性ある２量体構成を打ち立てるジスルフ ィドに対するスルフヒドリル基の酸化を可能にするように、再生が行なわれる。

単数又は複数の鎖内ジスルフィドも形成される。この２量体形成を促進する適当 なレドックス（酸化還元）条件には、酸化された及び還元されたグルタチオンと いったスルフヒドリル／ジスルフィド試薬の組合せが含まれる。還元グルタチオ ン対酸化グルタチオン又はその他のスルフヒドリル／ジスルフィドの組合せの比 率は標準的に約２　ｍＭ／　０．１　ｍＭから０．５ｍＭ／　１．　ＯｍＭであ る。その他の酸化方法も同様に許容できる。

いずれにせよ、再生プロセス中の溶液のｐＨは、反応に有利に作用するよう約７ ．５から９．０に保たれなくてはならない。初期精製を行なったきわめて還元性 の条件は、再生プロセス中にはもはや用いられない、ということは明白である。

再生プロセス中塩化ナトリウムといった塩の重大な濃縮を排除することにより、 次に続く濃縮／精製段階としてイオン交換クロマトグラフィを用いることが可能 となる。

再生プロセス中、Ｃ３Ｆ−１のより高いオリゴマ種が形成される可能性がある。

この凝集（集合）プロセスは、温度制御を通して最低限におさえられ、ここでは 、約０〜４°Ｃという低い温度が２５〜３７°Ｃというより高い温度よりも好ま しい。

再生されたＣ５Ｆ−１調製物の中に存在する残留Ｌ／ドックス剤は、次に続く精 製段階中ジスルフィド交換を容易にする可能性がある。望ましくないこのような ジスルフィド交換を阻止するさらに２つの好ましい方法には、ｐｔ＋を７，０以 下に低下させること又はレドックス試薬を除去するためのダイアフィルトレージ ョンがある。

例えば、再生された二量体Ｃ５Ｐ−１をさらに精製する前に、例えばＤＥＡＥセ ファロースを用いたイオン交換クロマトグラフィへの再生された物質の直接装入 により、レドックス物質の除去及び再生されたタンパク質の濃縮を行なうことが できる。

往々にしてこのような手順は８前後のｐｎにて行なわれる。しかしながらｐＨを ５．５から７．０の範囲まで低下させることにより、オリゴマー形成は減少し、 ２量体Ｃ５Ｆ−１の収量は増大した。

再生、濃縮及び精製の後、２量体はさらに残留レドックス物質及びその他のタン パク質から、単量体について前述したものと類憤の手順を用いて精製される。適 切な手段の中には、特に、ゲル透過、疎水性相互作用クロマトグラフィ、イオン 交換クロマトグラフィ及び逆相ＨＰＬＣなどが含まれる。

発熱物質又はその他のエンドトキシン（内毒素）といった望ましくない不純物の 除去のための特に有効なプロトコルには、フェニル−Ｔ　Ｓ　Ｋ又はフェニル− セファロースカラム上のクロマトグラフィの使用がある。クロマトグラフィは、 基本的にエンドトキシンの無い試薬及び条件を用いて行なわれる。望まれる２量 体Ｃ３Ｆ−１は、中性ｐＨにて約１．５Ｍの硫酸アンモニウムの中で可溶性であ りかつ安定しており、約４　”Ｃから約１０°Ｃ好ましくは約４℃といった低い 温度にてこれらの条件下でカラム上に装入される。硫酸アンモニウムを付加した 時点で形成する沈殿物を除去すると、再生されたＣ３Ｆ−１の不安定な形態及び いくつかの集合体が除去される。Ｃ５Ｆ−１タンパク質は、中性緩衝液内でエチ レングリコールが増大する（０％から５０％）状態で低減する硫酸アンモニウム （１，５ＭからＯＭ）の勾配を用いて溶離させることができる。Ｃ３Ｆ−１は、 約０．６Ｍの硫酸アンモニウムで、フェニル−ＴＳＫカラムから３５％のエチレ ングリコールを溶離する。エチレングリコールの代りにプロピレングリコールを 用いることができるが、この場合溶離条件は幾分か異なる。代替的な支持体も同 様に用いることができ、実際フェニル−セファロースは、精製Ｃ５Ｆ−１２量体 タンパク質のより大規模な生産のために好まれる。

橿二二ぎ 上述のＣ５Ｆ−１タンパク質は、（１）１又は複数の遊離アミノ基、好ましくは 生物活性の損失を最低限におさえるためわずか１つ又は２つの基、（２）タンパ ク買上の少なくとも１つの炭水化物成分、又は（３）クローンに誘導され再生の 後遊離状態にとどまっている１又は複数の遊離スルフヒドリル基のいずれかを介 して、重合体に接合される。

タンパク質に接合された重合体分子の数は、例えば酸の劣化又は消化及びそれに 続くアミノ酸分析〔結合がマレイミド又はブロモアセチル対システィンの結合で あり、誘導体化が高い（４モル１モル以上）の場合〕を含むさまざまな方法によ って決定することができる。代替的には、接合したタンパク質は、酵素（例えば トリプシン）で小さなフラグメントに消化され、カラムクロマトグラフィで分離 されうる。修飾前後のタンパク質のペプチド地図を比較し、溶離時間を異にする フラグメントを配列決定して重合体の付着場所を決定する。

第３の変形態様においては、重合体をカップリングに先立って放射性標識付けし 、Ｃ３Ｆ−１タンパク質１モルにつき何モルの放射性重合体が付着されるかを決 定することができる。

比較的均等な分子量の重合体が均等な分子量のＣ５Ｆ−１に対して接合される場 合には、接合体の分子量の測定が、ＣＳＦ　−１１分子あたりの重合体数の見積 りとして役立つ。

接合させるべき残基は、以下のようなものであり得る：（１）何らかの遊離アミ ノ基（リジン残基におけるε−アミノ基、又は場合によってはＮ末端における遊 離アミン基）、（２）ＣＳＦ−１に導入又は構成されているシスティン残基上の 遊離スルフヒドリル基、又は（３）炭水化物成分（他の箇所で論述）。タンパク 質は、ＰＥＧにより遊離アミノ基上で適度に誘導体化されている場合（すなわち 約１乃至３の修飾アミノ酸残基を含んでいる場合）、誘導体化されていないＣ３ Ｆ−１の生物活性の２５％から１００％を保持しているということがわかってい る。しかしながら、それがＰＥＧで高度に誘導体化されている場合、接合タンパ ク質は、Ｃ５Ｆ−１のタイプ、ＰＥＧ重合体の長さ及び使用されたリンカ−及び 反応条件に応じて、著しく低い可測生物活性を有する。

タンパク質が付着される重合体は、あらゆる場合において室温で水溶性をもつこ とをその条件として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のホモポリマー又はポ リプロピレングリコール（ＰＰＧ）のホモポリマー、ポリオキシエチル化ポリオ ール又はポリビニル・アルコールである。ポリオキシエチル化されたポリオール には、ポリオキシエチル化グリセロール、ポリオキシエチル化ソルビトール、ポ リオキシエチル化グルコースなどがある。

ポリオキシエチル化グリセロールのグリセロールバックボーンは、例えばモノ、 ジ、及びトリグリセリドの形で動物及びヒトなどの体内に天然に発生するものと 同じバックボーンである。従ってかかる化合物は、人体内で必ずしも異質のもの とはみられない可能性がある。

重合体の平均分子量は好ましくは、例えば使用される特定のＣ５Ｆ−１の分子量 に応じて約１０００から１０００００ダルトンの間好ましくは約４０００から４ ００００ダルトンの間である。変更の目的は、生物活性が保持され未複合タンパ ク質に比べ生体内半減期が高められ、しかも免疫原性が減少した複合タンパク質 を得ることにあるため、重合体の分子量は、これらの条件を最適化するよう選択 されることになる（例えば、約８０ｋｄ以上の見かけの分子量の変更２量体Ｃ５ Ｆ−１タンパク質）。

天然の２量体Ｃ５Ｆ−１（すなわち組換え型でないタンパク質）を誘導体化する ことによって得られるもう１つの利点は、精製のむずかしい希少なＣ５Ｆ−１の 使用がかかる変更により最大限になるということである。

好ましくは、ＰＥＧホモポリマーはアルキル基で一端にて置換されるが、これは 未置換状態のままでもよい。好ましくはアルキル基はＣ，−Ｃ，アルキル基であ り、最も好ましくはメチル基である。最も好ましくは、重合体はモノメチル置換 されたＰＥＧホモポリマーであり、その分子量は約４０００乃至４００００ダル トンである。

共有結合修飾反応は、上述の方法のいずれによっても、好ましくは約ｐ）１５− ９でさらに好ましくは７−９で（タンパク買上の反応基が遊離アミノ基である場 合）で行なわれてよい。

後者のアプローチを用いると、タンパク質は、重合体に付加された少なくとも１ つの末端反応基を介して接合される。この反応基（単数又は複数）を伴う重合体 をここでは「活性化重合体」と呼ぶ。反応基は、タンパク質の遊離アミノ又はそ の他の反応基と選択的に反応する。（複数の反応基がある場合、架橋を防ぐため 複合条件を入念に制御しなくてはならない。しかしながら、１価の種が好まれる ）。

使用される無傷の活性化重合体の量は、一般に、タンパク質に対する活性重合体 のモル過剰分の約１倍から３０倍である。

使用される正確なモル比は、使用される活性化重合体のタイプ、ｐＨ、タンパク 質濃度及び使用されるＣ５Ｆ−１分子を含む数多くの変数によって左右される。

ＰＥＧ−クロル蟻酸塩の活性エステル以外の活性化重合体については、タンパク 質に対する活性化重合体のモル過剰分は、好ましくはアミ、７基の誘導体化のた めのＣ３Ｆ−１２量体１モルあたり約１１モル未満であり、さらに好ましくはＣ ３Ｆ−１１モルあたり約１モルから８モルである。タンパク質に対するＰＥＧ− クロロ蟻酸塩の活性エステル（ＰＥＧ　−ＰＮＰ）のモル過剰分は、好ましくは 、アミノ基の誘導体化のためのＣ３Ｆ−１２量体１モルあたり約５モル未満であ り、さらに好ましくはＣ５Ｆ−１１モルあたり約１モルから２モルである。

一般に、この方法には、活性化重合体を調製することならびにその後活性化重合 体とタンパク質を反応させることが関与している。標準的には、反応は約７〜９ のｐＨの緩衝液内、往々にして、内部エステルを含まないＰＥＧ　−ＮＨＳ試薬 が用いられる場合には約１０ａＭのＨｅｐｅｓ　（ｐＨ７，５）、　１００ｍＭ のＮａＣ４で、或いは又、ＰＥＧ　−ＰＮＰ試薬が用いられる場合には約５０１ のホウ酸ナトリウム（ｐＨ９）で行なわれる。これら両方について以下に記述す る。反応は一般に約２０分から約１２時間０°Ｃから２５°Ｃで、好ましくは２ ０°Ｃで２５分から３５分又は４°Ｃで３時間、行なわれる。複合の後、望まし い生成物が回収され、カラムクロマトグラフィなどによって純化される。

活性ＰＥＧを用いた修飾反応は、単数又は複数の段階を用いて、以下に記す数多 くの方法で実行できる。一段階反応で活性化ＰＥＧを生産するのに用いることの できる適当な修飾剤の例としては、塩化シアヌール酸（２，４，６−１リクロロ −３−）リアジン）及びフン化シアヌール酸がある。

１つの好ましい実施態様においては、変更反応は２段階で行なわれ、ここにおい てＰＥＧ　−ＯＨはまず第一に無水コハク酸又は無水グルタル酸といった無水酸 と反応させられてカルボキシル酸を形成し、次にカルボキシル酸はこれと反応で きる１つの化合物と反応させられて、タンパク質と反応しうる反応性エステル基 と共に活性化されたＰＥＧを形成する。かかる化合物の例としては、Ｎ−ヒドロ キシスクシニミド、スルフオーＮ−ヒドロキシスクシニミド、４−ヒドロキシ− ３−二トロベンゼンスルフォン酸などが挙げられる。好ましくは、Ｎ−ヒドロキ シスクシニミドが用いられる。

例えば、モノメチル置換ＰＥＧを高温例えば約１００″Ｃから１１０°Ｃで４時 間、無水グルタル酸と反応させることができる。

こうして生産されたモノメチルＰＥＧ−グルタル酸は、次にジシクロヘキシル又 はジイソプロピルカルボジイミドといったカルボジイミド試薬の存在する中でＮ −ヒドロキシスクシニミドと反応させられ、活性化重合体、メトキシポリエチレ ングリコール−Ｎ−スクシニミジルグルタル酸塩を生成し、これは次に純化後の タンパク質と反応させることができる。

この方法については、Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ他、Ｃａｎｃｅｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍ 、　Ｂｉｏ−勘ヱＬユニ　１７５−１８６　（１９８４年）内に詳述されている 。

もう１つの例においては、モノメチル置換ＰＥＧを無水グルタル酸と反応させ、 その後ジシクロへキシル力ルボジイミドの存在スる中で４−ヒドロキシ−３−ニ トロベンゼンスルフォン酸（ＨＮＳＡ）と反応させて、活性化重合体を生成する ことができる。ＨＮＳＡについては、Ｂｈａ　ｔｒａｇａｒ他著ｂ１０吏狙：Ｓ 　ｎｔｈｅｓｉｓ−５ｔｕｒｃｔｕｒｅ−Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、　ＰＩ旦藏且（堕 」ｆ　ＳｅｖｅｎｔｈＡｍｅｒｉｃ旦）■佳服見−５ｙ年ｐ担＋ｎ　（ペプチド ：その合成−構造−機能、第７回米国ペプチドシンポジウム議事録）　、Ｒ＋ｃ ｈ他（ｅｄｓ、）（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ 　ＩＬ＋　ｌ９８１年）　、ｐ９７−ＩＱＱ、　Ｎ１ｔｅｃｋｉ他著坦ＩＬｋ蝕 ｌ江郊ｌ」犯中シ騰、Ｖｉｒｕｓ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ（ウィルスワクチンへのハ イテクの道）（Ａｍｅｒｉｃａｎ　５ｏｃｉｅｔｙｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ｏｇｙ　；　１９Ｂ５年）、ｐ４３−４６　（Ｘ９８４年１１月８日〜１０日の 座談会に基づ（）、表題’Ｎｏｖｅｌ　Ａｇｅｎｔ　ｆｏｒ　Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ｔｏ　Ｃａｒｒｉｅｒｓ　ａｎｄ　Ｉ ｔｓ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　（担体に対する合成ペプチドの新しいカップリ ング剤とその応用）」。

ならびにへｌｄｗｉｎ他著、Ａｎａｌ、β１ｏｃｔ＋ｅｇ、　（１９８７年）　 １６４　：　４９４−５０１の中で記述されている。これら全ての開示は、本書 中に参考文献として内含されている。

