JP2022520792A - 抗体－ｔｌｒアゴニストコンジュゲートを含有する組成物、その方法、及び使用 - Google Patents

抗体－ｔｌｒアゴニストコンジュゲートを含有する組成物、その方法、及び使用 Download PDF

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Abstract

少なくとも１つの非天然アミノ酸を含むトラスツズマブ連結ＴＬＲアゴニスト誘導類似体、ならびにそのような非天然アミノ酸及びポリペプチドを作製するための方法が、本明細書に開示される。トラスツズマブ連結ＴＬＲアゴニスト誘導類似体は、広範囲の可能な官能基を含むことができるが、典型的には、少なくとも１つのオキシム、カルボニル、ジカルボニル、及び／またはヒドロキシルアミン基を有する。翻訳後にさらに修飾される非天然アミノ酸トラスツズマブ連結ＴＬＲアゴニスト誘導類似体、そのような修飾をもたらすための方法、及びそのようなトラスツズマブ連結ＴＬＲアゴニスト誘導類似体を精製するための方法も本明細書に開示される。典型的には、修飾されたトラスツズマブ連結ＴＬＲアゴニスト誘導類似体は、少なくとも１つのオキシム、カルボニル、ジカルボニル、及び／またはヒドロキシルアミン基を含む。治療、診断、及び他のバイオテクノロジーの使用を含む、そのような非天然アミノ酸トラスツズマブ連結ＴＬＲアゴニスト誘導類似体及び修飾された非天然アミノ酸トラスツズマブ連結ＴＬＲアゴニスト誘導類似体を使用するための方法がさらに開示される。

Description

発明の詳細な説明
〔技術分野〕
関連出願の参照
本出願は、２０１９年２月１２日に出願された、それぞれ「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ＴＬＲ Ａｇｏｎｉｓｔ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」と題される米国仮特許出願第６２／８０４，７４２号の利益を主張するものであり、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩフォーマットで提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２０年２月７日に作成されたＡＳＣＩＩコピーは、ＡＭＢＸ＿０２３０＿ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔという名前で、３０，５２７バイトのサイズである。
本発明の開示は、ＴＬＲアゴニスト化合物及びＴＬＲアゴニストコンジュゲート（ＴＣ）、ならびにそれらの使用に関する。本発明はさらに、治療的または予防的として（ＴＣ）を含有する医薬組成物に関する。
〔背景技術〕
抗体及びその断片などの標的化分子またはポリペプチド、ならびにＴＬＲアゴニスト化合物は、部位特異的コンジュゲーションによって非天然コード化アミノ酸を使用して一緒にコンジュゲートさせて、新規のＴＬＲ－アゴニストコンジュゲート（ＴＣ）を産生することができる。新規のＴＣは、全身治療中に循環ＴＣがＴＬＲアゴニストを腫瘍部位に標的化し、局所的に有益な免疫応答を刺激し、それによって全身サイトカイン放出症候群を最小限に抑えることができるような方法で構築することができる。
〔発明の概要〕
本発明は、ＴＬＲ７及び／またはＴＬＲ８を含むがこれらに限定されない、ＴＬＲのアゴニスト化合物にコンジュゲートされた１つ以上の非天然コード化アミノ酸を有するポリペプチドを標的化することに関する。そのようなコンジュゲートは、本明細書では、ＴＬＲ－アゴニストコンジュゲート（ＴＣ）と称される。本発明のＴＣは、新規の生物学的ＴＬＲ－アゴニストコンジュゲート（ＢＴＣ）を産生するために、部位特異的コンジュゲートによって非天然コード化アミノ酸を使用して一緒にコンジュゲートされた生物学的分子またはポリペプチド及びＴＬＲアゴニスト化合物を標的化することを含む。標的化生物学的分子またはポリペプチドは、腫瘍標的化生物学的分子またはポリペプチドであり得る。
さらなる実施形態において、本発明はさらに、安定した二量体または多量体を形成する水溶性ポリマーにさらにコンジュゲートされたＴＣに関する。
本発明は、腫瘍に近接して患者の免疫系を刺激するために、腫瘍を有効量の本発明のＴＣと接触させることを含む、腫瘍またはがんの成長を阻害または低減する方法を提供する。本発明は、腫瘍を有効量の本発明のＰＥＧ化ＴＣ、またはＴＣの安定した二量体もしくは多量体と接触させることを含む、腫瘍またはがんの成長を阻害または低減する方法を提供する。一実施形態において、ＴＣは、非ペグ化またはモノペグ化される。一実施形態において、ＴＣは、ジペグ化される。一実施形態において、ＴＣは、それに結合された２つ以上の及び／または異なるＴＬＲアゴニスト分子を有する。一実施形態において、ＴＣは、それに結合された２つ以上の及び／または同じＴＬＲアゴニスト分子を有する。本発明の別の実施形態は、腫瘍細胞に対する免疫応答を調節するために、本発明のＴＣを使用する方法を提供する。ある特定の実施形態において、ＴＣは、少なくとも１つの化学療法剤及び／または少なくとも１つの免疫療法剤と同時投与される。化学療法剤は、テモゾロミド、ゲムシタビン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、パクリタキセル、シスプラチン、フルオロピリミジン、タキサン、アントラサイクリン、ラパチニブ、カペシタビン、レトロゾール、ペルツズマブ、ドセタキセル、ＩＦＮ－αからなる群から選択され得る。本発明の別の実施形態において、ＴＣは、少なくとも１つの化学療法剤及び／または少なくとも１つの免疫療法剤と同時投与される。
いくつかの実施形態において、ＴＣは、１つ以上の非天然コード化アミノ酸を含む抗原結合ポリペプチド（ＡＢＰ）を含むがこれに限定されない、標的化ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ＡＢＰは、完全な抗体重鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＡＢＰは、完全な抗体軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＡＢＰは、抗体軽鎖の可変領域を含む。いくつかの実施形態において、ＡＢＰは、抗体重鎖の可変領域を含む。いくつかの実施形態において、ＡＢＰは、抗体軽鎖の少なくとも１つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、ＡＢＰは、抗体重鎖の少なくとも１つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、ＡＢＰは、軽鎖の少なくとも１つのＣＤＲ及び重鎖の少なくとも１つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、ＡＢＰは、Ｆａｂを含む。いくつかの実施形態において、ＡＢＰは、２つ以上のＦａｂを含む。いくつかの実施形態において、ＡＢＰは、（Ｆａｂ’）２を含む。いくつかの実施形態において、ＡＢＰは、２つ以上の（Ｆａｂ’）２を含む。いくつかの実施形態において、ＡＢＰは、ｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態において、ＡＢＰは、２つ以上のｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態において、ＡＢＰは、ミニボディを含む。いくつかの実施形態において、ＡＢＰは、２つ以上のミニボディを含む。いくつかの実施形態において、ＡＢＰは、ダイアボディを含む。いくつかの実施形態において、ＡＢＰは、２つ以上のダイアボディを含む。いくつかの実施形態において、ＡＢＰは、軽鎖の可変領域及び重鎖の可変領域を含む。いくつかの実施形態において、ＡＢＰは、完全な軽鎖及び完全な重鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＡＢＰは、１つ以上のＦｃドメインまたはその一部を含む。いくつかの実施形態において、ＡＢＰは、上記の実施形態のいずれかの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、ＡＢＰは、上記の実施形態のいずれかのホモ二量体、ヘテロ二量体、ホモ多量体、またはヘテロ多量体を含む。いくつかの実施形態において、ＡＢＰは、結合パートナーに結合するポリペプチドを含み、結合パートナーは、抗原、ポリペプチド、核酸分子、ポリマー、または他の分子もしくは物質を含む。いくつかの実施形態において、ＡＢＰは、非抗体足場分子または物質と会合する。いくつかの実施形態において、抗原は、腫瘍抗原である。
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、広範囲の保存された病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を検出する。これらは、侵入病原体を感知し、続いて自然免疫応答を開始する重要な役割を果たす。ヒトにおけるＴＬＲファミリーの１０のメンバーが既知であり、これは、細胞外ロイシンリッチドメイン及び保存されたＴｏｌｌ／インターロイキン（ＩＬ）－１受容体（ＴＩＲ）ドメインを含有する細胞質尾部を特徴とするＩ型膜貫通タンパク質である。このファミリー内で、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、及びＴＬＲ９は、エンドソーム内に位置する。ＴＬＲ７及びＴＬＲ８は、特定の小分子リガンド（すなわち、ＴＬＲ７アゴニストまたはＴＬＲ８アゴニスト）またはその天然リガンド（すなわち、一本鎖ＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ）に結合することによって活性化され得る。アゴニストがＴＬＲ７またはＴＬＲ８に結合した後、その二量体化形態の受容体は、骨髄分化一次応答遺伝子８８（ＭｙＤ８８）を含むその細胞質ドメインにおけるアダプタータンパク質のその後の動員につながる構造変化を受けると考えられる。ＭｙＤ８８経路を介した受容体シグナル伝達カスケードの開始後、インターフェロン調節因子７（ＩＲＦ－７）及び核因子カッパＢ（ＮＦ－κＢ）などの細胞質転写因子が活性化される。次いで、これらの転写因子は、核に転座し、種々の遺伝子、例えば、ＩＦＮ－アルファ及び他の抗ウイルスサイトカイン遺伝子の転写を開始する。ＴＬＲ７は、主に形質細胞様細胞上、及びＢ細胞上に発現する。免疫細胞の応答性の変化は、がん患者における自然免疫応答の低減に寄与し得る。したがって、抗体またはその断片などの標的化部分にコンジュゲートされたＴＬＲ７及び／またはＴＬＲ８のアゴニスト誘導性活性化は、がんの治療のための新規アプローチを表し得る。ＴＬＲ７またはＴＬＲ８アゴニストを含むＴＣによる治療は、より優れた忍容性を有するより高い有効性を提供する有望な解決策を表す。ＴＣを作製するために本発明で使用される好適なＴＬＲ７及び／またはＴＬＲ８アゴニストは、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる以下の米国特許に見出される：米国特許第６，８２５，３５０号、米国特許第６，６５６，３８９号、米国特許第６，６５６，３９８号、米国特許第６，６８３，０８８号、米国特許第６，７５６，３８２号、米国特許第６，８２５，３５０号、米国特許第６，６６７，３１２号、米国特許第６，６７７，３４７号、米国特許第７，５９８，３８２号、米国特許第８，６７３，９３２号。
いくつかの実施形態において、ＴＣは、置換、付加、または欠失を伴わない対応する野生型ＴＣの適合性と比較した場合、ＴＣポリペプチドの薬学的保存剤（例えば、ｍ－クレゾール、フェノール、ベンジルアルコール）との適合性を増加させるアミノ酸置換、付加、または欠失をさらに含む標的化ポリペプチドを含む。この適合性の増加は、貯蔵中のタンパク質の生理化学的特性及び生物学的活性を維持する保存された医薬製剤の調製を可能にするであろう。
いくつかの実施形態において、１つ以上の操作された結合は、１つ以上の非天然アミノ酸で作製される。分子内結合は、好適な条件下でのタンパク質中の２つのアミノ酸間の反応（１つまたは両方のアミノ酸が非天然アミノ酸であり得る）、２つのアミノ酸との反応（それらのそれぞれが好適な条件下でのリンカー、ポリマー、または他の分子で天然にコード化されるか、または非天然にコード化され得る）などを含むが、これらに限定されない多くの方法で作製され得る。
いくつかの実施形態において、ＴＣポリペプチド中の１つ以上のアミノ酸置換は、１つ以上の天然に存在するまたは非天然に存在するアミノ酸によるものであり得る。いくつかの実施形態において、ＴＣにおけるアミノ酸置換は、天然に存在するまたは非天然に存在するアミノ酸によるものであり得るが、但し、少なくとも１つの置換が非天然コード化アミノ酸によるものであることを条件とする。いくつかの実施形態において、ＴＣポリペプチド中の１つ以上のアミノ酸置換は、１つ以上の天然に存在するアミノ酸によるものであり得、加えて、少なくとも１つの置換は、非天然コード化アミノ酸によるものである。いくつかの実施形態において、ＴＣポリペプチドは、抗体または抗体断片であり得る。いくつかの実施形態において、ＴＣポリペプチドは、腫瘍標的化ポリペプチドであり得る。
いくつかの実施形態において、非天然コード化アミノ酸は、カルボニル基、アセチル基、アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、セミカルバジド基、アジド基、またはアルキン基を含む。
いくつかの実施形態において、非天然コード化アミノ酸は、カルボニル基を含む。いくつかの実施形態において、非天然コード化アミノ酸は、構造：
Figure 2022520792000002
を有し、式中、ｎは、０～１０であり、Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル、または置換アリールであり、Ｒ２は、Ｈ、アルキル、アリール、置換アルキル、及び置換アリールであり、Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり、Ｒ４は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である。
いくつかの実施形態において、非天然コード化アミノ酸は、アミノオキシ基を含む。いくつかの実施形態において、非天然コード化アミノ酸は、ヒドラジド基を含む。いくつかの実施形態において、非天然コード化アミノ酸は、ヒドラジン基を含む。いくつかの実施形態において、非天然コード化アミノ酸残基は、セミカルバジド基を含む。
いくつかの実施形態において、非天然コード化アミノ酸残基は、アジド基を含む。いくつかの実施形態において、非天然コード化アミノ酸は、構造：
Figure 2022520792000003
を有し、式中、ｎは、０～１０であり、Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル、置換アリールであるか、または存在せず、Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであるか、または存在せず、ｍは、０～１０であり、Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり、Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である。
いくつかの実施形態において、非天然コード化アミノ酸は、アルキン基を含む。いくつかの実施形態において、非天然コード化アミノ酸は、構造：
Figure 2022520792000004
を有し、式中、ｎは、０～１０であり、Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル、または置換アリールであり、Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであるか、または存在せず、ｍは、０～１０であり、Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり、Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である。
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、水溶性ポリマーに連結された非天然コード化アミノ酸を含むＴＣである。いくつかの実施形態において、水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）部分を含む。いくつかの実施形態において、ＴＣは、非天然コード化アミノ酸、及び１つ以上の翻訳後修飾、リンカー、ポリマー、または生物学的活性分子を含む。
本発明はまた、ＴＣの標的化ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸を提供し、本発明は、ストリンジェントな条件下でポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む単離された核酸を提供する。本発明はまた、標的化ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸を提供し、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つのセレクターコドンを含む。当業者には、いくつかの異なるポリヌクレオチドが本発明の任意のポリペプチドをコードすることができることは容易に明らかである。
いくつかの実施形態において、セレクターコドンは、アンバーコドン、オーカーコドン、オパールコドン、ユニークコドン、レアコドン、５塩基コドン、及び４塩基コドンからなる群から選択される。
本発明はまた、水溶性ポリマーに連結される、または１つ以上のＴＣポリペプチドに連結されるＴＣポリペプチドを作製して、ホモ二量体またはホモ多量体を形成する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、非天然コード化アミノ酸を含む単離されたＴＣポリペプチドを、非天然コード化アミノ酸と反応する部分を含む水溶性ポリマーまたはリンカーと接触させることを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣポリペプチドに組み込まれる非天然コード化アミノ酸は、２０個の一般的なアミノ酸のいずれかに対してさもなければ非反応性である水溶性ポリマーまたはリンカーに対して反応性である。いくつかの実施形態において、ＴＣポリペプチドに組み込まれる非天然コード化アミノ酸は、２０個の一般的なアミノ酸のいずれかに対してさもなければ非反応性であるリンカー、ポリマー、または生物学的活性分子に対して反応性である。
いくつかの実施形態において、水溶性ポリマーまたはリンカーに連結されるＴＣポリペプチドは、カルボニル含有アミノ酸を含むＴＣポリペプチドを、ポリ（エチレングリコール）分子、またはアミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド、もしくはセミカルバジド基を含むリンカーと反応させることによって作製される。いくつかの実施形態において、アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド、またはセミカルバジド基は、アミド連結を介してポリ（エチレングリコール）分子またはリンカーに連結されている。いくつかの実施形態において、アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド、またはセミカルバジド基は、カルバメート連結を介してポリ（エチレングリコール）分子またはリンカーに連結されている。
いくつかの実施形態において、水溶性ポリマーに連結されるＴＣポリペプチドは、カルボニル基を含むポリ（エチレングリコール）分子またはリンカーを、アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド、またはセミカルバジド基を含む非天然コード化アミノ酸を含むポリペプチドと反応させることによって作製される。
いくつかの実施形態において、水溶性ポリマーまたはリンカーに連結されるＴＣポリペプチドは、アルキン含有アミノ酸を含むＴＣを、アジド部分を含むポリ（エチレングリコール）分子と反応させることによって作製される。いくつかの実施形態において、アジドまたはアルキン基は、アミド連結を介してポリ（エチレングリコール）分子またはリンカーに連結されている。
いくつかの実施形態において、水溶性ポリマーまたはリンカーに連結されるＴＣポリペプチドは、アジド含有アミノ酸を含むＴＣポリペプチドを、アルキン部分を含むポリ（エチレングリコール）分子と反応させることによって作製される。いくつかの実施形態において、アジドまたはアルキン基は、アミド連結を介してポリ（エチレングリコール）分子またはリンカーに連結されている。
いくつかの実施形態において、ポリ（エチレングリコール）分子またはリンカーは、約０．１ｋＤａ～約１００ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施形態において、ポリ（エチレングリコール）分子またはリンカーは、０．１ｋＤａ～５０ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施形態において、ポリ（エチレングリコール）分子またはリンカーは、分枝状ポリマーまたはリンカーである。いくつかの実施形態において、ポリ（エチレングリコール）分枝状ポリマーまたはリンカーの各分枝は、１ｋＤａ～１００ｋＤａ、または１ｋＤａ～５０ｋＤａの分子量を有する。
いくつかの実施形態において、ＴＣポリペプチドに連結される水溶性ポリマーは、ポリアルキレングリコール部分を含む。いくつかの実施形態において、ＴＣに組み込まれる非天然コード化アミノ酸残基は、カルボニル基、アミノオキシ基、ヒドラジド基、ヒドラジン、セミカルバジド基、アジド基、またはアルキン基を含む。いくつかの実施形態において、ＴＣポリペプチドに組み込まれる非天然コード化アミノ酸残基は、カルボニル部分を含み、水溶性ポリマーは、アミノオキシ、ヒドラジド、ヒドラジン、またはセミカルバジド部分を含む。いくつかの実施形態において、ＴＣポリペプチドに組み込まれる非天然コード化アミノ酸残基は、アルキン部分を含み、水溶性ポリマーは、アジド部分を含む。いくつかの実施形態において、ＴＣポリペプチドに組み込まれる非天然コード化アミノ酸残基は、アジド部分を含み、水溶性ポリマーは、アルキン部分を含む。本発明はまた、非天然コード化アミノ酸及び医薬的に許容される担体を含むＴＣポリペプチドを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、非天然コード化アミノ酸は、水溶性ポリマーに連結されている。
本発明はまた、セレクターコドンを含むＴＣの標的化ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む細胞を提供する。いくつかの実施形態において、細胞は、ＴＣの標的化ポリペプチドに非天然コード化アミノ酸を置換するための直交ＲＮＡ合成酵素及び／または直交ｔＲＮＡを含む。
本発明はまた、非天然コード化アミノ酸を含むＴＣの標的化ポリペプチドを作製する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、ＴＣの標的化ポリペプチド、直交ＲＮＡ合成酵素、及び／または直交ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド（複数可）を含む細胞を、ＴＣの標的化ポリペプチドまたはそのバリアントの発現を可能にする条件下で培養することと、ＴＣポリペプチドを細胞及び／または培養培地から精製することとを含む。
本発明は、ＴＣの治療上の半減期、血清半減期、または循環時間を増加させる方法も提供する。本発明はまた、ＴＣの免疫原性を調節する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、ＴＣの天然に存在する標的化ポリペプチド中の任意の１つ以上のアミノ酸の代わりに非天然コード化アミノ酸を用いること、及び／または標的化ポリペプチドを、リンカー、ポリマー、水溶性ポリマー、または生物学的活性分子に連結することを含む。
本発明はまた、そのような治療を必要とする患者を有効量の本発明のＴＣ分子で治療する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、治療有効量の、非天然コード化アミノ酸を含むＴＣと、医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物を患者に投与することを含む。いくつかの実施形態において、非天然コード化アミノ酸は、水溶性ポリマーに連結されている。いくつかの実施形態において、ＴＣは、グリコシル化される。いくつかの実施形態において、ＴＣは、グリコシル化されない。
本発明はまた、単一アミノ酸におけるＴＣへの共有結合によって連結される水溶性ポリマーまたはリンカーを含むＴＣを提供する。いくつかの実施形態において、水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）部分を含む。いくつかの実施形態において、水溶性ポリマーまたはリンカーに共有結合されるアミノ酸は、ＴＣの標的化ポリペプチドに存在する非天然コード化アミノ酸である。
本発明は、少なくとも１つのリンカー、ポリマー、または生物学的活性分子を含むＴＣポリペプチドを提供し、該リンカー、ポリマー、または生物学的活性分子は、ＴＣの標的化ポリペプチドにリボソームにより組み込まれる非天然コード化アミノ酸の官能基を介して、ポリペプチドに結合される。ＴＣコンジュゲートにおいて、ＰＥＧまたは他の水溶性ポリマー、別のＴＣ、ポリペプチド、または生物学的活性分子は、リンカーを介してＴＣに直接コンジュゲートされ得る。一実施形態において、リンカーは、可動性を可能にし、二量体形成を可能にするのに十分な長さである。一実施形態において、リンカーは、二量体形成を可能にするように、長さが少なくとも３個のアミノ酸、または１８個の原子である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、多量体の形成を可能にするようにリンカーに連結される。いくつかの実施形態において、リンカーは、二官能性リンカーである。いくつかの実施形態において、本発明の組成物及び／またはＴＣは、複数のリンカーを含み得る。他の実施形態において、各リンカーは、結合された１つ以上の化合物を含み得る。リンカーはまた、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ポリエーテル、ポリエステル、ポリアミド基（複数可）、ならびにポリアミノ酸、ポリペプチド、切断可能なペプチド、またはアミノベンジルカルバメートも含み得る。いくつかの実施形態において、リンカーは、同じまたは異なるリンカーであってもよい。好適なリンカーとしては、例えば、切断可能な及び切断不可能なリンカーが挙げられる。好適な切断可能なリンカーとしては、例えば、リソソームプロテアーゼまたはエンドソームプロテアーゼなどの細胞内プロテアーゼによって切断可能なペプチドリンカーが挙げられる。切断可能なリンカーは、バリン－シトルリンリンカーまたはバリン－アラニンペプチドを含み得る。いくつかの実施形態において、リンカーは、バリン－シトルリンまたはフェニルアラニン－リジンリンカーなどのジペプチドリンカーであり得る。バリン－シトルリンまたはバリン－アラニン含有リンカーは、マレイミドまたはスクシンイミド基を含有し得る。バリン－シトルリンまたはバリン－アラニン含有リンカーは、パラアミノベンジルアルコール（ＰＡＢＡ）基またはパラ－アミノベンジルカルバメート（ＰＡＢＣ）を含有し得る。他の好適なリンカーとしては、ｐＨ５．５未満で加水分解可能なリンカー、例えば、ヒドラゾンリンカーが挙げられる。さらなる好適な切断可能なリンカーとしては、ジスルフィドリンカーが挙げられる。いくつかの実施形態において、切断可能なリンカーは、腫瘍微小環境で切断されたリンカー、例えば、腫瘍浸潤性Ｔ細胞を含み得る。いくつかの実施形態において、切断不可能なリンカーには、マレイミドカプロイルリンカーが含まれるが、これに限定されない。マレイミドカプロイルリンカーは、Ｎ－マレイミドメチルシクロヘキサン－１－カルボキシレート、スクシンイミド基、ペンタフルオロフェニル基、及び／または１つ以上のＰＥＧ分子を含み得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本発明の組成物、化合物、またはその塩のうちのいずれか１つは、リンカーによりポリペプチドに連結され得る。いくつかの実施形態において、表３、４、５、６、及び７の、本明細書に開示される化合物またはその塩のうちのいずれか１つは、リンカーによりポリペプチドに連結され得る。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、標的化ポリペプチドまたは生物学的標的化ポリペプチドまたは腫瘍標的化ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、標的化ポリペプチドは、抗体または抗体断片である。
いくつかの実施形態において、ＴＣポリペプチドは、モノＰＥＧ化される。本発明はまた、１つ以上の非天然コード化アミノ酸に結合されるリンカー、ポリマー、または生物学的活性分子を含むＴＣを提供し、該非天然コード化アミノ酸は、予め選択された部位でポリペプチドにリボソームにより組み込まれる。
いくつかの実施形態において、本発明は、組み込まれた１つ以上の非天然コード化アミノ酸を有する、１つ以上の標的化ポリペプチドを含む組成物を提供し、ポリペプチドのうちの少なくとも１つは、ポリペプチドの非天然アミノ酸に共有結合されたリンカーを介して、ＴＬＲアゴニスト分子に連結されている。
別の実施形態において、本発明は、１つ以上の標的化ポリペプチドが同じまたは異なる標的化ポリペプチドである組成物を提供する。別の実施形態において、本発明は、１つ以上の標的化ポリペプチドが、細胞表面標的または腫瘍細胞標的またはがん細胞標的に結合する組成物を提供する。別の実施形態において、１つ以上の標的化ポリペプチドは、単一特異性、二重特異性、または多特異性標的化ポリペプチドである。
他の実施形態において、単一特異性、二重特異性、または多特異性標的化ポリペプチドは、薬物コンジュゲートまたはチェックポイント阻害剤を含む。任意の好適な免疫チェックポイント阻害剤は、本発明の組成物またはＴＣと共に使用することが企図される。いくつかの実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、１つ以上の免疫チェックポイントタンパク質の発現または活性を低減する。別の実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、１つ以上の免疫チェックポイントタンパク質とそれらのリガンドとの間の相互作用を低減する。免疫チェックポイント分子の発現及び／または活性を減少させる阻害性核酸も、本発明において使用することができる。いくつかの実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ４、ＴＩＧＩＴ、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）、誘導性Ｔ細胞共刺激性（ＩＣＯＳ）、ＣＤ９６、ポリオウイルス受容体関連２（ＰＶＲＬ２）、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＬＡＧ－３、Ｂ７－Ｈ４、キラー免疫グロブリン受容体（ＫＩＲ）、ＯＸ４０、ＯＸ４０－Ｌインドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ１（ＩＤＯ－１）、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ２（ＩＤＯ－２）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＤ２７２、ＴＥＶＩ３、アデノシンＡ２Ａ受容体、及びＶＩＳＴＡタンパク質である。いくつかの実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、またはＰＤ－Ｌｌの阻害剤である。
別の実施形態において、標的化ポリペプチドは、抗体または抗体断片を含む。他の実施形態において、標的化ポリペプチドは、細胞の抗原に結合する抗体または抗体断片である。別の実施形態において、標的ポリペプチドは、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＥＧＦＲ、ＴＲＯＰ２、ＰＳＭＡ、ＶＥＧＦＲ、ＣＴＬＡ－４、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ｃ－ｍｅｔ、ＧＰＣ３、ＥＮＰＰ３、ＴＩＭ－１、ＦＯＬＲ１、ＳＴＥＡＰ１、メソセリン、５Ｔ４、ＣＥＡ、ＣＡ９、カドヘリン６、ＲＯＲ１、ＳＬＣ３４Ａ２、ＳＬＣ３９Ａ６、ＳＬＣ４４Ａ４、ＬＹ６Ｅ、ＤＬＬ３、ｅＰｈＡ２、ＧＰＮＭＢ、ＳＬＩＴＲＫ６、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ９６、ＣＤ９７、ＣＤ９９、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１７９、ＣＤ２２３、及びＣＤ２７６からなる群から選択される標的に結合する抗体または抗体断片である。いくつかの実施形態において、標的化ポリペプチドは、ＨＥＲ２に結合する抗体または抗体断片を含む。別の実施形態において、標的化ポリペプチドは、トラスツズマブである。
別の実施形態において、抗体または抗体断片は、ＩｇＧ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、または一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を含む。いくつかの実施形態において、抗体または抗体断片は、１つ以上のＦａｂ、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、または一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）変異を含む。いくつかの実施形態において、抗体または抗体断片は、１つ以上のＦｃ変異を含む。他の実施形態において、抗体または抗体断片は、１～６つのＦｃ変異を含む。いくつかの実施形態において、抗体または抗体断片は、２つ以上のＦｃ変異を含む。他の実施形態において、抗体または抗体断片は、３つ以上のＦｃ変異を含む。いくつかの実施形態において、抗体または抗体断片は、４つ以上のＦｃ変異を含む。他の実施形態において、抗体または抗体断片は、５つ以上のＦｃ変異を含む。他の実施形態において、抗体または抗体断片は、６つのＦｃ変異を含む。
別の実施形態において、抗体または抗体断片は、重鎖、軽鎖、または重鎖及び軽鎖の両方に組み込まれた１つ以上の非天然コード化アミノ酸を含む。別の実施形態において、抗体または抗体断片は、重鎖及び軽鎖に組み込まれた１つ以上の非天然コード化アミノ酸を含む。別の実施形態において、抗体または抗体断片は、重鎖、軽鎖、または重鎖及び軽鎖の両方に組み込まれた１つ以上の非天然コード化アミノ酸を含み、１つ以上のＦｃ変異をさらに含む。別の実施形態において、抗体または抗体断片は、重鎖及び軽鎖のそれぞれに組み込まれた１つ以上の非天然コード化アミノ酸を含み、抗体または抗体断片は、１つ以上のＦｃ変異をさらに含む。別の実施形態において、抗体または抗体断片は、重鎖、軽鎖、または重鎖及び軽鎖の両方に組み込まれた１つ以上の非天然コード化アミノ酸を含み、少なくとも２つのＦｃ変異をさらに含む。別の実施形態において、抗体または抗体断片は、重鎖及び軽鎖のそれぞれに組み込まれた１つ以上の非天然コード化アミノ酸を含み、抗体または抗体断片は、少なくとも２つのＦｃ変異をさらに含む。別の実施形態において、抗体または抗体断片は、重鎖、軽鎖、または重鎖及び軽鎖の両方に組み込まれた１つ以上の非天然コード化アミノ酸を含み、少なくとも３つのＦｃ変異をさらに含む。別の実施形態において、抗体または抗体断片は、重鎖及び軽鎖のそれぞれに組み込まれた１つ以上の非天然コード化アミノ酸を含み、抗体または抗体断片は、少なくとも３つのＦｃ変異をさらに含む。別の実施形態において、抗体または抗体断片は、重鎖、軽鎖、または重鎖及び軽鎖の両方に組み込まれた１つ以上の非天然コード化アミノ酸を含み、少なくとも４つのＦｃ変異をさらに含む。別の実施形態において、抗体または抗体断片は、重鎖及び軽鎖のそれぞれに組み込まれた１つ以上の非天然コード化アミノ酸を含み、抗体または抗体断片は、少なくとも４つのＦｃ変異をさらに含む。別の実施形態において、抗体または抗体断片は、重鎖、軽鎖、または重鎖及び軽鎖の両方に組み込まれた１つ以上の非天然コード化アミノ酸を含み、少なくとも５つのＦｃ変異をさらに含む。別の実施形態において、抗体または抗体断片は、重鎖及び軽鎖のそれぞれに組み込まれた１つ以上の非天然コード化アミノ酸を含み、抗体または抗体断片は、少なくとも５つのＦｃ変異をさらに含む。別の実施形態において、抗体または抗体断片は、重鎖、軽鎖、または重鎖及び軽鎖の両方に組み込まれた１つ以上の非天然コード化アミノ酸を含み、少なくとも６つのＦｃ変異をさらに含む。別の実施形態において、抗体または抗体断片は、重鎖及び軽鎖のそれぞれに組み込まれた１つ以上の非天然コード化アミノ酸を含み、抗体または抗体断片は、少なくとも６つのＦｃ変異をさらに含む。
別の実施形態において、標的化ポリペプチドは、パラ－アセチルフェニルアラニン、ｐ－ニトロフェニルアラニン、ｐ－スルホチロシン、ｐ－カルボキシフェニルアラニン、ｏ－ニトロフェニルアラニン、ｍ－ニトロフェニルアラニン、ｐ－ボロニルフェニルアラニン、ｏ－ボロニルフェニルアラニン、ｍ－ボロニルフェニルアラニン、ｐ－アミノフェニルアラニン、ｏ－アミノフェニルアラニン、ｍ－アミノフェニルアラニン、ｏ－アシルフェニルアラニン、ｍ－アシルフェニルアラニン、ｐ－ＯＭｅフェニルアラニン、ｏ－ＯＭｅフェニルアラニン、ｍ－ＯＭｅフェニルアラニン、ｐ－スルホフェニルアラニン、ｏ－スルホフェニルアラニン、ｍ－スルホフェニルアラニン、５－ニトロＨｉｓ、３－ニトロＴｙｒ、２－ニトロＴｙｒ、ニトロ置換Ｌｅｕ、ニトロ置換Ｈｉｓ、ニトロ置換Ｄｅ、ニトロ置換Ｔｒｐ、２－ニトロＴｒｐ、４－ニトロＴｒｐ、５－ニトロＴｒｐ、６－ニトロＴｒｐ、７－ニトロＴｒｐ、３－アミノチロシン、２－アミノチロシン、Ｏ－スルホチロシン、２－スルホオキシフェニルアラニン、３－スルホオキシフェニルアラニン、ｏ－カルボキシフェニルアラニン、ｍ－カルボキシフェニルアラニン、ｐ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－プロパルギル－フェニルアラニン、Ｏ－メチル－Ｌ－チロシン、Ｌ－３－（２－ナフチル）アラニン、３－メチル－フェニルアラニン、Ｏ－４－アリル－Ｌ－チロシン、４－プロピル－Ｌ－チロシン、トリ－Ｏ－アセチル－ＧｌｃＮＡｃβ－セリン、Ｌ－ドパ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アジド－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アシル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ－ヨード－フェニルアラニン、ｐ－ブロモフェニルアラニン、ｐ－アミノ－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－プロパルギルオキシ－Ｌ－フェニルアラニン、４－アジド－Ｌ－フェニルアラニン、パラ－アジドエトキシフェニルアラニン、及びパラ－アジドメチル－フェニルアラニンの群から選択される１つ以上の非天然コード化アミノ酸を含む。別の実施形態において、非天然アミノ酸は、パラ－アセチル－フェニルアラニン、４－アジド－Ｌ－フェニルアラニン、パラ－アジドエトキシフェニルアラニン、またはパラ－アジドメチル－フェニルアラニンからなる群から選択される。他の実施形態において、非天然コード化アミノ酸は、１つ以上の標的化ポリペプチドに部位特異的に組み込まれる。
別の実施形態において、ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、またはＴＬＲ７／ＴＬＲ８デュアルアゴニストである。他の実施形態において、ＴＬＲアゴニストは、図１の構造１、２、３、４、または５のうちのいずれか１つに記載の分子構造を含むＴＬＲアゴニストである。別の実施形態において、ＴＬＲアゴニストは、本発明の表３、４、５、６、７に記載の構造の群から選択されるＴＬＲアゴニストのうちのいずれか１つである。
他の実施形態において、標的化ポリペプチドは、１つ以上のリンカー、ポリマー、または生物学的活性分子にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態において、標的化ポリペプチドは、１つ以上のリンカー、ポリマー、または生物学的活性分子に直接または間接的にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態において、１つ以上のリンカーは、切断可能または切断不可能なリンカーである。
いくつかの実施形態において、１つ以上のリンカーは、０．１ｋＤａ～５０ｋＤａである。他の実施形態において、１つ以上のリンカーは、０．１ｋＤａ～１０ｋＤａである。他の実施形態では、１つ以上のリンカーまたはポリマーは、直鎖状、分枝状、多量体、またはデンドリマーである。別の実施形態において、１つ以上のリンカーまたはポリマーは、二官能性もしくは多官能性リンカーまたは二官能性もしくは多官能性ポリマーである。
他の実施形態において、１つ以上のポリマーは、水溶性ポリマーである。他の実施形態において、水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧは、０．１ｋＤａ～１００ｋＤａの分子量を有する。他の実施形態において、ＰＥＧは、０．１ｋＤａ～５０ｋＤａの分子量を有する。他の実施形態において、ＰＥＧは、０．１ｋＤａ～４０ｋＤａの分子量を有する。他の実施形態において、ＰＥＧは、０．１ｋＤａ～３０ｋＤａの分子量を有する。他の実施形態において、ＰＥＧは、０．１ｋＤａ～２０ｋＤａの分子量を有する。他の実施形態において、ＰＥＧは、０．１ｋＤａ～１０ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施形態において、ポリ（エチレングリコール）分子は、約０．１ｋＤａ～約１００ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施形態において、ポリ（エチレングリコール）分子は、０．１ｋＤａ～５０ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施形態において、ポリ（エチレングリコール）は、１ｋＤａ～２５ｋＤａ、または２～２２ｋＤａ、または５ｋＤａ～２０ｋＤａの分子量を有する。例えば、ポリ（エチレングリコール）ポリマーの分子量は、約５ｋＤａ、または約１０ｋＤａ、または約２０ｋＤａ、または約３０ｋＤａであり得る。例えば、ポリ（エチレングリコール）ポリマーの分子量は、５ｋＤａ、または１０ｋＤａ、または２０ｋＤａ、または３０ｋＤａであり得る。いくつかの実施形態において、ポリ（エチレングリコール）分子は、分枝状ＰＥＧである。いくつかの実施形態において、ポリ（エチレングリコール）分子は、分枝状の５ＫのＰＥＧである。いくつかの実施形態において、ポリ（エチレングリコール）分子は、分枝状の１０ＫのＰＥＧである。いくつかの実施形態において、ポリ（エチレングリコール）分子は、分枝状の２０ＫのＰＥＧである。いくつかの実施形態において、ポリ（エチレングリコール）分子は、直鎖状ＰＥＧである。いくつかの実施形態において、ポリ（エチレングリコール）分子は、直鎖状の５ＫのＰＥＧである。いくつかの実施形態において、ポリ（エチレングリコール）分子は、直鎖状の１０ＫのＰＥＧである。いくつかの実施形態において、ポリ（エチレングリコール）分子は、直鎖状の２０ＫのＰＥＧである。いくつかの実施形態において、ポリ（エチレングリコール）分子は、直鎖状の３０ＫのＰＥＧである。いくつかの実施形態において、ポリ（エチレングリコール）ポリマーの分子量は、平均分子量である。ある特定の実施形態において、平均分子量は、数平均分子量（Ｍｎ）である。平均分子量は、ＧＰＣまたはＳＥＣ、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析、ＲＰ－ＨＰＬＣ、質量分析、またはキャピラリー電気泳動を使用して決定または測定され得る。
別の実施形態において、少なくとも１つのリンカー、ポリマー、または生物学的活性分子は、少なくとも１つの非天然コード化アミノ酸に連結されている。いくつかの実施形態において、リンカーは、ＰＥＧである。他の実施形態において、リンカーは、０．１ｋＤａ～５０ｋＤａの分子量を有するＰＥＧである。他の実施形態において、リンカーは、０．１ｋＤａ～４０ｋＤａの分子量を有するＰＥＧである。他の実施形態において、リンカーは、０．１ｋＤａ～３０ｋＤａの分子量を有するＰＥＧである。他の実施形態において、リンカーは、０．１ｋＤａ～２０ｋＤａの分子量を有するＰＥＧである。他の実施形態において、リンカーは、０．１ｋＤａ～１０ｋＤａの分子量を有するＰＥＧである。他の実施形態において、リンカーは、０．１ｋＤａ～５ｋＤａの分子量を有するＰＥＧである。
別の実施形態において、標的化ポリペプチドは、組成物の安定性または溶解性を増加させる１つ以上のアミノ酸置換、付加、または欠失を含む。別の実施形態において、標的化ポリペプチドは、ＡＤＣＰまたはＡＤＣＣ活性を増強／低減する１つ以上のアミノ酸置換、付加、または欠失を含む。別の実施形態において、標的化ポリペプチドは、組成物の薬物動態を増加させる１つ以上のアミノ酸置換、付加、または欠失を含む。他の実施形態において、組成物は、組換え宿主細胞における、またはインビトロで合成された標的化ポリペプチドの発現を増加させる、１つ以上のアミノ酸置換、付加、または欠失を含む。
別の実施形態において、非天然コード化アミノ酸は、ポリペプチド内の２０個の一般的なアミノ酸のいずれかに対してさもなければ非反応性である、リンカー、ポリマー、または生物学的活性分子に対して反応性である。別の実施形態において、非天然コード化アミノ酸は、カルボニル基、アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、セミカルバジド基、アジド基、またはアルキン基を含む。他の実施形態において、非天然コード化アミノ酸は、カルボニル基を含む。
別の実施形態において、標的化ポリペプチドは、細胞傷害性剤または免疫刺激剤に連結されている。別の実施形態において、本発明のＴＣまたはＢＴＣは、細胞傷害性剤または免疫刺激剤に連結される。別の実施形態において、標的化ポリペプチドは、細胞傷害性剤または免疫刺激剤を含む。別の実施形態において、本発明のＴＣまたはＢＴＣは、細胞傷害性剤または免疫刺激剤を含む。
別の実施形態において、本発明は、図１のいずれかの構造に記載の構造を含むＴＬＲアゴニストにコンジュゲートされた抗ＨＥＲ２抗体または抗体断片を含むＴＬＲアゴニストコンジュゲート（ＴＣ）を提供し、ＴＬＲアゴニストは、抗体または抗体断片に組み込まれた１つ以上の非天然コード化アミノ酸に共有結合されたリンカーを介して抗体または抗体断片にコンジュゲートされる。別の実施形態において、ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、またはＴＬＲ７／ＴＬＲ８デュアルアゴニストである。別の実施形態において、ＴＬＲアゴニストは、図１の構造１に記載の構造を含む。別の実施形態において、構造１に記載の構造を含むＴＬＲアゴニストは、ＡＸＣ－６２１、ＡＸＣ－６２２、ＡＸＣ－６２５、ＡＸＣ－６２６、ＡＸＣ－６２７、ＡＸＣ－６３８、ＡＸＣ－６３９、ＡＸＣ－６４０、ＡＸＣ－６４２、ＡＸＣ－６６２、ＡＸＣ－６６５、ＡＸＣ－６６６、ＡＸＣ－６６７、ＡＸＣ－６６８、ＡＸＣ－６６９、ＡＸＣ－６７０、ＡＸＣ－６７１、ＡＸＣ－６７２、ＡＸＣ－６７５、ＡＸＣ－６７８、ＡＸＣ－６７９、ＡＸＣ－６８１、ＡＸＣ－６８７、ＡＸＣ－６８８、ＡＸＣ－６８９、ＡＸＣ－６９０、ＡＸＣ－６９１、ＡＸＣ－６９６、ＡＸＣ－６９７、ＡＸＣ－６９８、ＡＸＣ－６９９、ＡＸＣ－７００、ＡＸＣ－７０１、ＡＸＣ－７０２、ＡＸＣ－７０９、ＡＸＣ－７１０、ＡＸＣ－７１１、ＡＸＣ－７１２、ＡＸＣ－７１３、ＡＸＣ－７１４、ＡＸＣ－７１５、ＡＸＣ－７１６、ＡＸＣ－７１７、ＡＸＣ－７１８、ＡＸＣ－７１９、ＡＸＣ－７２２、ＡＸＣ－７２３、ＡＸＣ－７２４、ＡＸＣ－７２５、ＡＸＣ－７２６、ＡＸＣ－７２７、ＡＸＣ－７２９、ＡＸＣ－７３１、ＡＸＣ－７３２、ＡＸＣ－７３３、ＡＸＣ－７３４、ＡＸＣ－７３５、ＡＸＣ－７３６、ＡＸＣ－７３７、ＡＸＣ－７３８、ＡＸＣ－７３９、ＡＸＣ－７４０、ＡＸＣ－７４１、ＡＸＣ－７４３、ＡＸＣ－７４２、ＡＸＣ－７４７、ＡＸＣ－７４８、ＡＸＣ－７４９、ＡＸＣ－７５０、ＡＸＣ－７５１、ＡＸＣ－７５２、ＡＸＣ－７５４、ＡＸＣ－７５５、ＡＸＣ－７５６、ＡＸＣ－７５７、ＡＸＣ－７５８、ＡＸＣ－７５９、ＡＸＣ－７６０、ＡＸＣ－７６１、ＡＸＣ－７６２、ＡＸＣ－７６４、ＡＸＣ－７７１、ＡＸＣ－７７２、ＡＸＣ－７７３、ＡＸＣ－７７７、ＡＸＣ－７７８、ＡＸＣ－７７９、ＡＸＣ－７８９、ＡＸＣ－７９３、ＡＸＣ－７９９、ＡＸＣ－８００、ＡＸＣ－８０１、ＡＸＣ－８０２、ＡＸＣ－８０３、ＡＸＣ－８０４、ＡＸＣ－８０５、ＡＸＣ－８０６、ＡＸＣ－８０７、ＡＸＣ－８０８、ＡＸＣ－８０９、ＡＸＣ－８１０、ＡＸＣ－８３１、及びＡＸＣ－９１０化合物の群から選択される。別の実施形態において、本発明は、リンカーをさらに含む、ＡＸＣ－６２１、ＡＸＣ－６２２、ＡＸＣ－６２５、ＡＸＣ－６２６、ＡＸＣ－６２７、ＡＸＣ－６３８、ＡＸＣ－６３９、ＡＸＣ－６４０、ＡＸＣ－６４２、ＡＸＣ－６６２、ＡＸＣ－６６５、ＡＸＣ－６６６、ＡＸＣ－６６７、ＡＸＣ－６６８、ＡＸＣ－６６９、ＡＸＣ－６７０、ＡＸＣ－６７１、ＡＸＣ－６７２、ＡＸＣ－６７５、ＡＸＣ－６７８、ＡＸＣ－６７９、ＡＸＣ－６８１、ＡＸＣ－６８７、ＡＸＣ－６８８、ＡＸＣ－６８９、ＡＸＣ－６９０、ＡＸＣ－６９１、ＡＸＣ－６９６、ＡＸＣ－６９７、ＡＸＣ－６９８、ＡＸＣ－６９９、ＡＸＣ－７００、ＡＸＣ－７０１、ＡＸＣ－７０２、ＡＸＣ－７０９、ＡＸＣ－７１０、ＡＸＣ－７１１、ＡＸＣ－７１２、ＡＸＣ－７１３、ＡＸＣ－７１４、ＡＸＣ－７１５、ＡＸＣ－７１６、ＡＸＣ－７１７、ＡＸＣ－７１８、ＡＸＣ－７１９、ＡＸＣ－７２２、ＡＸＣ－７２３、ＡＸＣ－７２４、ＡＸＣ－７２５、ＡＸＣ－７２６、ＡＸＣ－７２７、ＡＸＣ－７２９、ＡＸＣ－７３１、ＡＸＣ－７３２、ＡＸＣ－７３３、ＡＸＣ－７３４、ＡＸＣ－７３５、ＡＸＣ－７３６、ＡＸＣ－７３７、ＡＸＣ－７３８、ＡＸＣ－７３９、ＡＸＣ－７４０、ＡＸＣ－７４１、ＡＸＣ－７４３、ＡＸＣ－７４２、ＡＸＣ－７４７、ＡＸＣ－７４８、ＡＸＣ－７４９、ＡＸＣ－７５０、ＡＸＣ－７５１、ＡＸＣ－７５２、ＡＸＣ－７５４、ＡＸＣ－７５５、ＡＸＣ－７５６、ＡＸＣ－７５７、ＡＸＣ－７５８、ＡＸＣ－７５９、ＡＸＣ－７６０、ＡＸＣ－７６１、ＡＸＣ－７６２、ＡＸＣ－７６４、ＡＸＣ－７７１、ＡＸＣ－７７２、ＡＸＣ－７７３、ＡＸＣ－７７７、ＡＸＣ－７７８、ＡＸＣ－７７９、ＡＸＣ－７８９、ＡＸＣ－７９３、ＡＸＣ－７９９、ＡＸＣ－８００、ＡＸＣ－８０１、ＡＸＣ－８０２、ＡＸＣ－８０３、ＡＸＣ－８０４、ＡＸＣ－８０５、ＡＸＣ－８０６、ＡＸＣ－８０７、ＡＸＣ－８０８、ＡＸＣ－８０９、ＡＸＣ－８１０、ＡＸＣ－８３１、またはＡＸＣ－９１０化合物のうちのいずれか１つのＴＬＲアゴニストを提供する。別の実施形態において、ＴＬＲアゴニストは、リンカーをさらに含む、構造１に記載の構造を含む。
他の実施形態において、構造１に記載の構造を含むＴＬＲアゴニストは、ＡＸＣ－６２５、ＡＸＣ－６２６、ＡＸＣ－６３８、ＡＸＣ－６３９、ＡＸＣ－６４０、ＡＸＣ－６４２、ＡＸＣ－６６２、ＡＸＣ－６６７、ＡＸＣ－６６８、ＡＸＣ－６６９、ＡＸＣ－６７０、ＡＸＣ－６７１、ＡＸＣ－６７２、ＡＸＣ－６７５、ＡＸＣ－６８１、ＡＸＣ－６８７、ＡＸＣ－６８８、ＡＸＣ－６８９、ＡＸＣ－６９０、ＡＸＣ－６９１、ＡＸＣ－６９７、ＡＸＣ－６９９、ＡＸＣ－７００、ＡＸＣ－７０１、ＡＸＣ－７０２、ＡＸＣ－７０９、ＡＸＣ－７１０、ＡＸＣ－７１１、ＡＸＣ－７１３、ＡＸＣ－７１４、ＡＸＣ－７１７、ＡＸＣ－７１９、ＡＸＣ－７２２、ＡＸＣ－７２３、ＡＸＣ－７２４、ＡＸＣ－７２５、ＡＸＣ－７２６、ＡＸＣ－７２７、ＡＸＣ－７３１、ＡＸＣ－７３２、ＡＸＣ－７３３、ＡＸＣ－７３４、ＡＸＣ－７３５、ＡＸＣ－７３６、ＡＸＣ－７３７、ＡＸＣ－７３８、ＡＸＣ－７３９、ＡＸＣ－７４０、ＡＸＣ－７４１、ＡＸＣ－７４３、ＡＸＣ－７４２、ＡＸＣ－７４７、ＡＸＣ－７４８、ＡＸＣ－７５０、ＡＸＣ－７５１、ＡＸＣ－７５２、ＡＸＣ－７５４、ＡＸＣ－７５５、ＡＸＣ－７５６、ＡＸＣ－７５７、ＡＸＣ－７５８、ＡＸＣ－７５９、ＡＸＣ－７６０、ＡＸＣ－７６１、ＡＸＣ－７６２、ＡＸＣ－７６４、ＡＸＣ－７７１、ＡＸＣ－７７２、ＡＸＣ－７７３、ＡＸＣ－７７７、ＡＸＣ－７７８、ＡＸＣ－７７９、ＡＸＣ－７８９、ＡＸＣ－７９３、ＡＸＣ－８００、ＡＸＣ－８０１、ＡＸＣ－８０２、ＡＸＣ－８０３、ＡＸＣ－８０４、ＡＸＣ－８０５、ＡＸＣ－８０６、ＡＸＣ－８０７、ＡＸＣ－８０８、ＡＸＣ－８０９、ＡＸＣ－８１０、ＡＸＣ－８３１、及びＡＸＣ－９１０化合物の群から選択される。他の実施形態において、構造１に記載の構造を含むＴＬＲアゴニストは、ＡＸＣ－８０１、ＡＸＣ－８０２、ＡＸＣ－８３１、及びＡＸＣ－９１０化合物の群から選択される。他の実施形態において、ＡＸＣ－８０１、ＡＸＣ－８０２、ＡＸＣ－８３１、及びＡＸＣ－９１０化合物の群から選択される構造１に記載の構造を含むＴＬＲアゴニストは、リンカーをさらに含む。
別の実施形態において、抗ＨＥＲ２抗体または抗体断片は、重鎖、軽鎖、または重鎖及び軽鎖の両方に組み込まれた１つ以上の非天然コード化アミノ酸を含む。別の実施形態において、１つ以上の非天然コード化アミノ酸は、パラ－アセチルフェニルアラニン、ｐ－ニトロフェニルアラニン、ｐ－スルホチロシン、ｐ－カルボキシフェニルアラニン、ｏ－ニトロフェニルアラニン、ｍ－ニトロフェニルアラニン、ｐ－ボロニルフェニルアラニン、ｏ－ボロニルフェニルアラニン、ｍ－ボロニルフェニルアラニン、ｐ－アミノフェニルアラニン、ｏ－アミノフェニルアラニン、ｍ－アミノフェニルアラニン、ｏ－アシルフェニルアラニン、ｍ－アシルフェニルアラニン、ｐ－ＯＭｅフェニルアラニン、ｏ－ＯＭｅフェニルアラニン、ｍ－ＯＭｅフェニルアラニン、ｐ－スルホフェニルアラニン、ｏ－スルホフェニルアラニン、ｍ－スルホフェニルアラニン、５－ニトロＨｉｓ、３－ニトロＴｙｒ、２－ニトロＴｙｒ、ニトロ置換Ｌｅｕ、ニトロ置換Ｈｉｓ、ニトロ置換Ｄｅ、ニトロ置換Ｔｒｐ、２－ニトロＴｒｐ、４－ニトロＴｒｐ、５－ニトロＴｒｐ、６－ニトロＴｒｐ、７－ニトロＴｒｐ、３－アミノチロシン、２－アミノチロシン、Ｏ－スルホチロシン、２－スルホオキシフェニルアラニン、３－スルホオキシフェニルアラニン、ｏ－カルボキシフェニルアラニン、ｍ－カルボキシフェニルアラニン、ｐ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－プロパルギル－フェニルアラニン、Ｏ－メチル－Ｌ－チロシン、Ｌ－３－（２－ナフチル）アラニン、３－メチル－フェニルアラニン、Ｏ－４－アリル－Ｌ－チロシン、４－プロピル－Ｌ－チロシン、トリ－Ｏ－アセチル－ＧｌｃＮＡｃβ－セリン、Ｌ－ドパ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アジド－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アシル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ－ヨード－フェニルアラニン、ｐ－ブロモフェニルアラニン、ｐ－アミノ－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－プロパルギルオキシ－Ｌ－フェニルアラニン、４－アジド－Ｌ－フェニルアラニン、パラ－アジドエトキシフェニルアラニン、及びパラ－アジドメチル－フェニルアラニンの群から選択される。他の実施形態において、非天然アミノ酸は、パラ－アセチル－フェニルアラニン、４－アジド－Ｌ－フェニルアラニン、パラ－アジドメチル－フェニルアラニン、またはパラ－アジドエトキシフェニルアラニンである。
別の実施形態において、抗ＨＥＲ２抗体または抗体断片は、Ｆｃ領域に１つ以上の変異をさらに含む。別の実施形態において、抗ＨＥＲ２抗体または抗体断片は、Ｆｃ領域に２つ以上の変異をさらに含む。別の実施形態において、抗ＨＥＲ２抗体または抗体断片は、Ｆｃ領域に３つ以上の変異をさらに含む。別の実施形態において、抗ＨＥＲ２抗体または抗体断片は、Ｆｃ領域に４つ以上の変異をさらに含む。別の実施形態において、抗ＨＥＲ２抗体または抗体断片は、Ｆｃ領域に５つ以上の変異をさらに含む。別の実施形態において、抗ＨＥＲ２抗体または抗体断片は、Ｆｃ領域に６つ以上の変異をさらに含む。別の実施形態において、抗ＨＥＲ２抗体または抗体断片は、Ｆｃ領域に６つの変異をさらに含む。
別の実施形態において、１つ以上のリンカーは、切断可能または切断不可能なリンカーである。他の実施形態において、１つ以上のリンカーは、二官能性または多官能性リンカーである。
別の実施形態において、ＴＬＲアゴニストは、図１の構造２に記載の構造を含む。別の実施形態において、構造２に記載の構造を含むＴＬＲアゴニストは、ＡＸＣ－７４５、ＡＸＣ－７４６、及びＡＸＣ－７５３化合物の群から選択される。別の実施形態において、ＡＸＣ－７４５、ＡＸＣ－７４６、及びＡＸＣ－７５３化合物のうちのいずれか１つに記載の構造を含むＴＬＲアゴニストは、リンカーをさらに含む。別の実施形態において、ＴＬＲアゴニストは、リンカーをさらに含む、構造２に記載の構造を含む。
別の実施形態において、ＴＬＲアゴニストは、図１の構造３に記載の構造を含む。別の実施形態において、ＴＬＲアゴニストは、ＡＸＣ－８３７またはＡＸＣ－８４７化合物である構造３に記載の構造を含む。別の実施形態において、ＴＬＲアゴニストは、リンカーをさらに含む、ＡＸＣ－８３７またはＡＸＣ－８４７化合物に記載の構造を含む。別の実施形態において、ＴＬＲアゴニストは、リンカーをさらに含む、ＡＸＣ－８４７化合物に記載の構造を含む。別の実施形態において、ＴＬＲアゴニストは、リンカーをさらに含む、構造３に記載の構造を含む。
別の実施形態において、ＴＬＲアゴニストは、図１の構造４に記載の構造を含む。別の実施形態において、構造４に記載の構造を含むＴＬＲアゴニストは、ＡＸＣ－８４４、ＡＸＣ－８４２、ＡＸＣ－８４３、ＡＸＣ－８４５、ＡＸＣ－８４６、ＡＸＣ－８３６、またはＡＸＣ－８４１化合物の群から選択される。別の実施形態において、ＡＸＣ－８４４、ＡＸＣ－８４２、ＡＸＣ－８４３、ＡＸＣ－８４５、ＡＸＣ－８４６、ＡＸＣ－８３６、またはＡＸＣ－８４１化合物のうちのいずれか１つの構造４に記載の構造を含むＴＬＲアゴニストは、リンカーをさらに含む。別の実施形態において、ＴＬＲアゴニストは、リンカーをさらに含む、構造４に記載の構造を含む。
別の実施形態において、ＴＬＲアゴニストは、図１の構造５に記載の構造を含む。別の実施形態において、構造５に記載の構造を含むＴＬＲアゴニストは、ＡＸＣ－８６２、ＡＸＣ－８６３、ＡＸＣ－８６７、ＡＸＣ－８６８、ＡＸＣ－８６９、ＡＸＣ－８７２、ＡＸＣ－８７３、ＡＸＣ－８７６、ＡＸＣ－８７７、ＡＸＣ－８７８、ＡＸＣ－８７９、ＡＸＣ－８８０、ＡＸＣ－８８１、ＡＸＣ－８８２、ＡＸＣ－８８３、ＡＸＣ－８８４、ＡＸＣ－８８５、ＡＸＣ－８８６、ＡＸＣ－８８７、ＡＸＣ－８８８、ＡＸＣ－８８９、ＡＸＣ－８９０、ＡＸＣ－８９１、ＡＸＣ－８９２、ＡＸＣ－８９３、ＡＸＣ－８９５、ＡＸＣ－８９６、ＡＸＣ－８９７、ＡＸＣ－８９８、ＡＸＣ－９０１、ＡＸＣ－９０３、ＡＸＣ－９０４、ＡＸＣ－９０５、ＡＸＣ－９０６、ＡＸＣ－９０７、ＡＸＣ－９０８、ＡＸＣ－９０９、ＡＸＣ－９１１、ＡＸＣ－９１２、ＡＸＣ－９１３、ＡＸＣ－９１４、ＡＸＣ－９１５、またはＡＸＣ－９１６化合物の群から選択される。他の実施形態において、構造５に記載の構造を含むＴＬＲアゴニストは、ＡＸＣ－８６２、ＡＸＣ－８６３、ＡＸＣ－８６７、ＡＸＣ－８６８、ＡＸＣ－８６９、ＡＸＣ－８７３、ＡＸＣ－８７６、ＡＸＣ－８７９、ＡＸＣ－８８０、ＡＸＣ－８８２、ＡＸＣ－８８９、ＡＸＣ－８９３、ＡＸＣ－８９６、ＡＸＣ－８９７、ＡＸＣ－９０１、ＡＸＣ－９０７、ＡＸＣ－９０９、ＡＸＣ－９１３、及びＡＸＣ－９１４化合物の群から選択される。別の実施形態において、ＡＸＣ－８６２、ＡＸＣ－８６３、ＡＸＣ－８６７、ＡＸＣ－８６８、ＡＸＣ－８６９、ＡＸＣ－８７２、ＡＸＣ－８７３、ＡＸＣ－８７６、ＡＸＣ－８７７、ＡＸＣ－８７８、ＡＸＣ－８７９、ＡＸＣ－８８０、ＡＸＣ－８８１、ＡＸＣ－８８２、ＡＸＣ－８８３、ＡＸＣ－８８４、ＡＸＣ－８８５、ＡＸＣ－８８６、ＡＸＣ－８８７、ＡＸＣ－８８８、ＡＸＣ－８８９、ＡＸＣ－８９０、ＡＸＣ－８９１、ＡＸＣ－８９２、ＡＸＣ－８９３、ＡＸＣ－８９５、ＡＸＣ－８９６、ＡＸＣ－８９７、ＡＸＣ－８９８、ＡＸＣ－９０１、ＡＸＣ－９０３、ＡＸＣ－９０４、ＡＸＣ－９０５、ＡＸＣ－９０６、ＡＸＣ－９０７、ＡＸＣ－９０８、ＡＸＣ－９０９、ＡＸＣ－９１１、ＡＸＣ－９１２、ＡＸＣ－９１３、ＡＸＣ－９１４、ＡＸＣ－９１５、またはＡＸＣ－９１６化合物のいずれか１つに記載の構造を含むＴＬＲアゴニストは、リンカーをさらに含む。別の実施形態において、ＴＬＲアゴニストは、リンカーをさらに含む、構造５に記載の構造を含む。
別の実施形態において、抗ＨＥＲ２抗体または抗体断片は、配列番号１～１３のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、抗ＨＥＲ２抗体または抗体断片は、配列番号１～１３のうちの少なくとも２つのアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、抗ＨＥＲ２抗体または抗体断片は、ａ）配列番号１または２、ならびにｂ）配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３のうちのいずれか１つを含む。別の実施形態において、抗ＨＥＲ２抗体または抗体断片は、ａ）配列番号１または２の重鎖、ならびにｂ）配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３のうちのいずれか１つの軽鎖を含む。別の実施形態において、抗ＨＥＲ２抗体または抗体断片は、ａ）配列番号１、ならびにｂ）配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３のうちのいずれか１つを含む。別の実施形態において、抗ＨＥＲ２抗体または抗体断片は、ａ）配列番号２、ならびにｂ）配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３のうちのいずれか１つを含む。別の実施形態において、抗ＨＥＲ２抗体または抗体断片は、配列番号２及び配列番号３を含む。別の実施形態において、抗ＨＥＲ２抗体または抗体断片は、配列番号２及び配列番号４を含む。別の実施形態において、抗ＨＥＲ２抗体または抗体断片は、配列番号２及び配列番号５を含む。別の実施形態において、抗ＨＥＲ２抗体または抗体断片は、配列番号２及び配列番号６を含む。別の実施形態において、抗ＨＥＲ２抗体または抗体断片は、配列番号２及び配列番号７を含む。別の実施形態において、抗ＨＥＲ２抗体または抗体断片は、配列番号２及び配列番号８を含む。別の実施形態において、抗ＨＥＲ２抗体または抗体断片は、配列番号２及び配列番号９を含む。別の実施形態において、抗ＨＥＲ２抗体または抗体断片は、配列番号２及び配列番号１０を含む。別の実施形態において、抗ＨＥＲ２抗体または抗体断片は、配列番号２及び配列番号１１を含む。別の実施形態において、抗ＨＥＲ２抗体または抗体断片は、配列番号２及び配列番号１２を含む。別の実施形態において、抗ＨＥＲ２抗体または抗体断片は、配列番号２及び配列番号１３を含む。別の実施形態において、本発明は、抗ＨＥＲ２抗体または抗体断片を提供し、非天然コード化アミノ酸は、Ｋａｂａｔ番号付けによる１１４位に特異的に組み込まれる。
別の実施形態において、本発明は、図１のいずれかの構造に記載の構造を含むＴＬＲアゴニストにコンジュゲートされた抗ＨＥＲ２抗体または抗体断片を含むＴＬＲアゴニストコンジュゲート（ＴＣ）を提供し、ＴＬＲアゴニストは、抗体または抗体断片に組み込まれた１つ以上の非天然コード化アミノ酸に共有結合されたリンカーを介して抗体または抗体断片にコンジュゲートされ、ＴＣは、化学療法剤または免疫療法剤をさらに含む。別の実施形態において、本発明は、表３～７の化合物のうちのいずれか１つから選択されるＴＬＲアゴニストにコンジュゲートされた抗ＨＥＲ２抗体または抗体断片を含むＴＬＲアゴニストコンジュゲート（ＴＣ）を提供し、ＴＬＲアゴニストは、抗体または抗体断片に組み込まれた１つ以上の非天然コード化アミノ酸に共有結合されたリンカーを介して抗体または抗体断片にコンジュゲートされる。別の実施形態において、本発明は、表３～７の化合物のうちのいずれか１つから選択されるＴＬＲアゴニストにコンジュゲートされた抗ＨＥＲ２抗体または抗体断片を含むＴＬＲアゴニストコンジュゲート（ＴＣ）を提供し、ＴＬＲアゴニストは、抗体または抗体断片に組み込まれた１つ以上の非天然コード化アミノ酸に共有結合されたリンカーを介して抗体または抗体断片にコンジュゲートされ、ＴＣは、化学療法剤または免疫療法剤をさらに含む。
別の実施形態において、本発明は、図１のいずれかの構造に記載の構造を含むＴＬＲアゴニストにコンジュゲートされた抗ＨＥＲ２抗体または抗体断片を含むＴＬＲアゴニストコンジュゲート（ＴＣ）を提供し、ＴＬＲアゴニストは、抗体または抗体断片に組み込まれた１つ以上の非天然コード化アミノ酸に共有結合されたリンカーを介して抗体または抗体断片にコンジュゲートされ、ＴＣは、薬物コンジュゲートをさらに含む。他の実施形態において、薬物コンジュゲートは、抗体薬物コンジュゲートである。別の実施形態において、本発明は、表３～７の化合物のうちのいずれか１つから選択されるＴＬＲアゴニストにコンジュゲートされた抗ＨＥＲ２抗体または抗体断片を含むＴＬＲアゴニストコンジュゲート（ＴＣ）を提供し、ＴＬＲアゴニストは、抗体または抗体断片に組み込まれた１つ以上の非天然コード化アミノ酸に共有結合されたリンカーを介して抗体または抗体断片にコンジュゲートされる。別の実施形態において、本発明は、表３～７の化合物のうちのいずれか１つから選択されるＴＬＲアゴニストにコンジュゲートされた抗ＨＥＲ２抗体または抗体断片を含むＴＬＲアゴニストコンジュゲート（ＴＣ）を提供し、ＴＬＲアゴニストは、抗体または抗体断片に組み込まれた１つ以上の非天然コード化アミノ酸に共有結合されたリンカーを介して抗体または抗体断片にコンジュゲートされ、ＴＣは、薬物コンジュゲートをさらに含む。他の実施形態において、薬物コンジュゲートは、抗体薬物コンジュゲートである。他の実施形態において、ＴＣは、サイトカインまたはサイトトキシンをさらに含む。
別の実施形態において、本発明は、対象または患者に、治療有効量の本発明の組成物またはＴＣを投与することを含む、がんまたは疾患または状態または適応症または障害を有する対象または患者を治療する方法を提供する。ある特定の実施形態において、腫瘍またはがんは、ＨＥＲ２陽性腫瘍またはがんである。ある特定の実施形態において、腫瘍、がん、適応症、疾患、障害、または状態は、ＨＥＲ２陽性腫瘍、がん、適応症、疾患、障害、または状態である。ある特定の実施形態において、腫瘍またはがんは、結腸癌、卵巣癌、乳癌、黒色腫、肺癌、膠芽腫、前立腺癌、膀胱癌、子宮頸癌、膵臓癌、腎臓癌、食道癌、膣癌、胃癌、及び白血病からなる群から選択される。
別の実施形態において、本発明は、対象または患者に、治療有効量の、化学療法剤または免疫療法剤をさらに含む、本発明の組成物またはＴＣを投与することを含む、がんまたは疾患または状態を有する対象または患者を治療する方法を提供する。ある特定の実施形態において、ＴＣは、少なくとも１つの化学療法剤と同時投与される。化学療法剤は、テモゾロミド、ゲムシタビン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、パクリタキセル、シスプラチン、フルオロピリミジン、タキサン、アントラサイクリン、ラパチニブ、カペシタビン、レトロゾール、ペルツズマブ、ドセタキセル、ＩＦＮ－αからなる群から選択され得る。本発明の別の実施形態において、ＴＣは、少なくとも１つの化学療法剤と同時投与される。
別の実施形態において、本発明は、対象または患者に、治療有効量の、抗体薬物コンジュゲート、細胞傷害性剤、またはチェックポイント阻害剤をさらに含む、本発明の組成物またはＴＣを投与することを含む、がんまたは疾患または状態を有する対象または患者を治療する方法を提供する。
別の実施形態において、本発明は、細胞を、本発明のＴＣと接触させることを含む、細胞を死滅させる方法を提供する。他の実施形態において、本細胞は、腫瘍またはがん細胞である。ある特定の実施形態において、腫瘍またはがん細胞は、結腸、卵巣、乳房、黒色腫、肺、膠芽腫、前立腺、膀胱、子宮頸部、膵臓、腎臓、食道、膣、胃、または白血病がん細胞である。ある特定の実施形態において、腫瘍またはがんは、ＨＥＲ２陽性腫瘍またはがんである。ある特定の実施形態において、治療される腫瘍、がん、適応症、疾患、障害、または状態は、ＨＥＲ２陽性腫瘍、がん、適応症、疾患、障害、または状態である。
本発明は、腫瘍に近接して患者の免疫系を刺激するために、腫瘍を、有効量の本発明のＴＣと接触させることを含む、腫瘍またはがんの成長を阻害または低減する方法を提供する。本発明は、腫瘍を、有効量の本発明のＰＥＧ化ＴＣ、またはＴＣの安定した二量体もしくは多量体と接触させることを含む、腫瘍またはがんの成長を阻害または低減する方法を提供する。一実施形態において、ＴＣは、非ペグ化またはモノペグ化される。一実施形態において、ＴＣは、ジペグ化される。一実施形態において、ＴＣは、それに結合された２つ以上の及び／または異なるＴＬＲアゴニスト分子を有する。本発明の別の実施形態は、腫瘍細胞に対する免疫応答を調節するために、本発明のＴＣを使用する方法を提供する。
いくつかの実施形態において、本発明は、がんを治療するためにＴＣを使用する方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明のＴＣは、がん、例えば、血管新生及び異形成などの前がん状態に直接または間接的に関連する状態を含む、がん関連疾患、障害、及び状態の治療または予防に使用することができる。いくつかの実施形態において、腫瘍は、液性または固形腫瘍である。いくつかの実施形態において、治療される状態は、がんである。がんは、乳癌、脳癌、膵臓癌、皮膚癌、肺癌、肝臓癌、胆嚢癌、結腸癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮癌、骨癌、及び血液癌（白血病性癌）、またはこれらのがんのいずれかに関連するがんまたは疾患または状態であり得るが、これらに限定されない。癌腫は、上皮細胞から始まるがんであり、上皮細胞は、身体の表面を覆い、ホルモンを産生し、腺を構成する細胞である。非限定的な例として、癌腫には、乳癌、膵臓癌、肺癌、結腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、腎臓癌、膀胱癌、胃癌、前立腺癌、肝臓癌、卵巣癌、脳癌、膣癌、外陰部癌、子宮癌、口腔癌、陰茎癌、精巣癌、食道癌、皮膚癌、卵管の癌、頭頸部癌、消化管間質癌、腺癌、皮膚または眼内黒色腫、肛門領域の癌、小腸の癌、内分泌系の癌、甲状腺の癌、副甲状腺の癌、副腎の癌、尿道の癌、腎盂腎癌、尿管の癌、子宮内膜の癌、子宮頸部の癌、下垂体の癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の腫瘍、原発性ＣＮＳリンパ腫、脳幹神経膠腫、及び脊髄軸腫瘍が含まれる。いくつかの症例では、がんは、基底細胞癌、扁平上皮癌、黒色腫、非黒色腫、または日光（太陽）角化症などの皮膚癌である。いくつかの実施形態において、本発明はまた、哺乳動物における急性白血病を治療するための方法に関し、これには、治療有効量の本発明のＴＣを、該哺乳動物に投与することが含まれる。本発明はまた、急性白血病芽細胞の増殖を阻害するための方法を提供し、これには、治療有効量の本発明のＴＣを、急性白血病を患う哺乳動物に投与することが含まれる。
別の実施形態において、本明細書に開示されるＴＣは、免疫応答を調節するために使用され得る。免疫応答の調節は、免疫応答の刺激、活性化、増加、増強、または上方調節を含み得る。免疫応答の調節は、免疫応答を抑制、阻害、予防、低減、または下方調節することを含み得る。
別の実施形態において、本発明は、治療有効量の本発明の組成物またはＴＣと、医薬的に許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
別の実施形態において、本発明は、製剤の製造における本発明の組成物の使用を提供する。
別の実施形態において、本発明は、図１の構造のうちのいずれか１つに記載のＴＬＲアゴニストを含む、免疫刺激抗体コンジュゲート（ＩＳＡＣ）を提供する。別の実施形態において、本発明は、表３、４、５、６、７の化合物のうちのいずれか１つに記載のＴＬＲアゴニストを含む、免疫刺激抗体コンジュゲート（ＩＳＡＣ）を提供する。別の実施形態において、本発明は、ＴＬＲアゴニストが、ＡＸＣ－８６２、ＡＸＣ－８６３、ＡＸＣ－８６７、ＡＸＣ－８６８、ＡＸＣ－８６９、ＡＸＣ－８７４、ＡＸＣ－８７５、ＡＸＣ－８７６、ＡＸＣ－８７９、ＡＸＣ－８８０、ＡＸＣ－８８２、ＡＸＣ－８９３、ＡＸＣ－８９６、ＡＸＣ－８９７、ＡＸＣ－９０１、ＡＸＣ－９０７、及びＡＸＣ－９１０化合物の群から選択される化合物を含むＩＳＡＣを提供する。
別の実施形態において、本発明は、図１に記載の構造を有する化合物のうちのいずれか１つの塩を提供する。別の実施形態において、本発明は、表３、４、５、６、７の化合物のうちのいずれか１つの塩を提供する。別の実施形態において、本発明は、本開示の組成物、化合物、及びＴＣによる医薬組成物またはその塩を提供する。他の実施形態において、医薬組成物または塩は、医薬的に許容される賦形剤をさらに含む。
〔図面の簡単な説明〕
〔図１〕本発明での使用に好適なＴＬＲアゴニストの一般構造を示す。
〔図２〕種々のＴＣコンジュゲートの構造を示す。
〔図３〕さらなるＴＣコンジュゲートの構造を示す。
〔図４〕細胞増殖アッセイにおける選択されたＴＣコンジュゲートの生物学的活性を示す。
〔図５〕Ａ及びＢは、種々のＴＬＲ７アゴニストのＴＬＲ７活性を示す。
〔図６〕リンカーに結合された種々のＴＬＲ７アゴニストのＴＬＲ７活性を示す。
〔図７〕さらなるＴＬＲ７アゴニスト及びリンカーに結合されたＴＬＲ７アゴニストのＴＬＲ７活性を示す。
〔図８〕さらなるＴＬＲ７アゴニスト及びリンカーに結合されたＴＬＲ７アゴニストのＴＬＲ７活性を示す。
〔図９〕非天然アミノ酸であるｐＡＦ（ＤＬ－ｐＡＦ）と比較した、リンカーに結合された異なるＴＬＲ７アゴニスト（薬物リンカーまたはＤＬ）のＴＬＲ７活性を示す。
〔図１０〕アミノ酸位置ＨＡ１１４に非天然アミノ酸を有する非コンジュゲート抗ＨＥＲ２抗体（Ａ）、ならびにＴＬＲアゴニストＡＸＣ－８７５（Ｂ）及びＡＸＣ－８８０（Ｃ）を有するアミノ酸位置ＨＡ１１４にコンジュゲートされた抗ＨＥＲ２抗体のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
〔図１１〕ＳＫＯＶ３ ＨＥＲ２高発現腫瘍細胞株（Ａ）、ＪＩＭＴ－１ ＨＥＲ２中／低発現腫瘍細胞株（Ｂ）、及びＡ４３１ ＨＥＲ２低発現腫瘍細胞株（Ｃ）における、抗ＨＥＲ２抗体にコンジュゲートされた種々のペイロードリンカーの腫瘍依存性ＩＳＡＣ活性を比較する。
〔図１２〕ＳＫＢＲ３ ＨＥＲ２高発現腫瘍細胞株（Ａ）及びＨＣＣ１８０６ ＨＥＲ２超低発現腫瘍細胞株（Ｂ）における、抗ＨＥＲ２抗体にコンジュゲートされたさらなるペイロードリンカーの腫瘍依存性ＩＳＡＣ活性を比較する。
〔図１３〕ＳＫＢＲ３ ＨＥＲ２高発現腫瘍細胞株（Ａ）及びＨＣＣ１８０６ ＨＥＲ２超低発現腫瘍細胞株（Ｂ）における、抗ＨＥＲ２抗体にコンジュゲートされたさらなるペイロードリンカーの腫瘍依存性ＩＳＡＣ活性を比較する。
〔図１４〕ＳＫＢＲ３ ＨＥＲ２高発現腫瘍細胞株（Ａ）及びＨＣＣ１８０６ ＨＥＲ２超低発現腫瘍細胞株（Ｂ）における、抗ＨＥＲ２抗体にコンジュゲートされたさらなるペイロードリンカーの腫瘍依存性ＩＳＡＣ活性を比較する。
〔図１５〕ＳＫＢＲ３ ＨＥＲ２高発現腫瘍細胞株（Ａ）及びＨＣＣ１８０６ ＨＥＲ２超低発現腫瘍細胞株（Ｂ）における、抗ＨＥＲ２抗体にコンジュゲートされた３つの（３）ペイロードリンカーの腫瘍依存性ＩＳＡＣ活性を比較し、ＨＥＲ２－ＡＸＣ－８７９が最良のＩＳＡＣ活性を有することを示す。
〔発明を実施するための形態〕
抗体などの標的化部分及び１つ以上のＴＬＲアゴニストを含むＴＣが本明細書に開示される。ＴＬＲアゴニストは、１つ以上のリンカー（複数可）をさらに含み得る。本発明のＴＣは、標的化部分の非天然アミノ酸に連結されたＴＬＲアゴニストを含み得る。また、標的化部分ポリペプチドに組み込まれた非天然アミノ酸を含むそのようなＴＣを作製するための方法も含まれる。
ある特定の実施形態において、記載される化合物のいずれかと、医薬的に許容される担体、賦形剤、または結合剤とを含む、医薬組成物が提供される。
さらなるまたは代替的な実施形態は、患者におけるポリペプチドの存在を検出するための方法であり、該方法は、少なくとも１つの複素環含有非天然アミノ酸を含むポリペプチドを投与することを含み、得られる複素環含有非天然アミノ酸ポリペプチドは、相同的な天然に存在するアミノ酸ポリペプチドに対してポリペプチドの免疫原性を調節する。
本明細書に記載の方法及び組成物は、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコル、細胞株、構築物、及び試薬に限定されず、したがって変化し得ることが理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、単に特定の実施形態を説明するためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される、本明細書に記載の方法及び組成物の範囲を限定することを意図するものではないことも理解されたい。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確に他のことを指示しない限り、複数の参照を含む。
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本明細書に記載の発明が属する当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法、デバイス、及び材料を、本明細書に記載の本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法、デバイス、及び材料をここで説明する。
本明細書で言及されるすべての刊行物及び特許は、例えば、刊行物に記載されている構築物及び方法論を説明及び開示する目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれており、これは現在記載されている発明と関連して使用され得る。本明細書において論じられる刊行物は、本出願の出願日より前のそれらの開示についてのみ提供される。本明細書におけるいかなるものも、本明細書に記載の発明者が、先行発明またはいかなる他の理由によってもそのような開示に先行する権利がないことを認めるものとして解釈されるべきではない。
「アルドールベースの連結」または「混合アルドールベースの連結」という用語は、β－ヒドロキシカルボニル化合物－アルドールを生成するための、あるカルボニル化合物と、同じであってもなくてもよい別のカルボニル化合物のエノレート／エノールとの酸または塩基触媒縮合を指す。
本明細書で使用される場合、「親和性標識」という用語は、それを修飾するか、それを破壊するか、またはそれと化合物を形成するかのいずれかのために、別の分子に可逆的または不可逆的に結合する標識を指す。例として、親和性標識は、酵素及びそれらの基質、または抗体及びそれらの抗原を含む。
「アルコキシ」、「アルキルアミノ」、及び「アルキルチオ」（またはチオアルコキシ）という用語は、それらの従来の意味で使用され、それぞれ、酸素原子、アミノ基、または硫黄原子を介して分子に連結されたそれらのアルキル基を指す。
「アルキル」という用語は、それ自体または別の分子の一部として、別段の記載がない限り、直鎖もしくは分枝鎖、または環状炭化水素ラジカル、またはそれらの組み合わせを意味し、これは、完全飽和、一価または多価不飽和であり得、指定された炭素原子の数を有する（すなわち、Ｃ１～Ｃ１０は、１～１０個の炭素を意味する）二価及び多価ラジカルを含み得る。飽和炭化水素ラジカルの例としては、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｔ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチル、例えば、ｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチルなどの相同体及び異性体などの基が挙げられるが、これらに限定されない。不飽和アルキル基は、１つ以上の二重結合または三重結合を有するものである。不飽和アルキル基の例としては、ビニル、２－プロペニル、クロチル、２－イソペンテニル、２－（ブタジエニル）、２，４－ペンタジエニル、３－（１，４－ペンタジエニル）、エチニル、１－及び３－プロピニル、３－ブチニル、ならびにより高い相同体及び異性体が挙げられるが、これらに限定されない。「アルキル」という用語は、別段の記載がない限り、「ヘテロアルキル」、「ハロアルキル」、及び「ホモアルキル」などの、本明細書により詳細に定義されるアルキルのそれらの誘導体を含むことも意味する。
「アルキレン」という用語は、それ自体または別の分子の一部として、（－ＣＨ２－）ｎによって例示されるように、アルカンに由来する二価のラジカルを意味し、式中、ｎは、１～約２４であり得る。単なる例として、そのような基には、構造－ＣＨ２ＣＨ２－及び－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－などの１０個以下の炭素原子を有する基が含まれるが、これらに限定されない。「低級アルキル」または「低級アルキレン」は、一般に８個以下の炭素原子を有する、より短い鎖のアルキルまたはアルキレン基である。「アルキレン」という用語は、別段の記載がない限り、「ヘテロアルキレン」として本明細書に記載されるそれらの基を含むことも意味する。
「アミノ酸」という用語は、天然に存在する及び非天然のアミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣物を指す。天然にコードされるアミノ酸は、２０個の一般的なアミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリン）、ならびにピロリジン、及びセレノシステインである。アミノ酸類似体とは、天然に存在するアミノ酸、ほんの一例として、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基に結合されるα炭素と同じ基本的な化学構造を有する化合物を指す。そのような類似体は、修飾されたＲ基（例として、ノルロイシン）を有し得るか、または天然に存在するアミノ酸と同じ基本的な化学構造を依然として保持しながら修飾されたペプチド骨格を有し得る。アミノ酸類似体の非限定的な例としては、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムが挙げられる。
アミノ酸は、本明細書において、それらの名称、それらの一般的に知られている３文字記号、またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名委員会（ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）によって推奨される１文字記号のいずれかによって参照され得る。加えて、ヌクレオチドは、それらの一般に受け入れられている１文字コードによって参照されてもよい。
「アミノ末端修飾基」とは、末端アミン基に結合することができる任意の分子を指す。例として、そのような末端アミン基は、ポリマー分子の末端にあってもよく、そのようなポリマー分子は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、及び多糖類を含むが、これらに限定されない。末端修飾基には、種々の水溶性ポリマー、ペプチド、またはタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。ほんの一例として、末端修飾基には、ポリエチレングリコールまたは血清アルブミンが含まれる。末端修飾基は、ペプチドの血清半減期を増加させることを含むが、これに限定されないポリマー分子の治療特徴を修飾するために使用され得る。
本明細書における「抗体」とは、抗体遺伝子のすべてまたは一部によって実質的にコードされる１つ以上のポリペプチドからなるタンパク質を意味する。免疫グロブリン遺伝子としては、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４）、デルタ、イプシロン、及びミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書における抗体は、完全長抗体及び抗体断片を含み、任意の生物内に自然に存在するか、または操作される抗体（例えば、バリアント）を含むことを意味する。
「抗体断片」とは、全長形態以外の抗体の任意の形態を意味する。本明細書における抗体断片としては、全長抗体内に存在するより小さい構成要素である抗体、及び操作されている抗体が挙げられる。抗体断片には、限定されないが、Ｆｖ、Ｆｃ、Ｆａｂ、及び（Ｆａｂ’）２、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、二機能性ハイブリッド抗体、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＣＤＲの組み合わせ、可変領域、フレームワーク領域、定常領域、重鎖、軽鎖、及び可変領域、ならびに代替の足場非抗体分子、二重特異性抗体などが含まれる（Ｍａｙｎａｒｄ＆Ｇｅｏｒｇｉｏｕ，２０００，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．２：３３９－７６、Ｈｕｄｓｏｎ，１９９８，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：３９５－４０２）。別の機能的部分構造は、ペプチドリンカーによって共有結合される、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の可変領域からなる一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である（Ｓ－ｚ Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５６，３０５５－３０６１）。これらの小さな（Ｍｒ２５，０００）タンパク質は、一般に、単一ポリペプチド中の抗原に対する特異性及び親和性を保持し、より大きな抗原特異的分子のための便利な構築ブロックを提供することができる。特に記述のない限り、「抗体（複数可）」という用語を使用する明細書及び特許請求の範囲には、「抗体断片（複数可）」が具体的に含まれる。
本明細書で使用される場合、「抗体－薬物コンジュゲート」または「ＡＤＣ」とは、１つ以上の生物学的活性分子（複数可）に共有結合される抗体分子またはその断片を指す。生物学的活性分子は、リンカー、ポリマー、または他の共有結合を介して抗体にコンジュゲートされ得る。
本明細書で使用される場合、「芳香族」または「アリール」という用語は、コンジュゲートされたπ電子系を有する少なくとも１つの環を有し、炭素環式アリール及び複素環式アリール（または「ヘテロアリール」または「ヘテロ芳香族」）基の両方を含む閉環構造を指す。炭素環式または複素環式芳香族基は、５～２０個の環原子を含有し得る。この用語は、共有結合的に連結された単環式環または縮合環多環式（すなわち、隣接する炭素原子の対を共有する環）基を含む。芳香族基は、非置換であるか、または置換されていてもよい。「芳香族」または「アリール」基の非限定的な例としては、フェニル、１－ナフチル、２－ナフチル、４－ビフェニル、アントラセニル、及びフェナントラセニルが挙げられる。上述のアリール及びヘテロアリール環系のそれぞれに対する置換基は、本明細書に記載の許容される置換基の群から選択される。
簡潔に述べると、「芳香族」または「アリール」という用語は、他の用語と組み合わせて使用される場合（アリールオキシ、アリールチオキシ、アラルキルを含むが、これらに限定されない）、上で定義したアリール環及びヘテロアリール環の両方を含む。したがって、「アラルキル」または「アルカリル」という用語は、炭素原子（メチレン基を含むがこれに限定されない）がヘテロ原子、ほんの一例として、酸素原子に置き換えられているそれらのアルキル基を含む、アリール基がアルキル基（ベンジル、フェネチル、ピリジルメチルなどを含むがこれらに限定されない）に結合されるそれらのラジカルを含むことを意味する。そのようなアリール基の例としては、フェノキシメチル、２－ピリジルオキシメチル、３－（１－ナフチルオキシ）プロピルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「アリレン」という用語は、二価のアリールラジカルを指す。「アリレン」の非限定的な例としては、フェニレン、ピリジニレン、ピリミジニレン、及びチオフェニレンが挙げられる。アリレン基の置換基は、本明細書に記載の許容される置換基の群から選択される。
「二官能性ポリマー」は、「二官能性リンカー」とも称され、共有結合または非共有結合を形成するために他の部分と特異的に反応することが可能な２つの官能基を含むポリマーを指す。そのような部分には、天然もしくは非天然アミノ酸、またはそのような天然もしくは非天然アミノ酸を含有するペプチド上の側基が含まれ得るが、これらに限定されない。二官能性リンカーまたは二官能性ポリマーに連結され得る他の部分は、同じであっても異なっていてもよい。ほんの一例として、二官能性リンカーは、第１のペプチド上の基と反応性の官能基、及び第２のペプチド上の基と反応性の別の官能基を有し得、それにより、第１のペプチド、二官能性リンカー、及び第２のペプチドを含むコンジュゲートを形成する。種々の化合物をペプチドに結合させるための多くの手順及びリンカー分子が既知である。例えば、欧州特許出願第１８８，２５６号、米国特許第４，６７１，９５８号、同第４，６５９，８３９号、同第４，４１４，１４８号、同第４，６９９，７８４号、同第４，６８０，３３８号、及び同第４，５６９，７８９号を参照されたい（これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。「多官能性ポリマー」は、「多官能性リンカー」とも称され、他の部分と反応することが可能な２つ以上の官能基を含むポリマーを指す。そのような部分には、天然もしくは非天然アミノ酸、またはそのような天然もしくは非天然アミノ酸を含有するペプチド上の側基が含まれ得るが、これらに限定されない。共有結合または非共有結合を形成するための（アミノ酸側基を含むがこれらに限定されない）。二官能性ポリマーまたは多官能性ポリマーは、任意の所望の長さまたは分子量であってもよく、化合物に連結された１つ以上の分子と、それが結合する分子または化合物との間に特定の所望の間隔または立体配座を提供するように選択され得る。
本明細書で使用される場合、「バイオアベイラビリティ」という用語は、物質またはその活性部分が医薬剤形から送達され、作用部位でまたは一般的な循環において利用可能になる速度及び程度を指す。バイオアベイラビリティの増加は、物質またはその活性部分が医薬剤形から送達され、作用部位または一般的な循環において利用可能になる速度及び程度の増加を指す。例として、バイオアベイラビリティの増加は、他の物質または活性部分と比較したときに、血液中の物質またはその活性部分の濃度の増加として示され得る。バイオアベイラビリティの増加を評価するための方法は当該技術分野で既知であり、任意のポリペプチドのバイオアベイラビリティを評価するために使用され得る。
本明細書で使用される場合、「生物学的活性分子」、「生物学的活性部分」、または「生物学的活性剤」という用語は、ウイルス、細菌、バクテリオファージ、トランスポゾン、プリオン、昆虫、真菌、植物、動物、及びヒトを含むがこれらに限定されない、生物に関する生物学系、経路、分子、または相互作用の任意の物理的または生化学的特性に影響を及ぼし得る任意の物質を意味する。特に、本明細書で使用される場合、生物学的活性分子には、ヒトもしくは他の動物における疾患の診断、治癒、緩和、治療、もしくは予防を目的とした、またはさもなければヒトもしくは動物の身体的もしくは精神的健康を増強することを目的とした任意の物質が含まれるが、これに限定されない。生物学的活性分子の例としては、ペプチド、タンパク質、酵素、小分子薬物、ハードドラッグ、ソフトドラッグ、プロドラッグ、炭水化物、無機原子または分子、染料、脂質、ヌクレオシド、放射性核種、オリゴヌクレオチド、毒素、細胞、ウイルス、リポソーム、微粒子、及びミセルが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載の方法及び組成物との使用に好適な生物学的活性剤のクラスには、薬物、プロドラッグ、放射性核種、撮像剤、ポリマー、抗生物質、殺菌剤、抗ウイルス剤、抗炎症剤、抗腫瘍剤、心血管治療薬、抗不安剤、ホルモン、成長因子、ステロイド剤、微生物由来毒素などが含まれるが、これらに限定されない。
「生物学的活性の調節」とは、ポリペプチドの反応性を増加または減少させ、ポリペプチドの選択性を変化させ、ポリペプチドの基質選択性を増強または減少させることを意味する。修飾された生物学的活性の分析は、非天然ポリペプチドの生物学的活性を天然ポリペプチドの生物学的活性と比較することによって実施することができる。
本明細書で使用される場合、「生体材料」という用語は、バイオリアクター及び／または組換え方法及び技法から得られる材料を含むが、これらに限定されない、生物学的由来の材料を指す。
本明細書で使用される場合、「生物物理学的プローブ」という用語は、分子の構造変化を検出または監視することができるプローブを指す。そのような分子には、タンパク質が含まれるが、これに限定されず、「生物物理学的プローブ」は、他の巨大分子とのタンパク質の相互作用を検出または監視するために使用され得る。生物物理学的プローブの例としては、スピン標識、フルオロフォア、及び光活性化基が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「生合成的に」という用語は、次の構成要素：ポリヌクレオチド、コドン、ｔＲＮＡ、及びリボソームのうちの少なくとも１つの使用を含む、翻訳系（細胞または非細胞）を利用する任意の方法を指す。例として、非天然アミノ酸は、ＷＯ２００２／０８５９２３（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載の方法及び技法を使用して、非天然アミノ酸ポリペプチドに「生合成的に組み込まれ」得る。加えて、非天然アミノ酸ポリペプチドに「生合成的に組み込まれ」得る有用な非天然アミノ酸の選択方法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２００２／０８５９２３に記載される。
本明細書で使用される場合、「ビオチン類似体」または「ビオチン模倣物」とも称される用語は、アビジン及び／またはストレプトアビジンに高い親和性で結合するビオチン以外の任意の分子である。
本明細書で使用される場合、「カルボニル」という用語は、少なくとも１つのケトン基、及び／または少なくとも１つのアルデヒド基、及び／または少なくとも１つのエステル基、及び／または少なくとも１つのカルボン酸基、及び／または少なくとも１つのチオエステル基を含有する基を含むがこれらに限定されない、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２－、及び－Ｃ（Ｓ）－からなる群から選択される部分を含有する基を指す。そのようなカルボニル基には、ケトン、アルデヒド、カルボン酸、エステル、及びチオエステルが含まれる。加えて、そのような基は、直鎖状、分枝状、または環状分子の一部であり得る。
「カルボキシ末端修飾基」という用語は、末端カルボキシ基に結合することができる任意の分子を指す。例として、そのような末端カルボキシ基は、ポリマー分子の末端にあってもよく、そのようなポリマー分子は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、及び多糖類を含むが、これらに限定されない。末端修飾基には、種々の水溶性ポリマー、ペプチド、またはタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。ほんの一例として、末端修飾基には、ポリエチレングリコールまたは血清アルブミンが含まれる。末端修飾基は、ペプチドの血清半減期を増加させることを含むがこれに限定されないポリマー分子の治療特徴を修飾するために使用され得る。
本明細書で使用される場合、「化学的に切断可能な基」という用語は、「化学的に不安定な」とも称され、酸、塩基、酸化剤、還元剤、化学反応開始剤、またはラジカル反応開始剤に暴露されると分解または切断される基を指す。
本明細書で使用される場合、「コフォールディング」は、互いに相互作用し、折り畳まれていないまたは不適切に折り畳まれた分子の、適切な折り畳まれた分子への変換をもたらす少なくとも２つの分子を用いる再折り畳みプロセス、反応、または方法を指す。ほんの一例として、「コフォールディング」は、互いに相互作用し、折り畳まれていないまたは不適切に折り畳まれたポリペプチドの、天然の適切に折り畳まれたポリペプチドへの変換をもたらす少なくとも２つのポリペプチドを用いる。そのようなポリペプチドは、天然アミノ酸及び／または少なくとも１つの非天然アミノ酸を含有し得る。
本明細書で使用される場合、「コンジュゲート」は、本明細書に記載の化合物または化合物－リンカー、例えば、図１に記載の構造のうちのいずれか１つの化合物もしくは塩、または表３～７の構造のうちのいずれか１つに直接的にまたはリンカーを介してのいずれかで、連結される、例えば、共有結合されるポリペプチドを指す。「標的化部分」は、他の非標的分子と比較して標的分子に対して選択的親和性を有する構造を指す。本発明の標的化部分は、標的分子に結合する。標的化部分は、例えば、抗体、ペプチド、リガンド、受容体、またはそれらの結合部分を含み得る。標的生物学的分子は、生物学的受容体または腫瘍抗原などの細胞の他の構造であり得る。本明細書で使用される場合、「本発明のコンジュゲート」、「標的化部分コンジュゲート」、「標的化コンジュゲート」、「標的化部分活性分子コンジュゲート」、または「ＴＣ」という用語は、ＴＬＲ７及び／またはＴＬＲ８アゴニストを含むがこれらに限定されない、生物学的活性分子、その一部、またはその類似体にコンジュゲートされた細胞またはそのサブユニット上に存在する標的に結合する標的化ポリペプチド、またはその一部、類似体、もしくは誘導体を指す。本明細書で使用される場合、「腫瘍標的化部分コンジュゲート」、「腫瘍標的化部分－生物学的活性分子コンジュゲート」または「ＢＴＣ」という用語は、ＴＬＲ７及び／またはＴＬＲ８アゴニストを含むがこれらに限定されない、生物学的活性分子、その一部、またはその類似体にコンジュゲートされた腫瘍細胞またはそのサブユニット上に存在する標的に結合する腫瘍標的化ポリペプチド、またはその一部、類似体、もしくは誘導体を指す。別段の指示がない限り、「本発明の化合物」及び「本発明の組成物」という用語は、「本発明のコンジュゲート」という用語の代替として使用される。
「保存的に修飾されたバリアント」という用語は、天然及び非天然アミノ酸、ならびに天然及び非天然核酸配列の両方、ならびにそれらの組み合わせに適用される。特定の核酸配列に関して、「保存的に修飾されたバリアント」は、同一または本質的に同一の天然及び非天然アミノ酸配列をコードするか、または天然及び非天然アミノ酸が本質的に同一の配列に対して天然及び非天然アミノ酸配列をコードしないそれらの天然及び非天然核酸を指す。例として、遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一の核酸が任意の所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、及びＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンによって特定されるすべての位置で、コドンは、コードされたポリペプチドを改変することなく、記載の対応するコドンのいずれかに改変され得る。そのような核酸の変化は、保存的に修飾された変化の１つの種である「サイレント変化」である。したがって、例として、天然または非天然のポリペプチドをコードする本明細書のすべての天然または非天然核酸配列は、天然または非天然の核酸のすべての可能なサイレント変化も記載する。当業者であれば、天然または非天然核酸中の各コドン（通常、メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、及び通常、トリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を修飾して、機能的に同一の分子を得ることができることを認識するであろう。したがって、天然及び非天然ポリペプチドをコードする天然及び非天然核酸の各サイレント変化は、記載の各配列において暗示的である。
アミノ酸配列に関して、単一の天然及び非天然アミノ酸、またはコード配列中の少量の天然及び非天然アミノ酸を改変、付加、もしくは欠失する核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失、もしくは付加は、改変がアミノ酸の欠失、アミノ酸の付加、または天然及び非天然アミノ酸の化学的に類似したアミノ酸による置換をもたらす「保存的に修飾されたバリアント」である。機能的に類似した天然アミノ酸を提供する保存的置換表は、当該技術分野において周知である。そのような保存的に修飾されたバリアントは、本明細書に記載の方法及び組成物の多型バリアント、種間相同体、及び対立遺伝子に加えられ、かつそれらを除外しない。
機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表は、当業者に既知である。以下の８つの群はそれぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；及び８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）。（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ Ｈ Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．；２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９９３）を参照されたい。）
「シクロアルキル」及び「ヘテロシクロアルキル」という用語は、それ自体または他の用語と組み合わせて、別段の記載がない限り、それぞれ、「アルキル」及び「ヘテロアルキル」の環状型を表す。したがって、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルは、飽和、部分的に不飽和、及び完全に不飽和の環連結を含む。加えて、ヘテロシクロアルキルの場合、ヘテロ原子は、複素環が分子の残部に結合される位置を占めることができる。ヘテロ原子は、酸素、窒素、または硫黄を含み得るが、これらに限定されない。シクロアルキルの例には、シクロペンチル、シクロヘキシル、１－シクロヘキセニル、３－シクロヘキセニル、シクロヘプチルなどが含まれるが、これらに限定されない。ヘテロシクロアルキルの例としては、１－（１，２，５，６－テトラヒドロピリジル）、１－ピペリジニル、２－ピペリジニル、３－ピペリジニル、４－モルホリニル、３－モルホリニル、テトラヒドロフラン－２－イル、テトラヒドロフラン－３－イル、テトラヒドロチエン－２－イル、テトラヒドロチエン－３－イル、１－ピペラジニル、２－ピペラジニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。加えて、この用語は、二環式及び三環式環構造を含むがこれらに限定されない多環式構造を包含する。同様に、「ヘテロシクロアルキレン」という用語は、それ自体または別の分子の一部として、ヘテロシクロアルキルに由来する二価のラジカルを意味し、「シクロアルキレン」という用語は、それ自体または別の分子の一部として、シクロアルキルに由来する二価のラジカルを意味する。
本明細書で使用される場合、「シクロデキストリン」という用語は、環形成における少なくとも６～８つのグルコース分子からなる環状炭水化物を指す。環の外側部分は水溶性基を含有し、環の中心には小分子を収容することができる比較的非極性の空洞である。
本明細書で使用される場合、「細胞傷害性」という用語は、細胞を害する化合物を指す。
本明細書で使用される場合、「変性剤（Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ａｇｅｎｔ）」または「変性剤（ｄｅｎａｔｕｒａｎｔ）」は、ポリマーの可逆的なアンフォールディングを引き起こす任意の化合物または材料を指す。ほんの一例として、「変性剤（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ａｇｅｎｔ）」または「変性剤（ｄｅｎａｔｕｒａｎｔ）」は、タンパク質の可逆的なアンフォールディングを引き起こし得る。変性剤（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ａｇｅｎｔ）または変性剤（ｄｅｎａｔｕｒａｎｔ）の強度は、特定の変性剤（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ａｇｅｎｔ）または変性剤（ｄｅｎａｔｕｒａｎｔ）の特性及び濃度の両方によって決定される。例として、変性剤（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ａｇｅｎｔ）または変性剤（ｄｅｎａｔｕｒａｎｔ）には、カオトロープ、洗剤、有機水混和性溶媒、リン脂質、またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。カオトロープの非限定的な例としては、尿素、グアニジン、及びチオシアン酸ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されない。洗剤の非限定的な例には、強力な洗剤、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、もしくはポリオキシエチレンエーテル（例えば、ＴｗｅｅｎまたはＴｒｉｔｏｎ洗剤）、サルコシル、低刺激非イオン性洗剤（例えば、ジギトニン）、低刺激カチオン性洗剤、例えば、Ｎ－＞２，３－（ジオレイオキシ）－プロピル－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウム、低刺激イオン性洗剤（例えば、コール酸ナトリウムまたはデオキシコール酸ナトリウム）、または双性イオン洗剤（スルホベタイン（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ）、３－（３－クロロアミドプロピル）ジメチルアンモニオ－１－プロパンスルフェート（ＣＨＡＰＳ）、ならびに３－（３－クロロアミドプロピル）ジメチルアンモニオ－２－ヒドロキシ－１－プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）が含まれ得るが、これらに限定されない）を含み得るが、これらに限定されない。変性剤として使用され得る有機水混和性溶媒の非限定的な例としては、アセトニトリル、低級アルカノール（特に、エタノールまたはイソプロパノールなどのＣ２～Ｃ４アルカノール）、または低級アルカンジオール（エチレン－グリコールなどのＣ２～Ｃ４アルカンジオール）が挙げられるが、これらに限定されない。リン脂質の非限定的な例としては、天然に存在するリン脂質、例えば、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、及びホスファチジルイノシトール、または合成リン脂質誘導体もしくはバリアント、例えば、ジヘキサノイルホスファチジルコリンまたはジヘプタノイルホスファチジルコリンが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「ジアミン」という用語は、ヒドラジン基、アミジン基、イミン基、１，１－ジアミン基、１，２－ジアミン基、１，３－ジアミン基、及び１，４－ジアミン基を含むがこれらに限定されない、少なくとも２つのアミン官能基を含む基／分子を指す。加えて、そのような基は、直鎖状、分枝状、または環状分子の一部であり得る。
本明細書で使用される場合、「検出可能な標識」という用語は、蛍光、化学発光、電子－スピン共鳴、紫外線／可視吸光分光法、質量分析、核磁気共鳴、磁気共鳴、及び電気化学方法を含むが、これらに限定されない分析技法を使用して観察可能であり得る標識を指す。
本明細書で使用される場合、「ジカルボニル」という用語は、１，２－ジカルボニル基、１，３－ジカルボニル基、及び１，４－ジカルボニル基、ならびに少なくとも１つのケトン基、及び／または少なくとも１つのアルデヒド基、及び／または少なくとも１つのエステル基、及び／または少なくとも１つのカルボン酸基、及び／または少なくとも１つのチオエステル基を含有する基が含まれるが、これらに限定されない、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２－、及び－Ｃ（Ｓ）－からなる群から選択される少なくとも２つの部分を含有する基を指す。そのようなジカルボニル基には、ジケトン、ケトアルデヒド、ケト酸、ケトエステル、及びケトチオエステルが含まれる。加えて、そのような基は、直鎖状、分枝状、または環状分子の一部であり得る。ジカルボニル基中の２つの部分は、同じであっても異なっていてもよく、２つの部分のいずれかで、ほんの一例として、エステル、ケトン、アルデヒド、チオエステル、またはアミドを産生する置換基を含んでもよい。
本明細書で使用される場合、「薬物」という用語は、疾患または状態の予防、診断、軽減、治療、または治癒において使用される任意の物質を指す。
本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、治療される疾患または状態の症状のうちの１つ以上をある程度緩和する、投与される薬剤または化合物の十分な量を指す。結果は、疾患の徴候、症状、もしくは原因の低減及び／または軽減、または生物学系の任意の他の所望の変更であり得る。例として、投与される薬剤または化合物としては、天然アミノ酸ポリペプチド、非天然アミノ酸ポリペプチド、修飾された天然アミノ酸ポリペプチド、または修飾された非アミノ酸ポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。そのような天然アミノ酸ポリペプチド、非天然アミノ酸ポリペプチド、修飾された天然アミノ酸ポリペプチド、または修飾された非天然アミノ酸ポリペプチドを含有する組成物は、予防的、増強的、及び／または治療的処置のために投与され得る。任意の個々の症例における適切な「有効」量は、用量漸増研究などの技法を使用して決定され得る。
「増強する」または「増強」という用語は、効力または所望の効果の持続時間のいずれかが増加または延長することを意味する。例として、治療剤の効果を「増強する」とは、疾患、障害、または状態の治療中に、効力または持続時間のいずれかにおいて、治療剤の効果を増加または延長する能力を指す。本明細書で使用される場合、「増強有効量」は、疾患、障害、または状態の治療における治療剤の効果を増強するのに十分な量を指す。患者で使用される場合、この使用に有効な量は、疾患、障害、または状態の重症度及び経過、以前の療法、患者の健康状態及び薬物への応答、ならびに治療を行う医師の判断に依存する。
本明細書で使用される場合、「真核生物」という用語は、動物（哺乳動物、昆虫、爬虫類、鳥類などを含むがこれらに限定されない）、繊毛虫、植物（単子葉類、双子葉類、及び藻類を含むがこれらに限定されない）、真菌、酵母、鞭毛虫、微胞子虫、及び原生生物を含むがこれらに限定されない、系統学的ドメインの真核生物に属する生物を指す。
本明細書で使用される場合、「脂肪酸」という用語は、約Ｃ６またはより長い炭化水素側鎖を有するカルボン酸を指す。
本明細書で使用される場合、「フルオロフォア」という用語は、励起されると光子を放出し、それによって蛍光性である分子を指す。
本明細書で使用される場合、「官能基」、「活性部分」、「活性基」、「脱離基」、「反応性部位」、「化学反応性基」、及び「化学反応性部分」という用語は、化学反応が生じる分子の部分または単位を指す。これらの用語は、化学分野においてある程度同義であり、何らかの機能または活性を実施し、他の分子と反応性である分子の部分を示すために本明細書で使用される。
「ハロゲン」という用語は、フッ素、塩素、ヨウ素、及び臭素を含む。
本明細書で使用される場合、「ハロアシル」という用語は、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、－Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３などを含むが、これらに限定されないハロゲン部分を含有するアシル基を指す。
本明細書で使用される場合、「ハロアルキル」という用語は、－ＣＦ３及び－ＣＨ２ＣＦ３などを含むハロゲン部分を含有するアルキル基を指す。
本明細書で使用される場合、「ヘテロアルキル」という用語は、アルキル基、ならびにＯ、Ｎ、Ｓｉ、及びＳからなる群から選択される少なくとも１つのヘテロ原子からなる直鎖もしくは分枝鎖、または環状炭化水素ラジカル、あるいはそれらの組み合わせを指し、窒素及び硫黄原子は任意に酸化され得、窒素ヘテロ原子は任意に四級化され得る。ヘテロ原子（複数可）のＯ、Ｎ、及びＳ及びＳｉは、ヘテロアルキル基の任意の内部位置に、またはアルキル基が分子の残部に結合される位置に配置され得る。例としては、－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ３、－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ２、－Ｓ（Ｏ）－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｓ（Ｏ）２－ＣＨ３、－ＣＨ＝ＣＨ－Ｏ－ＣＨ３、－Ｓｉ（ＣＨ３）３、－ＣＨ２－ＣＨ＝Ｎ－ＯＣＨ３、及び－ＣＨ＝ＣＨ－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ３が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、最大２個のヘテロ原子が、連続していてもよく、例えば、例として、－ＣＨ２－ＮＨ－ＯＣＨ３及び－ＣＨ２－Ｏ－Ｓｉ（ＣＨ３）３が挙げられる。
「複素環式ベースの連結」または「複素環連結」という用語は、ジカルボニル基とジアミン基との反応から形成される部分を指す。得られる反応生成物は、ヘテロアリール基またはヘテロシクロアルキル基を含む複素環である。得られる複素環基は、非天然アミノ酸または非天然アミノ酸ポリペプチドと別の官能基との間の化学連結として機能する。一実施形態において、複素環連結は、ほんの例として、ピラゾール連結、ピロール連結、インドール連結、ベンゾジアゼピン連結、及びピラザロン連結を含む、窒素含有複素環連結を含む。
同様に、「ヘテロアルキレン」という用語は、－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ２－及び－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＨ２－によって例示されるが、これらに限定されない、ヘテロアルキルに由来する二価のラジカルを指す。ヘテロアルキレン基に関して、同じまたは異なるヘテロ原子はまた、鎖末端の一方または両方を占有することができる（アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノ、アミノオキシアルキレンなどを含むが、これらに限定されない）。またさらに、アルキレン及びヘテロアルキレン連結基に関して、連結基の配向は、連結基の式が書かれる方向によって暗示されない。例として、式－Ｃ（Ｏ）２Ｒ’－は、－Ｃ（Ｏ）２Ｒ’－及び－Ｒ’Ｃ（Ｏ）２－の両方を表す。
本明細書で使用される場合、「ヘテロアリール」または「ヘテロ芳香族」という用語は、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含有するアリール基を指し、窒素及び硫黄原子は任意に酸化され得、窒素原子（複数可）は任意に四級化され得る。ヘテロアリール基は、置換されるか、または非置換であり得る。ヘテロアリール基は、ヘテロ原子を介して分子の残部に結合され得る。ヘテロアリール基の非限定的な例としては、１－ピロリル、２－ピロリル、３－ピロリル、３－ピラゾリル、２－イミダゾリル、４－イミダゾリル、ピラジニル、２－オキサゾリル、４－オキサゾリル、２－フェニル－４－オキサゾリル、５－オキサゾリル、３－イソオキサゾリル、４－イソオキサゾリル、５－イソオキサゾリル、２－チアゾリル、４－チアゾリル、５－チアゾリル、２－フリル、３－フリル、２－チエニル、３－チエニル、２－ピリジル、３－ピリジル、４－ピリジル、２－ピリミジル、４－ピリミジル、５－ベンゾチアゾリル、プリニル、２－ベンズイミダゾリル、５－インドリル、１－イソキノリル、５－イソキノリル、２－キノキサリニル、５－キノキサリニル、３－キノリル、及び６－キノリルが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「ホモアルキル」という用語は、炭化水素基であるアルキル基を指す。
本明細書で使用される場合、「同一」という用語は、同じである２つ以上の配列または部分配列を指す。加えて、本明細書で使用される場合、「実質的に同一」という用語は、比較ウィンドウ、または比較アルゴリズムを使用して、もしくは手動アライメント及び目視検査によって測定される指定領域にわたって最大一致について比較及び整列させたときに同じである配列単位のパーセンテージを有する２つ以上の配列を指す。ほんの一例として、配列単位が、指定の領域にわたって約６０％同一、約６５％同一、約７０％同一、約７５％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、または約９５％同一である場合、２つ以上の配列は、「実質的に同一」であり得る。そのようなパーセンテージは、２つ以上の配列の「同一性パーセント」を説明する。配列の同一性は、長さが少なくとも約７５～１００の配列単位である領域にわたって、長さが約５０の配列単位である領域にわたって、または指定されていない場合は、配列全体にわたって存在することができる。この定義はまた、試験配列の相補性を指す。ほんの一例として、２つ以上のポリペプチド配列は、アミノ酸残基が同じであるときに同一である一方で、２つ以上のポリペプチド配列は、アミノ酸残基が指定の領域にわたって約６０％同一、約６５％同一、約７０％同一、約７５％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、または約９５％同一である場合、「実質的に同一」である。同一性は、長さが少なくとも約７５～約１００のアミノ酸である領域にわたって、長さが約５０のアミノ酸である領域にわたって、または指定されていない場合、ポリペプチド配列の配列全体にわたって存在することができる。加えて、ほんの一例として、２つ以上のポリヌクレオチド配列は、核酸残基が同じであるときに同一である一方で、２つ以上のポリヌクレオチド配列は、核酸残基が指定の領域にわたって約６０％同一、約６５％同一、約７０％同一、約７５％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、または約９５％同一である場合、「実質的に同一」である。同一性は、長さが少なくとも約７５～約１００の核酸である領域にわたって、長さが約５０の核酸である領域にわたって、または指定されていない場合、ポリヌクレオチド配列の配列全体にわたって存在することができる。
配列比較に関して、典型的には、１つの配列が、試験配列が比較される参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験及び参照配列がコンピュータに入力され、必要に応じて、部分配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムのパラメータが指定される。デフォルトのプログラムパラメータが使用され得るか、または代替のパラメータが指定され得る。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。
本明細書で使用される場合、「免疫原性」という用語は、治療薬の投与に対する抗体応答を指す。治療用の非天然アミノ酸ポリペプチドに対する免疫原性は、生物学的流体中の抗非天然アミノ酸ポリペプチド抗体の検出のための定量及び定性アッセイを使用して得ることができる。そのようなアッセイには、限定されないが、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、及び蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）が含まれる。治療用の非天然アミノ酸ポリペプチドに対する免疫原性の分析は、治療用の非天然アミノ酸ポリペプチドの投与時の抗体応答を、治療用の天然アミノ酸ポリペプチドの投与時の抗体応答と比較することを伴う。
本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、関心の構成要素を、関心のない構成要素から分離及び除去することを指す。単離された物質は、乾燥もしくは半乾燥状態、または水溶液を含むがこれらに限定されない溶液のいずれかであり得る。単離された構成要素は、均一な状態であるか、または単離された構成要素は、追加の医薬的に許容される担体及び／または賦形剤を含む医薬組成物の一部であってもよい。純度及び均一性は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない分析化学技法を使用して決定され得る。さらに、関心の構成要素が単離され、調製物中に存在する主要種である場合、構成要素は、本明細書において実質的に精製されたものとして記載される。本明細書で使用される場合、「精製された」という用語は、少なくとも８５％純粋、少なくとも９０％純粋、少なくとも９５％純粋、少なくとも９９％以上純粋である関心の構成要素を指し得る。ほんの一例として、核酸またはタンパク質は、そのような核酸もしくはタンパク質が、それが自然状態で会合している細胞構成要素の少なくともいくつかを含まないとき、または核酸もしくはタンパク質が、そのインビボもしくはインビトロ産生の濃度よりも高いレベルに濃縮されているときに、「単離される」。また、例として、遺伝子は、遺伝子に隣接し、関心の遺伝子以外のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームから分離されるときに単離される。
本明細書で使用される場合、「標識」という用語は、化合物に組み込まれ、容易に検出され、それにより、その物理的分布が検出及び／または監視され得る物質を指す。
本明細書で使用される場合、「連結」または「リンカー」という用語は、リンカーの官能基と別の分子との間の化学反応から形成される結合または化学部分を指す。そのような結合には、共有結合及び非共有結合が含まれ得るが、これらに限定されない。一方、そのような化学部分には、エステル、カーボネート、イミンリン酸エステル、ヒドラゾン、アセタール、オルトエステル、ペプチド連結、及びオリゴヌクレオチド連結が含まれ得るが、これらに限定されない。加水分解的に安定した連結は、連結が水中で実質的に安定であり、長期間、おそらく永久にでも、生理学的条件下を含むが、これに限定されない有用なｐＨ値で水と反応しないことを意味する。加水分解的に不安定なまたは分解可能な連結とは、連結が、例えば、血液を含む水または水溶液中で分解可能であることを意味する。酵素的に不安定なまたは分解可能な連結は、連結が１つ以上の酵素によって分解され得ることを意味する。ほんの一例として、ＰＥＧ及び関連ポリマーは、ポリマー骨格内、またはポリマー骨格とポリマー分子の末端官能基のうちの１つ以上との間のリンカー基内に分解可能な連結を含んでもよい。そのような分解可能な連結には、ＰＥＧカルボン酸または活性化ＰＥＧカルボン酸と生物学的活性剤上のアルコール基との反応によって形成されるエステル連結が含まれるが、これに限定されず、そのようなエステル基は一般に、生理的条件下で加水分解して生物学的活性剤を放出する。他の加水分解可能な連結としては、カーボネート連結、アミンとアルデヒドとの反応によって生じるイミン連結、アルコールとホスフェート基との反応によって形成されるリン酸エステル連結、ヒドラジドとアルデヒドとの反応生成物であるヒドラゾン連結、アルデヒドとアルコールとの反応生成物であるアセタール連結、ホルメートとアルコールとの反応生成物であるオルトエステル連結、ＰＥＧなどのポリマーの末端を含むが、これに限定されないアミン基及びペプチドのカルボキシル基によって形成されるペプチド連結、ならびにポリマーの末端を含むが、これに限定されないホスホロアミダイト基及びオリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシル基によって形成されるオリゴヌクレオチド連結が挙げられるが、これらに限定されない。リンカーには、限定されないが、ポリマーなどの短い直鎖状、分枝状、多アーム型、またはデンドリマー分子が含まれる。本発明のいくつかの実施形態において、リンカーは分枝していてもよい。他の実施形態において、リンカーは、二官能性リンカーであり得る。いくつかの実施形態において、リンカーは、三官能性リンカーであり得る。当業者には、いくつかの異なる切断可能なリンカーが知られている。米国特許第４，６１８，４９２号、同第４，５４２，２２５号、及び同第４，６２５，０１４号を参照されたい。これらのリンカー基から薬剤を放出するための機構としては、例えば、光不安定結合の照射及び酸触媒加水分解が挙げられる。例えば、米国特許第４，６７１，９５８号は、患者の補体系のタンパク質分解酵素によってインビボの標的部位で切断されるリンカーを含むイムノコンジュゲートの説明を含む。リンカーの長さは、ポリペプチドとそれに連結された分子との間の所望の空間関係に応じて、予め決定されるか、または選択され得る。様々な放射線診断化合物、放射線治療化合物、薬物、毒素、及び他の薬剤を抗体に結合させるための多数の方法が報告されていることを鑑みて、当業者は、所与の薬剤または分子をポリペプチドに結合させるための好適な方法を決定することができるであろう。
本明細書で使用される場合、「修飾された」という用語は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、天然アミノ酸ポリペプチド、または非天然アミノ酸ポリペプチドに対する変化の存在を指す。そのような変化または修飾は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、天然アミノ酸ポリペプチド、もしくは非天然アミノ酸ポリペプチドの合成後修飾によって、または同時翻訳によって、または天然アミノ酸、非天然アミノ酸、天然アミノ酸ポリペプチド、もしくは非天然アミノ酸ポリペプチドの翻訳後修飾によって得ることができる。「修飾されたまたは非修飾の」という形態は、論じられている天然アミノ酸、非天然アミノ酸、天然アミノ酸ポリペプチド、または非天然アミノ酸ポリペプチドが、任意に修飾されていること、すなわち、論じられている天然アミノ酸、非天然アミノ酸、天然アミノ酸ポリペプチド、または非天然アミノ酸ポリペプチドが、修飾されているか、または未修飾であり得ることを意味する。
本明細書で使用される場合、「調節された血清半減期」という用語は、修飾された生物学的活性分子の、その非修飾形態に対する循環半減期の正または負の変化を指す。例として、修飾された生物学的活性分子には、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、天然アミノ酸ポリペプチド、または非天然アミノ酸ポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。例として、血清半減期は、生物学的活性分子または修飾された生物学的活性分子の投与後の種々の時点で血液試料を採取し、各試料中のその分子の濃度を決定することによって測定される。血清濃度と時間の相関により、血清半減期の計算が可能になる。例として、調節された血清半減期は、改善された投与レジメンを可能にし得るか、または毒性効果を回避し得る、血清半減期の増加であり得る。血清のそのような増加は、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約５倍、または少なくとも約１０倍であり得る。任意のポリペプチドの血清半減期の増加を評価する方法は、当業者に周知である。
本明細書で使用される場合、「調節された治療半減期」という用語は、治療有効量の修飾された生物学的活性分子の、その非修飾形態に対する半減期における正または負の変化を指す。例として、修飾された生物学的活性分子には、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、天然アミノ酸ポリペプチド、または非天然アミノ酸ポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。例として、治療半減期は、投与後の種々の時点での分子の薬物動態及び／または薬力学的特性を測定することによって測定される。治療半減期の増加は、特定の有益な投与レジメン、特定の有益な総用量を可能にするか、または望ましくない効果を回避し得る。例として、治療半減期の増加は、効力の増加、修飾された分子のその標的への結合の増加もしくは減少、非修飾分子の別のパラメータもしくは作用機序の増加または減少、またはほんの一例として、プロテアーゼなどの酵素による分子の分解の増加もしくは減少から生じ得る。任意のポリペプチドの治療半減期の増加を評価する方法は、当業者に周知である。
「非天然アミノ酸」は、２０個の一般的なアミノ酸、またはピロリジンもしくはセレノシステインのうちの１つではないアミノ酸を指す。「非天然アミノ酸」という用語と同義に使用され得る他の用語は、「非天然コード化アミノ酸」、「非天然アミノ酸」、「非天然に存在するアミノ酸」、ならびにその種々のハイフンでつながれた及びハイフンでつながれていない形である。「非天然アミノ酸」という用語には、限定されないが、天然コード化アミノ酸の修飾によって天然に生じるアミノ酸（２０個の一般的なアミノ酸またはピロリジン及びセレノシステインを含むが、これらに限定されない）が含まれるが、それ自体は翻訳複合体によって成長するポリペプチド鎖に組み込まれない。そのようなアミノ酸の例としては、Ｎ－アセチルグルコサミニル－Ｌ－セリン、Ｎ－アセチルグルコサミニル－Ｌ－スレオニン、及びＯ－ホスホチロシンが挙げられるが、これらに限定されない。加えて、「非天然アミノ酸」という用語には、天然には生じず、合成的に得ることができるか、または非天然アミノ酸の修飾によって得ることができるアミノ酸が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、非天然アミノ酸は、リジン類似体、例えば、Ｎ６－アジドエトキシ－Ｌ－リジン（ＡｚＫ）、Ｎ６－プロパルギルエトキシ－Ｌ－リジン（ＰｒａＫ）、ＢＣＮ－Ｌ－リジン、ノルボルネンリジン、ＴＣＯ－リジン、メチルテトラジンリジン、またはアリルオキシカルボニルリジンを含む。いくつかの実施形態において、非天然アミノ酸は糖部分を含む。そのようなアミノ酸の例としては、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルコサミニル－Ｌ－セリン、Ｎ－アセチル－Ｌ－ガラクトサミニル－Ｌ－セリン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルコサミニル－Ｌ－スレオニン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルコサミニル－Ｌ－アスパラギン、及びＯ－マンノサミニル－Ｌ－セリンが挙げられる。そのようなアミノ酸の例には、アミノ酸と糖との間の天然に存在するＮ－またはＯ連結が、アルケン、オキシム、チオエーテル、アミドなどを含むがこれらに限定されない、天然には一般に見られない共有結合に置き換えられる例も含まれる。そのようなアミノ酸の例としては、２－デオキシ－グルコース、２－デオキシガラクトースなどの天然に存在するタンパク質に一般的に見られない糖類も挙げられる。非天然アミノ酸の具体的な例としては、ｐ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－プロパルギルオキシフェニルアラニン、Ｏ－メチル－Ｌ－チロシン、Ｌ－３－（２－ナフチル）アラニン、３－メチル－フェニルアラニン、Ｏ－４－アリル－Ｌ－チロシン、４－プロピル－Ｌ－チロシン、トリ－Ｏ－アセチル－ＧｌｃＮＡｃβ－セリン、Ｌ－ドパ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アジド－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アシル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ－ヨード－フェニルアラニン、ｐ－ブロモフェニルアラニン、ｐ－アミノ－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－プロパルギルオキシ－Ｌ－フェニルアラニン、４－アジド－Ｌ－フェニルアラニン、パラ－アジドエトキシフェニルアラニン、及びパラ－アジドメチル－フェニルアラニンなどが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、非天然アミノ酸は、パラ－アセチル－フェニルアラニン、４－アジド－Ｌ－フェニルアラニン、パラ－アジドエトキシフェニルアラニン、またはパラ－アジドメチル－フェニルアラニンからなる群から選択される。
本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態でのデオキシリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、またはリボヌクレオチド、ならびにそれらのポリマーを指す。ほんの一例として、そのような核酸及び核酸ポリマーとしては、（ｉ）参照核酸と同様の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様の様式で代謝される天然ヌクレオチドの類似体、（ｉｉ）ＰＮＡ（ペプチド核酸）を含むがこれに限定されないオリゴヌクレオチド類似体、アンチセンス技術で使用されるＤＮＡの類似体（ホスホロチオエート、ホスホロアミデートなど）、（ｉｉｉ）それらの保存的に修飾されたバリアント（縮重コドン置換を含むが、これに限定されない）、ならびに相補配列及び明示的に示される配列を含むが、これらに限定されない。例として、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（またはすべての）コドンの第３の位置が混合塩基及び／またはデオキシイノシン残基で置換される配列を生成することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）、Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５－２６０８（１９８５）、及びＲｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１－９８（１９９４））。
本明細書で使用される場合、「酸化剤」という用語は、酸化される化合物から電子を除去することが可能な化合物または材料を指す。例として、酸化剤には、酸化グルタチオン、シスチン、シスタミン、酸化ジチオスレイトール、酸化エリスレイトール、及び酸素が含まれるが、これらに限定されない。多種多様な酸化剤が本明細書に記載の方法及び組成物における使用に好適である。
本明細書で使用される場合、「医薬的に許容される」という用語は、化合物の生物学的活性または特性を抑止せず、比較的無毒である塩、担体、または希釈剤を含むが、これらに限定されない材料を指し、すなわち、材料は、望ましくない生物学的効果を引き起こさないか、またはそれを含有する組成物の構成要素のいずれかと有害な様式で相互作用することなく、個体に投与することができる。
本明細書で使用される場合、「ポリアルキレングリコール」または「ポリ（アルケングリコール）」という用語は、直鎖状または分枝状の高分子ポリエーテルポリオールを指す。そのようなポリアルキレングリコールには、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール、及びそれらの誘導体が含まれるが、これらに限定されない。他の例示的な実施形態は、例えば、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ’ｓ ｃａｔａｌｏｇ“Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ ａｎｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”（２００１）などの商業的供給元のカタログに列挙される。ほんの一例として、そのような高分子ポリエーテルポリオールは、約０．１ｋＤａ～約１００ｋＤａの平均分子量を有する。例として、そのような高分子ポリエーテルポリオールには、約１００Ｄａ～約１００，０００Ｄａ以上が含まれるが、これらに限定されない。ポリマーの分子量は、約１００，０００Ｄａ、約９５，０００Ｄａ、約９０，０００Ｄａ、約８５，０００Ｄａ、約８０，０００Ｄａ、約７５，０００Ｄａ、約７０，０００Ｄａ、約６５，０００Ｄａ、約６０，０００Ｄａ、約５５，０００Ｄａ、約５０，０００Ｄａ、約４５，０００Ｄａ、約４０，０００Ｄａ、約３５，０００Ｄａ、約３０，０００Ｄａ、約２５，０００Ｄａ、約２０，０００Ｄａ、約１５，０００Ｄａ、約１０，０００Ｄａ、約９，０００Ｄａ、約８，０００Ｄａ、約７，０００Ｄａ、約６，０００Ｄａ、約５，０００Ｄａ、約４，０００Ｄａ、約３，０００Ｄａ、約２，０００Ｄａ、約１，０００Ｄａ、約９００Ｄａ、約８００Ｄａ、約７００Ｄａ、約６００Ｄａ、約５００Ｄａ、４００Ｄａ、約３００Ｄａ、約２００Ｄａ、及び約１００Ｄａを含むが、これらに限定されない約１００Ｄａ～約１００，０００Ｄａであり得る。いくつかの実施形態において、ポリマーの分子量は、約１００Ｄａ～約５０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態において、ポリマーの分子量は、約１００Ｄａ～約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態において、ポリマーの分子量は、約１，０００Ｄａ～約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態において、ポリマーの分子量は、約２，０００～約５０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態において、ポリマーの分子量は、約５，０００Ｄａ～約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態において、ポリマーの分子量は、約１０，０００Ｄａ～約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態において、ポリ（エチレングリコール）分子は、分枝状ポリマーである。分枝鎖ＰＥＧの分子量は、約１００，０００Ｄａ、約９５，０００Ｄａ、約９０，０００Ｄａ、約８５，０００Ｄａ、約８０，０００Ｄａ、約７５，０００Ｄａ、約７０，０００Ｄａ、約６５，０００Ｄａ、約６０，０００Ｄａ、約５５，０００Ｄａ、約５０，０００Ｄａ、約４５，０００Ｄａ、約４０，０００Ｄａ、約３５，０００Ｄａ、約３０，０００Ｄａ、約２５，０００Ｄａ、約２０，０００Ｄａ、約１５，０００Ｄａ、約１０，０００Ｄａ、約９，０００Ｄａ、約８，０００Ｄａ、約７，０００Ｄａ、約６，０００Ｄａ、約５，０００Ｄａ、約４，０００Ｄａ、約３，０００Ｄａ、約２，０００Ｄａ、及び約１，０００Ｄａを含むが、これらに限定されない約１，０００Ｄａ～約１００，０００Ｄａであり得る。いくつかの実施形態において、分枝鎖ＰＥＧの分子量は、約１，０００Ｄａ～約５０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態において、分枝鎖ＰＥＧの分子量は、約１，０００Ｄａ～約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態において、分枝鎖ＰＥＧの分子量は、約５，０００Ｄａ～約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態において、分枝鎖ＰＥＧの分子量は、約５，０００Ｄａ～約２０，０００Ｄａである。他の実施形態において、分枝鎖ＰＥＧの分子量は、約２，０００～約５０，０００Ｄａである。
本明細書で使用される場合、「ポリマー」という用語は、反復サブユニットから構成される分子を指す。そのような分子としては、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または多糖類もしくはポリアルキレングリコールが挙げられるが、これらに限定されない。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書で交換可能に使用される。すなわち、ポリペプチドに関する説明は、ペプチドの説明及びタンパク質の説明に同等に適用され、逆もまた同様である。この用語は、天然に存在するアミノ酸ポリマー、ならびに１つ以上のアミノ酸残基が非天然アミノ酸であるアミノ酸ポリマーに適用される。加えて、そのような「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、完全長タンパク質を含む任意の長さのアミノ酸鎖を含み、アミノ酸残基は、共有結合ペプチド結合によって連結される。
「翻訳後修飾」という用語は、そのようなアミノ酸がポリペプチド鎖に翻訳により組み込まれた後に生じる、天然または非天然アミノ酸の任意の修飾を指す。そのような修飾としては、同時翻訳インビボ修飾、同時翻訳インビトロ修飾（無細胞翻訳系においてなど）、翻訳後インビボ修飾、及び翻訳後インビトロ修飾が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「プロドラッグ」または「医薬的に許容されるプロドラッグ」という用語は、薬物の生物学的活性または特性を抑止せず、比較的無毒である、インビボまたはインビトロで親薬物に変換される薬剤を指し、すなわち、材料は、望ましくない生物学的効果を引き起こさないか、またはそれを含有する組成物の構成要素のいずれかと有害な様式で相互作用することなく、個体に投与することができる。プロドラッグは一般に、対象への投与及びその後の吸収の後、代謝経路による変換などの何らかのプロセスを介して活性な種、またはより活性な種に変換される薬物前駆体である。いくつかのプロドラッグは、プロドラッグ上に存在する化学基を有し、これは、プロドラッグの活性を低下させる、及び／または薬物に溶解性または何らかの他の特性を付与する。化学基がプロドラッグから切断及び／または修飾されると、活性薬物が生成される。プロドラッグは、酵素反応または非酵素反応を通じて体内で活性薬物に変換される。プロドラッグは、改善された生理化学的特性、例えば、より良い溶解性、増強された送達特徴、例えば、特定の細胞、組織、臓器、もしくはリガンドを特異的に標的とすること、及び薬物の改善された治療価値を提供し得る。そのようなプロドラッグの利点としては、（ｉ）親薬物と比較した投与の容易さ、（ｉｉ）プロドラッグは経口投与により生体利用可能であるが、親薬物はそうではない、（ｉｉｉ）プロドラッグはまた、親薬物と比較して、医薬組成物において改善された溶解性を有し得ることが挙げられるが、これらに限定されない。プロドラッグには、薬理学的に不活性な、または低減した活性の、活性薬物の誘導体が含まれる。プロドラッグは、薬物の特性、例えば、生理化学的、生物薬剤学的、または薬物動態学的特性の操作を通じて所望の作用部位に到達する薬物または生物学的活性分子の量を調節するように設計され得る。プロドラッグの例としては、限定されないが、水溶性が移動性に有害であるが、後に、水溶性が有益である細胞内に入ると活性物質であるカルボン酸に代謝的に加水分解される、細胞膜を横断する伝達を促進するために、エステルとして投与される非天然アミノ酸ポリペプチド（「プロドラッグ」）が挙げられる。プロドラッグは、部位特異的組織への薬物輸送を増強するための修飾剤として使用するための、可逆的薬物誘導体として設計され得る。
本明細書で使用される場合、「予防有効量」という用語は、治療される疾患、状態、または障害の症状のうちの１つ以上をある程度緩和する、患者に予防的に適用される少なくとも１つの非天然アミノ酸ポリペプチドまたは少なくとも１つの修飾された非天然アミノ酸ポリペプチドを含有する組成物の量を指す。そのような予防的適用において、そのような量は、患者の健康状態、体重などに依存し得る。用量漸増臨床試験を含むがこれに限定されない、日常的な実験によってそのような予防有効量を決定することは、十分に当業者の範囲内であると考えられる。
本明細書で使用される場合、「保護された」という用語は、ある特定の反応条件下で化学反応性官能基の反応を防止する「保護基」または部分の存在を指す。保護基は、保護される化学反応性基の種類に応じて異なる。ほんの一例として、（ｉ）化学反応性基がアミンまたはヒドラジドである場合、保護基は、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル（ｔ－Ｂｏｃ）及び９－フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）から選択され得る、（ｉｉ）化学反応性基がチオールである場合、保護基は、オルトピリジルジスルフィドであり得る、及び（ｉｉｉ）化学反応性基が、ブタン酸もしくはプロピオン酸などのカルボン酸、またはヒドロキシル基である場合、保護基は、ベンジル、またはメチル、エチル、もしくはｔｅｒｔ－ブチルなどのアルキル基であり得る。
ほんの一例として、ブロッキング／保護基は、次から選択される。
Figure 2022520792000005
さらに、保護基には、Ｎｖｏｃ及びＭｅＮｖｏｃなどの光不安定基、ならびに当該技術分野で既知の他の保護基が含まれるが、これらに限定されない。他の保護基は、Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９９（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される。
「組換え宿主細胞」という用語は、「宿主細胞」とも称され、外因性ポリヌクレオチドを含む細胞を指し、外因性ポリヌクレオチドを細胞に挿入するために使用される方法には、直接取り込み、形質導入、ｆ交配、または組換え宿主細胞を作製するための当該技術分野で既知の他の方法が含まれるが、これらに限定されない。ほんの一例として、そのような外因性ポリヌクレオチドは、プラスミドを含むがこれに限定されない非組み込みベクターであり得るか、または宿主ゲノムに組み込まれ得る。
本明細書で使用される場合、「酸化還元活性剤」という用語は、別の分子を酸化または還元し、それによって酸化還元活性剤が還元または酸化される分子を指す。酸化還元活性剤の例としては、フェロセン、キノン、Ｒｕ２＋／３＋複合体、Ｃｏ２＋／３＋複合体、及びＯｓ２＋／３＋複合体が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「還元剤」という用語は、還元される化合物に電子を付加することが可能な化合物または材料を指す。例として、還元剤としては、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２－メルカプトエタノール、ジチオエリスリトール、システイン、システアミン（２－アミノエタンチオール）、及び還元型グルタチオンが挙げられるが、これらに限定されない。そのような還元剤は、ほんの一例として、還元状態でスルフヒドリル基を維持し、分子内または分子間ジスルフィド結合を還元するために使用され得る。
本明細書で使用される場合、「リフォールディング」は、不適切に折り畳まれたまたは折り畳まれていない状態を天然または適切に折り畳まれた立体配座に変換する任意のプロセス、反応、または方法を説明する。ほんの一例として、リフォールディングは、不適切に折り畳まれたまたは折り畳まれていない状態から、ジスルフィド結合に関して天然のまたは適切に折り畳まれた立体配座に、ジスルフィド結合含有ポリペプチドを形質転換する。そのようなジスルフィド結合含有ポリペプチドは、天然アミノ酸ポリペプチドまたは非天然アミノ酸ポリペプチドであり得る。
本明細書で使用される場合、「安全性」または「安全性プロファイル」という用語は、薬物が投与された回数に対して薬物の投与に関連し得る副作用を指す。例として、何度も投与され、副作用が軽度または全くない薬物は、優れた安全性プロファイルを有すると言われる。任意のポリペプチドの安全性プロファイルを評価するために使用される方法は、当該技術分野で既知である。
本明細書で使用される場合、「～に選択的にハイブリダイズする」または「～に特異的にハイブリダイズする」という語句は、その配列が、限定されないが、全細胞またはライブラリＤＮＡもしくはＲＮＡを含む、複合体混合物中に存在する場合、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下での特定のヌクレオチド配列への分子の結合、二本鎖形成、またはハイブリダイゼーションを指す。
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という語句は、低イオン強度及び高温の条件下でのＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、もしくは他の核酸模倣物、またはそれらの組み合わせの配列のハイブリダイゼーションを指す。例として、ストリンジェントな条件下では、プローブは、核酸の複合体混合物（全細胞またはライブラリＤＮＡもしくはＲＮＡを含むがこれらに限定されない）中でその標的配列にハイブリダイズするが、複合体混合物中の他の配列にハイブリダイズしない。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる条件では異なる。例として、より長い配列は、高温で特異的にハイブリダイズする。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、（ｉ）定義されたイオン強度及びｐＨでの特定の配列の熱融点（Ｔｍ）よりも約５～１０℃低いこと、（ｉｉ）塩濃度が、約ｐＨ７．０～約ｐＨ８．３で約０．０１Ｍ～約１．０Ｍであり、温度が、短いプローブ（約１０～約５０ヌクレオチドを含むが、これらに限定されない）については少なくとも約３０℃であり、長いプローブ（５０ヌクレオチド超を含むが、これに限定されない）については少なくとも約６０℃であること、（ｉｉｉ）ホルムアミドを含むが、これに限定されない不安定化剤の添加、（ｉｖ）５０％ホルムアミド、５× ＳＳＣ、及び１％ＳＤＳ、４２℃でのインキュベート、または５× ＳＳＣ、約１％ＳＤＳ、６５℃でのインキュベート、０．２× ＳＳＣで洗浄、及び約０．１％ＳＤＳ、約５分～約１２０分間、６５℃でのインキュベートが含まれる。ほんの一例として、選択的または特異的ハイブリダイゼーションの検出は、少なくとも２倍のバックグラウンドの正のシグナルを含むが、これに限定されない。核酸のハイブリダイゼーションの広範なガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ－－Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ｐｒｏｂｅｓ，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｓｓａｙｓ”（１９９３）に見出される。
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、治療、観察、または実験の対象である動物を指す。ほんの一例として、対象は、限定されないが、ヒトを含む哺乳動物であり得るが、これに限定されない。
本明細書で使用される場合、「実質的に精製された」という用語は、精製前の関心の構成要素に通常付随するかまたはそれと相互作用する他の構成要素を実質的にまたは本質的に含み得ない関心の構成要素を指す。ほんの一例として、関心の構成要素の調製物が、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満（乾燥重量）の汚染構成要素を含有する場合、関心の構成要素が「実質的に精製され」得る。したがって、関心の「実質的に精製された」構成要素は、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％以上の純度レベルを有し得る。ほんの一例として、天然アミノ酸ポリペプチドまたは非天然アミノ酸ポリペプチドは、天然細胞、または組換えにより産生された天然アミノ酸ポリペプチドまたは非天然アミノ酸ポリペプチドの場合、宿主細胞から精製され得る。例として、天然アミノ酸ポリペプチドまたは非天然アミノ酸ポリペプチドの調製物は、調製物が、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満（乾燥重量）の汚染材料を含有する場合、「実質的に精製」され得る。例として、天然アミノ酸ポリペプチドまたは非天然アミノ酸ポリペプチドが宿主細胞によって組換えにより産生される場合、天然アミノ酸ポリペプチドまたは非天然アミノ酸ポリペプチドは、細胞の乾燥重量の約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、約５％、約４％、約３％、約２％、または約１％以下で存在し得る。例として、天然アミノ酸ポリペプチドまたは非天然アミノ酸ポリペプチドが宿主細胞によって組換えにより生産される場合、天然アミノ酸ポリペプチドまたは非天然アミノ酸ポリペプチドは、細胞の乾燥重量の約５ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ、約７５０ｍｇ／Ｌ、約５００ｍｇ／Ｌ、約２５０ｍｇ／Ｌ、約１００ｍｇ／Ｌ、約５０ｍｇ／Ｌ、約１０ｍｇ／Ｌ、または約１ｍｇ／Ｌ以下で培養培地中に存在し得る。例として、「実質的に精製された」天然アミノ酸ポリペプチドまたは非天然アミノ酸ポリペプチドは、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析、ＲＰ－ＨＰＬＣ、ＳＥＣ、及びキャピラリー電気泳動を含むが、これらに限定されない適切な方法で決定されるとき、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％以上の純度レベルを有し得る。
「置換基」という用語は、「非干渉置換基」とも称され、分子上の別の基を置き換えるために使用され得る基を指す。そのような基としては、ハロ、Ｃ１－Ｃ１０アルキル、Ｃ２－Ｃ１０アルケニル、Ｃ２－Ｃ１０アルキニル、Ｃ１－Ｃ１０アルコキシ、Ｃ５－Ｃ１２アラルキル、Ｃ３－Ｃ１２シクロアルキル、Ｃ４－Ｃ１２シクロアルケニル、フェニル、置換フェニル、トルオリル、キシレニル、ビフェニル、Ｃ２－Ｃ１２アルコキシアルキル、Ｃ５－Ｃ１２アルコキシアリール、Ｃ５－Ｃ１２アリールオキシアルキル、Ｃ７－Ｃ１２オキシアリール、Ｃ１－Ｃ６アルキルスルフィニル、Ｃ１－Ｃ１０アルキルスルホニル、－（ＣＨ２）ｍ－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ１０アルキル）（式中、ｍは、１～８である）、アリール、置換アリール、置換アルコキシ、フルオロアルキル、複素環式ラジカル、置換複素環式ラジカル、ニトロアルキル、－ＮＯ２、－ＣＮ、－ＮＲＣ（Ｏ）－（Ｃ１－Ｃ１０アルキル）、－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１－Ｃ１０アルキル）、Ｃ２－Ｃ１０アルキチオアルキル、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－（Ｃ１－Ｃ１０アルキル）、－ＯＨ、－ＳＯ２、＝Ｓ、－ＣＯＯＨ、－ＮＲ２、カルボニル、－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１－Ｃ１０アルキル）－ＣＦ３、－Ｃ（Ｏ）－ＣＦ３、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、－（Ｃ１－Ｃ１０アリール）－Ｓ－（Ｃ６－Ｃ１０アリール）、－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ６－Ｃ１０アリール）、－（ＣＨ２）ｍ－Ｏ－（ＣＨ２）ｍ－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ１０アルキル）（各ｍは、１～８である）、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、－Ｃ（Ｓ）ＮＲ２、－ＳＯ２ＮＲ２、－ＮＲＣ（Ｏ）ＮＲ２、－ＮＲＣ（Ｓ）ＮＲ２、それらの塩などが挙げられるが、これらに限定されない。前述のリストの各Ｒ基としては、Ｈ、アルキルもしくは置換アルキル、アリールもしくは置換アリール、またはアルカリルが挙げられるが、これらに限定されない。置換基が、左から右に書かれたそれらの従来の化学式によって特定される場合、それらは、右から左に構造を書くことから生じるであろう化学的に同一の置換基を等しく包含し、例えば、－ＣＨ２Ｏ－は、－ＯＣＨ２－に等しい。
ほんの一例として、アルキル及びヘテロアルキルラジカルの置換基（アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、及びヘテロシクロアルケニルと称されるそれらの基を含む）には、以下が含まれるが、これらに限定されない：－ＯＲ、＝Ｏ、＝ＮＲ、＝Ｎ－ＯＲ、－ＮＲ２、－ＳＲ、－ハロゲン、－ＳｉＲ３、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｒ、－ＣＯ２Ｒ、－ＣＯＮＲ２、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２、－ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ、－ＮＲＣ（Ｏ）ＮＲ２、－ＮＲ（Ｏ）２Ｒ、－ＮＲ－Ｃ（ＮＲ２）＝ＮＲ、－Ｓ（Ｏ）Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２、－ＮＲＳＯ２Ｒ、－ＣＮ、及び－ＮＯ２。前述のリストの各Ｒ基は、水素、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換アリール（１～３個のハロゲンで置換されたアリールを含むがこれに限定されない）、置換もしくは非置換アルキル、アルコキシ、もしくはチオアルコキシ基、またはアラルキル基が含まれるがこれらに限定されない。２つのＲ基が同じ窒素原子に結合されるとき、それらは、窒素原子と組み合わされて、５、６、または７員環を形成することができる。例えば、－ＮＲ２は、限定されないが、１－ピロリジニル及び４－モルホリニルを含むことを意図する。
例として、アリール及びヘテロアリール基の置換基は、ゼロ～芳香族系上の開放原子価の総数の範囲の数で、限定されないが、－ＯＲ、＝Ｏ、＝ＮＲ、＝Ｎ－ＯＲ、－ＮＲ２、－ＳＲ、－ハロゲン、－ＳｉＲ３、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｒ、－ＣＯ２Ｒ、－ＣＯＮＲ２、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２、－ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ、－ＮＲＣ（Ｏ）ＮＲ２、－ＮＲ（Ｏ）２Ｒ、－ＮＲ－Ｃ（ＮＲ２）＝ＮＲ、－Ｓ（Ｏ）Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２、－ＮＲＳＯ２Ｒ、－ＣＮ、－ＮＯ２、－Ｒ、－Ｎ３、－ＣＨ（Ｐｈ）２、フルオロ（Ｃ１－Ｃ４）アルコキシ、及びフルオロ（Ｃ１－Ｃ４）アルキルを含み、前述のリストの各Ｒ基は、限定されないが、水素、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、及びヘテロアリールを含む。
本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、治療される疾患、障害、または状態の症状のうちの１つ以上を治癒するか、または少なくとも部分的に阻止するか、またはある程度緩和するのに十分な、疾患、状態、または障害を既に患っている患者に投与される、少なくとも１つの非天然アミノ酸ポリペプチド及び／または少なくとも１つの修飾された非天然アミノ酸ポリペプチドを含有する組成物の量を指す。そのような組成物の有効性は、疾患、障害、または状態の重症度及び経過、以前の療法、患者の健康状態及び薬物への応答、ならびに治療を行う医師の判断を含むが、これらに限定されない状態に依存する。ほんの一例として、治療有効量は、用量漸増臨床試験を含むが、これに限定されない、日常的な実験によって決定され得る。
本明細書で使用される場合、「チオアルコキシ」という用語は、酸素原子を介して分子に連結された硫黄含有アルキル基を指す。
本明細書で使用される場合、「毒性部分」または「毒性基」という用語は、害、障害、または死亡を引き起こし得る化合物を指す。毒性部分には、アウリスタチン、ＤＮＡ小溝結合剤、ＤＮＡ小溝アルキル化剤、エンジイン、レキシトロプシン、デュオカルマイシン、タキサン、ピューロマイシン、ＴＬＲアゴニスト、メイタンシノイド、ビンカアルカロイド、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ、ＡＥＢ、ＡＥＶＢ、アウリスタチンＥ、パクリタキセル、ドセタキセル、ＣＣ－１０６５、ＳＮ－３８、トポテカン、モルホリノ－ドキソルビシン、リゾキシン、シアノモルホリノ－ドキソルビシン、ＴＬＲ－アゴニスト－１０、エキノマイシン、コンブレタスタチン、カリキアマイシン、メイタンシン、ＤＭ－１、ネトロプシン、ポドフィロトキシン（例えば、エトポシド、テニポシドなど）、バッカチン及びその誘導体、抗チューブリン剤、クリプトフィジン、コンブレタスタチン、アウリスタチンＥ、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ＶＰ－１６、カンプトテシン、エポチロンＡ、エポチロンＢ、ノコダゾール、コルヒチン、コルシミド、エストラムスチン、セマドチン、ディスコデルモリド、メイタンシン、エリュテロビン、メクロレタミン、シクロホスファミド、メルファラン、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、クロロゾトシン、ウラシルマスタード、クロルメチン、イフォスファミド、クロランブシル、ピポブロマン、トリエチレンメラミン、トリエチレンチオホスホラミン、ブスルファン、ダカルバジン、及びテモゾロミド、イタラビン、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル、フロクスウリジン、６－チオグアニン、６－メルカプトプリン、ペントスタチン、５－フルオロウラシル、メトトレキサート、１０－プロパルギル－５，８－ジデアザフォレート、５，８－ジデアザテトラヒドロ葉酸、ロイコボリン、リン酸フルダラビン、ペントスタチン、ゲムシタビン、Ａｒａ－Ｃ、パクリタキセル、ドセタキセル、デオキシコホルマイシン、マイトマイシン－Ｃ、Ｌ－アスパラギナーゼ、アザチオプリン、ブレキナール、抗生物質（例えば、アントラサイクリン、ゲンタマイシン、セファロチン、バンコマイシン、テラバンシン、ダプトマイシン、アジスロマイシン、エリスロマイシン、ロシスロマイシン、フラゾリドン、アモキシシリン、アンピシリン、カルベニシリン、フルクロキサシリン、メチシリン、ペニシリン、シプロフロキサシン、モキシフロキサシン、オフロキサシン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、リファブチン、エタンブトール、リファキシミンなど）、抗ウイルス剤（例えば、アバカビル、アシクロビル、アンプリゲン、シドフォビル、デラビルジン、ジダノシン、エファビレンツ、エンテカビル、ホスフォネット、ガンシクロビル、イバシタビン、イムノビル、イドクスウリジン、イノシン、ロピナビル、メチサゾン、ネキサビル、ネビラピン、オセルタミビル、ペンシクロビル、スタブジン、トリフルリジン、トルバダ、バラシクロビル、ザナミビルなど）、ダウノルビシン塩酸塩、ダウノマイシン、ルビドマイシン、セルビジン、イダルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、及びモルホリノ誘導体、フェノキシゾンビスシクロペプチド（例えば、ダクチノマイシン）、塩基性糖ペプチド（例えば、ブレオマイシン）、アントラキノングリコシド（例えば、プリカマイシン、ミトラマイシン）、アントラセンジオン（例えば、ミトキサントロン）、アジリノピロロインドレジオン（例えば、マイトマイシン）、大環状免疫抑制剤（例えば、シクロスポリン、ＦＫ－５０６、タクロリムス、プログラフ、ラパマイシンなど）、ナベルベン、ＣＰＴ－１１、アナストラゾール、レトラゾール、カペシタビン、レロキサフィン、シクロホスファミド、イフォサミド、ドロロキサフィン、アロコルヒチン、ハリコンドリンＢ、コルヒチン、コルヒチン誘導体、メイタンシン、リゾキシン、パクリタキセル、パクリタキセル誘導体、ドセタキセル、チオコルヒチン、トリチルシステリン、ビンブラスチン硫酸塩、ビンクリスチン硫酸塩、シスプラチン、カルボプラチン、ヒドロキシ尿素、Ｎ－メチルヒドラジン、エピドフィロトキシン、プロカルバジン、ミトキサントロン、ロイコボリン、ならびにテガフールが含まれるが、これらに限定されない。「タキサン」は、パクリタキセル、ならびに任意の活性タキサン誘導体またはプロドラッグを含む。
本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療すること」、または「治療」という用語は、疾患もしくは状態の症状を軽減、減少、もしくは改善すること、追加の症状を予防すること、症状の根本的な代謝原因を改善もしくは予防すること、疾患もしくは状態を阻害すること、例えば、疾患もしくは状態の発症を阻止すること、疾患もしくは状態を緩和すること、疾患もしくは状態の退行を引き起こすこと、疾患もしくは状態によって引き起こされる状態を緩和すること、または疾患もしくは状態の症状を停止させることを含む。「治療する」、「治療すること」、または「治療」という用語には、予防的及び／または治療的処置が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「水溶性ポリマー」という用語は、水性溶媒に可溶性である任意のポリマーを指す。そのような水溶性ポリマーとしては、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、モノＣ１－Ｃ１０アルコキシまたはそのアリールオキシ誘導体（本明細書に参照により組み込まれる米国特許第５，２５２，７１４号に記載される）、モノメトキシ－ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアミノ酸、ジビニルエーテルマレイン酸無水物、Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）－メタクリルアミド、デキストラン、デキストラン硫酸塩を含むデキストラン誘導体、ポリプロピレングリコール、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、ヘパリン、ヘパリン断片、多糖類、オリゴ糖、グリカン、セルロース及びセルロース誘導体（限定されないが、メチルセルロース及びカルボキシメチルセルロースを含む）、血清アルブミン、デンプン及びデンプン誘導体、ポリペプチド、ポリアルキレングリコール及びその誘導体、ポリアルキレングリコール及びその誘導体のコポリマー、ポリビニルエチルエーテル、及びアルファ－ベータ－ポリ［（２－ヒドロキシエチル）－ＤＬ－アスパルトアミドなど、またはそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ほんの一例として、そのような水溶性ポリマーの天然アミノ酸ポリペプチドまたは非天然ポリペプチドへの結合は、非修飾形態と比較して、水溶性の増加、血清半減期の増加または調節、治療半減期の増加または調節、バイオアベイラビリティの増加、生物学的活性の調節、循環時間の延長、免疫原性の調節、限定されないが、凝集及び多量体形成、受容体結合、活性調節因子、または他の標的化ポリペプチド結合の変更、１つ以上の結合パートナーへの結合の変更、及び標的化ポリペプチド受容体の二量体化または多量体化の変更を含むが、これらに限定されない物理的会合特徴の調節を含むがこれらに限定されない変化をもたらし得る。加えて、そのような水溶性ポリマーは、独自の生物学的活性を有しても有していなくてもよく、１つ以上の標的化ポリペプチド、または１つ以上の生物学的活性分子を含むがこれらに限定されない、標的化ポリペプチドを他の物質に結合させるためのリンカーとして利用されてもよい。
別段の指示がない限り、当業者の技能の範囲内の、質量分析、ＮＭＲ、ＨＰＬＣ、タンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技法、及び薬理学の従来の方法が用いられる。
本明細書に提示される化合物（非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、修飾された非天然アミノ酸ポリペプチド、及び前述の化合物を産生するための試薬を含むが、これらに限定されない）は、本明細書に提示される種々の式及び構造に列記されるものと同一であるが、１つ以上の原子が、通常、天然に見出される原子質量または質量数とは異なる原子質量または質量数を有する原子に置き換えられるという事実に関して、同位体標識化合物を含む。本化合物に組み込まれ得る同位体の例としては、水素、炭素、窒素、酸素、フッ素、及び塩素の同位体、例えば、それぞれ２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、１７Ｏ、３５Ｓ、１８Ｆ、３６Ｃｌが挙げられる。本明細書に記載のある特定の同位体標識化合物、例えば、３Ｈ及び１４Ｃなどの放射性同位体が組み込まれる化合物は、薬物及び／または基質組織分布アッセイにおいて有用である。さらに、重水素、すなわち、２Ｈなどの同位体での置換は、より大きな代謝安定性、例えば、インビボでの半減期の増加または必要な投薬量の低減に起因するある特定の治療上の利点をもたらすことができる。
本明細書の化合物のいくつか（非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、及び修飾された非天然アミノ酸ポリペプチド、ならびに前述の化合物を産生するための試薬を含むが、これらに限定されない）は、不斉炭素原子を有し、したがって鏡像異性体またはジアステレオマーとして存在することができる。ジアステレオマー混合物は、例えば、クロマトグラフィー及び／または分別晶析によって知られる方法によって、それらの物理化学的相違に基づいて、それらの個々のジアステレオマーに分離することができる。エナンチオマーは、適切な光学活性化合物（例えば、アルコール）との反応によってエナンチオマー混合物をジアステレオマー混合物に変換し、ジアステレオマーを分離し、個々のジアステレオマーを対応する純粋なエナンチオマーに変換する（例えば、加水分解する）ことによって分離することができる。ジアステレオマー、エナンチオマー、及びそれらの混合物を含む、すべてのそのような異性体は、本明細書に記載の組成物の一部とみなされる。
追加またはさらなる実施形態において、本明細書に記載の化合物（非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、及び修飾された非天然アミノ酸ポリペプチド、ならびに前述の化合物を産生するための試薬を含むが、これらに限定されない）は、プロドラッグの形態で使用される。追加またはさらなる実施形態において、本明細書に記載の化合物（非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、及び修飾された非天然アミノ酸ポリペプチド、ならびに前述の化合物を産生するための試薬を含むが、これらに限定されない）は、代謝産物を産生する必要がある生物への投与時に代謝され、その後、所望の治療効果を含む所望の効果をもたらすために使用される。さらなるまたは追加の実施形態において、非天然アミノ酸及び「修飾されたまたは非修飾」非天然アミノ酸ポリペプチドの活性代謝産物である。
本明細書に記載の方法及び製剤は、Ｎ－オキシド、結晶形（多形としても知られる）、または非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、及び修飾された非天然アミノ酸ポリペプチドの医薬的に許容される塩の使用を含む。ある特定の実施形態において、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、及び修飾された非天然アミノ酸ポリペプチドは、互変異性体として存在し得る。すべての互変異性体は、本明細書に提示される非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、及び修飾された非天然アミノ酸ポリペプチドの範囲内に含まれる。加えて、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、及び修飾された非天然アミノ酸ポリペプチドは、非溶媒和、ならびに水、エタノールなどの医薬的に許容される溶媒との溶媒和形態で存在することができる。本明細書に提示される非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、及び修飾された非天然アミノ酸ポリペプチドの溶媒和形態も、本明細書に開示されるとみなされる。
本明細書の化合物のいくつか（非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、及び修飾された非天然アミノ酸ポリペプチド、ならびに前述の化合物を産生するための試薬を含むが、これらに限定されない）は、いくつかの互変異性形態で存在し得る。すべてのそのような互変異性形態は、本明細書に記載の組成物の一部とみなされる。また、例えば、本明細書の任意の化合物のすべてのエノール－ケト形態（非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、及び修飾された非天然アミノ酸ポリペプチド、ならびに前述の化合物を産生するための試薬を含むが、これらに限定されない）は、本明細書に記載の組成物の一部とみなされる。
本明細書の化合物のいくつか（非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、及び修飾された非天然アミノ酸ポリペプチド、ならびに前述の化合物のいずれかを産生するための試薬を含むが、これらに限定されない）は、酸性であり、医薬的に許容されるカチオンと塩を形成し得る。本発明の化合物のいくつか（非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、及び修飾された非天然アミノ酸ポリペプチド、ならびに前述の化合物を産生するための試薬を含むが、これらに限定されない）は、塩基性であり得、したがって、医薬的に許容されるアニオンと塩を形成し得る。二塩を含むすべてのそのような塩は、本明細書に記載の組成物の範囲内であり、それらは、従来の方法によって調製することができる。例えば、塩は、水性、非水性、または部分的水性媒体のいずれかで、酸性及び塩基性の物質を接触させることによって調製することができる。塩は、次の技法：濾過、非溶媒での沈殿、続いて濾過、溶媒の蒸発、または水溶液の場合、凍結乾燥、のうちの少なくとも１つを使用することによって回収される。
本明細書に開示される非天然アミノ酸ポリペプチドの医薬的に許容される塩は、親非天然アミノ酸ポリペプチド中に存在する酸性プロトンが、例として、アルカリ金属イオン、アルカリ土類イオン、もしくはアルミニウムイオンの金属イオンに置き換えられるか、または有機塩基と配位結合するときのいずれかの場合に形成され得る。加えて、開示される非天然アミノ酸ポリペプチドの塩形態は、出発材料または中間体の塩を使用して調製することができる。本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドは、本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドの遊離塩基形態を医薬的に許容される無機または有機酸と反応させることによって、医薬的に許容される酸付加塩（医薬的に許容される塩の一種である）として調製することができる。あるいは、本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドは、本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドの遊離酸形態を医薬的に許容される無機または有機酸と反応させることによって、医薬的に許容される塩基付加塩（医薬的に許容される塩の一種である）として調製することができる。
医薬的に許容される塩の種類には、以下が含まれるが、これらに限定されない：（１）無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などと形成された、または有機酸、例えば、酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、シクロペンタンプロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、３－（４－ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、１，２－エタンジスルホン酸、２－ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、２－ナフタレンスルホン酸、４－メチルビシクロ［２．２．２］オクト－２－エン－１－カルボン酸、グルコヘプトン酸、４，４’－メチレンビス－（３－ヒドロキシ－２－エン－１－カルボン酸）、３－フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、三級ブチル酢酸、ラウリル硫酸、グルコン酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸、ステアリン酸、ムコン酸などで形成された酸付加塩、あるいは（２）親化合物中に存在する酸性プロトンが、金属イオン、例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類イオン、もしくはアルミニウムイオンに置き換えられるか、または有機塩基と配位結合するときのいずれかの場合に形成された塩。許容される有機塩基には、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、Ｎ－メチルグルカミンなどが含まれる。許容される無機塩基には、水酸化アルミニウム、水酸化カルシウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウムなどが含まれる。
非天然アミノ酸ポリペプチドの医薬的に許容される塩の対応する対イオンは、イオン交換クロマトグラフィー、イオンクロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、誘導結合プラズマ、原子吸光分析、質量分析、またはそれらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない種々の方法を使用して分析及び特定され得る。加えて、そのような非天然アミノ酸ポリペプチドの医薬的に許容される塩の治療活性は、実施例に記載の技法及び方法を使用して試験され得る。
塩への言及は、溶媒付加形態またはその結晶形態、特に溶媒和物または多形を含むことが理解されるべきである。溶媒和物は、化学量論的量または非化学量論的量のいずれかの溶媒を含有し、多くの場合、水、エタノールなどの医薬的に許容される溶媒との結晶化プロセス中に形成される。水和物は溶媒が水である場合に形成されるか、またはアルコラートは溶媒がアルコールである場合に形成される。多形は、化合物の同じ元素組成の異なる結晶充填配置を含む。多形は、通常、異なるＸ線回折パターン、赤外線スペクトル、融点、密度、硬度、結晶形状、光学及び電気特性、安定性、ならびに溶解性を有する。再結晶化溶媒、結晶化速度、及び貯蔵温度などの種々の要因は、単結晶形態を支配する可能性がある。
非天然アミノ酸ポリペプチドの医薬的に許容される塩の多形及び／または溶媒和物のスクリーニング及び特徴付けは、熱分析、Ｘ線回折、分光法、蒸気吸着、及び顕微鏡法を含むがこれらに限定されない様々な技法を使用して達成され得る。熱分析方法は、多形遷移を含むがこれに限定されない熱化学分解または熱物理プロセスに対処し、そのような方法は、多形体間の関係を分析するため、重量損失を決定するため、ガラス遷移温度を見つけるため、または賦形剤適合性研究のために使用される。そのような方法には、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、変調示差走査熱量測定（ＭＤＣＳ）、熱重量分析（ＴＧＡ）、ならびに熱重量測定及び赤外線分析（ＴＧ／ＩＲ）が含まれるが、これらに限定されない。Ｘ線回折法には、単結晶及び粉末回折計ならびにシンクロトロン源が含まれるが、これらに限定されない。使用される種々の分光技法には、ラマン、ＦＴＩＲ、ＵＶＩＳ、及びＮＭＲ（液体及び固体状態）が含まれるが、これらに限定されない。種々の顕微鏡法の技法には、偏光顕微鏡法、エネルギー分散型Ｘ線分析（ＥＤＸ）を用いた走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）、ＥＤＸを用いた環境走査型電子顕微鏡法（ガスまたは水蒸気雰囲気中）、ＩＲ顕微鏡法、及びラマン顕微鏡法が含まれるが、これらに限定されない。
本発明の好ましい実施形態を本明細書で示し説明してきたが、そのような実施形態が例として提供されていることは当業者には明らかであろう。本発明から逸脱することなく、多くの変形、変更、及び置換が当業者に生じるであろう。本明細書に記載の本発明の実施形態に対する種々の代替案が、本発明を実施する際に用いられ得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲の範囲内の方法及び構造、ならびにそれらの等価物がそれによって網羅されることが意図される。
ＴＬＲ－アゴニストリンカー誘導体
あるレベルで、カルボニル、ジカルボニル、オキシム、またはヒドロキシルアミン基を有する少なくとも１つの非天然アミノ酸または修飾された非天然アミノ酸を含むＴＣまたは類似体の標的化ポリペプチドを作製し使用するためのツール（方法、組成物、技法）が本明細書に記載される。非天然アミノ酸を含むＴＣのそのような標的化ポリペプチドは、ポリマー、水溶性ポリマー、ポリエチレングリコールの誘導体、第２のタンパク質またはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体、抗体もしくは抗体断片、及びそれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されないさらなる官能基を含有し得る。種々の前述の官能基は、ある官能基のメンバーが別の官能基のメンバーとして分類することができないことを意味するものではないことに留意されたい。実際、特定の状況に応じて重複する。ほんの一例として、水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコールの誘導体と範囲が重複するが、重複は完全ではなく、したがって両方の官能基が上記に引用される。
一態様では、本明細書に記載の方法、組成物、及び技法を使用して修飾されるＴＬＲ－アゴニストリンカー誘導体、及び標的化ポリペプチドを選択及び設計する方法である。ほんの一例を含む、新規のＴＬＲ－アゴニストリンカー誘導体及び標的化ポリペプチドが、ハイスループットスクリーニングプロセス（その場合、多数のポリペプチドが設計、合成、特徴付け、及び／または試験され得る）の一部として、または研究者の関心に基づいて新規に設計され得る。新規のＴＬＲアゴニストリンカー誘導体及び標的化ポリペプチドは、既知のまたは部分的に特徴付けられたポリペプチドの構造に基づいて設計することもできる。ほんの一例として、ＴＬＲ－アゴニストは科学界による集中的な研究の対象であり、新規化合物はＴＬＲ－アゴニストの構造に基づいて設計され得る。どのアミノ酸（複数可）を置換及び／または修飾するかを選択するための原理は、本明細書において別個に記載される。どの修飾を用いるかの選択も本明細書に記載されており、実験者または最終使用者のニーズを満たすために使用することができる。そのようなニーズには、ポリペプチドの治療有効性を操作すること、ポリペプチドの安全性プロファイルを改善すること、ポリペプチドの薬物動態、薬理学、及び／または薬力学を調整すること、例えば、ほんの一例として、水溶性、バイオアベイラビリティの増加、血清半減期の増加、治療半減期の増加、免疫原性の調節、生物学的活性の調節、または循環時間の延長が含まれるが、これらに限定されない。加えて、そのような修飾には、ほんの一例として、ポリペプチドに追加の官能基を提供すること、抗体を組み込むこと、及び前述の修飾の任意の組み合わせが含まれる。
オキシム、カルボニル、ジカルボニル、またはヒドロキシルアミン基を有するか、または含有するように修飾され得る、ＴＬＲ－アゴニストリンカー誘導体及び標的化ポリペプチドも本明細書に記載される。この態様には、そのようなＴＬＲ－アゴニストリンカー誘導体及び標的化ポリペプチドを産生、精製、特徴付け、及び使用するための方法が含まれる。
ＴＬＲ－アゴニストリンカー誘導体または標的化ポリペプチドは、カルボニルもしくはジカルボニル基、オキシム基、ヒドロキシルアミン基、またはそれらの保護形態のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または１０以上を含有し得る。ＴＬＲ－アゴニストリンカー誘導体または標的化ポリペプチドは、同一であっても異なっていてもよく、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上の異なる反応性基を含む誘導体に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上の異なる部位が存在し得る。
本明細書に記載されるように、本開示は、式「標的化ポリペプチド－Ｌ－Ｍ」を有する別の分子に結合した標的化ポリペプチドを提供し、式中、Ｌは、連結基または化学結合であり、Ｍは、別の標的化ポリペプチドを含むが、これらに限定されない任意の他の分子である。いくつかの実施形態において、Ｌは、インビボで安定である。いくつかの実施形態において、Ｌは、インビボで加水分解可能である。いくつかの実施形態において、Ｌは、インビボで準安定である。
標的化ポリペプチド及びＭは、当業者に既知の標準的な連結剤及び手順を使用して、Ｌにより一緒に連結され得る。いくつかの態様において、標的化ポリペプチド及びＭは直接縮合され、Ｌは結合である。他の態様において、標的化ポリペプチド及びＭは、連結基Ｌを介して縮合される。例えば、いくつかの実施形態において、標的化ポリペプチド及びＭは、ペプチド結合を介して、任意に、ペプチドまたはアミノ酸スペーサーを通じて一緒に連結される。いくつかの実施形態において、標的化ポリペプチド及びＭは、化学コンジュゲーションを通じて、任意に、連結基（Ｌ）を通じて一緒に連結される。いくつかの実施形態において、Ｌは、標的化ポリペプチド及びＭのそれぞれに直接コンジュゲートされる。
化学コンジュゲーションは、ある化合物の求核反応性基を別の化合物の求電子反応性基に反応させることによって生じ得る。いくつかの実施形態において、Ｌが結合であるとき、標的化ポリペプチドは、標的化ポリペプチド上の求核反応性部分と、Ｙ上の求電子反応性部分とを反応させるか、または標的化ポリペプチド上の求電子反応性部分と、Ｍ上の求核反応性部分とを反応させるかのいずれかによって、Ｍにコンジュゲートされる。Ｌが標的化ポリペプチド及びＭを一緒に連結する基である実施形態において、標的化ポリペプチド及び／またはＭは、標的化ポリペプチド及び／またはＭ上の求核反応性部分と、Ｌ上の求電子反応性部分とを反応させるか、または標的化ポリペプチド及び／またはＭ上の求電子反応性部分と、Ｌ上の求核反応性部分とを反応させるかのいずれかによって、Ｌにコンジュゲートされ得る。求核反応性基の非限定的な例としては、アミノ、チオール、及びヒドロキシルが挙げられる。求電子反応性基の非限定的な例としては、カルボキシル、塩化アシル、無水物、エステル、スクシンイミドエステル、ハロゲン化アルキル、スルホネートエステル、マレイミド、ハロアセチル、及びイソシアネートが挙げられる。標的化ポリペプチド及びＭを、カルボン酸とアミンとを反応させることによって一緒にコンジュゲートする実施形態において、活性化剤を使用して、カルボン酸の活性化エステルを形成することができる。