エステル結合はアミド結合に比べて化学的及び生理学的により反応性が高いため 、最終生成物の中でエステルを生成しない活性化ポリエチレングリコール分子と タンパク質を誘導体化することが好ましい可能性がある。

１実施態様においては、ＰＥＧは、出発物質としてＰＥＧ−アミン又はＰＥＧ　 −ＯＨを用いてタンパク質に対する付着のために活性化されうる。ＰＥＧ　−０ １１は、本書中にその開示が参考文献として内含されているＶ、Ｎ、Ｒ，Ｐｉｌ ｌａｎ他のＪ、Ｏｒ　ａｎｉｃ　Ｃｈｅｍ。

旦：　５３６４−５３７０　（１９８０年）により記述されているように、ＰＥ Ｇ−アミンに変換されうる。簡単に言うと、５ＰＥＧ　−ＯＨをｍＰＥＧ　−ト シル化物にその後ｍＰＥＧＰＥ用イミドに変換することによりモノメチルＰＥＧ −アミン（ｍＰＥＧ）が調製され、フタルイミドはヒドラジンで分詞されて、ガ ブリエル合成でｍＰＥＧ　−ＮＨ，を生成する。次にｍＰＥＧ−’アミンは室温 にて約４時間無水グルタル酸と反応させられ、ｍＰＥＧ　　ＮＨＣＯ（ＣＨ２） ３ＣＯＯＨを生成する。反応後、生成物を沈殿させ、純化させ、Ｎ−ヒドロキシ スクシニミド及びジシクロへキシルカルボジイミドと反応さ化合物を次に、Ｃ５ Ｆ　−１ポリペプチドの適当な遊離アミノ基と反応させることができる。

もう１つの実施態様において、かかる接合に有用なポリエチレングリコールカル ボキシル酸の活性エステル形態は、Ｎ１ｔｅｃｈｉ他、Ｐｅ　ｔｉｄｅ　Ｃｈｅ ｎ＋１ｓｔｒ　　１９８７％、５ｈｉｂａ　＆　５ａｋａｋｉｂａｒａ（Ｅｄ） 、　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（タンパク質研 究基金）、大阪（１９８８年）の中で記述されている。簡単に言うと、活性エス テルは以下のような化学式を有している：Ｒ’　−（０−ＣＨ２−ＣＬ）ｌ、− ０−（ＣＨＲ”）−Ｃｏ−ＯＬＧ　　（１）又はＲ’　−（０−ＣＨ２−ＣＨｚ ）ｎ−１−０−ＣＨｚ−ｃｏ−ＯＬＧ　　（ＩＩ）なお式中、Ｒ′は１〜４個の 炭素原子の低級アルキル基であり、Ｒ２はＨ又は−有機置換基であり、ｎは約８ 〜５００、ＬＧは、シアノメチルの中から選ばれた脱落基、芳香族基をより不安 定にする１〜５個の置換基と置換されたフェニル又はナフヱニル基の中から選ば れた芳香族基及びこれらの置換基を１〜４個選択的に含むピリジル基である。こ れらのエステルは、化合物Ｉにってはアルファーハロアルカン酸又はそのエステ ルでのポリエチレングリコールのアルキル化とそれに続＜８Ｏ−Ｃ）ｌ、−ＣＮ 又はＬＧに相当する基でのエステル化によって、或いは又化合物（ＩＩ）につい てはその酸へのＰＥＧの酸化とそれに続＜ＨＯＣＨｚ　　ＣＮ又はＬＧに相当す る基でのエステル化によって生成されうる。、最も好ましくは、化学式Ｉが調製 され、活性化剤は、パラ−ニトロフェノール又はオルトニトロフェノールである 。最も好ましくは、重合体のパラ−ニトロフェニルエステルがら形成されたアミ ド結合を介して、重合体をタンパク質に接合させる。例えば、ＰＥＧ−ＯＨをＰ ＥＧ−０−１，：変換させＢｒＣＨｚＣ（ｈｃＨｓと反応させたり、メチルエス テルを加水分解させたり、酸をジシクロへキシルカルボジイミドの存在する中で −Ｐ−一二トロフェノールと反応さこの重合体の方は、精製の後、Ｃ５Ｆ−１の 利用可能な遊離アミノ基と反応させられる。

もう１つの実施Ｂ様においては、ＰＥＧ　−ＯＨはクロル蟻酸塩（クロロカーボ ネートとも呼ばれる）と反応させられ（ＰＥＧ−ＰＮＰ）とも呼ばれるＰＥＧ活 性エステルを形成する。ＰＥＧ活性エステルが形成されると、これをＣ５Ｆ−１ と反応させてＰＥＧ／ＣＳＦ　−１接合体を形成する。その全体が本書中に参考 文献として内含されているＶｅｒｏｎｅｓ４の１９８５年、Ｂｉｏｃｈｅ＋＋、 ａｎｄＢｉｏｔｅｃｈ、　１１　：　１４１−１５２も同様に参照されたい。ク ロル蟻酸塩は、Ａｌｄｒｉｃｈといった会社から購入できる。これを以下に等式 （１）に示されているように作ることも可能である。

クロル蟻酸塩は、塩化カルボニルとしても知られているホスゲンを、−ＯＢを有 する炭素上に電子求引性置換体を含むアルコール（Ｒ−ＯＨ）と反応させること によって作られる。アルコールは好ましくは酸性アルコール、さらに好ましくは 高い消衰係数をもつ芳香族環を含む酸性アルコールである。Ｒ基の例は、以下の ようなものである二Ｎ−ヒドロキシースクシニミド、Ｎ−ヒドロキシースルフォ スクシニミド、シアノメチルエステル、ベンゼン、ナフタレン上の全てのニトロ 、クロロ及びシアン置換、又はピリジン、パラニトロフェノール（ＰＮＰ）　、 オルト−ニトロフェノール（ＯＮＰ）などの、ペテロ原子を含んでいても含まな くてもよいさらに大きい芳香環系なとである。最も好ましいＲ基はＰＮＰ及びＯ ＮＰである。

クロル蟻酸塩が形成されると、これはＰＥＧ　−ＯＨと反応させられて等式（２ ）に示されているようにＰＥＧ活性エステルを形成する。

（２）　　ＰＥＧ−ＯＨ＋Ｃｌ−Ｃ−０−Ｒ−＋ＰＥＧ−０−Ｃ−０−Ｒ＋ＨＣ １！ＰＥ用蟻酸塩は、２つのサイトすなわち塩素とカルボニル基の間の結合（比 較的反応性が高い）及びカルボニルと０−Ｒ基の間の結合（比較的反応性が低い ）において反応性を有する。さらに反応性の高いサイトは、クロル蟻酸塩がＰＥ Ｇに結合するところである。ＰＥＧ　−ＯＨ及びクロル蟻酸塩は好ましくは、Ｃ ＨＣｆ　、又はＣＨ，（／！、といった適当な溶剤中で室温にて同時に付加され る。好ましくは、０時間から１時間後までの間にアシル化触媒が加えられる。好 ましくはこの触媒はピリジン又はジメチルピリジンである。好ましくはクロル蟻 酸塩は、最高１２Ｍの過剰分さらに好ましくは２Ｍの過剰分になるまで付加され る。この混合物を好ましくは４時間さらに好ましくは１６時間混合させる。この 時点で、沈殿物が形成する可能性がある。この沈殿物は、ろ過により除去される か又は廃棄される。ホワットマングラスファイバフィルタ　（ＧＨ／Ｂ）といっ たろ過装置が受容可能である。結果として得られる溶液にはＰＥＧ活性エステル ならびに未反応のＰＥＧ及び過剰のクロル蟻酸塩が含まれている。これはエーテ ルを付加することにより沈殿させられる。好ましくはエーテルはジエチルエーテ ルである。沈殿物は、ＰＥＧ活性エステルを含み、エーテルといった適当な溶剤 を用いて洗浄され、必要とあらば再度溶解又は再度沈殿させることができる。Ｐ ＥＧ活性エステルが形成されると、等式（３）に示されているようにＣ５Ｆ−１ とこれを複合させる： （３）　　ＰＥＧ　　ＯＣＯＲ＋ＮＨｚ　　ＣＳＦ　　１→ＰＥＧ−０−Ｃ−Ｎ Ｈ−Ｃ５Ｆ−１＋ＲＯＨＰＥＧ活性エステルのクロル蟻酸塩部分はなお、利用可 能な反応性の比較的低いサイトを有している。このサイトでは、ＰＥＣとＣ５Ｆ −１の間の共有結合が形成される。最終生成物の中では、ＰＥ０部分はカルバミ ン酸塩とも呼ばれるウレタつ。この結合は比較的安定しており、生理学的条件の 下でほとんど又は全く加水分解な（ＰＥＧをＣ３Ｆ−１に複合された状態に保つ ことになる。

大腸菌からのホモダイマー組換え型Ｃ３Ｆ−１は、再生が適切に完了された後は 、多数の反応性遊離スルフヒドリル基を含んでいない。しかしながら、クローン を遺伝子的に変更して、再生の後もスルフヒドリル基を保持しうる単数又は複数 の新奇のシスティン残基を含み入れることも可能である。このように生成された Ｃ５Ｆ−１突然変異タンパク質はなお、ここにおいて有用であるべく存意な生物 活性を保持していなくてはならない。

あるいは、ＣｙＳｒｓｑ上といったいくつかのＳＨ基が活性化重合体による変更 に使用可能となるようにホモダイマーを部分的に再生するか又は選択されたヘテ ロダイマーを作り出すことによって、遊離スルフヒドリルを生成することができ る。

システィン残基を介してタンパク質が複合される場合、好ましい接合様式は以下 のとおりである：すなわち、上述のようなｍＰＥＧ−ＮＨｚは、好ましくは０． ５時間から１．５時間室温で、Ｎ１ｔｅｃｋｉ他、肛肢ｄ匹Ｉ蛙匹１薗山山主力 」Ｌハ匹ｎ競（Ａｎ＋ｅｒ、Ｓｏｃ、ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　１９８５ 年）　ｐ４３〜４６、（前述）により記述されている４−ヒドロキシ−３−二ト ロベンゼンスルフォン酸のＮ−マレイミド−６−アミノカプロン酸エステル（ｍ ａ　１−　ｓａｃ　−ＨＮＳＡ）と反応させられる。かかる反応は好ましくは、 ＰＥＧ　−ＮＨ，に対し約５倍のｏｐａｌ　−５ａｃ　ＨＮＳＡのモル過剰分で 、行なわれる。加水分解された又は未反応のｍａｌ　−５ａｃ　ＨＮＳＡの除去 （例えば、透析、ダイアフィルトレージョン又はサイズ排除クロマトグラフィに よる）の後、次に、等モル量の試薬及びタンパク質を用いて緩衝液内で室温でタ ンパク質と試薬を反応させることができる。Ｎ−スクシニミジル−４−（Ｎ−マ レイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシル酸塩（ＳＭＣＣ）又はＨ ＣＬＣＯＮＨ（ＣＨｚ）ｓ　　ＨＮＳＡエステル（なお式中ＸはＢｒ、ＣＩ又は ！である）といったその他の試薬も、当業者にとっては周知のさまざまな反応条 件の下でｏｐａｌ−ｓａｃｌ（ＮＳＡと同じ機能を果たすことができる。

１金止■精星 接合反応の後、反応条件に応じて異なるアイデンティティを有する種の混合物が 存在する可能性がある。Ｃ３Ｆ−１に対し接合されたＰＥ０部分の数において異 なるこれらの種は、クロマトグラフィ、電気泳動及び塩分別を含むさまざまな方 法により分離されうる。フェニル−セファロースを用いた疎水性相互作用クロマ トグラフィ（旧Ｃ）が特に有用であることが示された。非還元性ＳＯＳ　−ＰＡ ＧＥ又は分子ふるいクロマトグラフィを用いてサイズ分離を達成することもでき る。さらにＣＳＦ〜１接合体ならびにインターロイキン−２（ＩＬ−２）といっ たその他のタンパク質の接合体の塩析も有用であることが立証された。一般に用 いられる塩は硫酸アンモニウム、（ＮＨ４）ｚｓＯ４；硫酸ナトリウム、Ｎａｚ ＳＯｎ　ｐマグネシウム塩及びリン酸塩である。複合度の高い種は、接合度の低 いタンパク質及び未接合タンパク質に比べて低い塩濃度で沈殿した。部分的に精 製された種のこれらの技術のうちのいずれかを通しての再循環は、結果として、 タンパク質１分子あたりの重合体数に関しほぼ相同の接合タンパク質種をもたら す可能性がこのように変更され選択的に接合程度に関し精製されたタンパク質は 、次に、好ましくは約３から８さらに好ましくは５から８のｐｏで、非毒性の安 定した薬学的に受諾可能な水性担体媒質に製剤される。投与は、従来のプロトコ ル及び養生法によるが、好ましくは静脈内投与を含む全身系のものである。診断 目的といった生体外応用については、投与様式や製剤形態は重要ではない。一般 には、培養基又はがん流媒質と相客性のある水性製剤形態が用いられる。治療の ため生体内で用いられる場合、かかる化合物は当該技術分野において既知のとお り、注入用の水、緩衝液及び安定剤といった従来の生理学的に受諾可能な賦形剤 を含んでいてもよい。マンニトールといった水溶性の担体もオブシーンとして媒 質に付加することができる。

修飾Ｃ５Ｆ−１は、単独の有効成分としてでも又相補的活性をもつその他のタン パク質又は化合物と組合わせた形ででも使用可能である。かかるその他の化合物 としては、ＩＬ−１゜−２，−３，−４インターフエロン（アルファ、ベータ又 ハガンマ）といったリンフ才力インのアドリアマイシン、ＧＭ　−ｃｓｐ　、　 Ｇ−Ｃ５Ｆ及び腫瘍壊死因子などの抗腫瘍剤が含まれうる。変更Ｃ３Ｆ−１の効 果は、このような付加的な成分の存在により改良されうる。タンパク質を含む薬 学的化合物についての製剤技術の要約は、例えば、匙舶ｙぶ４　（Ｒｅｏ＋ｉｎ ｇ−ｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｎｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ）、　Ｍａｃ ｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、＋Ｅａｓｔｏｎ＋　ＰＡ、最新版に記されて いる。

製剤内のタンパク質の用量レベルは、臨床前試験の後に得られた生体内効力デー タにより左右され、臨床応用に応じて変化する。タンパク質が中に溶解される媒 質は、混合物が再組成された時点で薬学的に受諾可能なｐＨにある。

製剤が凍結乾燥される場合、凍結乾燥された混合物は、バイアル（小びん）の中 に例えば注射用精製水といった従来の非経口水性溶剤を注入することによって再 組成されうる。