カルボン酸の活性化エステルは、例えば、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、トシレート（Ｔｏｓ）、メシレート、トリフレート、カルボジイミド、またはヘキサフルオロホスフェートであり得る。いくつかの実施形態において、カルボジイミドは、１，３－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１，１’－カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、または１，３－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣＤ）である。いくつかの実施形態において、ヘキサフルオロホスフェートは、ヘキサフルオロホスフェートベンゾトリアゾール－１－イル－オキシ－トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、ベンゾトリアゾール－１－イル－オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、２－（１Ｈ－７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、及びｏ－ベンゾトリアゾール－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－ウロニウム－ヘキサフルオロ－ホスフェート（ＨＢＴＵ）からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、標的化ポリペプチドは、ＭまたはＬ上の求電子反応性基にコンジュゲートすることが可能な求核反応性基（例えば、リジン、システインまたはセリンの側鎖のアミノ基、チオール基、またはヒドロキシル基）を含む。いくつかの実施形態において、標的化ポリペプチドは、ＭまたはＬ上の求核反応性基にコンジュゲートすることが可能な求電子反応性基（例えば、ＡｓｐまたはＧｌｕの側鎖のカルボキシレート基）を含む。いくつかの実施形態において、標的化ポリペプチドは、ＭまたはＬに直接コンジュゲートすることが可能な反応性基を含むように化学修飾される。いくつかの実施形態において、標的化ポリペプチドは、求核側鎖を有する天然または非天然アミノ酸を含むように、Ｎ末端またはＣ末端で修飾される。例示的な実施形態において、標的化ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端アミノ酸は、リジン、オルニチン、セリン、システイン、及びホモシステインからなる群から選択される。例えば、標的化ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端アミノ酸は、リジン残基を含むように修飾され得る。いくつかの実施形態において、標的化ポリペプチドは、例えば、Ａｓｐ及びＧｌｕなどの求電子側鎖を有する天然または非天然アミノ酸を含むように、Ｎ末端またはＣ末端アミノ酸で修飾される。いくつかの実施形態において、標的化ポリペプチドの内部アミノ酸は、本明細書に先に記載されるように、求核側鎖を有する天然または非天然アミノ酸で置換される。例示的な実施形態において、置換される標的化ポリペプチドの内部アミノ酸は、リジン、オルニチン、セリン、システイン、及びホモシステインからなる群から選択される。例えば、標的化ポリペプチドの内部アミノ酸は、リジン残基で置換され得る。いくつかの実施形態において、標的化ポリペプチドの内部アミノ酸は、例えば、Ａｓｐ及びＧｌｕなどの求電子側鎖を有する天然または非天然アミノ酸で置換される。
いくつかの実施形態において、Ｍは、標的化ポリペプチドまたはＬに直接コンジュゲートすることが可能な反応性基を含む。いくつかの実施形態において、Ｍは、標的化ポリペプチドまたはＬ上の求電子反応性基にコンジュゲートすることが可能な求核反応性基（例えば、アミン、チオール、ヒドロキシル）を含む。いくつかの実施形態において、Ｍは、標的化ポリペプチドまたはＬ上の求核反応性基にコンジュゲートすることが可能な求電子反応性基（例えば、カルボキシル基、カルボキシル基の活性化形態、脱離基を有する化合物）を含む。いくつかの実施形態において、Ｍは、標的化ポリペプチドまたはＬ上の求電子反応性基にコンジュゲートすることが可能な求核反応性基のいずれかを含むように化学修飾される。いくつかの実施形態において、Ｍは、標的化ポリペプチドまたはＬ上の求核反応性基にコンジュゲートすることが可能な求電子反応性基を含むように化学修飾される。
いくつかの実施形態において、コンジュゲーションは、オルガノシラン、例えば、グルタルアルデヒドで処理されたアミノシラン、シラノール基のカルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）活性化、またはデンドリマーの利用を通じて行われ得る。様々なデンドリマーが当該技術分野で既知であり、アンモニアまたはエチレンジアミン開始剤コア試薬から始まる分岐法によって合成されるポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー、トリス－アミノエチレン－イミンコアに基づくＰＡＭＡＭデンドリマーのサブクラス、親水性、求核性ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）内部及び疎水性有機ケイ素（ＯＳ）外部からなる逆単分子ミセルである放射状層ポリ（アミドアミン－有機ケイ素）デンドリマー（ＰＡＭＡＭＯＳ）、一般に、末端基として一級アミンを有するポリ－アルキルアミンであるが、デンドリマー内部は多数の三級トリス－プロピレンアミンからなるポリ（プロピレンイミン）（ＰＰＩ）デンドリマー、ポリ（プロピレンアミン）（ＰＯＰＡＭ）デンドリマー、ジアミノブタン（ＤＡＢ）デンドリマー、両親媒性デンドリマー、水溶性超分枝状ポリフェニレンの単分子ミセルであるミセルデンドリマー、ポリリジンデンドリマー、ならびにポリ－ベンジルエーテル超分枝状骨格に基づくデンドリマーを含む。
いくつかの実施形態において、コンジュゲーションは、オレフィンメタセシスを通じて行われ得る。いくつかの実施形態において、Ｍ及び標的化ポリペプチド、Ｍ及びＬ、または標的化ポリペプチド及びＬは両方とも、メタセシスを受けることが可能なアルケンまたはアルキン部分を含む。いくつかの実施形態において、好適な触媒（例えば、銅、ルテニウム）を使用して、メタセシス反応を加速させる。オレフィンメタセシス反応を実施する好適な方法は、当該技術分野において記載されている。例えば、Ｓｃｈａｆｍｅｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２：５８９１－５８９２（２０００）、Ｗａｌｅｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０５：１４６６－１４７０（２００４）、及びＢｌａｃｋｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ，Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．３７：３２８１－３２８４（１９９８）を参照されたい。
いくつかの実施形態において、コンジュゲーションは、クリック化学を使用して行われ得る。「クリック反応」は、範囲が広く、実施が容易であり、容易に入手可能な試薬のみを使用し、酸素及び水に対して非感受性である。いくつかの実施形態において、クリック反応は、トリアゾリル基を形成するためのアルキニル基とアジド基との間の環状付加反応である。いくつかの実施形態において、クリック反応は、銅またはルテニウム触媒を使用する。クリック反応を実施するための好適な方法は、当該技術分野において記載されている。例えば、Ｋｏｌｂ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ ８：１１２８（２００３）、Ｋｏｌｂ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４０：２００４（２００１）、Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４１：２５９６（２００２）、Ｔｏｒｎｏｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６７：３０５７（２００２）、Ｍａｎｅｔｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２６：１２８０９（２００４）、Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４１：１０５３（２００２）、Ｓｐｅｅｒｓ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５：４６８６（２００３）、Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．６：２８５３（２００４）、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２７：１５９９８（２００５）、及びＷａｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２７：８２９４（２００５）を参照されたい。
高親和性特異的結合パートナー、例えば、ストレプトアビジン／ビオチンまたはアビジン／ビオチンまたはレクチン／炭水化物を介した間接的なコンジュゲーションも企図される。
いくつかの実施形態において、標的化ポリペプチド及び／またはＭは、有機誘導体化剤を有する求核反応性基または求電子反応性基を含むように官能化される。この誘導体化剤は、標的化ポリペプチド上の標的とされるアミノ酸の選択された側鎖またはＮ末端もしくはＣ末端残基、及びＭ上の官能基と反応することが可能である。標的化ポリペプチド及び／またはＭ上の反応性基には、例えば、アルデヒド、アミノ、エステル、チオール、ａ－ハロアセチル、マレイミド、またはヒドラジノ基が含まれる。誘導体化剤としては、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を通じたコンジュゲーション）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を通じて）、グルタルアルデヒド、コハク酸無水物、または当該技術分野で既知の他の薬剤が挙げられる。あるいは、標的化ポリペプチド及び／またはＭは、多糖またはポリペプチド担体などの中間担体を通じて間接的に互いに連結され得る。多糖担体の例としては、アミノデキストランが挙げられる。得られるロードした担体に望ましい溶解性を付与するための好適なポリペプチド担体の例としては、ポリリジン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、そのコポリマー、及びこれらのアミノ酸及び他のアミノ酸、例えばセリンの混合ポリマーが挙げられる。
システイニル残基を、最も一般的には、クロロ酢酸またはクロロアセトアミドなどのａ－ハロアセテート（及び対応するアミン）と反応させて、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得る。システイニル残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、アルファ－ブロモ－β－（５－イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ－アルキルマレイミド、３－ニトロ－２－ピリジルジスルフィド、メチル２－ピリジルジスルフィド、ｐ－クロロメルクリベンゾエート、２－クロロメルクリ－４－ニトロフェノール、またはクロロ－７－ニトロベンゾ－２－オキサ－１，３－ジアゾールとの反応によって誘導体化される。
ヒスチジル残基は、この薬剤がヒスチジル側鎖に比較的特異的であるため、ｐＨ５．５～７．０でジエチルピロカーボネートとの反応によって誘導体化される。パラ－ブロモフェナシルブロミドも有用であり、反応は、好ましくは、ｐＨ６．０の０．１Ｍのカコジル酸ナトリウム中で実施される。
リシニル及びアミノ末端残基をコハク酸または他のカルボン酸無水物と反応させる。これらの薬剤による誘導体化は、リシニル残基の電荷を逆転させる効果を有する。アルファ－アミノ含有残基を誘導体化するための他の好適な試薬としては、ピコリンイミド酸メチル、ピリドキサールリン酸、ピリドキサール、クロロ水素化ホウ素（ｃｈｌｏｒｏｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄｅ）、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ－メチルイソ尿素、２，４－ペンタンジオン、及びグリオキシレートとのトランスアミナーゼ触媒反応などのイミドエステルが挙げられる。
アルギニル残基は、１つまたはいくつかの従来の試薬、その中でもフェニルグリオキサール、２，３－ブタンジオン、１，２－シクロヘキサンジオン、及びニンヒドリンとの反応によって修飾される。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基のｐＫａが高いため、アルカリ性条件下で反応を実施する必要がある。さらに、これらの試薬は、リジンの基ならびにアルギニンイプシロン－アミノ基と反応し得る。
チロシル残基の特異的修飾は、特に、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によって、スペクトル標識をチロシル残基に導入することに関心を持って行われ得る。最も一般的には、Ｎ－アセチルイミジゾール及びテトラニトロメタンを使用して、それぞれ、Ｏ－アセチルチロシル種及び３－ニトロ誘導体を形成する。
カルボキシル側基（アスパルチルまたはグルタミル）は、カルボジイミド（Ｒ－Ｎ＝Ｃ＝Ｎ－Ｒ’）との反応により選択的に修飾され、式中、Ｒ及びＲ’は、１－シクロヘキシル－３－（２－モルホリニル－４－エチル）カルボジイミドまたは１－エチル－３－（４－アゾニア－４，４－ジメチルペンチル）カルボジイミドなどの異なるアルキル基である。さらに、アンモニウムイオンとの反応により、アスパルチル及びグルタミル残基をアスパラギニル及びグルタミニル残基に変換する。
他の修飾としては、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリルもしくはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のアルファ－アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ．７９－８６（１９８３））、アスパラギンもしくはグルタミンの脱アミド化、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び／またはＣ末端カルボン酸基のアミド化もしくはエステル化が挙げられる。
共有結合修飾の別の種類は、グリコシドをペプチドに化学的または酵素的に結合することを伴う。糖（複数可）が、（ａ）アルギニン及びヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）遊離スルフヒドリル基、例えば、システインのもの、（ｄ）遊離ヒドロキシル基、例えば、セリン、スレオニン、もしくはヒドロキシプロリンのもの、（ｅ）芳香族残基、例えば、チロシンもしくはトリプトファンのもの、または（ｆ）グルタミンのアミド基に結合され得る。これらの方法は、ＷＯ１９８７／０５３３０号、及びＡｐｌｉｎ ａｎｄ Ｗｒｉｓｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ．２５９－３０６（１９８１）に記載される。
いくつかの実施形態において、Ｌは、結合である。これらの実施形態において、標的化ポリペプチド及びＭは、標的化ポリペプチド上の求核反応性部分と、Ｍ上の求電子反応性部分とを反応させることによって、一緒にコンジュゲートされる。代替的な実施形態において、標的化ポリペプチド及びＭは、標的化ポリペプチド上の求電子反応性部分と、Ｍ上の求核部分とを反応させることによって、一緒にコンジュゲートされる。例示的な実施形態において、Ｌは、標的化ポリペプチド上のアミン（例えば、リジン残基のε－アミン）と、Ｍ上のカルボキシル基との反応時に形成されるアミド結合である。代替的な実施形態において、標的化ポリペプチド及び／またはＭは、コンジュゲーション前に誘導体化剤で誘導体化される。
いくつかの実施形態において、Ｌは、連結基である。いくつかの実施形態において、Ｌは、二官能性リンカーであり、標的化ポリペプチド及びＭへのコンジュゲーション前に２つの反応性基のみを含む。標的化ポリペプチド及びＭの両方が求電子反応性基を有する実施形態において、Ｌは、標的化ポリペプチド及びＭへのコンジュゲーション前に、同じ求核基を２つまたは２つの異なる求核基（例えば、アミン、ヒドロキシル、チオール）を含む。標的化ポリペプチド及びＭの両方が求核反応性基を有する実施形態において、Ｌは、標的化ポリペプチド及びＭへのコンジュゲーション前に、同じ求電子基を２つまたは２つの異なる求電子基（例えば、カルボキシル基、カルボキシル基の活性化形態、脱離基を有する化合物）を含む。標的化ポリペプチドまたはＭの一方が求核反応性基を有し、標的化ポリペプチドまたはＭの他方が求電子反応性基を有する実施形態において、Ｌは、標的化ポリペプチド及びＭへのコンジュゲーション前に、１つの求核反応性基及び１つの求電子基を含む。
Ｌは、（標的化ポリペプチド及びＭへのコンジュゲーション前に）標的化ポリペプチド及びＭのそれぞれと反応可能な少なくとも２つの反応性基を有する任意の分子であり得る。いくつかの実施形態において、Ｌは、２つの反応性基のみを有し、二官能性である。Ｌ（ペプチドへのコンジュゲーション前）は、式ＶＩ：
Figure 2022520792000006
で表すことができ、式中、Ａ及びＢは、独立して、求核または求電子反応性基である。いくつかの実施形態において、Ａ及びＢは、両方とも求核基または両方とも求電子基のいずれかである。いくつかの実施形態において、ＡまたはＢのうちの一方が求核基であり、ＡまたはＢの他方が求電子基である。Ａ及びＢの非限定的な組み合わせを以下の表１に示す。
Figure 2022520792000007
Figure 2022520792000008
Figure 2022520792000009
Figure 2022520792000010
Figure 2022520792000011
Figure 2022520792000012
いくつかの実施形態において、Ａ及びＢは、オレフィンメタセシス反応に好適なアルケン及び／またはアルキン官能基を含み得る。いくつかの実施形態において、Ａ及びＢは、クリック化学に好適な部分（例えば、アルケン、アルキン、ニトリル、アジド）を含む。反応性基（Ａ及びＢ）の他の非限定的な例としては、ピリジルジチオール、アリールアジド、ジアジリン、カルボジイミド、及びヒドラジドが挙げられる。
いくつかの実施形態において、Ｌは、疎水性である。疎水性リンカーは当該技術分野で既知である。例えば、参照によりその全体が組み込まれるＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９６）を参照されたい。当該技術分野で既知の好適な疎水性連結基として、例えば、８－ヒドロキシオクタン酸及び８－メルカプトオクタン酸が挙げられる。組成物のペプチドへのコンジュゲートの前に、疎水性連結基は、本明細書に記載され、以下に示す、少なくとも２つの反応性基（Ａ及びＢ）を含む：
Figure 2022520792000013
いくつかの実施形態において、疎水性連結基は、反応性基として、マレイミドまたはヨードアセチル基のいずれか、及びカルボン酸または活性化カルボン酸（例えば、ＮＨＳエステル）のいずれかを含む。これらの実施形態において、マレイミドまたはヨードアセチル基は、標的化ポリペプチドまたはＭ上のチオール部分に結合することができ、カルボン酸または活性化カルボン酸は、結合試薬の使用の有無にかかわらず、標的化ポリペプチドまたはＭ上のアミンに結合することができる。当業者に既知の任意の結合剤を使用して、カルボン酸を、例えば、本明細書に記載のＤＣＣ、ＤＩＣ、ＨＡＴＵ、ＨＢＴＵ、ＴＢＴＵ、及び他の活性化剤などの遊離アミンと結合することができる。特定の実施形態において、親水性結合基は、２～１００のメチレン基の脂肪族鎖を含み、Ａ及びＢは、カルボキシル基またはその誘導体（例えば、コハク酸）である。他の特定の実施形態において、Ｌは、ヨード酢酸である。
Figure 2022520792000014
いくつかの実施形態において、連結基は、例えば、ポリアルキレングリコールなどの親水性である。組成物のペプチドへのコンジュゲーションの前に、親水性連結基は、本明細書に記載され、以下に示す、少なくとも２つの反応性基（Ａ及びＢ）を含む：
Figure 2022520792000015
特定の実施形態において、連結基は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ある特定の実施形態におけるＰＥＧは、約１００ダルトン～約１０，０００ダルトン、例えば、約５００ダルトン～約５０００ダルトンの分子量を有する。いくつかの実施形態におけるＰＥＧは、約１０，０００ダルトン～約４０，０００ダルトンの分子量を有する。
いくつかの実施形態において、親水性連結基は、反応性基として、マレイミドまたはヨードアセチル基のいずれか、及びカルボン酸または活性化カルボン酸（例えば、ＮＨＳエステル）のいずれかを含む。これらの実施形態において、マレイミドまたはヨードアセチル基は、標的化ポリペプチドまたはＭ上のチオール部分に結合することができ、カルボン酸または活性化カルボン酸は、結合試薬の使用の有無にかかわらず、標的化ポリペプチドまたはＭ上のアミンに結合することができる。当業者に既知の任意の適切な結合剤を使用して、カルボン酸を、例えば、本明細書に記載のＤＣＣ、ＤＩＣ、ＨＡＴＵ、ＨＢＴＵ、ＴＢＴＵ、及び他の活性化剤などのアミンと結合することができる。いくつかの実施形態において、連結基は、マレイミド－ポリマー（２０～４０ｋＤａ）－ＣＯＯＨ、ヨードアセチル－ポリマー（２０～４０ｋＤａ）－ＣＯＯＨ、マレイミド－ポリマー（２０～４０ｋＤａ）－ＮＨＳ、またはヨードアセチル－ポリマー（２０～４０ｋＤａ）－ＮＨＳである。
いくつかの実施形態において、連結基は、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、またはポリペプチドからなり、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、またはポリペプチドは、本明細書に記載される少なくとも２つの活性化基を含む。いくつかの実施形態において、連結基（Ｌ）は、アミノ、エーテル、チオエーテル、マレイミド、ジスルフィド、アミド、エステル、チオエステル、アルケン、シクロアルケン、アルキン、トリゾイル、カルバメート、カーボネート、カテプシンＢ切断可能、及びヒドラゾンからなる群から選択される部分を含む。
いくつかの実施形態において、Ｌは、１～約６０個、または１～３０個以上の原子、２～５個の原子、２～１０個の原子、５～１０個の原子、または１０～２０個の長さの原子の鎖を含む。いくつかの実施形態において、鎖原子はすべて、炭素原子である。いくつかの実施形態において、リンカーの骨格中の鎖原子は、Ｃ、Ｏ、Ｎ、及びＳからなる群から選択される。鎖原子及びリンカーは、より可溶性のコンジュゲートを提供するために、それらの予想される溶解性（親水性）によって選択され得る。いくつかの実施形態において、Ｌは、標的組織または器官または細胞に見出される酵素または他の触媒または加水分解条件による切断の対象となる官能基を提供する。いくつかの実施形態において、Ｌの長さは、立体障害の可能性を低減するのに十分に長い。
いくつかの実施形態において、Ｌは、血液または血液画分などの生物学的流体中で安定である。いくつかの実施形態において、Ｌは、血清中で少なくとも５分間安定であり、例えば、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％未満のコンジュゲートが、血清中で５分間インキュベートされたときに切断される。他の実施形態において、Ｌは、少なくとも１０、もしくは２０、もしくは２５、もしくは３０、もしくは６０、もしくは９０、もしくは１２０分間、または３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１８、もしくは２４時間、血清中で安定である。これらの実施形態において、Ｌは、インビボで加水分解を受けることが可能な官能基を含まない。いくつかの例示的な実施形態において、Ｌは、血清中で少なくとも約７２時間安定である。インビボで顕著な加水分解を受けることができない官能基の非限定的な例としては、アミド、エーテル、及びチオエーテルが挙げられる。例えば、以下の化合物は、インビボで顕著な加水分解を受けない：
Figure 2022520792000016
いくつかの実施形態において、Ｌは、インビボで加水分解可能である。これらの実施形態において、Ｌは、インビボで加水分解を受けることが可能な官能基を含む。インビボで加水分解を受けることが可能な官能基の非限定的な例としては、エステル、無水物、及びチオエステルが挙げられる。例えば、以下の化合物は、エステル基を含むため、インビボで加水分解を受けることが可能である。
Figure 2022520792000017
いくつかの例示的な実施形態において、Ｌは不安定であり、３７℃の血漿中で３時間以内に実質的な加水分解を受け、６時間以内に加水分解が完了する。いくつかの例示的な実施形態において、Ｌは、不安定ではない。
いくつかの実施形態において、Ｌは、インビボで準安定である。これらの実施形態において、Ｌは、任意に、ある期間にわたってインビボで化学的または酵素的に切断されることが可能な官能基（例えば、酸不安定性、還元不安定性、または酵素不安定性官能基）を含む。これらの実施形態において、Ｌは、例えば、ヒドラゾン部分、ジスルフィド部分、またはカテプシン切断可能部分を含むことができる。Ｌが準安定であり、いかなる特定の理論にも拘束されることを意図するものではないが、標的化ポリペプチド－Ｌ－Ｍコンジュゲートは、細胞外環境、例えば、上述の期間にわたって血清中で安定であるが、細胞内環境または細胞内環境を模倣する条件において不安定であり、その結果、細胞内に入ると切断される。いくつかの実施形態において、Ｌが準安定である場合、Ｌは、少なくとも約２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、４２、もしくは４８時間、例えば、少なくとも約４８、５４、６０、６６、もしくは７２時間、または約２４～４８、４８～７２、２４～６０、３６～４８、３６～７２、もしくは４８～７２時間、血清中で安定である。
別の実施形態において、本発明のポリマー誘導体は、構造：
Ｘ－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２）ｍ－Ｗ－Ｎ＝Ｎ＝Ｎ
を有するポリマー骨格を含み、式中、Ｗは、１～１０個の炭素原子を含む脂肪族または芳香族リンカー部分であり、
ｎは、１～約４０００であり、Ｘは、上述の官能基であり、ｍは、１～１０である。
本発明のアジド含有ポリマー誘導体は、当該技術分野で既知の及び／または本明細書に開示される様々な方法によって調製することができる。以下に示す１つの方法では、約８００Ｄａ～約１００，０００Ｄａの平均分子量を有する水溶性ポリマー骨格であり、第１の官能基に結合した第１の末端及び好適な脱離基に結合した第２の末端を有するポリマー骨格を、アジドアニオン（ナトリウム、カリウム、ｔｅｒｔ－ブチルアンモニウムなどを含むいくつかの好適な対イオンのいずれかと対合されてもよい）と反応させる。脱離基が求核置換を受け、アジド部分に置き換えられ、所望のアジド含有ポリマーを得る：
Ｘ－ポリマー－ＬＹ＋Ｎ３ －→Ｘ－ポリマー－Ｌ Ｎ３
例示されるように、本発明で使用するのに好適なポリマー骨格は、式Ｘ－ポリマー－ＬＹを有し、式中、ポリマーはポリ（エチレングリコール）であり、Ｘはアジド基と反応しない官能基であり、Ｙは好適な脱離基である。好適な官能基の例としては、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、アセタール、アルケニル、アミン、アミノオキシ、保護されたアミン、保護されたヒドラジド、保護されたチオール、カルボン酸、保護されたカルボン酸、マレイミド、ジチオピリジン、及びビニルピリジン、ならびにケトンが挙げられるが、これらに限定されない。好適な脱離基の例としては、塩化物、臭化物、ヨウ化物、メシレート、トレシレート、及びトシレートが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明のアジド含有ポリマー誘導体の調製のための別の方法において、アジド官能基を有する連結剤は、約８００Ｄａ～約１００，０００Ｄａの平均分子量を有する水溶性ポリマー骨格と接触させられ、連結剤は、ポリマー上の化学官能基と選択的に反応してアジド含有ポリマー誘導体生成物を形成する化学官能基を有し、アジドは、連結基によってポリマー骨格から分離される。
例示的な反応スキームを以下に示す：
Ｘ－ポリマー－Ｙ＋Ｎ－リンカー－Ｎ＝Ｎ＝Ｎ→ＰＧ－Ｘ－ポリマー－リンカー－Ｎ＝Ｎ＝Ｎ、式中、
ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）であり、Ｘは、アルコキシまたは上述の官能基などのキャッピング基であり、Ｙは、アジド官能基と反応性ではないが、Ｎ官能基と効率的かつ選択的に反応する官能基である。
好適な官能基の例としては、限定されないが、Ｎがアミンである場合、Ｙは、カルボン酸、カーボネート、または活性エステルであり、Ｎがヒドラジドまたはアミノオキシ部分である場合、Ｙはケトンであり、Ｎが求核剤である場合、Ｙは脱離基であることが挙げられる。粗生成物の精製は、必要に応じて、生成物の沈殿、続いてクロマトグラフィーを含むがこれらに限定されない既知の方法によって達成することができる。
より具体的な例は、以下に示され、ポリマージアミンの場合、アミンのうちの１つをｔｅｒｔ－ブチル－Ｂｏｃなどの保護基部分によって保護し、得られる単保護ポリマージアミンを、アジド官能基を有する連結部分と反応させる。ＢｏｃＨＮ－ポリマー－ＮＨ２＋ＨＯ２Ｃ－（ＣＨ２）３－Ｎ＝Ｎ＝Ｎ
この場合、アミン基を、塩化チオニルまたはカルボジイミド試薬、ならびにＮ－ヒドロキシスクシンイミドまたはＮ－ヒドロキシベンゾトリアゾールなどの様々な活性化剤を使用してカルボン酸基に結合させて、モノアミンポリマー誘導体とアジド担持リンカー部分との間にアミド結合を作製することができる。アミド結合の形成に成功した後、得られるＮ－ｔｅｒｔ－ブチル－Ｂｏｃ－保護アジド含有誘導体を直接使用して、生理活性分子を修飾することができるか、またはそれをさらに緻密化して、他の有用な官能基を設置することができる。例えば、Ｎ－ｔ－Ｂｏｃ基は、強酸で処理することによって加水分解されて、オメガ－アミノポリマーアジドを生成することができる。得られるアミンは、有益なヘテロ二官能性試薬を作製するために、マレイミド基、活性化ジスルフィド、活性化エステルなどの他の有用な官能基を設置するための合成ハンドルとして使用することができる。
ヘテロ二官能性誘導体は、ポリマーの各末端に異なる分子を結合させることが所望される場合、特に有用である。例えば、オメガ－Ｎ－アミノ－Ｎ－アジドポリマーは、アルデヒド、ケトン、活性化エステル、活性化カーボネートなどの活性化求電子基を有する分子を、ポリマーの一方の末端に、そしてアセチレン基を有する分子を、ポリマーの他方の末端に結合させることを可能にするであろう。
本発明の別の実施形態において、Ａは、１～１０個の炭素原子の脂肪族リンカー、または６～１４個の炭素原子の置換アリール環である。Ｘはアジド基と反応しない官能基であり、Ｙは好適な脱離基である。
複数の標的化ポリペプチドは、リンカーポリペプチドによって接合されてもよく、リンカーポリペプチドは、任意に、長さが６～１４、７～１３、８～１２、７～１１、９～１１、または９アミノ酸である。他のリンカーとしては、限定されないが、ＰＥＧなどの小さなポリマーが挙げられ、これは、複数の標的化ポリペプチド分子が一緒に連結されることを可能にする多アーム型であり得る。複数の標的化ポリペプチド及び修飾された標的化ポリペプチドは、そのようなリンカーの使用を通じて、または各ポリペプチドのそれぞれのＮ末端間の直接的な化学結合により、頭－頭配置でそれらのＮ末端を介して互いに連結され得る。例えば、２つの標的化ポリペプチドを連結して、それらのＮ末端アミノ基または修飾されたＮ末端アミノ基間の化学結合によって二量体を形成してもよい。また、各標的化ポリペプチドのＮ末端と結合するための複数の化学官能基を含むように設計される連結分子を使用して、それらのそれぞれのＮ末端で複数の標的化ポリペプチドをそれぞれ接合してもよい。加えて、複数の標的化ポリペプチドは、Ｎ末端アミノ酸またはＣ末端アミノ酸以外のアミノ酸間の結合を通じて連結され得る。本明細書に記載される標的化ポリペプチドの二量体及び多量体を形成するために利用され得る共有結合の例としては、ジスルフィドまたはスルフヒドリルまたはチオール結合が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、ある特定の酵素、例えば、ソルターゼを使用して、標的化ポリペプチドのＮ末端を含む位置で、標的化ポリペプチドとリンカーとの間に共有結合を形成してもよい。
リンカーは、広範囲の分子量または分子長を有し得る。標的化ポリペプチドと連結された実体との間、または連結された実体とその結合パートナーとの間（もしあれば）に所望の空間的関係または立体配座を提供するために、より大きいまたはより小さい分子量のリンカーが使用され得る。また、標的化ポリペプチドと連結された実体との間、または連結された実体とその結合パートナーとの間に所望の空間または柔軟性を提供するために、より長いまたはより短い分子長を有するリンカーが使用され得る。
いくつかの実施形態において、本発明は、ａ）ポリマー骨格の少なくとも第１の末端上にアジド、アルキン、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、またはカルボニル含有部分、及びｂ）ポリマー骨格の第２の末端上に少なくとも第２の官能基を含む、ダンベル構造を有する水溶性二官能性リンカーを提供する。第２の官能基は、第１の官能基と同じであっても異なっていてもよい。いくつかの実施形態において、第２の官能基は、第１の官能基と反応性ではない。本発明は、いくつかの実施形態において、分枝状分子構造の少なくとも１つのアームを含む水溶性化合物を提供する。例えば、分枝状分子構造は、樹状であり得る。
例示的な実施形態において、ポリマーは、リンカーを通じて標的化ポリペプチドまたは修飾された標的化ポリペプチドに連結される。例えば、リンカーは、一方の末端でポリマー（例えば、アルブミン結合部分など）に結合し、他方の末端でポリペプチド骨格上の任意の利用可能な位置に結合する１つまたは２つのアミノ酸を含み得る。追加の例示的なリンカーとしては、少なくとも５個の非水素原子を含む化学部分などの親水性リンカーが挙げられ、これらのうちの３０～５０％は、ＮまたはＯのいずれかである。ポリマーを標的化ポリペプチドまたは修飾された標的化ポリペプチドに連結し得る追加の例示的なリンカーは、Ｕ．Ｓ．２０１２／０２９５８４７及びＷＯ／２０１２／１６８４３０に開示されており、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
任意に、複数の標的化ポリペプチドまたは修飾された標的化ポリペプチド分子は、リンカーポリペプチドによって接合されてもよく、該リンカーポリペプチドは、任意に、長さが１、１～２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、１～１０、１～１１、１～１２アミノ酸、及び長さがそれ以上であり、任意に、１つの標的化ポリペプチドのＮ末端が、リンカーポリペプチドのＣ末端に縮合され、リンカーポリペプチドのＮ末端が、別の標的化ポリペプチドのＮ末端に縮合される。利用され得るさらなる例示的なリンカーポリペプチドは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ／２０１３／００４６０７に開示される。
本明細書で使用される場合、「求電子基」、「求電子剤」などの用語は、共有結合を形成するために電子対を受け入れることができる原子または原子の基を指す。本明細書で使用される「求電子基」は、ハロゲン化物、カルボニル、及びエポキシド含有化合物を含むが、これらに限定されない。一般的な求電子剤は、チオホスゲン、グリセリンジクロロヒドリン、フタロイルクロリド、スクシニルクロリド、クロロアセチルクロリド、クロロスクシリルクロリドなどのハロゲン化物、クロロアククトン、ブロモアセトンなどのケトン、グリオキサールなどのアルデヒド、ヘキサメチレンジイソシアネート、トリレンジイソシアネート、メタ－キシリレンジイソシアネート、シクロヘキシルメタン－４，４－ジイソシアネートなどのイソシアネート、及びそれらの化合物の誘導体であり得る。
本明細書で使用される場合、「求核基」、「求核剤」などの用語は、共有結合を形成することができる電子対を有する原子または原子の基を指す。この種類の基は、アニオン性基として反応するイオン化基であり得る。本明細書で使用される「求核基」は、ヒドロキシル、一級アミン、二級アミン、三級アミン、及びチオールを含むが、これらに限定されない。
表２は、所望の官能基を作製するために組み合わされ得る種々の出発求電子剤及び求核剤を提供する。提供される情報は、例示的なものであり、本明細書に記載の合成技法に限定されるものではない。
Figure 2022520792000018
Figure 2022520792000019
一般に、炭素求電子剤は、炭素求核剤を含む相補的な求核剤によって攻撃されやすく、攻撃的な求核剤は、求核剤と炭素求電子剤との間に新しい結合を形成するために、電子対を炭素求電子剤にもたらす。
炭素求核剤の非限定的な例としては、アルキル、アルケニル、アリール、及びアルキニルグリニャール、有機リチウム、有機亜鉛、アルキル－、アルケニル－、アリール－、及びアルキニル－スズ試薬（有機スタンナン）、アルキル－、アルケニル－、アリール－、及びアルキニル－ボラン試薬（有機ボラン及び有機ボロネート）が挙げられるが、これらに限定されない。これらの炭素求核剤は、水または極性有機溶媒中で動態学的に安定であるという利点を有する。炭素求核剤の他の非限定的な例としては、リンイリド、エノール、及びエノラート試薬が挙げられる。これらの炭素求核剤は、合成有機化学の当業者に周知の前駆体から生成することが比較的容易であるという利点がある。炭素求核剤は、炭素求電子剤と併せて使用される場合、炭素求核剤と炭素求電子剤との間に新しい炭素－炭素結合を生じさせる。
炭素求電子剤への結合に好適な非炭素求核剤の非限定的な例としては、一級及び二級アミン、チオール、チオレート、ならびにチオエーテル、アルコール、アルコキシド、アジド、セミカルバジドなどが挙げられるが、これらに限定されない。これらの非炭素求核剤は、炭素求電子剤と併せて使用される場合、典型的にはヘテロ原子連結（Ｃ－Ｘ－Ｃ）を生成し、Ｘは、酸素、硫黄、または窒素を含むが、これらに限定されないヘテロ原子である。
場合によっては、本発明で使用されるポリマーは、一端で、ヒドロキシまたはメトキシで終結する、すなわち、Ｘは、ＨまたはＣＨ３（「メトキシＰＥＧ」）である。あるいは、ポリマーは反応性基で終結し、それにより二官能性ポリマーを形成することができる。典型的な反応性基としては、２０個の一般的なアミノ酸に見られる官能基（マレイミド基、活性化カーボネート（ｐ－ニトロフェニルエステルを含むがこれに限定されない）、活性化エステル（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、ｐ－ニトロフェニルエステルを含むがこれらに限定されない）、及びアルデヒドを含むがこれらに限定されない）と反応するために一般的に使用されるそれらの反応性基、ならびに２０個の一般的なアミノ酸に対して不活性であるが、相補的な官能基（アジド基、アルキン基を含むがこれらに限定されない）と特異的に反応する官能基が挙げられる。Ｙによって上記の式に示されるポリマーの他方の端は、天然に存在するまたは非天然コード化アミノ酸を介して標的化ポリペプチドに直接または間接的のいずれかで結合することに留意されたい。例えば、Ｙは、ポリペプチドのアミン基（リジンのイプシロンアミンまたはＮ末端を含むがこれらに限定されない）へのアミド、カルバメート、または尿素連結であり得る。あるいは、Ｙは、チオール基（システインのチオール基を含むがこれに限定されない）へのマレイミド連結であり得る。あるいは、Ｙは、２０の一般的なアミノ酸を介して一般的にアクセス可能ではない残基への連結であり得る。例えば、ポリマー上のアジド基を標的化ポリペプチド上のアルキン基と反応させて、ヒュスゲン［３＋２］環化付加生成物を形成することができる。あるいは、ポリマー上のアルキン基を標的化ポリペプチド中に存在するアジド基と反応させて、類似の生成物を形成することができる。いくつかの実施形態において、適用できる場合、強力な求核剤（ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、セミカルバジドを含むがこれらに限定されない）を、標的化ポリペプチド中に存在するアルデヒドまたはケトン基と反応させて、ヒドラゾン、オキシム、またはセミカルバゾンを形成することができ、場合によっては、適切な還元剤での処理によってさらに還元することができる。あるいは、強力な求核剤は、非天然コード化アミノ酸を介して標的化ポリペプチドに組み込むことができ、水溶性ポリマー中に存在するケトンまたはアルデヒド基と優先的に反応させるために使用することができる。
ポリマーの任意の分子量は、所望されるように、約１００ダルトン（Ｄａ）～１００，０００Ｄａ以上を含むがこれらに限定されない、実質的に所望されるように使用することができる（場合によっては０．１～５０ｋＤａまたは１０～４０ｋＤａを含むがこれらに限定されない）。ポリマーの分子量は、約１００Ｄａ～約１００，０００Ｄａ以上を含むがこれらに限定されない広範囲のものであり得る。ポリマーは、１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、１，０００Ｄａ、９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００Ｄａ、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａ、及び１００Ｄａを含むがこれらに限定されない、約１００Ｄａ～約１００，０００Ｄａであり得る。いくつかの実施形態において、ポリマーは、約１００Ｄａ～約５０，０００Ｄａである。各鎖が、１～１００ｋＤａ（１～５０ｋＤａまたは５～２０ｋＤａを含むがこれらに限定されない）の範囲の分子量を有するポリマー分子を含むが、これに限定されない分枝鎖ポリマーも使用することができる。分枝鎖ポリマーの各鎖の分子量は、限定されないが、約１，０００Ｄａ～約１００，０００Ｄａ以上を含むものであり得る。分枝鎖ポリマーの各鎖の分子量は、１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、及び１，０００Ｄａを含むがこれらに限定されない、約１，０００Ｄａ～約１００，０００Ｄａであり得る。いくつかの実施形態において、分枝鎖ポリマーの各鎖の分子量は、約１，０００Ｄａ～約５０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態において、分枝鎖ポリマーの各鎖の分子量は、約１，０００Ｄａ～約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態において、分枝鎖ポリマーの各鎖の分子量は、約５，０００Ｄａ～約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態において、分枝鎖ポリマーの各鎖の分子量は、約５，０００Ｄａ～約２０，０００Ｄａである。広範囲のポリマー分子が、限定されないが、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．のカタログ、Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓのカタログ（参照により本明細書に組み込まれる）を含むものに記載される。
いくつかの実施形態において、本発明は、約８００Ｄａ～約１００，０００Ｄａの平均分子量を有する水溶性ポリマー骨格を含む、アジド及びアセチレン含有ポリマー誘導体を提供する。水溶性ポリマーのポリマー骨格は、ポリ（エチレングリコール）であり得る。しかしながら、ポリ（エチレン）グリコールを含むがこれに限定されない多種多様の水溶性ポリマー、ならびにポリ（デキストラン）及びポリ（プロピレングリコール）を含む他の関連ポリマーもまた、本発明の実施において使用するのに好適であり、用語ＰＥＧまたはポリ（エチレングリコール）の使用は、すべてのそのような分子を包含し、含むことが意図されていることを理解されたい。ＰＥＧという用語には、二官能性ＰＥＧ、多アーム型ＰＥＧ、誘導体化ＰＥＧ、フォーク型ＰＥＧ、分枝型ＰＥＧ、ペンダント型ＰＥＧ（すなわち、ポリマー骨格に対してペンダント状である１つ以上の官能基を有するＰＥＧまたは関連ポリマー）、またはそれらの中に分解可能な連結を有するＰＥＧを含む、その形態のいずれかのポリ（エチレングリコール）が含まれるが、これに限定されない。
これらの形態のポリマーに加えて、ポリマーは、骨格内の弱いまたは分解可能な連結で調製することもできる。例えば、ポリマーは、加水分解を受けるポリマー骨格内のエステル連結で調製することができる。以下に示すように、この加水分解は、ポリマーを低分子量の断片に切断する。－ポリマー－ＣＯ２－ポリマー－＋Ｈ２Ｏ→ポリマー－ＣＯ２Ｈ＋ＨＯ－ポリマー－
多くのポリマーはまた、本発明での使用に好適である。いくつかの実施形態において、２～約３００の末端を有する水溶性のポリマー骨格は、本発明において特に有用である。好適なポリマーの例としては、ポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）などの他のポリ（アルキレングリコール）、それらのコポリマー（エチレングリコール及びプロピレングリコールのコポリマーを含むが、これに限定されない）、それらのターポリマー、それらの混合物などが挙げられるが、これらに限定されない。ポリマー骨格の各鎖の分子量は変化し得るが、典型的には、約８００Ｄａ～約１００，０００Ｄａ、多くの場合約６，０００Ｄａ～約８０，０００Ｄａの範囲である。ポリマー骨格の各鎖の分子量は、約１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、１，０００Ｄａ、９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００Ｄａ、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａ、及び１００Ｄａを含むがこれらに限定されない、約１００Ｄａ～約１００，０００Ｄａであり得る。いくつかの実施形態において、ポリマー骨格の各鎖の分子量は、約１００Ｄａ～約５０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態において、ポリマー骨格の各鎖の分子量は、約１００Ｄａ～約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態において、ポリマー骨格の各鎖の分子量は、約１，０００Ｄａ～約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態において、ポリマー骨格の各鎖の分子量は、約５，０００Ｄａ～約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態において、ポリマー骨格の各鎖の分子量は、約１０，０００Ｄａ～約４０，０００Ｄａである。
本発明のこの実施形態の１つの特徴において、インタクトなポリマーコンジュゲートは、加水分解の前に、切断可能な結合の加水分解が活性標的化ポリペプチドの血流への遅い放出速度を制御するのに有効であるように、投与時に最小限に分解され、これは、標的化ポリペプチドの体循環へのその放出前の酵素分解とは対照的である。
適切な生理学的に切断可能な連結には、エステル、炭酸エステル、カルバメート、スルフェート、ホスフェート、アシルオキシアルキルエーテル、アセタール、及びケタールが含まれるが、これらに限定されない。そのようなコンジュゲートは、貯蔵時及び投与時に安定である生理学的に切断可能な結合を有するべきである。例えば、ポリマーに連結された標的化ポリペプチドまたは修飾された標的化ポリペプチドは、最終的な医薬組成物の製造時、用いられる場合、適切な送達ビヒクルにおける溶解時、及び経路にかかわらず投与時にその完全性を維持するべきである。
本発明はまた、参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１７／０１８２１８１に開示される薬物コンジュゲートの細胞内送達のための調節可能な安定性を有するホスフェートベースのリンカーを含む。ホスフェートベースのリンカーは、遠位方向から近位方向に、調節要素、任意にスペーサー要素、及び反応性官能基を含む、リンカーアームの遠位端に共有結合したモノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、またはテトラホスフェート基（ホスフェート基）を含む。ホスフェートベースのリンカーのホスフェート基は、ペイロードにコンジュゲートすることが可能であり、反応性官能基は、抗体などの細胞特異的標的化リガンドにコンジュゲートすることが可能である。ホスフェートベースのリンカーの一般的な構造は、ホスフェート基－調節要素－任意のスペーサー要素－官能性反応性基である。ペイロードにコンジュゲートされたホスフェートベースのリンカーは、一般的な構造：ペイロード－ホスフェート基－調節要素－任意のスペーサー要素－官能性反応性基を有し、標的化リガンドにコンジュゲートされた場合、一般構造：ペイロード－ホスフェート基－調節要素－任意のスペーサー要素－標的化リガンドを有する。これらのホスフェートベースのリンカーは、細胞内環境（例えば、リソソームコンパートメント）と比較して、血液中で区別され、調節可能な安定性を有する。ホスフェート基が細胞内環境で切断されて、その天然または活性形態でペイロードを放出する速度は、ホスフェート基の置換によって媒介されるさらなる効果を有する調節要素の構造によって、ならびにホスフェート基がモノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、またはテトラホスフェートであるかどうかによって影響され得る。さらに、これらのホスフェートベースのリンカーは、本明細書に開示されるホスフェートベースのリンカーではないリンカーを使用して、同じペイロードが抗体または標的化リガンドにコンジュゲートされるコンジュゲートと比較して、コンジュゲートが凝集体を形成する傾向が低減される抗体－薬物コンジュゲートなどのコンジュゲートを構築する能力を提供する。
ＴＬＲ－アゴニストリンカー誘導体の構造及び合成：求電子及び求核基
ヒドロキシルアミン（アミノオキシとも呼ばれる）基を含有するリンカーを有するＴＬＲアゴニスト誘導体は、様々な求電子基と反応して、コンジュゲート（ＰＥＧまたは他の水溶性ポリマーを含むがこれらに限定されない）を形成することができる。ヒドラジン、ヒドラジド、及びセミカルバジドと同様に、アミノオキシ基の求核性が増強することにより、ケトン、アルデヒド、または同様の化学反応性を有する他の官能基を含むがこれらに限定されない、カルボニルまたはジカルボニル基を含有する様々な分子と効率的かつ選択的に反応することが可能となる。例えば、Ｓｈａｏ，Ｊ．ａｎｄ Ｔａｍ，Ｊ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：３８９３－３８９９（１９９５）、Ｈ．Ｈａｎｇ ａｎｄ Ｃ．Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．３４（９）：７２７－７３６（２００１）を参照されたい。ヒドラジン基との反応の結果は、対応するヒドラゾンであるが、オキシムは、一般に、アミノオキシ基と、例として、ケトン、アルデヒド、または同様の化学反応性を有する他の官能基などのカルボニルまたはジカルボニル含有基との反応から生じる。いくつかの実施形態において、アジド、アルキン、またはシクロアルキンを含むリンカーを有するＴＬＲ－アゴニスト誘導体は、環化付加化反応（例えば、１，３－二極環化付加、アジド－アルキンヒュスゲン環化付加など）を介した分子の連結を可能にする。（反応に対する程度において、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，８０７，６１９号に記載される）。
したがって、ある特定の実施形態において、ヒドロキシルアミン、アルデヒド、保護されたアルデヒド、ケトン、保護されたケトン、チオエステル、エステル、ジカルボニル、ヒドラジン、アミジン、イミン、ジアミン、ケト－アミン、ケト－アルキン、及びエン－ジオンヒドロキシルアミン基、ヒドロキシルアミン様基（ヒドロキシルアミン基に類似する反応性を有し、ヒドロキシルアミン基に構造的に類似する）、マスクされたヒドロキシルアミン基（ヒドロキシルアミン基に容易に変換され得る）、または保護されたヒドロキシルアミン基（脱保護時にヒドロキシルアミン基に類似する反応性を有する）を含むリンカーを有するＴＬＲ－アゴニスト誘導体が本明細書に記載される。いくつかの実施形態において、リンカーを有するＴＬＲアゴニスト誘導体は、アジド、アルキン、またはシクロアルキンを含む。
そのようなＴＬＲ－アゴニストリンカー誘導体または標的化ポリペプチドは、塩の形態であり得るか、または非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、任意に翻訳後修飾され得る。
ある特定の実施形態において、式（Ｉ）～（ＶＩＩ）の化合物は、弱酸性条件下で、少なくとも１ヶ月間水溶液中で安定である。ある特定の実施形態において、式（Ｉ）～（ＶＩＩ）の化合物は、弱酸性条件下で、少なくとも２週間安定である。ある特定の実施形態において、式（Ｉ）～（ＶＩＩ）の化合物は、弱酸性条件下で、少なくとも５日間安定である。ある特定の実施形態において、そのような酸性条件は、ｐＨ２～８である。
本明細書に提供及び記載される方法及び組成物は、少なくとも１つのカルボニルもしくはジカルボニル基、オキシム基、ヒドロキシルアミン基、またはそれらの保護もしくはマスクされた形態を有する非天然アミノ酸を含むポリペプチドを含む。少なくとも１つの反応性基の、ＴＬＲ－アゴニストリンカー誘導体または標的化ポリペプチドへの導入は、一般的に存在するアミノ酸と反応しない一方で、１つ以上の標的化ポリペプチド（複数可）を含むが、これに限定されないものとの特定の化学反応を伴うコンジュゲーション化学の適用を可能にすることができる。一旦組み込まれると、ＴＣ側鎖の標的化ポリペプチドはまた、本明細書に記載される化学方法論を利用することによって修飾されるか、またはＴＬＲ－アゴニストリンカー誘導体もしくは標的化ポリペプチドに存在する特定の官能基もしくは置換基に好適であり得る。
本明細書に記載のＴＬＲ－アゴニストリンカー誘導体及び標的化ポリペプチド、方法、ならびに組成物は、ポリマー、水溶性ポリマー、ポリエチレングリコール誘導体、第２のタンパク質またはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体、抗体または抗体断片、及びそれらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない他の物質を伴う多種多様の官能基、置換基、または部分を有する物質のコンジュゲートを提供する。
ある特定の実施形態において、式（Ｉ）～（ＶＩＩ）の化合物を含む、本明細書に記載のＴＬＲ－アゴニストリンカー誘導体、標的化ポリペプチド、ＴＣ、リンカー、及び試薬は、弱酸性条件下（ｐＨ２～８を含むが、これらに限定されない）で、水溶液中で安定である。他の実施形態において、そのような化合物は、弱酸性条件下で少なくとも１ヶ月間安定である。他の実施形態において、そのような化合物は、弱酸性条件下で少なくとも２週間安定である。他の実施形態において、そのような化合物は、弱酸性条件下で少なくとも５日間安定である。
組成物、方法、技法、及び戦略の別の態様において、前述の「修飾されたまたは非修飾」非天然アミノ酸標的化ポリペプチドのうちのいずれかを研究または使用するための方法が本明細書に記載される。この態様には、ほんの一例として、「修飾されたもしくは非修飾」非天然アミノ酸ポリペプチドまたはタンパク質を含む標的化ポリペプチドから利益を受けるであろう、治療的、診断的、アッセイベースの、工業的、美容的、植物生物学的、環境的、エネルギー産生的、消費者製品、及び／または軍事的使用が含まれる。
少なくとも１つの非天然アミノ酸を含むＴＣ分子が本発明で提供される。本発明のある特定の実施形態では、少なくとも１つの非天然アミノ酸を有するＴＣは、少なくとも１つの翻訳後修飾を含む。一実施形態において、少なくとも１つの翻訳後修飾は、標識、染料、リンカー、別のＴＣポリペプチド、ポリマー、水溶性ポリマー、ポリエチレングリコールの誘導体、光架橋剤、放射性核種、細胞傷害性化合物、薬物、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物、樹脂、第２のタンパク質またはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体、抗体もしくは抗体断片、金属キレート剤、補因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスポリヌクレオチド、糖、シクロデキストリン、阻害性リボ核酸、生体材料、ナノ粒子、スピン標識、フルオロフォア、金属含有部分、放射性部分、新規官能基、他の分子と共有結合的もしくは非共有結合的に相互作用する基、光ケージ化（ｐｈｏｔｏｃａｇｅｄ）部分、アクチン放射線励起部分、光異性化可能部分、ビオチン、ビオチン誘導体、ビオチン類似体、重原子を組み込んだ部分、化学的に切断可能な基、光切断可能な基、細長い側鎖、炭素連結された糖、酸化還元活性剤、アミノチオ酸、毒性部分、同位体標識された部分、生物物理学的プローブ、リン光基、化学発光基、電子密集基、磁性基、挿入基、発色団、エネルギー移動剤、生物学的活性剤、検出可能な標識、小分子、量子ドット、ナノ伝達物質、放射性ヌクレオチド、放射性伝達物質、中性子捕捉剤、または上記の任意の組み合わせ、あるいは任意の他の望ましい化合物もしくは物質（特定の反応性基に好適であることが当業者に知られている化学方法論を利用する第１の反応性基を含む、少なくとも１つの非天然アミノ酸に対する第２の反応性基を含む）を含むが、これらに限定されない分子の結合を含む。例えば、第１の反応性基はアルキニル部分（非天然アミノ酸ｐ－プロパルギルオキシフェニルアラニン内を含むがこれに限定されない、ここで、プロパルギル基は、アセチレン部分とも称されることがある）であり、第２の反応性基はアジド部分であり、［３＋２］環化付加化学方法論が利用される。別の実施例において、第１の反応性基は、アジド部分（本明細書内で時折参照される非天然アミノ酸ｐ－アジド－Ｌ－フェニルアラニンまたはｐＡＺ内を含むが、これらに限定されない）であり、第２の反応性基は、アルキニル部分である。本発明の修飾されたＴＣのある特定の実施形態において、少なくとも１つの翻訳後修飾を含む少なくとも１つの非天然アミノ酸（ケト官能基を含有する非天然アミノ酸を含むが、これに限定されない）が使用され、ここで、少なくとも１つの翻訳後修飾は糖部分を含む。ある特定の実施形態において、翻訳後修飾は、真核生物細胞または非真核生物細胞においてインビボで行われる。リンカー、ポリマー、水溶性ポリマー、または他の分子は、分子をポリペプチドに結合し得る。さらなる実施形態において、ＴＣに結合されたリンカーは、二量体の形成を可能にするのに十分な長さである。分子はまた、ポリペプチドに直接連結され得る。
ある特定の実施形態において、ＴＣタンパク質は、１つの宿主細胞によってインビボで行われる少なくとも１つの翻訳後修飾を含み、ここで、翻訳後修飾は通常、別の宿主細胞型によって行われない。ある特定の実施形態において、タンパク質は、真核細胞によってインビボで行われる少なくとも１つの翻訳後修飾を含み、ここで、翻訳後修飾は通常、非真核細胞によって行われない。翻訳後修飾の例には、グリコシル化、アセチル化、アシル化、脂質修飾、パルミトイル化、パルミテート付加、リン酸化、糖脂質連結修飾などが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、ＴＣは、ポリペプチドのグリコシル化、アセチル化、アシル化、脂質修飾、パルミトイル化、パルミテート付加、リン酸化、または糖脂質連結修飾のための１つ以上の非天然コード化アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、ＴＣは、ポリペプチドのグリコシル化のための１つ以上の非天然コード化アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、ＴＣは、ポリペプチドのグリコシル化、アセチル化、アシル化、脂質修飾、パルミトイル化、パルミテート付加、リン酸化、または糖脂質連結修飾のための１つ以上の天然コード化アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、ＴＣは、ポリペプチドのグリコシル化のための１つ以上の天然コード化アミノ酸を含む。
いくつかの実施形態において、ＴＣは、ポリペプチドのグリコシル化を増強する１つ以上の非天然コード化アミノ酸付加及び／または置換を含む。いくつかの実施形態において、ＴＣは、ポリペプチドのグリコシル化を増強する１つ以上の欠失を含む。いくつかの実施形態において、ＴＣは、ポリペプチド中の異なるアミノ酸においてグリコシル化を増強する１つ以上の非天然コード化アミノ酸付加及び／または置換を含む。いくつかの実施形態において、ＴＣは、ポリペプチド中の異なるアミノ酸においてグリコシル化を増強する１つ以上の欠失を含む。いくつかの実施形態において、ＴＣは、ポリペプチド中の非天然コード化アミノ酸においてグリコシル化を増強する１つ以上の非天然コード化アミノ酸付加及び／または置換を含む。いくつかの実施形態において、ＴＣは、ポリペプチド中の天然コード化アミノ酸においてグリコシル化を増強する１つ以上の非天然コード化アミノ酸付加及び／または置換を含む。いくつかの実施形態において、ＴＣは、ポリペプチド中の異なるアミノ酸においてグリコシル化を増強する１つ以上の天然コード化アミノ酸付加及び／または置換を含む。いくつかの実施形態において、ＴＣは、ポリペプチド中の天然コード化アミノ酸においてグリコシル化を増強する１つ以上の非天然コード化アミノ酸付加及び／または置換を含む。いくつかの実施形態において、ＴＣは、ポリペプチド中の非天然コード化アミノ酸においてグリコシル化を増強する１つ以上の非天然コード化アミノ酸付加及び／または置換を含む。
一実施形態において、翻訳後修飾は、ＧｌｃＮＡｃ－アスパラギン連結によるオリゴ糖のアスパラギンへの結合（オリゴ糖が（ＧｌｃＮＡｃ－Ｍａｎ）２－Ｍａｎ－ＧｌｃＮＡｃ－ＧｌｃＮＡｃなどを含む場合を含むが、これに限定されない）を含む。別の実施形態において、翻訳後修飾は、ＧａｌＮＡｃ－セリン、ＧａｌＮＡｃ－スレオニン、ＧｌｃＮＡｃ－セリン、またはＧｌｃＮＡｃ－スレオニン連結によるオリゴ糖（Ｇａｌ－ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌ－ＧｌｃＮＡｃなどを含むが、これらに限定されない）のセリンまたはスレオニンへの結合を含む。ある特定の実施形態において、本発明のタンパク質またはポリペプチドは、分泌または局在化配列、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジンタグ、ＧＳＴ融合物及び／または同等物を含むことができる。分泌シグナル配列の例としては、原核生物分泌シグナル配列、真核生物分泌シグナル配列、細菌発現のために５’最適化された真核生物分泌シグナル配列、新規分泌シグナル配列、ペクテートリアーゼ分泌シグナル配列、Ｏｍｐ Ａ分泌シグナル配列、及びファージ分泌シグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない。分泌シグナル配列の例としては、ＳＴＩＩ（原核生物）、Ｆｄ ＧＩＩＩ及びＭ１３（ファージ）、Ｂｇｌ２（酵母）、ならびにトランスポゾンに由来するシグナル配列ｂｌａが挙げられるが、これらに限定されない。任意のそのような配列は、１つのシグナル配列を異なるシグナル配列で置換すること、リーダー配列を異なるリーダー配列で置換することなどを含むがこれらに限定されない、ポリペプチドでの所望の結果を提供するように修飾され得る。
関心のタンパク質またはポリペプチドは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または１０以上の非天然アミノ酸を含有することができる。非天然アミノ酸は、同じであっても異なっていてもよく、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の異なる非天然アミノ酸を含むタンパク質中の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の異なる部位が存在し得る。ある特定の実施形態において、天然に存在するタンパク質型に存在する特定のアミノ酸の少なくとも１つであるが、すべてより少ないアミノ酸が、非天然アミノ酸で置換される。
本発明は、少なくとも１つの非天然コード化アミノ酸を含むＴＣに基づく方法及び組成物を提供する。ＴＣへの少なくとも１つの非天然コード化アミノ酸の導入は、一般的に存在する２０個のアミノ酸と反応しない一方で、１つ以上の非天然コード化アミノ酸を含むが、これに限定されないものとの特定の化学反応を伴うコンジュゲート化学の適用を可能にすることができる。いくつかの実施形態において、非天然コード化アミノ酸を含むＴＣは、非天然コード化アミノ酸の側鎖を介して、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの水溶性ポリマー、またはリンカーに連結される。本発明は、ＰＥＧ誘導体またはＴＬＲ－リンカー誘導体を有するタンパク質の選択的修飾のための非常に効率的な方法を提供し、これは、ケトン、アジド、またはアセチレン部分を含むがこれらに限定されない２０個の天然に組み込まれたアミノ酸に見られない官能基または置換基を含有するそれらのアミノ酸を含むがこれに限定さない非遺伝子コード化アミノ酸を、セレクターコドンに応答してタンパク質に選択的に組み込むことと、その後にそれらのアミノ酸を好適な反応性ＰＥＧ誘導体で修飾することとを伴う。組み込まれると、アミノ酸側鎖は次いで、非天然コード化アミノ酸に存在する特定の官能基または置換基に好適なように、当業者に知られている化学方法論を利用することによって修飾され得る。多種多様の既知の化学方法論は、水溶性ポリマーをタンパク質に組み込むために本発明での使用に好適である。そのような方法論には、それぞれ、アセチレンまたはアジド誘導体を含むが、これらに限定されないものとのヒュスゲン［３＋２］環化付加反応（例えば、Ｐａｄｗａ，Ａ．ｉｎ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｖｏｌ．４，（１９９１）Ｅｄ．Ｔｒｏｓｔ，Ｂ．Ｍ．，Ｐｅｒｇａｍｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ，ｐ．１０６９－１１０９及びＨｕｉｓｇｅｎ，Ｒ．ｉｎ １，３－Ｄｉｐｏｌａｒ Ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（１９８４）Ｅｄ．Ｐａｄｗａ，Ａ．，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐ．１－１７６を参照されたい）が含まれるが、これに限定されない。
ヒュスゲン［３＋２］環化付加方法は、求核置換反応ではなく環化付加を伴うため、タンパク質は極めて高い選択性で修飾され得る。反応は、反応混合物に触媒量のＣｕ（Ｉ）塩を添加することによって、優れた位置選択性（１，４＞１，５）を有する水性条件で室温で行われ得る。例えば、Ｔｏｒｎｏｅ，ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６７：３０５７－３０６４及びＲｏｓｔｏｖｔｓｅｖ，ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４１：２５９６－２５９９、ならびにＷＯ０３／１０１９７２を参照されたい。［３＋２］環状付加を通じて本発明のタンパク質に付加され得る分子は、アジドまたはアセチレン誘導体を含むがこれらに限定されない好適な官能基または置換基を有する実質的に任意の分子を含む。これらの分子は、それぞれ、ｐ－プロパルギルオキシフェニルアラニンを含むがこれに限定されないアセチレン基、またはｐ－アジド－フェニルアラニンを含むがこれに限定されないアジド基を有する非天然アミノ酸に付加することができる。
ヒュスゲン［３＋２］環化付加から生じる５員環は、還元環境では一般的に可逆的ではなく、水性環境での長期間の加水分解に対して安定である。したがって、多種多様な物質の物理的及び化学的特徴は、本発明の活性ＰＥＧ誘導体またはＴＬＲ－リンカー誘導体を用いた厳しい水性条件下で修飾することができる。さらに重要なことに、アジド及びアセチレン部分は互いに特異的である（及び例えば、２０個の一般的な遺伝子コード化アミノ酸のいずれとも反応しない）ため、タンパク質は、極めて高い選択性で１つ以上の特異的部位で修飾され得る。
また、本発明は、ＰＥＧ誘導体またはＴＬＲリンカー誘導体の水溶性及び加水分解的に安定な誘導体、ならびに１つ以上のアセチレンまたはアジド部分を有する関連する親水性ポリマーを提供する。アセチレン部分を含有するＰＥＧポリマー誘導体は、セレクターコドンに応答してタンパク質に選択的に導入されたアジド部分との結合に対して選択性が高い。同様に、アジド部分を含有するＰＥＧポリマー誘導体は、セレクターコドンに応答してタンパク質に選択的に導入されたアセチル部分との結合に対して選択性が高い。より具体的には、アジド部分は、アルキルアジド、アリールアジド、及びこれらのアジドの誘導体を含むが、これらに限定されない。アルキル及びアリールアジドの誘導体は、アセチレン特異的反応性が維持される限り、他の置換基を含むことができる。アセチレン部分は、アルキル及びアリールアセチレン、ならびにそれぞれの誘導体を含む。アルキル及びアリールアセチレンの誘導体は、アジド特異的反応性が維持される限り、他の置換基を含むことができる。
本発明は、標識、染料、ポリマー、水溶性ポリマー、ポリエチレングリコールの誘導体、光架橋剤、放射性核種、細胞傷害性化合物、薬物、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物、樹脂、第２のタンパク質またはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体、抗体もしくは抗体断片、金属キレート剤、補因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスポリヌクレオチド、糖、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、阻害性リボ核酸、生体材料、ナノ粒子、スピン標識、フルオロフォア、金属含有部分、放射性部分、新規官能基、他の分子と共有結合的もしくは非共有結合的に相互作用する基、光ケージ化部分、アクチン放射線励起部分、光異性化可能部分、ビオチン、ビオチン誘導体、ビオチン類似体、重原子を組み込んだ部分、化学的に切断可能な基、光切断可能な基、細長い側鎖、炭素連結された糖、酸化還元活性剤、アミノチオ酸、毒性部分、同位体標識された部分、生物物理学的プローブ、リン光基、化学発光基、電子密集基、磁性基、挿入基、発色団、エネルギー移動剤、生物学的活性剤、検出可能な標識、小分子、量子ドット、ナノ伝達物質、放射性ヌクレオチド、放射性伝達物質、中性子捕捉剤、または上記の任意の組み合わせ、あるいは任意の他の望ましい化合物または物質を含むが、これらに限定されない他の物質との、多種多様な官能基、置換基、または部分を有する物質のコンジュゲートを提供する。本発明は、対応するアセチレンまたはアジド部分を有するＰＥＧポリマー誘導体を有するアジドまたはアセチレン部分を有する物質のコンジュゲートも含む。例えば、アジド部分を含有するＰＥＧポリマーは、アセチレン官能基を有する非遺伝子コード化アミノ酸を含有するタンパク質内の位置で、生物学的活性分子に結合され得る。ＰＥＧ及び生物学的活性分子が結合している連結には、限定されないが、ヒュスゲン［３＋２］環化付加生成物が含まれる。
ＰＥＧを使用して生体材料の表面を修飾することができることは当該技術分野で十分に確立されている（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，６１０，２８１号、Ｍｅｈｖａｒ，Ｒ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．，３（１）：１２５－１３６（２０００））を参照されたい）。本発明はまた、１つ以上の反応性アジドまたはアセチレン部位を有する表面と、ヒュスゲン［３＋２］環化付加連結を介して表面に結合された本発明のアジドまたはアセチレン含有ポリマーのうちの１つ以上とを含む生体材料を含む。生体材料及び他の物質はまた、アジドまたはアセチレン連結以外の連結、例えば、カルボン酸、アミン、アルコール、またはチオール部分を含む連結を通じて、アジドまたはアセチレン活性化ポリマー誘導体に結合されて、アジドまたはアセチレン部分をその後の反応のために利用可能にすることができる。
本発明は、本発明のアジド及びアセチレン含有ポリマーを合成する方法を含む。アジド含有ＰＥＧ誘導体の場合、アジドは、ポリマーの炭素原子に直接結合することができる。あるいは、アジド含有ＰＥＧ誘導体は、得られるポリマーがその末端にアジド部分を有するように、一方の末端にアジド部分を有する連結剤を従来の活性化ポリマーに結合させることによって調製することができる。アセチレン含有ＰＥＧ誘導体の場合、アセチレンは、ポリマーの炭素原子に直接結合することができる。あるいは、アセチレン含有ＰＥＧ誘導体は、得られるポリマーがその末端にアセチレン部分を有するように、一方の末端にアセチレン部分を有する連結剤を従来の活性化ポリマーに結合させることによって調製することができる。
より具体的には、アジド含有ＰＥＧ誘導体の場合、少なくとも１つの活性ヒドロキシル部分を有する水溶性ポリマーは、その上にメシレート、トレシレート、トシレート、またはハロゲン脱離基などのより反応性の部分を有する置換ポリマーを産生するための反応を受ける。スルホニル酸ハロゲン化物、ハロゲン原子、及び他の脱離基を含有するＰＥＧ誘導体またはＴＬＲ－リンカー誘導体の調製及び使用は、当業者に既知である。次いで、得られた置換ポリマーは、ポリマーの末端のアジド部分の代わりにより反応性の部分を使用するための反応を受ける。あるいは、少なくとも１つの活性求核または求電子部分を有する水溶性ポリマーは、ＰＥＧポリマーと連結剤との間に共有結合が形成され、アジド部分がポリマーの末端に配置されるように、１つの末端にアジドを有する連結剤との反応を受ける。アミン、チオール、ヒドラジド、ヒドラジン、アルコール、カルボキシレート、アルデヒド、ケトン、チオエステルなどを含む求核及び求電子部分は、当業者に既知である。
より具体的には、アセチレン含有ＰＥＧ誘導体の場合、少なくとも１つの活性ヒドロキシル部分を有する水溶性ポリマーは、アセチレン部分を含有する前駆体からハロゲンまたは他の活性化された脱離基を置換する反応を受ける。あるいは、少なくとも１つの活性求核または求電子部分を有する水溶性ポリマーは、ＰＥＧポリマーと連結剤との間に共有結合が形成され、アセチレン部分がポリマーの末端に配置されるように、１つの末端にアセチレンを有する連結剤との反応を受ける。有機合成及びＰＥＧ誘導体またはＴＬＲ－リンカー誘導体の調製及び使用の文脈におけるハロゲン部分、活性化された脱離基、求核及び求電子部分の使用は、当業者に十分に確立されている。
本発明はまた、アジドまたはアセチレン部分を含有する、ＰＥＧ及びＰＥＧ誘導体またはＴＬＲ－リンカー誘導体、リンカー、または別のＴＣポリペプチドなどの水溶性ポリマーを含むがこれらに限定されない、他の物質を修飾されたタンパク質に付加するためのタンパク質の選択的修飾のための方法を提供する。アジド及びアセチレン含有ＰＥＧ誘導体またはＴＬＲ－リンカー誘導体は、生体適合性、安定性、溶解性、及び免疫原性の欠如が重要である表面及び分子の特性を修飾するために使用することができると同時に、当該技術分野で以前に知られていたよりもタンパク質にＰＥＧ誘導体またはＴＬＲ－リンカー誘導体を結合させるより選択的な手段を提供する。
本発明で使用するための一般的な組換え核酸方法
本発明の多数の実施形態において、関心のＴＣの標的化ポリペプチドをコードする核酸は、組換え方法を使用して単離、クローニング、及びしばしば改変される。そのような実施形態は、タンパク質発現のために、またはバリアント、誘導体、発現カセット、もしくはＴＣの標的化ポリペプチドに由来する他の配列の生成中に使用されることを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドをコードする配列は、異種プロモーターに作動可能に連結される。
非天然コード化アミノ酸を含むＴＣの標的化ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、親ポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて合成され、次いで、関連するアミノ酸残基（複数可）の導入（すなわち、組み込みまたは置換）または除去（すなわち、欠失または置換）をもたらすようにヌクレオチド配列を変更することができる。ヌクレオチド配列は、従来の方法により、部位特異的変異誘発によって便利に修飾され得る。あるいは、オリゴヌクレオチド合成装置の使用を含むがこれに限定されない化学合成によってヌクレオチド配列を調製してもよく、所望のポリペプチドのアミノ酸配列に基づいてオリゴヌクレオチドを設計し、好ましくは、組換えポリペプチドが産生される宿主細胞において好ましいそれらのコドンを選択する。例えば、所望のポリペプチドの部分をコードするいくつかの小さなオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ、ライゲーション、またはライゲーション連鎖反応によって合成及び組み立てられ得る。例えば、Ｂａｒａｎｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：１８９－１９３（１９９１）、米国特許第６，５２１，４２７号（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
本発明は、組換え遺伝学の分野における通例の技法を利用する。本発明における一般的な使用方法を開示する基本的なテキストとしては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ ｅｄ．２００１）、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９０）及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）が挙げられる。
本発明はまた、直交ｔＲＮＡ／ＲＳ対を介した非天然アミノ酸のインビボ組み込みのための、真核宿主細胞、非真核宿主細胞、及び生物に関する。宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチド、または例えば、クローニングベクターもしくは発現ベクターであり得る本発明のベクターを含むがこれに限定されない、本発明のポリヌクレオチドを含む構築物で遺伝子操作される（形質転換、形質導入、もしくはトランスフェクトを含むがこれらに限定されない）。
標的核酸を細胞に導入するいくつかの周知の方法が利用可能であり、これらのうちのいずれかが本発明で使用され得る。これらには、ＤＮＡを含有する細菌プロトプラストとのレシピエント細胞の融合、エレクトロポレーション、入射粒子衝撃法、及びウイルスベクターによる感染（以下でさらに論じられる）などが含まれる。細菌細胞を使用して、本発明のＤＮＡ構築物を含有するプラスミドの数を増幅することができる。細菌を対数期まで成長させ、細菌内のプラスミドを当該技術分野で既知の様々な方法によって単離することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋを参照されたい）。加えて、細菌からのプラスミドの精製のためにキットが市販されている（例えば、ＥａｓｙＰｒｅｐ（商標）、ＦｌｅｘｉＰｒｅｐ（商標）（両方ともＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＳｔｒａｔａＣｌｅａｎ（商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、及びＱＩＡｐｒｅｐ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を参照されたい）。次いで、単離及び精製されたプラスミドをさらに操作して、他のプラスミドを産生し、細胞をトランスフェクトするために使用するか、または関連するベクターに組み込んで、生物に感染させる。典型的なベクターは、転写及び翻訳ターミネーター、転写及び翻訳開始配列、ならびに特定の標的核酸の発現の調節に有用なプロモーターを含有する。ベクターは、任意に、少なくとも１つの独立したターミネーター配列、真核生物もしくは原核生物、またはその両方におけるカセットの複製を可能にする配列（シャトルベクターを含むが、これに限定されない）を含有する一般的な発現カセット、及び原核生物及び真核生物系の両方の選択マーカーを含む。ベクターは、原核生物、真核生物、またはその両方における複製及び組み込みに好適である。Ｇｉｌｌａｍ＆Ｓｍｉｔｈ，Ｇｅｎｅ ８：８１（１９７９）、Ｒｏｂｅｒｔｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２８：７３１（１９８７）、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．６（１）：１０－１４（１９９５）、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｂｅｒｇｅｒ（全て上記）を参照されたい。クローニングに有用な細菌及びバクテリオファージのカタログは、例えば、ＡＴＣＣ、例えば、Ｔｈｅ ＡＴＣＣ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ（１９９２）Ｇｈｅｒｎａ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ）によって提供される。分子生物学のシーケンシング、クローニング、及び他の態様、ならびに基礎となる理論考察のための追加の基本的な手順は、Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ，ＮＹにも見出される。加えて、本質的に、任意の核酸（及び標準的であるか非標準的であるかに関わらず、実質的に任意の標識された核酸）は、Ｍｉｄｌａｎｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｄｌａｎｄ，ＴＸ、Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂ ａｔ ｍｃｒｃ．ｃｏｍで入手可能）、Ｔｈｅ Ｇｒｅａｔ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｇｅｎｅ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒａｍｏｎａ，ＣＡ、Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂ ａｔ ｇｅｎｃｏ．ｃｏｍで入手可能）、ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ Ｉｎｃ．（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ、Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂ ａｔ ｅｘｐｒｅｓｓｇｅｎ．ｃｏｍで入手可能）、Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）、及び多くのその他の様々な商業的供給源のいずれかから特別注文または標準注文することができる。
セレクターコドン
本発明のセレクターコドンは、タンパク質生合成機構の遺伝子コドンフレームワークを拡張する。例えば、セレクタ－コドンには、固有の３塩基コドン、終止コドンなどのナンセンスコドン（アンバーコドン（ＵＡＧ）、オーカーコドン、またはオパールコドン（ＵＧＡ）、非天然コドン、４塩基以上のコドン、レアコドンなどを含むこれらに限定されない）が含まれるが、これらに限定されない。当業者であれば、所望の遺伝子またはポリヌクレオチドに導入することができるセレクターコドンの数には、ＴＣの少なくとも一部をコードする単一のポリヌクレオチド中に、１つ以上、２つ以上、３つ以上、４、５、６、７、８、９、１０以上を含むが、これらに限定されない幅広い範囲があることは、容易に明らかである。
一実施形態において、方法は、インビボで１つ以上の非天然アミノ酸を組み込むための終止コドンであるセレクターコドンの使用を伴う。例えば、ＵＡＧを含むがこれに限定されない終止コドンを認識するＯ－ｔＲＮＡが産生され、所望の非天然アミノ酸を有するＯ－ＲＳによってアミノアシル化される。このＯ－ｔＲＮＡは、天然に存在する宿主のアミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素によって認識されない。従来の部位特異的変異誘発を使用して、ＴＡＧを含むがこれに限定されない終止コドンを、関心のポリペプチド内の関心の部位に導入することができる。例えば、Ｓａｙｅｒｓ，Ｊ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（１９８８），５’－３’Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ－ｂａｓｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１６：７９１－８０２を参照されたい。Ｏ－ＲＳ、Ｏ－ｔＲＮＡ、及び関心のポリペプチドをコードする核酸をインビボで組み合わせると、非天然アミノ酸がＵＡＧコドンに応答して組み込まれ、非天然アミノ酸を特定の位置に含有するポリペプチドが得られる。
インビボでの非天然アミノ酸の組み込みは、真核宿主細胞の著しい撹乱なしに行うことができる。例えば、ＵＡＧコドンの抑制効率は、アンバーサプレッサーｔＲＮＡを含むがこれに限定されないＯ－ｔＲＮＡと、真核生物放出因子（ｅＲＦを含むがこれに限定されない）（終止コドンに結合し、リボソームからの成長ペプチドの放出を開始する）との間の競合に依存するため、抑制効率は、Ｏ－ｔＲＮＡの発現レベル及び／またはサプレッサーｔＲＮＡを増加させることを含むがこれに限定されないことによって調節され得る。
非天然アミノ酸はまた、レアコドンでコードすることができる。例えば、インビトロタンパク質合成反応におけるアルギニン濃度が低下した場合、レアアルギニンコドンであるＡＧＧは、アラニンでアシル化された合成ｔＲＮＡによるＡｌａの挿入に効率的であることが証明されている。例えば、Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２：７９３９（１９９３）を参照されたい。この場合、合成ｔＲＮＡは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおいて少数の種として存在する天然に存在するｔＲＮＡＡｒｇと競合する。一部の生物は、すべてのトリプレットコドンを使用しない。インビトロ転写／翻訳抽出物におけるアミノ酸の挿入には、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓにおける割り当てられていないコドンＡＧＡが利用されている。例えば、Ｋｏｗａｌ ａｎｄ Ｏｌｉｖｅｒ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２５：４６８５（１９９７）を参照されたい。本発明の構成要素は、これらのレアコドンをインビボで使用するために生成され得る。
セレクターコドンはまた、限定されないが、４つ以上の塩基コドン、例えば、４、５、６つ以上の塩基コドンを含む、伸長コドンを含む。４つの塩基コドンの例としては、ＡＧＧＡ、ＣＵＡＧ、ＵＡＧＡ、ＣＣＣＵなどが挙げられるが、これらに限定されない。５つの塩基コドンの例としては、ＡＧＧＡＣ、ＣＣＣＣＵ、ＣＣＣＵＣ、ＣＵＡＧＡ、ＣＵＡＣＵ、ＵＡＧＧＣなどが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の特徴は、フレームシフト抑制に基づく伸長コドンを使用することを含む。限定されないが、１つまたは複数の非天然アミノ酸を含むが、これに限定されない４つ以上の塩基コドンを、同じタンパク質に挿入することができる。例えば、アンチコドンループを有する、例えば、少なくとも８～１０ｎｔのアンチコドンループを有する特殊なフレームシフトサプレッサーｔＲＮＡを含むが、これに限定されない変異Ｏ－ｔＲＮＡの存在下で、４つ以上の塩基コドンを単一のアミノ酸として読み取る。他の実施形態において、少なくとも４塩基コドン、少なくとも５塩基コドン、または少なくとも６塩基コドン以上を含むが、これらに限定されないアンチコドンループは、デコードすることができる。可能な４塩基コドンが２５６あるため、複数の非天然アミノ酸を、４つ以上の塩基コドンを使用して同じ細胞にコードすることができる。Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｌｉｍｉｔｓ ｏｆ Ｃｏｄｏｎ ａｎｄ Ａｎｔｉｃｏｄｏｎ Ｓｉｚｅ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，９：２３７－２４４、Ｍａｇｌｉｅｒｙ，（２００１）Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ：Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ ｏｆ Ｆｏｕｒ－ｂａｓｅ Ｃｏｄｏｎｓ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ“Ｓｈｉｆｔｙ”Ｆｏｕｒ－ｂａｓｅ Ｃｏｄｏｎｓ ｗｉｔｈ ａ Ｌｉｂｒａｒｙ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０７：７５５－７６９を参照されたい。
例えば、４塩基コドンは、インビトロ生合成方法を使用して、非天然アミノ酸をタンパク質に組み込むために使用されている。例えば、Ｍａ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２：７９３９、及びＨｏｈｓａｋａ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：３４を参照されたい。ＣＧＧＧ及びＡＧＧＵを使用して、２つの化学的にアシル化されたフレームシフトサプレッサーｔＲＮＡを用いて、２－ナフチルアラニン及びリジンのＮＢＤ誘導体をインビトロでストレプトアビジンに同時に組み込んだ。例えば、Ｈｏｈｓａｋａ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：１２１９４を参照されたい。インビボ研究において、Ｍｏｏｒｅらは、ＮＣＵＡアンチコドンを有するｔＲＮＡＬｅｕ誘導体が、ＵＡＧＮコドン（Ｎは、Ｕ、Ａ、Ｇ、またはＣであり得る）を抑制する能力を調べ、四重ＵＡＧＡが、０または－１フレームにおけるデコードがほとんどなく、１３～２６％の効率で、ＵＣＵＡアンチコドンを有するｔＲＮＡＬｅｕによってデコードされ得ることを見出した。Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２９８：１９５を参照されたい。一実施形態において、レアコドンまたはナンセンスコドンに基づく伸長コドンを本発明で使用することができ、これは他の望ましくない部位におけるミスセンスリードスルー及びフレームシフト抑制を低減することができる。
所与の系について、セレクターコドンはまた、天然の３つの塩基コドンのうちの１つを含むことができ、内因性系は、天然の塩基コドンを使用しない（またはほとんど使用しない）。例えば、これには、天然の３塩基コドンを認識するｔＲＮＡを欠いている系、及び／または３塩基コドンがレアコドンである系が含まれる。
セレクターコドンは、任意に、非天然塩基対を含む。これらの非天然塩基対は、既存の遺伝的アルファベットをさらに拡張する。１つの余分な塩基対は、トリプレットコドンの数を６４から１２５に増加させる。第３の塩基対の特性としては、安定した選択的塩基対形成、ポリメラーゼによる高忠実度でのＤＮＡへの効率的な酵素による組み込み、及び新生非天然塩基対の合成後の効率的な継続的プライマー伸長が挙げられる。方法及び組成物に適合させることができる非天然塩基対の説明には、例えば、Ｈｉｒａｏ，ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ａｎ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ｂａｓｅ ｐａｉｒ ｆｏｒ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０：１７７－１８２が含まれる。Ｗｕ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：１４６２６－１４６３０も参照されたい。他の関連する出版物を以下に列挙する。
インビボでの使用に関して、非天然ヌクレオシドは膜透過性であり、リン酸化されて対応するトリホスフェートが形成される。加えて、増加した遺伝情報は安定しており、細胞酵素によって破壊されない。Ｂｅｎｎｅｒらの以前の試みは、正準ワトソン－クリック対のものとは異なる水素結合パターンを利用しており、その最も注目すべき例は、イソ－Ｃ：イソ－Ｇ対である。例えば、Ｓｗｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１１：８３２２及びＰｉｃｃｉｒｉｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４３：３３、Ｋｏｏｌ，（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：６０２を参照されたい。これらの塩基は一般に、天然塩基とある程度誤って対形成し、酵素により複製することはできない。Ｋｏｏｌ及び同僚は、塩基間の疎水性パッキング相互作用が、水素結合を置き換えて塩基対の形成を駆動することができることを示した。Ｋｏｏｌ，（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：６０２及びＧｕｃｋｉａｎ ａｎｄ Ｋｏｏｌ，（１９９８）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３６，２８２５を参照されたい。上記のすべての要件を満たす非天然塩基対を開発する目的で、Ｓｃｈｕｌｔｚ、Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ、及び同僚は、一連の非天然疎水性塩基を体系的に合成し、研究した。ＰＩＣＳ：ＰＩＣＳ自己対は、天然塩基対よりも安定であることが見出され、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ（ＫＦ）のクレノウ断片によってＤＮＡに効率的に組み込まれ得る。例えば、ＭｃＭｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：１１５８５－６及びＯｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：３２７４を参照されたい。３ＭＮ：３ＭＮの自己対は、ＫＦによって、生物学的機能に十分な効率性及び選択性で合成され得る。例えば、Ｏｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：８８０３を参照されたい。しかしながら、両方の塩基は、さらなる複製のための鎖ターミネーターとして作用する。ＰＩＣＳ自己対を複製するために使用することができる変異体ＤＮＡポリメラーゼが最近考案された。加えて、７ＡＩ自己対を複製することができる。例えば、Ｔａｅ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２３：７４３９を参照されたい。Ｃｕ（ＩＩ）に結合すると安定した対を形成する、新規のメタロ塩基対であるＤｉｐｉｃ：Ｐｙも開発された。Ｍｅｇｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：１０７１４を参照されたい。伸長コドン及び非天然コドンは、天然コドンに本質的に直交するため、本発明の方法は、この特性を利用して、それらのための直交ｔＲＮＡを生成することができる。
翻訳バイパス系を使用して、所望のポリペプチドに非天然アミノ酸を組み込むこともできる。翻訳バイパス系では、大きな配列は遺伝子に組み込まれるが、タンパク質には翻訳されない。この配列は、リボソームが配列を飛ばし、挿入の下流で翻訳を再開するように誘導するための手がかりとして機能する構造を含有する。
ＴＣの標的化ポリペプチドなどの関心のタンパク質をコードする核酸分子は、ポリペプチドの任意の所望の位置にシステインを導入するために容易に変異され得る。システインは、反応性分子、水溶性ポリマー、タンパク質、または多種多様な他の分子を関心のタンパク質上に導入するために広く使用される。システインをポリペプチドの所望の位置に組み込むのに好適な方法は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，６０８，１８３号に記載されるもの、及び標準的な変異誘発技法など、当業者に既知である。
ＩＩＩ．非天然コード化アミノ酸
非常に多種多様な非天然コード化アミノ酸が、本発明での使用に好適である。任意の数の非天然コード化アミノ酸をＴＣに導入することができる。一般的に、導入された非天然コード化アミノ酸は、２０個の一般的な遺伝子コード化アミノ酸（すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリン）に対して実質的に化学的に不活性である。いくつかの実施形態において、非天然コード化アミノ酸は、２０個の一般的なアミノ酸には見られない官能基（アジド、ケトン、アルデヒド、及びアミノオキシ基を含むがこれらに限定されない）と効率的かつ選択的に反応して、安定したコンジュゲートを形成する側鎖官能基を含む。例えば、アジド官能基を含有する非天然コード化アミノ酸を含むＴＣの標的化ポリペプチドを、ポリマー（ポリ（エチレングリコール）、または代替的に、アルキン部分を含有する第２のポリペプチドもしくはリンカーを含むが、これらに限定されない）と反応させて、アジド及びアルキン官能基の選択的反応から生じる安定したコンジュゲートを形成し、ヒュスゲン［３＋２］環化付加生成物を形成することができる。
アルファ－アミノ酸の一般構造は、以下（式Ｉ）のように示される：
Figure 2022520792000020
非天然コード化アミノ酸は、典型的には、上に列記される式を有する任意の構造であり、Ｒ基は、２０個の天然アミノ酸で使用される置換基以外の任意の置換基であり、本発明での使用に好適であり得る。本発明の非天然コード化アミノ酸は、典型的には、側鎖の構造のみにおいて天然アミノ酸と異なるため、非天然コード化アミノ酸は、天然または非天然コード化を含むがこれらに限定されない他のアミノ酸と、天然に存在するポリペプチド内で形成されるのと同じ様式でアミド結合を形成する。しかしながら、非天然コード化アミノ酸は、それらを天然アミノ酸と区別する側鎖基を有する。例えば、Ｒは、任意に、アルキル－、アリール－、アシル－、ケト－、アジド－、ヒドロキシル－、ヒドラジン、シアノ－、ハロ－、ヒドラジド、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、セレノ－、スルホニル－、ボレート、ボロネート、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環式、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン、アミノ基など、またはそれらの任意の組み合わせを含む。本発明での使用に好適であり得る他の関心の非天然に存在するアミノ酸としては、光活性化架橋剤を含むアミノ酸、スピン標識アミノ酸、蛍光アミノ酸、金属結合アミノ酸、金属含有アミノ酸、放射性アミノ酸、新規官能基を有するアミノ酸、他の分子と共有結合的もしくは非共有結合的に相互作用するアミノ酸、光ケージ化及び／または光異性化可能なアミノ酸、ビオチンもしくはビオチン類似体を含むアミノ酸、糖置換セリンなどのグリコシル化アミノ酸、他の炭水化物修飾されたアミノ酸、ケト含有アミノ酸、ポリエチレングリコールもしくはポリエーテルを含むアミノ酸、重原子置換アミノ酸、化学的に切断可能な及び／または光切断可能なアミノ酸、天然アミノ酸と比較して細長い側鎖を有するアミノ酸（約５超または約１０超の炭素を含むがこれらに限定されない、ポリエーテルもしくは長鎖炭化水素を含むがこれらに限定されない）、炭素連結された糖含有アミノ酸、酸素還元活性アミノ酸、アミノチオ酸含有アミノ酸、ならびに１つ以上の毒素部分を含むアミン酸が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明での使用に好適であり得、水溶性ポリマーとの反応に有用である例示的な非天然コード化アミノ酸には、カルボニル、アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド、セミカルバジド、アジド、及びアルキン反応性基を有するものが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、非天然コード化アミノ酸は糖部分を含む。そのようなアミノ酸の例としては、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルコサミニル－Ｌ－セリン、Ｎ－アセチル－Ｌ－ガラクトサミニル－Ｌ－セリン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルコサミニル－Ｌ－スレオニン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルコサミニル－Ｌ－アスパラギン、及びＯ－マンノサミニル－Ｌ－セリンが挙げられる。そのようなアミノ酸の例には、アミノ酸と糖との間の天然に存在するＮ－またはＯ連結が、アルケン、オキシム、チオエーテル、アミドなどを含むがこれらに限定されない、天然には一般に見られない共有結合に置き換えられる例も含まれる。そのようなアミノ酸の例としては、２－デオキシ－グルコース、２－デオキシガラクトースなどの天然に存在するタンパク質に一般的に見られない糖類も挙げられる。
本明細書で提供される非天然コード化アミノ酸の多くは、例えば、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（ａ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、またはＰｅｐｔｅｃｈ（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）から市販されている。市販されていないものは、本明細書に提供されるように、または当業者に既知の標準的な方法を使用して任意に合成される。有機合成技法については、例えば、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｂｙ Ｆｅｓｓｅｎｄｏｎ ａｎｄ Ｆｅｓｓｅｎｄｏｎ，（１９８２，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｌａｒｄ Ｇｒａｎｔ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｓｔｏｎ Ｍａｓｓ．）、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｂｙ Ｍａｒｃｈ（Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８５，Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、及びＡｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｂｙ Ｃａｒｅｙ ａｎｄ Ｓｕｎｄｂｅｒｇ（Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐａｒｔｓ Ａ ａｎｄ Ｂ，１９９０，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい。米国特許第７，０４５，３３７号及び同第７，０８３，９７０号（参照により本明細書に組み込まれる）も参照されたい。新規の側鎖を含有する非天然アミノ酸に加えて、本発明での使用に好適であり得る非天然アミノ酸は、任意に、式ＩＩ及びＩＩＩの構造：
Figure 2022520792000021
Figure 2022520792000022
（式中、Ｚは、典型的には、ＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、ＮＨ－Ｒ’、またはＳ－Ｒ’を含み、Ｘ及びＹは、同じであっても異なっていてもよく、典型的には、ＳまたはＯを含み、Ｒ及びＲ’は、任意に、同じであっても異なっていてもよく、典型的には、式Ｉ及び水素を有する非天然アミノ酸について上述したＲ基の成分と同じリストから選択される）によって示されるように、これらを含むがこれらに限定されない、修飾された骨格構造も含む。例えば、本発明の非天然アミノ酸は、任意に、式ＩＩ及びＩＩＩによって示されるように、アミノまたはカルボキシル基に置換を含む。この種類の非天然アミノ酸には、一般的な２０個の天然アミノ酸または非天然側鎖に対応する側鎖を含むが、これらに限定されないものを有する、α－ヒドロキシ酸、α－チオ酸、α－アミノチオカルボキシレートが含まれるが、これらに限定されない。加えて、α炭素での置換には、任意に、Ｌ、Ｄ、またはＤ－グルタメート、Ｄ－アラニン、Ｄ－メチル－Ｏ－チロシン、アミノ酪酸などのα－α－二置換アミノ酸が含まれるが、これらに限定されない。他の構造代替物としては、プロリン類似体などの環状アミノ酸、ならびに３、４、６、７、８、及び９員環プロリン類似体、置換β－アラニン及びγ－アミノ酪酸などのβ及びγアミノ酸が挙げられる。
多くの非天然アミノ酸は、チロシン、グルタミン、フェニルアラニンなどの天然アミノ酸に基づいており、本発明での使用に好適である。チロシン類似体としては、限定されないが、パラ置換チロシン、オルト置換チロシン、及びメタ置換チロシンが挙げられ、ここで、置換チロシンは、ケト基（アセチル基を含むがこれに限定されない）、ベンゾイル基、アミノ基、ヒドラジン、ヒドロキシアミン、チオール基、カルボキシ基、イソプロピル基、メチル基、Ｃ６－Ｃ２０直鎖または分枝状炭化水素、飽和または不飽和炭化水素、Ｏ－メチル基、ポリエーテル基、ニトロ基、アルキニル基などを含むが、これらに限定されない。加えて、複数の置換アリール環も企図される。本発明での使用に好適であり得るグルタミン類似体には、α－ヒドロキシ誘導体、γ－置換誘導体、環状誘導体、及びアミド置換グルタミン誘導体が含まれるが、これらに限定されない。本発明での使用に好適であり得る例示的なフェニルアラニン類似体としては、限定されないが、パラ置換フェニルアラニン、オルト置換フェニルアラニン、及びメタ置換フェニルアラニンが挙げられ、ここで、置換基は、ヒドロキシ基、メトキシ基、メチル基、アリル基、アルデヒド、アジド、ヨード、ブロモ、ケト基（アセチル基を含むがこれに限定されない）、ベンゾイル、アルキニル基などを含むが、これらに限定されない。本発明での使用に好適であり得る非天然アミノ酸の具体例としては、ｐ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニン、Ｏ－メチル－Ｌ－チロシン、Ｌ－３－（２－ナフチル）アラニン、３－メチル－フェニルアラニン、Ｏ－４－アリル－Ｌ－チロシン、４－プロピル－Ｌ－チロシン、トリ－Ｏ－アセチル－ＧｌｃＮＡｃβ－セリン、Ｌ－ドパ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アジド－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アシル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ－ヨード－フェニルアラニン、ｐ－ブロモフェニルアラニンｐ－アミノ－Ｌ－フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、及びｐ－プロパルギルオキシ－フェニルアラニンなどが挙げられるが、これらに限定されない。本発明での使用に好適であり得る様々な非天然アミノ酸の構造の例は、例えば、「Ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ」と題されるＷＯ２００２／０８５９２３に提供される。追加のメチオニン類似体については、参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｉｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｚｉｄｅｓ ｉｎｔｏ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ ｃｈｅｍｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ ｌｉｇａｔｉｏｎ，ＰＮＡＳ ９９：１９－２４も参照されたい。参照により本明細書に組み込まれる「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ，ａｎｄ Ｕｓｅｓ ｏｆ Ｎｏｎ－ｎａｔｕｒａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ」と題される国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０６／４７８２２号は、限定されないが、ｐ－アミノ－フェニルアラニン及び還元的アミノ化を含む芳香族アミン部分の還元的アルキル化を記載する。
本発明の別の実施形態において、１つ以上の非天然コード化アミノ酸を有するＴＣポリペプチドは、共有結合により修飾される。生物学的系の多様な官能基に直交する選択的化学反応は、化学生物学における重要なツールとして認識されている。合成化学のレパートリーの比較的新規なものとして、これらの生体直交反応は、化合物ライブラリ合成、タンパク質工学、機能的プロテオミクス、及び細胞表面の化学的リモデリングのための新しい戦略を刺激してきた。アジドは、生体コンジュゲートのための固有の化学ハンドルとして重要な役割を確保している。シュタウディンガライゲーションは、細胞糖コンジュゲートに代謝により導入されたアジド糖にタグを付けるために、ホスフィンと共に使用されてきた。シュタウディンガライゲーションは、生きている動物において、生理学的な害なしに実施することができる。それにもかかわらず、シュタウディンガ反応は、不利なことがないわけではない。必要なホスフィンは空気酸化されやすく、改善された水溶性及び増加された反応速度のそれらの最適化は、合成的に困難であることが判明している。
アジド基は、Ｈｕｉｓｇｅｎによって記載されるアルキンとの［３＋２］環化付加という、生体直交反応性の代替モードを有する。その古典的な形態では、この反応は、合理的な反応速度のための高温（または圧力）の要件により、生物学的系への適用性が限定されている。Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ及び同僚は、生理学的温度及び十分に機能化された生物学的環境で容易に進行する「クリック化学」と呼ばれる銅（Ｉ）触媒バージョンの開発により、この障害を克服した。この発見は、複合体組織溶解物からのウイルス粒子、核酸、及びタンパク質の選択的修飾を可能にした。残念ながら、必須の銅触媒は、細菌細胞及び哺乳類細胞の両方に対して毒性であり、したがって、細胞が生存していなければならない用途を排除する。電子求引性置換基によって活性化されたアルキンの触媒不含ヒュスゲン環化付加は、周囲温度で生じることが報告されている。しかし、これらの化合物は、生物学的求核剤によりマイケル反応を受ける。
一実施形態において、非天然アミノ酸（ｐ－（プロパルギルオキシ）－フェニルアラニンなど）を含むＴＣの標的化ポリペプチドの組成物が提供される。タンパク質及び／または細胞を含むがこれらに限定されない、ｐ－（プロパルギルオキシ）－フェニルアラニンを含む種々の組成物も提供される。一態様において、ｐ－（プロパルギルオキシ）－フェニルアラニン非天然アミノ酸を含む組成物は、直交ｔＲＮＡをさらに含む。非天然アミノ酸は、アミノ－アシル結合を通じた直交ｔＲＮＡへの共有結合、直交ｔＲＮＡの末端リボース糖の３’ＯＨまたは２’ＯＨへの共有結合などを含むがこれらに限定されない、直交ｔＲＮＡに結合され得る（限定されないが共有結合を含む）。
タンパク質に組み込むことができる非天然アミノ酸を介した化学部分は、タンパク質の様々な利点及び操作を提供する。例えば、ケト官能基の固有の反応性は、インビトロ及びインビボで、いくつかのヒドラジンまたはヒドロキシルアミン含有試薬のいずれかを用いたタンパク質の選択的修飾を可能にする。重原子非天然アミノ酸は、例えば、Ｘ線構造データの相化に有用であり得る。非天然アミノ酸を使用した重原子の部位特異的導入は、重原子の位置を選択する際の選択性及び柔軟性も提供する。光反応性非天然アミノ酸（ベンゾフェノン及びアリールアジド（フェニルアジドを含むがこれに限定されない）側鎖を有するアミノ酸を含むがこれに限定されない）は、例えば、タンパク質のインビボ及びインビトロでの効率的な光架橋を可能にする。光反応性非天然アミノ酸の例としては、ｐ－アジド－フェニルアラニン及びｐ－ベンゾイル－フェニルアラニンが挙げられるが、これらに限定されない。次いで、光反応性非天然アミノ酸を有するタンパク質を、光反応性基の励起によって任意に架橋し、時間的制御を提供することができる。一実施例において、非天然アミノのメチル基は、核磁気共鳴及び振動分光法の使用を含むがこれらに限定されないものの使用により、局所構造及び動態のプローブとして、限定されないが、メチル基を含む同位体標識されたもので置換され得る。例えば、アルキニルまたはアジド官能基は、［３＋２］環化付加反応を通じて分子によるタンパク質の選択的修飾を可能にする。
アミノ末端のポリペプチドに組み込まれる非天然アミノ酸は、２０個の天然アミノ酸に使用される置換基以外の任意の置換基であるＲ基、及びアルファ－アミノ酸に通常存在するＮＨ２基とは異なる第２の反応性基から構成されてもよい。同様の非天然アミノ酸は、アルファ－アミノ酸に通常存在するＣＯＯＨ基とは異なる第２の反応性基を有するＣ末端に組み込むことができる。
本発明の非天然アミノ酸は、２０個の天然アミノ酸では利用できない追加の特徴を提供するように選択または設計され得る。例えば、非天然アミノ酸は、例えば、それらが組み込まれるタンパク質の生物学的特性を修飾するように任意に設計または選択され得る。例えば、以下の特性は、非天然アミノ酸をタンパク質に含めることによって任意に修飾され得る：毒性、生体分布、溶解度、安定性、例えば、熱、加水分解、酸化、酵素分解に対する耐性など、精製及び処理の容易さ、構造特性、分光学的特性、化学及び／または光化学特性、触媒活性、酸化還元電位、半減期、他の分子と反応する能力、例えば、共有結合的または非共有結合的など。
いくつかの実施形態において、本発明は、オキシム結合によって水溶性ポリマー、例えばＰＥＧに連結されたＴＣを提供する。多くの種類の非天然コード化アミノ酸は、オキシム結合の形成に好適である。これらには、カルボニル、ジカルボニル、またはヒドロキシルアミン基を含有する非天然コード化アミノ酸が含まれるが、これらに限定されない。そのようなアミノ酸は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２００６／０１９４２５６号、同第２００６／０２１７５３２号、及び同第２００６／０２１７２８９号、ならびに「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ，ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ，ａｎｄ ｕｓｅｓ ｏｆ ｎｏｎ－ｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ」と題されるＷＯ２００６／０６９２４６に記載されている。非天然コード化アミノ酸は、米国特許第７，０８３，９７０号及び米国特許第７，０４５，３３７号にも記載されており、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本発明のいくつかの実施形態は、パラ－アセチルフェニルアラニンアミノ酸で、１つ以上の位置で置換されているＴＣポリペプチドを利用する。ｐ－アセチル－（＋／－）－フェニルアラニン及びｍ－アセチル－（＋／－）－フェニルアラニンの合成は、Ｚｈａｎｇ，Ｚ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２：６７３５－６７４６（２００３）（参照により組み込まれる）に記載されている。他のカルボニルまたはジカルボニル含有アミノ酸は、当業者によって同様に調製され得る。さらに、本明細書に含まれる非天然アミノ酸の非限定的な例示的な合成は、米国特許第７，０８３，９７０号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に提示される。
求電子反応性基を有するアミノ酸は、とりわけ求核付加反応を介して分子を連結するための様々な反応を可能にする。そのような求電子性反応性基としては、カルボニル基（ケト基及びジカルボニル基を含む）、カルボニル様基（カルボニル基（ケト基及びジカルボニル基を含む）に類似の反応性を有し、かつカルボニル基に構造的に類似している）、マスクされたカルボニル基（カルボニル基（ケト基及びジカルボニル基を含む）に容易に変換することができる）、または保護されたカルボニル基（脱保護時にカルボニル基（ケト基及びジカルボニル基を含む）に類似の反応性を有する）が挙げられる。そのようなアミノ酸には、式（ＩＶ）の構造を有するアミノ酸が含まれる：
Figure 2022520792000023
式中、
Ａは任意であり、存在する場合、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリレン、置換アリレン、ヘテロアリレン、置換ヘテロアリレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり、
Ｂは任意であり、存在する場合、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、－Ｏ－、－Ｏ－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｓ－、－Ｓ－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｓ（Ｏ）ｋ－（ｋは、１、２、または３である）、－Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｎ（Ｒ’）－、－ＮＲ’－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－ＣＯＮ（Ｒ’）－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－ＣＳＮ（Ｒ’）－、－ＣＳＮ（Ｒ’）－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｎ（Ｒ’）ＣＯ－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）－Ｎ＝、－Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ－、－Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ－Ｎ（Ｒ’）－、－Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ－Ｎ＝、－Ｃ（Ｒ’）２－Ｎ＝Ｎ－、及び－Ｃ（Ｒ’）２－Ｎ（Ｒ’）－Ｎ（Ｒ’）－（各Ｒ’は、独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択されるリンカーであり、
Ｊは、
Figure 2022520792000024
であり、
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり、
各Ｒ”は、独立して、Ｈ、アルキル、置換アルキル、または保護基であるか、または２つ以上のＲ”基が存在する場合、２つのＲ”は、任意に、ヘテロシクロアルキルを形成し、
Ｒ１は任意であり、存在する場合、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり、
Ｒ２は任意であり、存在する場合、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり、
Ｒ３及びＲ４のそれぞれは、独立して、Ｈ、ハロゲン、低級アルキル、もしくは置換低級アルキルであるか、あるいはＲ３及びＲ４、または２つのＲ３基は、任意に、シクロアルキルもしくはヘテロシクロアルキルを形成するか、
あるいは－Ａ－Ｂ－Ｊ－Ｒ基は一緒に、ジカルボニル基を含む少なくとも１つのカルボニル基、保護されたジカルボニル基を含む保護されたカルボニル基、またはマスクされたジカルボニル基を含むマスクされたカルボニル基を含む、二環式もしくは三環式シクロアルキルもしくはヘテロシクロアルキルを形成するか、
あるいは－Ｊ－Ｒ基は一緒に、ジカルボニル基を含む少なくとも１つのカルボニル基、保護されたジカルボニル基を含む保護されたカルボニル基、またはマスクされたジカルボニル基を含むマスクされたカルボニル基を含む、単環式もしくは二環式シクロアルキルもしくはヘテロシクロアルキルを形成するが、
但し、Ａがフェニレンであり、かつ各Ｒ３がＨである場合、Ｂが存在し、Ａが－（ＣＨ２）４－であり、かつ各Ｒ３がＨである場合、Ｂは－ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２ＣＨ２）－ではなく、Ａ及びＢが不在であり、かつ各Ｒ３がＨである場合、Ｒはメチルではないことを条件とする。
加えて、式（Ｖ）の構造を有するものが含まれる：
Figure 2022520792000025
式中、
Ａは任意であり、存在する場合、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリレン、置換アリレン、ヘテロアリレン、置換ヘテロアリレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり、
Ｂは任意であり、存在する場合、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、－Ｏ－、－Ｏ－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｓ－、－Ｓ－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｓ（Ｏ）ｋ－（ｋは、１、２、または３である）、－Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｎ（Ｒ’）－、－ＮＲ’－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－ＣＯＮ（Ｒ’）－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－ＣＳＮ（Ｒ’）－、－ＣＳＮ（Ｒ’）－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｎ（Ｒ’）ＣＯ－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）－Ｎ＝、－Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ－、－Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ－Ｎ（Ｒ’）－、－Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ－Ｎ＝、－Ｃ（Ｒ’）２－Ｎ＝Ｎ－、及び－Ｃ（Ｒ’）２－Ｎ（Ｒ’）－Ｎ（Ｒ’）－（各Ｒ’は、独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択されるリンカーであり、
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり、
Ｒ１は任意であり、存在する場合、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり、
Ｒ２は任意であり、存在する場合、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであるが、
但し、Ａがフェニレンである場合、Ｂが存在し、Ａが－（ＣＨ２）４－である場合、Ｂは－ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２ＣＨ２）－ではなく、Ａ及びＢが不在の場合、Ｒはメチルではないことを条件とする。
加えて、式（ＶＩ）の構造を有するアミノ酸が含まれる：
Figure 2022520792000026
式中、
Ｂは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、－Ｏ－、－Ｏ－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｓ－、－Ｓ－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｓ（Ｏ）ｋ－（ｋは、１、２、または３である）、－Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｎ（Ｒ’）－、－ＮＲ’－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－ＣＯＮ（Ｒ’）－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－ＣＳＮ（Ｒ’）－、－ＣＳＮ（Ｒ’）－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｎ（Ｒ’）ＣＯ－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）－Ｎ＝、－Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ－、－Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ－Ｎ（Ｒ’）－、－Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ－Ｎ＝、－Ｃ（Ｒ’）２－Ｎ＝Ｎ－、及び－Ｃ（Ｒ’）２－Ｎ（Ｒ’）－Ｎ（Ｒ’）－（各Ｒ’は、独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択されるリンカーであり、
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり、
Ｒ１は任意であり、存在する場合、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり、
Ｒ２は任意であり、存在する場合、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり、
各Ｒａは、独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、－Ｎ（Ｒ’）２、－Ｃ（Ｏ）ｋＲ’（ｋは、１、２、または３である）、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、－ＯＲ’、及び－Ｓ（Ｏ）ｋＲ’（各Ｒ’は、独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択される。
加えて、以下のアミノ酸が含まれる：
Figure 2022520792000027
（式中、そのような化合物は、任意に、アミノ保護基、カルボキシル保護されている、またはその塩である）。加えて、以下の非天然アミノ酸のいずれかを、非天然アミノ酸ポリペプチドに組み込むことができる。
加えて、式（ＶＩＩ）の構造を有する以下のアミノ酸が含まれる：
Figure 2022520792000028
式中、
Ｂは任意であり、存在する場合、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、－Ｏ－、－Ｏ－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｓ－、－Ｓ－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｓ（Ｏ）ｋ－（ｋは、１、２、または３である）、－Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｎ（Ｒ’）－、－ＮＲ’－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－ＣＯＮ（Ｒ’）－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－ＣＳＮ（Ｒ’）－、－ＣＳＮ（Ｒ’）－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｎ（Ｒ’）ＣＯ－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）－Ｎ＝、－Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ－、－Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ－Ｎ（Ｒ’）－、－Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ－Ｎ＝、－Ｃ（Ｒ’）２－Ｎ＝Ｎ－、及び－Ｃ（Ｒ’）２－Ｎ（Ｒ’）－Ｎ（Ｒ’）－（各Ｒ’は、独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択されるリンカーであり、
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり、
Ｒ１は任意であり、存在する場合、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり、
Ｒ２は任意であり、存在する場合、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり、
各Ｒａは、独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、－Ｎ（Ｒ’）２、－Ｃ（Ｏ）ｋＲ’（ｋは、１、２、または３である）、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、－ＯＲ’、及び－Ｓ（Ｏ）ｋＲ’（各Ｒ’は、独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択され、ｎは、０～８であるが、
但し、Ａが－（ＣＨ２）４－である場合、Ｂは－ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２ＣＨ２）－ではないことを条件とする。
加えて、以下のアミノ酸が含まれる：
Figure 2022520792000029
（式中、そのような化合物は、任意に、アミノ保護されるか、任意に、カルボキシル保護されるか、任意に、アミノ保護され、かつカルボキシル保護されるか、またはその塩である）。加えて、これらの非天然アミノ酸及び以下の非天然アミノ酸のいずれかを、非天然アミノ酸ポリペプチドに組み込むことができる。
加えて、式（ＶＩＩＩ）の構造を有する以下のアミノ酸が含まれる：
Figure 2022520792000030
式中、Ａは任意であり、存在する場合、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリレン、置換アリレン、ヘテロアリレン、置換ヘテロアリレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり、
Ｂは任意であり、存在する場合、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、－Ｏ－、－Ｏ－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｓ－、－Ｓ－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｓ（Ｏ）ｋ－（ｋは、１、２、または３である）、－Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｎ（Ｒ’）－、－ＮＲ’－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－ＣＯＮ（Ｒ’）－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－ＣＳＮ（Ｒ’）－、－ＣＳＮ（Ｒ’）－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｎ（Ｒ’）ＣＯ－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）－Ｎ＝、－Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ－、－Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ－Ｎ（Ｒ’）－、－Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ－Ｎ＝、－Ｃ（Ｒ’）２－Ｎ＝Ｎ－、及び－Ｃ（Ｒ’）２－Ｎ（Ｒ’）－Ｎ（Ｒ’）－（各Ｒ’は、独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択されるリンカーであり、
Ｒ１は任意であり、存在する場合、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり、
Ｒ２は任意であり、存在する場合、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドである。
加えて、式（ＩＸ）の構造を有する以下のアミノ酸が含まれる：
Figure 2022520792000031
Ｂは任意であり、存在する場合、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、－Ｏ－、－Ｏ－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｓ－、－Ｓ－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｓ（Ｏ）ｋ－（ｋは、１、２、または３である）、－Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｎ（Ｒ’）－、－ＮＲ’－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－ＣＯＮ（Ｒ’）－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－ＣＳＮ（Ｒ’）－、－ＣＳＮ（Ｒ’）－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｎ（Ｒ’）ＣＯ－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）－Ｎ＝、－Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ－、－Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ－Ｎ（Ｒ’）－、－Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ－Ｎ＝、－Ｃ（Ｒ’）２－Ｎ＝Ｎ－、及び－Ｃ（Ｒ’）２－Ｎ（Ｒ’）－Ｎ（Ｒ’）－（各Ｒ’は、独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択されるリンカーであり、
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり、
Ｒ１は任意であり、存在する場合、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり、
Ｒ２は任意であり、存在する場合、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり、
各Ｒａは、独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、－Ｎ（Ｒ’）２、－Ｃ（Ｏ）ｋＲ’（ｋは、１、２、または３である）、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、－ＯＲ’、及び－Ｓ（Ｏ）ｋＲ’（各Ｒ’は、独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択される。
加えて、以下のアミノ酸が含まれる：
Figure 2022520792000032
（式中、そのような化合物は、任意に、アミノ保護されるか、任意に、カルボキシル保護されるか、任意に、アミノ保護され、かつカルボキシル保護されるか、またはその塩である）。加えて、これらの非天然アミノ酸及び以下の非天然アミノ酸のいずれかを、非天然アミノ酸ポリペプチドに組み込むことができる。
加えて、式（Ｘ）の構造を有する以下のアミノ酸が含まれる：
Figure 2022520792000033
式中、Ｂは任意であり、存在する場合、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、－Ｏ－、－Ｏ－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｓ－、－Ｓ－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｓ（Ｏ）ｋ－（ｋは、１、２、または３である）、－Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｎ（Ｒ’）－、－ＮＲ’－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－ＣＯＮ（Ｒ’）－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－ＣＳＮ（Ｒ’）－、－ＣＳＮ（Ｒ’）－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｎ（Ｒ’）ＣＯ－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）－Ｎ＝、－Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ－、－Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ－Ｎ（Ｒ’）－、－Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ－Ｎ＝、－Ｃ（Ｒ’）２－Ｎ＝Ｎ－、及び－Ｃ（Ｒ’）２－Ｎ（Ｒ’）－Ｎ（Ｒ’）－（各Ｒ’は、独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択されるリンカーであり、
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり、
Ｒ１は任意であり、存在する場合、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり、
Ｒ２は任意であり、存在する場合、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり、
各Ｒａは、独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、－Ｎ（Ｒ’）２、－Ｃ（Ｏ）ｋＲ’（ｋは、１、２、または３である）、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、－ＯＲ’、及び－Ｓ（Ｏ）ｋＲ’（各Ｒ’は、独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択され、ｎは、０～８である。
加えて、以下のアミノ酸が含まれる：
Figure 2022520792000034
（式中、そのような化合物は、任意に、アミノ保護されるか、任意に、カルボキシル保護されるか、任意に、アミノ保護され、かつカルボキシル保護されるか、またはその塩である）。加えて、これらの非天然アミノ酸及び以下の非天然アミノ酸のいずれかを、非天然アミノ酸ポリペプチドに組み込むことができる。
モノカルボニル構造に加えて、本明細書に記載の非天然アミノ酸は、ジカルボニル、ジカルボニル様、マスクされたジカルボニル、及び保護されたジカルボニル基などの基を含み得る。
例えば、式（ＸＩ）の構造を有する以下のアミノ酸が含まれる：
Figure 2022520792000035
式中、Ａは任意であり、存在する場合、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリレン、置換アリレン、ヘテロアリレン、置換ヘテロアリレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり、
Ｂは任意であり、存在する場合、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、－Ｏ－、－Ｏ－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｓ－、－Ｓ－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｓ（Ｏ）ｋ－（ｋは、１、２、または３である）、－Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｎ（Ｒ’）－、－ＮＲ’－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－ＣＯＮ（Ｒ’）－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－ＣＳＮ（Ｒ’）－、－ＣＳＮ（Ｒ’）－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｎ（Ｒ’）ＣＯ－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）－Ｎ＝、－Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ－、－Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ－Ｎ（Ｒ’）－、－Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ－Ｎ＝、－Ｃ（Ｒ’）２－Ｎ＝Ｎ－、及び－Ｃ（Ｒ’）２－Ｎ（Ｒ’）－Ｎ（Ｒ’）－（各Ｒ’は、独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択されるリンカーであり、
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり、
Ｒ１は任意であり、存在する場合、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり、
Ｒ２は任意であり、存在する場合、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドである。
加えて、式（ＸＩＩ）の構造を有する以下のアミノ酸が含まれる：
Figure 2022520792000036
Ｂは任意であり、存在する場合、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、－Ｏ－、－Ｏ－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｓ－、－Ｓ－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｓ（Ｏ）ｋ－（ｋは、１、２、または３である）、－Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｎ（Ｒ’）－、－ＮＲ’－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－ＣＯＮ（Ｒ’）－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－ＣＳＮ（Ｒ’）－、－ＣＳＮ（Ｒ’）－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｎ（Ｒ’）ＣＯ－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）－Ｎ＝、－Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ－、－Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ－Ｎ（Ｒ’）－、－Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ－Ｎ＝、－Ｃ（Ｒ’）２－Ｎ＝Ｎ－、及び－Ｃ（Ｒ’）２－Ｎ（Ｒ’）－Ｎ（Ｒ’）－（各Ｒ’は、独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択されるリンカーであり、
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり、
Ｒ１は任意であり、存在する場合、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり、
Ｒ２は任意であり、存在する場合、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり、
各Ｒａは、独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、－Ｎ（Ｒ’）２、－Ｃ（Ｏ）ｋＲ’（ｋは、１、２、または３である）、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、－ＯＲ’、及び－Ｓ（Ｏ）ｋＲ’（各Ｒ’は、独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択される。
加えて、以下のアミノ酸が含まれる：
Figure 2022520792000037
（式中、そのような化合物は、任意に、アミノ保護されるか、任意に、カルボキシル保護されるか、任意に、アミノ保護され、かつカルボキシル保護されるか、またはその塩である）。加えて、これらの非天然アミノ酸及び以下の非天然アミノ酸のいずれかを、非天然アミノ酸ポリペプチドに組み込むことができる。
加えて、式（ＸＩＩＩ）の構造を有する以下のアミノ酸が含まれる：
Figure 2022520792000038
式中、Ｂは任意であり、存在する場合、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、－Ｏ－、－Ｏ－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｓ－、－Ｓ－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｓ（Ｏ）ｋ－（ｋは、１、２、または３である）、－Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｎ（Ｒ’）－、－ＮＲ’－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－ＣＯＮ（Ｒ’）－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－ＣＳＮ（Ｒ’）－、－ＣＳＮ（Ｒ’）－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｎ（Ｒ’）ＣＯ－（アルキレンまたは置換アルキレン）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）－Ｎ＝、－Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ－、－Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ－Ｎ（Ｒ’）－、－Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ－Ｎ＝、－Ｃ（Ｒ’）２－Ｎ＝Ｎ－、及び－Ｃ（Ｒ’）２－Ｎ（Ｒ’）－Ｎ（Ｒ’）－（各Ｒ’は、独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択されるリンカーであり、
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり、
Ｒ１は任意であり、存在する場合、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり、
Ｒ２は任意であり、存在する場合、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり、
各Ｒａは、独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、－Ｎ（Ｒ’）２、－Ｃ（Ｏ）ｋＲ’（ｋは、１、２、または３である）、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、－ＯＲ’、及び－Ｓ（Ｏ）ｋＲ’（各Ｒ’は、独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択され、ｎは、０～８である。
加えて、以下のアミノ酸が含まれる：
Figure 2022520792000039
（式中、そのような化合物は、任意に、アミノ保護されるか、任意に、カルボキシル保護されるか、任意に、アミノ保護され、かつカルボキシル保護されるか、またはその塩である）。加えて、これらの非天然アミノ酸及び以下の非天然アミノ酸のいずれかを、非天然アミノ酸ポリペプチドに組み込むことができる。
加えて、式（ＸＩＶ）の構造を有する以下のアミノ酸が含まれる：
Figure 2022520792000040
式中、
Ａは任意であり、存在する場合、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリレン、置換アリレン、ヘテロアリレン、置換ヘテロアリレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり、
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり、
Ｒ１は任意であり、存在する場合、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり、
Ｒ２は任意であり、存在する場合、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり、
Ｘ１は、Ｃ、Ｓ、またはＳ（Ｏ）であり、Ｌは、アルキレン、置換アルキレン、Ｎ（Ｒ’）（アルキレン）、またはＮ（Ｒ’）（置換アルキレン）であり、ここで、Ｒ’は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルである。
加えて、式（ＸＩＶ－Ａ）の構造を有する以下のアミノ酸が含まれる：
Figure 2022520792000041
式中、
Ａは任意であり、存在する場合、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリレン、置換アリレン、ヘテロアリレン、置換ヘテロアリレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり、
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり、
Ｒ１は任意であり、存在する場合、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり、
Ｒ２は任意であり、存在する場合、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり、
Ｌは、アルキレン、置換アルキレン、Ｎ（Ｒ’）（アルキレン）、またはＮ（Ｒ’）（置換アルキレン）であり、ここで、Ｒ’は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルである。
加えて、式（ＸＩＶ－Ｂ）の構造を有する以下のアミノ酸が含まれる：
Figure 2022520792000042
式中、
Ａは任意であり、存在する場合、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリレン、置換アリレン、ヘテロアリレン、置換ヘテロアリレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり、
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり、
Ｒ１は任意であり、存在する場合、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり、
Ｒ２は任意であり、存在する場合、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり、
Ｌは、アルキレン、置換アルキレン、Ｎ（Ｒ’）（アルキレン）、またはＮ（Ｒ’）（置換アルキレン）であり、ここで、Ｒ’は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルである。
加えて、式（ＸＶ）の構造を有する以下のアミノ酸が含まれる：
Figure 2022520792000043
式中、
Ａは任意であり、存在する場合、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリレン、置換アリレン、ヘテロアリレン、置換ヘテロアリレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり、
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり、
Ｒ１は任意であり、存在する場合、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり、
Ｒ２は任意であり、存在する場合、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり、
Ｘ１は、Ｃ、Ｓ、またはＳ（Ｏ）であり、ｎは、０、１、２、３、４、または５であり、各ＣＲ８Ｒ９基上の各Ｒ８及びＲ９は、独立して、Ｈ、アルコキシ、アルキルアミン、ハロゲン、アルキル、アリールからなる群から選択されるか、または任意のＲ８及びＲ９が一緒に、＝Ｏもしくはシクロアルキルを形成することができるか、または隣接するいずれかのＲ８基が一緒に、シクロアルキルを形成することができる。
加えて、式（ＸＶ－Ａ）の構造を有する以下のアミノ酸が含まれる：
Figure 2022520792000044
式中、
Ａは任意であり、存在する場合、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリレン、置換アリレン、ヘテロアリレン、置換ヘテロアリレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり、
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり、
Ｒ１は任意であり、存在する場合、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり、
Ｒ２は任意であり、存在する場合、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり、
ｎは、０、１、２、３、４、または５であり、各ＣＲ８Ｒ９基上の各Ｒ８及びＲ９は、独立して、Ｈ、アルコキシ、アルキルアミン、ハロゲン、アルキル、アリールからなる群から選択されるか、または任意のＲ８及びＲ９が共に、＝Ｏもしくはシクロアルキルを形成することができるか、または隣接するいずれかのＲ８基が共に、シクロアルキルを形成することができる。
加えて、式（ＸＶ－Ｂ）の構造を有する以下のアミノ酸が含まれる：
Figure 2022520792000045
式中、
Ａは任意であり、存在する場合、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリレン、置換アリレン、ヘテロアリレン、置換ヘテロアリレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり、
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり、
Ｒ１は任意であり、存在する場合、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり、
Ｒ２は任意であり、存在する場合、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり、
ｎは、０、１、２、３、４、または５であり、各ＣＲ８Ｒ９基上の各Ｒ８及びＲ９は、独立して、Ｈ、アルコキシ、アルキルアミン、ハロゲン、アルキル、アリールからなる群から選択されるか、または任意のＲ８及びＲ９が共に、＝Ｏもしくはシクロアルキルを形成することができるか、または隣接するいずれかのＲ８基が共に、シクロアルキルを形成することができる。
加えて、式（ＸＶＩ）の構造を有する以下のアミノ酸が含まれる：
Figure 2022520792000046
式中、
Ａは任意であり、存在する場合、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリレン、置換アリレン、ヘテロアリレン、置換ヘテロアリレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり、
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり、
Ｒ１は任意であり、存在する場合、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり、
Ｒ２は任意であり、存在する場合、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり、
Ｘ１は、Ｃ、Ｓ、またはＳ（Ｏ）であり、Ｌは、アルキレン、置換アルキレン、Ｎ（Ｒ’）（アルキレン）、またはＮ（Ｒ’）（置換アルキレン）であり、ここで、Ｒ’は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルである。
加えて、式（ＸＶＩ－Ａ）の構造を有する以下のアミノ酸が含まれる：
Figure 2022520792000047
式中、
Ａは任意であり、存在する場合、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリレン、置換アリレン、ヘテロアリレン、置換ヘテロアリレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり、
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり、
Ｒ１は任意であり、存在する場合、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり、
Ｒ２は任意であり、存在する場合、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり、
Ｌは、アルキレン、置換アルキレン、Ｎ（Ｒ’）（アルキレン）、またはＮ（Ｒ’）（置換アルキレン）であり、ここで、Ｒ’は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルである。
加えて、式（ＸＶＩ－Ｂ）の構造を有する以下のアミノ酸が含まれる：
Figure 2022520792000048
式中、
Ａは任意であり、存在する場合、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリレン、置換アリレン、ヘテロアリレン、置換ヘテロアリレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり、
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり、
Ｒ１は任意であり、存在する場合、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり、
Ｒ２は任意であり、存在する場合、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり、
Ｌは、アルキレン、置換アルキレン、Ｎ（Ｒ’）（アルキレン）、またはＮ（Ｒ’）（置換アルキレン）であり、ここで、Ｒ’は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルである。
加えて、式（ＸＶＩＩ）の構造を有するアミノ酸が含まれる：
Figure 2022520792000049
式中、
Ａは任意であり、存在する場合、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリレン、置換アリレン、ヘテロアリレン、置換ヘテロアリレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり、
Ｍは、
Figure 2022520792000050
であり、（ａ）は、Ａ基への結合を示し、（ｂ）は、それぞれのカルボニル基への結合を示し、Ｒ３及びＲ４は、独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、もしくは置換シクロアルキルから選択されるか、あるいはＲ３及びＲ４または２つのＲ３基もしくは２つのＲ４基は、任意に、シクロアルキルもしくはヘテロシクロアルキルを形成し、
Ｒは、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり、
Ｔ３は、結合、Ｃ（Ｒ）（Ｒ）、Ｏ、またはＳであり、Ｒは、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり、
Ｒ１は任意であり、存在する場合、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり、
Ｒ２は任意であり、存在する場合、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドである。
加えて、式（ＸＶＩＩＩ）の構造を有するアミノ酸が含まれる：
Figure 2022520792000051
式中、
Ｍは、
Figure 2022520792000052
であり、（ａ）は、Ａ基への結合を示し、（ｂ）は、それぞれのカルボニル基への結合を示し、Ｒ３及びＲ４は、独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、もしくは置換シクロアルキルから選択されるか、あるいはＲ３及びＲ４または２つのＲ３基もしくは２つのＲ４基は、任意に、シクロアルキルもしくはヘテロシクロアルキルを形成し、
Ｒは、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり、
Ｔ３は、結合、Ｃ（Ｒ）（Ｒ）、Ｏ、またはＳであり、Ｒは、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり、
Ｒ１は任意であり、存在する場合、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり、
Ｒ２は任意であり、存在する場合、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり、
各Ｒａは、独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、－Ｎ（Ｒ’）２、－Ｃ（Ｏ）ｋＲ’（ｋは、１、２、または３である）、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、－ＯＲ’、及び－Ｓ（Ｏ）ｋＲ’（各Ｒ’は、独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択される。
加えて、式（ＸＩＸ）の構造を有するアミノ酸が含まれる：
Figure 2022520792000053
式中、
Ｒは、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり、
Ｔ３は、ＯまたはＳである。
加えて、式（ＸＸ）の構造を有するアミノ酸が含まれる：
Figure 2022520792000054
式中、
Ｒは、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルである。
加えて、式（ＸＸＩ）の構造を有する以下のアミノ酸が含まれる：
Figure 2022520792000055
いくつかの実施形態において、非天然アミノ酸を含むポリペプチドは、反応性カルボニルまたはジカルボニル官能基を生成するように化学修飾される。例えば、コンジュゲーション反応に有用なアルデヒド官能基は、隣接するアミノ及びヒドロキシル基を有する官能基から生成することができる。生物学的活性分子が例えばポリペプチドである場合、Ｎ末端セリンまたはスレオニン（通常存在し得るか、または化学的または酵素的消化を介して曝露され得る）を使用して、過ヨウ素酸を使用して穏やかな酸化切断条件下でアルデヒド官能基を生成することができる。例えば、Ｇａｅｒｔｎｅｒ，ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．３：２６２－２６８（１９９２）、Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ，Ｋ．＆Ｓｔｒｏｈ，Ｊ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．３：１３８－１４６（１９９２）、Ｇａｅｒｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：７２２４－７２３０（１９９４）を参照されたい。しかしながら、当該技術分野で既知の方法は、ペプチドまたはタンパク質のＮ末端のアミノ酸に限定される。
本発明では、隣接するヒドロキシル及びアミノ基を担持する非天然アミノ酸を、「マスクされた」アルデヒド官能基としてポリペプチドに組み込むことができる。例えば、５－ヒドロキシリジンは、イプシロンアミンに隣接するヒドロキシル基を担持する。アルデヒドを生成するための反応条件は、典型的には、ポリペプチド内の他の部位における酸化を回避するために、穏やかな条件下でモル過剰のメタ過ヨウ素酸ナトリウムを添加することを伴う。酸化反応のｐＨは、典型的には、約７．０である。典型的な反応は、ポリペプチドの緩衝溶液に約１．５モル過剰のメタ過ヨウ素酸ナトリウムを添加し、続いて暗所で約１０分間インキュベートすることを伴う。例えば、米国特許第６，４２３，６８５号を参照されたい。
カルボニルまたはジカルボニル官能基を、水溶液中で、穏やかな条件下でヒドロキシルアミン含有試薬と選択的に反応させて、生理学的条件下で安定である対応するオキシム連結を形成することができる。例えば、Ｊｅｎｃｋｓ，Ｗ．Ｐ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８１，４７５－４８１（１９５９）、Ｓｈａｏ，Ｊ．ａｎｄ Ｔａｍ，Ｊ．Ｐ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：３８９３－３８９９（１９９５）を参照されたい。さらに、カルボニルまたはジカルボニル基の固有の反応性は、他のアミノ酸側鎖の存在下での選択的修飾を可能にする。例えば、Ｃｏｒｎｉｓｈ，Ｖ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８：８１５０－８１５１（１９９６）、Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ，Ｋ．Ｆ．＆Ｓｔｒｏｈ，Ｊ．Ｇ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．３：１３８－１４６（１９９２）、Ｍａｈａｌ，Ｌ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：１１２５－１１２８（１９９７）を参照されたい。
Ａ．カルボニル反応性基
カルボニル反応性基を有するアミノ酸は、とりわけ求核付加またはアルドール縮合反応を介して分子（ＰＥＧまたは他の水溶性分子を含むがこれらに限定されない）を連結するための様々な反応を可能にする。
例示的なカルボニル含有アミノ酸は、以下のように表すことができ、
Figure 2022520792000056
式中、ｎは、０～１０であり、Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル、または置換アリールであり、Ｒ２は、Ｈ、アルキル、アリール、置換アルキル、及び置換アリールであり、Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり、Ｒ４は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である。いくつかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、Ｒ２は、単純なアルキル（すなわち、メチル、エチル、またはプロピル）であり、ケトン部分は、アルキル側鎖に対してパラ位に配置される。いくつかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、Ｒ２は、単純なアルキル（すなわち、メチル、エチル、またはプロピル）であり、ケトン部分は、アルキル側鎖に対してメタ位に配置される。
ｐ－アセチル－（＋／－）－フェニルアラニン及びｍ－アセチル－（＋／－）－フェニルアラニンの合成は、Ｚｈａｎｇ，Ｚ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４２：６７３５－６７４６（２００３）（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。他のカルボニル含有アミノ酸も、当業者によって同様に調製され得る。
いくつかの実施形態において、非天然コード化アミノ酸を含むポリペプチドは、反応性カルボニル官能基を生成するように化学修飾される。例えば、コンジュゲーション反応に有用なアルデヒド官能基は、隣接するアミノ及びヒドロキシル基を有する官能基から生成することができる。生物学的活性分子が例えばポリペプチドである場合、Ｎ末端セリンまたはスレオニン（通常存在し得るか、または化学的または酵素的消化を介して曝露され得る）を使用して、過ヨウ素酸塩を使用して穏やかな酸化切断条件下でアルデヒド官能基を生成することができる。例えば、Ｇａｅｒｔｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．３：２６２－２６８（１９９２）、Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ，Ｋ．＆Ｓｔｒｏｈ，Ｊ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．３：１３８－１４６（１９９２）、Ｇａｅｒｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：７２２４－７２３０（１９９４）を参照されたい。しかしながら、当該技術分野で既知の方法は、ペプチドまたはタンパク質のＮ末端のアミノ酸に限定される。
本発明では、隣接するヒドロキシル及びアミノ基を有する非天然コード化アミノ酸を、「マスクされた」アルデヒド官能基としてポリペプチドに組み込むことができる。例えば、５－ヒドロキシリジンは、イプシロンアミンに隣接するヒドロキシル基を有する。アルデヒドを生成するための反応条件は、典型的には、ポリペプチド内の他の部位における酸化を回避するために、穏やかな条件下でモル過剰のメタ過ヨウ素酸ナトリウムを添加することを伴う。酸化反応のｐＨは、典型的には、約７．０である。典型的な反応は、ポリペプチドの緩衝溶液に約１．５モル過剰のメタ過ヨウ素酸ナトリウムを添加し、続いて暗所で約１０分間インキュベートすることを伴う。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，４２３，６８５号を参照されたい。
カルボニル官能基を、水溶液中で、穏やかな条件下で、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、またはセミカルバジド含有試薬と選択的に反応させて、それぞれ、生理学的条件下で安定である対応するヒドラゾン、オキシム、またはセミカルバゾン連結を形成することができる。例えば、Ｊｅｎｃｋｓ，Ｗ．Ｐ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８１，４７５－４８１（１９５９）、Ｓｈａｏ，Ｊ．ａｎｄ Ｔａｍ，Ｊ．Ｐ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：３８９３－３８９９（１９９５）を参照されたい。さらに、カルボニル基の固有の反応性は、他のアミノ酸側鎖の存在下での選択的修飾を可能にする。例えば、Ｃｏｒｎｉｓｈ，Ｖ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８：８１５０－８１５１（１９９６）、Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ，Ｋ．Ｆ．＆Ｓｔｒｏｈ，Ｊ．Ｇ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．３：１３８－１４６（１９９２）、Ｍａｈａｌ，Ｌ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：１１２５－１１２８（１９９７）を参照されたい。
Ｂ．ヒドラジン、ヒドラジド、またはセミカルバジド反応基
ヒドラジン、ヒドラジド、またはセミカルバジドなどの求核基を含有する非天然コード化アミノ酸は、様々な求電子基と反応して、（ＰＥＧまたは他の水溶性ポリマーを含むがこれらに限定されないものと）コンジュゲートを形成することを可能にする。
例示的なヒドラジン、ヒドラジド、またはセミカルバジド含有アミノ酸は、以下のように表すことができ、
Figure 2022520792000057
式中、ｎは、０～１０であり、Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル、もしくは置換アリールであるか、または存在せず、Ｘは、Ｏ、Ｎ、もしくはＳであるか、または存在せず、Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり、Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である。
いくつかの実施形態において、ｎは４であり、Ｒ１は存在せず、ＸはＮである。いくつかの実施形態において、ｎは２であり、Ｒ１は存在せず、Ｘは存在しない。いくつかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、ＸはＯであり、酸素原子は、アリール環上のアルファ基に対してパラに配置される。
ヒドラジド、ヒドラジン、及びセミカルバジド含有アミノ酸は、商業的供給源から入手可能である。例えば、Ｌ－グルタメート－γ－ヒドラジドは、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手可能である。市販されていない他のアミノ酸は、当業者によって調製され得る。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，２８１，２１１号を参照されたい。
ヒドラジド、ヒドラジン、またはセミカルバジド官能基を担持する非天然コード化アミノ酸を含有するポリペプチドは、アルデヒドまたは同様の化学反応性を有する他の官能基を含有する様々な分子と効率的かつ選択的に反応することができる。例えば、Ｓｈａｏ，Ｊ．ａｎｄ Ｔａｍ，Ｊ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：３８９３－３８９９（１９９５）を参照されたい。ヒドラジド、ヒドラジン、及びセミカルバジド官能基の固有の反応性により、２０個の一般的なアミノ酸（セリンもしくはスレオニンのヒドロキシル基、またはリジン及びＮ末端のアミノ基を含むがこれらに限定されない）上に存在する求核基と比較して、これらを、アルデヒド、ケトン、及び他の求電子基に対して顕著により反応性にする。
Ｃ．アミノオキシ含有アミノ酸
アミノオキシ（ヒドロキシルアミンとも呼ばれる）基を含有する非天然コード化アミノ酸は、様々な求電子基と反応して、（ＰＥＧまたは他の水溶性ポリマーを含むがこれらに限定されないものと）コンジュゲートを形成することを可能にする。ヒドラジン、ヒドラジド、及びセミカルバジドと同様に、アミノオキシ基の求核性が増強することにより、アルデヒド、または同様の化学反応性を有する他の官能基を含有する様々な分子と効率的かつ選択的に反応することが可能となる。例えば、Ｓｈａｏ，Ｊ．ａｎｄ Ｔａｍ，Ｊ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：３８９３－３８９９（１９９５）、Ｈ．Ｈａｎｇ ａｎｄ Ｃ．Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．３４：７２７－７３６（２００１）を参照されたい。ヒドラジン基との反応の結果は、対応するヒドラゾンであるが、オキシムは、一般に、アミノオキシ基と、ケトンなどのカルボニル含有基との反応から生じる。
アミノオキシ基を含有する例示的なアミノ酸は、以下のように表すことができ、
Figure 2022520792000058
式中、ｎは、０～１０であり、Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル、もしくは置換アリールであるか、または存在せず、Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであるか、または存在せず、ｍは、０～１０であり、Ｙ＝Ｃ（Ｏ）であるか、または存在せず、Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり、Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である。いくつかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、ＸはＯであり、ｍは１であり、Ｙは、存在する。いくつかの実施形態において、ｎは２であり、Ｒ１及びＸは存在せず、ｍは０であり、Ｙは存在しない。
アミノオキシ含有アミノ酸は、容易に入手可能なアミノ酸前駆体（ホモセリン、セリン、及びスレオニン）から調製され得る。例えば、Ｍ．Ｃａｒｒａｓｃｏ ａｎｄ Ｒ．Ｂｒｏｗｎ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６８：８８５３－８８５８（２００３）を参照されたい。Ｌ－２－アミノ－４－（アミノオキシ）酪酸などのある特定のアミノオキシ含有アミノ酸は、天然源から単離されてきた（Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ，Ｇ．，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．６０：１６３５－１６４１（１９９７））。他のアミノオキシ含有アミノ酸は、当業者によって調製され得る。
Ｄ．アジド及びアルキン反応性基
アジド及びアルキン官能基の固有の反応性は、それらを、ポリペプチド及び他の生物学的分子の選択的修飾に非常に有用なものにする。有機アジ化物、特にアルファアジド、及びアルキンは、一般的な反応性の化学条件に対して一般的に安定である。特に、アジド及びアルキン官能基の両方は、天然に存在するポリペプチドに見られる２０個の一般的なアミノ酸の側鎖（すなわち、Ｒ基）に対して不活性である。しかしながら、近接させると、アジド及びアルキン基の「バネ式（ｓｐｒｉｎｇ－ｌｏａｄｅｄ）」性質が明らかになり、それらはヒュスゲン［３＋２］環化付加反応を介して選択的かつ効率的に反応して、対応するトリアゾールを生成する。例えば、Ｃｈｉｎ Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１：９６４－７（２００３）、Ｗａｎｇ，Ｑ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５，３１９２－３１９３（２００３）、Ｃｈｉｎ，Ｊ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：９０２６－９０２７（２００２）を参照されたい。
ヒュスゲン環化付加反応は、求核置換よりも選択的環化付加反応を伴うため（例えば、Ｐａｄｗａ，Ａ．，ｉｎ ＣＯＭＰＲＥＨＥＮＳＩＶＥ ＯＲＧＡＮＩＣ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ，Ｖｏｌ．４，（ｅｄ．Ｔｒｏｓｔ，Ｂ．Ｍ．，１９９１），ｐ．１０６９－１１０９、Ｈｕｉｓｇｅｎ，Ｒ．ｉｎ １，３－ＤＩＰＯＬＡＲ ＣＹＣＬＯＡＤＤＩＴＩＯＮ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，（ｅｄ．Ｐａｄｗａ，Ａ．，１９８４），ｐ．１－１７６を参照されたい）、アジド及びアルキン含有側鎖を担持する非天然コード化アミノ酸の組み込みにより、非天然コード化アミノ酸の位置で、得られるポリペプチドを選択的に修飾することが可能となる。アジドまたはアルキン含有ＴＣを伴う環化付加反応は、触媒量で、インサイツで、Ｃｕ（ＩＩ）をＣｕ（Ｉ）に還元するための還元剤の存在下で、Ｃｕ（ＩＩ）（触媒量のＣｕＳＯ４の形態を含むがこれに限定されない）を添加することによって、水性条件下で、室温で行うことができる。例えば、Ｗａｎｇ，Ｑ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５，３１９２－３１９３（２００３）、Ｔｏｒｎｏｅ，Ｃ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６７：３０５７－３０６４（２００２）、Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４１：２５９６－２５９９（２００２）を参照されたい。例示的な還元剤としては、アスコルベート、金属銅、キニーネ、ヒドロキノン、ビタミンＫ、グルタチオン、システイン、Ｆｅ２＋、Ｃｏ２＋、及び適用電位が挙げられるが、これらに限定されない。
場合によっては、アジドとアルキンとの間のヒュスゲン［３＋２］環状付加反応が所望される場合、ＴＣは、アルキン部分を含む非天然コード化アミノ酸を含み、アミノ酸に結合される水溶性ポリマーは、アジド部分を含む。あるいは、逆反応（すなわち、アミノ酸上にアジド部分を有し、アルキン部分が水溶性ポリマー上に存在する）を実施することもできる。
アジド官能基を、アリールエステルを含有する水溶性ポリマーと選択的に反応させ、アリールホスフィン部分で適切に官能化して、アミド連結を生成することもできる。アリールホスフィン基は、アジドをインサイツで還元し、次いで、得られるアミンが近位エステル連結と効率的に反応して、対応するアミドを生成する。例えば、Ｅ．Ｓａｘｏｎ ａｎｄ Ｃ．Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７，２００７－２０１０（２０００）を参照されたい。アジド含有アミノ酸は、アルキルアジド（２－アミノ－６－アジド－１－ヘキサン酸を含むがこれに限定されない）またはアリールアジド（ｐ－アジド－フェニルアラニン）のいずれかであり得る。
アリールエステル及びホスフィン部分を含有する例示的な水溶性ポリマーは、以下のように表すことができ、
Figure 2022520792000059
式中、Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであるか、または存在しなくもよく、Ｐｈはフェニルであり、Ｗは水溶性ポリマーであり、Ｒは、Ｈ、アルキル、アリール、置換アルキル、及び置換アリール基であり得る。例示的なＲ基としては、－ＣＨ２、－Ｃ（ＣＨ３）３、－ＯＲ’、－ＮＲ’Ｒ”、－ＳＲ’、－ハロゲン、－Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－ＣＯＮＲ’Ｒ”、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、－Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ”、－ＣＮ、及び－ＮＯ２が挙げられるが、これらに限定されない。Ｒ’、Ｒ”、Ｒ’’’、及びＲ’’’’は、それぞれ独立して、水素、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換アリール（１～３個のハロゲンで置換されたアリールを含むがこれに限定されない）、置換もしくは非置換アルキル、アルコキシ、もしくはチオアルコキシ基、またはアリールアルキル基を指す。本発明の化合物が例えば２つ以上のＲ基を含む場合、Ｒ基の各々は、これらの基のうちの２つ以上が存在する場合、それぞれのＲ’、Ｒ”、Ｒ’’’、及びＲ’’’’基と同様に独立して選択される。Ｒ’及びＲ”が同じ窒素原子に結合されるとき、それらは、窒素原子と組み合わされて、５、６、または７員環を形成することができる。例えば、－ＮＲ’Ｒ”は、限定されないが、１－ピロリジニル及び４－モルホリニルを含むことを意図する。置換基の上記の考察から、当業者は、「アルキル」という用語が、水素基以外の基、例えば、ハロアルキル（－ＣＦ３及び－ＣＨ２ＣＦ３を含むがこれらに限定されない）及びアシル（－Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、－Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３などを含むが、これらに限定されない）に結合した炭素原子を含む基を含むことを意味することを理解するであろう。
アジド官能基を、チオエステルを含有する水溶性ポリマーと選択的に反応させ、アリールホスフィン部分で適切に官能化して、アミド連結を生成することもできる。アリールホスフィン基は、アジドをインサイツで還元し、次いで、得られるアミンがチオエステル連結と効率的に反応して、対応するアミドを生成する。チオエステル及びホスフィン部分を含有する例示的な水溶性ポリマーは、以下のように表すことができ、
Figure 2022520792000060
式中、ｎは、１～１０であり、Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであるか、または存在しなくてもよく、Ｐｈはフェニルであり、Ｗは、水溶性ポリマーである。
例示的なアルキン含有アミノ酸は、以下のように表すことができ、
Figure 2022520792000061
式中、ｎは、０～１０であり、Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル、または置換アリールであるか、または存在せず、Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであるか、または存在せず、ｍは、０～１０であり、Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり、Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である。いくつかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、Ｘは存在せず、ｍは０であり、アセチレン部分は、アルキル側鎖に対してパラ位に配置される。いくつかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、ＸはＯであり、ｍは１であり、プロパルギルオキシ基は、アルキル側鎖に対してパラ位（すなわち、Ｏ－プロパルギル－チロシン）に配置される。いくつかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１及びＸは存在せず、ｍは０である（すなわち、プロパリルグリシン）。
アルキン含有アミノ酸は市販されている。例えば、プロパルギルグリシンは、Ｐｅｐｔｅｃｈ（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から市販されている。あるいは、アルキン含有アミノ酸は、標準的な方法により調製することができる。例えば、ｐ－プロパルギルオキシフェニルアラニンは、例えば、Ｄｅｉｔｅｒｓ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５：１１７８２－１１７８３（２００３）に記載されるように合成され得、４－アルキニル－Ｌ－フェニルアラニンは、Ｋａｙｓｅｒ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５３（７）：２４７５－２４８４（１９９７）に記載されるように合成され得る。他のアルキン含有アミノ酸は、当業者によって調製され得る。
例示的なアジド含有アミノ酸は、以下のように表すことができ、
Figure 2022520792000062