前述のように調製された再組成された製剤は、治療上有効な量（すなわち、死亡 率又は受諾不可能な罹病率なく患者の病理状態を削除又は軽減する量）でヒト又 はその他の哺乳動物に対し経口外投与し治療を与えるのに適している。ＣＳＦ　 −１療法は、免疫系の強化、マクロファージの細胞毒性作用の強化、単核細胞及 び果粒細胞白血球数の増加、サイトメガロウィルスや細菌感染（例えばダラム陰 性セプシス）といった感染性疾患の、哺乳動物に対する治療的又は予防的投与に よる処置、哺乳動物におけるサルコーマ（肉腫）又はメラノーマ（黒色腫）とい った腫瘍の苦しみの治療、コレステロール血症（Ｎｉｍｅｒ他、　（１９８８年 ）　ＪＡＭＡ　２６０　；　３２９７−３３００ニよりＧＭ−Ｃ５Ｆについて記 述されているようなもの〕の治療、及び／又は、哺乳動物における創傷の治ゆと いったさまざまな適応症に対して適切でありうる。さらに、Ｃ３Ｆ−１は、本書 中にその開示が参考資料として内含されている、１９８８年７月６日に公示され た欧州特許公報第０２７３７７８号の中に記述されているように、免疫系の刺激 のためＧ−Ｃ３Ｆと組合わせることができる。

接合Ｃ５Ｆ−１の用量及び投与量法は、例えば、薬物速度論、疾病又は状態の内 容、重合体のタイプ及び長さ、特定のＣ５Ｆ−１の特性例えばその治療指数、活 性スペクトル、患者及び患者の既往症などにより左右される。さまざまな変更ｃ ｓｐ　−１タンパク質は、異なる投与経路にとって有利な異なる薬物速度論上及 び治療上の特性を有していると予想される。長く作用する薬物は、３〜４日に一 度、−週間に一度又は２週間に一度投与するだけでよい。浄化率は、例えば重合 体のタイプ、付着される重合体のサイズ、及び重合体が付着されるアミノ酸配列 を変えることによって患者の特定的ニーズに合わせるべく最大限の柔軟性を与え るよう変化させることができる。

本発明をさらに詳しく示す以下の例においては、全ての割合及び百分率は相反す る指示のないかぎり重量での割合であり、全ての温度は摂氏温度である。

廿Ｌ−に 結合方法１による、ＰＥＧ化されたＣ５Ｆ　１の調製Ａ、：　　　　れたＰＩＧ 　−Ｎｌ２の礼１１まず第１にＵｎｉｏｎ　Ｃａｒｂｉｄｅ社から入手可能なモ ノメチルＰＥＧ−７０００を１００℃から１１０　”Ｃで４時間無水グルタル酸 と反応させることによってか或いは又本書にその開示が参考文献として内含され ているＡｂｕｃｈｏｗｓｋｉ他の偽匹と」力回目１注旺■Ｌ７　：　１７５−１ ８６　（１９８４年）の方法に類似した方法によって、平均分子量７０００のモ ノメチルＰＥＧの線形エステルを得ることができる。結果として得られたＰＥＧ グルタル酸塩を、Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ他（前述）が２１７６で詳述しているよ うに、ジシクロへキシルカルボジイミドが存在する中で、Ｎ−ヒドロキシスクシ ニミドと反応させた。その結果得られた生成物は、メトキシポリエチレングリコ ールＮ−スクシニミジルグルタル酸塩であり、以下これをＰＥＧ★−７０００と 呼ぶ。ＰＥＧ　−４８００（Ｕｎｉｏｎ　Ｃａｒｂｉｄｅ社から入手可能）を同 じ方法で反応させた結果、ＰＥＧ★−４８００が得られた。

ＰＥＧ−１１，０００グルタルアミドＮＨ３種（ＰＥＧ”　−１１０００）は、 Ｐｉｌｌａｉ他、Ｊ、Ｏｒ　、Ｃｈｅｍ、　４５　：　５３６４　５３７０　（ １９８０年）の手順に従って以下のように調製された：すなわち、Ｕｎｉｏｎ　 Ｃａｒｂｉｄｅ社から入手した平均分子量１１０００ダルトンの線形モノメチル ＰＥＧ　（１、５ｍｍｏ　１２　ｅ）をまず１０＃ｌｌ！の塩化メチレン内で溶 解させ、次に１．８　ｌＩｒ１（２２，２ｍｍｏ　Ｉ！　ｅ）のピリジン及び６ ．０　ｇ　（３１，６＋ｕ＋ｏ　ｊ２　ｅ）のｐ−トルエン−スルフォニル塩化 物を加えた。フラスコは窒素でフラッシングし、反応混合物は一晩室温で撹拌し た。混合物を約５ｄまで濃縮し、生成物を７５−のエチルエーテルで沈殿させた 。沈殿物を収集しエーテルで洗浄した。生成物（ｍＰＥＧ　）シル化物）は、エ タノールから再晶出された。

２０ｄのジメチルホルムアミドの中にｍＰＥＧ−トシル化物（約１　、５ｍｍｏ 　ｉ、ｅ）を溶解し、２．５　ｇ　（１７，抛ｍｏ　１２　ｅ）のカリウムフタ ルイミドを加えた。４時間、窒素下の還流で溶液を加熱した。

形成した沈殿物をろ過してとり除き、ろ液を３００ｍのエーテルに滴下して生成 物を沈殿させた。沈殿物をろ過してエーテルで洗浄した。３０ｍ１の塩化メチレ ンの中で生成物を懸濁させ、０．５時間撹拌した。不溶性の不純物をろ過してと り除き、生成物（＋ｗＰＥＧ−フタルイミド）をエーテルで沈殿させた。次に、 １５ｄのエタノール内にｍＰＥＧ−フタルイミド（約１．１ｍｍｏｆｅ）を溶解 させ、２．　Ｏｔａｉｌ　（４１，２ｍｍｏ　ｉ！　ｅ）のヒドラジン水和物を 加えた。

混合物を一晩還流させた。反応混合物を室温で冷却し、生成物をエステルで沈殿 させた。

沈殿物はろ過により収集し、２５ｄの塩化メチレン内で再度懸濁させた。不溶性 の不純物をろ過して取り除き、エーテルで沈殿させた。この沈殿物、ｎ＋ＰＥＧ −１１０００７ミンをＣＨｚＣｌ　ｚ内で懸濁させ、ろ過し、エーテルでさらに ２回沈殿させた。

２回目に、この沈殿物は塩化メチレン中に完全に溶解できた。

１０ｄのジオクサン中に合計０．５ｇのｍＰＥＧ−１１０００−アミンを溶解さ せ、これに０．２５ｇの無水グルタル酸を加えた。室温で４時間反応させた。反 応後、生成物ｍＰＥＧ　　ＮＨＣＯ（Ｃ）ｈ）ｚｃＯＯＨを約１００ｄのエーテ ルで沈殿させた。混合物をろ過し、生成物をＣＨｚＣｆｌ　ｚ内に溶解させ、エ ーテル内にろ過し、ろ過、乾燥させた。生成物の収量は２００■であった。

次にｍＰＥＧ　　ＮＨＣＯ（Ｃ）１ｇ）ユＣ０ＯＨを、ＰＥＧ★７０００のため 前述したヨウニジシクロへキシルカルボジイミドの存在する中でＮ−ヒドロキシ スクシニミドと反応させた。結果として得られた生成物は、ここではＰＥＧ”− １１０００と呼ばれる。

Ｂ、　　Ｃ５Ｆ−１の　　１と ５Ｃ３Ｆ／Ｎ３Ｃ１５８遺伝子を含むプラスミドｐＪＮ６５３　（かかるプラス ミドは１９８７年１１月１２日付でＡＴＣＣ第６７５６１号として供託されてい る）で形質転換された大腸菌株Ｈ−２２を、６．５ｇ／ｊ！のグルコース、２． ２＋ＭＭのＭｇ５Ｏ＊　４７８ｚＯ１９５岸のＰｅ５ｏ４・７８ｚＯ１及び２６ ■／！のチアミン・）Ｉ（Ｊの無菌付加を伴い、１０というＯＤ、＠ｏｎ、に達 するまで３０°Ｃで、９６ｍＭの（ＮＨ，）ｚｓＯｎ　、２８１１ＭのＫＨｚＰ Ｏａ　、４　＋ａＭのクエン酸Ｎａｓ　−２ＨｚＯ、１，７ｄ／　ｉ＜のＴＫ９ 　（３抛ＨのＺｎ５Ｏ−、３０ＩＩＩＭのＭｇ５Ｏａ　、　　１＋ＭのＣｕ５Ｏ ａ）を含む基本培地の中で１０リットル入り発酵槽内で成長させた。次にカザミ ノ酸を２％−／ｖ、まで付加した。培養温度を３７°Ｃにまで上昇させることに より、Ｃ３Ｆ−１表現を誘発した。４時間後、６８０ｎｍでの吸収率は７９に達 した。

細胞を５倍の濃度で収穫し、Ｄｏｒｒ−０１ｉｖｅｒ接線交差流微孔性ろ過を用 いてｐｎｓ、ｓで５ｍＭのＥＤＴＡＩＯ体積に対し分別ろ過した。細胞をＭａｎ ｔｏｎ−Ｇａｕｌｉｎの高圧機械式細胞ホモジナイザーの中に７５００ｐｓ　ｉ で３回通過させることにより分析した。０．１％（ｖ／ｖ）まで１−オクタツー ルを付加し、ホモゲネートを４°Ｃで一晩保持した。

このホモゲネートを、６３％（ｗ／ｖ）のスクロース（しょＩり溶液を付加する ことによって２５％のスクロースにした。９０００×ｇ、１リットル／分及び４ 〜６°Ｃでの連続流ディスクスタック遠心分離（Ｗｅｓｔｐｈａｌｉａ　５Ｂ７ ）により細胞デプリから不溶性タンパク質分画（屈折力ある物質）を分離した。

湿潤な沈殿物を５０　：　５０（ｗ／ｖ）で脱イオン水と混合し、−２０°Ｃで アリコート内に保存した。

屈折力ある物質の懸濁物２５グラム（約３９０■のタンパク質）を、２５ｓ＋Ｍ のＴｒｉｓ＋　１０＋ｓＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８，４）、１＋Ｍの エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）及び４ｍＭのジチオスレイトール（Ｄ ＴＴ）を含む８Ｍの尿素２５０−の中で可溶化した。室温で２時間置いた後、１ ５分間１５０００ｘ　ｇでの遠心分離により溶液を清澄させた。次に、２５ｍＭ のＴｒｉｓ＋　１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）を含む６Ｍの 尿素内で平衡化された５％８ｍのＤＥＡＥ−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ）カラム上に、可溶化したＣ５Ｆ−１の１５０ｄのアリコートを装入した。カラ ムは１ｍＭのＤＴＴと１ｍＭのＥＤＴＡを含むよう変更された上述の溶液１ベツ ド容積（ｂｅｄ　ｖｏｌｕｍｅ）で洗浄し、次に、洗浄緩衝液内で０〜０．６Ｍ の塩化ナトリウムの１．４リツトルの塩勾配でＣ３Ｆ−１を溶離させた。Ｃ５Ｆ −１は、約０．０６Ｍの塩化ナトリウムでピーク溶離を示した。次に残りの９０ ｄの可溶化された屈折力ある物質を、同様のやり方でＤＥＡＥ−セファロースカ ラム全体にわたり純化させた０組合わせたＣ５Ｆ−１プール（１６５ｄ）は、約 ５０％の純度で約２５０■のタンパク質を含んでいた。

次に、４°Ｃに予め冷却された５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８，５）　、　　５　 ｍＨのＥＤＴＡ　、　２　ｍＭの還元グルタチオン、１ｍＭの酸化グルタチオン を含む再生用緩衝液の中へＤＥＡＥ−プールを希釈させることによって、Ｃ３Ｆ −１を再生した。４℃で３０時間Ｃ５Ｆ−１を再生させた。再生されたＣ５Ｆ− １のｐ）ｌを次に、８．５％のリン酸溶液を用いて６．８に調整した。その後、 １５０００Ｘ　ｇで１０分間遠心分離により溶液を清澄させ、１０ｍＭのリン酸 ナトリウム、２５ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ６，８）内で予備平衡化された５％４ｃ ｍのＤＥＡＥセファロースカラム上に装入した。かかる緩衝液３００Ｉｄでカラ ムを洗浄し、次に同じ緩衝液系内で７００ｄ、Ｏ〜０．６Ｍの塩化ナトリウム勾 配で溶離させた。Ｃ５Ｆ−１は、約１２０ｍＭの塩化ナトリウムで溶離した。次 に、１Ｍの最終濃度に達するまで９５ｄのＤＥＡＥプールに対し硫酸アンモニウ ム１４Ｍの原料（スト・ツク）、ｐＨ７，０）を加えた。次にＮａｌｇｅｎｅの ０．４５ミクロンのフィルターを通してＣ５Ｆ−１をろ過し、発熱物質が除去さ れた１、５Ｍの硫酸アンモニウム、０．１Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ７，０） 内で平衡化された２１．５Ｘ１５０　ｒｌｌｎのＢｉｏ−Ｒａｄ　ＴＳＫフェニ ル−５−ＰＷカラム上に装入した（４°Ｃで）。カラムをかかる装入用緩衝液２ ベツド容積（ｂｅｄ　ｖｏｌｕ＋＋＋ｅ）で洗浄し、次に、硫酸アンモニウム濃 度が１．５ＭからＯＭに減少しエチレングリコール濃度が０〜６％（ｖ／ｖ）か ら増加した４５分の勾配を用いて、０．１Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ７，０） で溶離させた。

全ての作業は、基本的に発熱物質の無い条件の下で４℃で行なわれた。Ｃ３Ｆ− １は、３０％のエチレングリコール内で約０．６Ｍの硫酸アンモニウムで溶離し た。次に、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む１０−ＭのＨｅｐｅｓ緩衝液（ｐ Ｈ７，５）内へＣ３Ｆ−１を広範に透析させ、その後、Ｍｉｌｌｅｘの０．４５ ミクロンのフィルターを通してフィルター滅菌した。

約５０■の精製５ＣＳＦ／Ｎ３Ｃ１５８Ｃ５Ｆ　−１を得た。９０％以上の最終 Ｃ３Ｆ−１生成物がＳＤＳ　−ＰＡＧＥ上で単一の種として移行し、同じ生成物 は、アセトニトリル／ＴＦＡ内でＲＰ　−ＨＰＬＣにより分析した場合的９６％ が単一種であった。比活性は約１．５−１．７　ＸＩＯ”単位／■テアッた（単 位は、Ｃ５Ｆ−１依存型細胞系を用いて単位当量を形成するコロニーとして決定 され、タンパク質濃度はＡ　ｚ　１１゜閣を用いて決定され、０．６という消衰 係数はアミノ酸化合物の決定から見積られた）、この比活性は、純化された天然 のＭｉａ　ＰａＣａ　ＣＳＦ　−１のものよりも大きくはないにせよ、少なくと も同等である。ＬＡＬアッセイにより決定される、再生され純化されたＣ５Ｆ− １生成物のエンドトキシン（内毒素）含有量は、Ｃ３Ｆ−１１■あたり０．５〜 ｌｎｇであった。