式中、ｎは、０～１０であり、Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル、置換アリールであるか、または存在せず、Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであるか、または存在せず、ｍは、０～１０であり、Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり、Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である。いくつかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、Ｘは存在せず、ｍは０であり、アジド部分は、アルキル側鎖に対してパラ位に配置される。いくつかの実施形態において、ｎは、０～４であり、Ｒ１及びＸは存在せず、ｍ＝０である。いくつかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、ＸはＯであり、ｍは２であり、－アジドエトキシ部分は、アルキル側鎖に対してパラ位に配置される。
アジド含有アミノ酸は、商業的供給源から入手可能である。例えば、４－アジドフェニルアラニンは、Ｃｈｅｍ－Ｉｍｐｅｘ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．（Ｗｏｏｄ Ｄａｌｅ，ＩＬ）から得ることができる。市販されていないこれらのアジド含有アミノ酸に関して、アジド基は、限定されないが、好適な脱離基（ハロゲン化物、メシレート、トシレートを含むがこれらに限定されない）の置換を介して、または好適に保護されたラクトンの開口を介して、当業者に既知の標準的な方法を使用して比較的容易に調製することができる。例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｂｙ Ｍａｒｃｈ（Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８５，Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい。
Ｅ．アミノチオール反応性基
ベータ置換アミノチオール官能基の固有の反応性により、それらを、チアゾリジンの形成を介してアルデヒド基を含有するポリペプチド及び他の生物学的分子の選択的修飾に非常に有用なものにする。例えば、Ｊ．Ｓｈａｏ ａｎｄ Ｊ．Ｔａｍ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９５，１１７（１４）３８９３－３８９９を参照されたい。いくつかの実施形態において、ベータ置換アミノチオールアミノ酸は、ＴＣポリペプチドに組み込まれ、次いで、アルデヒド官能基を含む水溶性ポリマーと反応させることができる。いくつかの実施形態において、水溶性ポリマー、薬物コンジュゲート、または他のペイロードは、チアゾリジンの形成を介して、ベータ置換アミノチオールアミノ酸を含むＴＣの標的化ポリペプチドに結合され得る。
Ｆ．追加の反応性基
本発明のＴＣポリペプチドに組み込むことができる、パラ－アミノ－フェニルアラニンを含むがこれに限定されない追加の反応性基及び非天然コード化アミノ酸は、参照によりそれらのすべてが本明細書に組み込まれる以下の特許出願に記載されている：米国特許公開第２００６／０１９４２５６号、米国特許公開第２００６／０２１７５３２号、米国特許公開第２００６／０２１７２８９号、米国仮特許第６０／７５５，３３８号、米国仮特許第６０／７５５，７１１号、米国仮特許第６０／７５５，０１８号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０６／４９３９７号、ＷＯ２００６／０６９２４６、米国仮特許第６０／７４３，０４１号、米国仮特許第６０／７４３，０４０号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０６／４７８２２号、米国仮特許第６０／８８２，８１９号、米国仮特許第６０／８８２，５００号、及び米国仮特許第６０／８７０，５９４。これらの出願はまた、コンジュゲーションのための、ヒドロキシルアミン（アミノオキシ）基を含むがこれに限定されないＰＥＧまたは他のポリマー上に存在し得る反応性基について考察する。
ＴＣポリペプチド内の非天然アミノ酸の位置
本明細書に記載の方法及び組成物は、本発明のＴＣを作製するために、１つ以上の非天然アミノ酸を標的化ポリペプチドに組み込むことを含む。１つ以上の非天然アミノ酸は、標的化ポリペプチドの活性を妨害しない１つ以上の特定の位置に組み込まれ得る。これは、疎水性アミノ酸を非天然もしくは天然の疎水性アミノ酸で、かさ高のアミノ酸を非天然もしくは天然のかさ高のアミノ酸で、親水性アミノ酸を非天然もしくは天然の親水性アミノ酸で置換すること、及び／または非天然アミノ酸を活性に必要とされない位置に挿入することを含むが、これらに限定されない「保存的」置換を行うことによって達成することができる。
様々な生化学的及び構造的アプローチを用いて、ＴＣの標的化ポリペプチド内の非天然アミノ酸での置換のための所望の部位を選択することができる。いくつかの実施形態において、非天然アミノ酸は、ＴＬＲ－アゴニスト誘導体のＣ末端で連結されている。他の実施形態において、非天然アミノ酸は、ＴＬＲ－アゴニスト誘導体のＮ末端で連結されている。ＴＣの標的化ポリペプチドの任意の位置は、非天然アミノ酸を組み込むための選択に好適であり、選択は、合理的設計に基づくか、または任意のもしくは特定の所望の目的のためのランダム選択によるものであってもよい。所望の部位の選択は、限定されないが、受容体結合調節因子、受容体活性調節因子、結合剤パートナーへの結合の調節因子、結合パートナー活性調節因子、結合パートナー立体配座調節因子、二量体または多量体形成、天然分子と比較して活性または特性に対する変化なし、または可溶性、凝集、もしくは安定性などのポリペプチドの任意の物理もしくは化学特性の操作を含む、任意の所望の特性または活性を有する非天然アミノ酸ポリペプチド（さらに修飾されるか、または未修飾のままであり得る）の産生に基づき得る。あるいは、生物学的活性にとって重要であると特定された部位はまた、やはりポリペプチドに求められる所望の活性に応じて、非天然アミノ酸での置換のための好適な候補であり得る。別の代替案は、単に、非天然アミノ酸を用いてポリペプチド鎖上の各位置に連続置換を行い、ポリペプチドの活性に対する効果を観察することであろう。非天然アミノ酸での任意のポリペプチドへの置換のための位置を選択するための任意の手段、技法、または方法は、本明細書に記載の方法、技法、及び組成物において使用するのに好適である。
欠失を含有するポリペプチドの天然に存在する変異体の構造及び活性を調べて、非天然アミノ酸での置換に耐性である可能性が高いタンパク質の領域を決定することもできる。非天然アミノ酸での置換に不耐性である可能性が高い残基が排除されると、関連するポリペプチドの三次元構造、及び任意の関連するリガンドまたは結合タンパク質を含むがこれらに限定されない方法を使用して、残りの各位置での提案された置換の影響を調べることができる。多くのポリペプチドのＸ線結晶学的及びＮＭＲ構造は、タンパク質及び核酸の巨大分子の三次元構造データを含む集中データベースであるタンパク質構造データバンク（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ）（ＰＤＢ、ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ）において入手可能であり、非天然アミノ酸で置換され得るアミノ酸位置を特定するために使用することができる。加えて、三次元構造データが利用できない場合、ポリペプチドの二次及び三次構造を調査するモデルを作製してもよい。したがって、非天然アミノ酸で置換され得るアミノ酸位置の同一性を容易に得ることができる。
非天然アミノ酸の組み込みの例示的な部位としては、潜在的な受容体結合領域、または結合タンパク質もしくはリガンドへの結合のための領域から除外されるもの、完全にまたは部分的に溶媒曝露され得るもの、近くの残基との水素結合相互作用が最小限であるか、または全くないもの、近くの反応性残基に最小限に曝露され得るもの、及び／または関連する受容体、リガンド、もしくは結合タンパク質を有する特定のポリペプチドの三次元結晶構造によって予測されるように非常に柔軟な領域にあり得るものが挙げられるが、これらに限定されない。
多種多様な非天然アミノ酸を、ポリペプチド内の所与の位置に置換するか、またはその中に組み込むことができる。例として、特定の非天然アミノ酸は、その関連するリガンド、受容体、及び／または結合タンパク質を有するポリペプチドの三次元結晶構造の検査に基づいた組み込みのために選択されてもよく、保存的置換が好ましい。
一実施形態において、本明細書に記載の方法は、非天然アミノ酸をＴＣの標的化ポリペプチドに組み込むことであって、ＴＣの標的化ポリペプチドが第１の反応性基を含む、組み込むことと、ＴＣの標的化ポリペプチドを、第２の反応性基を含む分子（第２のタンパク質またはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体、抗体もしくは抗体断片、及びそれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない）と接触させることと、を含む。ある特定の実施形態において、第１の反応性基はヒドロキシルアミン部分であり、第２の反応性基はカルボニルまたはジカルボニル部分であり、それによりオキシム連結が形成される。ある特定の実施形態において、第１の反応性基はカルボニルまたはジカルボニル部分であり、第２の反応性基はヒドロキシルアミン部分であり、それによりオキシム連結が形成される。ある特定の実施形態において、第１の反応性基はカルボニルまたはジカルボニル部分であり、第２の反応性基はオキシム部分であり、それによりオキシム交換反応が生じる。ある特定の実施形態において、第１の反応性基はオキシム部分であり、第２の反応性基はカルボニルまたはジカルボニル部分であり、それによりオキシム交換反応が生じる。
場合によっては、非天然アミノ酸のＴＣ組み込み（複数可）の標的化ポリペプチドを、ポリペプチド内の他の付加、置換、または欠失と組み合わせて、他の化学的、物理的、薬理学的、及び／または生物学的形質に影響を与える。場合によっては、他の付加、置換、または欠失は、ポリペプチドの安定性（タンパク質分解に対する耐性を含むがこれに限定されない）を増加させるか、またはポリペプチドの、その適切な受容体、リガンド、及び／または結合タンパク質に対する親和性を増加させ得る。場合によっては、他の付加、置換、または欠失は、ポリペプチドの溶解性（Ｅ．ｃｏｌｉまたは他の宿主細胞で発現された場合を含むがこれらに限定されない）を増加させ得る。いくつかの実施形態において、部位は、Ｅ．ｃｏｌｉまたは他の組換え宿主細胞における発現後のポリペプチド溶解性を増加させる目的で、非天然アミノ酸の組み込みのための別の部位に加えて、天然コード化または非天然アミノ酸での置換のために選択される。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、関連するリガンド、結合タンパク質、及び／または受容体に対する親和性を調節する、受容体二量体化を調節する（限定するものではないが、増加または減少を含む）、受容体二量体を安定化する、循環半減期を調節する、放出もしくはバイオアベイラビリティを調節する、精製を促進する、または特定の投与経路を改善もしくは変更する別の付加、置換、または欠失を含む。同様に、非天然アミノ酸ポリペプチドは、検出（ＧＦＰを含むがこれに限定されない）、精製、組織もしくは細胞膜を通した輸送、プロドラッグ放出もしくは活性化、サイズ低減、またはポリペプチドの他の形質を改善する、化学もしくは酵素切断配列、プロテアーゼ切断配列、反応性基、抗体結合ドメイン（ＦＬＡＧまたはポリ－Ｈｉｓを含むがこれらに限定されない）、または他の親和性ベースの配列（ＦＬＡＧ、ポリ－Ｈｉｓ、ＧＳＴなどを含むがこれらに限定されない）、または連結された分子（ビオチンを含むがこれに限定されない）を含むことができる。
標的化部分の例としての抗ＨＥＲ２抗体
本明細書に記載の方法、組成物、戦略、及び技法は、特定の種類、クラス、またはファミリーの標的化部分ポリペプチドまたはタンパク質に限定されない。実際、実質的に任意の標的化部分ポリペプチドは、本明細書に記載のＴＣの標的化ポリペプチドを含有する少なくとも１つの「修飾されたまたは未修飾」の非天然アミノ酸を含むように設計または修飾され得る。ほんの一例として、標的化部分ポリペプチドは、アルファ－１抗トリプシン、アンギオスタチン、抗溶血因子、抗体、抗体断片、モノクローナル抗体（例えば、ベバシズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、インフリキシマブ、アダリムマブ、バシリキシマブ、ダクリズマブ、オマリズマブ、ウステキヌマブ、エタネルセプト、ゲムツズマブ、アレムツズマブ、リツキシマブ、トラスツズマブ、ニモツズマブ、パリビズマブ、及びアブシキシマブ）、アポリポタンパク質、アポタンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ－Ｘ－Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ－２、ＥＮＡ－７８、ｇｒｏ－ａ、ｇｒｏ－ｂ、ｇｒｏ－ｃ、ＩＰ－１０、ＧＣＰ－２、ＮＡＰ－４、ＳＤＦ－１、ＰＦ４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃ－ｋｉｔリガンド、ＣＣケモカイン、単球化学誘引物質タンパク質－１、単球化学誘引物質タンパク質－２、単球化学誘引物質タンパク質－３、単球炎症性タンパク質－１アルファ、単球炎症性タンパク質－ｉベータ、ＲＡＮＴＥＳ、１３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ｃ－ｋｉｔリガンド、コラーゲン、結腸刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子５ａ、補体阻害剤、補体受容体１、サイトカイン、上皮好中球活性化ペプチド－７８、ＭＩＰ－１６、ＭＣＰ－１、表皮成長因子（ＥＧＦ）、上皮好中球活性化ペプチド、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、剥離毒素、第ＩＸ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第Ｘ因子、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、４ヘリカルバンドルタンパク質、Ｇ－ＣＳＦ、ｇｌｐ－１、ＧＭ－ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、成長因子、成長因子受容体、成長ホルモン放出因子、ヘッジホッグタンパク質、ヘモグロビン、肝細胞成長因子（ｈＧＦ）、ヒルジン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト血清アルブミン、ＩＣＡＭ－１、ＩＣＡＭ－１受容体、ＬＦＡ－１ ＬＦＡ－１受容体、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、ＩＧＦ－Ｉ、ＩＧＦ－ＩＩ、インターフェロン（ＩＦＮ）、ＩＦＮ－アルファ、ＩＦＮ－ベータ、ＩＦＮ－ガンマ、インターロイキン（ＩＬ）、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病抑制因子、ルシフェラーゼ、ニュールツリン、好中球抑制因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成タンパク質、がん遺伝子産物、パラシトニン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、ＰＤ－ＥＣＧＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、プレイオトロピン、プロテインＡ、プロテインＧ、発熱性外毒素Ａ、発熱性外毒素Ｂ、発熱性外毒素Ｃ、ペプチドＹＹ（ＰＹＹ）、リラキシン、レニン、ＳＣＦ、小さな生合成タンパク質、可溶性補体受容体Ｉ、可溶性Ｉ－ＣＡＭ １、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、超抗原、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌエンテロトキシン、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ステロイドホルモン受容体、スーパーオキシドジスムターゼ、毒素性ショック症候群毒素、サイモシンアルファ１、組織プラスミノーゲン活性化因子、腫瘍成長因子（ＴＧＦ）、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子アルファ、腫瘍壊死因子ベータ、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＶＬＡ－４タンパク質、ＶＣＡＭ－１タンパク質、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ウロキナーゼ、ｍｏｓ、ｒａｓ、ｒａｆ、ｍｅｔ、ｐ５３、ｔａｔ、ｆｏｓ、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｍｙｂ、ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、テストステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体、及びコルチコステロンからなる群から選択される治療用タンパク質と同種であり得る。
一実施形態においては、乳癌、小細胞肺癌、卵巣癌、子宮内膜癌、膀胱癌、頭頸部癌、前立腺癌、胃癌、子宮頸癌、子宮癌、食道癌、及び結腸癌からなる群から選択されるＨＥＲ－２を過剰発現する固形腫瘍を治療するための方法である。別の実施形態において、固形腫瘍は、乳癌である。さらなる実施形態において、固形腫瘍は、卵巣癌である。
したがって、トラスツズマブの以下の説明は、例示の目的のため、及びほんの一例として提供され、本明細書に記載の方法、組成物、戦略、及び技法の範囲を限定するものではない。さらに、本出願におけるトラスツズマブへの言及は、任意の抗体の例として一般用語を使用することを意図する。したがって、トラスツズマブに関して本明細書に記載される修飾及び化学は、本明細書に具体的に列記されるものを含む、任意の抗体またはモノクローナル抗体に等しく適用され得ることを理解されたい。
トラスツズマブは、ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体の細胞外セグメントのドメインＩＶに結合するヒト化モノクローナル抗体である。ＨＥＲ２遺伝子（ＨＥＲ２／ｎｅｕ及びＥｒｂＢ２遺伝子としても知られる）は、早期乳癌の２０～３０％で増幅され、それを過剰発現させる。また、がんにおいて、ＨＥＲ２は、マイトジェンが到達せずにシグナルを送り、任意の受容体に結合し、それを過剰に活性化し得る。
ＨＥＲ２は細胞膜を通って伸長し、細胞の外部から内部へシグナルを伝達する。健康な人では、マイトジェンと呼ばれるシグナル伝達化合物が細胞膜に到達し、受容体のＨＥＲファミリーの他のメンバーの外部に結合する。次いで、これらの結合した受容体は、ＨＥＲ２と連結（二量体化）し、それを活性化する。次いで、ＨＥＲ２は細胞の内部にシグナルを送る。シグナルは異なる生化学的経路を通過する。これには、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路及びＭＡＰＫ経路が含まれる。これらのシグナルは、細胞の侵入、生存、及び血管の成長（血管新生）を促進する。
トラスツズマブで処理された細胞は、細胞周期のＧ１期中に阻止するため、増殖が低減する。トラスツズマブは、ＨＥＲ２／ｎｅｕの下方調節によってその効果の一部を誘導し、下流のＰＩ３Ｋカスケードを通じて受容体の二量体化及びシグナル伝達の破壊をもたらすことが示唆されている。次いで、Ｐ２７Ｋｉｐ１は、リン酸化されず、核に入り、ｃｄｋ２活性を阻害することができ、細胞周期を阻止させる。また、トラスツズマブは、抗血管新生因子の誘導及び血管新生促進因子の抑制の両方によって血管新生を抑制する。がんにおいて観察される無制御な成長への寄与は、細胞外ドメインの放出をもたらすＨＥＲ２／ｎｅｕのタンパク質分解切断による可能性があると考えられる。トラスツズマブは、乳癌細胞におけるＨＥＲ２／ｎｅｕ外部ドメイン切断を阻害することが示されている。
非真核生物及び真核生物における発現
クローニングされたＴＣポリヌクレオチドの高レベルの発現を得るために、典型的には、本発明のＴＣポリペプチドの標的化ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、転写を指向する強力なプロモーター、転写／翻訳ターミネーター、及びタンパク質をコードする核酸の場合は翻訳開始のためのリボソーム結合部位を含有する発現ベクターにサブクローニングする。好適な細菌プロモーターは、当業者に既知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．に記載されている。
本発明のＴＣポリペプチドを発現するための細菌発現系は、限定されないが、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａ含むこれらにおいて利用可能である（Ｐａｌｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ２２：２２９－２３５（１９８３）、Ｍｏｓｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３０２：５４３－５４５（１９８３）。そのような発現系のためのキットは市販されている。哺乳類細胞、酵母、及び昆虫細胞の真核生物発現系は、当業者に既知であり、また、市販されている。直交ｔＲＮＡ及びアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（上述）を使用して、本発明のＴＣポリペプチドを発現する場合、発現のための宿主細胞は、直交構成要素を使用するそれらの能力に基づいて選択される。例示的な宿主細胞としては、グラム陽性細菌（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、またはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓを含むがこれらに限定されない）、ならびにグラム陰性細菌（Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、ならびに酵母及び他の真核細胞が挙げられる。Ｏ－ｔＲＮＡ／Ｏ－ＲＳ対を含む細胞は、本明細書に記載されるように使用され得る。
本発明の真核宿主細胞または非真核宿主細胞は、非天然アミノ酸を有益に大量に含むタンパク質を合成する能力を提供する。一態様において、組成物は、任意に、少なくとも１０マイクログラム、少なくとも５０マイクログラム、少なくとも７５マイクログラム、少なくとも１００マイクログラム、少なくとも２００マイクログラム、少なくとも２５０マイクログラム、少なくとも５００マイクログラム、少なくとも１ミリグラム、少なくとも１０ミリグラム、少なくとも１００ミリグラム、少なくとも１グラム以上の、非天然アミノ酸を含むタンパク質、またはインビボでのタンパク質産生方法で達成可能な量を含むが、これらに限定されない（組み換えタンパク質の産生及び精製の詳細は、本明細書に提供される）。別の態様において、タンパク質は、任意に、細胞溶解物、緩衝液、医薬緩衝液、または他の液体懸濁液（約１ｎｌ～約１００Ｌ以上の間の体積を含むが、これらに限定されない）を含むが、これらに限定されないものにおいて、１リットル当たり少なくとも１０マイクログラムのタンパク質、１リットル当たり少なくとも５０マイクログラムのタンパク質、１リットル当たり少なくとも７５マイクログラムのタンパク質、１リットル当たり少なくとも１００マイクログラムのタンパク質、１リットル当たり少なくとも２００マイクログラムのタンパク質、１リットル当たり少なくとも２５０マイクログラムのタンパク質、１リットル当たり少なくとも５００マイクログラムのタンパク質、１リットル当たり１ミリグラムのタンパク質、または１リットル当たり少なくとも１０ミリグラムのタンパク質以上を含むがこれらに限定されない濃度で、組成物中に存在する。本発明の特徴は、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む真核細胞におけるタンパク質の大量産生（インビトロ翻訳を含むがこれに限定されない他の方法で典型的に可能な量を超えることを含むがこれに限定されない）である。
ＴＣポリペプチドの標的化ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列には、シグナルペプチドをコードする配列が含まれていても、含まれていなくてもよい。シグナルペプチドは、ポリペプチドが発現する細胞から分泌される場合に存在する。そのようなシグナルペプチドは、任意の配列であり得る。シグナルペプチドは、原核生物であっても真核生物であってもよい。Ｃｏｌｏｍａ，Ｍ（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １５２：８９ １０４）は、哺乳類細胞において使用するためのシグナルペプチド（マウスＩｇカッパ軽鎖シグナルペプチド）を記載している。他のシグナルペプチドには、Ｓ．Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのアルファ因子シグナルペプチド（米国特許第４，８７０，００８号、参照により本明細書に組み込まれる）、マウス唾液アミラーゼのシグナルペプチド（Ｏ．Ｈａｇｅｎｂｕｃｈｌｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，２８９，１９８１，ｐｐ．６４３－６４６）、修飾されたカルボキシペプチダーゼシグナルペプチド（Ｌ．Ａ．Ｖａｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ４８，１９８７，ｐｐ．８８７－８９７）、酵母ＢＡＲ１シグナルペプチド（ＷＯ８７／０２６７０、参照により本明細書に組み込まれる）、及び酵母アスパラギン酸プロテアーゼ３（ＹＡＰ３）シグナルペプチド（Ｍ．Ｅｇｅｌ－Ｍｉｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｙｅａｓｔ，６，１９９０，ｐｐ．１２７－１３７を参照）が含まれるが、これらに限定されない。
適切な哺乳類宿主細胞の例は、当業者に既知である。そのような宿主細胞は、組織培養における、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えば、ＣＨＯ－Ｋ１；ＡＴＣＣ ＣＣＬ－６１）、ミドリザル細胞（ＣＯＳ）（例えば、ＣＯＳ１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６５０）、ＣＯＳ７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６５１））、マウス細胞（例えば、ＮＳ／Ｏ）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞株（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６３２またはＡＴＣＣ ＣＣＬ－１０）、及びヒト細胞（例えば、ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５７３））、ならびに植物細胞であり得る。これらの細胞株及び他の細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．などの公共保管所から入手可能である。ＴＣポリペプチドの改善されたグリコシル化を提供するために、哺乳類宿主細胞は、例えば、米国特許第５，０４７，３３５号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、シアリルトランスフェラーゼ、例えば、１，６－シアリルトランスフェラーゼを発現するように修飾され得る。
外因性ＤＮＡを哺乳類宿主細胞に導入するための方法は、これらに限定されないが、リン酸カルシウム媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性トランスフェクション、リポソーム媒介性トランスフェクション、ウイルスベクター、ならびにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ ２０００を使用した、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫにより記載されるトランスフェクション方法、及びＦｕＧＥＮＥ ６を使用したＲｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＵＳＡにより記載されるトランスフェクション方法を含むが、これらに限定されない。これらの方法は、当該技術分野において周知であり、Ａｕｓｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），１９９６，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡによって記載される。哺乳類細胞の培養は、確立された方法、例えば、（Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｎｉｇｅｌ Ｊｅｎｋｉｎｓ，１９９９，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，ＵＳＡ及びＨａｒｒｉｓｏｎ Ｍａｓｓ．ａｎｄ Ｒａｅ ＩＦ，Ｇｅｎｅｒａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９７）に開示される確立された方法により実施され得る。
Ｉ．Ｅ．Ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、及び他の原核生物 細菌発現技法が当業者に既知である。多種多様なベクターが、細菌宿主における使用に利用可能である。ベクターは、単一のコピーまたは低もしくは高マルチコピーベクターであり得る。ベクターは、クローニング及び／または発現のために機能し得る。ベクターに関する豊富な文献、多くのベクターの商業的利用可能性、さらにはベクター及びその制限マップ及び特徴を説明するマニュアルを考慮すると、ここでは広範な考察を必要としない。周知のように、ベクターは通常、選択を可能にするマーカーを伴い、このマーカーは、細胞傷害性剤耐性、原栄養性、または免疫を提供し得る。多くの場合、異なる特徴を提供する複数のマーカーが存在する。
細菌プロモーターは、細菌ＲＮＡポリメラーゼを結合し、コード配列（例えば構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流（３’）転写を開始することができる任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、コード配列の５’末端の近位に通常配置される転写開始領域を有する。この転写開始領域は、典型的には、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位及び転写開始部位を含む。細菌プロモーターはまた、ＲＮＡ合成が始まる隣接するＲＮＡポリメラーゼ結合部位と重複し得るオペレーターと呼ばれる第２のドメインも有し得る。遺伝子リプレッサータンパク質は、オペレーターに結合し、それにより特定の遺伝子の転写を阻害し得るため、オペレーターは、負に調節された（誘導可能な）転写を可能にする。構成的発現は、オペレーターなどの負の調節要素の不在下で生じ得る。加えて、正の調節は、存在する場合、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合配列に近位（５’）である遺伝子活性化タンパク質結合配列によって達成され得る。遺伝子活性化タンパク質の例は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるｌａｃオペロンの転写を開始するのに役立つカタボライト活性化因子タンパク質（ＣＡＰ）である（Ｒａｉｂａｕｄ ｅｔ ａｌ．，ＡＮＮＵ．ＲＥＶ．ＧＥＮＥＴ．（１９８４）１８：１７３を参照されたい）。したがって、調節された発現は、正または負のいずれかであり得、それにより、転写を増強または低減する。
「細菌宿主」または「細菌宿主細胞」という用語は、組換えベクターまたは他のトランスファーＤＮＡのレシピエントとして使用され得るか、または使用されてきた細菌を指す。この用語は、トランスフェクトされた元の細菌宿主細胞の子孫を含む。単一の親細胞の子孫は、偶発的または意図的な変異により、必ずしも、形態、または元の親に対して相補的なゲノムもしくは全ＤＮＡが完全に同一ではない場合があることを理解されたい。ＴＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の存在など、関連する特性によって特徴付けられる親と十分に類似している親細胞の子孫は、この定義によって意図される子孫に含まれる。
ＴＣポリペプチドの発現に好適な宿主細菌の選択は、当業者に既知である。発現のための細菌宿主の選択において、好適な宿主は、とりわけ、良好な封入体形成能、低タンパク質分解活性、及び全体的な堅牢性を有することが示されるものを含み得る。細菌宿主は、一般に、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）及びｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（“ＡＴＣＣ”）（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を含むがこれらに限定されない様々な供給源から入手可能である。工業／医薬発酵は、一般に、Ｋ株（例えばＷ３１１０）に由来する細菌、またはＢ株（例えばＢＬ２１）に由来する細菌を使用する。これらの株は、それらの成長パラメータが非常に周知で堅牢であるため、特に有用である。加えて、これらの株は非病原性であり、安全性及び環境的な理由から商業的に重要である。好適なＥ．ｃｏｌｉ宿主の他の例としては、ＢＬ２１、ＤＨ１０Ｂ、またはそれらの誘導体の株が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の方法の別の実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主は、ＯＭＰ－及びＬＯＮ－を含むがこれらに限定されないプロテアーゼマイナス株である。宿主細胞株は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａを含むがこれらに限定されないＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種であり得る。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ｂｉｏｖａｒ １、指定株ＭＢ１０１は、組換え産生に有用であり、治療用タンパク質産生プロセスに利用可能であることが知られている。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ発現系の例は、宿主株としてＴｈｅ Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙから入手可能な系（Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ、ｔｈｅ ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ ｗｅｂ ａｔ ｄｏｗ．ｃｏｍで入手可能）を含む。
組換え宿主細胞株が確立されると（すなわち、発現構築物が宿主細胞に導入され、適切な発現構築物を有する宿主細胞が単離される）、組換え宿主細胞株を、ＴＣポリペプチドの産生に適切な条件下で培養する。当業者には明らかであるように、組換え宿主細胞株の培養方法は、利用される発現構築物の性質及び宿主細胞の同一性に依存する。組換え宿主株は、通常、当業者に既知の方法を使用して培養される。組換え宿主細胞は、典型的には、炭素、窒素、及び無機塩の同化可能な源を含有し、任意に、ビタミン、アミノ酸、成長因子、及び当業者に既知の他のタンパク質性培養サプリメントを含有する液体培地中で培養される。宿主細胞の培養のための液体培地は、任意に、望ましくない微生物の成長を防止するための抗生物質もしくは抗真菌剤、及び／または発現ベクターを含有する宿主細胞を選択するための抗生物質を含むがこれに限定されない化合物を含有し得る。
組換え宿主細胞は、バッチまたは連続的な形式のいずれかで、細胞採取（ＴＣポリペプチドが細胞内で蓄積する場合）または培養上清の採取のいずれかを伴って、バッチまたは連続的な形式で培養され得る。原核宿主細胞における産生のために、バッチ培養及び細胞採取が好ましい。
本発明のＴＣポリペプチドは、通常、組換え系において発現後に精製される。ＴＣポリペプチドは、当該技術分野において既知の様々な方法によって宿主細胞または培養培地から精製され得る。細菌宿主細胞で産生されるＴＣポリペプチドは、難溶性であっても不溶性であってもよい（封入体の形態で）。本発明の一実施形態において、アミノ酸置換は、本明細書に開示される方法及び当該技術分野で既知の方法を利用して、組換え産生されたタンパク質の溶解性を増加させる目的で選択されるＴＣポリペプチドにおいて容易に行うことができる。不溶性タンパク質の場合、タンパク質は遠心分離によって宿主細胞溶解物から収集され得、さらに細胞の均質化が続き得る。難溶性タンパク質の場合、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含むがこれに限定されない化合物を添加して、部分的に可溶性のタンパク質の沈殿を誘導することができる。次いで、沈殿したタンパク質は、遠心分離によって便利に収集され得る。組換え宿主細胞は、当業者に既知の様々な方法を使用して、細胞内から封入体を放出するように破壊または均質化され得る。宿主細胞の破壊または均質化は、酵素細胞破壊、超音波処理、ダウンス均質化、または高圧放出破壊を含むが、これらに限定されない周知の技法を使用して実施され得る。本発明の方法の一実施形態において、高圧放出技法を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞を破壊し、ＴＣポリペプチドの封入体を放出する。ＴＣポリペプチドの封入体を取り扱う場合、可溶化、機械的剪断、またはタンパク質分解などの要因による損失なしに封入体の収率を最大にするために、反復における均質化時間を最小限にすることが有利であり得る。
次いで、不溶性または沈殿したＴＣポリペプチドを、当該技術分野で既知のいくつかの好適な可溶化剤のうちのいずれかを使用して可溶化してもよい。ＴＣポリペプチドは、尿素またはグアニジン塩酸塩で可溶化され得る。可溶化ＴＣポリペプチドの体積は、便利に管理可能なバッチサイズを使用して大きなバッチを産生することができるように最小限にする必要がある。この要因は、組換え宿主が数千リットルの体積のバッチで成長し得る大規模な商業的環境において顕著であり得る。加えて、ＴＣポリペプチドを、特にヒトの医薬用途のために、大規模な商業的環境で製造する場合、機械及び容器、またはタンパク質製品自体を損傷する可能性のある刺激の強い化学物質の回避は、可能であれば、避けるべきである。本発明の方法において、より刺激の強い変性剤グアニジン塩酸塩の代わりに、より刺激の少ない変性剤尿素を使用して、ＴＣポリペプチド封入体を可溶化することが示されている。尿素の使用は、ＴＣポリペプチド封入体を効率的に可溶化しながら、ＴＣポリペプチドの製造及び精製プロセスで利用されるステンレス鋼装置への損傷のリスクを大幅に低減する。
ＴＣタンパク質の可溶性標的化ポリペプチドの場合、ＴＣの標的化ポリペプチドは、細胞質周辺腔または培養培地中に分泌され得る。加えて、可溶性ＴＣは、宿主細胞の細胞質に存在してもよい。精製ステップを実施する前に、可溶性ＴＣを濃縮することが望ましい場合がある。当業者に既知の標準的な技法を使用して、例えば、細胞溶解物または培養培地から可溶性標的化ポリペプチドを濃縮することができる。加えて、当業者に知られている標準的な技法を使用して、宿主細胞を破壊し、宿主細胞の細胞質または細胞質周辺腔から可溶性ＴＣを放出してもよい。
一般に、発現されたポリペプチドを変性及び還元して、次いでポリペプチドを好ましい立体配座にリフォールディングすることが時折望ましい。例えば、グアニジン、尿素、ＤＴＴ、ＤＴＥ、及び／またはシャペロニンを、関心の翻訳産物に添加することができる。タンパク質を還元、変性、及び再生する方法は、当業者に既知である（上記の参考文献、ならびにＤｅｂｉｎｓｋｉ，ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：１４０６５－１４０７０、Ｋｒｅｉｔｍａｎ ａｎｄ Ｐａｓｔａｎ（１９９３）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．，４：５８１－５８５、及びＢｕｃｈｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０５：２６３－２７０を参照されたい）。Ｄｅｂｉｎｓｋｉらは、例えば、グアニジン－ＤＴＥにおける封入体タンパク質の変性及び還元について記載している。タンパク質は、酸化されたグルタチオン及びＬ－アルギニンを含むがこれらに限定されない酸化還元緩衝液中でリフォールディングされ得る。リフォールディング試薬は、１つ以上のポリペプチドまたは他の発現産物と接触するように流されるか、さもなければ移動させることができ、逆もまた同様である。
ＴＣポリペプチドの原核生物産生の場合、このようにして産生されたＴＣポリペプチドは、ミスフォールディングされ得、したがって、生物学的活性を欠くか、またはそれが低減され得る。タンパク質の生物活性は、「リフォールディング」によって回復させることができる。一般に、ミスフォールディングされたＴＣポリペプチドは、例えば、１つ以上のカオトロピック剤（例えば、尿素及び／またはグアニジン）及びジスルフィド結合を還元することができる還元剤（例えば、ジチオスレイトール、ＤＴＴ、または２－メルカプトエタノール、２－ＭＥ）を使用して、ポリペプチド鎖を可溶化（ＴＣポリペプチドも不溶性である）、アンフォールディング、及び還元することによってリフォールディングされる。中濃度のカオトロープでは、次いで酸化剤（例えば、酸素、シスチン、またはシスタミン）が添加され、これによりジスルフィド結合の再形成が可能になる。ＴＣポリペプチドは、米国特許第４，５１１，５０２号、同第４，５１１，５０３号、及び同第４，５１２，９２２号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるものなどの、当該技術分野で既知の標準的な方法を使用してリフォールディングされ得る。ＴＣポリペプチドは、他のタンパク質とコフォールディングされて、ヘテロ二量体またはヘテロ多量体を形成してもよい。
リフォールディング後、ＴＣの標的化ポリペプチドをさらに精製してもよい。ＴＣの精製は、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィーなど、またはそれらの任意の組み合わせを含む、当業者に既知の様々な技法を使用して達成され得る。さらなる精製には、精製したタンパク質を乾燥または沈殿させるステップも含まれ得る。
精製後、ＴＣの標的化ポリペプチドは、限定されないが、透析濾過及び透析を含む、当該技術分野で既知の様々な方法のうちのいずれかによって、異なる緩衝液に交換され、及び／または濃縮され得る。単一の精製タンパク質として提供されるＴＣは、凝集及び沈殿に供されてよい。
ＴＣの精製された標的化ポリペプチドは、少なくとも９０％純粋（逆相高速液体クロマトグラフィー、ＲＰ－ＨＰＬＣ、またはドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより測定される）、または少なくとも９５％純粋、または少なくとも９６％純粋、または少なくとも９７％純粋、または少なくとも９８％純粋、または少なくとも９９％以上純粋であり得る。ＴＣの標的化ポリペプチドの純度の正確な数値にかかわらず、ＴＣの標的化ポリペプチドは、医薬製品として使用するため、またはＰＥＧなどの水溶性ポリマーとのコンジュゲーションなどのさらなる処理のために十分に純粋である。
ある特定のＴＣ分子は、他の活性成分もしくはタンパク質（賦形剤、担体、及び安定剤、血清アルブミン以外）の不在下で治療剤として使用され得るか、またはそれらは、別のタンパク質もしくはポリマーと複合体化され得る。
以前に、非天然アミノ酸は、所望のアンバーナンセンス変異を含有する遺伝子でプログラムされたタンパク質合成反応に化学的にアミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡを添加することによって、インビトロでタンパク質に部位特異的に組み込むことができることが示された。これらのアプローチを使用して、特定のアミノ酸に栄養要求性の株を使用して、一般的な２０個のアミノ酸のいくつかを、密接な構造相同体で置換することができ、例えば、フェニルアラニンの代わりにフルオロフェニルアラニンを使用することができる。例えば、Ｎｏｒｅｎ，Ｃ．Ｊ．，Ａｎｔｈｏｎｙ－Ｃａｈｉｌｌ，Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，Ｍ．Ｃ．，Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１８２－１８８（１９８９）、Ｍ．Ｗ．Ｎｏｗａｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８：４３９－４２（１９９５）、Ｂａｉｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｇｌａｂｅ，Ｃ．Ｇ．，Ｄｉｘ，Ｔ．Ａ．，Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ，Ａ．Ｒ．，Ｄｉａｌａ，Ｅ．Ｓ．Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｎ－ｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｉｎｔｏ ａ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ，Ｊ．Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ，１１１：８０１３－８０１４（１９８９）、Ｎ．Ｂｕｄｉｓａ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．１３：４１－５１（１９９９）、Ｅｌｌｍａｎ，Ｊ．Ａ．，Ｍｅｎｄｅｌ，Ｄ．，Ａｎｔｈｏｎｙ－Ｃａｈｉｌｌ，Ｓ．，Ｎｏｒｅｎ，Ｃ．Ｊ．，Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ．，ｖｏｌ．２０２，３０１－３３６（１９９２）、及びＭｅｎｄｅｌ，Ｄ．，Ｃｏｒｎｉｓｈ，Ｖ．Ｗ．＆Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｗｉｔｈ ａｎ Ｅｘｐａｎｄｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｔｒｕｃｔ．２４，４３５－６２（１９９５）を参照されたい。
例えば、終止コドンＵＡＧを認識し、非天然アミノ酸で化学的にアミノアシル化したサプレッサーｔＲＮＡを調製した。従来の部位特異的変異誘発を使用して、タンパク質遺伝子内の関心の部位に終止コドンＴＡＧを導入した。例えば、Ｓａｙｅｒｓ，Ｊ．Ｒ．，Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｗ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．５’－３’Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ－ｂａｓｅｄ ｏｌｉｇｎｏｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｓｉｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１６（３）：７９１－８０２（１９８８）を参照されたい。アシル化サプレッサーｔＲＮＡ及び変異遺伝子をインビトロ転写／翻訳系で組み合わせた場合、非天然アミノ酸は、指定位置にそのアミノ酸を含有するタンパク質をもたらすＵＡＧコドンに応答して組み込まれた。［３Ｈ］－Ｐｈｅを使用した実験及びα－ヒドロキシ酸を用いた実験は、所望のアミノ酸のみがＵＡＧコドンによって指定された位置に組み込まれ、このアミノ酸がタンパク質中の任意の他の部位に組み込まれないことを示した。例えば、Ｎｏｒｅｎ，ｅｔ ａｌ．、上記、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０（６）：４２５－４３２及びＥｌｌｍａｎ，Ｊ．Ａ．，Ｍｅｎｄｅｌ，Ｄ．，Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｂａｃｋｂｏｎｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５（５０４１）：１９７－２００（１９９２）を参照されたい。
ｔＲＮＡは、化学的または酵素的アミノアシル化を含むがこれらに限定されない任意の方法または技法によって所望のアミノ酸でアミノアシル化され得る。
アミノアシル化は、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素によって、またはリボザイムを含むがこれに限定されない他の酵素分子によって達成され得る。「リボザイム」という用語は、「触媒ＲＮＡ」と交換可能である。Ｃｅｃｈ及び同僚（Ｃｅｃｈ，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３６：１５３２－１５３９、ＭｃＣｏｒｋｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｃｏｎｃｅｐｔｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：２２１－２２６）は、触媒（リボザイム）として作用することができる天然に存在するＲＮＡの存在を示した。しかしながら、これらの天然ＲＮＡ触媒は、切断及びスプライシングのためのリボ核酸基質に作用することのみが示されているが、最近のリボザイムの人工進化の開発は、触媒作用のレパートリーを種々の化学反応に拡大している。研究により、アミノアシル－ＲＮＡ結合を自ら（２’）３’末端で触媒することができるＲＮＡ分子（Ｉｌｌａｎｇａｋｅｋａｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：６４３－６４７）、及びアミノ酸を１つのＲＮＡ分子から別のＲＮＡ分子に移行することができるＲＮＡ分子（Ｌｏｈｓｅ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ ３８１：４４２－４４４）が特定されている。
参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００３／０２２８５９３号は、リボザイムを構築する方法、及び天然コード化アミノ酸及び非天然コード化アミノ酸によるｔＲＮＡのアミノアシル化におけるそれらの使用を記載する。リボザイムを含むがこれに限定されない、ｔＲＮＡをアミノアシル化することができる酵素分子の基質固定化形態は、アミノアシル化産物の効率的な親和性精製を可能にし得る。好適な基質の例としては、アガロース、セファロース、及び磁気ビーズが挙げられる。アミノアシル化のためのリボザイムの基質固定化形態の産生及び使用は、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００３，１０：１０７７－１０８４及び米国特許出願公開第２００３／０２２８５９３号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
化学的アミノアシル化方法としては、Ｈｅｃｈｔ及び同僚（Ｈｅｃｈｔ，Ｓ．Ｍ．Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．１９９２，２５，５４５、Ｈｅｃｋｌｅｒ，Ｔ．Ｇ．；Ｒｏｅｓｓｅｒ，Ｊ．Ｒ．；Ｘｕ，Ｃ．；Ｃｈａｎｇ，Ｐ．；Ｈｅｃｈｔ，Ｓ．Ｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８８，２７，７２５４、Ｈｅｃｈｔ，Ｓ．Ｍ．；Ａｌｆｏｒｄ，Ｂ．Ｌ．；Ｋｕｒｏｄａ，Ｙ．；Ｋｉｔａｎｏ，Ｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７８，２５３，４５１７）、及びＳｃｈｕｌｔｚ、Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ、Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙら（Ｃｏｒｎｉｓｈ，Ｖ．Ｗ．；Ｍｅｎｄｅｌ，Ｄ．；Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．１９９５，３４，６２１、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｓ．Ａ．；Ｅｌｌｍａｎ，Ｊ．Ａ．；Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９１，１１３，２７２２、Ｎｏｒｅｎ，Ｃ．Ｊ．；Ａｎｔｈｏｎｙ－Ｃａｈｉｌｌ，Ｓ．Ｊ．；Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，Ｍ．Ｃ．；Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８９，２４４，１８２、Ｂａｉｎ，Ｊ．Ｄ．；Ｇｌａｂｅ，Ｃ．Ｇ．；Ｄｉｘ，Ｔ．Ａ．；Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ，Ａ．Ｒ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８９，１１１，８０１３、Ｂａｉｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ １９９２，３５６，５３７、Ｇａｌｌｉｖａｎ，Ｊ．Ｐ．；Ｌｅｓｔｅｒ，Ｈ．Ａ．；Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ，Ｄ．Ａ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１９９７，４，７４０、Ｔｕｒｃａｔｔｉ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６，２７１，１９９９１、Ｎｏｗａｋ，Ｍ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５，２６８，４３９、Ｓａｋｓ，Ｍ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６，２７１，２３１６９、Ｈｏｈｓａｋａ，Ｔ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９９，１２１，３４）により導入されたものが挙げられるが、これらに限定されない。そのような方法または他の化学的アミノアシル化方法を使用して、ｔＲＮＡ分子をアミノアシル化してもよい。
触媒ＲＮＡを生成する方法は、ランダム化リボザイム配列の別個のプールを生成すること、プール上で指向性進化を実施すること、望ましいアミノアシル化活性についてプールをスクリーニングすること、及び所望のアミノアシル化活性を示すそれらのリボザイムの配列を選択することを伴い得る。
再構成された翻訳系も使用され得る。精製された翻訳因子の混合物は、ｍＲＮＡを、タンパク質、ならびに溶解物または開始因子－１（ＩＦ－１）、ＩＦ－２、ＩＦ－３（αまたはβ）、伸長因子Ｔ（ＥＦ－Ｔｕ）、もしくは終結因子などの精製された翻訳因子で補充された溶解物の組み合わせに翻訳するためにも良好に使用されている。細胞を含まない系も、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９９３）（参照により本明細書に具体的に組み込まれる）に記載されるように、ＤＮＡが系に導入され、ｍＲＮＡに転写され、ｍＲＮＡが翻訳される、結合転写／翻訳系であり得る。真核生物転写系で転写されるＲＮＡは、ヘテロ核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）または５’末端キャップ（７－メチルグアノシン）、及び３’末端ポリＡ尾部成熟ｍＲＮＡの形態であってよく、これはある特定の翻訳系において利点であり得る。例えば、キャップされたｍＲＮＡは、網状赤血球溶解物系において高効率で翻訳される。
ＴＣポリペプチドに結合された巨大分子ポリマー
本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドに対する様々な修飾は、本明細書に記載の組成物、方法、技法、及び戦略を使用して行われ得る。これらの修飾には、標識、染料、ポリマー、水溶性ポリマー、ポリエチレングリコールの誘導体、光架橋剤、放射性核種、細胞傷害性化合物、薬物、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物、樹脂、第２のタンパク質またはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体、抗体もしくは抗体断片、金属キレート剤、補因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスポリヌクレオチド、糖、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、阻害性リボ核酸、生体材料、ナノ粒子、スピン標識、フルオロフォア、金属含有部分、放射性部分、新規官能基、他の分子と共有結合的もしくは非共有結合的に相互作用する基、光ケージ化部分、アクチン放射線励起部分、光異性化可能部分、ビオチン、ビオチン誘導体、ビオチン類似体、重原子を組み込んだ部分、化学的に切断可能な基、光切断可能な基、細長い側鎖、炭素連結された糖、酸化還元活性剤、アミノチオ酸、毒性部分、同位体標識された部分、生物物理学的プローブ、リン光基、化学発光基、電子密集基、磁性基、挿入基、発色団、エネルギー移動剤、生物学的活性剤、検出可能な標識、小分子、量子ドット、ナノ伝達物質、放射性ヌクレオチド、放射性伝達物質、中性子捕捉剤、または上記の任意の組み合わせ、あるいは任意の他の望ましい化合物または物質を含むが、これらに限定されない、ポリペプチドの非天然アミノ酸構成要素上へのさらなる官能性の組み込みが含まれる。本明細書に記載の組成物、方法、技法、及び戦略の例示的な非限定的な例として、以下の説明は、本明細書に記載の組成物、方法、技法、及び戦略もまた、上記に列記されるものを含むが、これらに限定されない他の官能性を追加することに適用可能である（必要に応じて適切な修飾により、そして本明細書の開示により当業者が作製することができる）と理解した上で、巨大分子ポリマーを非天然アミノ酸ポリペプチドに付加することに焦点を当てる。
多種多様な巨大分子ポリマー及び他の分子を本発明のＴＣポリペプチドに連結して、ＴＣポリペプチドの生物学的特性を調節し、及び／またはＴＣ分子に新しい生物学的特性を提供することができる。これらの巨大分子ポリマーは、天然コード化アミノ酸を介して、非天然コード化アミノ酸を介して、または天然もしくは非天然アミノ酸の任意の官能性置換基、または天然もしくは非天然アミノ酸に付加された任意の置換基もしくは官能基を介して、ＴＣポリペプチドに連結され得る。ポリマーの分子量は、約１００Ｄａ～約１００，０００Ｄａ以上を含むがこれらに限定されない、広範囲のものであり得る。ポリマーの分子量は、約１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、１，０００Ｄａ、９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００Ｄａ、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａ、及び１００Ｄａを含むがこれらに限定されない、約１００Ｄａ～約１００，０００Ｄａであり得る。いくつかの実施形態において、ポリマーの分子量は、約１００Ｄａ～約５０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態において、ポリマーの分子量は、約１００Ｄａ～約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態において、ポリマーの分子量は、約１，０００Ｄａ～約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態において、ポリマーの分子量は、約５，０００Ｄａ～約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態において、ポリマーの分子量は、約１０，０００Ｄａ～約４０，０００Ｄａである。
本発明は、ポリマー：タンパク質コンジュゲートの実質的に均質な調製物を提供する。本明細書で使用される場合、「実質的に均質な」とは、ポリマー：タンパク質コンジュゲート分子が総タンパク質の半分を超えることが観察されることを意味する。ポリマー：タンパク質コンジュゲートは、生物学的活性を有し、本明細書に提供される本「実質的に均質な」ＰＥＧ化ＴＣポリペプチド調製物は、均質な調製物の利点、例えば、ロット間薬物動態の予測可能性における臨床応用の容易さを示すのに十分に均質なものである。
ポリマー：タンパク質コンジュゲート分子の混合物を調製することを選択することもでき、本明細書で提供される利点は、混合物に含めるモノポリマー：タンパク質コンジュゲートの割合を選択することができることである。したがって、所望する場合、結合された種々の数のポリマー部分（すなわち、ジ、トリ、テトラなど）を有する種々のタンパク質の混合物を調製し、本発明の方法を使用して調製されたモノポリマー：タンパク質コンジュゲートと該コンジュゲートを組み合わせ、所定の割合のモノポリマー：タンパク質コンジュゲートを有する混合物を有することができる。
選択されたポリマーは、それが結合しているタンパク質が生理学的環境などの水性環境で沈殿しないように水溶性であり得る。ポリマーは、分枝状または非分枝状であり得る。最終製品の調製物の治療用途のために、ポリマーは、医薬的に許容される。
ポリマーの例としては、ポリアルキルエーテル及びそのアルコキシキャップされた類似体（例えば、ポリオキシエチレングリコール、ポリオキシエチレン／プロピレングリコール、及びメトキシまたはそのエトキシキャップされた類似体、特に、ポリオキシエチレングリコール、後者はポリエチレングリコールまたはＰＥＧとしても知られる）、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルキルエーテル、ポリオキサゾリン、ポリアルキルオキサゾリン及びポリヒドロキシアルキルオキサゾリン、ポリアクリルアミド、ポリアルキルアクリルアミド、及びポリヒドロキシアルキルアクリルアミド（例えば、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド及びその誘導体）、ポリヒドロキシアルキルアクリレート、ポリシアル酸及びその類似体、親水性ペプチド配列、多糖類及びそれらの誘導体（デキストラン及びデキストラン誘導体、例えば、カルボキシメチルデキストラン、デキストラン硫酸、アミノデキストランを含む）、セルロース及びその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、キチン及びその誘導体、例えば、キトサン、スクシニルキトサン、カルボキシメチルキチン、カルボキシメチルキトサン、ヒアルロン酸及びその誘導体、デンプン、アルギネート、コンドロイチン硫酸、アルブミン、プルラン及びカルボキシメチルプルラン、ポリアミノ酸及びその誘導体、例えば、ポリグルタミン酸、ポリリジン、ポリアスパラギン酸、ポリアスパルタミド、無水マレイン酸コポリマー、例えば、スチレン無水マレイン酸コポリマー、ジビニルエチルエーテル無水マレイン酸コポリマー、ポリビニルアルコール、それらのコポリマー、それらのターポリマー、それらの混合物、ならびに前述の誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
ポリエチレングリコール分子とタンパク質分子との比率は、反応混合物中のそれらの濃度と同様に変化する。概して、最適な比率（過剰な未反応タンパク質またはポリマーが最小であるという点での反応効率の観点から）は、選択されたポリエチレングリコールの分子量及び利用可能な反応性基の数によって決定され得る。分子量に関連するように、典型的には、ポリマーの分子量が高いほど、タンパク質に結合され得るポリマー分子の数が少ない。同様に、ポリマーの分枝は、これらのパラメータを最適化する際に考慮されるべきである。一般に、分子量が高い（または分枝が多い）ほど、ポリマー：タンパク質比が高い。
本明細書で使用される場合、及びＰＥＧ：ＴＣポリペプチドコンジュゲートを企図する場合、「治療有効量」という用語は、患者に所望の利益を与える量を指す。量は個人によって異なり、患者の全体的な身体状態及び治療される状態の根本的な原因を含むいくつかの要因に依存する。療法に使用されるＴＣポリペプチドの量は、許容される変化率を与え、所望の応答を有益なレベルで維持する。本組成物の治療有効量は、公的に入手可能な材料及び手順を使用して、当業者によって容易に確認され得る。
水溶性ポリマーは、直鎖状、フォーク状、または分枝状を含むが、これらに限定されない任意の構造形態であり得る。典型的には、水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）などのポリ（アルキレングリコール）であるが、他の水溶性ポリマーを用いることもできる。例として、ＰＥＧは、本発明のある特定の実施形態を説明するために使用される。
ＰＥＧは、市販されているか、または当業者に既知の方法によりエチレングリコールの開環重合によって調製することができる周知の水溶性ポリマーである（Ｓａｎｄｌｅｒ ａｎｄ Ｋａｒｏ，Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｖｏｌ．３，ｐａｇｅｓ １３８－１６１）。「ＰＥＧ」という用語は、サイズまたはＰＥＧの末端での修飾に関係なく、任意のポリエチレングリコール分子を包含するように広く使用され、式：
ＸＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｙ
（式中、ｎは２～１０，０００であり、Ｘは、Ｈまたは末端修飾であり、Ｃ１－４アルキル、保護基、または末端官能基を含むが、これらに限定されない）によってＴＣポリペプチドに連結されるように表され得る。
場合によっては、本発明で使用されるＰＥＧは、一端で、ヒドロキシまたはメトキシで終結する、すなわち、Ｘは、ＨまたはＣＨ３（「メトキシＰＥＧ」）である。あるいは、ＰＥＧは反応性基で終結し、それにより二官能性ポリマーを形成することができる。典型的な反応性基としては、２０個の一般的なアミノ酸に見られる官能基（マレイミド基、活性化カーボネート（ｐ－ニトロフェニルエステルを含むがこれに限定されない）、活性化エステル（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、ｐ－ニトロフェニルエステルを含むがこれらに限定されない）、及びアルデヒドを含むがこれらに限定されない）と反応するために一般的に使用されるそれらの反応性基、ならびに２０個の一般的なアミノ酸に対して不活性であるが、非天然コード化アミノ酸に存在する相補的な官能基（アジド基、アルキン基を含むがこれらに限定されない）と特異的に反応する官能基が挙げられる。Ｙによって上記の式に示されるＰＥＧの他方の端は、天然に存在するまたは非天然コード化アミノ酸を介してＴＣポリペプチドに直接または間接的のいずれかで結合することに留意されたい。例えば、Ｙは、ポリペプチドのアミン基（リジンのイプシロンアミンまたはＮ末端を含むがこれらに限定されない）へのアミド、カルバメート、または尿素連結であり得る。あるいは、Ｙは、チオール基（システインのチオール基を含むがこれに限定されない）へのマレイミド連結であり得る。あるいは、Ｙは、２０の一般的なアミノ酸を介して一般的にアクセス可能ではない残基への連結であり得る。例えば、ＰＥＧ上のアジド基をＴＣポリペプチド上のアルキン基と反応させて、ヒュスゲン［３＋２］環化付加生成物を形成することができる。あるいは、ＰＥＧ上のアルキン基を、非天然コード化アミノ酸に存在するアジド基と反応させて、類似の生成物を形成することができる。いくつかの実施形態において、適用できる場合、強力な求核剤（ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、セミカルバジドを含むがこれらに限定されない）を、非天然コード化アミノ酸に存在するアルデヒドまたはケトン基と反応させて、ヒドラゾン、オキシム、またはセミカルバゾンを形成することができ、場合によっては、適切な還元剤での処理によってさらに還元することができる。あるいは、強力な求核剤は、非天然コード化アミノ酸を介してＴＣポリペプチドに組み込むことができ、水溶性ポリマー中に存在するケトンまたはアルデヒド基と優先的に反応させるために使用することができる。
ＰＥＧの任意の分子量は、所望されるように、約１００ダルトン（Ｄａ）～１００，０００Ｄａ以上を含むがこれらに限定されない、実質的に所望されるように使用することができる（場合によっては０．１～５０ｋＤａまたは１０～４０ｋＤａを含むがこれらに限定されない）。ＰＥＧの分子量は、約１００Ｄａ～約１００，０００Ｄａ以上を含むがこれらに限定されない、広範囲のものであり得る。ＰＥＧは、１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、１，０００Ｄａ、９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００Ｄａ、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａ、及び１００Ｄａを含むがこれらに限定されない、約１００Ｄａ～約１００，０００Ｄａであり得る。いくつかの実施形態において、ＰＥＧは、約１００Ｄａ～約５０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態において、ＰＥＧは、約１００Ｄａ～約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態において、ＰＥＧは、約１，０００Ｄａ～約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態において、ＰＥＧは、約５，０００Ｄａ～約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態において、ＰＥＧは、約１０，０００Ｄａ～約４０，０００Ｄａである。各鎖が、１～１００ｋＤａ（１～５０ｋＤａまたは５～２０ｋＤａを含むがこれらに限定されない）の範囲の分子量を有するＰＥＧ分子を含むが、これに限定されない分枝鎖ＰＥＧも使用することができる。分枝鎖ＰＥＧの各鎖の分子量は、限定されないが、約１，０００Ｄａ～約１００，０００ Ｄａ以上を含むものであり得る。分枝鎖ＰＥＧの各鎖の分子量は、１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、及び１，０００Ｄａを含むがこれらに限定されない、約１，０００Ｄａ～約１００，０００Ｄａであり得る。いくつかの実施形態において、分枝鎖ＰＥＧの各鎖の分子量は、約１，０００Ｄａ～約５０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態において、分枝鎖ＰＥＧの各鎖の分子量は、約１，０００Ｄａ～約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態において、分枝鎖ＰＥＧの各鎖の分子量は、約５，０００Ｄａ～約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態において、分枝鎖ＰＥＧの各鎖の分子量は、約５，０００Ｄａ～約２０，０００Ｄａである。広範なＰＥＧ分子が、参照により本明細書に組み込まれるＳｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．のカタログ、Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓのカタログを含むが、これらに限定されないものに記載される。
一般に、ＰＥＧ分子の少なくとも１つの末端は、非天然コード化アミノ酸との反応に利用可能である。例えば、アミノ酸側鎖との反応のためのアルキン及びアジド部分を担持するＰＥＧ誘導体またはＴＬＲ－リンカー誘導体を使用して、本明細書に記載の非天然コード化アミノ酸にＰＥＧを結合させることができる。非天然コード化アミノ酸がアジドを含む場合、ＰＥＧは、典型的には、［３＋２］環化付加生成物の形成をもたらすアルキン部分、またはアミド連結の形成をもたらすホスフィン基を含有する活性化ＰＥＧ種（すなわち、エステル、カーボネート）のいずれかを含有する。あるいは、非天然コード化アミノ酸がアルキンを含む場合、ＰＥＧは、典型的には、［３＋２］ヒュスゲン環化付加生成物の形成をもたらすアジド部分を含有する。非天然コード化アミノ酸がカルボニル基を含む場合、ＰＥＧは、典型的には、それぞれ、対応するヒドラゾン、オキシム、及びセミカルバゾン連結の形成をもたらすために、強力な求核剤（ヒドラジド、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、またはセミカルバジド官能基を含むがこれらに限定されない）を含む。他の代替案では、上述の反応性基の配向の逆を使用することができ、すなわち、非天然コード化アミノ酸中のアジド部分を、アルキンを含有するＰＥＧ誘導体と反応させることができる。
いくつかの実施形態において、ＰＥＧ誘導体を有するＴＣポリペプチドは、非天然コード化アミノ酸の側鎖上に存在する化学官能基と反応性である化学官能基を含有する。
いくつかの実施形態において、本発明は、約８００Ｄａ～約１００，０００Ｄａの平均分子量を有する水溶性ポリマー骨格を含む、アジド及びアセチレン含有ポリマー誘導体を提供する。水溶性ポリマーのポリマー骨格は、ポリ（エチレングリコール）であり得る。しかしながら、ポリ（エチレン）グリコールを含むがこれに限定されない多種多様の水溶性ポリマー、ならびにポリ（デキストラン）及びポリ（プロピレングリコール）を含む他の関連ポリマーもまた、本発明の実施において使用するのに好適であり、用語ＰＥＧまたはポリ（エチレングリコール）の使用は、すべてのそのような分子を包含し、含むことが意図されていることを理解されたい。ＰＥＧという用語には、二官能性ＰＥＧ、多アーム型ＰＥＧ、誘導体化ＰＥＧ、フォーク型ＰＥＧ、分枝型ＰＥＧ、ペンダント型ＰＥＧ（すなわち、ポリマー骨格に対してペンダント状である１つ以上の官能基を有するＰＥＧまたは関連ポリマー）、またはそれらの中に分解可能な連結を有するＰＥＧを含む、その形態のいずれかにおけるポリ（エチレングリコール）が含まれるが、これに限定されない。
ＰＥＧは、典型的には、透明、無色、無臭であり、水に可溶性であり、熱に安定であり、多くの化学剤に対して不活性であり、加水分解または劣化せず、一般に無毒である。ポリ（エチレングリコール）は生体適合性であると考えられており、つまり、ＰＥＧは、害を及ぼすことなく生体組織または生物と共存することができる。より具体的には、ＰＥＧは、実質的に、非免疫原性であり、つまり、ＰＥＧは、体内で免疫応答をもたらさない傾向がある。生物学的活性剤など、体内である望ましい機能を有する分子に結合された場合、ＰＥＧは、薬剤をマスクする傾向があり、生物が薬剤の存在を忍容できるように、任意の免疫応答を低減または排除することができる。ＰＥＧコンジュゲートは、実質的な免疫応答をもたらさないか、または凝固もしくは他の望ましくない効果を引き起こさない傾向がある。式－－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－－ＣＨ２ＣＨ２－－（式中、ｎは、約３～約４０００、典型的には約２０～約２０００である）を有するＰＥＧは、本発明での使用に好適である。本発明のいくつかの実施形態において、約８００Ｄａ～約１００，０００Ｄａの分子量を有するＰＥＧは、ポリマー骨格として特に有用である。ＰＥＧの分子量は、約１００Ｄａ～約１００，０００Ｄａ以上を含むがこれらに限定されない、広範囲のものであり得る。ＰＥＧの分子量は、約１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、１，０００Ｄａ、９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００Ｄａ、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａ、及び１００Ｄａを含むがこれらに限定されない、約１００Ｄａ～約１００，０００Ｄａであり得る。いくつかの実施形態において、ＰＥＧの分子量は、約１００Ｄａ～約５０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態において、ＰＥＧの分子量は、約１００Ｄａ～約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態において、ＰＥＧの分子量は、約１，０００Ｄａ～約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態において、ＰＥＧの分子量は、約５，０００Ｄａ～約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態において、ＰＥＧの分子量は、約１０，０００Ｄａ～約４０，０００Ｄａである。
ポリマー骨格は、直鎖状または分枝状であり得る。分枝状ポリマー骨格は、一般に当該技術分野で既知である。典型的には、分枝状ポリマーは、中央分枝コア部分及び中央分枝コアに連結された複数の直鎖状ポリマー鎖を有する。ＰＥＧは、グリセロール、グリセロールオリゴマー、ペンタエリスリトール、及びソルビトールなどの種々のポリオールにエチレンオキシドを添加することによって調製することができる分枝形態で一般的に使用される。中央分枝部分はまた、リジンなどのいくつかのアミノ酸に由来し得る。分枝状ポリ（エチレングリコール）は、一般的な形態では、Ｒ（－ＰＥＧ－ＯＨ）ｍとして表すことができ、Ｒは、グリセロール、グリセロールオリゴマー、またはペンタエリスリトールなどのコア部分に由来し、ｍは、アームの数を表す。米国特許第５，９３２，４６２号、同第５，６４３，５７５号、同第５，２２９，４９０号、同第４，２８９，８７２号、米国特許出願第２００３／０１４３５９６号、ＷＯ９６／２１４６９号、及びＷＯ９３／２１２５９号（それらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているものなどの多アーム型ＰＥＧ分子もまた、ポリマー骨格として使用することができる。
分枝状ＰＥＧはまた、ＰＥＧ（－ＹＣＨＺ２）ｎで表されるフォーク型ＰＥＧの形態であってもよく、ここで、Ｙは連結基であり、Ｚは、定義された長さの原子鎖によってＣＨに連結された活性化末端基である。さらに別の分枝状形態であるペンダント型ＰＥＧは、ＰＥＧ鎖の末端ではなく、ＰＥＧ骨格に沿ってカルボキシルなどの反応性基を有する。
これらの形態のＰＥＧに加えて、ポリマーは、骨格内の弱いまたは分解可能な連結で調製することもできる。例えば、ＰＥＧは、加水分解を受けるポリマー骨格内のエステル連結で調製することができる。以下に示すように、この加水分解は、ポリマーを低分子量の断片に切断する。
－ＰＥＧ－ＣＯ２－ＰＥＧ－＋Ｈ２Ｏ→ＰＥＧ－ＣＯ２Ｈ＋ＨＯ－ＰＥＧ－
当業者であれば、ポリ（エチレングリコール）またはＰＥＧという用語は、本明細書に開示されるものを含むがこれらに限定されない、当該技術分野で既知のすべての形態を表すか、またはそれらを含むことを理解されたい。
多くの他のポリマーはまた、本発明での使用に好適である。いくつかの実施形態において、２～約３００の末端を有する水溶性のポリマー骨格は、本発明において特に有用である。好適なポリマーの例としては、ポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）などの他のポリ（アルキレングリコール）、それらのコポリマー（エチレングリコール及びプロピレングリコールのコポリマーを含むが、これに限定されない）、それらのターポリマー、それらの混合物などが挙げられるが、これらに限定されない。ポリマー骨格の各鎖の分子量は変化し得るが、典型的には、約８００Ｄａ～約１００，０００Ｄａ、多くの場合約６，０００Ｄａ～約８０，０００Ｄａの範囲である。ポリマー骨格の各鎖の分子量は、約１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、１，０００Ｄａ、９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００Ｄａ、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａ、及び１００Ｄａを含むがこれらに限定されない、約１００Ｄａ～約１００，０００Ｄａであり得る。いくつかの実施形態において、ポリマー骨格の各鎖の分子量は、約１００Ｄａ～約５０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態において、ポリマー骨格の各鎖の分子量は、約１００Ｄａ～約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態において、ポリマー骨格の各鎖の分子量は、約１，０００Ｄａ～約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態において、ポリマー骨格の各鎖の分子量は、約５，０００Ｄａ～約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態において、ポリマー骨格の各鎖の分子量は、約１０，０００Ｄａ～約４０，０００Ｄａである。
当業者であれば、実質的に水溶性の骨格に関する前述のリストは、決して網羅的なものではなく、単なる例示であり、上述の質を有するすべてのポリマー材料が、本発明での使用に好適であると企図されることを認識するであろう。
本発明のいくつかの実施形態において、ポリマー誘導体は、「多官能性」であり、ポリマー骨格が、官能基で官能化または活性化された少なくとも２つの末端、及び場合によっては約３００ほどの末端を有することを意味する。多官能性ポリマー誘導体としては、限定されないが、２つの末端を有する直鎖状ポリマーが挙げられ、各末端は、同じであっても異なっていてもよい官能基に結合されている。
「保護された」という用語は、ある特定の反応条件下で化学反応性官能基の反応を防止する保護基または部分の存在を指す。保護基は、保護される化学反応性基の種類に応じて異なる。例えば、化学反応性基がアミンまたはヒドラジドである場合、保護基は、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル（ｔ－Ｂｏｃ）及び９－フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）の基から選択され得る。化学反応性基がチオールである場合、保護基は、オルトピリジルジスルフィドであり得る。化学反応性基が、ブタン酸もしくはプロピオン酸などのカルボン酸、またはヒドロキシル基である場合、保護基は、ベンジル、またはメチル、エチル、もしくはｔｅｒｔ－ブチルなどのアルキル基であり得る。当該技術分野で既知の他の保護基もまた、本発明で使用され得る。
文献における末端官能基の具体的な例としては、Ｎ－スクシンイミジルカーボネート（例えば、米国特許第５，２８１，６９８号、同第５，４６８，４７８号を参照されたい）、アミン（例えば、Ｂｕｃｋｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．１８２：１３７９（１９８１）、Ｚａｌｉｐｓｋｙ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ．Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．１９：１１７７（１９８３）を参照されたい）、ヒドラジド（例えば、Ａｎｄｒｅｓｚ ｅｔ ａｌ．Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．１７９：３０１（１９７８）を参照されたい）、プロピオン酸スクシンイミジル及びブタン酸スクシンイミジル（例えば、Ｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ１７０－１８１，Ｈａｒｒｉｓ＆Ｚａｌｉｐｓｋｙ Ｅｄｓ．，ＡＣＳ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９９７を参照されたい、また米国特許第５，６７２，６６２号も参照されたい）、コハク酸スクシンイミジル（例えば、Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．７：１７５（１９８４）及びＪｏｐｐｉｃｈ ｅｔ ａｌ．Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．１８０：１３８１（１９７９）を参照されたい）、スクシンイミジルエステル（例えば、米国特許第４，６７０，４１７号を参照されたい）、炭酸ベンゾトリアゾール（例えば、米国特許第５，６５０，２３４号を参照されたい）、グリシジルエーテル（例えば、Ｐｉｔｈａ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．９４：１１（１９７９），Ｅｌｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３：３５４（１９９１）を参照されたい）、オキシカルボニルイミダゾール（例えば、Ｂｅａｕｃｈａｍｐ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３１：２５（１９８３），Ｔｏｎｄｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １：２５１（１９８５）を参照されたい）、ｐ－ニトロフェニルカーボネート（例えば、Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１１：１４１（１９８５）及びＳａｒｔｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２７：４５（１９９１）を参照されたい）、アルデヒド（例えば、Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．Ｃｈｅｍ．Ｅｄ．２２：３４１（１９８４）、米国特許第５，８２４，７８４号、米国特許第５，２５２，７１４号を参照されたい）、マレイミド（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）８：３４３（１９９０）、Ｒｏｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ２：２９（１９８４）、及びＫｏｇａｎ，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃｏｍｍ．２２：２４１７（１９９２）を参照されたい）、オルトピリジル－ジスルフィド（例えば、Ｗｏｇｈｉｒｅｎ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．４：３１４（１９９３）を参照されたい）、アクリロール（例えば、Ｓａｗｈｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２６：５８１（１９９３）を参照されたい）、ビニルスルホン（例えば、米国特許第５，９００，４６１号を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。上記の参照文献及び特許のすべては、参照により本明細書に組み込まれる。
Ｐ－アジド－Ｌ－フェニルアラニンなどの非天然コード化アミノ酸を含有するＴＣポリペプチドのＰＥＧ化（すなわち、任意の水溶性ポリマーの付加）は、任意の便利な方法によって行われる。例えば、ＴＣポリペプチドは、アルキン末端処理されたｍＰＥＧ誘導体でＰＥＧ化される。簡単に述べると、過剰の固体ｍＰＥＧ（５０００）－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ≡ＣＨを、撹拌しながら、ｐ－アジド－Ｌ－Ｐｈｅ含有ＴＣポリペプチドの水溶液に室温で添加する。典型的には、水溶液は、反応が行われるｐＨ付近のｐＫａを有する緩衝液（一般に、約ｐＨ４～１０）で緩衝される。例えば、ｐＨ７．５でのＰＥＧ化に好適な緩衝液の例としては、限定されないが、ＨＥＰＥＳ、ホスフェート、ボレート、ＴＲＩＳ－ＨＣｌ、ＥＰＰＳ、及びＴＥＳが挙げられる。ｐＨは、連続的に監視され、必要に応じて調整される。反応は、典型的には、約１～４８時間継続させる。
その後、反応生成物を疎水性相互作用クロマトグラフィーに供して、ＰＥＧ化ＴＣポリペプチドを遊離ｍＰＥＧ（５０００）－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ≡ＣＨ及びペグ化ＴＣポリペプチドの任意の高分子量複合体（非ブロック化ＰＥＧが分子の両端で活性化されるときに形成され得る）から分離し、それにより、ＴＣポリペプチド分子を架橋することができる。疎水性相互作用クロマトグラフィー中の条件は、遊離ｍＰＥＧ（５０００）－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ≡ＣＨがカラムを通って流れる一方で、任意の架橋されたＰＥＧ化ＴＣポリペプチド複合体が、１つ以上のＰＥＧ基にコンジュゲートされた１つのＴＣポリペプチド分子を含有する所望の形態の後に溶出される。好適な条件は、架橋された複合体と所望のコンジュゲートとの相対サイズに応じて異なり、当業者によって容易に決定される。所望のコンジュゲートを含有する溶出液を、限外濾過により濃縮し、透析濾過により脱塩する。
実質的に精製されたＰＥＧ－ＴＣは、産生されたＰＥＧ－ＴＣが、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析、ＲＰ－ＨＰＬＣ、ＳＥＣ、及びキャピラリー電気泳動などの適切な方法によって決定される場合、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％の純度レベル、具体的には少なくとも約７５％、８０％、８５％の純度レベル、より具体的には少なくとも約９０％の純度レベル、少なくとも約９５％の純度レベル、少なくとも約９９％以上の純度レベルを有する、上述の溶出方法を使用して製造され得る。必要に応じて、疎水性クロマトグラフィーから得られたＰＥＧ化ＴＣポリペプチドは、親和性クロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥの使用を含むがこれに限定されない）、シリカでのクロマトグラフィー、逆相ＨＰＬＣ、ゲル濾過（ＳＥＰＨＡＤＥＸ Ｇ－７５の使用を含むがこれに限定されない）、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、金属－キレートクロマトグラフィー、限外濾過／透析濾過、エタノール沈殿、硫酸アンモニウム沈殿、クロマトフォーカシング、置換クロマトグラフィー、電気泳動手順（分取等電点電気泳動を含むがこれに限定されない）、差溶解性（硫酸アンモニウム沈殿を含むがこれに限定されない）、または抽出を含むがこれらに限定されない、当業者に既知の１つ以上の手順によってさらに精製され得る。見かけの分子量は、球状タンパク質標準品（Ｐｒｅｎｅｔａ，ＡＺ ｉｎ ＰＲＯＴＥＩＮ ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＭＥＴＨＯＤＳ，Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｈａｒｒｉｓ＆Ａｎｇａｌ，Ｅｄｓ．）ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ １９８９，２９３－３０６）と比較することによって、ＧＰＣにより推定され得る。ＴＣ－ＰＥＧコンジュゲートの純度は、タンパク質分解（トリプシン切断を含むがこれに限定されない）、続いて質量分析により評価され得る。Ｐｅｐｉｎｓｋｙ ＲＢ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍｃｏｌ．＆Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２９７（３）：１０５９－６６（２００１）。
本発明のＴＣポリペプチドの標的化ポリペプチドのアミノ酸に連結された水溶性ポリマーは、さらに誘導体化または置換することができるが、これらに限定されない。
アジド含有ＰＥＧ誘導体またはＴＬＲ－リンカー誘導体
本発明の別の実施形態において、ＴＣの標的化ポリペプチドは、非天然コード化アミノ酸の側鎖上に存在するアルキン部分と反応するアジド部分を含有するＰＥＧ誘導体で修飾される。一般に、ＰＥＧ誘導体またはＴＬＲ－リンカー誘導体は、１～１００ｋＤａ、いくつかの実施形態においては１０～４０ｋＤａの範囲の平均分子量を有する。
いくつかの実施形態において、アジド末端ＰＥＧ誘導体は、以下の構造：
ＲＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－Ｏ－（ＣＨ２）ｍ－Ｎ３
を有し、式中、Ｒは、単純なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２～１０であり、ｎは１００～１，０００である（すなわち、平均分子量は５～４０ｋＤａである）。
別の実施形態において、アジド末端ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－Ｏ－（ＣＨ２）ｍ－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－（ＣＨ２）ｐ－Ｎ３
を有し、式中、Ｒは、単純なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２～１０であり、ｐは２～１０であり、ｎは１００～１，０００である（すなわち、平均分子量は５～４０ｋＤａである）。
本発明の別の実施形態において、アルキン含有アミノ酸を含むＴＣの標的化ポリペプチドは、末端アジド部分を含有する分枝状ＰＥＧ誘導体で修飾され、分枝状ＰＥＧの各鎖は、１０～４０ｋＤａの範囲の分子量を有し、５～２０ｋＤａであり得る。例えば、いくつかの実施形態において、アジド末端ＰＥＧ誘導体は、以下の構造：
［ＲＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－Ｏ－（ＣＨ２）２－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）］２ＣＨ（ＣＨ２）ｍ－Ｘ－（ＣＨ２）ｐＮ３
を有し、式中、Ｒは、単純なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２～１０であり、ｐは２～１０であり、ｎは１００～１，０００であり、Ｘは、任意に、Ｏ、Ｎ、Ｓ、またはカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）であり、各場合において、存在するか、または不在であり得る。
アルキン含有ＰＥＧ誘導体またはＴＬＲ－リンカー誘導体
本発明の別の実施形態において、ＴＣの標的化ポリペプチドは、非天然コード化アミノ酸の側鎖上に存在するアジド部分と反応するアルキン部分を含有するＰＥＧ誘導体で修飾される。
いくつかの実施形態において、アルキン末端ＰＥＧ誘導体は、以下の構造：
ＲＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－Ｏ－（ＣＨ２）ｍ－Ｃ≡ＣＨ
を有し、式中、Ｒは、単純なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２～１０であり、ｎは１００～１，０００である（すなわち、平均分子量は５～４０ｋＤａである）。
本発明の別の実施形態において、アルキン含有非天然コード化アミノ酸を含むＴＣの標的化ポリペプチドは、アミド連結によってＰＥＧ骨格に連結される末端アジドまたは末端アルキン部分を含有するＰＥＧ誘導体で修飾される。
いくつかの実施形態において、アルキン末端ＰＥＧ誘導体は、以下の構造：
ＲＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－Ｏ－（ＣＨ２）ｍ－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－（ＣＨ２）ｐ－Ｃ≡ＣＨ
を有し、式中、Ｒは、単純なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２～１０であり、ｐは２～１０であり、ｎは１００～１，０００である。
本発明の別の実施形態において、アジド含有アミノ酸を含むＴＣの標的化ポリペプチドは、末端アルキン部分を含有する分枝状ＰＥＧ誘導体で修飾され、分枝状ＰＥＧの各鎖は、１０～４０ｋＤａの範囲の分子量を有し、５～２０ｋＤａであり得る。例えば、いくつかの実施形態において、アルキン末端ＰＥＧ誘導体は、以下の構造：
［ＲＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－Ｏ－（ＣＨ２）２－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）］２ＣＨ（ＣＨ２）ｍ－Ｘ－（ＣＨ２）ｐＣ≡ＣＨ
を有し、式中、Ｒは、単純なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２～１０であり、ｐは２～１０であり、ｎは１００～１，０００であり、Ｘは、任意に、Ｏ、Ｎ、Ｓ、もしくはカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）であるか、または存在しない。
ホスフィン含有ＰＥＧ誘導体またはＴＬＲ－リンカー誘導体
本発明の別の実施形態において、ＴＣの標的化ポリペプチドは、非天然コード化アミノ酸の側鎖上に存在するアジド部分と反応するアリールホスフィン基をさらに含む活性化官能基（エステル、カーボネートを含むがこれらに限定されない）を含有するＰＥＧ誘導体で修飾される。一般に、ＰＥＧ誘導体またはＴＬＲ－リンカー誘導体は、１～１００ｋＤａ、いくつかの実施形態においては１０～４０ｋＤａの範囲の平均分子量を有する。
いくつかの実施形態において、ＰＥＧ誘導体は、構造：
Figure 2022520792000063
を有し、式中、ｎは、１～１０であり、Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであるか、または存在しなくてもよく、Ｐｈはフェニルであり、Ｗは、水溶性ポリマーである。
いくつかの実施形態において、ＰＥＧ誘導体は、構造：
Figure 2022520792000064
を有し、式中、Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであるか、または存在しなくもよく、Ｐｈはフェニルであり、Ｗは水溶性ポリマーであり、Ｒは、Ｈ、アルキル、アリール、置換アルキル、及び置換アリール基であり得る。例示的なＲ基としては、－ＣＨ２、－Ｃ（ＣＨ３）３、－ＯＲ’、－ＮＲ’Ｒ”、－ＳＲ’、－ハロゲン、－Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－ＣＯＮＲ’Ｒ”、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、－Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ”、－ＣＮ、及び－ＮＯ２が挙げられるが、これらに限定されない。Ｒ’、Ｒ’、及びＲ’はそれぞれ独立して、水素、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換アリール（１～３個のハロゲンで置換されたアリールを含むがこれに限定されない）、置換もしくは非置換アルキル、アルコキシ、もしくはチオアルコキシ基、またはアリールアルキル基を指す。本発明の化合物が例えば２つ以上のＲ基を含む場合、Ｒ基の各々は、これらの基のうちの２つ以上が存在する場合、それぞれのＲ’、Ｒ”、Ｒ’’’、及びＲ’’’’基と同様に独立して選択される。Ｒ’及びＲ”が同じ窒素原子に結合されるとき、それらは、窒素原子と組み合わされて、５、６、または７員環を形成することができる。例えば、－ＮＲ’Ｒ”は、限定されないが、１－ピロリジニル及び４－モルホリニルを含むことを意図する。置換基の上記の考察から、当業者は、「アルキル」という用語が、水素基以外の基、例えば、ハロアルキル（－ＣＦ３及び－ＣＨ２ＣＦ３を含むがこれらに限定されない）及びアシル（－Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、－Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３などを含むが、これらに限定されない）に結合した炭素原子を含む基を含むことを意味することを理解するであろう。
他のＰＥＧ誘導体またはＴＬＲ－リンカー誘導体及び一般的なコンジュゲーション技法
ＴＣポリペプチドに連結され得る他の例示的なＰＥＧ分子、ならびにＰＥＧ化方法には、例えば、米国特許公開第２００４／０００１８３８号、同第２００２／００５２００９号、同第２００３／０１６２９４９号、同第２００４／００１３６３７号、同第２００３／０２２８２７４号、同第２００３／０２２０４４７号、同第２００３／０１５８３３３号、同第２００３／０１４３５９６号、同第２００３／０１１４６４７号、同第２００３／０１０５２７５号、同第２００３／０１０５２２４号、同第２００３／００２３０２３号、同第２００２／０１５６０４７号、同第２００２／００９９１３３号、同第２００２／００８６９３９号、同第２００２／００８２３４５号、同第２００２／００７２５７３号、同第２００２／００５２４３０号、同第２００２／００４００７６号、同第２００２／００３７９４９号、同第２００２／０００２２５０号、同第２００１／００５６１７１号、同第２００１／００４４５２６号、同第２００１／００２１７６３号、米国特許第６，６４６，１１０号、同第５，８２４，７７８号、同第５，４７６，６５３号、同第５，２１９，５６４号、同第５，６２９，３８４号、同第５，７３６，６２５号、同第４，９０２，５０２号、同第５，２８１，６９８号、同第５，１２２，６１４号、同第５，４７３，０３４号、同第５，５１６，６７３号、同第５，３８２，６５７号、同第６，５５２，１６７号、同第６，６１０，２８１号、同第６，５１５，１００号、同第６，４６１，６０３号、同第６，４３６，３８６号、同第６，２１４，９６６号、同第５，９９０，２３７号、同第５，９００，４６１号、同第５，７３９，２０８号、同第５，６７２，６６２号、同第５，４４６，０９０号、同第５，８０８，０９６号、同第５，６１２，４６０号、同第５，３２４，８４４号、同第５，２５２，７１４号、同第６，４２０，３３９号、同第６，２０１，０７２号、同第６，４５１，３４６号、同第６，３０６，８２１号、同第５，５５９，２１３号、同第５，７４７，６４６号、同第５，８３４，５９４号、同第５，８４９，８６０号、同第５，９８０，９４８号、同第６，００４，５７３号、同第６，１２９，９１２号、ＷＯ９７／３２６０７、ＥＰ２２９，１０８、ＥＰ４０２，３７８、ＷＯ９２／１６５５５、ＷＯ９４／０４１９３、ＷＯ９４／１４７５８、ＷＯ９４／１７０３９、ＷＯ９４／１８２４７、ＷＯ９４／２８０２４、ＷＯ９５／００１６２、ＷＯ９５／１１９２４、ＷＯ９５／１３０９０、ＷＯ９５／３３４９０、ＷＯ９６／０００８０、ＷＯ９７／１８８３２、ＷＯ９８／４１５６２、ＷＯ９８／４８８３７、ＷＯ９９／３２１３４、ＷＯ９９／３２１３９、ＷＯ９９／３２１４０、ＷＯ９６／４０７９１、ＷＯ９８／３２４６６、ＷＯ９５／０６０５８、ＥＰ４３９ ５０８、ＷＯ９７／０３１０６、ＷＯ９６／２１４６９、ＷＯ９５／１３３１２、ＥＰ９２１ １３１、ＷＯ９８／０５３６３、ＥＰ８０９ ９９６、ＷＯ９６／４１８１３、ＷＯ９６／０７６７０、ＥＰ６０５ ９６３、ＥＰ５１０ ３５６、ＥＰ４００ ４７２、ＥＰ１８３ ５０３、及びＥＰ１５４ ３１６（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているものが含まれるが、これらに限定されない。本明細書に記載のＰＥＧ分子のいずれかは、単鎖、分枝鎖、多アーム鎖、単一官能性、二官能性、多官能性、またはそれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない任意の形態で使用され得る。
ヒドロキシルアミン（アミノオキシ）ＰＥＧ誘導体またはＴＬＲリンカー誘導体を含むがこれらに限定されない、追加のポリマー及びＰＥＧ誘導体またはＴＬＲリンカー誘導体は、参照によりその全体が本明細書にすべて組み込まれる以下の特許出願に記載される：米国特許公開第２００６／０１９４２５６号、米国特許公開第２００６／０２１７５３２号、米国特許公開第２００６／０２１７２８９号、米国仮特許第６０／７５５，３３８号、米国仮特許第６０／７５５，７１１号、米国仮特許第６０／７５５，０１８号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０６／４９３９７号、ＷＯ２００６／０６９２４６、米国仮特許第６０／７４３，０４１号、米国仮特許第６０／７４３，０４０号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０６／４７８２２号、米国仮特許第６０／８８２，８１９号、米国仮特許第６０／８８２，５００号、及び米国仮特許第６０／８７０，５９４。
ＴＣポリペプチドのグリコシル化
グリコシル化は、ＴＣポリペプチドなどのポリペプチドの物理的特性（例えば、溶解性）に劇的に影響を与えることができ、タンパク質の安定性、分泌、及び細胞内局在化においても重要であり得る。グリコシル化ポリペプチドはまた、増強された安定性を示すことができるか、または半減期などの１つ以上の薬物動態学的特性を改善することができる。加えて、溶解性の改善は、例えば、非グリコシル化ポリペプチドを含む製剤よりも医薬投与に好適な製剤の生成を可能にすることができる。
本発明は、糖残基を担持する１つ以上の非天然コード化アミノ酸を組み込んだＴＣポリペプチドを含む。糖残基は、天然（Ｎ－アセチルグルコサミンを含むがこれに限定されない）または非天然（３－フルオロガラクトースを含むがこれに限定されない）のいずれかであり得る。糖類は、Ｎ－またはＯ連結グリコシド連結（Ｎ－アセチルガラクトース－Ｌ－セリンを含むがこれに限定されない）または非天然連結（オキシムまたは対応するＣ－もしくはＳ連結グリコシドを含むがこれらに限定されない）のいずれかによって非天然コード化アミノ酸に連結され得る。
糖（グリコシルを含むがこれに限定されない）部分は、インビボまたはインビトロのいずれかでＴＣポリペプチドに付加され得る。本発明のいくつかの実施形態において、カルボニル含有非天然コード化アミノ酸を含むＴＣの標的化ポリペプチドを、アミノオキシ基で誘導体化された糖で修飾して、オキシム連結を介して連結された対応するグリコシル化ポリペプチドを生成する。非天然にコード化アミノ酸に結合すると、糖は、グリコシルトランスフェラーゼ及び他の酵素で処理することによってさらに緻密化されて、ＴＣポリペプチドに結合したオリゴ糖を生成することができる。例えば、Ｈ．Ｌｉｕ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５：１７０２－１７０３（２００３）を参照されたい。
本発明のいくつかの実施形態において、カルボニル含有非天然コード化アミノ酸を含むＴＣポリペプチドは、アミオキシ誘導体として調製される定義された構造を有するグリカンで直接修飾される。当業者であれば、アジド、アルキン、ヒドラジド、ヒドラジン、及びセミカルバジドを含む他の官能基を使用して、糖を非天然コード化アミノ酸に連結することができることを認識するであろう。
本発明のいくつかの実施形態において、アジドまたはアルキニル含有非天然コード化アミノ酸を含むＴＣの標的化ポリペプチドは、次いで、それぞれアルキニルまたはアジド誘導体を含むがこれらに限定されないものとのヒュスゲン［３＋２］環状付加反応を含むが、これに限定されないものによって修飾され得る。この方法は、タンパク質を極めて高い選択性で修飾することを可能にする。
ＴＣ二量体及び多量体
本発明はまた、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ホモ多量体、またはヘテロ多量体（すなわち、三量体、四量体など）などのＴＣ及びＴＣ類似体の組み合わせを提供し、ここで、１つ以上の非天然コード化アミノ酸を含有するＴＣは、ポリペプチド骨格に直接またはリンカーを介してのいずれかで、別のＴＣまたはＴＣではない任意の他のポリペプチドに結合される。モノマーと比較して分子量が増加しているため、ＴＣ二量体または多量体コンジュゲートは、モノマーＴＣと比較して異なる薬理学的、薬物動態学的、薬力学的、調節された治療半減期、または調節された血漿半減期を含むが、これらに限定されない新しいまたは望ましい特性を示し得る。いくつかの実施形態において、本発明のＴＣ二量体は、ＴＣ受容体のシグナル伝達を調節する。他の実施形態において、本発明のＴＣ二量体または多量体は、ＴＣ受容体アンタゴニスト、アゴニスト、または調節因子として作用する。
いくつかの実施形態において、ＴＣ含有二量体または多量体に存在するＴＣ分子のうちの１つ以上は、水溶性ポリマーに連結された非天然コード化アミノ酸を含む。
いくつかの実施形態において、ＴＣポリペプチドは、Ａｓｎ－Ｌｙｓアミド連結またはＣｙｓ－Ｃｙｓジスルフィド連結を含むが、これらに限定されないものを介して直接連結される。いくつかの実施形態において、ＴＣポリペプチド及び／または連結された非ＴＣ分子は、第１のＴＣポリペプチドの１つの非天然コード化アミノ酸中のアルキン、及び第２の分子の第２の非天然コード化アミノ酸中のアジドが、ヒュスゲン［３＋２］環化付加を介してコンジュゲートされることを含むがこれに限定されない、二量体化を容易にするための、異なる非天然コード化アミノ酸を含む。あるいは、ケトン含有非天然コード化アミノ酸を含むＴＣ及び／または連結された非ＴＣ分子を、ヒドロキシルアミン含有非天然コード化アミノ酸を含む第２のポリペプチドにコンジュゲートすることができ、ポリペプチドを、対応するオキシムの形成を介して反応させる。
あるいは、２つのＴＣポリペプチド及び／または連結された非ペプチドＴＣ分子は、リンカーを介して連結される。任意のヘテロまたはホモ二官能性リンカーを使用して、同じまたは異なる一次配列を有することができる２つの分子及び／または連結された非ペプチドＴＣ分子を連結することができる。場合によっては、ＴＣをつなぐために使用されるリンカー及び／または連結された非ペプチドＴＣ分子は一緒に、二官能性ＰＥＧ試薬であってもよい。リンカーは、広範囲の分子量または分子長を有し得る。ＴＣと連結された実体との間、またはＴＣとその受容体、または連結された実体とその結合パートナー（もしあれば）との間の所望の空間的関係または立体配座を提供するために、より大きいまたはより小さい分子量のリンカーが使用され得る。また、ＴＣと連結された実体との間、または連結された実体とその結合パートナー（もしあれば）との間に所望の空間または柔軟性を提供するために、より長いまたはより短い分子長を有するリンカーが使用され得る。
いくつかの実施形態において、本発明は、ａ）ポリマー骨格の少なくとも第１の末端上にアジド、アルキン、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、またはカルボニル含有部分、及びｂ）ポリマー骨格の第２の末端上に少なくとも第２の官能基を含む、ダンベル構造を有する水溶性二官能性リンカーを提供する。第２の官能基は、第１の官能基と同じであっても異なっていてもよい。いくつかの実施形態において、第２の官能基は、第１の官能基と反応性ではない。本発明は、いくつかの実施形態において、分枝状分子構造の少なくとも１つのアームを含む水溶性化合物を提供する。例えば、分枝状分子構造は、樹状であり得る。
いくつかの実施形態において、本発明は、以下の構造：
Ｒ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－Ｏ－（ＣＨ２）ｍ－Ｘ（式中、ｎは約５～３，０００であり、ｍは２～１０であり、Ｘは、アジド、アルキン、ヒドラジン、ヒドラジド、アミノオキシ基、ヒドロキシルアミン、アセチル、またはカルボニル含有部分であり得、Ｒは、キャッピング基、官能基、またはＸと同じであっても異なっていてもよい脱離基であり得る）を有する水溶性の活性化ポリマーとの反応により形成される、１つ以上のＴＣポリペプチドを含む多量体を提供する。Ｒは、例えば、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、アルコキシル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル、１－ベンゾトリアゾリルエステル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルカーボネート、１－ベンゾトリアゾリルカーボネート、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、活性スルホン、アミン、アミノオキシ、保護されたアミン、ヒドラジド、保護されたヒドラジド、保護されたチオール、カルボン酸、保護されたカルボン酸、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨードアセタミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン、メシレート、トシレート、及びトレシレート、アルケン、ならびにケトンからなる群から選択される官能基であり得る。
ＨＥＲ２標的に対するＴＣポリペプチド活性及びＴＣポリペプチドの親和性の測定
ＴＣポリペプチド活性は、標準的なまたは既知のインビトロまたはインビボアッセイを使用して決定することができる。ＴＣは、当該技術分野で既知の好適な方法によって生物学的活性について分析され得る。そのようなアッセイには、ＴＣ応答性遺伝子の活性化、受容体結合アッセイ、抗ウイルス活性アッセイ、細胞障害効果阻害アッセイ、抗増殖アッセイ、免疫調節アッセイ、及びＭＨＣ分子の誘導を監視するアッセイが含まれるが、これらに限定されない。
ＴＣポリペプチドは、ＴＣ感受性シグナル伝達経路を活性化する能力について分析され得る。一例は、インターフェロン刺激応答要素（ＩＳＲＥ）アッセイである。ＴＣ受容体を構成的に発現する細胞を、ＩＳＲＥ－ルシフェラーゼベクター（ｐＩＳＲＥ－ｌｕｃ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）で一過性にトランスフェクトする。トランスフェクション後、細胞をＴＣの標的化ポリペプチドで処理する。例えば、０．０００１～１０ｎｇ／ｍＬのいくつかのタンパク質濃度を試験し、用量応答曲線を生成する。ＴＣポリペプチドがＴＣ受容体に結合してそれを活性化する場合、得られるシグナル伝達カスケードは、ルシフェラーゼ発現を誘導する。発光は、例えば、ＴｏｐＣｏｕｎｔ（商標）またはＦｕｓｉｏｎ（商標）マイクロプレートリーダー及びＳｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用することによって、いくつかの方法で測定することができる。
ＴＣポリペプチドは、ＴＣ受容体に結合するそれらの能力について分析され得る。非天然アミノ酸を含む非ＰＥＧ化またはＰＥＧ化ＴＣポリペプチドに関して、ＴＣのその受容体に対する親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）バイオセンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用することによって測定することができる。好適な結合アッセイとしては、限定されないが、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ（Ｐｅａｒｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８：８１－８９（１９９９））及びＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）アッセイ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）が挙げられる。
どの方法を使用してＴＣポリペプチドを作製するかにかかわらず、ＴＣポリペプチドは、生物学的活性についてのアッセイに供される。一般に、生物学的活性の試験は、生物学的活性の増加もしくは減少（修飾されたＴＣと比較したとき）、異なる生物学的活性（修飾されたＴＣと比較したとき）、受容体もしくは結合パートナー親和性分析、ＴＣ自体もしくはその受容体の立体配座もしくは構造変化（修飾されたＴＣと比較したとき）、または血清半減期分析などの所望の結果に対する分析を提供するべきである。
効力、機能的インビボ半減期、及び薬物動態パラメータの測定
本発明の重要な態様は、水溶性ポリマー部分へのポリペプチドのコンジュゲーションの有無にかかわらず、ＴＣの構築によって得られる生物学的半減期の延長である。投与後のＴＣ血清濃度の減少率により、コンジュゲートされた及びコンジュゲートされていないＴＣポリペプチドならびにそのバリアントによる治療に対する生物学的応答を評価することが重要となり得る。本発明のコンジュゲートされた及びコンジュゲートされていないＴＣポリペプチドならびにそのバリアントは、例えば、皮下またはｉ．ｖ．投与による投与後にも血清半減期が延長し得、それにより、例えば、ＥＬＩＳＡ方法または一次スクリーニングアッセイにより測定が可能となる。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）などの商業的供給源からのＥＬＩＳＡまたはＲＩＡキットを使用してもよい。インビボの生物学的半減期の測定は、本明細書に記載されるように行われる。
非天然コード化アミノ酸を含むＴＣの標的化ポリペプチドの効力及び機能的インビボ半減期は、当業者に既知のプロトコルにより決定され得る。
非天然コード化アミノ酸を含むＴＣポリペプチドの薬物動態パラメータは、正常なスプラーグドーリーラットの雄（治療群当たりＮ＝５匹の動物）において評価することができる。動物は、２５ｕｇ／ラットｉｖまたは５０ｕｇ／ラットｓｃのいずれかの単回用量を受け、約５～７の血液試料が、所定の時間経過に従って採取され、一般に、水溶性ポリマーにコンジュゲートされていない非天然コード化アミノ酸を含むＴＣポリペプチドでは約６時間、そして非天然コード化アミノ酸を含み、水溶性ポリマーにコンジュゲートされたＴＣポリペプチドでは約４日かかる。非天然コード化アミノ酸を含まないＴＣの薬物動態データは、非天然コード化アミノ酸を含むＴＣポリペプチドについて得られたデータと直接比較することができる。
投与及び医薬組成物
本発明のポリペプチドまたはタンパク質（ＴＣ、合成酵素、１つ以上の非天然アミノ酸を含むタンパク質などを含むがこれらに限定されない）は、任意に、限定されないが、好適な医薬担体と組み合わせることを含む治療用途に用いられる。そのような組成物は、例えば、治療有効量の化合物、及び医薬的に許容される担体または賦形剤を含む。そのような担体または賦形剤としては、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、及び／またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。製剤は、投与様式に合うように作製される。一般に、タンパク質を投与する方法は当業者に既知であり、本発明のポリペプチドの投与に適用することができる。組成物は、酸及び塩基付加塩の両方を含むことを意図する、医薬的に許容される塩として存在するなど、水溶性形態であってもよい。
本発明の１つ以上のポリペプチドを含む治療用組成物は、任意に、当業者に既知の方法により、有効性、組織代謝を確認し、投薬量を推定するために、疾患の１つ以上の適切なインビトロ及び／またはインビボ動物モデルにおいて試験される。特に、投薬量は、天然アミノ酸相同体に対する本明細書における非天然アミノ酸の活性、安定性、または他の好適な尺度（１つ以上の非天然アミノ酸を含むように修飾されたＴＣの標的化ポリペプチドと天然アミノ酸ＴＣポリペプチドとの比較、及び１つ以上の非天然アミノ酸を含むように修飾されたＴＣの標的化ポリペプチドと現在利用可能なＴＣ治療との比較を含むが、これらに限定されない）によって、すなわち、関連するアッセイにおいて、最初に決定することができる。
投与は、血液または組織細胞との最終接触へと分子を導入するために通常使用される経路のいずれかによる。本発明の非天然アミノ酸ポリペプチドは、任意に、１つ以上の医薬的に許容される担体と共に、任意の好適な方法で投与される。本発明の文脈におけるそのようなポリペプチドを患者に投与する好適な方法が利用可能であり、２つ以上の経路を使用して特定の組成物を投与することができるが、特定の経路は別の経路よりもより即時的かつより有効な作用または反応を提供し得る場合が多い。
医薬的に許容される担体は、部分的には、投与される特定の組成物、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法によって決定される。したがって、本発明の医薬組成物の好適な製剤は多種多様である。
本発明のＴＣポリペプチドは、非経口、例えば、皮下もしくは静脈内、または任意の他の形態の注射もしくは注入を含むがこれらに限定されない、注射を含むがこれに限定されない、タンパク質またはペプチドに好適な任意の従来の経路によって投与され得る。ポリペプチド組成物は、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、経皮、皮下、局所、舌下、または直腸手段が挙げられるがこれらに限定されない、いくつかの経路によって投与することができる。修飾または未修飾の非天然アミノ酸ポリペプチドを含む組成物は、リポソームを介して投与することもできる。そのような投与経路及び適切な製剤は、一般に、当業者に既知である。ＴＣポリペプチドは、単独で、または薬学的担体などの他の好適な構成要素と組み合わせて使用され得る。ＴＣポリペプチドは、他の薬剤または治療薬と組み合わせて使用され得る。
単独でまたは他の好適な構成要素と組み合わせて、非天然アミノ酸を含むＴＣポリペプチドを、吸入を介して投与されるエアロゾル製剤にすることもできる（すなわち、それらを「噴霧する」ことができる）。エアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの加圧された許容される推進剤中に配置することができる。
例えば、関節内（関節内（ｊｏｉｎｔｓ））、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、及び皮下経路などによる非経口投与に好適な製剤には、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、及び製剤を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質を含有し得る水性及び非水性等張滅菌注射液、ならびに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、及び保存剤を含み得る水性及び非水性滅菌懸濁液が含まれる。ＴＣの製剤は、単位用量または複数回用量の密封容器、例えば、アンプル及びバイアルで提示することができる。
非経口投与及び静脈内投与が好ましい投与方法である。特に、天然アミノ酸相同体治療薬（ＥＰＯ、ＧＨ、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ、例えば、ＴＣ、インターロイキン、抗体、ＦＧＦ、及び／または任意の他の医薬的に送達されるタンパク質に典型的に使用されるものを含むがこれらに限定されない）に既に使用されている投与経路は、現在使用中の製剤と共に、本発明のポリペプチドのための好ましい投与経路及び製剤を提供する。
本発明の文脈において、患者に投与される用量は、適用に応じて、経時的に患者における有益な治療応答、または他の適切な活性を有するのに十分である。用量は、特定のベクター、または製剤の有効性、及び用いられる非天然アミノ酸ポリペプチドの活性、安定性、または血清半減期、及び患者の状態、ならびに治療される患者の体重または表面積によって決定される。用量のサイズは、特定の患者における特定のベクター、製剤などの投与に伴う任意の有害な副作用の存在、性質、及び程度によっても決定される。
疾患（好中球減少症、再生不良性貧血、周期性好中球減少症、特発性好中球減少症、Ｃｈｄｉａｋ－Ｈｉｇａｓｈｉ症候群、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、白血病、骨髄異形成症候群、及び骨髄線維症などを含むがこれらに限定されない）の治療または予防に投与されるベクターまたは製剤の有効量を決定する際に、医師は循環血漿レベル、製剤毒性、及び疾患進行を評価する。
例えば、７０キログラムの患者に投与される用量は、典型的には、関連する組成物の変更された活性または血清半減期について調整された、現在使用されている治療用タンパク質の投薬量に相当する範囲内である。本発明のベクターまたは医薬製剤は、抗体投与、ワクチン投与、細胞傷害性薬剤、天然アミノ酸ポリペプチド、核酸、ヌクレオチド類似体、生物学的応答修飾剤などの投与を含む、任意の既知の従来の療法によって治療条件を補完することができる。
投与に関して、本発明の製剤は、患者の体重及び全体的な健康に適用される場合を含むが、これらに限定されない、関連する製剤のＬＤ－５０またはＥＤ－５０により、及び／または様々な濃度での非天然アミノ酸ポリペプチドの任意の副作用の観察により決定される速度で投与さる。投与は、単回用量または分割用量によって達成され得る。
製剤の注入を受ける患者が、発熱、悪寒、または筋肉痛を発症する場合、患者は、適切な用量のアスピリン、イブプロフェン、アセトアミノフェン、または他の疼痛／熱制御薬を受ける。発熱、筋肉痛、及び悪寒などの、注入に対する反応を経験する患者は、後の注入の３０分前に、アスピリン、アセトアミノフェン、またはジフェンヒドラミンを含むがこれらに限定されないもののいずれかを前投薬される。メペリジンは、解熱剤及び抗ヒスタミン剤にすぐに応答しないより重度の悪寒及び筋肉痛に使用される。細胞注入は、反応の重症度に応じて遅くされるか、または中止される。
本発明のＴＣの標的化ポリペプチドのヒト形態は、哺乳類対象に直接投与することができる。投与は、ＴＣポリペプチドを対象に導入するために通常使用される経路のいずれかによる。本発明の実施形態によるＴＣポリペプチド組成物は、経口、直腸、局所、吸入（エアロゾルを介することを含むが、これに限定されない）、頬（舌下を含むが、これに限定されない）、膣、非経口（皮下、筋肉内、皮内、関節内、胸膜内、腹腔内、脳内、動脈内、または静脈内を含むが、これらに限定されない）、局所（すなわち、気道表面を含む皮膚及び粘膜表面の両方）、肺、眼内、鼻腔内、及び経皮投与に好適なものを含むが、いずれの場合においても、最も好適な経路は、治療される状態の性質及び重症度に依存する。投与は、局所または全身のいずれかであり得る。化合物の製剤は、単位用量または複数回用量の密封容器、例えば、アンプル及びバイアルにおいて提示することができる。本発明のＴＣポリペプチドは、医薬的に許容される担体と共に、単位投薬量の注射可能な形態（溶液、懸濁液、またはエマルジョンを含むがこれらに限定されない）で混合物中で調製することができる。本発明のＴＣポリペプチドはまた、連続注入（浸透圧ポンプなどのミニポンプを使用することを含むが、これに限定されない）、単回ボーラス、または徐放性デポー製剤により投与することもできる。
投与に好適な製剤としては、水性及び非水性溶液、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、及び製剤を等張にする溶質を含有することができる等張滅菌液、ならびに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、及び保存剤を含むことができる水性及び非水性滅菌懸濁液が挙げられる。溶液及び懸濁液は、前述の種類の滅菌粉末、顆粒、及び錠剤から調製され得る。
凍結乾燥は、関心のタンパク質調製物から水を除去する役割を果たすタンパク質を提示するために一般的に用いられる技法である。凍結乾燥（Ｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｙｉｎｇ）、または凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）は、乾燥される材料が最初に凍結され、次いで真空環境での昇華によって氷または凍結溶媒が除去されるプロセスである。賦形剤は、凍結乾燥プロセス中の安定性を増強させる、及び／または保管時の凍結乾燥生成物の安定性を改善するために、凍結乾燥前の製剤に含まれ得る。Ｐｉｋａｌ，Ｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．３（９）２６－３０（１９９０）及びＡｒａｋａｗａ ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．８（３）：２８５－２９１（１９９１）。
医薬品の噴霧乾燥も、当業者に既知である。例えば、Ｂｒｏａｄｈｅａｄ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ Ｓｐｒａｙ Ｄｒｙｉｎｇ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，”ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．Ｉｎｄ．Ｐｈａｒｍ，１８（１１＆１２），１１６９－１２０６（１９９２）を参照されたい。小分子医薬品に加えて、様々な生物学的材料が噴霧乾燥されており、これらには、酵素、血清、血漿、微生物、及び酵母が含まれる。噴霧乾燥は、一段階プロセスで液体医薬調製物を微細、無塵、または凝集粉末に変換することができるため、有用な技法である。基本的な技法は、以下の４つのステップを含む：ａ）供給溶液の噴霧への微粒化、ｂ）噴霧－空気接触、ｃ）噴霧乾燥、及びｄ）乾燥空気からの乾燥生成物の分離。米国特許第６，２３５，７１０号及び同第６，００１，８００号（参照により本明細書に組み込まれる）は、噴霧乾燥による組換えエリスロポエチンの調製を記載している。
本発明の医薬組成物及び製剤は、医薬的に許容可能な担体、賦形剤、または安定剤を含み得る。医薬的に許容される担体は、部分的には、投与される特定の組成物、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法によって決定される。したがって、本発明の医薬組成物（任意の医薬的に許容される担体、賦形剤、または安定剤を含む）の多種多様な好適な製剤が存在する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ ｅｄ．１９８５）を参照されたい）。
好適な担体としては、コハク酸、リン酸、ホウ酸、ＨＥＰＥＳ、クエン酸、ヒスチジン、イミダゾール、酢酸、重炭酸、及び他の有機酸を含有する緩衝剤；アスコルビン酸を含むが、これに限定されない抗酸化剤；約１０残基未満のものを含むが、これらに限定されない低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンを含むが、これらに限定されないタンパク質；ポリビニルピロリドンを含むが、これに限定されない親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、ヒスチジンもしくはヒスチジン誘導体、メチオニン、グルタメート、またはリシンを含むが、これらに限定されないアミノ酸；トレハロース、スクロース、グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含むが、これらに限定されない、単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ及びエデト酸二ナトリウムを含むがこれらに限定されないキレート剤；亜鉛、コバルト、もしくは銅を含むがこれらに限定されない二価の金属イオン；マンニトールもしくはソルビトールを含むがこれらに限定されない糖アルコール；ナトリウム及び塩化ナトリウムを含むがこれらに限定されない塩形成対イオン；微結晶セルロース、ラクトース、トウモロコシ、及び他のデンプンなどの充填剤；結合剤；甘味料及び他の香味剤；着色剤；及び／またはＴｗｅｅｎ（商標）（Ｔｗｅｅｎ８０（ポリソルベート８０）及びＴｗｅｅｎ２０（ポリソルベート２０）を含むが、これらに限定されない）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（商標）及び他のプルロニック酸（プルロニック酸Ｆ６８（ポロキサマー１８８））を含むが、これに限定されない）非イオン性界面活性剤、またはＰＥＧが挙げられるが、これらに限定されない。好適な界面活性剤としては、例えば、ポリ（エチレンオキシド）－ポリ（プロピレンオキシド）－ポリ（エチレンオキシド）、すなわち、（ＰＥＯ－ＰＰＯ－ＰＥＯ）、またはポリ（プロピレンオキシド）－ポリ（エチレンオキシド）－ポリ（プロピレンオキシド）、すなわち、（ＰＰＯ－ＰＥＯ－ＰＰＯ）、またはそれらの組み合わせに基づくポリエーテルが挙げられるが、これらに限定されない。ＰＥＯ－ＰＰＯ－ＰＥＯ及びＰＰＯ－ＰＥＯ－ＰＰＯは、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（商標）、Ｒ－Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（商標）、Ｔｅｔｒｏｎｉｃｓ（商標）、及びＲ－Ｔｅｔｒｏｎｉｃｓ（商標）（ＢＡＳＦ Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ Ｃｏｒｐ．，Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ，Ｍｉｃｈ．）の商品名で市販されており、米国特許第４，８２０，３５２号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）にさらに記載されている。他のエチレン／ポリプロピレンブロックポリマーは、好適な界面活性剤であり得る。界面活性剤または界面活性剤の組み合わせを使用して、限定されないが、撹拌から生じる応力を含む１つ以上の応力に対してＰＥＧ化ＴＣを安定化することができる。上記のうちのいくつかは、「増量剤」と称され得る。いくつかは、「等張修飾剤」とも称され得る。抗菌保存剤は、製品の安定性及び抗菌効果のために適用されてもよく、好適な保存剤としては、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、メタクレゾール、メチル／プロピルパラベン、クレゾール、及びフェノール、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。米国特許第７，１４４，５７４号（参照により本明細書に組み込まれる）は、本発明の医薬組成物及び製剤、ならびに他の送達調製物に好適であり得る追加の材料を記載している。
ＰＥＧなどの水溶性ポリマーに連結されたものを含む本発明のＴＣポリペプチドは、徐放系によって、またはその一部として投与することもできる。持続放出組成物としては、フィルムまたはマイクロカプセルを含むが、これらに限定されない成形品の形態の半透過性ポリマーマトリックスを含むが、これに限定されないものが挙げられる。持続放出マトリックスとしては、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：２６７－２７７（１９８１）、Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８－１０５（１９８２））、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒら、上記）、またはポリ－Ｄ－（－）－３－ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）、ポリラクチド（ポリ乳酸）（米国特許第３，７７３，９１９号、ＥＰ５８，４８１）、ポリグリコリド（グリコール酸のポリマー）、ポリラクチドコ－グリコリド（乳酸とグリコール酸とのコポリマー）ポリ無水物、Ｌ－グルタミン酸とガンマ－エチル－Ｌ－グルタメートとのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２，５４７－５５６（１９８３））、ポリ（オルト）エステル、ポリペプチド、ヒアルロン酸、コラーゲン、コンドロイチン硫酸塩、カルボン酸、脂肪酸、リン脂質、多糖類、核酸、ポリアミノ酸、アミノ酸、例えば、フェニルアラニン、チロシン、イソロイシン、ポリヌクレオチド、ポリビニルプロピレン、ポリビニルピロリドン、及びシリコーンなどの生体適合性材料からのものが挙げられる。持続放出組成物には、リポソーム捕捉された化合物も含まれる。化合物を含有するリポソームは、それ自体が知られている方法によって調製される：ＤＥ３，２１８，１２１、Ｅｐｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２：３６８８－３６９２（１９８５）、Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７７：４０３０－４０３４（１９８０）、ＥＰ５２，３２２、ＥＰ３６，６７６、米国特許第４，６１９，７９４号、ＥＰ１４３，９４９、米国特許第５，０２１，２３４号、日本特許出願第８３－１１８００８号、米国特許第４，４８５，０４５号及び同第４，５４４，５４５号、ならびにＥＰ１０２，３２４。引用されるすべての参照文献及び特許は、参照により本明細書に組み込まれる。
リポソーム捕捉されたＴＣポリペプチドは、例えば、ＤＥ３，２１８，１２１、Ｅｐｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２：３６８８－３６９２（１９８５）、Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７７：４０３０－４０３４（１９８０）、ＥＰ５２，３２２、ＥＰ３６，６７６、米国特許第４，６１９，７９４号、ＥＰ１４３，９４９、米国特許第５，０２１，２３４号、日本特許出願第８３－１１８００８号、米国特許第４，４８５，０４５号及び同第４，５４４，５４５号、ならびにＥＰ１０２，３２４に記載される方法によって調製され得る。リポソームの組成物及びサイズは、周知であるか、または当業者が経験的に容易に決定することが可能である。リポソームのいくつかの例は、例えば、Ｐａｒｋ ＪＷ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：１３２７－１３３１（１９９５）、Ｌａｓｉｃ Ｄ ａｎｄ Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ Ｄ（ｅｄｓ）：ＭＥＤＩＣＡＬ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＬＩＰＯＳＯＭＥＳ（１９９８）、Ｄｒｕｍｍｏｎｄ ＤＣ，ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ，ｉｎ Ｔｅｉｃｈｅｒ Ｂ（ｅｄ）：ＣＡＮＣＥＲ ＤＲＵＧ ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ ＡＮＤ ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ（２００２）、Ｐａｒｋ ＪＷ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．８：１１７２－１１８１（２００２）、Ｎｉｅｌｓｅｎ ＵＢ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １５９１（１－３）：１０９－１１８（２００２）、Ｍａｍｏｔ Ｃ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６３：３１５４－３１６１（２００３）に記載される通りである。引用されるすべての参照文献及び特許は、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の文脈において、患者に投与される用量は、経時的に対象において有益な応答を引き起こすのに十分でなければならない。一般に、用量当たり非経口投与される本発明のＴＣポリペプチドの医薬有効量の合計は、患者の体重の約０．０１μｇ／ｋｇ／日～約１００μｇ／ｋｇ、または約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇの範囲であるが、これは治療的裁量に依存する。本実施形態の特定の態様において、コンジュゲートは、１日当たり４μｇ／ｋｇ超～１日当たり約２０μｇ／ｋｇの範囲の用量で投与され得る。また他の態様において、コンジュゲートは、１日当たり４μｇ／ｋｇ超～１日当たり約９μｇ／ｋｇの範囲の用量で投与され得る。さらに他の態様において、コンジュゲートは、１日当たり約４μｇ／ｋｇ～１日当たり約１２．５μｇ／ｋｇの範囲の用量で投与され得る。特定の態様において、コンジュゲートは、過度の毒性を伴わずに忍容される最大用量である用量以下で投与され得る。さらに、コンジュゲートは、週に少なくとも２回投与され得るか、またはコンジュゲートは、週に少なくとも３回、週に少なくとも４回、週に少なくとも５回、週に少なくとも６回、または週に７回投与され得る。特定の態様において、コンジュゲートを２回以上投与する場合、コンジュゲートは、毎回１日当たり４μｇ／ｋｇ超の用量で投与され得る。特に、コンジュゲートは、２週間以上の期間にわたって投与され得る。ある特定の態様において、インターロイキン－１０受容体発現細胞の成長は、参照試料、すなわち、本発明のコンジュゲートと接触していない細胞の試料と比較して、少なくとも５０％、少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％阻害され得る。本実施形態の特定の態様において、コンジュゲートは、１日当たり約５．３μｇ／ｋｇの用量で、または１日当たり約７．１μｇ／ｋｇの用量で、または１日当たり約９．４μｇ／ｋｇの用量で、または１日当たり約１２．５μｇ／ｋｇの用量で投与され得る。投与頻度も治療的裁量に依存し、ヒトでの使用が承認されている市販のＴＣポリペプチド製品よりも頻度が高い、または頻度が低い場合がある。一般に、本発明のＴＣ、ＰＥＧ化ＴＣポリペプチド、コンジュゲートされたＴＣポリペプチド、またはＰＥＧ化されたコンジュゲートされたＴＣポリペプチドの標的化ポリペプチドは、上述の投与経路のいずれかによって投与することができる。
本発明のＴＣの治療用途
本発明のＴＣは、広範囲の障害の治療に有用である。本発明はまた、ＴＣ、ＣＤ８＋Ｔ細胞刺激、及び／またはＴＣ製剤に応答するがんのリスクがあるか、それを有するか、及び／またはそれを有している哺乳動物を治療する方法を含む。ＴＣの投与は、短期的な効果、すなわち、観察されたいくつかの臨床パラメータに対する即時の有益な効果をもたらし得、これは、投与から１２時間または２４時間であり得る一方で、長期的な効果、腫瘍成長の進行の有益な遅延、腫瘍サイズの低減、及び／または循環ＣＤ８＋Ｔ細胞レベルの増加ももたらし得、本発明のＴＣは、当業者に既知の任意の手段によって投与され得、所望の薬理学的効果を得るのに十分な投薬量で、注入を介して、例えば、動脈、腹腔内もしくは静脈内注射、及び／または注入により有益に投与され得る。
ＴＣ投薬量は、１回の治療につき、ｋｇ体重当たり１０～２００ｍｇ、または４０～８０ｍｇのＴＣポリペプチドの範囲であり得る。例えば、投与されるＴＣの投薬量は、ボーラス注射として、及び／または臨床的に必要な期間、例えば、数分～数時間、例えば、最大２４時間の範囲の期間にわたって注入として与えられるｋｇ体重当たり約２０～１００ｍｇのＴＣポリペプチドであり得る。必要に応じて、ＴＣ投与は、１回または数回繰り返され得る。ＴＣの投与は、化学療法剤などの他の医薬品の投与と組み合わされ得る。さらに、本発明は、がんの予防及び／または治療のための方法であって、それを必要とする対象に有効量のＴＣを投与することを含む方法に関する。
ＴＣの平均量は異なり、特に資格のある医師の推奨及び処方に基づいている必要がある。ＴＣの正確な量は、治療される状態の正確な種類、治療される患者の状態、ならびに組成物中の他の成分などの要因に依存する優先事項の問題である。本発明はまた、治療有効量の別の活性剤の投与も提供する。与えられる量は、ＴＣによる療法に基づいて、当業者によって容易に決定され得る。
〔実施例〕
以下の実施例は、特許請求される発明を例示するが、限定するものではない。
実施例１：ＴＬＲアゴニストの合成のための一般的な方法論
本実施例は、本発明のＴＬＲ－アゴニストの合成において使用される一般的な方法論を提供する。
すべての市販の無水溶媒はさらに精製することなく使用し、窒素雰囲気下で保管した。ＵＶ光及び／または可視化のためのＫＭｎＯ４水溶液による染色を使用して、Ｍｅｒｃｋシリカゲル６０ Ｆ２５４プレート上でＴＬＣを実施した。実験手順で詳述した条件を使用して、Ｔｅｌｅｄｙｎｅ ＩＳＣＯからのＣｏｍｂｉ Ｆｌａｓｈ Ｒｆでクロマトグラフィー精製を実施した。Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ－ＮＸ Ｃ１８ ５μｍ ５０×４．６ｍｍカラムを使用して、Ｓｈｉｍａｄｚｕシステムで分析ＨＰＬＣを実施し、カラムは、０．０５％ＴＦＡを含有する水中のアセトニトリルの線形勾配で１ｍｌ／分で溶出した。（移動相Ａ：水中０．０５％トリフルオロ酢酸；移動相Ｂ：９０％アセトニトリル（ＡＣＮ）水溶液中０．０５％トリフルオロ酢酸）またはＷａｔｅｒｓ ＢＥＨ １．７μｍ ｖ２．１×５０ｍｍカラム。分析方法１：１分で０％Ｂ、１１分で０～５０％Ｂ、０．５分で５０～１００％Ｂ、１．５分間１００％Ｂ、１分で１００～０％Ｂ、２分間０％Ｂ；方法２：１分で１０～２０％Ｂ、１１分で２０～７０％Ｂ、０．５分で７０～１００％Ｂ、１．５分間１００％Ｂ、１分で１００～１０％Ｂ、２分間１０％Ｂ；方法３：方法２：１分で０～４０％Ｂ、１１分で４０～９０％Ｂ、０．５分で９０～１００％Ｂ、１．５分間１００％Ｂ、１分で１００～１０％Ｂ、２分間１０％Ｂ；方法４：０．３分で５％Ｂ、０．３～１．５分間５％～１００％Ｂ、１．５分～１．８分間１００％Ｂ、０分～１．８分間０．８ｍｌ／分～１．１ｍｌ／分の流量。
スケールに応じて、Ｇｅｍｉｎｉ－ＮＸ Ｃ１８ ５μｍ １００×３０ｍｍ、１５０×３０ｍｍ、または２５０×５０ｍｍのカラムを使用して、Ｓｈｉｍａｄｚｕシステムで分取ＨＰＬＣを実施した。質量スペクトル（ＭＳ）を、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣＭＳ－２０２０システムで記録し、データを、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬａｂＳｏｌｕｔｉｏｎｓソフトウェアを使用して処理した。６２３０ Ａｃｃｕｒａｔｅ－Ｍａｓｓ ＴＯＦＭＳシステムと結合したＡｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｎａｒｙ ＬＣを、ＨＲ－ＥＳＩ－ＴＯＦ分析に使用した。ＮＭＲスペクトルデータを、５００ＭＨｚ Ｂｒｕｋｅｒ ＮＭＲ分光計で収集した。化学シフト（δ）をｐｐｍで報告し、重水素溶媒シグナルから参照した。結合定数（Ｊ）をヘルツ（Ｈｚ）で報告する。スピン多重度は、以下のように記載される：ｓ（一重線）、ｂｒ（広い）、ｄ（二重線）、ｄｄ（二重二重線）、ｔ（三重線）、ｑ（四重線）、またはｍ（多重線）。単量体抗体をプールし、０．２２μＭ濾過し、さらに使用するまで６５℃以下で保管した。
実施例２：以下の構造－コア１（図１）を含むＴＬＲアゴニストの合成：
Figure 2022520792000065
いくつかの実施形態において、Ｘは、ＣＨまたはＮＨであり、
Ｒ２及びＲ３はそれぞれ、Ｃ４～Ｃ８シクロアルキル、または独立して－Ｈ、Ｃ１～Ｃ１２アルキル、ニトロ含有アルキル、芳香族環、または－Ｃ（ＮＨ）ＮＨ２を形成するように結合され、
Ｒ４は、Ｃ１～Ｃ１２アルキル、Ｃ１～Ｃ１２置換アルキル、Ｃ４～Ｃ８シクロアルキル、Ｃ４～Ｃ８置換シクロアルキル、芳香族環、置換芳香属環、芳香族ヘテロ環、置換芳香族ヘテロ環、－ＯＮＨ２末端Ｃ１～Ｃ１２アルキル、または不在である。いくつかの実施形態において、Ｚ１＝Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル、またはＣ３～Ｃ８ニトロ含有複素環である。
コア１構造を有するＴＬＲ－アゴニストは、以下のスキームに開示されるように合成された。
Figure 2022520792000066
ｔｅｒｔ－ブチル２－（２－（３－ニトロキノリン－４－イルアミノ）エトキシ）エチルカルバメート（１）：４－クロロ－３－ニトロキノリン（１７５０ｍｇ、８．３９ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（３０ｍＬ）に溶解し、遊離アミン（１８００ｍｇ、８．５５ｍｍｏｌ）、続いてＴＥＡ（２．２９ｍＬ、１７．３ｍｍｏｌ）で処理した。反応物を室温で１８時間保持し、次いでＨ２Ｏ（２０ｍＬ）、ブライン（１０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、真空中で濃縮した。標的化合物（１）を、黄色の固体（３１３０ｍｇ、９９％）として得た、ＭＳ ｍ／ｚ ３９９（Ｍ＋Ｎａ）＋。
ｔｅｒｔ－ブチル２－（２－（３－アミノキノリン－４－イルアミノ）エトキシ）エチルカルバメート（２）：ニトロ化合物（１）（３．１２ｇ、８．２９ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（１００ｍＬ）及び水（８０ｍＬ）に溶解した。亜鉛（１３．５５ｇ、２０７．２ｍｍｏｌ）を、一度に添加し、続いてＮＨ４Ｃｌ（１３．３ｇ、２４８．６ｍｍｏｌ）を添加した。懸濁液を室温で１時間激しく撹拌した（ＨＰＬＣ）。濾過後、ケーキをＴＨＦ（２０ｍＬ×２）で洗浄した。水相が飽和されるまで濾液にＮａＣｌを添加した。液相を収集し、ＴＨＦ層を分離した。水層をＴＨＦ／ＥＡ（５０ｍＬ／５０ｍＬ）で抽出した。有機層を組み合わせ、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濃縮して、次のステップのための残留物（２）（３．１ｇ、＞１００％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ３４７（Ｍ＋Ｈ）＋。
ｔｅｒｔ－ブチル２－（２－（２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）エトキシ）エチルカルバメート（３）：アミン化合物（２）（３．１ｇ、粗製、＜８．９５ｍｍｏｌ）及びトリエチルオルトバレレート（３．１ｍＬ、１３．５ｍｍｏｌ）を、トルエン（２００ｍＬ）に懸濁し、１１０℃に加熱した。次いで、ピリジンＨＣｌ（５５ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を４時間加熱した。混合物を室温で４８時間保持した。液体をデカントし、残りの固体／残留物を、トルエン（２０ｍＬ×２）で撹拌し、液体と合わせ、濃縮した。残留物を、ＤＣＭに溶解し、カラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中のメタノール、０～１０～２０％、８０ｇカラム）によって精製して、標的化合物（３）（１．０５ｇ、３０％、ニトロ化合物１から２段階）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４１３（Ｍ＋Ｈ）＋。
１－（２－（２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）エトキシ）エチル）－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン５－オキシド（４）：化合物３（１．０５ｇ、２．５４ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（２０ｍＬ）に溶解し、ｍＣＰＢＡ（７５０ｍｇ、２．８３ｍｍｏｌ）で処理した。反応物を室温で４時間保持した。混合物を、ＮａＨＣＯ３飽和溶液（１５ｍＬ×３）で洗浄し、乾燥させ、濃縮して、次のステップ（４）のための粗製シロップ（９００ｍｇ、８３％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４２９（Ｍ＋Ｈ）＋。
ｔｅｒｔ－ブチル２－（２－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）エトキシ）エチルカルバメート（５）：圧力チューブ内で、化合物４（９００ｍｇ、２．１８ｍｍｏｌ）を、ジクロロエタン（２５ｍＬ）に溶解し、濃縮水酸化アンモニウム（２８％、１ｍＬ）で処理し、温度を８０℃にした。この混合物に、冷却後５分間にわたって塩化トシル（４７０ｍｇ、２．４６ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加した。濃縮水酸化アンモニウム（０．５ｍＬ）を添加し、チューブを密封した。チューブを８０℃で４時間加熱した。冷却後、混合物を、ＤＣＭ（６０ｍＬ）で希釈し、水（４０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、標的化合物（５）（７５０ｍｇ、８０％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４２８（Ｍ＋Ｈ）＋。
１－（２－（２－アミノエトキシ）エチル）－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－４－アミン（Ａ）：化合物５（７５０ｍｇ、１．７５ｍｍｏｌ）を、室温で１７時間、ＥｔＯＨ（２０ｍＬ）中１．２５ＭのＨＣｌで処理した。次に、反応物を真空中で乾燥させ、残留物をＥｔＯＨ／Ｅｔ２Ｏ（１／１０；２０ｍＬ）に再懸濁し、濾過した。固体を収集して、標的化合物（Ａ）（６００ｍｇ、８５％）を得た。ＨＰＬＣ（方法１）：５．８分、ＭＳ ｍ／ｚ ３２８（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000067
ｔｅｒｔ－ブチル４－（２－（２－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）エトキシ）エチルカルバモイル）ピペラジン－１－カルボキシレート（６）：化合物Ａ、ＨＣｌ塩（１００ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（１０ｍＬ）に溶解し、ＴＥＡ（６８ｕＬ、０．５１１ｍｍｏｌ）で処理した。懸濁液に、ｔｅｒｔ－ブチル４－（クロロカルボニル）ピペラジン－１－カルボキシレート（７５ｍｇ、０．２８６ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で１７時間保持し、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ（４ｍＬ／１ｍＬ）で希釈し、次いで溶液をブラインで洗浄した。有機相をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、純粋な生成物６（１３０ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ、９６％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ５４０（Ｍ＋Ｈ）＋。
Ｎ－（２－（２－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）エトキシ）エチル）ピペラジン－１－カルボキサミド（７）：化合物（６）（１０ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ）を、ＥｔＯＨ中のＨＣｌ（約１．５Ｍ、１ｍＬ）で、室温で１時間、次いで６０℃で１時間処理し、真空中で乾燥させた。残留物を、ジエチルエーテルで洗浄し、乾燥させて、標的化合物（７）（９ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ、定量的）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４４０（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000068
Ｎ－（２－（２－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）エトキシ）エチル）モルホリン－４－カルボキサミド（８）：６について記載した同様の手順を使用して、化合物Ａを、モルホリン－４－カルボニルクロリドと反応させることにより、化合物７を調製して、標的化合物７（７ｍｇ、４２％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４４１（Ｍ＋Ｈ）。
Figure 2022520792000069
４－（（Ｒ）－２－（（Ｒ）－２－（２－（アミノオキシ）アセトアミド）－３－メチルブタンアミド）－５－ウレイドペンタンアミド）ベンジル４－（２－（２－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）エトキシ）エチルカルバモイル）ピペラジン－１－カルボキシレート（９）：化合物７（２２ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（１ｍＬ）に溶解し、ＤＩＰＥＡ（３．５ｕＬ、０．０２ｍｍｏｌ）、続いて２，５－ジオキソピロリジン－１－イル２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノオキシ）アセテート（３．３ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）で処理した。反応物を室温で１７時間保持した。混合物に、ＴＦＡ（０．３ｍＬ）を添加し、１５分間撹拌した。真空中で乾燥させた後、残留物を分取ＨＰＬＣにより精製して、化合物９（７から１５ｍｇ、２２％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ９１８（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000070
４－（（Ｒ）－２－（（Ｒ）－２－（２－（アミノオキシ）アセトアミド）－３－メチルブタンアミド）－５－ウレイドペンタンアミド）ベンジル２－ブチル－１－（２－（２－（ピペラジン－１－カルボキサミド）エトキシ）エチル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－４－イルカルバメート（１０）：化合物６（６５ｍｇ、０．０９７ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解し、ＤＩＰＥＡ（３４ｕＬ、０．１９４ｍｍｏｌ）、続いてＦｍｏｃ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＰＮＰ（９４ｍｇ、０．１１６ｍｍｏｌ）で処理した。反応物を室温で１時間保持し、水（１０ｍＬ）を添加した。固体を収集し、水（２ｍＬ）で洗浄し、乾燥させた。黄色の固体を、ＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解し、ジエチルアミン（１００ｕＬ、０．９７ｍｍｏｌ）で３０分間室温で処理した。反応混合物を分取ＬＣにより精製し、中間体Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＯＣＯ－（化合物６）を得た。この中間体（１１ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（１ｍＬ）に溶解し、ＤＩＰＥＡ（３．５ｕＬ、０．０２ｍｍｏｌ）、続いて２，５－ジオキソピロリジン－１－イル２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノオキシ）アセテート（３．３ｍｇ、０．０１１ｍｏｍｏｌ）で処理した。反応物を室温で１７時間保持した。ＴＦＡ（０．３ｍＬ）を添加し、混合物を１５分間撹拌した。真空中で乾燥させた後、残留物を分取ＨＰＬＣにより精製して、化合物１０（化合物６から１５ｍｇ、１６％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ９１８（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000071
４－（（Ｒ）－２－（（Ｒ）－２－（２－（アミノオキシ）アセトアミド）－３－メチルブタンアミド）－５－ウレイドペンタンアミド）ベンジル１－（２－（２－アミノエトキシ）エチル）－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－４－イルカルバメート（１１）：１０について記載されるのと同様の手順を用いて、５を出発材料として使用して化合物１１を調製して、標的化合物１１（５から２２ｍｇ、２１％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ８０６（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000072
４－（（Ｒ）－２－（（Ｒ）－２－（（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）プロパンアミド）－３－メチルブタンアミド）－５－ウレイドペンタンアミド）ベンジル２－ブチル－１－（２－（２－（ピペラジン－１－カルボキサミド）エトキシ）エチル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－４－イルカルバメート（１２）：１０について記載されるのと同様の手順を用いて、５，２，５－ジオキソピロリジン－１－イル３－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）プロパノエートを出発材料として使用して、化合物１２を調製して、標的化合物１２（ＴＦＡ処理なし）（５から１５ｍｇ、１７％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ９８４（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000073
アジピン酸－ビス－（Ｎ－（２－（２－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）エトキシ）エチル）ピペラジン－１－カルボキサミド（１３）：ＤＭＦ（１ｍＬ）中の化合物７（８ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ）及びアジピン酸（２ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）の溶液に、ＥＤＣ（３ｍｇ、０．０１６ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（１ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ）、及びＤＩＥＡ（４ｕｌ、０．２３ｍｍｏｌ）を２３℃で添加した。２４時間後、混合物を分取ＬＣにより精製し、乾燥させて、化合物１３（５ｍｇ、０．００４ｍｍｏｌ、２３％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ １２１７（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000074
ｔｅｒｔ－ブチル４－（４－アミノ－２－エチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチルカルバメート（１４）：Ｂｏｃ－１，４－ブタンジアミン及びトリエチルオルトプロピオネートを出発材料として使用し、５について記載されるのと同様の手順を使用して、化合物１４を調製して、標的化合物１４（出発材料から４２０ｍｇ、１．０９５ｍｍｏｌ、１４．５％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ３８４（Ｍ＋Ｈ）＋。
１－（４－アミノブチル）－２－エチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－４－アミン、２ＨＣｌ（Ｂ）：化合物１４（４００ｍｇ、１．０４３ｍｍｏｌ）を、ジオキサン（１０ｍＬ、４０ｍｍｏｌ）中のＤＣＭ（０．５ｍＬ）及び４ＭのＨＣｌに２３℃で添加した。１時間後、ＬＣＭＳは、反応が完了したことを示した。溶媒を真空中で除去し、高真空ポンプで６時間乾燥させて、化合物Ｂ（４００ｍｇ、１．１２９ｍｍｏｌ、９９％）を淡黄色の固体として得た。ＭＳ ｍ／ｚ ２８４（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000075
ｔｅｒｔ－ブチル２－（４－（４－アミノ－２－エチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチルアミノ）アセテート（１５）：ＤＣＭ（５ｍＬ）中の化合物Ｂ（３１ｍｇ、０．１０９ｍｍｏｌ）の溶液に、ｔｅｒｔ－ブチルブロモアセテート（１５ｕＬ、０．１０２ｍｍｏｌ）を添加し、続いてＴＥＡ（８８ｕＬ、０．６８１ｍｍｏｌ）を２３℃で添加した。２４時間後、混合物を分取ＬＣにより精製して、化合物１５（４ｍｇ、０．００６ｍｍｏｌ、６％）を黄色の固体として得た。ＭＳ ｍ／ｚ ３９８（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000076
５－アミノ－Ｎ－（４－（４－アミノ－２－エチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチル）ピコリンアミド（１６）：ＤＭＦ（１ｍＬ）中の化合物Ｂ（２５ｍｇ、０．０７１ｍｍｏｌ）及び５－アミノピリジン－２－カルボン酸（１０ｍｇ、０．０７２ｍｍｏｌ）の溶液に、ＨＡＴＵ（２０ｍｇ、０．０８３ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（５０ｕＬ、０．２８７ｍｍｏｌ）を２３℃で添加した。１時間後、混合物を分取ＬＣにより精製し、乾燥させて、化合物１６（２１ｍｇ、０．０３３ｍｍｏｌ、４６％）を白色の固体として得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４０４（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000077
Ｎ－（４－（４－アミノ－２－エチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチル）－５，６，７－トリメトキシ－１Ｈ－インドール－２－カルボキサミド（１７）ａ：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｂ及び５，６，７－トリメトキシ－１Ｈ－インドール－２－カルボン酸を出発材料として使用して、化合物１７を調製して、標的化合物１７（１３ｍｇ、０．０１７ｍｍｏｌ、４４％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ５１７（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000078
５－アミノ－Ｎ－（２－（２－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）エトキシ）エチル）ピコリンアミド（１８）：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ａ及び５－アミノピリジン－２－カルボン酸を出発材料として使用して、化合物１８を調製して、標的化合物１８（２４ｍｇ、０．０３６ｍｍｏｌ、８２％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４４８（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000079
メチル３－（４－（Ｎ－（４－（４－アミノ－２－エチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチル）スルファモイル）フェニル）プロパノエート（１９）：ＤＭＦ（１ｍＬ）中の化合物Ｂ（１４ｍｇ、０．０３５ｍｍｏｌ）及び５－アミノピリジン－２－カルボン酸（６ｍｇ、０．０４３ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＩＥＡ（４０ｕＬ、０．２３０ｍｍｏｌ）を２３℃で添加した。３０分後、混合物を分取ＬＣにより精製し、乾燥させて、化合物１９（１５ｍｇ、０．０２０ｍｍｏｌ、５８％）を淡黄色の固体として得た。ＭＳ ｍ／ｚ ５１０（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000080
１－（４－（４－アミノ－２－エチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチル）－３－（３－（ピロリジン－１－イルメチル）ベンジル）尿素（２０）：ＤＭＦ（１ｍＬ）中の（３－（ピロリジン－１－イルメチル）フェニル）メタンアミン（１９ｍｇ、０．１００ｍｍｏｌ）及びニトロフェニルクロロホルメート（２１ｍｇ、０．１０４ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＩＥＡ（３４ｕＬ、０．１９５ｍｍｏｌ）を２３℃で添加した。１０分後、ＬＣＭＳは、ニトロフェノールの活性化が完了したことを示した。この混合物に化合物Ｂを添加した。２時間後、混合物を分取ＬＣにより精製し、乾燥させて、化合物２０（３ｍｇ、０．００６ｍｍｏｌ、６％）を白色の固体として得た。
Figure 2022520792000081
Ｎ－（４－（４－アミノ－２－エチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチル）ピラジン－２－カルボキサミド（２１）：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｂ及びピラジンカルボン酸を出発材料として使用して、化合物２８を調製して、標的化合物２１（１１ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ、２３％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ３９０（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000082
ｔｅｒｔ－ブチル２－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）エチルカルバメート（２２）：化合物５について記載されるのと同様の手順を用いて、４－クロロ－３－ニトロキノリン、ｔｅｒｔ－ブチル２－アミノエチルカルバメート、及びトリエチルオルトバレレートを出発材料として使用して、化合物２２を調製して、標的化合物２２（１４０ｍｇ、０．３６５ｍｍｏｌ、３３％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ３８４（Ｍ＋Ｈ）＋。
１－（４－アミノブチル）－２－エチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－４－アミン、３ＨＣｌ（Ｃ）：Ａについて記載されるのと同様の手順を用いて、化合物２２を出発材料として使用して化合物Ｃを調製して、標的化合物Ｃ（６０ｍｇ、０．１６９ｍｍｏｌ、定量的）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ２８４（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000083
Ｎ－（２－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）エチル）ピラジン－２－カルボキサミド（２３）：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｃ及びピラジンカルボン酸を出発材料として使用して、化合物２３を調製して、標的化合物２３（８ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ、２９％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ３９０（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000084
（Ｓ）－ｔｅｒｔ－ブチル１－（２－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）エチルアミノ）－５－グアニジノ－１－オキソペンタン－２－イルカルバメート（２４）：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｃ及びＢｏｃ－Ａｒｇ－ＯＨを出発材料として使用して、化合物２４を調製して、標的化合物２４（７５ｍｇ、０．０９８ｍｍｏｌ、７９％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ５４０（Ｍ＋Ｈ）＋。
（Ｓ）－２－アミノ－Ｎ－（２－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）エチル）－５－グアニジノペンタンアミド、３ＨＣｌ（２５）：化合物２４（６０ｍｇ、０．１１１ｍｍｏｌ）に、ジオキサン中４ＭのＨＣｌ（１ｍＬ、４ｍｍｏｌ）を２３℃で添加した。２時間後、反応物を真空中で乾燥させた。残留物を高真空ポンプ下で乾燥させて、化合物２５（６４ｍｇ、０．１１０ｍｍｏｌ、定量的）を白色の固体として得た。
Figure 2022520792000085
（Ｓ）－ｔｅｒｔ－ブチル１－（２－（２－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）エトキシ）エチルアミノ）－５－グアニジノ－１－オキソペンタン－２－イルカルバメート（２６）：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ａ及びＢｏｃ－Ａｒｇ－ＯＨを出発材料として使用して、化合物２６を調製して、標的化合物２６（２０ｍｇ、０．０１９ｍｍｏｌ、５９％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ５８４（Ｍ＋Ｈ）＋。
（Ｓ）－２－アミノ－Ｎ－（２－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）エチル）－５－グアニジノペンタンアミド（２７）：２５について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物２６を出発材料として使用して、化合物２７を調製して、標的化合物２７（１４ｍｇ、０．０１６ｍｍｏｌ、定量的）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４８４（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000086
Ｎ－（２－（２－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）エトキシ）エチル）ピラジン－２－カルボキサミド（２８）：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ａ及びピラジンカルボン酸を出発材料として使用して、化合物２８を調製して、標的化合物２８（１．３ｍｇ、０．００１ｍｍｏｌ、４％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４３４（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000087
１－（２－（２－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）エトキシ）エチル）グアニジン（２９）：ＤＭＦ（１ｍＬ）及び水（１ｍＬ）中の化合物Ａ（１５ｍｇ、０．０３８ｍｍｏｌ）及びメチルカルバムイミドチオエートビス（スルフェート）（２５ｍｇ、０．０９０ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＥＡ（５０ｕＬ、０．３５８ｍｍｏｌ）を８０℃で添加した。１８時間後、混合物を分取ＬＣにより精製して、化合物２９（１２ｍｇ、０．０１７ｍｍｏｌ、４５％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ３７０（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000088
１－（２－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）エチル）グアニジン（３０）：２９について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｃを出発材料として使用して、化合物３０を調製して、標的化合物３０（１０ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ、２９％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４３４（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000089
１－（４－（４－アミノ－２－エチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチル）グアニジン（３１）：２９について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｂを出発材料として使用して、化合物３１を調製して、標的化合物３１（８ｍｇ、０．０１０ｍｍｏｌ、２９％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ３２６（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000090
（Ｓ）－２－アセトアミド－Ｎ－（２－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）エチル）－５－グアニジノペンタンアミド（３２）：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｃ及びアセチル－アルギンを出発材料として使用して、化合物３２を調製して、標的化合物３２（１８ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ、６９％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４８２（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000091
（Ｓ）－２－アセトアミド－Ｎ－（２－（２－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）エトキシ）エチル）－５－グアニジノペンタンアミド（３３）：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ａ及びアセチル－アルギンを出発材料として使用して、化合物３３を調製して、標的化合物３３（４ｍｇ、０．０１９ｍｍｏｌ、６７％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ５２６（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000092
（Ｓ）－２－アセトアミド－Ｎ－（４－（４－アミノ－２－エチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチル）－５－グアニジノペンタンアミド（３４）：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｂ及びアセチル－アルギンを出発材料として使用して、化合物３４を調製して、標的化合物３４（５ｍｇ、０．００７ｍｍｏｌ、３０％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４８２（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000093
Ｎ－（４－（４－アミノ－２－エチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチル）ベンズアミド（３５）：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｂ及び安息香酸を出発材料として使用して、化合物３５を調製して、標的化合物３５（８ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ、５３％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ３８８（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000094
ｔｅｒｔ－ブチル４－（４－（４－アミノ－２－エチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチルカルバモイル）フェネチルカルバメート（３６）：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｂ及び４－（（２－ｂｏｃ－アミノ）エチル）安息香酸を出発材料として使用して、化合物３６を調製して、標的化合物３６（２５ｍｇ、０．０３３ｍｍｏｌ、３８％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ５３１（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000095
Ｎ－（４－（４－アミノ－２－エチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチル）－４－グアニジノブタンアミド（３７）：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｂ及び４－グアニド酪酸を出発材料として使用して、化合物３７を調製して、標的化合物３７（１０ｍｇ、０．０１６ｍｍｏｌ、４５％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４１１（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000096
Ｎ－（４－（４－アミノ－２－エチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチル）－２，３，５，６－テトラフルオロベンズアミド（３８）：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｂ及び２，３，５，６－テトラフルオロ安息香酸を出発材料として使用して、化合物３８を調製して、標的化合物３８（７ｍｇ、０．０１０ｍｍｏｌ、３６％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４６０（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000097
ｔｅｒｔ－ブチル４－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチルカルバメート（３９）：化合物５について記載されるのと同様の手順を用いて、４－クロロ－３－ニトロキノリン、ｔｅｒｔ－ブチル４－アミノブチルカルバメート、及びトリエチルオルトバレレートを出発材料として使用して、化合物３９を調製して、標的化合物３９（出発材料から１７７ｍｇ、０．４３０ｍｍｏｌ、２０％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４１２（Ｍ＋Ｈ）＋。
１－（４－アミノブチル）－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－４－アミン、３ＨＣｌ（Ｄ）：Ａについて記載されるのと同様の手順を用いて、化合物３９を出発材料として使用して、化合物Ｄを調製して、標的化合物Ｄ（１８０ｍｇ、０．４３１ｍｍｏｌ、定量的）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ３１２（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000098
Ｎ－（４－（４－アミノ－２－エチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチル）－４－ヨードベンズアミド（４０）：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｂ及び４－ヨード安息香酸を出発材料として使用して、化合物４０を調製して、標的化合物４０（１５ｍｇ、０．０２０ｍｍｏｌ、７２％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ５１４（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000099
Ｎ－（４－（４－アミノ－２－エチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチル）－４－（２－グアニジノエチル）ベンズアミド（４１）：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｂ及び４－（２－グアニジノエチル）安息香酸を出発材料として使用して、化合物４１を調製して、標的化合物４１（７ｍｇ、０．００９ｍｍｏｌ、２９％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４７３（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000100
Ｎ－（４－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチル）ベンズアミド（４２）：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｄ及び安息香酸を出発材料として使用して、化合物４２を調製して、標的化合物４２（６ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ、３８％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４１６（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000101
ｔｅｒｔ－ブチル４－（４－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチルカルバモイル）フェネチルカルバメート（４３）：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｄ及び４－（（２－ｂｏｃ－アミノ）エチル）安息香酸を出発材料として使用して、化合物４３を調製して、標的化合物４３（９ｍｇ、０．０１０ｍｍｏｌ、３８％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ５５９（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000102
ｔｅｒｔ－ブチル４－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチルカルバメート（４４）：５について記載されるのと同様の手順を用いて、４－クロロ－３－ニトロ－１，５－ナフチリジン、ｔｅｒｔ－ブチル４－アミノエチルカルバメート、及びトリエチルオルトバレレートを出発材料として使用して、化合物４４を調製して、標的化合物４４（出発材料から１２０ｍｇ、０．１５９ｍｍｏｌ、５．３％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４１３（Ｍ＋Ｈ）＋。
１－（４－アミノブチル）－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］［１，５］ナフチリジン－４－アミン、４ＨＣｌ（Ｅ）：Ａについて記載されるのと同様の手順を用いて、化合物４４を出発材料として使用して、化合物Ｅを調製して、標的化合物Ｅ（１４５ｍｇ、０．２９６ｍｍｏｌ、定量的）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ３１３（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000103