同様の要領で、欧州特許公報第０２７２７７９号に記述されているような５Ｃ５ Ｆ／Ｎ２Ｃ１５０をコード化するＤＮＡからＰＬプロモータの制御下で生産され た大腸菌タンパク質を、同様に再生させ純化させた。大腸菌を形質転換するのに 用いたベクターは、Ｎ末端ｇｌｕ−ｇｌｕを欠失したＣ５Ｆ／Ｎ２をコード化す るため適当なＣ３Ｆ−１７ベクターの切除されたＨｉｎｄ　ｍ　／　ＢｓｔＸＩ ＤＮＡに対し適当な合成フラグメントを置換することにより調製された。

Ｃ９Ｃ５Ｆ−１に・　るＰＥＧ★−７０００の　ム第Ｂ節中（Ｄ　Ｃ５Ｆ　−１ タンハクｉｔ　（ＳＣＳＦ／ＮＶ２ＣＶ１５０）　ヲ、１００ｍＭのＮａＣｊ２ を含むｐＨ７，２の１０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液の媒質内に透析させた（１■の タンパク質＃）。ＰＥＧ★−７０００ヲ２゜速に少量の水の中に溶解させ、直ち にタンパク質溶液に付加し、これを反応中連続的に撹拌した。Ｃ３Ｆ−１２量体 に対し３倍から３０倍のモル過剰分のＰＥＧ★−７０００を用いた。反応は２０ °Ｃで約３０分、４°Ｃで約３時間で完了した。

サイズ除外ＨＰＬＣで試料を分析した。第３Ａ図は、実験に先立っての誘導体化 されていないｒＣＳＦ−１（ＳＣＳＦ　／　Ｎ２Ｃ１５０）試料のクロマトグラ ムを示している。第３Ｂ図は、２０°Ｃで３０分間ＰＥＧ★−７０００の５倍の モル過剰分で誘導体化された後の同じＣ５Ｆ−１試料１００■クロマトグラムを 示している。

５ｔａｎｌｅｙ＋　Ｒ−及びＧｕｉｌｂｅｒｔの方法、Ｊ、Ｉｍｍ、Ｍｅｔｈｏ ｄｓ　４２　：　２５３−２８４　（１９８１年）に従って行なわれた放射線免 疫検定法は、第３Ｂ図に見られる最初の３つの主要な吸収ピークがｒＣＳＦ−１ を含んでいることを確認した。表Ｉを参照のこと。

分画３０　、３２　、３４　、３６　、３７　、３８　、３９　、４１及び４２ も同様に、本書にその開示が参考文献として内含されているＭｏｏｒｅ他、ムＩ ｍｍｕｎｏ１．　（１９８３年＞　１３１　：　２３９７及びＰｒｙｓｔｏｗｓ ｋｙ他Ａｏ＋、Ｊ、Ｐａｔｈｏｌ。

（１９８４年）　１１４　；　１４９により記述されているマウス骨髄検定法を 用いて、生物活性について分析された。表■が、結果を示している。

に−Ｌ ＰＥＧ★−７０００での誘導体 クローン：　５Ｃ５Ｆ／Ｎ２Ｃ１５０ 生物活性 立厘互□　　　ＬＪＬ　　　ＲＩＡｌ　　　止−皇二３２　　　　　　５１９０ ０　　　２８８．０００　　　　０．１Ｂ３４　　　　　１７５．１００　　　 ５７６．０００　　　　０．３０３６　　　　　２１０．７００　　　　４５４ ０００　　　　０．４６３７　　　　　５２２０００　　　　８８６０００　　 　　０．５９３８　　　　　８０９３００　　　　４４５０００　　　　１．８ ２３９　　　　　６６０．０００　　　　３４８０００　　　　１．９０４１　 　　　１２８１．０００　　　８００，０００　　　　１．６０４２　　　　１ ．０４８，０００　　　＞１．０００，０００．−　　　　Ｎ　Ｄａ８分画は、 約１０００ＲＩＡ　Ｕ／ｄまで希釈した後に検定された。

１　単位（ユニット）数／− ２、生物活性比＝生物検定をＲＩＡで除したもの。

ＮＤ　　測定せず。

表■の結果及び以下の結果をみると、未反応のｒＣＳＦ−１及び、誘導体化され たｒＣＳＦ　−１の最小分子量ピークがほぼ完全な生物活性（実験誤差内で）を 保持したことがわかる。より大きい種は、はるかに小さい残留生物活性を保持し た。ＰＥＧ★−７０００との反応は、明らかにＣ３Ｆ−１の放射線免疫検定（Ｒ ＩＡ）反応性に著しい影響を及ぼさながったが、これは、分割されていない誘導 体化されたｒＣＳＦ　　１がタンパク質１　ｍｇあたりほぼ完全なＲＩＡ免疫反 応性を保持していたからである。

Ｄ、Ｃ３Ｆ−１に・　るＰＥＧ”−１１０００のＡ１９８８年６月２９日に公開 された欧州特許公報第０２７２７７９号の中に記述されているように構成された ベクター内でのＰＬプロモータの制御下での大腸菌内の５ＣＳＦ／Ｃ１５０をコ ード化する構成物の発現の後、生物活性あるタンパク質を精製し再生した。使用 した菌株は、プラスミド０／Ｅ　、　ｐＰｔ　Ｃ５Ｆ−１７ａｓｐｓｑ／Ｃ１５ ０（ＡＴＣＣＮα６７．３８９）で形質転換された大腸菌λ溶原、ＤＧ１１６で あった。タンパク質は、単量体不溶性形態で細胞内で生産され、ＰＣＴ公報第一 ０８８１０８００３号（前述）の中に記述されているように純化され再生された 。

１００ａ＋ＭのＮａＣｊ２を含むｐＨ７，２のＨｅｐｅｓ緩衝液の中に、タンパ ク質１−あたり１■の割合で、この純化Ｃ５Ｆ−１を合計２■透析した。　　Ｐ ＥＧ″１１０００を少量の水の中で急速に溶解させ、タンパク賞溶液内に直ちに 加え、これを反応中連続的に撹拌した。Ｃ５Ｆ−１２量体に対しテＰＥＧ”　− １１０００（７）　８倍ノモル過剰分を用いた。反応は２０°Ｃで３０分で完了 した。このＣＳＦ　−１は、５Ｃ５Ｆ／Ｎ２Ｃ１５０とＰＥＧ★−７０００の反 応ときわめて類似した形で、ＰＥＧ”−１１０００と反応した。表■が示してい るように、穏やかなＰＥＧ化（２量体１つあたり１〜２）はここでも生物活性に 対しわずかな影響しか及ぼさなかったが、一方高度に変更されたプールの活性は 著しく低下した。

盗−一１ ＰＥＧ”−１１０００及びＰＥＧ★−７０００でのｒＣＳＦ　　１の誘導体化の 比較 多数　　　　０−２０　　　　８−１１ＣＳＦ−１２量体 １つあたり１〜２　　　　１００　　　　　　　　　９０−１００１　５ＥＣ− ＨＰＬＣ及びＳＤＳ　−ＰＡＧＥにより計測された見かけの固有分子量から見積 ったもの。

第４図はＰＥＧ”　−１１，０００で誘導体化されたｒＣＳＦ−１（ＳＣ５Ｆ　 ／Ｃ１５０）　　８■のサイズ除外ＨＰＬＣクロマトグラムを示している。

図中に示されているようにプールされた穏やかに誘導体化された分画は、基本的 に完全な生物活性を保持し、サイジング時点で５ｏｏｏｏダルトン又還元されな いＳＯＳ　−ＰＡＧＥ上で４５０００ダルトンの見かけの分子量で移動すること がわかっている。

この分画は、約２０％の全体的収量で回収された。

これら２つの技術により見積られたＰＥＧ　−Ｃ５ＦＯサイズの差異は、その他 のものにより行なわれた観察と一貫している。

ＰＥＧは、ＳＤＳと結合するタンパク質の能力を変え、５ＤＳ−ＰＡＧＥ上での 移動度に影響を及ぼすことができる。又、ＰＥＧは、カラムマトリクスとの疎水 性相互作用などによってサイズ除外見積りにも影響を及ぼしうる。

リムルスアメーバ様細胞すゼイト（ＬＡＬ）検定法により検定されたこの試料の 内毒素レベルは、２８０ｎｍ　（Ａｚｓ。単位）のタンパク質で１吸光単位あた りｌｎｇ未−であることがわかった。ＣＬＡＬ検定法は−Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ 　ｏｆ　Ｃａｐｅ　Ｃｏｃｌ　！ｎｃ、＋Ｗｏｏｄｓ　Ｈｏ１ｅ、　ＭＡから入 手可能なＰｙｒｏｔｅｌｌブランドについての製品カタログ（１９８２年）によ り記述されている：ヌこれはＷａｔｓｏｎ他（ｅｄｓ）　　ｒエンドトキシン及 びリムルスアメーバ様細胞すゼイトテストによるその検出、　、匡７−じ−１ｆ ｆｉ　＋’／　ｙ１崖及ｐ１【ロノＬ役ＪＪＬヱ−ぶりＬ寿ノＬｙＺ’７１−ム ニ苔携ｌＥ胞Ａしだ／（上、Ω狭用−項閲まｊ１■議１事−鉄、Ａｌａｎ　Ｒ， ｌ、ｉｓｓ　Ｉｎｃ、。ニア）・−ヨー＝り（１９８２年）及びＬｅｖｉｎ他（ １９６４年）　Ｂｕｌｌ　Ｊｏｈｎｓ、　）！ｏｐｋｉｎｓ　Ｈｏ５ｐ、。

１１５　：　２６５によっても記述されている〕。

Ｅ、　　ＣＳＦ二上但月−り虹門５艷二１即９αｑ慶合ＰＥＧ★−４８００とク ローン５Ｃ５Ｆ／Ｃ１５０からのｒＣＳＦ　　１と反応させるために、ＰＥＧ” −１１０００の場合と同じ条件が用いられた。Ｃ３Ｆ−１をうまく誘導体化し、 穏やかに誘導体化されたプール（１つ又は２つのサイトにて）は基本的に完全な 生物活性を保持した。

Ｆ、支！」」咽机吠ゑ末（Ｉ＝１翫工江ニーＬζＬ乳灸化立木たＣ３Ｆ　−上■ 盃理立皿 平均体重が１６１ｇの３匹の誰のラット（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒ　Ｂｒｅ− ｅｄｉｎｇ　Ｌａｂｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、　ＭＡ）に対し、第８図に示さ れた前述の５Ｃ５Ｆ／Ｃ１５０クローンからのＰＥＧ”−１１０００誘導体化さ れたＣ３Ｆ−１の穏やかに誘導体化された分画を体重１　ｋＪｇあたりＩＩＩＩ ｇの割合で、尾の静脈内に注射した。留置カテーテルにより血漿試料を収量し、 ＲＩＡによりＣ３Ｆ−１の力価を測定した。０分、３０分及び１２０分の時点で 尿試料を収集し検定した。

グリコジル化された５２２アミノ酸前駆物質（ＬＣ５Ｆ）から生じる哺乳動物の 細胞（ＣＯ３）内で発現される誘導体化されていないｒＣＳＦ　　１とｒｃｓＦ 　−１を用いて、付加的なデータも収集した。

未修飾のＣ５Ｆ−１を用いた実験においてラットの平均体重は１７８ｇであり、 未修飾Ｃ５Ｆ−１を体重１ｋｇあたり１２５ｎの割合で注射した。その他の条件 は全て同じであった。

第５図は、修飾及び未修飾Ｃ５Ｆ−１タンパク質の血液浄化の時間的推移を比較 し７ている。血漿曲線の下の面積で用量を除することにより全身浄化値が計算さ れる。このデータにより、匍液中の誘導体化されたｒＣＳＦ−１の全身浄化値は 、誘導体化されていないｒＣＳＦ−１の３．８４ｄ／分／ｋｇに対し、０．３０ ２〜，７／分／ｋｇであることがわかる。このことはすなわち誘導体化されてい ないタンパク質に比較した場合誘導体されたタンパク質の滞留時間が１２．７倍 延びていることを表わしている。

第６図は、誘導体化されたＣ３Ｆ−１（ＳＣ５Ｆ／ＣＶ１５０）　（７）注射か らｊ、２０分後のラットの血漿のサイズ除外ＨＰＬＣを示している。

この図によると、血漿内のＲＩＡ検出可能なｒＣＳＦ　−１シグナルの静脈内注 射から２時間後の見かけのサイズが４３−８０ｋｄであったことがわかる。この 観察は、薬理動態の実験（１２０分で）において測定されたＲＩＡシグナルが無 傷のＰＥＧ−ｒＣＳＦ　−１及びｒＣＳＦ　　１を表わしていることを示唆して いる。Ｂｕｒ＋ａｅｔｔｅ技法（１９８１年）　、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、 　１１２　：　１９５　２０３による（ＣＳＦＩフラグメントを検出することの できる組換え型ｃｓｐ−ｉとそれに続＜ｌ２ｓＩタンパク質Ａに対する抗血清を 用いて開発されたもの）尿及び血漿の非還元ＳＤＳ　−ＰＡＧゲルのウェスタン ブロッティング法は、かかる方法により検出されたｒＣＳＦ　−１抗原が見かけ 上無傷で２量体でありかつ、注入された物質と同じサイズを有することを確認し た。

劃−」− 第２の結合方法による活性化されＰＥＧ化されたＣ３Ｆ−１の調製 ベンゾフェノンナトリウムから精製されたばかりのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ ）約２０ｄ中に０．６４ｇのナフタレンの溶液に対して０．１５ｇのＮａを加え ることにより、ナトリウム−ナフタレンを調製した。平均分子量５０００のモノ メチルポリ　（エチＬ／７グリコール）（ｒｍＰＥＧ５０００Ｊ　）をＰ２Ｏ５ の入った真空乾燥器の中で一晩乾燥した。５０ｍまでの乾燥ＴＨＦ　（精製され たばかりの）中に２．５ｇのｍＰＥＧ５０００の溶液に対してＮａ−ナフタレン 溶液を滴下した。過剰を示すべく溶液内に緑色が持続した時点で、塩基の付加を 止め、１．２　ｄのＢｒＣＨｔＣＯＯＣＨｓを滴下した。緑色は消え、混合物は 曇った。この混合物を一晩室温で撹拌した。曇った混合物を、約７０−の低温エ ーテルの入ったフラスコに注ぎ込んだ。真空ろ過により沈殿物を収集し、エーテ ルで洗浄した。乾燥した固体を１５ｄのＩＭのＮａＯＨ内で溶解させ、室温で２ ．５時間撹拌してメチルエステルを加水分解した。ＨＣＩ！を加えてｐＨを約３ に調整し、溶液を回転式蒸発器で濃縮させた。残留物をＣ）１．ｃＩ！、、内に とり込み、約１時間撹拌した。不溶性物質をろ過して除去し、溶液をエーテル内 に注ぎ込んだ。真空ろ過で固体を収集し、これをエーテルで洗浄しＰ２Ｏ，上で 真空乾燥器内にて乾燥させた。こうして、望まれたカルボキシメチルｍＰＥＧ　 　５０００酸が生み出された。この酸を滴定して、完壁な変換が起こったことを 立証した。さらに大きな規模でカルボキシメチルｍＰＥＧ　　５０００の調製を くり返した。沈殿物を収集し乾燥させた。収量は８．５ｇ、滴定は約１０２％の 酸を示した。かかる実験についての参考文献はＢｕｃｋ−ｍａｎｎ他、Ｍａｋｒ ｏｍｏｌ、Ｃｂｅｍ、　１８２　：　１３７９　（１９８１年）である。