Ｎ－（４－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチル）ピラジン－２－カルボキサミド（４５）：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｄ及びピラジンカルボン酸を出発材料として使用して、化合物４５を調製して、標的化合物４５（４ｍｇ、０．００４ｍｍｏｌ、１４％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４１８（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000104
４－アミノ－Ｎ－（４－（４－アミノ－２－エチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチル）－３－メトキシベンズアミド（４６）：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｂ及び４－アミノ－３－メトキシ安息香酸を出発材料として使用して、化合物４６を調製して、標的化合物４６（１２．１ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ、５８％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４３３（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000105
４－アミノ－Ｎ－（４－（４－アミノ－２－エチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチル）ベンズアミド（４７）：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｂ及び４－アミノ安息香酸を出発材料として使用して、化合物４７を調製して、標的化合物４７（６ｍｇ、０．００７ｍｍｏｌ、３０％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４０３（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000106
４－アミノ－Ｎ－（４－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチル）ベンズアミド（４８）：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｄ及び４－アミノ安息香酸を出発材料として使用して、化合物４８を調製して、標的化合物４８（０．４ｍｇ、０．０００５ｍｍｏｌ、２％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４３１（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000107
４－アミノ－Ｎ－（４－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチル）－３－メトキシベンズアミド（４９）：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｄ及び４－アミノ－３－メトキシ安息香酸を出発材料として使用して、化合物４９を調製して、標的化合物４９（４．２ｍｇ、０．００５ｍｍｏｌ、２１％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４６１（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000108
２－アセチル－Ｎ－（４－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチル）ベンズアミド（５０）：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｄ及び２－アセチル安息香酸を出発材料として使用して、化合物５０を調製して、標的化合物５０（７．６ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ、４３％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４５８（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000109
Ｎ－（４－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチル）－４－（２－アミノエチル）ベンズアミド、４Ｈｃｌ（５１）：Ａについて記載されるのと同様の手順を用いて、化合物４３を出発材料として使用して、化合物５１を調製して、標的化合物５１（１０ｍｇ、０．０１７ｍｍｏｌ、定量的）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４５９（Ｍ＋Ｈ）＋
Figure 2022520792000110
Ｎ－（４－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］［１，５］ナフチリジン－１－イル）ブチル）ベンズアミドベンズアミド（５２）：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｅ及び安息香酸を出発材料として使用して、化合物５２を調製して、標的化合物５２（１．５ｍｇ、０．００２ｍｍｏｌ、８％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４１７（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000111
ｔｅｒｔ－ブチル４－（４－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］［１，５］ナフチリジン－１－イル）ブチルカルバモイル）フェネチルカルバメート（５３）：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｅ及び４－（（２－ｂｏｃ－アミノ）エチル）安息香酸を出発材料として使用して、化合物５３を調製して、標的化合物５３（３．８ｍｇ、０．００４ｍｍｏｌ、１６％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ５６０（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000112
Ｎ－（４－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］［１，５］ナフチリジン－１－イル）ブチル）ピラジン－２－カルボキサミド（５４）：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｄ及びピラジンカルボン酸を出発材料として使用して、化合物５４を調製して、標的化合物５４（３ｍｇ、０．００４ｍｍｏｌ、２０％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４１９（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000113
Ｎ－（４－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］［１，５］ナフチリジン－１－イル）ブチル）－４－グアニジノブタンアミド（５５）：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｅ及び４－グアニドカルボン酸を出発材料として使用して、化合物５５を調製して、標的化合物５５（２ｍｇ、０．００３ｍｍｏｌ、１２％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４４０（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000114
Ｎ－（４－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］［１，５］ナフチリジン－１－イル）ブチル）－４－（２－アミノエチル）ベンズアミド、４ＴＦＡ（５６）：化合物５３（３．６ｍｇ、０．００６ｍｍｏｌ）に、ＤＣＭ（０．５ｍＬ）及びＴＦＡ（１ｍｌ）を２３℃で添加した。２０分後、反応物を真空中で乾燥させ、次いで高真空ポンプで一晩乾燥させて、標的化合物５６（７ｍｇ、０．００８ｍｍｏｌ、定量的）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４６０（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000115
２－アセチル－Ｎ－（４－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］［１，５］ナフチリジン－１－イル）ブチル）ベンズアミド（５７）：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｅ及び２－アセチル安息香酸を出発材料として使用して、化合物５７を調製して、標的化合物５７（５．２ｍｇ、０．００６ｍｍｏｌ、２７％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４５９（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000116
４－アミノ－Ｎ－（４－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］［１，５］ナフチリジン－１－イル）ブチル）－３－メトキシベンズアミド（５８）：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｅ及び４－アミノ－３－メトキシ安息香酸を出発材料として使用して、化合物５８を調製して、標的化合物５８（（４．３ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ、２０％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４６２（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000117
４－アミノ－Ｎ－（４－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチル）ベンズアミド（５９）：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｅ及び４－アミノ安息香酸を出発材料として使用して、化合物５９を調製して、標的化合物５９（１．６ｍｇ、０．００２ｍｍｏｌ、８％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４３２（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000118
Ｎ－（４－（４－アミノ－２－エチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチル）－４－（２－ジメチルアミノ）ベンズアミド（６０）：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｂ及び４－ジメチルアミノ安息香酸を出発材料として使用して、化合物６０を調製して、標的化合物６０（１ｍｇ、０．００１ｍｍｏｌ、６％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４３１（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000119
（Ｅ）－Ｎ－（４－（４－アミノ－２－エチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチル）－３－（４－（ジメチルアミノ）フェニル）アクリルアミド（６１）：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｂ及び４－ジメチルアミノケイ皮酸を出発材料として使用して、化合物６１を調製して、標的化合物６１（２ｍｇ、０．００３ｍｍｏｌ、１１％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４５７（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000120
Ｎ－（４－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチル）－４－（ジメチルアミノ）ベンズアミド（６２）：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｄ及び４－ジメチルアミノ安息香酸を出発材料として使用して、化合物６２を調製して、標的化合物６２（３．５ｍｇ、０．００４ｍｍｏｌ、２０％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４５９（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000121
（Ｅ）－Ｎ－（４－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチル）－３－（４－（ジメチルアミノ）フェニル）アクリルアミド（６３）：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｄ及び４－ジメチルアミノケイ皮酸を出発材料として使用して、化合物６３を調製して、標的化合物６３（４．５ｍｇ、０．００５ｍｍｏｌ、２５％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４８５（Ｍ＋Ｈ）＋
Figure 2022520792000122
Ｎ－（４－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］［１，５］ナフチリジン－１－イル）ブチル）－４－（ジメチルアミノ）ベンズアミド（６４）：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｅ及び４－ジメチルアミノ安息香酸を出発材料として使用して、化合物６４を調製して、標的化合物６４（０．５ｍｇ、０．００１ｍｍｏｌ、７％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４６０（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000123
（Ｅ）－Ｎ－（４－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］［１，５］ナフチリジン－１－イル）ブチル）－３－（４－（ジメチルアミノ）フェニル）アクリルアミド（６５）：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｅ及び４－ジメチルアミノケイ皮酸を出発材料として使用して、化合物６５を調製して、標的化合物６５（０．５ｍｇ、０．００１ｍｍｏｌ、７％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４８６（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000124
（Ｅ）－Ｎ－（２－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）エチル）－３－（４－（ジメチルアミノ）フェニル）アクリルアミド（６６）：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｃ及び４－ジメチルアミノケイ皮酸を出発材料として使用して、化合物６６を調製して、標的化合物６６（３ｍｇ、０．００４ｍｍｏｌ、１６％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４５７（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000125
ｔｅｒｔ－ブチル４－（２－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）エチルカルバモイル）フェネチルカルバメート（６７）：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｃ及び４－（２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）エチル）安息香酸を出発材料として使用して、化合物６７を調製して、標的化合物６７（１．５ｍｇ、０．００２ｍｍｏｌ、１１％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４５７（Ｍ＋Ｈ）＋。
Ｎ－（２－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）エチル）－４－（２－アミノエチル）ベンズアミド（６８）：５６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物６７を出発材料として使用して、化合物６８を調製して、標的化合物６８（２．９ｍｇ、０．００３ｍｍｏｌ、定量）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４３１（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000126
１－（４－アミノブチル）－２－エチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－４－アミン（Ｆ）：Ａについて記載されるのと同様の手順を用いて、４－クロロ－３－ニトロ－１，５－ナフチリジン、ｔｅｒｔ－ブチル４－アミノブチルカルバメート及びトリエチルオルトアセテートを出発材料として使用して、化合物Ｆを調製して、標的化合物Ｆ（出発材料から１３０ｍｇ、０．３１６ｍｍｏｌ、９％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ２７０（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000127
Ｎ－（４－（４－アミノ－２－メチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチル）ベンズアミド（６９）：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｆ及び安息香酸を出発材料として使用して、化合物６９を調製して、標的化合物６９（６．５ｍｇ、０．００８ｍｍｏｌ、４２％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ３７４（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000128
Ｎ－（４－（４－アミノ－２－メチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチル）－４－（ジメチルアミノ）ベンズアミド（７０）：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｆ及び４－ジメチルアミノ安息香酸を出発材料として使用して、化合物７０を調製して、標的化合物７０（６．５ｍｇ、０．００９ｍｍｏｌ、３９％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４１７（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000129
Ｎ－（４－（４－アミノ－２－メチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチル）－４－（ピロリジン－１－イル）ベンズアミド（７１）：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｆ及び４－（１－ピロリジニル安息香酸を出発材料として使用して、化合物７１を調製して、標的化合物７１（３．１ｍｇ、０．００４ｍｍｏｌ、１８％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４４３（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000130
Ｎ－（４－（４－アミノ－２－メチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチル）－４－（ジエチルアミノ）ベンズアミド（７２）：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｆ及び４－（ジエチルアミノ）安息香酸を出発材料として使用して、化合物７２を調製して、標的化合物７２（６．４ｍｇ、０．００８ｍｍｏｌ、４１％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４４５（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000131
３，４－ジアミノ－Ｎ－（４－（４－アミノ－２－エチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチル）ベンズアミド（７３）：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｂ及び３，４－ジアミノ安息香酸を出発材料として使用して、化合物７３を調製して、標的化合物７３（１．１ｍｇ、０．００１ｍｍｏｌ、４％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４１８（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000132
Ｎ－（４－（４－アミノ－２－エチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチル）－４－（ピロリジン－１－イル）ベンズアミド（７４）：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｂ及び４－（ピロリジン－１－イル）安息香酸を出発材料として使用して、化合物７４を調製して、標的化合物７４（４．５ｍｇ、０．００５ｍｍｏｌ、１９％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４５７（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000133
Ｎ－（４－（４－アミノ－２－エチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチル）－４－（メチルアミノ）ベンズアミド（７５）：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｂ及び４－メチルアミノ安息香酸を出発材料として使用して、化合物７５を調製して、標的化合物７５（７．６ｍｇ、０．００９ｍｍｏｌ、３３％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４１７（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000134
４－アミノ－Ｎ－（４－（４－アミノ－２－エチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチル）－３－フルオロベンズアミド（７６）：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｂ及び３－フルオロ－４－アミノ安息香酸を出発材料として使用して、化合物７６を調製して、標的化合物７６（７ｍｇ、０．００８ｍｍｏｌ、３１％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４２１（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000135
Ｎ－（４－（４－アミノ－２－エチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチル）－４－（ジメチルアミノ）－３，５－ジフルオロベンズアミド（７７）：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｂ及び４－（ジメチルアミノ）－３，５－ジフルオロ安息香酸を出発材料として使用して、化合物７７を調製して、標的化合物７７（９．５ｍｇ、０．０１０ｍｍｏｌ、４１％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４６７（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000136
Ｎ－（４－（４－アミノ－２－エチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチル）－４－（ジメチルアミノ）－３－フルオロベンズアミド（７８）：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｂ及び４－（ジメチルアミノ）－３－フルオロ安息香酸を出発材料として使用して、化合物７８を調製して、標的化合物７８（１２ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ、４９％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４４９（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000137
Ｎ－（４－（４－アミノ－２－エチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチル）－４－（ジメチルアミノ）－３－ニトロベンズアミド（７９）：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｂ及び４－（ジメチルアミノ）－３－ニトロ安息香酸を出発材料として使用して、化合物７９を調製して、標的化合物７９（１１ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ、５０％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４７６（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000138
Ｎ－（４－（４－アミノ－２－エチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチル）－４－（ジエチルアミノ）ベンズアミド（８０）：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｂ及び４－（ジエチルアミノ）安息香酸を出発材料として使用して、化合物８０を調製して、標的化合物８０（１０ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ、４２％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４５９（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000139
Ｎ－（４－（４－アミノ－２－エチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチル）－２－（ジメチルアミノ）ベンズアミド（８１）：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｂ及び２－（ジエチルアミノ）安息香酸を出発材料として使用して、化合物８１を調製して、標的化合物８１（１２．２ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ、５７％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４３１（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000140
４－アミノ－Ｎ－（４－（４－アミノ－２－エチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチル）－３，５－ジフルオロベンズアミド（８２）：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｂ及び４－アミノ－３，５－ジフルオロ安息香酸を出発材料として使用して、化合物８２を調製して、標的化合物８２（１０．２ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ、４９％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４３９（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000141
Ｎ－（４－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチル）－４－（ジメチルアミノ）－３－フルオロベンズアミド（８３）：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｄ及び４－（ジメチルアミノ）－３－フルオロ安息香酸を出発材料として使用して、化合物８３を調製して、標的化合物８３（９ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ、５０％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４７７（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000142
Ｎ－（４－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチル）－４－（ジメチルアミノ）－３，５－ジフルオロベンズアミド（８４）：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｄ及び４－（ジメチルアミノ）－３，５－ジフルオロ安息香酸を出発材料として使用して、化合物８４を調製して、標的化合物８４（７ｍｇ、０．００８ｍｍｏｌ、３８％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４９５（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000143
Ｎ－（４－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチル）－４－（ジメチルアミノ）－３－ニトロベンズアミド（８５）：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｄ及び４－（ジメチルアミノ）－３－ニトロ安息香酸を出発材料として使用して、化合物８５を調製して、標的化合物８５（１０ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ、５４％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ５０４（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000144
Ｎ－（４－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチル）－４－（ピロリジン－１－イル）ベンズアミド（８６）：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｄ及び４－（１－ピロリジニルアミノ）安息香酸を出発材料として使用して、化合物８６を調製して、標的化合物８６（２ｍｇ、０．００２ｍｍｏｌ、１１％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４８５（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000145
４－アミノ－Ｎ－（４－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチル）－３－フルオロベンズアミド（８７）：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｄ及び４－アミノ－３－フルオロ安息香酸を出発材料として使用して、化合物８７を調製して、標的化合物８７（６ｍｇ、０．００８ｍｍｏｌ、２０％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４４９（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000146
４－アミノ－Ｎ－（４－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチル）－３，５－ジフルオロベンズアミド（８８）：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｄ及び４－アミノ－３，５－ジフルオロ安息香酸を出発材料として使用して、化合物８８を調製して、標的化合物８８（６ｍｇ、０．００７ｍｍｏｌ、３４％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４６７（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000147
Ｎ－（４－（４－アミノ－２－エチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチル）－４－（ジメチルアミノ）ベンズアミド（８９）：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｂ及び４－アミノ－３，５－ジフルオロ安息香酸を出発材料として使用して、化合物８９を調製して、標的化合物８９（１０ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ、２７％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４３１（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000148
５－アミノ－Ｎ－（４－（４－アミノ－２－エチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチル）ピラジン－２－カルボキサミド（９０）：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｂ及び５－アミノピリジン－２－カルボン酸を出発材料として使用して、化合物９０を調製して、標的化合物９０（８ｍｇ、０．００９ｍｍｏｌ、３７％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４０５（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000149
ｔｅｒｔ－ブチル４－（３－アミノキノリン－４－イルアミノ）ブチルカルバメート（９１）：２について記載されるのと同様の手順を用いて、４－クロロ－３－ニトロキノリン及びｔｅｒｔ－ブチル４－アミノブチルカルバメートを使用して、化合物９１を調製して、標的化合物９１（出発材料から５０５０ｍｇ，、１５．２８４ｍｍｏｌ、９７％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ３３１（Ｍ＋Ｈ）＋。
ｔｅｒｔ－ブチル４－（２－（エトキシメチル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチルカルバメートブチルカルバメート（９２）：無水ＴＨＦ（１２ｍＬ）中のｔｅｒｔ－ブチル４－（３－アミノキノリン－４－イルアミノ）ブチルカルバメート（１０７０ｍｇ、３．２３８ｍｍｏｌ）の溶液に、トリエチルアミン（８８５ｕＬ、８．７４６ｍｍｏｌ）及び２－エトキシアセチルクロリド（５００ｍｇ、４．０７８ｍｍｏｌ）を２３℃で添加した。２０時間後、溶媒を真空中で除去した。残留物をＤＣＭ（５０ｍＬ）に溶解し、飽和重炭酸ナトリウム（５０ｍＬ）及びブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、中間体（ｔｅｒｔ－ブチル４－（３－（２－エトキシアセトアミド）キノリン－４－イルアミノ）ブチルカルバメート）を粗製物として得た。この粗製物をＭｅＯＨ（５ｍＬ）中に溶解し、続いて酸化カルシウム（０．５ｇ）を密封チューブに添加した。この反応混合物を、１２０℃で２．５時間加熱した。ＣａＯを濾過により除去した後、溶媒を真空下で除去し、残留物を分取ＬＣにより精製して、化合物９２（３４６ｍｇ、０．８６８ｍｍｏｌ、２７％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ３９９（Ｍ＋Ｈ）＋。
１－（４－アミノブチル）－２－（エトキシメチル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－４－アミン、３ＨＣｌ（Ｇ）：Ａについて記載されるのと同様の手順を用いて、化合物９２を使用して、化合物Ｇを調製して、標的化合物Ｇ（出発材料から５２７０ｍｇ、０．５９５ｍｍｏｌ、４％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ３１２（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000150
３－アミノ－Ｎ－（４－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチル）ベンズアミド（９３）：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｄ及び３－アミノ安息香酸を出発材料として使用して、化合物９３を調製して、標的化合物９３（５ｍｇ、０．００６ｍｍｏｌ、１９％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４３１（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000151
３－アミノ－Ｎ－（４－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチル）－４－フルオロベンズアミド（９４）：ＤＭＦ（１ｍＬ）中のＤ（１０ｍｇ、０．０２４ｍｍｏｌ）及び３－アミノ－４－フルオロ－安息香酸（４ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＭＴＭＭＴ（７ｍｇ、０．０２９ｍｍｏｌ）、及びＤＩＥＡ（３０ｕｌ、０．１７２ｍｍｏｌ）を２３℃で添加した。１０分後、混合物を分取ＬＣにより精製して、標的化合物９４（５ｍｇ、０．００６ｍｍｏｌ、２１％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４４９（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000152
３－アミノ－Ｎ－（４－（４－アミノ－２－（エトキシメチル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチル）－４－フルオロベンズアミド（９５））：９４について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｇ及び３－アミノ－４－フルオロ安息香酸を出発材料として使用して、化合物９５を調製して、標的化合物９５（６ｍｇ、０．００７ｍｍｏｌ、２６％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４５１（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000153
３－アミノ－Ｎ－（４－（４－アミノ－２－（エトキシメチル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチル）－４－フルオロベンズアミド（９６））：９４について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｇ及び３－アミノ安息香酸を出発材料として使用して、化合物９６を調製して、標的化合物９６（５ｍｇ、０．００６ｍｍｏｌ、１９％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４３３（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000154
３－アミノ－Ｎ－（４－（４－アミノ－２－（エトキシメチル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチル）ベンズアミド（９７））：９４について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｇ及び４－アミノ－３－メトキシ安息香酸を出発材料として使用して、化合物９７を調製して、標的化合物９７（５ｍｇ、０．００５ｍｍｏｌ、２３％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４６３（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000155
５－アミノ－Ｎ－（２－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）エチ）ピラジン－２－カルボキサミド（９８））：１６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｃ及び５－アミノ－ピラジン－２－カルボン酸を出発材料として使用して、化合物９８を調製して、標的化合物９８（２．１３ｍｇ、０．００２ｍｍｏｌ、１１％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４０５（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000156
４－アミノ－Ｎ－（４－（４－アミノ－２－（エトキシメチル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチル）－３－フルオロベンズアミド（９９）：９４について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｇ及び３－フルオロ－４－アミノ安息香酸を出発材料として使用して、化合物９９を調製して、標的化合物９９（７．３７ｍｇ、０．００８ｍｍｏｌ、３７％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４５１（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000157
４－アミノ－Ｎ－（４－（４－アミノ－２－（エトキシメチル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチル）－３，５－ジフルオロベンズアミド（１００）：９４について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物Ｇ及び４－アミノ－３，５－ジフルオロ安息香酸を出発材料として使用して、化合物１００を調製して、標的化合物１００（９．７ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ、５１％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４６９（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000158
メチル－４－アミノ－３，５－ジフルオロベンゾエート（１０１）：アセトニトリル（１５ｍＬ）中の４－アミノ－３，５－ジフルオロ安息香酸（２０８７ｍｇ、１２．０５５ｍｍｏｌ）の溶液に、塩化チオニル（１２ｍＬ）を添加し、次いで８０℃に加熱した。１時間後、溶媒を真空中で除去した。トルエン（１０ｍＬ）を混合物に添加し、続いて真空中で蒸発させた。残留物を無水ＭｅＯＨ（５ｍＬ）に溶解した。０．５時間後、溶媒を真空中で除去した。残留物をＤＣＭ（２０ｍＬ）に溶解し、飽和重炭酸ナトリウム（５０ｍＬ）及びブライン（５０ｍＬ）で洗浄した後、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過した。溶媒を真空中で除去して、化合物１０１（１７３０ｍｇ、９．２４４ｍｍｏｌ、７７％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ １８８（Ｍ＋Ｈ）＋。
（Ｓ）－ｔｅｒｔ－ブチル１－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）－１－オキソ－５－ウレイドペンタン－２－イルカルバメート（１０２）：ＤＭＦ（５ｍＬ）中のＢｏｃ－Ｃｉｔ－ＯＨ（１１５０ｍｇ、４．１７７ｍｍｏｌ）の溶液に、ＣＤＩ（８８０ｍｇ、５．４２７ｍｍｏｌ）を室温で添加し、次いで６０℃に加熱した。２時間後、この混合物にＣＤＩ（２２０ｍｇ、１．３５７ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を６０℃で１時間撹拌した。３時間後、反応物を真空中で乾燥させた。残留物をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）で希釈し、水（５０ｍＬ）、飽和重炭酸ナトリウム（２０ｍＬ）及びブライン（２０ｍＬ）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、続いて濾過し、溶媒を真空中で除去して、化合物１０２（１４６５ｍｇ、４．５０３ｍｍｏｌ、粗製物）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ３２６（Ｍ＋Ｈ）＋。
（Ｓ）－４－（２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）－５－ウレイドペンタンアミド）－３，５－ジフルオロ安息香酸（１０３）：ＴＨＦ（２ｍＬ）中の化合物１０３（１８８ｍｇ、０．５７８ｍｍｏｌ）及び化合物１０２（１０８ｍｇ、０．５７７ｍｍｏｌ）の溶液に、ＮａＨ６０％（７０ｍｇ、１．８２６ｍｍｏｌ）を２３℃で添加した。２０時間後、１ｍＬの水を添加し、混合物を１０分間撹拌した。溶媒を真空中で除去し、残留物を分取ＬＣにより精製して、化合物１０３（１７ｍｇ、０．０４９ｍｍｏｌ、９％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ３４５（Ｍ＋Ｈ）＋。
（Ｓ）－ｔｅｒｔ－ブチル１－（４－（４－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチルカルバモイル）－２，６－ジフルオロフェニルアミノ）－１－オキソ－５－ウレイドペンタン－２－イルカルバメート（１０４）：ＤＭＦ（１ｍＬ）中の化合物Ｄ（２０ｍｇ、０．０４４ｍｍｏｌ）及び化合物１０３（１７ｍｇ、０．０４０ｍｍｏｌ）の溶液に、ＨＡＴＵ（１６ｍｇ、０．０４２ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（６０ｕＬ、０．３４４ｍｍｏｌ）を２３℃で添加した。２０分後、混合物を分取ＬＣにより精製して、化合物１０４（２３ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ、５５％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ７２４（Ｍ＋Ｈ）＋。
（Ｓ）－Ｎ－（４－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチル）－４－（２－アミノ－５－ウレイドペンタンアミド）－３，５－ジフルオロベンズアミド（１０５）：ＤＣＭ（１ｍＬ）中の化合物１０４（２３ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＦＡ（１ｍＬ）を２３℃で添加した。１５分後、溶媒を真空中で除去した。残留物に１０ｍＬのトルエンを添加し、再蒸発させた。残留物を高真空ポンプで乾燥させて、化合物１０５（２４ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ、定量）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ６２４（Ｍ＋Ｈ）＋。
Ｎ－（４－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチル）－４－（（Ｓ）－２－（（Ｓ）－２－（２－（アミノオキシ）アセトアミド）－３－メチルブタンアミド）－５－ウレイドペンタンアミド）－３，５－ジフルオロベンズアミド（１０６）：ＤＭＦ（１ｍＬ）中のＦｍｏｃ－Ａｏａ－Ｖａｌ－ＯＨ（１１ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）及び化合物１０５（２４ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）の溶液に、ＨＡＴＵ（９ｍｇ、０．０３７ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（４０ｕｌ、０．０２３ｍｍｏｌ）を２３℃で添加した。１０分後、この混合物にピペリジン（５０ｕＬ、５％）を添加した。５分後、混合物を分取ＬＣにより精製して、化合物１０６（９ｍｇ、０．００７ｍｍｏｌ、２７％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ７９６（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000159
（Ｓ）－ｔｅｒｔ－ブチル１－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）－１－オキソプロパン－２－イルカルバメート（１０７）：１０２について記載されるのと同様の手順を用いて、Ｂｏｃ－アラニンを使用して、化合物１０７を調製して、標的化合物１０７（７３０ｍｇ、３．０５１ｍｍｏｌ、７５％粗製物）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ３２６（Ｍ＋Ｈ）＋。
（Ｓ）－４－（２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）－５－ウレイドペンタンアミド）－３，５－ジフルオロ安息香酸（１０８）：１０３について記載されるのと同様の手順を用いて、１０７を使用して、化合物１０８を調製して、標的化合物１０８（１７ｍｇ、０．０４９ｍｍｏｌ、９％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４３１（Ｍ＋Ｈ）＋。
（Ｓ）－Ｎ－（４－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチル）－４－（２－（２－（アミノオキシ）アセトアミド）プロパンアミド）－３，５－ジフルオロベンズアミド（１０９）：１０６について記載されるのと同様の手順を用いて、１０８及び化合物Ｄを使用して、化合物１０９を調製して、標的化合物１０９（１０８から９ｍｇ、０．００７ｍｍｏｌ、３１％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ７９６（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000160
（Ｓ）－ｔｅｒｔ－ブチル２－（３－（２－（１，３－ジオキソイソインドリン－２－イルオキシ）エトキシ）プロパンアミド）－３－メチルブタノエート（１１０）：ＤＣＭ（５ｍＬ）中の３－（２－（１，３－ジオキソイソインドリン－２－イルオキシ）エトキシ）プロパン酸（２９５ｍｇ、１．０５６ｍｍｏｌ）及びＶａｌ－ＯｔＢｕ、ＨＣｌ（２２５ｍｇ、１．０７８ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＭＴＭＭＴ（３０４ｍｇ、１．２６０ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（４６０ｕＬ、２．６４１ｍｍｏｌ）を２３℃で添加した。１．５時間後、溶液をＥｔＯＡＣ（１００ｍＬ）で希釈し、１ＮのＨＣｌ（１００ｍＬ）、飽和重炭酸ナトリウム（１００ｍＬ）、及びブライン（５０ｍＬ）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、溶媒を真空中で除去した。残留物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、化合物１１０（３７９ｍｇ、０．８７２ｍｍｏｌ、８３％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４３５（Ｍ＋Ｈ）＋。
（Ｓ）－２－（３－（２－（１，３－ジオキソイソインドリン－２－イルオキシ）エトキシ）プロパンアミド）－３－メチルブタン酸（１１１）：化合物１１０（３７９ｍｇ、０．８７２ｍｍｏｌ）の溶液に、ジオキサン中の４ＭのＨＣｌ（５ｍＬ、２０ｍｍｏｌ）を２３℃で添加した。２０時間後、溶媒を真空中で除去し、高真空ポンプを使用して乾燥させて、化合物１１１（３２０ｍｇ、０．８４６ｍｍｏｌ、９７％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ３７９（Ｍ＋Ｈ）＋。
Ｎ－（４－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）ブチル）－４－（（Ｓ）－２－（（Ｓ）－２－（３－（２－（アミノオキシ）エトキシ）プロパンアミド）－３－メチルブタンアミド）－５－ウレイドペンタンアミド）－３，５－ジフルオロベンズアミド（１１２）：ＤＭＦ（１ｍＬ）中の化合物１１１（３ｍｇ、０．００７ｍｍｏｌ）及び化合物１０５（５ｍｇ、０．００５ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＭＴＭＭＴ（３ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（２０ｕＬ、０．１１５ｍｍｏｌ）を２３℃で添加した。１．５時間後、この混合物にヒドラジン、Ｈ２Ｏ（２ｕＬ、０．５０６ｍｍｏｌ）を添加した。５分後、混合物を分取ＬＣにより精製して、化合物１１２（２ｍｇ、０．００２ｍｍｏｌ、２１％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ８５５（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000161
（Ｓ）－Ｎ－（４－（（Ｎ－（２－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）エチル）カルバムイミドイルカルバモイルオキシ）メチル）フェニル）－２－（（Ｓ）－２－（２－（アミノオキシ）アセトアミド）－３－メチルブタンアミド）－５－ウレイドペンタンアミド（１１３）：１０６について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物３０を出発材料として使用して、化合物１１３を調製して、標的化合物１１３（化合物３０から２ｍｇ、０．００１ｍｍｏｌ、２％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ８０５（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000162
Figure 2022520792000163
Figure 2022520792000164
Figure 2022520792000165
Figure 2022520792000166
Figure 2022520792000167
Figure 2022520792000168
Figure 2022520792000169
Figure 2022520792000170
Figure 2022520792000171
Figure 2022520792000172
Figure 2022520792000173
Figure 2022520792000174
Figure 2022520792000175
Figure 2022520792000176
実施例３：以下の代表的な構造－コア５（図１）を含むＴＬＲアゴニストの合成：
Figure 2022520792000177
いくつかの実施形態において、Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、またはＨであり、
Ｒ１は、Ｃ１～Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１～Ｃ１２アルキル、酸素含有Ｃ１～Ｃ１２アルキル、複素環、置換複素環、シクロアルキル、置換シクロアルキル、－Ｎ３、末端Ｃ１～Ｃ１２アルキル、末端置換Ｃ１～Ｃ１２アルキル、または不在であり、
Ｒ２またはＲ３は、それぞれ、Ｃ４～Ｃ８シクロアルキル、または独立して、－Ｈ、Ｃ１～Ｃ１２アルキル、ニトロ含有アルキル、酸素含有アルキル、芳香族環を形成するように結合され、
Ｒ４は、－ＯＮＨ２、末端Ｃ１～Ｃ１２アルキル、Ｃ１～Ｃ１２アルキル、Ｃ１～Ｃ１２置換アルキル、Ｃ４～Ｃ８シクロアルキル、芳香族環、置換芳香族環、芳香族複素環、置換芳香族複素環、または不在であり、
Ｚ１は、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ３～Ｃ１０シクロアルキル、Ｃ３～Ｃ１０ニトロ含有複素環であり、
Ｚ２は、芳香族環、芳香族複素環、Ｃ２～Ｃ８シクロアルキル、または不在であり、
Ｚ３は、Ｃ１～Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１～Ｃ１２アルキル、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル、置換Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル、置換Ｃ３～Ｃ８ニトロ含有複素環、Ｃ３～Ｃ８ニトロ含有複素環、または不在である。
コア５構造を有するＴＬＲアゴニストは、以下のスキームに開示されるように合成された。
Figure 2022520792000178
ｔｅｒｔ－ブチル４－（（２，６－ジクロロ－９Ｈ－プリン－９－イル）メチル）ベンジルカルバメート、ｔｅｒｔ－ブチル４－（（２，６－ジクロロ－７Ｈ－プリン－７－イル）メチル）ベンジルカルバメート（１１４）：ＴＨＦ（１０ｍＬ）中のｔｅｒｔ－ブチル４－（ヒドロキシメチル）ベンジルカルバメート（１２８０ｍｇ、５．３９４ｍｍｏｌ）及び２，６－ジクロロプリン（１０５０ｍｇ、５．５５６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＰＰｈ３（１５６０ｍｇ、５．９４８ｍｍｏｌ）を２３℃で添加した。３０分後、ＤＩＡＤ（１６００ｕＬ、８．１２６ｍｍｏｌ）を０℃で５分間にわたって添加した。混合物を５０℃で撹拌した。２時間後、溶媒を真空中で除去した。残留混合物を、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）により希釈し、半飽和重炭酸ナトリウム（１００ｍＬ）及びブライン（２０ｍＬ）を使用して洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過した。溶媒を真空中で除去した。残留物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、化合物１１４（２２６８ｍｇ、＜５．５５５ｍｍｏｌ、ＰＰｈ３との粗製混合物）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４０９（Ｍ＋Ｈ）＋。
ｔｅｒｔ－ブチル４－（（６－アミノ－２－クロロ－９Ｈ－プリン－９－イル）メチル）ベンジルカルバメート（１１５）：化合物１１４（ＰＰｈ３の粗製混合物、２２６８ｍｇ、＜５．５５５ｍｍｏｌ）を、撹拌棒を備えた耐圧ガラス容器に入れた。この容器に、ＭｅＯＨ中の７ＮのＮＨ３（１２ｍＬ、８４ｍｍｏｌ）を添加した。チューブを密封し、１２０℃で加熱した。１時間後、溶媒を真空中で除去し、残留物をＤＣＭ（１００ｍＬ）に溶解した。沈殿物を濾過により除去した。液体をフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、化合物１１５（２，６－ジクロロプリンから１０４３ｍｇ、２．６８２ｍｍｏｌ、５０％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４００（Ｍ＋Ｈ）＋。
ｔｅｒｔ－ブチル４－（（６－アミノ－２－ブトキシ－９Ｈ－プリン－９－イル）メチル）ベンジルカルバメート（１１６）：化合物１１５（１０４３ｍｇ、２．６８２ｍｍｏｌ）を２０％ナトリウムｎ－ブトキシド（５ｍＬ、１０．４ｍｍｏｌ）に、乾燥窒素ガス下で、２３℃で溶解し、温度を１１０℃に上げた。１．５時間後、１ｍＬの水を混合物に添加し、続いてＢｏｃ無水物（１７０ｍｇ、０．７７９ｍｍｏｌ）を添加した。５分後、溶媒を真空中で除去した。残留物をＤＣＭ（３０ｍＬ）に溶解し、半飽和重炭酸ナトリウム（５０ｍＬ）及びブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過した。有機溶媒を真空中で除去した。残留物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、化合物１１６（５６０ｍｇ、１．３１３ｍｍｏｌ、４９％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４２７（Ｍ＋Ｈ）＋。
ｔｅｒｔ－ブチル４－（（６－アミノ－８－ブロモ－２－ブトキシ－９Ｈ－プリン－９－イル）メチル）ベンジルカルバメート（１１７）：ＤＣＭ（１０ｍＬ）中の化合物１１６（５６０ｍｇ、１．３１３ｍｍｏｌ）の溶液に、臭素（１３５ｕＬ、０．５０７ｍｍｏｌ）を２３℃で添加した。１０分後、反応物を真空中で乾燥させた。残留物をＤＣＭ（５０ｍＬ）に溶解し、半飽和重炭酸ナトリウム（５０ｍＬ）及びブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過した。溶媒を真空中で除去した。残留物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、化合物１１７（４４０ｍｇ、０．８７１ｍｍｏｌ、６６％）をＨＢｒ塩として得た。ＭＳ ｍ／ｚ ５０６（Ｍ＋Ｈ）＋。
６－アミノ－９－（４－（アミノメチル）ベンジル）－２－ブトキシ－７Ｈ－プリン－８（９Ｈ）－オン（１１８）：化合物１１７（２４０ｍｇ、０．４１０ｍｍｏｌ）を、濃縮ＨＣｌ溶液、３７％（１０ｍＬ）に溶解し、還流した。４．５時間後、溶媒を真空中で除去した。残留物に水（１０ｍＬ）及びＭｅＯＨ（４ｍＬ）を添加し、これをＮＨ３、２８％溶液（９ｍＬ）を添加することによって中和した。溶媒を真空中で除去した。残留物を分取ＬＣにより精製して、化合物１１８（１１ｍｇ、０．０１９ｍｍｏｌ、５％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ３４３（Ｍ＋Ｈ）＋。
Ｎ－（４－（（６－アミノ－２－ブトキシ－８－オキソ－７Ｈ－プリン－９（８Ｈ）－イル）メチル）ベンジル）－２－（アミノオキシ）アセトアミド（１１９）：ＤＭＦ（１ｍＬ）中の化合物１１８（５ｍｇ、０．００７ｍｍｏｌ）及び２，５－ジオキソピロリジン－１－イル２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノオキシ）アセテート（３ｍｇ、０．０１０ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＩＥＡ（５ｕＬ、０．０５７ｍｍｏｌ）を２３℃で添加した。１０分後、溶媒を真空中で除去した。残留物に、ＤＣＭ（１ｍＬ）及びＴＦＡ（１ｍＬ）を２３℃で添加した。１０分後、混合物を分取ＬＣにより精製して、化合物１１９（３．６ｍｇ、０．００５ｍｍｏｌ、６５％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４１６（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000179
Ｎ－（４－（（６－アミノ－２－ブトキシ－８－オキソ－７Ｈ－プリン－９（８Ｈ）－イル）メチル）ベンジル）－３－（２－（アミノオキシ）エトキシ）プロパンアミド（１２０）：ＤＭＦ（１ｍＬ）中の１１８（５ｍｇ、０．００７ｍｍｏｌ）及び３－（２－（１，３－ジオキソイソインドリン－２－イルオキシ）エトキシ）プロパン酸（３ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＭＴＭＭＴ（３ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（８ｕＬ、０．０４６ｍｍｏｌ）を２３℃で添加した。１５分後、混合物にヒドラジン、Ｈ２Ｏ（３ｕＬ、０．０６ｍｍｏｌ）を添加した。２０分後、混合物を分取ＬＣにより精製して、化合物１２０（３．５ｍｇ、０．００４ｍｍｏｌ、５９％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４７４（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000180
２，６－ジクロロ－９－（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）－９Ｈ－プリン（１２１）：酢酸エチル（１００ｍＬ）中の２，６－ジクロロプリン（２９５０ｍｇ、１５．６０８ｍｍｏｌ）の磁気撹拌溶液に、ベンゼンスルホン酸（３０ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）を添加し、乾燥窒素下で５０℃に加熱した。撹拌混合物に、３，４－ジヒドロ－２Ｈ－ピラン（２２００ｕＬ、２６．１５３ｍｍｏｌ）を、５０℃で１時間にわたって添加した。温度を２３℃に下げた。１時間後、混合物を半飽和ＮａＨＣＯ３（５０ｍＬ）及びブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過した。有機溶媒を真空中で除去し、残留物を高真空ポンプで乾燥させて、化合物１２１（４１７０ｍｇ、１５．２６９ｍｍｏｌ、９８％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ２７４（Ｍ＋Ｈ）＋。
２－クロロ－９－（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）－９Ｈ－プリン－６－アミン（１２２）：化合物１２１（４１７０ｍｇ、１５．２６９ｍｍｏｌ）を、撹拌棒を備えた耐圧ガラス容器に入れた。この容器に、ＭｅＯＨ中の７ＮのＮＨ３（１２．８４ｍｍｏｌ）を添加した。チューブを密封し、１１０℃で加熱した。３．５時間後、混合物を室温に冷却し、一晩放置した。沈殿物を濾過し、ＭｅＯＨ（５ｍＬ）で洗浄した。固体を高真空ポンプで乾燥させて、化合物１２２（３４５０ｍｇ、１３．６ｍｍｏｌ、８９％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ２５４（Ｍ＋Ｈ）＋。
２－クロロ－９－（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）－９Ｈ－プリン－６－アミン（１２３）：化合物１２２（１７４６ｍｇ、６．８８２ｍｍｏｌ）を、撹拌棒を備えた耐圧ガラス容器に入れた。この容器に、ｎ－ブチルアミン（７ｍＬ、７０．８６ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（２．３ｍＬ、１３．２５ｍｍｏｌ）を添加した。チューブを密封し、１５０℃で加熱した。５時間後、混合物を室温に冷却し、溶媒を真空中で除去した。残留物をＤＣＭ（１００ｍＬ）中に溶解し、水（３０ｍＬ）及びブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過した。有機溶媒を真空中で除去した。残留物（中間体）をＭｅＯＨ（１０ｍＬ）及びＴＦＡ（２ｍＬ）に溶解し、２３℃で一晩撹拌した。１８時間後、溶媒を真空中で除去した。残留物にＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）及びヘキサン（５０ｍＬ）を添加して沈殿させた。沈殿物を、濾過し、真空ポンプで乾燥させることにより収集して、化合物１２３（１６４０ｍｇ、３．７７７ｍｍｏｌ、５５％）を２ＴＦＡ塩として得た。ＭＳ ｍ／ｚ ２０７（Ｍ＋Ｈ）＋。
Ｎ２－ブチル－９－（（６－クロロピリジン－３－イル）メチル）－９Ｈ－プリン－２，６－ジアミン（１２４）：ＤＭＦ（５ｍＬ）中の化合物１２３（１６４０ｍｇ、３．７７７ｍｍｏｌ）及び２－クロロ－５－（クロロメチル）ピリジン（９００ｍｇ、５．５５６ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｋ２ＣＯ３（２６００ｍｇ、１８．８１３ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を、窒素ガス下で、５０℃で撹拌した。２４時間後、氷水（１００ｍＬ）を混合物に添加し、沈殿物を分離した。沈殿物をＤＣＭ（１００ｍＬ）に溶解させ、ブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過した。有機溶媒を真空中で除去した。残留物を、１％～１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ勾配でフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル）により精製して、化合物１２４（１０２０ｍｇ、３．０７４ｍｍｏｌ、８１％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ３３２（Ｍ＋Ｈ）＋。
６－アミノ－２－（ブチルアミノ）－９－（（６－クロロピリジン－３－イル）メチル）－７Ｈ－プリン－８（９Ｈ）－オン（１２５）：ＤＣＭ（１０ｍＬ）中の化合物１２４（１０２０ｍｇ、３．０７４ｍｍｏｌ）の溶液に、臭素（２５０ｕＬ、０．９３９ｍｍｏｌ）を２３℃で添加した。１．５時間後、溶媒を真空中で除去した。残留物を高真空ポンプで乾燥した。８－ブロモ－Ｎ２－ブチル－９－（（６－クロロピリジン－３－イル）メチル）－９Ｈ－プリン－２，６－ジアミン、ＨＢｒ（１５００ｍｇ、＜３．０７４ｍｍｏｌ）の粗製中間体を、濃縮ＨＣｌ溶液、３７％（１５ｍＬ）に溶解し、溶液を還流した。８時間後、溶媒を真空中で除去した。残留物に水（１０ｍＬ）及びＭｅＯＨ（４ｍＬ）を添加し、次いでＮＨ３、２８％溶液（５ｍＬ）を添加することによって中和した。沈殿した固体を遠心分離（５分、４０００ｒｐｍ）により分離し、ＭｅＯＨ（２ｍＬ）及び水（１０ｍＬ）で洗浄した。沈殿物を乾燥させて、化合物１２５（１１００ｍｇ、２．４２１ｍｍｏｌ、７９％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ３４８（Ｍ＋Ｈ）＋。
６－アミノ－９－（（６－（４－（２－アミノエチル）ピペラジン－１－イル）ピリジン－３－イル）メチル）－２－（ブチルアミノ）－７Ｈ－プリン－８（９Ｈ）－オン（１２６）：化合物１２５（３０ｍｇ、０．０８６ｍｍｏｌ）及びｔｅｒｔ－ブチル２－（ピペラジン－１－イル）エチルカルバメート（２６ｍｇ、０．１１３ｍｍｏｌ）の混合物を、１４０℃で加熱した。２０時間後、混合物を２３℃に冷却した。残留物に、ＤＣＭ（０．５ｍＬ）及びＴＦＡ（０．５ｍＬ）を添加した。３０分後、溶媒を真空中で除去し、残留物を分取ＬＣにより精製して、化合物１２６（９ｍｇ、０．０１０ｍｍｏｌ、１２％）をＴＦＡ塩として得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４４１（Ｍ＋Ｈ）＋。
Ｎ－（２－（４－（５－（（６－アミノ－２－（ブチルアミノ）－８－オキソ－７Ｈ－プリン－９（８Ｈ）－イル）メチル）ピリジン－２－イル）ピペラジン－１－イル）エチル）－２－（アミノオキシ）アセトアミド（１２７）：ＤＭＦ（１ｍＬ）中の化合物１２６（９ｍｇ、０．０１０ｍｍｏｌ）及び２，５－ジオキソピロリジン－１－イル２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノオキシ）アセテート（２．５ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＩＥＡ（１０ｕＬ、０．０６０ｍｍｏｌ）を２３℃で添加した。１５分後、溶媒を真空中で除去した。残留物にＤＣＭ（１ｍＬ）及びＴＦＡ（１ｍＬ）を添加した。５分後、溶媒を真空中で除去した。残留物を分取ＬＣにより精製して、化合物１２７（８ｍｇ、０．００８ｍｍｏｌ、８２％）をＴＦＡ塩として得た。ＭＳ ｍ／ｚ ５１４（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000181
６－アミノ－９－（（６－（２－（（２－アミノエチル）（メチル）アミノ）エチルアミノ）ピリジン－３－イル）メチル）－２－（ブチルアミノ）－７Ｈ－プリン－８（９Ｈ）－オン（１２８）：化合物１２５（３０ｍｇ、０．０８６ｍｍｏｌ）及び２，２’ジアミノ－Ｎ－メチルジエチルアミン（１００ｕＬ、０．８５３ｍｍｏｌ）の混合物を、１３０℃で加熱した。２０時間後、混合物を２３℃に冷却し、分取ＬＣにより精製して、化合物１２８（４０ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ、５２％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４２３（Ｍ＋Ｈ）＋。
Ｎ－（２－（（２－（５－（（６－アミノ－２－（ブチルアミノ）－８－オキソ－７Ｈ－プリン－９（８Ｈ）－イル）メチル）ピリジン－２－イルアミノ）エチル）（メチル）アミノ）エチル）－２－（アミノオキシ）アセトアミド（１２９）：１２７について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物１２８を出発材料として使用して、化合物１２９を調製して、標的化合物１２９（１３ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ、５４％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ５０２（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000182
ＮＨ２Ｏ－ＰＥＧ３－Ｐｒ－（６－アミノ－９－（（６－（２－（（２－アミノエチル）（メチル）アミノ）エチルアミノ）ピリジン－３－イル）メチル）－２－（ブチルアミノ）－７Ｈ－プリン－８（９Ｈ）－オン）アセトアミド（１３０）：ＤＭＦ（１ｍＬ）中の化合物１２８（２０ｍｇ、０．０２３ｍｍｏｌ）及びＰｈｔｈ－ＰＥＧ４－ＯＳｕ（１０ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＩＥＡ（５０ｕＬ、０．２８７ｍｍｏｌ）を２３℃で添加した。５分後、２３℃でヒドラジン、Ｈ２Ｏ（１０ｕＬ）を混合物に添加した。５分後、混合物を分取ＬＣにより精製して、化合物１３０（２０ｍｇ、０．０１６ｍｍｏｌ、７０％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ６９２（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000183
６－アミノ－２－（ブチルアミノ）－９－（（６－（２－（（２－ヒドロキシエチル）（メチル）アミノ）エトキシ）ピリジン－３－イル）メチル）－７Ｈ－プリン－８（９Ｈ）－オン（１３１）：ＤＭＦ（４ｍＬ）中の化合物１２５（１２４ｍｇ、０．２１５ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ－メチルジエタノールアミン（２００ｕＬ、１．００７ｍｍｏｌ）及びＮａＨ、６０％（３５０ｍｇ、８．７５０ｍｍｏｌ）を２３℃で添加した。混合物を乾燥窒素下で、６０℃で撹拌した。３時間後、１ＮのＨＣｌ（４ｍＬ）を混合物に添加し、分取ＬＣにより精製して、化合物１３１（７５ｍｇ、０．０８５ｍｍｏｌ、３９％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４３１（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000184
２－ブトキシ－９Ｈ－プリン－６－アミン（１３２）：化合物１２２（６９０ｍｇ、２．７２０ｍｍｏｌ）を、乾燥窒素ガス下で、２３℃で２０％ナトリウムｎ－ブトキシド（８ｍＬ、１６．７ｌｍｍｏｌ）に溶解した。添加後、温度を１００℃に上げた。２０時間後、溶媒を真空中で除去した。残留物をＤＣＭ（３０ｍＬ）に溶解し、半飽和重炭酸ナトリウム（５０ｍＬ）及びブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過した。有機溶媒を真空中で除去した。ＭｅＯＨ（５ｍＬ）及びＴＦＡ（１ｍＬ）を残留物に添加し、２３℃で撹拌した。１８時間後、溶媒を真空中で除去した。残留物をＤＣＭ（３０ｍＬ）に溶解し、重炭酸ナトリウム（５０ｍＬ）及びブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過した。有機溶媒を真空中で除去し、２－ブトキシ－９Ｈ－プリン－６－アミン（１３００ｍｇ、２．９８７、定量的）を粗製物として得た。ＭＳ ｍ／ｚ ２０８（Ｍ＋Ｈ）＋。
Ｎ２－ブチル－９－（（６－クロロピリジン－３－イル）メチル）－９Ｈ－プリン－２，６－ジアミン（１３３）：１２４について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物１３２を出発材料として使用して、化合物１３３を調製して、標的化合物１３３（４６８ｍｇ、１．４０６ｍｍｏｌ、４７％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ３３３（Ｍ＋Ｈ）＋。
Ｎ－（２－（４－（５－（（６－アミノ－２－ブトキシ－９Ｈ－プリン－９－イル）メチル）ピリジン－２－イル）ピペラジン－１－イル）エチル）－２－（アミノオキシ）アセトアミド（１３４）：１２７について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物１３３を出発材料として使用して、化合物１３４を調製して、標的化合物１３４（化合物１３３から１２ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ、１０％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ５１４（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000185
６－アミノ－２－ブトキシ－９－（（６－クロロピリジン－３－イル）メチル）－７Ｈ－プリン－８（９Ｈ）－オン（１３５）：ＤＣＭ（１０ｍＬ）中の化合物１３３（１２４ｍｇ、０．３７３ｍｍｏｌ）の溶液に、臭素（３０ｕＬ、０．１１３ｍｍｏｌ）を２３℃で添加した。２時間後、反応物を真空中で乾燥させた。８－ブロモ－２－ブトキシ－９－（（６－クロロピリジン－３－イル）メチル）－９Ｈ－プリン－６－アミン、ＨＢｒ（１５０ｍｇ、＜０．３７３ｍｍｏｌ、粗製物）の粗製残留物を、３ＮのＨＣｌ溶液（１５ｍＬ）に溶解し、還流した。２０時間後、溶媒を真空中で除去した。混合物を分取ＬＣにより精製して、化合物１３５（４７ｍｇ、０．１１０ｍｍｏｌ、２９％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ３４９（Ｍ＋Ｈ）＋。
６－アミノ－９－（（６－（４－（２－アミノエチル）ピペリジン－１－イル）ピリジン－３－イル）メチル）－２－ブトキシ－７Ｈ－プリン－８（９Ｈ）－オン（１３６）：化合物１３５（４６ｍｇ、０．１３２ｍｍｏｌ）及び４－（２－ｂｏｃ－アミノエチル）－ピペリジン（１２０ｍｇ、０．５２６ｍｍｏｌ）を混合し、混合物を１４０℃で撹拌した。２５時間後、２３℃に冷却した後、混合物にＤＣＭ（１ｍＬ）及びＴＦＡ（１ｍＬ）を添加した。１０分後、有機溶媒を真空中で除去した。混合物を分取ＬＣにより精製して、化合物１３６（１１ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ、１１％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４４１（Ｍ＋Ｈ）＋。
Ｎ－（２－（１－（５－（（６－アミノ－２－ブトキシ－８－オキソ－７Ｈ－プリン－９（８Ｈ）－イル）メチル）ピリジン－２－イル）ピペリジン－４－イル）エチル）－３－（２－（アミノオキシ）エトキシ）プロパンアミド（１３７）：１３０について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物１３６及び３－（２－（１，３－ジオキソイソインドリン－２－イルオキシ）エトキシ）プロパン酸を出発材料として使用して、化合物１３７を調製して、標的化合物１３７（９ｍｇ、０．０１０ｍｍｏｌ、７０％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ５７２（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000186
９－（４－（２－アミノエチル）ベンジル）－２－ブトキシ－９Ｈ－プリン－６－アミン（１３８）：化合物１２２（３３３０ｍｇ、１３．１２６ｍｍｏｌ）を２０％ナトリウムｎ－ブトキシド（２５ｍＬ）に、乾燥窒素ガス下で、２３℃で溶解し、温度を１００℃に上げた。１．５時間後、溶媒を真空中で除去した。残留物をＤＣＭ（３０ｍＬ）に溶解し、半飽和重炭酸ナトリウム（５０ｍＬ）及びブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過した。有機溶媒を真空中で除去した。残留物を１％～４％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ勾配でフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、化合物１３８（２６８７ｍｇ、９．２２４ｍｍｏｌ、７０％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ２９２（Ｍ＋Ｈ）＋。
８－ブロモ－２－ブトキシ－９－（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）－９Ｈ－プリン－６－アミン（１３９）：ＤＣＭ（５０ｍｌ）中の化合物１３８（２６８７ｍｇ、９２２４ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ－ブロモスクシンイミド（２０００ｍｇ、１１０６９ｍｍｏｌ）を２３℃で添加した。１時間後、飽和チオ硫酸ナトリウム（２０ｍＬ）を混合物に添加した。材料をＤＣＭ（２０ｍＬ）で抽出した。有機層を飽和重炭酸ナトリウム（５０ｍＬ）及びブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過した。有機溶媒を真空中で除去した。残留物を２０％～７０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン勾配でフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、化合物１３９（２５１７ｍｇ、６．７９９ｍｍｏｌ、７４％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ３７１（Ｍ＋Ｈ）＋。
２－ブトキシ－８－メトキシ－９Ｈ－プリン－６－アミン（１４０）：化合物１３９（２５１７ｍｇ、６．７９９ｍｍｏｌ）を、乾燥窒素ガス下で、２３℃で２５％ナトリウムメトキシド（２０ｍＬ、４２ｍｍｏｌ）に溶解した。添加後、温度を７０℃に上げた。２．５時間後、混合物を真空中で濃縮し、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）に溶解し、水（１００ｍＬ）及びブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過した。有機層を収集し、真空中で蒸発させた。残留物にＭｅＯＨ（１０ｍＬ）及びＴＦＡ（３ｍＬ）を添加した。ＴＦＡ添加の４８時間後、溶媒を真空中で除去した。混合物を分取ＬＣにより精製して、化合物１４０（７０８ｍｇ、２．９８４、４４％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ２３８（Ｍ＋Ｈ）＋。
（４－（（６－アミノ－２－（ブチルアミノ）－８－メトキシ－９Ｈ－プリン－９－イル）メチル）フェニル）メタノール（１４１）：化合物１４０の溶液に、ＤＭＦ（２ｍＬ）中のＴＦＡ塩（２５ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（２０ｍｇ、０．５２４ｍｍｏｌ）、及び（４－ヒドロキシメチル）ベンジルクロリド（１１ｍｇ、０．０７０ｍｍｏｌ）を添加し、５０℃で撹拌した。２時間後、溶媒を濃縮した。残留物に水を添加し、次いで、混合物をＤＣＭ（５０ｍＬ）で抽出した。有機層を水（１０ｍＬ）及びブライン（２０ｍＬ）で洗浄し、続いてＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過した。溶媒を真空中で除去した。混合物を分取ＬＣにより精製して、化合物１４１（２９ｍｇ、０．０４２ｍｍｏｌ、７７％）をＴＦＡ塩として得た。ＭＳ ｍ／ｚ ３５７（Ｍ＋Ｈ）＋。
６－アミノ－２－ブトキシ－９－（４－（クロロメチル）ベンジル）－７Ｈ－プリン－８（９Ｈ）－オン（１４２）：化合物１４１（６０７ｍｇ、１．０３７ｍｍｏｌ）に、ジクロロメタン（１０ｍＬ）を添加した。得られる懸濁液に塩化チオニル（１０００ｕＬ）を添加し、混合物を５℃で３時間撹拌した。トルエン（３０ｍＬ）を混合物に添加し、溶媒を蒸発させた。残留物にトルエン（１００ｍＬ）を再び添加し、溶媒を蒸発させ、減圧下で乾燥させて、化合物１４２（４０２ｍｇ、１．１１１ｍｍｏｌ、定量的）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ３６２（Ｍ＋Ｈ）＋。
ｔｅｒｔ－ブチル２－（１－（４－（（６－アミノ－２－ブトキシ－８－オキソ－７Ｈ－プリン－９（８Ｈ）－イル）メチル）ベンジル）ピペリジン－４－イル）エチルカルバメート（１４３）：ＤＭＦ（２ｍＬ）中の化合物１４２（１６６ｍｇ、０．３８４ｍｍｏｌ）及び４－（２－ｂｏｃ－アミノエチル）－ピペリジン（１８０ｍｇ、０．７８８ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＩＥＡ（１０００ｕＬ、５．７４１ｍｍｏｌ）を添加し、温度を８０℃に上げた。３．５ｈ後、溶媒を真空中で除去した。混合物を分取ＬＣにより精製して、化合物１４３（２０５ｍｇ、０．２２９ｍｍｏｌ、２９％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ５５４（Ｍ＋Ｈ）＋。
６－アミノ－９－（４－（（４－（２－アミノエチル）ピペリジン－１－イル）メチル）ベンジル）－２－ブトキシ－７Ｈ－プリン－８（９Ｈ）－オン（１４４）：化合物１４３（４１ｍｇ、０．０５２ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍＬ）及びＴＦＡ（１ｍＬ）に溶解した。５分後、溶媒を真空中で除去した。トルエン（５ｍＬ）を残留物に添加し、真空中で蒸発させた。残留物を高真空ポンプで乾燥させて、化合物１４４（４１ｍｇ、０．０５２ｍｍｏｌ、定量的）をＴＦＡ塩として得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４５４（Ｍ＋Ｈ）＋。
Ｎ－（２－（１－（４－（（６－アミノ－２－ブトキシ－８－オキソ－７Ｈ－プリン－９（８Ｈ）－イル）メチル）ベンジル）ピペリジン－４－イル）エチル）－２－（アミノオキシ）アセトアミド（１４５）：１２７について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物１４４を出発材料として使用して、化合物１４５を調製して、標的化合物１４５（１５ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ、８７％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ５２７（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000187
Ｎ－（２－（１－（４－（（６－アミノ－２－ブトキシ－８－オキソ－７Ｈ－プリン－９（８Ｈ）－イル）メチル）ベンジル）ピペリジン－４－イル）エチル）－３－（２－（アミノオキシ）エトキシ）プロペンアミド（１４６）：１３７について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物１４４を出発材料として使用して、化合物１４６を調製して、標的化合物１４６（１６ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ、８７％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ５８５（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000188
ｔｅｒｔ－ブチル２－（１－（４－（（６－アミノ－２－ブトキシ－８－オキソ－７Ｈ－プリン－９（８Ｈ）－イル）メチル）ベンジル）ピペリジン－４－イル）エチルカルバメート（１４７）：１４３について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物１４２及びｔｅｒｔ－ブチル６－アミノヘキシルカルバメートを出発材料として使用して、化合物１４７を調製して、標的化合物１４７（２３ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ、１４％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ５４２（Ｍ＋Ｈ）＋。
６－アミノ－９－（４－（（６－アミノヘキシルアミノ）メチル）ベンジル）－２－ブトキシ－７Ｈ－プリン－８（９Ｈ）－オン（１４８）：１４４について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物１４７を出発材料として使用して、化合物１４８を調製して、標的化合物１４８（２４ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ、定量的）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４４２（Ｍ＋Ｈ）＋。
Ｎ－（６－（４－（（６－アミノ－２－ブトキシ－８－オキソ－７Ｈ－プリン－９（８Ｈ）－イル）メチル）ベンジルアミノ）ヘキシル）－２－（アミノオキシ）アセトアミド（１４９）：１２７について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物１４８を出発材料として使用して、化合物１４９を調製して、標的化合物１４９（７ｍｇ、０．００８ｍｍｏｌ、３１％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ５１５（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000189
Ｎ－（２－（１－（４－（（６－アミノ－２－ブトキシ－８－オキソ－７Ｈ－プリン－９（８Ｈ）－イル）メチル）ベンジル）ピペリジン－４－イル）エチル）－３－（２－（アミノオキシ）エトキシ）プロパンアミド（１５０）：ＤＭＦ（１ｍＬ）中の化合物１４４（１４ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ）及びＮ－Ｂｏｃ－Ｎ，２－ジメチル－アラニン（５．５ｍｇ、０．０２０ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＭＴＭＭＴ（５ｍｇ、０．０２１ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（２０ｕＬ、０．１１５ｍｍｏｌ）を２３℃で添加した。３０分後、混合物を分取ＬＣにより精製し、化合物１５０（７ｍｇ、０．００７ｍｍｏｌ、３７％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ６５３（Ｍ＋Ｈ）＋。
Ｎ－（２－（１－（４－（（６－アミノ－２－ブトキシ－８－オキソ－７Ｈ－プリン－９（８Ｈ）－イル）メチル）ベンジル）ピペリジン－４－イル）エチル）－２－メチル－２－（メチルアミノ）プロパンアミド（１５１）：１４４について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物１５０を出発材料として使用して、化合物１５１を調製して、標的化合物１５１（５．５ｍｇ、０．００５ｍｍｏｌ、定量的）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ５５３（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000190
Ｎ－（２－（１－（４－（（６－アミノ－２－ブトキシ－８－オキソ－７Ｈ－プリン－９（８Ｈ）－イル）メチル）ベンジル）ピペリジン－４－イル）エチル）ピバルアミド（１５２）：ＤＭＦ（１ｍＬ）中の化合物１４４（１４ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ）及びトリメチルアセチルクロリド（２．８ｕｌ、０．０２２ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＩＥＡ（２０ｕＬ、０．１１５ｍｍｏｌ）を２３℃で添加した。１時間後、混合物を分取ＬＣにより精製し、化合物１５２（７ｍｇ、０．００８ｍｍｏｌ、３６％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ５３８（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000191