３ｄのＣＨＣｌ　ｘＯ中に合計１ｇのｍＰＥＧ　　５０００酸（２Ｘ１０−’モ ル）を溶解させたやごの溶液に対して、０．２８ｇのニーニトロフェノール（２ Ｘ１０−’モル）を加えた。溶液は薄黄色になった。次に０．０４１　ｇのジシ クロへクシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（２Ｘ１０−’モル）を少量のＣＨＩ、 ｅｓ内に溶解させ、室温でＰＥＧ−酸溶液に滴下した。約１０分間撹拌した後、 ２ｐ１のＣＨＣｆ　３混合物を１０ｄの０．ＯＩＭのリン酸塩緩衝液（ｐｉ（７ ，０）に加えた。−Ｌ−二トロフェノール陰イオンの４００ｎｓにおける吸光度 は０．０２４４３であった。５ＮのＮａＯＨを加え、Ａ４゜。を０．５８４７に まで増大させた（エステルの％は以下の公式で計算して５８．２％である： 約３時間の反応後、ＩＩのＣＨＣｊ２：＋混合物を１．　Ｏｊｄの０．０１Ｍリ ン酸塩（ｐＨ７，０）に加えた。Ａ４゜。は０．２２３Ｂであった。

５０ｉ１１の５Ｎ　　ＮａＯＨを加えたところ、Ａ、０゜は１．１５４で８０． ６％のエステルを生み出した。

１つの沈殿物、ジシクロヘキシル尿素が現われ、グラスファイバフィルターを通 してこれをろ過してとり除き、ｃＨ１３で乾燥させた。約３００ｄの無水エチル エーテルを加えることによりエステルを沈殿させた。３時間混合物を沈殿させ、 次にガラスフリットを通してろ過させた。次にＣ：１（Ｃｆ、内で沈殿物を再度 溶解させ、約１ｏｏ−のエチルエーテルで再度沈殿させ、中ガラスフリットを通 してろ過させた。少量の湿った固体を０．ＯＩＭのリン酸塩緩衝液、ｐＨ７，０ 内で溶解させた。

Ａ　ａ　ｏ。は０．０２４０であった。５０ｍ＜７）５Ｎ　　ＮａＯＨを付加す ると、Ａ４゜。は３．３３０まで増加した（エステル％は９９．３であった）。

主沈殿物を真空乾燥器内で一晩乾燥させた。この沈殿物が入っていたフラスコを 水で洗浄し、残留物を凍結乾燥させた。

次に、ｐＨ７，ＯＴｆ　２　ｄノｏ、ｏＩＭ　（７）　’Ｊ　７酸塩内で合計４ Ｍ（７）沈殿物を溶解させた（Ａ、、。＝０．０２７６）　、　５０Ｊ（７１５ Ｎ（７）ＮａＯＨを付加したところ、Ａ４゜。は３．５ｏであった（目盛外）。

合計２００Ｉの溶液を８００１１１（７）０．０１　Ｍ　（７）リン酸塩（ｐＨ ７，０）　ニなるまで希釈させた。、Ａ、。。は０．７９８５であった。計算さ れたエステル％−９９，３％。

合計１．５■の凍結乾燥された残留物を、１．０−の０．ＯＩＭのリン酸塩（ｐ ）１７．０）内に溶解させた。吸光度は０．０６８０であった。合計５０Ｊｄ（ ７）５Ｎ　　ＮａＯＨを加えると、Ａ４゜。は１．１０６（ｘステル％−９３， ９）であった。主要沈殿物からのフィルタ上の残留物を水で洗い、週末をがけて 凍結乾燥させた。重量は１３１■のふわふわした白色粉末であった。少量を０． ＯＩＭのリン酸塩、ｐＨ７の中に溶解させ、Ａ４゜。は０．０８５９であった。

５０ｍの５Ｎ・ＮａＯＨを付加した時点でＡ。。は０．６７９４であった（エス テル８７．４％） エステルの構造： 前述の／＜５−ニトロフェニルエステルを、以下のようにして例■に記されてい るａｓｐｓ＊５ｃｓＦ／Ｃ１５０の再生タンパク質とカップリングさせた。

ｒＣＳＦ　　１　　（１■／　ｌ１ｄｌの割合で２００ｇ）を、１００ｍＭのＮ ａ（Ｊ！を含む２０ｍＭの）Ｉｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７，２）内に透析した。合 計０．８■の／＜５−ニトロフェニルエステルを少量の水の中に溶解させ、この 溶液２５０■を直ちに５ＣＳＦ／Ｃ１５０に加えた。４時間２０°Ｃで接合を行 ない、サイズ除外ＨＰＬＣで試料を分析した。

穏やかに誘導体されたｒＣＳＦ　−１（Ｃ３Ｆ−１１つあたり１又は２のＰＥ０ 分子に相当するもの）は、マウス骨髄で検定したところ基本的に完全な生物活性 を保持していた。

反応を、２重ビームの）ｌｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ分光計内のキュベツト 内で行なう場合、バラ−ニトロフェノール陰イオンの放出を監視することができ 、こうしてカップリング反応は、一定の与えられた量の放出が起こった後再現可 能な形で停止させることが可能となる。

［ 員１１會工走」）゛　による、ＰＥＧ　　　れたＣ３Ｆ−１の璽翌 Ａ　′　　　れたＰＥＧエスール（ＰＥＧ　−ＰＮＰ）のｆ１１低濃度のジオー ルしか含まない平均分子量１ｏｏｏｏのモノメチルＰＥＧ　Ｃｍ−ＰＥＧ１００ ＯＯ；　　Ｕｎｉｏｎ　Ｃａｒｂｉｄｅ社）２５グラム（２，５ｍ、ｍｏｆｅ） を５００ｄ入りの３つロ丸底フラスコ内で２５０ｄのＣＨｚＣ１ｚ中に溶解させ た。５グラム（２５ｍ、ｍｏ　ｌ　ｅｓ）のＰ−二）　０７　ニー１−ルクロル 蟻酸塩（ＰＮＰ−ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ）と３グラム（２５ｍｍｏ　ｌ　 ｅ）のジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を付加した。混合物を窒素下で室温 で一晩撹拌した。反応混合物をろ過してＤ？ＩＡＰ　−Ｈ（Ｊを除去し、１００ 威まで濃縮させた。濃縮溶液を撹拌しながら１リツトルのエーテルに付加した。

粗焼結ガラスフィルター上で沈殿物を収集した。次に沈殿物を約１時間約４００ ｄの塩化メチレンと共に撹拌し、次にろ過して約１００ｉになるまで濃縮した。

溶液を１リツトルのエーテルに付加することによりＰＥＧエステルを再度沈殿さ せた。グラスファイバーフィルタを用いて沈殿物を収集し、真空乾燥器内で乾燥 させた。収量は１７．５グラムであった。

生成物をｐ−二トロフェニル炭酸塩の含有量について検定した。ｌｏｄの０．１ Ｍリン酸ナトリウム（ｐ［（８）の中に１０．３■（１，０３ｘｌＯ−”モル） を溶解させた。４００ｎｍでの吸光度により、遊離又は未反応Ｐ−ニトロフェニ ル（ＰＮＰ）不純物を測定した。

初期Ａ４゜。は０．３７であった。１．０−〇ＰＥＧ　−ＰＮＰに対し５０マイ クロリンドルの５Ｎ　ＮａＯＨを加えたところ、存在する全てのエステルは加水 分解され、Ａ　ａ　ｏ　ｏは２．０６であった。秤量された全ての生成物（１０ ，３■）がＰＥＧ　−ＰＮＰであったならば（すなわち遊離ＰＮＰが全（存在し なかった場合）、理論上の最大Ａ４゜。と呼ばれるＡ４゜。−１，８５を有する １、０３Ｘ１０−’モル／リットルのＰＮＰが放出されただろう。

ＰＥＧ　−ＰＮＰであった。初期吸光度（０，３７）はかなり高いものであった ため、遊離ＰＮＰは見かけ上存在していた。生成物を、約７５ｄのＣＨ２Ｃｊ２ ．内で溶解させ１．２リツトルのエーテルを加えて沈殿させることによりさらに 純化した。沈殿物を収集し、乾燥させ（１５，８グラム）、再度検定した。

基本的に例Ｉに記述されているとおりにＣ５Ｆ−１を生産した。Ｃ５Ｆ−１を０ ．０５Ｍのホウ酸ナトリウム（ｐＨ９，０）の中で約１０■／ｄまでＣ５Ｆ−１ を濃縮させた。例Ｉ［［、Ａ部から固体として得られたＰＥＧ−ＰＮＰ　５■を Ｃ５Ｆ−１１ｄにつき付加した（約１：ＩＭの比率）。反応を２時間室温で続け た。

ＮａＣｊ！を、約５Ｍの最終濃度（飽和）に至るまで反応混合物に付加し、フェ ニルセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆａｓｔ　ＦｌｏｗＨｉｇｈ　５ｕｂ ｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）カラムに高温混合物を装入した。装入された１０ｍｇのタ ンパク質について約１ｄのフェニル・セファロースが適当であった。　０．１Ｍ 　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ８，５内で１．２からＯＭの硫酸アンモニウム勾配でカラム からＣ５Ｆ−１を溶離させた。

Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ−染色された非還元性ＳＯ５−ＰＡＧＥにより分画を分析し 、ＮＦＳ６０生物検定での生物活性を測定した。結果は表■に示されている。プ ラスは、試料中の異なるＣ３Ｆ−１複合体の相対量を示している。生物活性デー タは、３回の検定の平均である。

分画　　　　　存在するＣ５Ｆ−１複合体　　生物活性（ＩＪ／ｍｇ）＃ＰＥＧ ５／ＣＳＦ　−１０，１，２，３１１，４Ｘ１０” ＋　＋　＋　＋　十 ２１．４Ｘ１０” ＋＋＋　　　　＋＋ ３　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　８．１Ｘ１０’＋＋　　　　　＋ ＋＋ ４　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５．７Ｘ）、０’＋　　　　　 　＋＋＋＋ ５　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　６、ｌＸ１０’＋　　　　　　＋ ＋＋＋ ５　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋＋＋＋　　　＋　　　　 　　　　　　　　　７．３Ｘ１０’７　　　　　　　　　　　　＋＋＋　　＋　 　ｑ８．３Ｘ１０７８＋＋　　　＋＋＋　　　　　９．３Ｘ１０’９　　　　　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋　　　　　　＋＋＋＋　　　　　　　 　６．４Ｘ！０’５Ｃ５Ｆ／Ｎ３Ｃ１５８遺伝子を含むｐ　Ｊ　Ｎ　６５３で形 質転換された大腸菌株ＨＷ２２の増殖及び収量は、例Ｉにおいて記述したとおり であった。

次に屈折体懸濁物を、同様に例Ｉに記されているとおりに可溶化し、再生し精製 させた。最終比活性は、Ｃ３Ｆ−１依存型細胞系統について行なわれたＣ３Ｆ− １生物検定において約１．５ＸｉＯ”単位／■であった。

］、Ｏｍ　ＭのＨｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７，５）及び１００ｍＭのＮａＣ１！中 で２．６Ｍ／−の濃度で、上述の再生されたＣ３Ｆ−１４０■を２０℃で撹拌し ながら保温した。２００ｍの精製水内にＰＥＧ″’　−１１，０００を溶解さセ 、Ｃ５Ｆ−１２Ｍ体に対してＰＥＧ”−１１０００の１１倍のモル過剰分でＣ３ Ｆ−１溶液に直ちに付加した。（ＰＥＧ”　−１１０００は約５５％加水分解さ れておらず、活性であった。３０分の保温の後、ＩＭの原料（ストック）ｆ￥ｊ 液からＰＥＧ”　−１１０００１モルにつき２モルのε−アミノカプロン酸塩を 加えて、反応を停止させた。、Ａｍ１ｃｏｎ　Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−３０遠心分 離により試料を６ｍまで濃縮させ、３回の同じ２−装入ランでサイズ除外ＨＰＬ Ｃにより純化させた。使用したカラムは、０．２ＭのＮａｚＨＰＯａ／ＮａＨ， ＰＯａ緩衝液（ｐＨ７，０）内で平衡化されたＢｌｏ−５ｉｌ＠ＴＳＫ　　２５ ０．６００Ｘ２１．５Ｍｗ（ＢｉｏＲａｄ）であった。

３回の試行における穏やかにＰＥＧ化されたタンパク質のＡ　ｚ　ａ　ｏピーク をプールしくプール１，５ＥＣ）、最終的な２ｍ体積まで濃縮させ、これを同じ カラム上で再注入させた。活性のＰＥＧ化された分画をプールし濃縮させた。

出発物質の１５％を占める最終プール（プール２．５ＥＣ）は、未修飾Ｃ５Ｆ− １の初期生物活性の約１００％を有する６■のＣ３Ｆ−１から成り、ＳＤＳ　− ＰＡＧＥ上で約４５にの見かけのＭｒで移動する主要なＰＥＧ−ＣＳＦ　−１種 を含んでいた。少量の未修飾Ｃ５Ｆ−１及びさらに高度に変更されたＣ３Ｆ−１ （約１０％）がプールされた生成物の中に残っていた。サイズ除外クロマトグラ フィ（ＳＥＣ）プール１及び２の特徴づけは、以下の表■及びＶパこ示されてい る。

未修飾ｒＣ５Ｆ　　１　　４０．０　　　１００　　　　　０．１４プール１． ＳＥＣ１２，２３０ＮＤ★ プール２．ＳＥＣ６，２１５０，４３ 友修飾ｒｃｓＦ１　　　１　ｘｌＯ＠Ｉ　ＸＩＯ”　　　　　１．５Ｘ１０”プ ール２．ＳＥＣ２，７Ｘ１０”　　　　　１．ｌＸ１０”　　　　　１．６Ｘ１ ０”Ｂ、ＰＥＧ　　されたＣ３Ｆ−１（ＳＣＳＦ　　Ｎ３Ｃ１５８）の′　　１ ＰＥＧ化されたＣ５Ｆ−１とされていないＣ５Ｆ−１の両方についての用量が６ ■／ｋｇである点を除いて、本例の第Ａ節で記述されているＣ３Ｆ−１とＰＥＧ −ＣＳＦ−１の３匹のラットにおける平均静脈内浄化を見積るために二側Ｉに記 されているものと同じ条件が用いられた。

第７図は、静脈内注射後の時間数と３匹のラットの血液からのＣ５Ｆ−１の相対 的濃度の関係を表わす曲線を示している。

浄化は、ＰＥＧ化されたＣ３Ｆ−１については約０．６３ｄ／分／μでありＰＥ Ｇ化されていないＣＳＦ　　ｉについては７．５０Ｈ１／分／ｋｇである（５分 に対し３時間）ことがわかった。このことは、ＰＥＧ化された分子について血液 内平均滞留時間の約１２倍の増大を表わしている。

■−Ｍ ＰＥＧ／Ｃ５Ｆ　−１種合体の硫酸アンモニウム分別Ａ、［且 ０ＰＥＣ−Ｃ５Ｆ−１（未接合Ｃ５Ｆ−１）、　ＩＰＥＧ−Ｃ３Ｆ　−１（ＣＳ Ｆ−１１モルあたりＰＥＧ　１モル）　、　２ＰＥＧ−Ｃ５Ｆ　−１（ＣＳＦ− １１モルあたりＰＥＧ　２モル）　、　３ＰＥＧ−Ｃ３Ｆ　−１（Ｃ３Ｆ−１１ モルあたりＰＥＧ　３モル）及び４ＰＥＧ−ＣＳＦ　−１（ＣＳＦ−１１モルあ たりＰＥＧ４モル）を含む１０ｄの反応混合物は、タンパク質１ｄあたり約１■ であった。約１．３Ｍまで、固体（ＮＨ４）　２ｓｏ４を付加した。

沈殿物を形成させ、１１００００ｒｐで１０分間遠心分離により除去した。沈殿 物（ペレッｌ−）を貯え、約１．４Ｍで濁るまで上澄みに対しくＮＨ４）２５０ ４を加えた。沈殿物を遠心分離でとり除いた。

この手順を続行し、約１．５，１．６及び１．７Ｍで付加的な（ＮＨ４）　２Ｓ Ｏ４カツトを行なった。０．１ＭのＴｒｉｓ　ｐＨ８，６内で沈殿物を再度恕濁 させた。沈殿物のＳＤＳ　−ＰＡＧＥ分析は、１．７Ｍの（ＮＨ４）　、ｓｏ４ の沈殿物における未接合Ｃ５Ｆ−１の濃縮及び１．５及び１．６Ｍの沈殿物にお けるＩＰＥＧ−ＣＳＦ　−１種の濃縮を示した。ＩＰＥＧ−及び３ＰＥＧ−ＣＳ Ｆ　−１も存在していたものの、１．４Ｍの沈殿物の中での優占種は２ＰＥＧ− Ｃ３Ｆ　−１であった。表■は、Ｃｏｏｓａｓｓｉｅ染色された非還元性ＳＯ５ −ＰＡＧＥにより分析された場合の、増大する（ＮＨ４）　２ＳＯ４濃度の沈殿 物（ベレット）内のさまざまなＣ３Ｆ−１の相対量を示している。Ｃ５Ｆ−１複 合体を１種以上含む分画の反復的（ＮＨ４）ｚｓＯｎ分別の結果、基本的に純粋 な未接合Ｃ５Ｆ−１及びＩＰＥＧ−ＣＳＦ　−１が得られた。

この反復は同様に、はぼ純粋なＺＰＥＧ−Ｃ５Ｆ　−１又は３ＰＥＧ　−Ｃ３Ｆ −１を生産するためにも用いることができる。

表■ ＰＥＧ−Ｃ５Ｆ−１接合体の硫酸アンモニウム分別Ｂ、！ＪＬＪ！Ｌ 例■に従ッテ約１　ｇ　（７）Ｃ５Ｆ−１（ＳＣ５Ｆ／Ｎ３ｃ１５８）を接合さ せた。第Ａ部に記されているような（ＮＨ２）Ｓｏ、にょる分別の後、１つのＰ ＥＧに対して接合されたＣ３Ｆ−１２量体の分子量をもつＣ５Ｆ−１約６００■ を純化した。この接合体は約６．２Ｘ］Ｏ’Ｕ／■の比活性を有していた。結合 された１つ、２つ又は３つのＰＥＧを有するＣ３Ｆ−１の混合物的８０■も又回 収され、これは約３．２　ｘ１０７Ｕ／■の比活性を有していた。

劃−ｊ− ＰＥＧ−ＩＬ−２接合体の硫酸アンモニウム分別Ａ、アミドリンカ−るＰＥＧ− ４Ｌ−２人基本的に１９８８年１１月１７日に公示されたＰＣＴ特許公報第一〇 。

８８１０８８４９号に記されているように生産され純化され、基本的に米国特許 第７，７６６、１０６号に記述されているようにＰＥＧ化された約１２■のＩ　 Ｌ−２を、１−の１．ＯＭ　ＴｒｉｓｐＨ８内で再度懸濁させた。溶液が濁るま で固体の（ＮＨｚ）Ｓｏ４を付加した。

試料を１２分間１２０００ｒｐａ＋で遠心分離した。沈殿物（ベレット）を０． １ＭのＴｒｉｓ　ｐＨ８，６内で再度沈殿させた。例Ｖに記述されているように （Ｎ）Ｉｔ）Ｓ０４分別を続行し、再沈殿した沈殿物（ベレット）のＳＯＳ　− ＰＡＧＥ分析は、未接合ＩＬ−２を接合ＩＬ−２から分離できることを示してい た。さらに、Ｃ５Ｆ−１について例Ｖに記述されている結果と同様に、ＩＰＥＧ に対して複合されたＩＬ−２について濃縮された分画が得られた。特定の複合体 について濃縮された分画の再循環が、結果としてほぼ純粋な複合体をもたらすも のと予想される。

Ｂ、ウレ　ンリンカー　　　るＰＥＧ−ＩＬ−２ム１９８９年１月２０日に提出 された同−所有権者の同時係属米国特許出願第　　　　号に記述されている手順 により、ＰＥＧ　−ＩＬ−２を得た。ここで記述するウレタンリンカ−を介して ＰＥ０部分をＩ　Ｌ−２に付着させた。基本的に例■第Ａ部及び例Ｖに記述され ているとおりの（Ｎ）１２）ＳＯ４沈殿の結果、さまざまなＰＥＧ−ＩＬ−２接 合体の分別が得られた。

劃−ｊ− ＰＥＧ化されたＣ５Ｆ−１（ＳＣ５Ｆ／Ｎ３Ｃ１５８）の土体吉効カニ細菌怒染 モデル 例■に記述されている５Ｃ５Ｆ／Ｎ３Ｃ１５８、例■に記述されているとおりに 調製されたＰＥＧ化された５Ｃ５Ｆ／Ｎ３Ｃ１５８又は食塩水（対照グループ） を、５匹のマウスがら成るグループに対し第１日日に（致死量の大腸菌５Ｍ１Ｂ に感染させる前の日）腹腔内注射した。２つのＣＳＦ　−１用量グループ（マウ ス−匹あたり１０■と５０■）を用いた。第０ローに、致死量（５Ｘ１０’細胞 ）の大腸菌５Ｍ１Ｂを全てのマウスに腹腔内注射した。生きのびたマウスの数を ５日間にわたり追跡調査した。

結果は下表に示されている。

ｌ−ユ 経過日数別の生存マウス数 １　２　３　４　５　６（ロー） 対照（食塩水注射）　　　　２０００００未修飾Ｃ５Ｐ−１ １０■　　　　　　　　　３２２２２２５０が　　　　　　　　　３３３３３３ ＰＥＧ化Ｃ５Ｆ−１ １０／Ｚｇ２　２　１　１　１　１ ５０Ｊ４５　４　３　３　３　３ 結果は、生存率に対するｒＣＳＦ　−１の用量依存型効果が存在することを示し ている。変更Ｃ５Ｆ−１と未変更Ｃ５Ｆ−１の間でのこの単一の実験における効 力のわずかな差は、充分有意なものではない。Ｃ５Ｆ−１のＰＥＧ化は、このプ ロトコルにより検知された効力を減少させず、又、当該実験において観察可能な 薬物依存型毒性を増大することもなかった。

ＡＭｅｔｈ（メチオニン）Ａ肉腫モデル７日前にＭｅｔｈＡ肉腫を皮下移植した マウス（１グループにマウス１０匹）１匹１回あたり最高５０Ｉｒｇの用量で、 ＰＥＧ化されたＣ５Ｆ−１を腹腔内、皮下又は静脈内（ｉ−ｐ−＋　Ｓ、Ｃ，、 ｉ、ｖ、）注射した。投薬計画は、使用された特定のＰＥＧ化Ｃ５Ｆ−１調製に より左右される。Ｃ３Ｆ−１処置の開始以後１４日間、腫瘍の大きさを追跡調査 する。Ｃ３Ｆ処理されたマウス及び対照処理されたマウスにおける時間の経過に つれての腫瘍の大きさの平均的変化を比較することによって、結果を評価する。

★　（ΔＴＶ＝単一のマウスグループ内の第Ｏ日日の平均腫瘍体積に対する指定 の日における平均腫瘍体積の比）。

Ｂ、Ｂ抜艇１萱【乙上 Ｂ１６のネズミ黒色腫細胞系内の転移を防ぐためＰＥＧ化Ｃ５Ｆ−１を用いた第 ２の生体内腫瘍モデルも同様に有用である。

０、２　ｄのＣａ”及びＭｇ″２を含まないＨＢＳＳ内で懸濁された１−１０Ｘ 　１０’の腫瘍を、麻酔をかけていないマウスの尾の側静脈に接種する。腫瘍細 胞の接種後１４日から２１日ロー、マウスを安楽死させ、剖検する。剖検の間、 肺と脳を除去し、水で洗浄して秤量する。次に肺をブアン溶液内で固定し、一対 の肺についての表面腫瘍小結節の数を解剖顕微鏡を用いて見極める。

例■に従って調製され、１〜・２５ｘｌＯ’　Ｕ／ｌＩＩｇの潜在能を薬学的に 受容可能なエンドトキシンレベルを有するＰＥＧ化された組換え型ヒトＣ３Ｆ− １を用いる。Ｃ３Ｆ−１は、実験毎に直前に凍結原料（ストック）から得たばか りのものであり、１ＪｓＰ０．９％食塩水内で注射直前に希釈される。ＰＥＧ化 されたＣ３Ｆ−１は、使用される特定のＰＥＧ化Ｃ５Ｆ−１調製に応じた計画に 基づいて、静脈内、腹腔内又は皮下注射させる。使用される投薬レベルは、最高 ５■ｙ’　ｋｇまでである。非特異的で非治療的なタンパク賞から成る陰性対照 と＋、では、ＵＳＰヒト血清アルブミン（ＩＳＡ）又は煮沸したＰＥＧ化Ｃ５Ｆ −１を用いる。、ＲＥＧ化Ｃ５Ｆ　　１は、Ｃ５Ｆ−１活性を不活性にするため ３０分間煮沸される。

効力データは、ＰＥＧ化Ｃ３Ｆ−１が肺転移の中央数を著しく減少させるという ことを立証し、でいる。

開−人 且旦逅進」錯ニュｍ工友工ＭＭ怒５ぴどＬ生岩−処ｌ亜致死量のす・イトメガ口 うイルス（ＣＭν）に感染させる２日前から始めて、異系交配のＣＤ−１マウス に、最高４００ｇ、／廟の用量でＰＥＧ化Ｃ５Ｆ−１を、腹腔内、静脈内又は皮 下注射する。投薬計画は、使用される特定のＰＥＧ化Ｃ３Ｆ−１の調製により左 右される。マウスは、感染後３日目に安楽死させ、牌臓といった標的器官内のウ ィルス複製の範囲をプラーク測定法で評価する。結果は、ＰＥＧ化Ｃ５１ｌでの 処置を受けたマウスが、食塩水での処置を受けたマウスに比べて器官ウィルス力 価を著しく下げたことを示しており、これはすなわちＰ　Ｅ　Ｇ化ＣＳＦ　　１ で処置されたマウスにおいてＣＭＶ惑染感染較的軽度であることを表わしている 。

別途に、異系交配されたＣＤ−１マウスにおいて、致死量のネズミＣＭＶ感染モ デルでのＰＥＧ化Ｃ５Ｆ−１をテストすることが可能である（これは、器官力価 を監視している亜致死量のＣＭ　Ｖを用いた前述の実験と対照的である）。ウィ ルスの攻讐誘発より最高２４時間前に始めて、最高４１１ｇ／ｋｇ（マウス−匹 あたり）の用量でマウスにＰＥＧ化Ｃ３Ｆ−１を腹腔内、皮下又は静脈内投与し た場合、食塩水で処置された対照に比べて生存率の著しい増大がみられる。

従って、ＰＥＧ化Ｃ５Ｆ−１は、ウィルス感染全般の治療において単独で或いは 又もう１つのリンフ才力インと組合わせた形で使用でき、特に、後天性免疫不全 症候群（ＡＩＤＳ）といった免疫抑制ウィルス感染において有益でありうる。

使用するＰＥＧ化Ｃ３Ｆ−１の調製によって異なるさまざまな投薬計画に基づき 一回の投与あたり最高約２■／ｋｇＯ量で、例■に記述されているようにＰＥＧ 化された純化された組換え型ヒｌ−Ｃ５Ｆ　−１を、異系交配のＣＤ−１マウス に投与する。

合計の白血球数、好中球数、単球数及びリンパ球数を測定する。これらのパラメ ータのうちのいずれかにおける増加は、果粒細胞又は単球の生産の刺激及び白血 球数の増強構造（エンハンサ−）として臨床医学及び獣医学の分野で有用である 可能性がある。

ｔＵ上 鳳盗」旦玉虜服ＩＩ、ＰＥＧＬ公り二り移植されたボアテックス管が侵入マクロ ファージ、線維芽細胞及びその他の結合組繊細胞及びコラーゲン及びフィブリン 沈着で一杯になる、Ｇａｏｄｓｏｎ及びＨｕｎｔ、　１９８２年、虹鐵ＬＲｅｓ 　　３３　：　３９４のゴアテックスミニチ１７創傷治ゆモデルといったプロト コル及び動物モデルを用いて、ＰＥＧ化Ｃ５Ｆ　−１を創傷治ゆについて検定す る。治ゆは、顕微鏡で管の内容物を検査することにより評価される。第２のモデ ルば、Ｈｉｓｅ−ｎｇｅｒ他、１９８８年、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、− ５ｃｉ、ＵＳＡ　肢ｉ　１９３７の切開創始ゆモデルであり、ごこては、創傷は 目で観察され、治ゆ、細胞密度及び毛包から発生する表皮細胞層数を監視するた めパンチ生検（細切採取法）が行なわれる。同様に実験の終りには、創傷の破断 強度が測定される。第３のモデルは、傷害部位の中皮再生度によって、定められ た断面内の治ゆが評価されるような、Ｆｏｔｅｖ、他、１９８７年、Ｊ、Ｐａｔ 、ｈ虹、　１５１　：　２０９の火傷を受けた精巣漿膜といった漿膜モデルであ る。これらのモデルの各々による教示は本書に参考文献と１．て内含されている 。

ｇｔ、、ご、ＰＥＧ化Ｃ５Ｆ−１は、局所的創傷についての表皮細胞誘導因子（ ＥＤＦ）を用いた切開創始ゆモデルの参考文献中に記述されているよ・うな無菌 条件下で食塩水中に最高ＰＥＧ化Ｃ５Ｆ−１１ｄあたり１００００００　Ｕ　／ 　ｍＲの量で非付着性外科包帯を浸漬させることにより、創傷部位に適用される 。代替的には、同量のＰＥＧ化Ｃ５Ｆ−１を、Ｇｏｏｄｓｏｎ及びＨｕｎｔ　（ 同書）に記述されているような移植の時点でボアテックス管内に導入する。或い は又、ＰＥＧ化Ｃ３Ｆ−１を低速放出マトリクス内に内含させて創傷部位に（ボ アテックス管内、包帯内又は包帯下又は漿液窩内注入により）適用することもで きる。又、ＰＥＧ化Ｃ５Ｆ−１は、最高１１０００ｊｔ／ｋｇ／日の用量で全身 的に（静脈内、腹腔内ヌは皮下）投与される。

各モデルの治ゆ速度を測定し６、ＰＥＧ化Ｃ３Ｆ−１が存在する場合又は存在し ７ない場合の組織の修復を評価する。

ＰＥＧ化Ｃ５Ｆ−１は、ＥＤＦ、表皮細胞成長因子（ＨＧＦ）、線維芽細胞成長 因子（塩基性及び酸性ＦＧＦ）、血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）又は転質転換 成長因子（ＴＧＦアルファ及びベータ）といった創傷治ゆを促進するその他の成 長因子、ＩＬ−１（インター０　、イキン１）及びその他のソマトメジンＣやビ タミンＣといった物質と組合せて用いることもできる。

りＬＩＩ Ｌｉ９化−改ル隘囚錯ｑ汎翌− Ａ、Ｌ−含 ＰＥＧ”−１１０００は、例ＩＡに記されているとおりに調製した。１９８８年 １０月２０日に公示されたＰＣＴ公報ＷＯ８８１０８００３号内に開示されてい る発酵純化及び再生手順に従って、Ｃ３Ｆｉ　（ＬＣＳＦ　／　Ｎ　Ｖ　３３Ｃ Ｖ　２２１）を調製した。５ｍｇ（７）ＬＣＳＦを、５０ｍＭ　（７）ＮａＣＩ ２を含むＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７，５）　２０ｍＭ内に透析した。ＬＣ５Ｆ２ 量体に対し６倍のモル過剰分でＰＥＧ”−１１０００を加えた。

２０゛Ｃで撹拌している２■／ｄのＬＣ５Ｆ溶液に対し、乾燥した活性化ＰＥＧ を付加した。Ｚｏｒｂａｘ　ＧＦ２５０（Ｄｕｐｏｎｔ社）上のサイズ除外ＨＰ ＬＣ（ＳＥＣ）により１０分毎に反応混合物のアリコートを分析した。ＰＥＧに 対して１０倍のε−アミノカプロン酸塩過剰分を付加することで、反応を停止さ せた。表■は、ＰＥＧ　−ＬＣＳＦ反応混合物のＮＦＳ６０生物検定データを示 している。

２■／ＩｄのＭ−ＣＳＦを含む試料を、１２■／ＩｄのＢＳＡを含むＰＢＳ内に 希釈させ、ＮＦＳ６０検定法で検定した。値は、各試料の段階希釈について行な われた重複測定の平均を表わしＰＥＧ　−ＬＣ５Ｆ／Ｎ３２２１のＮＦＳ生物検 定ｊｉＪＬ　　　　　　Ｕ　　ｄ　　Ｃ３Ｆ−１：出発物質　　　　　　　　　 ３．６５　Ｘ　１０’１０分＋Ｐ　Ｅ　Ｇ　　　　　　　　２．５１Ｘ１０７２ ０分十Ｐ　Ｅ　Ｇ　　　　　　　　　３．３０Ｘ１０’３０分十Ｐ　Ｅ　Ｇ　　 　　　　　　１．６８Ｘ１０’ＰＥＧ化反応のサイズ除外分析は、３０分の反応 の後の２つの主要なＰＥＧ　−Ｃ５Ｆ種を示した。そのサイズは、Ｃ５Ｆ−１２ 量体１モルあたり１モル及び２モルのＰＥＧのおおよその誘導体化と矛盾してい なかった。４５分後のＳＥＣプロフィールは、約３０分で反応が完了したことを 示していた。

ＢＬＣ３Ｆか′のＰＥＧ　−ＬＣＳＦのゝミ試料をＩＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌでｐ ）１８．３にまで調整し、３０ｍＭまでの塩濃度を引き出すため分別ろ過し、Ｂ ｉｏ　−Ｇｅｌ　＠　ＴＳＫ　−ＤＥＡＥ−５−Ｐ讐ＨＰＬＣ７５Ｘ　７．５　 ｍのカラムに適用した。カラムを３０ｗＭのＴｒｉｓ−ＨＣ／！　、　ｐＨ８， ５内で平衡化させ、０から０．６Ｍ　ＮａＣ１の４０ｍ１ｎ勾配で展開させた。

全ての緩衝液は、発熱物質を除いた水で調製し、ＨＰＬＡシステムは予め０．１ ＭのＮａＯＨ及び５０％のエタノールで洗浄し、エンドトキシンを除去した。カ ラム外の分画をＳＤＳ　−ＰＡＧＥで分析した。ＰＥＧ化された種は、未修飾Ｃ ５Ｆ−１よりも早くカラムから溶離した。カラムの開口部内にも、成る程度のＰ ＥＧ　−Ｃ３Ｆが現われ、この物質は、カラムへ再度適用しても再度結合しなか った。結合しなかった分画も同様に、放出されたＮＨ３陰イオンを含んでいた。

土Ω血■夫隻班 本書中の反応は、ポリビニルアルコール又はポリオキシエチル化ポリオールを用 いても行なうことができる。活性ＰＯＧ−ＣＳＦ−１は次のように調製できる。

分子量５０００のポリオキシエチル化グリセロール（ＰＯＧ）は、Ｐｏ１ｙｓｃ ｉｅｎｃｅｓから入手可能である。ＰＯＧｌｏｇに対し、２．２８ｇのグルタル 酸無水物（ＰＯＧに対し１０倍の過剰分）を加えることができる。この混合物を ２時間１１０　”Ｃで撹拌し、冷却することができる。これを２０ｄのＣＩ（Ｃ ｆ　、の中に？容解させ、激しく撹拌しなから５００ｄのエーテル内にゆっくり と注ぎこむ。

生成物を収集して、エーテルで洗い、約９０％のＰＯＧ−グルタル酸塩生成物を 生み出すことができる。この生成物を例ＩＡで記述されているようにＮ−ヒドロ キシスクシニミドと反応させ、活性エステルＰＯＧ−グルタリルＮ−ヒドロキシ スクシニミド（ＰＯＧ″）を生み出す。次に上述のＣ３Ｆ−１タンパク質のうち の１つをＰＯＧ★と反応させることができる。

Ｃ５Ｆ−１に対する接合のための活性化されたポリビニルアルコールを調製する のにニトリル置換のポリビニルアルコールも使用できる。

！−圧 ＰＣＴ公報−０８６１０４６０７号及び欧州特許公報０２７２７７９号により詳 しく記述されている以下の培養物は、Ｃｅｔｕｓ　ＭａｓｔｅｒＣｕｌｔｕｒｅ 　ＣｏｌｌＣｏ１１ｅｃｔｉｏｎ（Ｃ，１４００，Ｆｉｆｔｙ−Ｔｈｉｒｄ　５ ｔｒｅｅｔ。

Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌ、　ＣＡ、９４６０８　ＵＳＡ及びＡ＋ａｅｒｉｃａｎ　Ｔ ｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅ−ｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、　１２３０１ 　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ、２０８５２ ｔｌｓＡに供託された。供託された試料のＣＭＣＣ及びＡＴＣＣの受入れ番号及 びＡＴＣＣ寄託年月日は以下のとおりである。

培養物呼称　　　　　ＣＭＣＣｋ　　ＡＴＣＣＮＣＬ　　ＡＴＣＣ供託年月日大 腸菌ＤＧ９８中のファー ジｐＨＣ５Ｆ−１４０，１７７１９８５年４月２日ｐＨＣ３Ｆ−１λＣｈａｒｏ ｎ　４Ａ　　　２３１２　４０．１８５　１９８５年５月２１日大腸菌ＭＭ２９ ４中のＣ５Ｆ−１７２３４７５３，１４９１９８５年６月１４日ｐＣＳＦ−ａｓ ｐｓｗ　　　　　　　　２７０５　６７．１３９　１９８５年６月１９日ｐＣＳ Ｆ−ｇｌｎｓｚ　　　　　　　　２７０８　６７．１４０　１９８６年６月１９ 日ｐＣ５Ｆ　　ｐｒｏｓｚ　　　　　　　　２７０９　６７．１４１　１９８５ 年６月１９日ｐＣ３Ｆ−Ｂａｍ　　　　　　　　　２７１０　６７．１４２　１ ９８６年６月１９日ｐＣ５Ｆ−ＢａｍＢｃ］　　　　　　　　２７１２　６７． １４４　１９８６年６月１９日ｐＣＳＦ　　ＧＩｙ＋ｓ。　　　　　　　２７６ ２　６７．１４５　１９８６年６月１９日ｐｃＤＢＣＳＦ４　（又は ｐｃＤＢｈｕＣＳＦ−４）　　　　　　　　２８９４　６７．２５０　１９８６ 年１０月２４日培養物呼称　　　　　ＣＭＣＣｋ　　ＡＴＣＣＮαＡＴＣＣ供託 年月日ｐＪＮ６５３　　　　　　　　　　　３２０４　６７．５６１　１９８７ 年１１月１２日上記寄託は、ＡＴＣＣと本特許出願の譲受人であるＣｅｔｕｓ　 Ｃｏｒ−ｐｏｒａｔｉｏｎの間の契約に基づき行なわれたものである。　ＡＴＣ Ｃとの契約は、寄託又は刊行物を記述し識別する米国特許の発行或いは何らかの 米国又は外国特許出願明細書の公開のうちいずれか先に発生した方の時点でかか るプラスミドの後代及び細胞系を一般大衆に対し永久に利用可能な状態におくこ と、ならびに、３５ＵＳＣｉｌ　１２２及びそれに基づく特許局長規則（３７Ｃ ＦＲ６１，１４特に８８６０Ｇ６３Ｂを含む）に従って米国特許局長が権利有り と認めた者に対してかかるプラスミドの後代及び細胞系を利用可能な状態におく ことを規定している。本出願明細書の譲受人は、供託中のプラスミド及び細胞系 が適切な条件下で培養されている間に死滅又は損失した場合、通知に基づいて同 じプラスミド及び細胞系の存続可能な培養ですみやかにこれらを置換することに 同意した。

要約すると、本発明は、異なる化学リンカ−を用いて異なるサイズの水溶性重合 体で選択的に誘導体化されたさまざまな組換え型Ｃ５Ｆ−１分子を提供するもの と考えられている。

Ｃ３Ｆ−１の誘導体化は、ＣＳＦ　−ｉの見かけの分子量を増大させ、ラットの 血漿中のその生体内半減期を増大させる。誘導体化は又、生理学的ｐＨでの水性 媒質中のＣ３Ｆ−ｉの可溶性も増大し、集合体を減少又は除去するか又はその抗 原決定基を遮へいすることによってその免疫原性を減少させることができる。

上述の明細は、当業者が本発明を実施できるのに充分なものであると考えられる 。供託された実施例は本発明の一態様の単なる一例として示されているものにす ぎず、機能的に同等のあらゆる培養が本発明の範囲内に入ることから、本発明は 、寄託された培養により範囲の制限を受けるものではない。

本書中の物質の寄託は、本書に含まれている記述が本発明の最良の様式を含む全 ての態様の実施を可能にするのに適切でないということの認知を成すものではな く、又、それによってそれが代表する特定的な例にクレームの範囲が制限される ことになると考えてはならない。実際、薬学製剤の分野又はそれに関連する分野 の当業者にとっては明白な本発明の上述の実施態様のさまざまな変更が、以下の クレームの範囲内に入るものと意図されている。

ＦＩＧ、　ｌ−２ ＋４ｄＱ Ｃ＾＾１■にＣ＜　ＴＴ ＦＩＧ、　２−１ ＣｒＣｋＯＣＡＡＣＣＣｃ′ｒＣＣＡＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＴＣＡＤＣＣｋＣＡ ＯＣＴＴＴＣＣｋＧ人ＡＧｃｃＡｃＴＣＣｒＣＯＧＧＣＩ２S４ ３＄１　　ＬｔｕＳ＊ｒＡｓｎＰｒｏ５＠ｒＴｈｒＬｇｕＳ＊ｒＡｌｉＧｌａＰ ｒａＧｌｎＬｔｕ５＠ｒ＾ｒｇｓｒｒＨｉｍｓｅｒｓｅｒＧ撃■ ＦＩＧ、　２−２ ＦＩＧ、　３Ａ ＦＩＧ、３Ｂ ＦＩＧ、　４ ＦＩＧ、５ Ｖｏ　１５０　６８４３　　１７　　　　　　　ＶＩＦＩＧ、　６ 但Ｊ友Ｉし＆　　　　　　（バー乞ンＩ−、／ｍＪ）手続補正書く方式） ％式％ １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　８９１００２７０ ２、発明の名称 ポリマーとコロニー刺激因子−１との接合体３、補正をする者 事件との関係　　　特許出願人 名称　　シタス　コーポレイション ４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号５、補正命令の日付 ６、補正の対象 （１）　　特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の「発明の名称」及び 「発明者（ヤング。

ジョン　ディー）の住所」の欄 （２）　　明細書及び請求の範囲の翻訳文７、補正の内容 （１）別紙の通り （２）　　明細書、請求の範囲の翻訳文の浄書（但し、明細書の翻訳文第１頁の 発明の名称以外、内容に変更なし） ８、添付書類の目録 （１）訂正した特許法第１８４条の５ 第１項の規定による書面　　　　　　１通（２）明細書及び請求の範囲の翻訳文 　　各１通国際調査報告 ｌ叫内＋ｍ−＾”””−Ｈａ、　ＰＣＴ／ＵＳ　８９１００２７０ｍｓ”ｓｌ、 ＋ｔ＃Ｉ　ｈｗｂｒａｍ＊　Ｎ１．　ＰＣＴ／ＵＳ　８９１００２７０

Claims (45)

【特許請求の範囲】
1. １．蛋白質を含んで成る生物学的に活性な組成物であって、該蛋白質はインビト ロコロニー刺激因子−１（ＣＳＦ−１）測定において一次マクロファージコロニ ーの形成を刺激し、そして該蛋白質はポリエチレン又はポリプロピレングリコー ルホモポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、及びポリビニルアルコールか ら成る群から選択された水溶性ポリマーに共有結合により接合しており、ここで 前記ホモポリマーは一端においてアルキル基により置換されているか又は置換さ れていない、ことを特徴とする前記組成物。
2. ２．前記蛋白質が生来のヒトＣＳＦ−１である請求項１に記載の組成物。
3. ３．前記蛋白質が組換ヒトＣＳＦ−１である請求項１に記載の組成物。
4. ４．前記蛋白質が細菌中で組換発現されたものであり、そしてＬＣＳＦ／Ｃ１５ ０ないしＣ４６４；ｔｙｒ５９ＬＣＳＦ／Ｃ１５０ないしＣ４６４；ＳＣＳＦ／ Ｃ１５０ないしＣ１６６；ａｓｐｇｓＳＣＳＦ／Ｃ１５０ないしＣ１６６；並び にこれらのｇｌｕｓ２ミューテイン及びＮ３及びＮ３ミューテインから成る群か ら選択された予想アミノ酸配列を有するホモダイマーであり、ここでＬＣＳＦは 第２図のアミノ酸１−５２２として示される配列によりコードされており、そし てＳＣＳＦは第１図のアミノ酸１−２２４として示される配列によりコードされ ている、請求項３に記載の組成物。
5. ５．前記蛋白質が、ＬＣＳＦ／Ｃ１５０；ｔｙｒ５９ＬＣＳＦ／Ｃ１５０；ＬＣ ＳＦ／Ｃ１９０；ｔｙｒ５９ＬＣＳＦ／Ｃ１９０；ＬＣＳＦ／Ｃ１９１；ｔｙｒ ５９ＬＣＳＦ／Ｃ１９１；ＬＣＳＦ／Ｃ２２１；ｔｙｒ５９ＬＣＳＦ／Ｃ２２１ ；ＬＣＳＦ／Ｃ２２３；ｔｙｒ５９ＬＣＳＦ／Ｃ２２３；ＬＣＳＦ／Ｃ２３６； ｔｙｒ５９ＬＣＳＦ／Ｃ２３６；ＬＣＳＦ／Ｃ２３８；ｔｙｒ５９ＬＣＳＦ／Ｃ ２３８；ＬＣＳＦ／Ｃ２４９；ｔｙｒ５９ＬＣＳＦ／Ｃ２４９；ＬＣＳＦ／Ｃ２ ５８；ｔｙｒ５９ＬＣＳＦ／Ｃ２５８；ＬＣＳド／Ｃ４１１；ｔｙｒ５９ＬＣＳ Ｆ／Ｃ４１１；ＬＣＳＦ／Ｃ４６４；ｔｙｒ５９ＬＣＳＦ／Ｃ４６４；ＳＣＳＦ ／Ｃ１５０；ＳＣＳＦ／Ｃ１５３；ＳＣＳＦ／Ｃ１５８；対応するａｓｐ５９Ｓ ＣＦ；並びにそのｇｌｎｓｚミューテイン及びＮ２及びＮ３ミューテインから成 る群から選択される予想アミノ酸配列を有するホモダイマーである、請求項４に 記載の組成物。
6. ６．前記蛋白質が、ＬＣＳＦ／Ｃ１５０，ＬＣＳＦ／Ｃ１９０，ＬＣＳＦ／Ｃ２ ２１，ｔｙｒ５９ＬＣＳＦ／Ｃ１５０，ｔｙｒ５９ＬＣＳＦ／Ｃ１９０，ｔｙｒ ５９ＬＣＳＦ／Ｃ２２１，ＳＣＳＦ／Ｃ１５８，ＳＣＳＦ／Ｃ１５０，ａｓｐ５ ９ＳＣＳＦ／Ｃ１５８；ａｓｐ５９ＳＣＳＦ／Ｃ１５０；並びにそのＮ２及びＮ ３ミューテインから成る群から選ばれた配列によりコードされたホモダイマーで ある、請求項５に記載の組成物。
7. ７．前記蛋白質が、ＳＣＳＦ／Ｃ１５０，ａｓｐ５９ＳＣＳＦ／Ｃ１５０，ＳＣ ＳＦ／Ｎ３Ｃ１５０，ａｓｐ５９ＳＣＳＦ／Ｎ３Ｃ１５０，ＳＣＳＦ／Ｎ３Ｃ１ ５８，ａｓｐ５９ＳＣＳＦ／Ｎ３Ｃ１５８ａｓｐ５９ＳＣＳＦ／Ｎ２Ｃ１５０及 びａｓｐ５９ＳＣＳＦ／Ｈ２Ｃ１５８から成る群から選択された配列によりコー ドされたホモダイマーである、請求項６に記載の組成物。
8. ８．前記蛋白質が、ポリマーと反応性の遊離スルヒドリル基と共にシステイン残 基を含有する１個のサブユニットから成る組換ヘテロダイマーである、請求項１ に記載の組成物。
9. ９．前記蛋白質がミューテインＣＳＦ−１である、請求項１に記載の組成物。
10. １０．前記蛋白質が真核性宿主中で発現されそこから分泌されたヒトＣＳＦ−１ である、請求項１に記載の組成物。
11. １１．前記蛋白質が、ＬＣＳＦ／Ｃ１５０；ｔｙｒ５９ＬＣＳＦ／Ｃ１５０；Ｌ ＣＳＦ／Ｃ１９０；ｔｙｒ５９ＬＣＳＦ／Ｃ１９０；ＬＣＳＦ／Ｃ１９１；ｔｙ ｒ５９ＬＣＳＦ／Ｃ１９１；ＬＣＳＦ／Ｃ２２１；ｔｙｒ５９ＬＣＳＦ／Ｃ２２ １；ＬＣＳＦ／Ｃ２２３；ｔｙｒ５９ＬＣＳＦ／Ｃ２２３；ＬＣＳＦ／Ｃ２３６ ；ｔｙｒ５９ＬＣＳＦ／Ｃ２３６；ＬＣＳＦ／Ｃ２３８；ｔｙｒ５９ＬＣＳＦ／ Ｃ２３８；ＬＣＳＦ／Ｃ２４９；ｔｙｒ５９ＬＣＳＦ／Ｃ２４９；ＬＣＳＦ／Ｃ ２５８；ｔｙｒ５９ＬＣＳＦ／Ｃ２５８；ＬＣＳＦ／Ｃ４１１；ｔｙｒ５９ＬＣ ＳＦ／Ｃ４Ｈ；ＬＣＳＦ／Ｃ４６４；ｔｙｒ５９ＬＣＳＦ／Ｃ４６４；ＳＣＳＦ ／Ｃ１５０；ＳＣＳＦ／Ｃ１５３；ＳＣＳＦ／Ｃ１５８；対応するａｓｐ５９Ｓ ＣＳＦ；並びにそれらのｇｌｎ５２ミューテインから成る群から選択された配列 によりコードされたダイマーである、請求項１０に記載の組成物。
12. １２．前記ポリマーが約１０００〜１００，０００ダルトンの平均分子量を有す るものである、請求項１に記載の組成物。
13. １３．前記ポリマーが４０００〜４０．０００ダルトンの平均分子量を有するも のである、請求項１に記載の組成物。
14. １４．前記ポリマーが該ポリマーのカルボン酸の活性エステルによる反応を介し て蛋白質に接合している、請求項１に記載の組成物。
15. １５．前記ポリマーが非置換ポリエチレングリコールホモポリマー、モノメチル ポリエチレングリコールホモポリマー又はポリオキシエチル化グリセロールであ る、請求項１４に記載の組成物。
16. １６．前記蛋白質がその１〜３個の遊離アミノ基を介して接合しており、そして 前記ポリマーが核蛋白質の該遊離アミノ基と反応するＮ−ヒドロキシサクシンイ ミドエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル又は４−ヒドロキシ−３−ニトロベ ンゼンスルホン酸エステル基を含有している、請求項１に記載の組成物。
17. １７．接合する前記アミノ基がリジン残基もしくはＮ−末端アミノ酸又はその組 合せに存在する、請求項１６に記載の組成物。
18. １８．前記蛋白質が１又は複数のシステイン残基を介して接合しており、そして 前記ポリマーが該システイン残基の遊離スルヒドリル基と反応するマレイミド基 又はハロアセチル基を含有する、請求項１に記載の組成物。
19. １９．前記蛋白質がグリコシル化されており、そして該蛋白質上の炭水化物成分 の少なくとも１つを介してポリマーに接合しており、そして該ポリマーが、該炭 水化物成分の酸化により形成される遊離アルデヒドと反応するアミノ、ヒドラジ ン又はヒドラジド基を含有する、請求項１に記載の組成物。
20. ２０．前記蛋白質が真核性宿主において組換え発現される組換えＣＳＦ−１のダ イマー生成物である、請求項１９に記載の組成物。
21. ２１．前記真核宿主が哺乳類、昆虫、酵母又は真菌の細胞である、請求項２０に 記載の組成物。
22. ２２．医薬として許容される水性キャリヤー媒体に溶解している請求項１の組成 物を含んで成る医薬製剤。
23. ２３．前記蛋白質が再生されておりそしてインビトロで精製されており、そして 細菌において組換発現される組換ＣＳＦ−１クローンの生成物である、請求項２ ２に記載の製剤。
24. ２４．前記蛋白質が、１．０ｎｇ／ｍｇＣＳＦ−１未満のエンドトキシン含量を 有しそして実質的にパイロジエンを含有しない生物学的に活性な再生されたＣＳ Ｆ−１ダイマーである、請求項２３に記載の製剤。
25. ２５．前記蛋白質がウレタン結合を介して前記ポリマーに結合している、請求項 １に記載の組成物。
26. ２６．前記ポリマーが該ポリマーのカルボン酸の活性エステルとの反応を介して 蛋白質に接合している、請求項１に記載の組成物。
27. ２７．前記ポリマーが非置換ポリエチレングリコールホモポリマー、モノメチル ポリエチレングリコールホモポリマー又はポリオキシエチル化グリセロールであ る、請求項２５に記載の組成物。
28. ２８．１モルのＣＳＦ−１ダイマー当り１〜３モルのポリマーが存在する、請求 項２６に記載の組成物。
29. ２９．前記共有結合により接合した蛋白質がＣＳＦ−１モル当りポリマーのモル 数に関して実質的に純粋である、請求項１に記載の組成物。
30. ３０．前記実質的に純粋な接合した蛋白質が硫酸アンモニウム分画により得られ たものである、請求項２９に記載の組成物。
31. ３１．インビトロコロニー刺激因子一１（ＣＳＦ−１）測定において一次マクロ ファージコロニーの形成を刺激する、接合した蛋白質の製造方法であって、 （ａ）少なくとも１個の末端反応基を有する水溶性ポリマーを用意し、書套ポリ マーは、ポリエチレン又はポリプロピレングリコールホモポリマー及びポリオキ シエチル化ポリオール並びにポリビニルアルコールから成る群から選択されたも のであり、該ホモポリマーはアルキル基により一端において置換されているか又 は置換されておらず；（ｂ）蛋白質を前記ポリマーの反応性基と反応せしめるこ とにより該蛋白質を生物学的に活性にしそして選択に接合せしめ；そして （ｃ）接合した蛋白質を精製する； ことを含んで成る方法。
32. ３２．前記ポリマーが約１，０００〜１００，０００ダルトンの平均分子量を有 する、請求項３１に記載の方法。
33. ３３．前記蛋白質がその１〜３個の遊離アミノ基を介して接合しており、そして 前記ポリマーが該蛋白質の遊離アミノ基と反応するＮ−ヒドロキシサクシンイミ ドエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、又は４−ヒドロキシ−３−ニトロベ ンゼンスルホン酸エステル基を含有する、請求項３１に記載の方法。
34. ３４．前記アミノ基がリジン残基もしくはＮ−末端アミノ酸又はその組合せであ り、そして段階（ｂ）が約７〜９のｐＨにおいて行われる、請求項３３に記載の 方法。
35. ３５．前記ポリマーが非置換ポリエチレングリコールホモポリマー、モノメチル ポリエチレングリコールホモポリマー又はポリオキシエチル化グリセロールであ る、請求項３１に記載の方法。
36. ３６．前記蛋白質が組換ヒトＣＳＦ−１である、請求項３１に記載の方法。
37. ３７．前記蛋白質が細菌中で組換発現されたものであり、そしてＬＣＳＦ／Ｃ１ ５０ないしＣ４６４；ｔｙｒ５９ＬＣＳＦ／Ｃ１５０ないしＣ４６４；ＳＣＳＦ ／Ｃ１５０ないしＣ１６６；ａｓｐ９５ＳＣＳＦ／Ｃ１５０ないしＣ１６６；並 びにこれらのｇＩｕ５２ミューテイン及びＮ３及びＮ３ミューテインから成る群 から選択された予想アミノ酸配列を有するホモダイマーであり、ここでＬＣＳＦ は第２図のアミノ酸１−５２２として示される配列によりコードされており、そ してＳＣＳＦは第１図のアミノ酸１−２２４として示される配列によりコードさ れている、請求項３１に記載の方法。
38. ３８．前記蛋白質が真核性宿主中で発現されそこから分泌されたヒトＣＳＦ−１ である、請求項３１に記載の方法。
39. ３９．段階（ｃ）の後、医薬として許容される水性キャリヤー媒体中に蛋白質に 製剤化する段階をさらに含んで成る、請求項３１に記載の方法。
40. ４０．前記蛋白質がグリコシル化されており、そして該蛋白質上の炭水化物成分 の少なくとも１つを介してポリマーに接合しており、そして該ポリマーが、該炭 水化物成分の酸化により形成される遊離アルデヒドと反応するアミノ、ヒドラジ ン又はヒドラジド基を含有する、請求項１に記載の組成物。
41. ４１．前記蛋白質が真核性宿主において組換え発現される組換えＣＳＦ−１のダ イマー生成物である、請求項４０に記載の方法。
42. ４２．前記真核宿主が哺乳類、昆虫、酵母又は真菌の細胞である、請求項４１に 記載の方法。
43. ４３．段階（ｃ）が硫酸アンモニウム分画を含んで成る、請求項３１に記載の方 法。
44. ４４．請求項２２の製剤の免疫療法的有効量を哺乳類に投与することを含んで成 る、哺乳類における感染性疾患の予防的又は治療的処置方法。
45. ４５．請求項２２の製剤の免疫療法的有効量を哺乳類に投与することを含んで成 る哺乳類における腫瘍の治療方法。