Ｎ－（２－（１－（４－（（６－アミノ－２－ブトキシ－８－オキソ－７Ｈ－プリン－９（８Ｈ）－イル）メチル）ベンジル）ピペリジン－４－イル）エチル）アセトアミド（１５３）：ＤＭＦ（１ｍＬ）中の化合物１４４（２０ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）及び無水酢酸（２．１ｕＬ、０．０２１ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＩＥＡ（２０ｕＬ、０．１１５ｍｍｏｌ）を２３℃で添加した。１時間後、混合物を分取ＬＣにより精製し、化合物１５３（８ｍｇ、０．０１０ｍｍｏｌ、４３％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４９６（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000192
４－アミノ－Ｎ－（２－（１－（４－（（６－アミノ－２－ブトキシ－８－オキソ－７Ｈ－プリン－９（８Ｈ）－イル）メチル）ベンジル）ピペリジン－４－イル）エチル）－３，５－ジフルオロベンズアミド（１５４）：１５０について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物１４４及び４－アミノ－３，５－ジフルオロ安息香酸を出発材料として使用して、化合物１５４を調製して、標的化合物１５４（８ｍｇ、０．００８ｍｍｏｌ、３８％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ６０９（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000193
Ｎ－（２－（１－（４－（（６－アミノ－２－ブトキシ－８－オキソ－７Ｈ－プリン－９（８Ｈ）－イル）メチル）ベンジル）ピペリジン－４－イル）エチル）イソブチルアミド（１５５）：１５０について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物１４４及びイソ酪酸を出発材料として使用して、化合物１５５を調製して、化合物１５５（６ｍｇ、０．００７ｍｍｏｌ、３２％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ５２４（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000194
ｔｅｒｔ－ブチル１，７－ビス（２－（１－（４－（（６－アミノ－２－ブトキシ－８－オキソ－７Ｈ－プリン－９（８Ｈ）－イル）メチル）ベンジル）ピペリジン－４－イル）エチルアミノ）－１，７－ジオキソヘプタン－４－イルカルバメート（１５６）：１５０について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物１４４及び４－（Ｎ－Ｂｏｃ－アミノ）－１，６－ヘプタン二酸を出発材料として使用して、化合物１５６を調製して、標的化合物１５６（１５ｍｇ、０．００９ｍｍｏｌ、３４％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ １１４７（Ｍ＋Ｈ）＋。
４－アミノ－Ｎ１，Ｎ７－ビス（２－（１－（４－（（６－アミノ－２－ブトキシ－８－オキソ－７Ｈ－プリン－９（８Ｈ）－イル）メチル）ベンジル）ピペリジン－４－イル）エチル）ヘプタンジアミド（１５７）：１４４について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物１５６を出発材料として使用して、化合物１５７を調製して、標的化合物１５７（１５ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ、定量的）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ １０４７（Ｍ＋Ｈ）＋。
Ｎ１，Ｎ７－ビス（２－（１－（４－（（６－アミノ－２－ブトキシ－８－オキソ－７Ｈ－プリン－９（８Ｈ）－イル）メチル）ベンジル）ピペリジン－４－イル）エチル）－４－（２－（アミノオキシ）アセトアミド）ヘプタンジアミド（１５８）：１４５について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物１５７及び２，５－ジオキソピロリジン－１－イル２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノオキシ）アセテートを出発材料として使用して、化合物１５８を調製して、標的化合物１５８（５ｍｇ、０．００３ｍｍｏｌ、３４％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ １１２０（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000195
（Ｓ）－２－アミノ－Ｎ－（２－（１－（４－（（６－アミノ－２－ブトキシ－８－オキソ－７Ｈ－プリン－９（８Ｈ）－イル）メチル）ベンジル）ピペリジン－４－イル）エチル）プロパンアミド（１７３）：ＤＭＦ（１ｍＬ）中の化合物１４４（２０ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）及びＮ－Ｂｏｃ－アラニン（５ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＭＴＭＭＴ（６ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（２０ｕＬ、０．１１５ｍｍｏｌ）を２３℃で添加した。１０分後、溶媒を真空中で除去した。残留物にＤＣＭ（１ｍＬ）及びＴＦＡ（１ｍＬ）を添加した。１０分後、溶媒を真空中で除去し、残留物を分取ＬＣにより精製して、化合物１７３（８ｍｇ、０．００９ｍｍｏｌ、４２％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ５２５（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000196
（Ｓ）－２－アミノ－Ｎ－（２－（１－（４－（（６－アミノ－２－ブトキシ－８－オキソ－７Ｈ－プリン－９（８Ｈ）－イル）メチル）ベンジル）ピペリジン－４－イル）エチル）－５－グアニジノペンタンアミド（１７４）：１７３について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物１４４及びＮ－Ｂｏｃ－アルギニンを出発材料として使用して、化合物１７４を調製して、標的化合物１７４（１０ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ、４８％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ６１０（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000197
ｔｅｒｔ－ブチル４－（２－（イソブチルアミノ）エチル）ピペリジン－１－カルボキシレート（１７５）：４－（２－アミノエチル）－１－Ｂｏｃ－ピペリジン（５２０ｍｇ、２．２７８ｍｍｏｌ）及びイソブチルアルデヒド（２３０ｕｌ、３．１９０ｍｍｏｌ）を、２３℃でメタノール（１０ｍＬ）に溶解した。２時間後、水素化ホウ素ナトリウム（１４２ｍｇ、３．７５４ｍｍｏｌ）をこの混合物に添加した。１０分後、溶媒を真空中で除去した。残留物をＤＣＭ（１００ｍＬ）に溶解し、飽和ＮａＨＣＯ３（５０ｍＬ）及びブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過した。溶媒を真空中で除去した。残留物を分取ＬＣにより精製して、化合物１７５（４９９ｍｇ、１．７５５ｍｍｏｌ、５５％）をガラス質の無色の固体として得た。ＭＳ ｍ／ｚ ２８５（Ｍ＋Ｈ）＋。
ｔｅｒｔ－ブチル４－（２－（３－（２－（１，３－ジオキソイソインドリン－２－イルオキシ）エトキシ）－Ｎ－イソブチルプロパンアミド）エチル）ピペリジン－１－カルボキシレート（１７６）：ＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）中の化合物１７５（８０ｍｇ、０．２０１ｍｍｏｌ）及びＰｈｔｈ－ＰＥＧ１－ＣＯＯＨ（５６ｍｇ、０．２０１ｍｍｏｌ）の溶液に、ＣＭＰＩ（６２ｍｇ、０．２４３ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（７０ｕｌ、０．４０２ｍｍｏｌ）を２３℃で添加した。３時間後、沈殿物を濾過によって除去し、濾液をフラッシュクロマトグラフィーで精製して、化合物１７６（６５ｍｇ、０．１１９ｍｍｏｌ、５９％）を白色の固体として得た。ＭＳ ｍ／ｚ ５４６（Ｍ＋Ｈ）＋。
３－（２－（１，３－ジオキソイソインドリン－２－イルオキシ）エトキシ）－Ｎ－イソブチル－Ｎ－（２－（ピペリジン－４－イル）エチル）プロパンアミド（１７７）：１４４について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物１７６を出発材料として使用して、化合物１７７を調製して、標的化合物１７７（６６ｍｇ、０．１１８ｍｍｏｌ、定量的）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４４６（Ｍ＋Ｈ）＋。
Ｎ－（２－（１－（４－（（６－アミノ－２－ブトキシ－８－オキソ－７Ｈ－プリン－９（８Ｈ）－イル）メチル）ベンジル）ピペリジン－４－イル）エチル）－３－（２－（アミノオキシ）エトキシ）－Ｎ－イソブチルプロパンアミド（１７８）：１４３について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物１７７及び化合物１４２を出発物質として使用して、化合物１７８を調製し、続いて、１３０について記載されるように、ヒドラジン、Ｈ２Ｏ（１０ｕＬ）で処理して、化合物１７８（１９ｍｇ、０．０１９ｍｍｏｌ、７％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ６４１（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000198
６－アミノ－２－ブトキシ－９－（４－（ピペリジン－１－イルメチル）ベンジル）－７Ｈ－プリン－８（９Ｈ）－オン（１７９）：１４３について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物１４２及びピペリジンを出発材料として使用して、化合物１７９を調製して、化合物１７９（３１ｍｇ、０．０４１ｍｍｏｌ、５４％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４１１（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000199
４－アミノ－Ｎ－（２－（１－（４－（（６－アミノ－２－ブトキシ－８－オキソ－７Ｈ－プリン－９（８Ｈ）－イル）メチル）ベンジル）ピペリジン－４－イル）エチル）－３－メトキシベンズアミド（１８０）：１５０について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物１４４及び４－アミノ－３－メトキシ安息香酸を出発材料として使用して、化合物１８０を調製して、標的化合物１８０（８ｍｇ、０．００８ｍｍｏｌ、３９％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ６０３（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000200
（Ｓ）－Ｎ－（２－（１－（４－（（６－アミノ－２－ブトキシ－８－オキソ－７Ｈ－プリン－９（８Ｈ）－イル）メチル）ベンジル）ピペリジン－４－イル）エチル）－２－（２－（アミノオキシ）アセトアミド）プロパンアミド（１８１）：１２７について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物１７３及び２，５－ジオキソピロリジン－１－イル２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノオキシ）アセテートを出発材料として使用して、化合物１８１を調製して、標的化合物１８１（５ｍｇ、０．００５ｍｍｏｌ、５８％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ５９８（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000201
（Ｓ）－Ｎ－（２－（１－（４－（（６－アミノ－２－ブトキシ－８－オキソ－７Ｈ－プリン－９（８Ｈ）－イル）メチル）ベンジル）ピペリジン－４－イル）エチル）－２－（２－（アミノオキシ）アセトアミド）－５－グアニジノペンタンアミド（１８２）：１２７について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物１７４及び２，５－ジオキソピロリジン－１－イル２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノオキシ）アセテートを出発材料として使用して、化合物１８２を調製して、標的化合物１８２（５ｍｇ、０．００４ｍｍｏｌ、４２％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ６８３（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000202
９－（４－（４，４’－ビピペリジン－１－イルメチル）ベンジル）－６－アミノ－２－ブトキシ－７Ｈ－プリン－８（９Ｈ）－オンオン（１８３）：１４３について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物１４２及び４，４’－ビピペリジンを出発材料として使用して、化合物１８３を調製して、化合物１８３（１３ｍｇ、０．０１６ｍｍｏｌ、７％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４９４（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000203
６－アミノ－９－（４－（（１’－（２－（アミノオキシ）アセチル）－４，４’－ビピペリジン－１－イル）メチル）ベンジル）－２－ブトキシ－７Ｈ－プリン－８（９Ｈ）－オン（１８４）：１２７について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物１８３及び２，５－ジオキソピロリジン－１－イル２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノオキシ）アセテートを出発材料として使用して、化合物１８４を調製して、標的化合物１８４（５ｍｇ、０．００５ｍｍｏｌ、１８％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ５６７（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000204
３－アミノ－Ｎ－（２－（１－（４－（（４－アミノ－６－ブトキシ－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］ピリジン－１－イル）メチル）ベンジル）ピペリジン－４－イル）エチル）ベンズアミド（１８５）：１５０について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物１４４及び３－アミノ安息香酸を出発材料として使用して、化合物１８５を調製して、標的化合物１８５（８ｍｇ、０．００９ｍｍｏｌ、５３％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ５７２（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000205
Ｎ－（２－（１－（４－（（４－アミノ－６－ブトキシ－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］ピリジン－１－イル）メチル）ベンジル）ピペリジン－４－イル）エチル）－４－（２－アミノエチル）ベンズアミド（１８６）：１７３について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物１４４及び４－（２－Ｂｏｃ－アミノ）エチル安息香酸を出発材料として使用して、化合物１８６を調製して、標的化合物１８６（９ｍｇ、０．０１０ｍｍｏｌ、５８％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ６００（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000206
４－アミノ－Ｎ－（２－（１－（４－（（４－アミノ－６－ブトキシ－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］ピリジン－１－イル）メチル）ベンジル）ピペリジン－４－イル）エチル）ベンズアミドベンズアミド（１８７）：１５０について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物１４４及び４－アミノ安息香酸を出発材料として使用して、化合物１８７を調製して、標的化合物１８７（８ｍｇ、０．００９ｍｍｏｌ、５３％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ５７２（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000207
３－アミノ－Ｎ－（２－（１－（４－（（４－アミノ－６－ブトキシ－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］ピリジン－１－イル）メチル）ベンジル）ピペリジン－４－イル）エチル）－４－フルオロベンズアミド（１８８）：１５０について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物１４４及び３－アミノ－４－フルオロ安息香酸を出発材料として使用して、化合物１８８を調製して、標的化合物１８８（１１ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ、６４％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ５９０（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000208
Ｎ－（２－（１－（４－（（４－アミノ－６－ブトキシ－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］ピリジン－１－イル）メチル）ベンジル）ピペリジン－４－イル）エチル）－４－（２－（２－（アミノオキシ）アセトアミド）エチル）ベンズアミド（１８９）：１２７について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物１８６及び２，５－ジオキソピロリジン－１－イル２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノオキシ）アセテートを出発材料として使用して、化合物１８９を調製して、標的化合物１８９（１１ｍｇ、０．０１０ｍｍｏｌ、９４％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ６７３（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000209
６－アミノ－９－（４－（（４－（４－アミノフェニル）ピペリジン－１－イル）メチル）ベンジル）－２－ブトキシ－７Ｈ－プリン－８（９Ｈ）－オン（１９０）：１４３について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物１４２及び４－（４－アミノフェニル）－ピペリジンを出発材料として使用して、化合物１９０を調製して、化合物１９０（３ｍｇ、０．００４ｍｍｏｌ、５％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ５０２（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000210
６－アミノ－９－（４－（（１’－（３－（２－（アミノオキシ）エトキシ）プロパノイル）－４，４’－ビピペリジン－１－イル）メチル）ベンジル）－２－ブトキシ－７Ｈ－プリン－８（９Ｈ）－オン（１９１）：１３７について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物１８３を出発材料として使用して、化合物１９１を調製して、標的化合物１９１（１３ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ、４８％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ６２５（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000211
Ｎ－（２－（１－（４－（（４－アミノ－６－ブトキシ－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］ピリジン－１－イル）メチル）ベンジル）ピペリジン－４－イル）エチル）－４－ヒドロキシベンズアミド（２１３）：１５０について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物１４４及び４－ヒドロキシ安息香酸を出発材料として使用して、化合物２１３を調製して、標的化合物２１３（１０ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ、６６％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ５７３（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000212
Ｎ－（２－（１－（４－（（４－アミノ－６－ブトキシ－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］ピリジン－１－イル）メチル）ベンジル）ピペリジン－４－イル）エチル）－３－（４－ヒドロキシフェニル）プロパンアミド（２１４）：１５０について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物１４４及び３－（４－ヒドロキシフェニル）プロパン酸を出発材料として使用して、化合物２１４を調製して、標的化合物２１４（９ｍｇ、０．０１０ｍｍｏｌ、５８％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ６０１（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000213
Ｂｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ－アミノオキシアセチル）－ＯＨ（２１５）：ＤＭＦ（５ｍＬ）中の２，５－ジオキソピロリジン－１－イル２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノオキシ）アセテート（３９９ｍｇ、１．３８４ｍｍｏｌ）及びＢｏｃ－Ｌｙｓ－ＯＨ（３３５ｍｇ、１．３６０ｍｍｏｌ）に、ＤＩＥＡ（７５０ｕｌ、４．３０６ｍｍｏｌ）を２３℃で添加した。２時間後、溶媒を真空中で除去した。残留物をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）に溶解し、１ＮのＨＣｌ（５０ｍＬ）及びブライン（２０ｍＬ）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、溶媒を真空中で除去した。残留物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、化合物２１５（４８０ｍｇ、１．１４４ｍｍｏｌ、８３％）を白色の固体として得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４２０（Ｍ＋Ｈ）＋。
（Ｓ）－２－アミノ－Ｎ－（２－（１－（４－（（４－アミノ－６－ブトキシ－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］ピリジン－１－イル）メチル）ベンジル）ピペリジン－４－イル）エチル）－６－（２－（アミノオキシ）アセトアミド）ヘキサンアミド（２１６）：１７３について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物１４４及び化合物２１５を出発材料として使用して、化合物２１６を調製して、標的化合物２１６（６ｍｇ、０．００６ｍｍｏｌ、３７％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ６５４（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000214
（Ｓ）－Ｎ－（５－アミノ－６－（１’－（４－（（４－アミノ－６－ブトキシ－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］ピリジン－１－イル）メチル）ベンジル）－４，４’－ビペリジン－１－イル）－６－オキソヘキシル）－２－（アミノオキシ）アセトアミド（２１７）：１７３について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物１８３及び化合物２１５を出発材料として使用して、化合物２１７を調製して、標的化合物２１７（６ｍｇ、０．００６ｍｍｏｌ、３７％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ６５４（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000215
５－アミノ－Ｎ－（２－（１－（４－（（４－アミノ－６－ブトキシ－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］ピリジン－１－イル）メチル）ベンジル）ピペリジン－４－イル）エチル）ニコチンアミド（２１８）：１５０について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物１４４及び５－アミノニコチン酸を出発材料として使用して、化合物２１８を調製して、標的化合物２１８（１ｍｇ、０．００１ｍｍｏｌ、７％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ５７３（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000216
５－アミノ－Ｎ－（２－（１－（４－（（４－アミノ－６－ブトキシ－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］ピリジン－１－イル）メチル）ベンジル）ピペリジン－４－イル）エチル）ピラジン－２－カルボキサミド（２１９）：１５０について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物１４４及び５－アミノ－ピラジン－カルボン酸を出発材料として使用して、化合物２１９を調製して、標的化合物２１９（１０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ、６６％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ５７４（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000217
Figure 2022520792000218
Figure 2022520792000219
Figure 2022520792000220
Figure 2022520792000221
Figure 2022520792000222
実施例４：以下の構造－コア３（図１）を含むＴＬＲアゴニストの合成：
Figure 2022520792000223
いくつかの実施形態において、Ｘは、ＮまたはＨであり、Ｙは、ＣまたはＮであり、
Ｒ１は、Ｃ１～Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１～Ｃ１２アルキル、酸素含有Ｃ１～Ｃ１２アルキル、複素環、置換複素環、またはＨであり、
Ｒ２は、Ｃ１～Ｃ１２アルキル、Ｃ１～Ｃ１２置換アルキル、Ｃ４～Ｃ８シクロアルキル、芳香族環、置換芳香族環、芳香族ヘテロ環、置換芳香族ヘテロ環、－ＯＮＨ２、末端Ｃ１～Ｃ１２アルキル、またはＨである。
コア３構造を有するＴＬＲアゴニストは、以下のスキームに開示されるように合成された。
Figure 2022520792000224
４－ニトロ－１－トシル－１Ｈ－インドール（１６０）：化合物１５９（４－ニトロ－１Ｈ－インドール）（２．４３ｇ、１５．０ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１５ｍＬ）に溶解した。ＴＨＦ（３０ｍＬ）中の水素化ナトリウム（９００ｍｇ、２２．５ｍｍｏｌ）を、０℃で懸濁液に滴加した。溶液を室温に温め、さらに１時間撹拌した。次に、ＴＨＦ（１５ｍＬ）中の塩化トシル（３．０ｇ、１５．７５ｍｍｏｌ）をゆっくり添加し、反応物を一晩撹拌し、溶液を、ＮａＨＣＯ３とＥｔ２Ｏとの間で分配した。水層を抽出し（３×７５ｍＬ）、合わせた有機層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、真空中で濃縮した。得られる固体をＡｃＣＮに取り込み、超音波処理し、濾過した。固体（出発材料）は使用しなかった。液体を回転蒸発させ、残留物（１６０）を次のステップで使用した（３．１２ｇ）。ＭＳ ｍ／ｚ ＮＯ２は観察されなかった。
５－メチル－４－ニトロ－１－（フェニルスルホニル）－１Ｈ－インドール（１６１）：化合物１６０（３．１１ｇ、９．８３ｍｍｏｌ）を、－１５℃でＴＨＦ（９８．３ｍＬ）に溶解した。塩化メチルマグネシウム（４．９ｍＬ、１４．７５ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を１時間４５分間撹拌した。次に、－１０℃を下回る温度に維持しながら、ＤＤＱ（３．７９ｇ、１６．７１ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温に温め、一晩撹拌した。次に、反応物をＤＣＭで希釈して反応をクエンチし、続いて回転蒸発させた。粗製物を、ＳｉＯ２のプラグに通し、ＤＣＭで溶出した。溶出液を乾燥させ、カラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中のヘキサン、０～４０％、４０ｇのカラム）により精製して、標的化合物１６１（２工程にわたって２．０６ｇ、６３％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ＮＯ２は観察されなかった。
（Ｅ）Ｎ，Ｎ－ジメチル－２－（４－ニトロ－１－（フェニルスルホニル）－１Ｈ－インドール－５－イル）エテン－１－アミン（１６２）：５－メチル－４－ニトロ－１－（フェニルスルホニル）－１Ｈ－インドール（１６１）（０．８３ｇ、２．６３ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（２６．３ｍＬ）に溶解した。Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドジメチルアセタール（３．５４ｍＬ、２６．３ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を１１５℃で加熱した。反応物をロータリーエバポレーターで蒸発させた。残留物（化合物１６２）を次の反応に使用した（０．９８ｇ）。ＭＳ ｍ／ｚ ＮＯ２は観察されなかった。
４－ニトロ－１－（フェニルスルホニル）－１Ｈ－インドール－５－カルバルデヒド（１６３）：ＴＨＦ（１３．２ｍＬ）及び水（１３．２ｍＬ）中の化合物１６２（０．９８ｇ、２．６ｍｍｏｌ）の溶液に、メタ過ヨウ素酸ナトリウム（１．７ｇ、７．９ｍｍｏｌ）を添加し、撹拌した。反応物を濾過し、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）で洗浄した。有機層をＮａＨＣＯ３で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、ロータリーエバポレーターで蒸発させた。残留物（化合物１６３、０．５６ｇ）を真空ポンプで乾燥させ、次の反応に使用した。ＭＳ ｍ／ｚ ＮＯ２は観察されなかった。
４－アミノ－１－（フェニルスルホニル）－１Ｈ－インドール－５－カルバルデヒド（１６４）：ＭｅＯＨ（４７ｍＬ）中の化合物１６３（０．５６ｇ、１．７ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｐｄ／Ｃ（０．０３ｇ）を添加した。反応物を水素雰囲気下で撹拌した（二重バルーン／１気圧）。反応物をセライトで濾過し、ＭｅＯＨで洗浄した。溶媒を真空中で乾燥させ、残留物をカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ中のヘキサン、０～５０％、１２ｇカラム）により精製して、標的化合物１６４（３工程で９３ｍｇ、１２％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ３０１（Ｍ＋Ｈ）＋。
７Ｈ－ピロロ［２，３－ｈ］キナゾリン－２－アミン（１６５）：ＤＭＡ（３．１ｍＬ）中の化合物１６４（０．０９２ｇ、０．３１ｍｍｏｌ）の溶液に、炭酸グアニジン（２７９ｍｇ、３．０９ｍｍｏｌ）を添加し、１５０℃で撹拌した。ＬＣＭＳは、反応が完了したことを示し、混合物を分取ＬＣによって精製して、標的化合物１６５（６ｍｇ、１１％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ２５７（Ｍ＋Ｈ）＋。
１－（２－アミノ－７Ｈ－ピロロ［２，３－ｈ］キナゾリン－７－イル）－２－メチルプロパン－２－オール（１６６）：水素化ナトリウム（鉱油中の６０％分散液、２．２ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃で５ｍＬのヘキサンを添加し、溶液を撹拌した。ヘキサンを除去して、鉱油を洗い流した。次に、ＤＭＦ（１．１ｍＬ）中の化合物１６５（２ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）を溶液に滴加し、１時間撹拌した。次に、イソブチレンオキシド（１ｕＬ、０．０１１ｍｍｏｌ）を滴加し、反応物を撹拌した。反応物を濾過し、混合物を分取ＬＣで精製して、標的化合物１６６（１．５ｍｇ、２３％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ １８５（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000225
実施例５：以下の代表的な構造－コア２（図１）を含むＴＬＲアゴニストの合成：
Figure 2022520792000226
いくつかの実施形態において、Ｒ１またはＲ２はそれぞれ、Ｃ４～Ｃ８シクロアルキル、または独立して、－Ｈ、Ｃ１～Ｃ１２アルキル、ニトロ含有アルキル、芳香族環、または－Ｃ（ＮＨ）ＮＨ２を形成するように結合され、
Ｒ３は、Ｃ１～Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１～Ｃ１２アルキル、酸素含有Ｃ１～Ｃ１２アルキル、複素環、置換複素環、またはＨである。
コア２構造を有するＴＬＲアゴニストは、以下のスキームに開示されるように合成された。
Figure 2022520792000227
ｔｅｒｔ－ブチル２－（５，６－ジアミノピリミジン－４－イルアミノ）－２－オキソエチルカルバメート（１６７）：ＤＣＭ（５０ｍＬ）中のピリミジン－４，５，６－トリアミン（２０５０ｍｇ、１６．３８３ｍｍｏｌ）及びＢｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ（２８８０、１６．４４０ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＣＣ（３８００ｍｇ、１８．４１７ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（８０ｍｇ、０．６５５ｍｍｏｌ）を２３℃で添加した。３時間後、沈殿物を濾過により除去した。混合物を分取ＬＣにより精製して、標的化合物１６７（２４５８ｍｇ、８．７０７ｍｍｏｌ、５３％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ２８３（Ｍ＋Ｈ）＋。
ｔｅｒｔ－ブチル（６－アミノ－９Ｈ－プリン－８－イル）メチルカルバメート（１６８）：ｎ－ＢｕＯＨ（２０ｍＬ）中の化合物１６７（６２０ｍｇ、２．１９６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＭｅＯＨ（２５００ｕｌ、１１．５７０ｍｍｏｌ）中のＮａＯＭｅ ２５％を２３℃で添加した。温度を７０℃に上げた。１時間後、６ＮのＨＣｌ（１．８３ｍＬ、１１ｍｍｏｌ）を氷浴中で混合物に添加し、混合物をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）で希釈した。混合物を飽和重炭酸ナトリウム（５０ｍＬ）及びブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過した。混合物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、標的化合物１６８（２５０ｍｇ、０．９４６ｍｍｏｌ、４３％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ２６５（Ｍ＋Ｈ）＋。
ｔｅｒｔ－ブチル（６－アミノ－９－（２－ブロモエチル）－９Ｈ－プリン－８－イル）メチルカルバメート（１６９）：ＤＭＦ（５ｍＬ）中の化合物１６８（２５０ｍｇ、０．９４６ｍｍｏｌ）の溶液に、ジブロモエタン（２１００ｍｇ、２．７９５ｍｍｏｌ）及びＣｓＣＯ３（２４００ｍｇ、１．８４２ｍｍｏｌ）を２３℃で添加した。２．５時間後、混合物を２０ｍＬのＤＣＭで希釈し、飽和重炭酸ナトリウム（５０ｍＬ）及びブライン（５０ｍＬ）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過した。混合物を分取ＬＣにより精製して、化合物１６９（１４４ｍｇ、０．５４５ｍｍｏｌ、５８％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ３７２（Ｍ＋Ｈ）＋。
ｔｅｒｔ－ブチル４－アミノ－８，９－ジヒドロピラジノ［１，２－ｅ］プリン－７（６Ｈ）－カルボキシレート（１７０）：水素化ナトリウム（鉱油中６０％分散液、５１．４ｍｇ、１．２８６ｍｍｏｌ）の溶液に、５ｍＬのヘキサンを添加した。溶液を撹拌し、続いてヘキサンを除去して鉱油を洗い流した。ＤＭＦ（２．９ｍＬ）中の化合物１６９（１５９．２ｍｇ、０．４２９ｍｍｏｌ）を、２３℃で撹拌しながら溶液に滴加した。１時間後、ＬＣＭＳは、反応が完了したことを示した。混合物を、Ｇｅｍｉｎｉ ＮＸ、１５０×３０ Ｃ１８カラムを使用して、２０分間、５％～６０％の水／９０％ＡＣＮ ０．０５％ＴＦＡ勾配で、分取ＬＣにより精製した。生成物を含有する画分を合わせ、ロータリーエバポレーターで蒸発させた。残留物を高真空ポンプで乾燥させて、標的化合物１７０（３６．７ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ、１１％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ２９１（Ｍ＋Ｈ）＋。
６，７，８，９－テトラヒドロピラジノ［１，２－ｅ］プリン－４－アミン（１７１）：１７０（３５．７ｍｇ、０．１２３ｍｍｏｌ）の溶液に、１．２ｍＬのＤＣＭを添加した。トリフルオロ酢酸（４５．７ｕＬ、０．６１５ｍｍｏｌ）を２３℃で撹拌しながら滴加した。１時間後、ＬＣＭＳは反応が完了したことを示した。混合物を、ＰｈＭｅを使用したさらなる共沸によってロータリーエバポレーターで蒸発させ、化合物１７１（３８．５ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ、４１％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ １９１（Ｍ＋Ｈ）＋。
７－ベンジル－６，７，８，９－テトラヒドロピラジノ［１，２－ｅ］プリン－４－アミン（１７２）：ＤＭＦ（１．１ｍＬ）中の１７１（１０ｍｇ、０．０５３ｍｍｏｌ）の溶液に、ベンズアルデヒド（６．７ｕＬ、０．０６６ｍｍｏｌ）を添加した。ＤＩＥＡ（１８．３ｕＬ、０．１０５ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を１５分間撹拌した。次に、ボロン－ピリジン複合体（６．７ｕＬ、０．０６７ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を２３℃で一晩撹拌した。混合物を、Ｇｅｍｉｎｉ ＮＸ、１５０×３０ Ｃ１８カラムを使用して、２０分間、５％～６０％の水／９０％ＡＣＮ ０．０５％ＴＦＡ勾配で、分取ＬＣにより精製した。生成物を含有する画分を合わせ、ロータリーエバポレーターで蒸発させた。残留物を高真空ポンプで乾燥させて、化合物１７２（１．３ｍｇ、０．００２ｍｍｏｌ、３％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ２８１（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000228
実施例６：以下の代表的な構造－コア４（図１）を含むＴＬＲアゴニストの合成：
コア４
Figure 2022520792000229
いくつかの実施形態において、Ｒ１は、Ｃ１～Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１～Ｃ１２アルキル、酸素含有Ｃ１～Ｃ１２アルキル、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル、複素環、置換複素環、ハロゲン、またはＨであり、
Ｒ２は、Ｃ１～Ｃ１２アルキル、Ｃ１～Ｃ１２置換アルキル、Ｃ４～Ｃ８シクロアルキル、芳香族環、置換芳香族環、芳香族複素環、置換芳香族複素環、－ＯＮＨ２末端Ｃ１～Ｃ１２アルキル、またはＨであり、
Ｒ３は、Ｃ１～Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１～Ｃ１２アルキル、酸素／窒素／硫黄含有Ｃ１～Ｃ１２アルキル、複素環、置換複素環、シクロアルキル、置換シクロアルキル、－Ｎ３、末端Ｃ１～Ｃ１２アルキル、末端置換Ｃ１～Ｃ１２アルキル、または不在である。
コア４構造を有するＴＬＲアゴニストは、以下のスキームに開示されるように合成された。
Figure 2022520792000230
Ｎ－（４，６－ジアミノピリミジン－５－イル）ペンタンアミド（１９３）：ピリミジン－４，５，６－トリアミン（１０１５ｍｇ、８．１１２ｍｍｏｌ）を、７０℃でＮ－メチル－２－ピロリドン（１０ｍＬ）に溶解した。溶液が透明になった後、２３℃に冷却した。混合物に塩化バレリル（９８０ｕｌ、８．１２７ｍｍｏｌ）を添加し、温度を５０℃に上げた。２０時間後、温度を２３℃に下げ、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ、沈殿物）を混合物に添加し、沈殿物を濾過により分離した。固体をＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）及びアセトン（１０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させて、化合物１９３（１７８０ｍｇ、７．２３７ｍｍｏｌ、９０％）を淡褐色の固体として得た。生成物をさらに精製することなく次のステップに使用した。ＭＳ ｍ／ｚ ２１０（Ｍ＋Ｈ）＋。
８－ブチル－９Ｈ－プリン－６－アミン（１９４）：ｎ－ＢｕＯＨ（３０ｍＬ）中の粗製化合物１９３（１７８０ｍｇ、７．２７３ｍｍｏｌ）の溶液に、２３℃でナトリウムメトキシド（１５７０ｍｇ、２９．０６３ｍｍｏｌ）を添加し、還流まで加熱した。１時間後、溶液を室温に冷却し、６ＭのＨＣｌ（３．２ｍＬ）で中和し、ブライン（２０ｍＬ）を添加して、二相混合物を得た。有機層を分離し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、続いて真空中で濃縮して、標的化合物１９４（１１４８ｍｇ、６．００３ｍｍｏｌ、８３％）を淡褐色の固体として得た。ＭＳ ｍ／ｚ １９２（Ｍ＋Ｈ）＋。
ｔｅｒｔ－ブチル４－（６－アミノ－８－ブチル－９Ｈ－プリン－９－イル）ブチルカルバメート（１９５）：ＴＨＦ（２０ｍＬ）中のＮ－Ｂｏｃ－アミノ－ブタノール（１５２０ｍｇ、８．０３２ｍｍｏｌ）及び化合物１９４（１４２０ｍｇ、７．４２６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＰＰｈ３（２０８０ｍｇ、７．９３０ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。３０分後、この混合物にＤＩＡＤ（２２００ｕｌ、１１．１７４ｍｍｏｌ）を０℃で５分間にわたって添加した。３時間後、溶媒を真空中で除去した。残留物をＤＣＭ（１００ｍＬ）で希釈し、半飽和重炭酸ナトリウム（１００ｍＬ）及びブライン（２０ｍＬ）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過した。溶媒を真空中で除去した。残留物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、化合物１９５（１０６４ｍｇ、２．９３５ｍｍｏｌ、３７％）を淡褐色の固体として得た。ＭＳ ｍ／ｚ ３６３（Ｍ＋Ｈ）＋。
ｔｅｒｔ－ブチル４－（６－（Ｎ－ベンゾイルベンズアミド）－８－ブチル－９Ｈ－プリン－９－イル）ブチルカルバメート（１９６）：ＤＣＭ（１０ｍＬ）中の化合物１９５（１０６４ｍｇ、２．９３５ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃で塩化ベンゾイル（７００ｕｌ、４．９８０ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（９００ｕｌ、１７．７８８ｍｍｏｌ）を添加し、温度を２０℃に上げた。２．５時間後、混合物を飽和重炭酸ナトリウム（５０ｍＬ）及びブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過した。溶媒を真空中で除去し、残留物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、化合物１９６（１６５０ｍｇ、２．８９１ｍｍｏｌ、９８％）を淡褐色の油状物として得た。ＭＳ ｍ／ｚ ５７１（Ｍ＋Ｈ）＋。
ｔｅｒｔ－ブチル４－（６－（Ｎ－ベンゾイルベンズアミド）－８－ブチル－２－ニトロ－９Ｈ－プリン－９－イル）ブチルカルバメート（１９７）：ＤＣＭ（１０ｍＬ）中のテトラメチル硝酸アンモニウム（７８０ｍｇ、５．７２９ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸無水物（１２００ｕｌ、１７．１１８ｍｍｏｌ）を２３℃で添加した。１時間後、混合物を０℃に冷却し、ＤＣＭ（２０ｍＬ）中の化合物１９６（１６５０ｍｇ、２．８９１ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。温度を２３℃に上げた。２時間後、混合物をＤＣＭ（２０ｍＬ）で希釈し、半飽和重炭酸ナトリウム（２０ｍＬ）及びブライン（２０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過した。溶媒を真空中で除去し、残留物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、化合物１９７（１０６７ｍｇ、１．７３３ｍｍｏｌ、６０％）をガラス質の淡黄色の固体として得た。ＭＳ ｍ／ｚ ６１６（Ｍ＋Ｈ）＋。
９－（４－アミノブチル）－８－ブチル－９Ｈ－プリン－６－アミン（１９８）及び６－アミノ－９－（４－アミノブチル）－８－ブチル－９Ｈ－プリン－２－オール（１９９）：ＥｔＯＨ（２０ｍＬ）中の化合物１９７（２２０ｍｇ、０．３５７ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｐｄ／Ｃ（１０％、０．１ｇ）を２３℃で添加し、水素ガスを通気した。１８時間後、ＬＣＭＳは、脱ニトロ化された化合物が作製されたことを示した。ＮａＯＭｅ（３０ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を４時間撹拌した。次に、ＴＦＡ（３ｍＬ）を添加した。２０分後、溶媒を真空中で除去し、混合物を分取ＬＣにより精製して、化合物１９８（９４ｍｇ、０．１５６ｍｍｏ、４４％）を淡褐色の固体として得（ＭＳ ｍ／ｚ ２６３（Ｍ＋Ｈ）＋）、化合物１９９（０．０２４ｍｍｏｌ、７％）を淡褐色の固体として得た（ＭＳ ｍ／ｚ ２７９（Ｍ＋Ｈ）＋）。
Figure 2022520792000231
４－アミノ－Ｎ－（４－（６－アミノ－８－ブチル－２－ヒドロキシ－９Ｈ－プリン－９－イル）ブチル）－３，５－ジフルオロベンズアミド（２００）：１５０について記載したのと同様の手順を用いて、化合物１９９及び４－アミノ－３，５－ジフルオロ－安息香酸を出発材料として使用して、化合物２００を調製して、標的化合物２００（１４ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ、６１％）を淡褐色の固体として得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４３４（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000232
４－アミノ－Ｎ－（４－（６－アミノ－８－ブチル－９Ｈ－プリン－９－イル）ブチル）－３，５－ジフルオロベンズアミド（２０１）：１５０について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物１９８及び４－アミノ－３，５－ジフルオロ－安息香酸を出発材料として使用して、化合物２０１を調製して、標的化合物２０１（１３ｍｇ、０．０１７ｍｍｏｌ、９３％）を淡褐色の固体として得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４１８（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000233
３－アミノ－Ｎ－（４－（６－アミノ－８－ブチル－９Ｈ－プリン－９－イル）ブチル）ベンズアミド（２０２）：１５０について記載したのと同様の手順を用いて、化合物１９８及び３－アミノ安息香酸を出発材料として使用して、化合物２０２を調製して、標的化合物２０２（１０ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ、８８％）を淡褐色の固体として得た。ＭＳ ｍ／ｚ ３８２（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000234
５－アミノ－Ｎ－（４－（６－アミノ－８－ブチル－９Ｈ－プリン－９－イル）ブチル）ニコチンアミド（２０３）：１５０について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物１９８及び５－アミノ－ニコチン酸を出発材料として使用して、化合物２０３を調製して、標的化合物２０３（１４ｍｇ、０．０１９ｍｍｏｌ、定量的）を淡褐色の固体として得た。ＭＳ ｍ／ｚ ３８３（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000235
ｔｅｒｔ－ブチル４－（２，６－ジクロロ－９Ｈ－プリン－９－イル）ブチルカルバメート（２０４）：ＴＨＦ（１０ｍＬ）中のＮ－Ｂｏｃ－アミノ－ブタノール（１６２０ｍｇ、８．５６０ｍｍｏｌ）及び２，６－ジクロロプリン（１４９５ｍｇ、７．９１０ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃でＰＰｈ３（２２８０ｍｇ、８．６９３ｍｍｏｌ）を添加した。３０分後、ＤＩＡＤ（２３００ｕｌ、１１．６８１ｍｍｏｌ）を０℃で５分間にわたって添加した。混合物を５０℃で撹拌した。６時間後、溶媒を真空中で除去した。残留物をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）で希釈し、半飽和重炭酸ナトリウム（１００ｍＬ）及びブライン（２０ｍＬ）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過した。溶媒を真空中で除去した。残留物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、化合物２０４（４５００ｍｇ、＜１２．４９２ｍｍｏｌ、＜１００％）を黄色の油状物として得た。（約２０％の不純物がＰＰｈ３である）。ＭＳ ｍ／ｚ ３６１（Ｍ＋Ｈ）＋。
ｔｅｒｔ－ブチル４－（６－アミノ－２－クロロ－９Ｈ－プリン－９－イル）ブチルカルバメート（２０５）：化合物２０４（ＰＰｈ３の粗製混合物、４５００ｍｇ、＜１２．４９２ｍｍｏｌ）を、撹拌棒を備えた耐圧ガラス容器に入れた。この容器に、ＭｅＯＨ中の７ＮのＮＨ３（１２ｍＬ、８４ｍｍｏｌ）を添加した。チューブを密封し、次いで、１２０℃で加熱した。３０分後、溶媒を真空中で除去し、残留物をＤＣＭ（１００ｍＬ）に溶解した。溶液を飽和重炭酸ナトリウム（１００ｍＬ）及びブライン（３０ｍＬ）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過した。溶媒を真空中で除去した。残留物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、化合物２０５（１３１０ｍｇ、３．８４４ｍｍｏｌ、３７％）を淡黄色の固体として得た。ＭＳ ｍ／ｚ ３４１（Ｍ＋Ｈ）＋。
ｔｅｒｔ－ブチル４－（６－アミノ－２－ブトキシ－９Ｈ－プリン－９－イル）ブチルカルバメート（２０６）：ｎ－ブタノール（５ｍＬ）中の化合物２０５（２５７ｍｇ、０．７５４ｍｍｏｌ）の溶液に、乾燥窒素ガス下で、ナトリウム金属（９０ｍｇ、２．４５５ｍｍｏｌ）を２３℃で添加した。温度を１００℃に上げた。１８時間後、溶媒を真空中で除去した。残留物をＤＣＭ（５０ｍＬ）に溶解し、半飽和重炭酸ナトリウム（５０ｍＬ）及びブライン（５０ｍＬ）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過した。溶媒を真空中で除去した。化合物２０６（３１０ｍｇ、＜０．８１９ｍｍｏｌ、定量的）を淡褐色の粗製固体として得た。ＭＳ ｍ／ｚ ３７９（Ｍ＋Ｈ）＋。
ｔｅｒｔ－ブチル４－（６－アミノ－８－ブロモ－２－ブトキシ－９Ｈ－プリン－９－イル）ブチルカルバメート（２０７）：ＤＣＭ（１０ｍＬ）中の化合物２０６（３１０ｍｇ、０．８１９ｍｍｏｌ、粗製）の溶液に、臭素（１５０ｕＬ、０．５６３ｍｍｏｌ）を２３℃で添加した。１時間後、溶媒を真空中で除去した。混合物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、化合物２０７（２５０ｍｇ、０．５４７ｍｍｏｌ、６７％）をガラス質の淡黄色の固体として得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４５８（Ｍ＋Ｈ）＋。
ｔｅｒｔ－ブチル４－（６－アミノ－２－ブトキシ－８－メチル－９Ｈ－プリン－９－イル）ブチルカルバメート（２０８）：乾燥ＴＨＦ（５ｍＬ）中の化合物２０７（８２ｍｇ、０．１７９ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＨＦ中のトリメチルアルミニウム、１Ｍ（３６０ｕｌ、０．３６ｍｍｏｌ）及びＰｄＣｌ２（ＰＰｈ３）２（４４ｍｇ、０．０６３ｍｍｏｌ）を２３℃で添加した。混合物を還流した。２０時間後、混合物を２０ｍＬのＤＣＭで希釈し、半飽和重炭酸ナトリウム（２０ｍＬ）及びブライン（２０ｍＬ）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過した。溶媒を真空中で除去した。残留物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、化合物２０８（１２ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ、１７％）を淡褐色の固体として得た。ＭＳ ｍ／ｚ ３９３（Ｍ＋Ｈ）＋。
９－（４－アミノブチル）－２－ブトキシ－８－メチル－９Ｈ－プリン－６－アミン（２０９）：ＤＣＭ（０．５ｍＬ）中の化合物２０８（１２ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（０．５ｍＬ）を２３℃で添加した。１時間後、溶媒を真空で除去した。残留物を高真空ポンプで一晩乾燥させて、化合物２０９（１５ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ、定量的）を淡褐色の固体として得た。ＭＳ ｍ／ｚ ２９３（Ｍ＋Ｈ）＋。
４－アミノ－Ｎ－（４－（６－アミノ－２－ブトキシ－８－メチル－９Ｈ－プリン－９－イル）ブチル）－３，５－ジフルオロベンズアミド（２１０）：１５０について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物２０９及び４－アミノ－３，５－ジフルオロ－安息香酸を出発材料として使用して、化合物２１０を調製して、標的化合物２１０（３．５ｍｇ、０．００４ｍｍｏｌ、２２％）を淡褐色の固体として得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４６９（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000236
９－（４－アミノブチル）－８－ブロモ－２－ブトキシ－９Ｈ－プリン－６－アミン（２１１）：２０９について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物２０７を使用して、化合物２１１を調製して、標的化合物２１１（８ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ、定量的）を淡褐色の固体として得た。ＭＳ ｍ／ｚ ３５８（Ｍ＋Ｈ）＋。
４－アミノ－Ｎ－（４－（６－アミノ－８－ブロモ－２－ブトキシ－９Ｈ－プリン－９－イル）ブチル）－３，５－ジフルオロベンズアミド（２１２）：１５０について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物２１１及び４－アミノ－３，５－ジフルオロ－安息香酸を出発材料として使用して、化合物２１２を調製して、標的化合物２１２（８ｍｇ、０．００９ｍｍｏｌ、８２％）を淡褐色の固体として得た。ＭＳ ｍ／ｚ ５１３（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2022520792000237
実施例７：本実施例は、本発明で使用される種々の方法論及び技法を開示する。
分子クローニング－ＣＨＯ細胞コドン最適化抗体重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡ配列は、商業的ＤＮＡ合成サービス（ＩＤＴ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から得た。合成されたＤＮＡ断片を、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ及びＥｃｏＲ Ｉ（いずれもＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ），Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡから）で消化し、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）により精製した。消化された抗体遺伝子断片をクイックライゲーションキット（ＮＥＢ）を介して発現ベクターにライゲーションして、野生型抗体重鎖及び軽鎖の発現のための構築物を得た。得られるプラスミドをＥ．ｃｏｌｉで増殖させ、ＤＮＡシーケンシングサービス（Ｅｔｏｎ）により検証した。
アンバーコドン含有変異体の生成－抗ＨＥＲ２ Ｆａｂの結晶構造に基づいて、非天然アミノ酸（例えば、パラ－アセチル－フェニルアラニン（ｐＡＦ）、またはパラ－アジド－フェニルアラニン）を遺伝子組み込みするために、軽鎖定常領域に位置する１０の異なる表面アクセス可能部位を選択した。これらの部位は、抗原－抗体結合に重要ではない。その後、選択した部位の各遺伝子コドンを、部位特異的変異誘発を介してアンバーコドン（ＴＡＧ）に変異させて、その抗体変異体の発現プラスミドを生成した。プライマーは、ＩＤＴから購入した。すべての部位特異的変異誘発実験は、取扱説明書（ＮＥＢ）に従ってＱ５部位特異的変異誘発キットを使用し行った。変異体の発現プラスミドをＥ．ｃｏｌｉで増殖させ、ＤＮＡシーケンシングサービス（Ｅｔｏｎ）により検証した。表８は、抗ＨＥＲ２ Ｆａｂの重鎖または軽鎖定常領域における、それらのＫａｂａｔ番号付けによるアンバー変異部位、及び対応するアミノ酸配列（配列番号２及び４～１１）のリストを提供する。配列番号１及び３は、それぞれ、抗ＨＥＲ２ Ｆａｂの野生型重鎖及び軽鎖を示す。抗ＨＥＲ２ Ｆａｂとしては、配列番号２及び配列番号４、配列番号２及び配列番号５、配列番号２及び配列番号６、配列番号２及び配列番号７、配列番号２及び配列番号８、配列番号２及び配列番号９、配列番号２及び配列番号１０、配列番号２及び配列番号１１、配列番号２及び配列番号１２、配列番号２及び配列番号１３の重鎖及び軽鎖配列が挙げられる。
Figure 2022520792000238
Figure 2022520792000239
Figure 2022520792000240
Figure 2022520792000241
Ｘは非天然アミノ酸（ｎｎＡＡ）を示し、下線付きは表７のＦｃ変異を示す。
１１４位の重鎖におけるアンバー変異に加えて、Ｆｃ変異もまた、抗ＨＥＲ２抗体または抗体断片の種々の位置で生成され、薬物動態を改善し、及び／または抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）及び／または抗体依存性細胞毒性ＡＤＣＣ活性を増強した（表９）。
Figure 2022520792000242
一過性発現－プラットフォーム細胞株３０１～１４を、３ｍＭのＬ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）及び３ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＥＸ－Ｃｅｌｌ ３０２（Ｓｉｇｍａ）中で維持した。細胞を３～４日ごとに継代し、４０万個の細胞／ｍＬの密度で播種した。トランスフェクションの１日前に、細胞を１ｍＬ当たり６０万個の細胞で播種した。０日目に、取扱説明書に従って、ＭａｘＣｙｔｅエレクトロポレーションプラットフォームを使用して、軽鎖及び重鎖をコードする抗体発現プラスミドで細胞をトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞を空の１２５ｍＬ振盪フラスコに静置し、３７℃の静的インキュベーターで３０分間インキュベートした。次いで、トランスフェクトした細胞を、振盪フラスコ中に３×１０６／ｍＬの密度で、基本発現培地（５０μＭのＭＳＸを補充した５０％Ｄｙｎａｍｉｓ－５０％ＥｘＣｅｌｌ ３０２）に接種した。トランスフェクトした細胞を、１４０ｒｐｍに設定したオービタルシェーカー上で、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。１ｍＭのｐＡＦを、７ｇ／ＬのＣｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ ５（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、１２０μｇ／ＬのＬｏｎｇ Ｒ３ ＩＧＦ－１（ｓｉｇｍａ）、及び２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸと一緒に、１日目に培養物に添加した。インキュベーター内の温度を３７℃から３２℃に変えた。さらに７ｇ／ＬのＣｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ ５及び２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸを３日目に添加し、５日目に上清を収集した。グルコースレベルをグルコースメーターを使用して監視し、培養培地中のグルコースレベルが２ｇ／Ｌを下回った場合、追加のグルコースを培養物に添加した。生存細胞数及び生存率をＶｉ－Ｃｅｌｌ機器によって測定した。生産性は、プロテインＧセンサーを使用して、Ｏｃｔｅｔにより測定した。
安定したバルクプール生成－発現プラスミドを、６時間のＰｖｕ Ｉ（ＮＥＢ）消化を使用して線形化した。線形化後、フェノール抽出を使用してＤＮＡを精製し、２．５μｇ／μｌの濃度でエンドトキシン不含水に溶解した。プラットフォーム細胞株ＢＢ－１１７を、３ｍＭのＬ－グルタミン及び３ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸを補充したＥＸ－Ｃｅｌｌ ３０２中で維持した。細胞を３～４日ごとに継代し、０．４×１０６／ｍＬの密度で播種した。トランスフェクションの１日前、細胞を０．６×１０６／ｍＬで播種した。０日目に、取扱説明書に従って、ＭａｘＣｙｔｅエレクトロポレーションプラットフォームを使用して、細胞を線形化抗体発現プラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞を空の１２５ｍＬ振盪フラスコに静置し、３７℃の静的インキュベーターで３０分間インキュベートした。次いで、３０ｍＬの回収培地（３ｍＭのグルタミン及び３ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸを補充した５０％Ｅｘ－３０２～５０％ＣＤ－ＣＨＯ）をフラスコに添加し、一晩振盪した。１日目に、トランスフェクトした細胞を計数し、沈降させ、洗浄し、安定したバルクプール生成のために選択培地（５０～１００μＭのＭＳＸを含む５０％Ｅｘ－３０２～５０％ＣＤ－ＣＨＯ）に再懸濁した。生存細胞数及び生存率を監視し、安定したバルクプールの生存率が９０％に戻るまで、３～４日ごとに培地を交換した。選択が終了したら、凍結細胞ストックを作製し、得られる安定したバルクプールを使用して、供給回分発現のための材料を生成した。
供給回分発現－０日目に、振盪フラスコ中に０．５×１０６／ｍＬの密度で、以前に生成された抗体の安定したバルクプールを基本発現培地（５０μＭのＭＳＸを補充した５０％Ｄｙｎａｍｉｓ－５０％ＥｘＣｅｌｌ ３０２）に接種した。トランスフェクトした細胞を、１４０ｒｐｍに設定したオービタルシェーカー上で、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。０．５ｍＭのｐＡＦを、１０ｇ／ＬのＣｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ ４（ＧＥ ｈｅａｌｔｈ ｃａｒｅ）及び０．５２ｇ／ＬのＣｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ ７ｂ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と一緒に、３日目に培養物に添加した。５日目に、１２０μｇ／ＬのＬｏｎｇ Ｒ３ ＩＧＦ－１を培養物に添加した。グルコースレベルをグルコースメーターを使用して監視し、培養培地中のグルコースレベルが２ｇ／Ｌを下回った場合、追加のグルコースを培養物に添加した。生存細胞数及び生存率をＶｉ－Ｃｅｌｌ機器によって測定した。７日目に、精製のために上清を収集した。生産性は、プロテインＧセンサーを使用して、Ｏｃｔｅｔにより測定した。
ＥｕＣＯＤＥ発現系からｎｎＡＡを含有する抗体の精製－ｎｎＡＡを含有する標的抗体を含有する清澄化した細胞培養培地を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１００ｍＭの塩化ナトリウム（ｐＨ７．５）において平衡化したプロテインＡ ＰｒｏＳｅｐ Ｕｌｔｒａカラム（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上にロードした。ロード後、カラムを、緩衝液Ａ（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．５）、続いて洗浄緩衝液Ｂ（５ｍＭのコハク酸、ｐＨ５．８）で洗浄して、宿主細胞汚染物質を除去した。標的抗体を溶出緩衝液Ｃ（５０ｍＭのグリシン、１０ｍＭのコハク酸、ｐＨ３．２）でカラムから溶出した。標的抗体をプールし、２．０Ｍのトリス塩基でｐＨ５．０に調整した。標的抗体を、３０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）において平衡化したＣａｐｔｏ ＳＰ Ｉｍｐｒｅｓカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に条件付けされたプロテインＡプールをロードすることによってさらに精製した。標的抗体を、１００％緩衝液Ｂ（３０ｍＭの酢酸ナトリウム、０．５Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ５．０）への線形勾配でカラムから溶出し、モノマー抗体を含有する画分をプールし、０．２２μＭ濾過し、さらなる使用まで６５℃以下で保管した。
ＴＬＲアゴニストリンカーペイロードの部位特異的コンジュゲーション－ｎｎＡＡ、例えばパラ－アセチルフェニルアラニンを含有する抗体をコンジュゲーション緩衝液（３０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０）に緩衝液交換し、１０～２０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。最終的な１００ｍＭの酢酸ヒドラジドを抗体に添加し、続いて１０モル当量のヒドロキシル－アミン官能化ＴＬＲアゴニスト薬物－リンカーを添加した。コンジュゲーション反応を２５～３０℃で１８～２０時間インキュベートし、続いてＣａｐｔｏ ＳＰ Ｉｍｐｒｅｓカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で精製して、過剰な試薬を除去した。精製したＡＤＣを製剤緩衝液（５０ｍＭのヒスチジン、１００ｍＭのＮａＣｌ、５％トレハロース、ｐＨ６．０）に緩衝液交換し、さらなる使用まで６５℃以下で保管した。図２及び３は、本発明のＴＣの部位特異的コンジュゲーションを図示する。種々のＴＬＲアゴニストとのＴＬＲアゴニスト薬物－リンカー抗体コンジュゲーションが図示される。図３に示すように、ＡＡは切断可能なアミノ酸リンカーを示し、Ｌは切断不能なリンカーを示す。
実施例８：小分子ＴＬＲアゴニストのインビトロ機能アッセイ
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ７細胞を、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）検出培地中でインキュベートし、増加濃度のＴＬＲ７もしくはＴＬＲ８またはＴＬＲ７／８アゴニストで刺激した。２４時間のインキュベーション後、ＮＦ－ｋＢ誘導性ＳＥＡＰのレベルを、Ｑｕａｎｔｉ－Ｂｌｕｅ検出試薬（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）により決定し、読み取り値を６５５ｎｍのＯＤで得た。ＥＣ５０を、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して用量応答曲線から決定した。以下の表及び図は、本明細書の実施例１～６に記載の本発明の例示的なＴＬＲアゴニストの活性を示す。５００ｎＭ未満のＥＣ５０値は、５０ｎＭ～１ｕＭ、または１ｕＭ～３ｕＭを超えるＥＣ５０値を有する化合物よりも高い効力を有する化合物を示唆する。
図４は、２．０８ｕＭのＥＣ５０を有する市販のＴＬＲ７レシキモド（Ｒ８４８）、０．４３５ｕＭのＥＣ５０を有する化合物１、及び０．１５３ｕＭのＥＣ５０を有する化合物２を使用した、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ｈＴＬＲ７レポーター細胞株におけるＴＬＲ７アゴニスト刺激を示す。
上記の実施例１～６に開示される例示的なＴＬＲアゴニストの活性をアッセイした。図５Ａ、表１０は、市販の対照ＤＳＲ－６４３４、レシキモド、及びモトリモドと比較したＥＣ５０値を示す。
Figure 2022520792000243
図５Ｂ及び表１１は、選択されたＴＬＲ７アゴニストのＴＬＲ７活性を示す。ＡＸＣ－８８７及びＡＸＣ－８７７は、１０ｎＭを下回るＥＣ５０値を示し、これらの化合物が非常に強力なＴＬＲ７アゴニストであることを示唆している。ＴＬＲ８レポーターアッセイにおいて、ＡＸＣ－８８７は、１４２７ｎＭのＥＣ５０を有する市販の化合物モトリモドと比較して、３７３３ｎＭのＥＣ５０を有する測定可能な活性を示した。これは、ＡＣＸ－８８７がＴＬＲ７／８デュアルアゴニストであることを示唆した。
Figure 2022520792000244
図６及び表１２は、リンカーに結合された選択されたＴＬＲ７アゴニストのＴＬＲ７活性を示す。ＡＸＣ－８７９は、異なるＴＬＲ－アゴニスト（ペイロード）リンカーの中で最も高い効力を示した。
Figure 2022520792000245
図７及び表１３は、追加のＴＬＲ７アゴニスト及びリンカーに結合されたＴＬＲ７アゴニストのＴＬＲ７活性を示した。ＡＸＣ－８９５は、試験した異なるペイロードの中で最も高い効力を示し、ＡＸＣ－９０１は、異なるペイロードリンカーの中で最も高い効力を示した。（ＤＬ）は、薬物リンカーまたはリンカーに結合されたＴＬＲアゴニストまたはリンカーに結合されたＴＬＲアゴニスト（ペイロード）を示す。
Figure 2022520792000246
図８及び表１４は、追加のＴＬＲ７アゴニスト及びリンカーに結合されたＴＬＲ７アゴニストのＴＬＲ７活性を示す。すべての試験化合物は、ＴＬＲ７アゴニスト活性を有する。ＡＸＣ－８９４、ＡＸＣ－９０３、ＡＸＣ－９０４、ＡＸＣ９０５、及びＡＸＣ－９０６は、１０ｎＭを下回るＥＣ５０値で試験した異なるペイロードの中で最も高い効力を示した。
Figure 2022520792000247
図９及び表１５は、リンカー（薬物リンカーまたはＤＬ）、及び最終代謝産物を含有する非天然アミノ酸、例えばｐＡＦ（ＤＬ－ｐＡＦ）に結合された異なるＴＬＲ７アゴニストのＴＬＲ７活性を比較した。すべての場合において、最終代謝産物を含有するｐＡＦは、薬物リンカーを有するそれぞれのペイロードよりも高い効力を示した。ＡＸＣ－８７９は、異なるＴＬＲペイロードリンカーの中で最も高い効力を示した。
Figure 2022520792000248
実施例９：ＴＣの部位特異的コンジュゲーション
ＴＣの部位特異的コンジュゲーションは、分析逆相ＨＰＬＣを使用して、実施例７に記載されるように行われた。図１０Ａは、還元条件下で、非天然アミノ酸、例えば、ｐＡＦを有するコンジュゲートされていない抗ＨＥＲ２抗体の、アミノ酸位置ＨＡ１１４における分析逆相ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図１０Ｂ及び１０Ｃは、それぞれ、ＴＬＲアゴニストＡＸＣ－８７５及びＡＸＣ－８８０とアミノ酸位置ＨＡ１１４でコンジュゲートした抗ＨＥＲ２抗体を示す。表１６は、上述の標準的なコンジュゲーション条件からのＴＬＲコンジュゲートの薬物－抗体比（ＤＡＲ）を示す。様々なＤＡＲレベル（０．３～２．０）がＴＬＲコンジュゲート間で見ることができるが、これは、主に、関連するＴＬＲリンカー－ペイロードの異なる特性に起因する。
Figure 2022520792000249
実施例１０：種々の腫瘍細胞とのインビトロ共培養アッセイ
ＲＡＷ－Ｂｌｕｅ（商標）細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）を、異なるレベルのＨＥＲ２発現レベルを有するヒト腫瘍細胞と、９６ウェルプレートのウェル当たりの総細胞数１００万個で、１：１のＥ：Ｔ比で共培養した。異なる濃度の小分子ＴＬＲ７アゴニスト及びコンジュゲートされたＩＳＡＣ（免疫刺激抗体コンジュゲート）を共培養細胞培地に添加した。２４時間のインキュベーション後、ＲＡＷ－Ｂｌｕｅ（商標）細胞からのＮＦ－ｋＢ誘導性ＳＥＡＰのレベルを、ＯＤ ６５５ｎｍで読み取って、Ｑｕａｎｔｉ－Ｂｌｕｅ検出試薬（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）により決定した。Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、用量応答曲線を生成した。
図１１Ａ～１１Ｃは、抗ＨＥＲ２抗体にコンジュゲートされたときの、選択されたペイロードリンカーの腫瘍依存性ＩＳＡＣ活性を比較する。ＳＫＯＶ３は、ＨＥＲ２高発現腫瘍細胞株（図１１Ａ）であり、ＪＩＭＴ－１は、ＨＥＲ２中／低発現腫瘍細胞株（図１１Ｂ）であり、Ａ４３１は、ＨＥＲ２低発現腫瘍細胞株（図１１Ｃ）である。小分子ＴＬＲ７アゴニストは、すべての腫瘍細胞株の存在下で強力なＴＬＲ７活性を示す。すべてのＴＬＲ７ ＩＳＡＣＳは、ＨＥＲ２低または中発現腫瘍細胞株の存在下で活性を示さない。ペイロード薬物リンカーＡＸＣ－８６３を有するＩＳＡＣは、ＨＥＲ２高発現腫瘍細胞株の存在下でのみ強力な用量依存活性を示す。
図１２Ａ及び１２Ｂは、抗ＨＥＲ２抗体にコンジュゲートされたときの、追加のペイロードリンカーの腫瘍依存性ＩＳＡＣ活性を比較する。ＳＫＢＲ３は、ＨＥＲ２高発現腫瘍細胞株であり（図１２Ａ）、ＨＣＣ１８０６は、ＨＥＲ２超低発現腫瘍細胞株である（図１２Ｂ）。小分子ＴＬＲ７アゴニストは、すべての腫瘍細胞株の存在下で強力なＴＬＲ７活性を示す。すべてのＴＬＲ７ ＩＳＡＣＳ及びコンジュゲートされていない抗ＨＥＲ２抗体は、ＨＥＲ２超低発現腫瘍細胞株の存在下で活性を示さない。ペイロード薬物リンカーＡＸＣ－８６３を有するＩＳＡＣは、ＨＥＲ２高発現腫瘍細胞株の存在下でのみ強力な用量依存活性を示す。
図１３Ａ及び１３Ｂは、抗ＨＥＲ２抗体にコンジュゲートされたときの、追加のペイロードリンカーの腫瘍依存性ＩＳＡＣ活性を比較する。ＳＫＢＲ３は、ＨＥＲ２高発現腫瘍細胞株であり（図１３Ａ）、ＨＣＣ１８０６は、ＨＥＲ２超低発現腫瘍細胞株である（図１３Ｂ）。小分子ＴＬＲ７アゴニストは、すべての腫瘍細胞株の存在下で強力なＴＬＲ７活性を示す。すべてのＴＬＲ７ ＩＳＡＣＳ及びコンジュゲートされていない抗ＨＥＲ２抗体は、ＨＥＲ２超低発現腫瘍細胞株の存在下で活性を示さない。すべてのＩＳＡＣは、ＨＥＲ２高発現腫瘍細胞株の存在下でのみ強力な用量依存活性を示す（図１３Ａ）。ペイロード薬物リンカーＡＸＣ－８７９を有するＩＳＡＣＳは、最も高いＨＥＲ２依存性ＴＬＲ７活性を示した。
図１４Ａ及び１４Ｂは、抗ＨＥＲ２抗体にコンジュゲートされたときの、追加のペイロードリンカーの腫瘍依存性ＩＳＡＣ活性を比較する。ＳＫＢＲ３は、ＨＥＲ２高発現腫瘍細胞株であり（図１４Ａ）、ＨＣＣ１８０６は、ＨＥＲ２超低発現腫瘍細胞株である（図１４Ｂ）。小分子ＴＬＲ７アゴニストは、すべての腫瘍細胞株の存在下で強力なＴＬＲ７活性を示す。ＴＬＲ７ ＩＳＡＣＳ及びコンジュゲートされていない抗ＨＥＲ２抗体は、ＨＥＲ２超低発現腫瘍細胞株の存在下で活性を示さなかった。すべてのＩＳＡＣは、ＨＥＲ２高腫瘍細胞株の存在下でのみ強力な用量依存活性を示す。ペイロード薬物リンカーＡＸＣ－９０１を有するＩＳＡＣは、最も高いＨＥＲ２依存性ＴＬＲ７活性を示した。
図１５Ａ及び１５Ｂは、ＳＫＢＲ３ ＨＥＲ２高発現腫瘍細胞株（図１５Ａ）及びＨＣＣ１８０６ ＨＥＲ２超低発現腫瘍細胞株（図１５Ｂ）における、抗ＨＥＲ２抗体にコンジュゲートされた３つの（３）ペイロードリンカーの腫瘍依存性ＩＳＡＣ活性を比較し、ＨＥＲ２－ＡＸＣ－８７９が、既知のＩＳＡＣの代表であるＨＥＲ２－ＡＸＣ－８６０及びＨＥＲ２－ＡＸＣ－９１０と比較して、最良のＩＳＡＣ活性を有することを示す。表１７は、比較したＨＥＲ２－ＡＸＣ ＩＳＡＣの生成に使用されたＴＬＲ－アゴニスト－リンカー構造を示す。
Figure 2022520792000250
実施例１１：乳癌の治療
乳癌療法のためのトラスツズマブ連結ＴＬＲアゴニスト誘導体の安全性及び／または有効性のヒト臨床試験
目的：トラスツズマブ連結ＴＬＲアゴニスト誘導体を含む、投与された組成物の安全性及び薬物動態を比較するため。
研究設計：この研究は、乳癌患者における第Ｉ相、単一施設、非盲検、無作為化用量漸増試験、続く第ＩＩ相試験とする。患者は、研究のエントリー前に、トラスツズマブ連結ＴＬＲアゴニスト誘導体に曝露されていてはならない。患者は、試験開始の２週間以内にがんの治療を受けていてはならない。治療には、化学療法、造血成長因子、及びモノクローナル抗体などの生物学的療法の使用が含まれる。患者は、以前の治療に関連するすべての毒性（グレード０または１）から回復していなければならない。すべての対象を安全性について評価し、薬物動態分析のためのすべての採血を予定通りに収集する。すべての研究は、施設の倫理委員会の承認及び患者の同意を得て実施される。
第Ｉ相：患者は、各２８日サイクルの１、８、及び１５日目に、ｉ．ｖ．でトラスツズマブ連結ＴＬＲアゴニスト誘導体を受ける。トラスツズマブ連結ＴＬＲアゴニスト誘導体の用量を、以下に概説される評価に基づいて、毒性に関して保持または修飾してもよい。治療は、許容できない毒性の不在下で２８日ごとに繰り返される。３～６人の患者のコホートは、トラスツズマブ連結ＴＬＲアゴニスト誘導体の最大耐容用量（ＭＴＤ）が決定されるまで、トラスツズマブ連結ＴＬＲアゴニスト誘導体の漸増用量を受ける。ＭＴＤは、３人のうちの２人または６人のうちの２人が用量制限毒性を経験した用量の前の用量として定義される。用量制限毒性は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＣＩ）Ｃｏｍｍｏｎ Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ Ａｄｖｅｒｓｅ Ｅｖｅｎｔｓ（ＣＴＣＡＥ）Ｖｅｒｓｉｏｎ ３．０（２００６年８月９日）によって設定された定義及び基準に従って決定される。
第ＩＩ相：患者は、第Ｉ相で決定されたＭＴＤにおいて第Ｉ相と同様にトラスツズマブ連結ＴＬＲアゴニスト誘導体を受ける。治療は、疾患の進行または許容できない毒性の不在下で４週間ごとに２～６コース繰り返される。２コースの研究療法を完了した後、完全または部分的な応答を達成した患者は、さらに４コースを受けることができる。６コースの研究治療を完了した後２ヶ月以上安定した疾患を維持する患者は、元の適格性基準を満たしていれば、疾患進行時にさらに６コースを受けることができる。
連続採血の血液は、トラスツズマブ連結ＴＬＲアゴニスト誘導体の投与の前後に、直接静脈穿刺によって採取される。血清濃度を決定するための静脈血試料（５ｍＬ）を、投与の約１０分前、及び投与後およそ以下の時間：１、８、及び１５日目に得る。各血清試料は、２つのアリコートに分割される。すべての血清試料は、－２０℃で保存される。血清試料は、ドライアイスで輸送される。
薬物動態：患者は、治療を開始する前、及び１、８、及び１５日目に、薬物動態評価のための血漿／血清試料収集を受ける。薬物動態パラメータは、最新バージョンのＢＩＯＡＶＬソフトウェアを使用して、Ｄｉｇｉｔａｌ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ＶＡＸ ８６００コンピュータシステム上でモデルに依存しない方法によって計算される。以下の薬物動態パラメータを決定する：ピーク血清濃度（Ｃｍａｘ）、ピーク血清濃度までの時間（ｔｍａｘ）、線形台形則を使用して計算された時間ゼロから最後の血液サンプリング時間までの濃度－時間曲線下面積（ＡＵＣ）（ＡＵＣ０－７２）、及び消失速度定数から計算された末端消失半減期（ｔ１／２）。消失速度定数は、対数線形濃度－時間プロットの末端線形領域における連続データ点の線形回帰により推定される。薬物動態パラメータの平均、標準偏差（ＳＤ）、及び変動係数（ＣＶ）は、各処理について計算される。パラメータ手段（保存製剤／非保存製剤）の比率を計算する。
併用療法に対する患者の応答：患者の応答は、Ｘ線、ＣＴスキャン、及びＭＲＩによる画像診断を介して評価され、画像診断は、研究の開始前及び最初のサイクルの終了時に実施され、追加の画像診断は４週間ごとにまたはその後のサイクルの終了時に実施される。画像診断様式は、がんの種類及び実現可能性／可用性に基づいて選択され、同じ画像診断様式は、類似のがんの種類ならびに各患者の研究コースを通して利用される。応答率は、ＲＥＣＩＳＴ基準を使用して決定される。（Ｔｈｅｒａｓｓｅ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．２０００ Ｆｅｂ ２；９２（３）：２０５－１６、ｈｔｔｐ：／／ｃｔｅｐ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｆｏｒｍｓ／ＴｈｅｒａｓｓｅＲＥＣＩＳＴＪＮＣＩ．ｐｄｆ）。患者はまた、フローサイトメトリー、ウェスタンブロッティング、及びＩＨＣによる前駆がん細胞表現型及びクローン性成長の変化を評価し、ＦＩＳＨによる細胞遺伝学の変化を評価するために、がん／腫瘍生検を受ける。研究治療の完了後、患者を４週間にわたって定期的に追跡する。
実施例１２：乳癌の治療
乳癌療法のためのトラスツズマブ連結ＴＬＲアゴニスト誘導体の安全性及び有効性のヒト臨床試験
目的：ＨＥＲ２過剰発現の転移性乳癌を有する女性における、トラスツズマブ連結ＴＬＲ－アゴニスト誘導体単独、疾患進行時に、続いてトラスツズマブとパクリタキセルとの組み合わせ対第１選択薬のトラスツズマブとパクリタキセルとの組み合わせの有効性及び毒性を比較する。
研究設計：この研究は、無作為化された多施設研究である。患者は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ過剰発現の程度（２＋対３＋）、以前のアントラサイクリン含有アジュバント治療（左胸壁への放射線療法なしの前治療なし対前治療と、左胸壁への放射線療法による前治療）、エストロゲン受容体状態（陽性対陰性対不明）、前療法（第１選択薬対第２／第３選択薬）、及び中央施設に応じて層別化される。患者は、２つの治療群のうちの１つに無作為に分けられる。群Ｉ：患者は、毎週３０～９０分にわたって、ＩＶでトラスツズマブ連結ＴＬＲアゴニスト誘導体を受ける。疾患の進行時に、患者は、群ＩＩと同様に、トラスツズマブ連結ＴＬＲ－アゴニスト誘導体ＩＶ及びパクリタキセルＩＶの組み合わせを受ける。群ＩＩ：患者は、毎週３０～９０分にわたって、ＩＶでトラスツズマブ連結ＴＬＲアゴニスト誘導体を受ける。パクリタキセルは、毎週１時間にわたって３週間ＩＶ投与され、その後１週間休薬する。
治療は、疾患の進行または許容できない毒性の不在下で、両群で継続する。生活の質は、ベースラインならびにコース２、３、４、５、６、８、１０、及び１２の１日目に評価される。患者は、１、３、及び６ヶ月で追跡され、その後６ヶ月ごとに追跡される。
実施例１３：膀胱癌の治療
目的：膀胱の筋肉侵襲性移行細胞癌のために経尿道膀胱切除術を以前に受けた患者における、本明細書に記載のＴＬＲアゴニスト誘導体の有無にかかわらず、パクリタキセル及び放射線療法の急性毒性を決定するため。
疾患の特徴：膀胱原発性の移行細胞癌（ＴＣＣ）が組織学的または細胞学的に確認されている；筋固有浸潤の組織学的証拠；以下のステージ基準のうちの１つを満たしている：ステージＴ２－４ａ；ＮＸ、Ｎ０、またはＮ１；ならびにＭ０疾患または臨床ステージＴ１、グレード３／３の疾患であり、かつ確定的な局所療法が必要である；次の基準を満たしている場合には、前立腺尿道の腫瘍病変が認められている：腫瘍が目に見えて完全に切除されている；前立腺の間質浸潤の証拠がなく、胸部Ｘ線またはＣＴスキャンならびに腹部／骨盤ＣＴスキャンによる遠隔転移の証拠がない；腫瘍マッピングによる双合診を含む過去３～８週間以内に経尿道膀胱切除術を受けた（可能な限り安全に判断された）；十分な腫瘍組織がＨＥＲ２／ｎｅｕ分析のために利用可能；根治的膀胱切除術の候補者ではない。
研究設計：この研究は、無作為化されていない多施設研究である。患者は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ状態（ＨＥＲ２／ｎｅｕ２＋または３＋染色［群１］対ＨＥＲ２／ｎｅｕ ０または１＋染色［群２］）に従って、２つの治療群のうちの１つに割り当てられる。
群１：患者は、１、８、１５、２２、２９、３６、及び４３日目に１時間にわたってＩＶでパクリタキセルを受け、１日目に９０分にわたって、次いで８、１５、２２、２９、３６、及び４３日目に３０分にわたってＩＶを介して、本明細書に記載のトラスツズマブ連結ＴＬＲアゴニスト誘導体を受ける。また、患者は、１～５、８～１２、１５～１９、２２～２６、２９～３３、３６～４０、４３～４７、及び５０日目に１日１回放射線療法を受ける。治療は、疾患の進行または許容できない毒性の不在下で継続する。
群２：患者はパクリタキセルを受け、群１と同様に放射線療法を受ける。研究治療終了後、患者は４～５週間、１年間は３ヶ月ごと、１年間は４ヶ月ごと、３年間は６ヶ月ごと、その後は毎年追跡される。
実施例１４：卵巣癌の治療
卵巣癌療法のための本明細書に記載のトラスツズマブ連結ＴＬＲアゴニスト誘導体の安全性及び有効性のヒト臨床試験
目的：ＨＥＲ２過剰発現卵巣癌を有する女性において、本明細書に記載のトラスツズマブ連結ＴＬＲアゴニスト誘導体を含む組成物の、１週間に１回、４週間のＩＶ投薬量の安全性及び有効性を評価する。
研究設計：この研究は、無作為化、非盲検、１１週間、多施設研究である。この試験は、１週間に１回、４回のＩＶ投薬量の安全性プロファイル、ＭＴＤ、ＰＫ、及びトラスツズマブ連結ＴＬＲアゴニスト誘導体の免疫原性を評価する。患者は１つの群に割り当てられる。患者は、１週間に１回、４週間、１用量のトラスツズマブ連結ＴＬＲアゴニスト誘導体を受ける。トラスツズマブ連結ＴＬＲアゴニスト誘導体は、研究の１、８、１５、及び２２日目にＩＶ注入により投与される。１及び２２日目に尿試料を採取する。
連続採血の血液は、トラスツズマブ連結ＴＬＲアゴニスト誘導体の投与の前後に、直接静脈穿刺によって採取される。血清濃度を決定するための静脈血試料（５ｍＬ）を、投与の約１０分前、及び投与後およそ以下の時間：１、２、４、５、８、１５、２２、３６、４３，及び５０日目に得る。各血清試料は、２つのアリコートに分割される。すべての血清試料は、－２０℃で保存される。血清試料は、ドライアイスで輸送される。
治療は、疾患の進行または許容できない毒性の不在下で継続する。生活の質は、ベースラインならびにコース２、３、４、５、６、８、１０、及び１２の１日目に評価される。２９、３６、４３、及び５０日目に患者を追跡する。有害事象について患者に尋ねる。患者は、腫瘍サイズ及び心機能を評価するための画像診断スキャン及びＥＣＧを受ける（４３日目）。研究の終了時に、患者は身体検査を受ける（５０日目）。疾患退行の証拠を有する患者は、疾患の進行の証拠が文書化されるまで継続的な療法を受けることができる。
本発明は、以下の番号付けされた実施形態によってさらに説明される。
１．組み込まれた１つ以上の非天然コード化アミノ酸を有する、１つ以上の腫瘍標的化ポリペプチドを含む、組成物であって、前記ポリペプチドが、前記腫瘍標的化ポリペプチドの非天然アミノ酸に共有結合されるリンカーを介して、ＴＬＲアゴニスト分子に連結されている、前記組成物。
２．前記腫瘍標的ポリペプチドが、ＨＥＲ２に結合する抗体である、実施形態１に記載の組成物。
３．前記腫瘍標的ポリペプチドが、トラスツズマブである、実施形態１に記載の組成物。
４．前記ＴＬＲアゴニストが、ＴＬＲ７またはＴＬＲ８アゴニストである、実施形態１、２、または３に記載の組成物。
５．前記ＴＬＲアゴニストが、図４のＴＬＲ７またはＴＬＲ８アゴニストである、実施形態１、２、または３に記載の組成物。
６．前記腫瘍標的化ポリペプチドが、１つ以上の水溶性ポリマーにコンジュゲートされる、実施形態１に記載の組成物。
７．前記水溶性ポリマーのうちの少なくとも１つが、前記非天然コード化アミノ酸のうちの少なくとも１つに連結されている、実施形態６に記載の組成物。
８．前記水溶性ポリマーがＰＥＧである、実施形態７に記載の組成物。
９．前記リンカーが、１０～５０の分子量を有するＰＥＧである、実施形態１に記載の組成物。
１０．前記組成物が、前記組成物の安定性または溶解性を増加させる１つ以上のアミノ酸置換、付加、または欠失を含む、実施形態１に記載の組成物。
１３．前記組成物が、組換え宿主細胞またはインビトロで合成された前記腫瘍標的化ポリペプチドの発現を増加させる、１つ以上のアミノ酸置換、付加、または欠失を含む、実施形態１に記載の組成物。
１４．前記非天然コード化アミノ酸が、前記ポリペプチド内の２０個の一般的なアミノ酸のいずれかに対してさもなければ非反応性である、リンカー、ポリマー、または生物学的活性分子に対して反応性である、実施形態１に記載の組成物。
１５．前記非天然コード化アミノ酸が、カルボニル基、アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、セミカルバジド基、アジド基、またはアルキン基を含む、実施形態１４に記載の組成物。
１６．前記非天然コード化アミノ酸が、カルボニル基を含む、実施形態１４に記載の組成物。
１７．前記腫瘍標的化ポリペプチドが、生物学的活性分子、細胞傷害性剤、水溶性ポリマー、または免疫刺激剤に連結されている、実施形態１に記載の組成物。
本発明での使用に好適なＴＬＲアゴニストの一般構造を示す。 種々のＴＣコンジュゲートの構造を示す。 さらなるＴＣコンジュゲートの構造を示す。 細胞増殖アッセイにおける選択されたＴＣコンジュゲートの生物学的活性を示す。 Ａ及びＢは、種々のＴＬＲ７アゴニストのＴＬＲ７活性を示す。 リンカーに結合された種々のＴＬＲ７アゴニストのＴＬＲ７活性を示す。 さらなるＴＬＲ７アゴニスト及びリンカーに結合されたＴＬＲ７アゴニストのＴＬＲ７活性を示す。 さらなるＴＬＲ７アゴニスト及びリンカーに結合されたＴＬＲ７アゴニストのＴＬＲ７活性を示す。 非天然アミノ酸であるｐＡＦ（ＤＬ－ｐＡＦ）と比較した、リンカーに結合された異なるＴＬＲ７アゴニスト（薬物リンカーまたはＤＬ）のＴＬＲ７活性を示す。 アミノ酸位置ＨＡ１１４に非天然アミノ酸を有する非コンジュゲート抗ＨＥＲ２抗体（Ａ）、ならびにＴＬＲアゴニストＡＸＣ－８７５（Ｂ）及びＡＸＣ－８８０（Ｃ）を有するアミノ酸位置ＨＡ１１４にコンジュゲートされた抗ＨＥＲ２抗体のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。 ＳＫＯＶ３ ＨＥＲ２高発現腫瘍細胞株（Ａ）、ＪＩＭＴ－１ ＨＥＲ２中／低発現腫瘍細胞株（Ｂ）、及びＡ４３１ ＨＥＲ２低発現腫瘍細胞株（Ｃ）における、抗ＨＥＲ２抗体にコンジュゲートされた種々のペイロードリンカーの腫瘍依存性ＩＳＡＣ活性を比較する。 ＳＫＢＲ３ ＨＥＲ２高発現腫瘍細胞株（Ａ）及びＨＣＣ１８０６ ＨＥＲ２超低発現腫瘍細胞株（Ｂ）における、抗ＨＥＲ２抗体にコンジュゲートされたさらなるペイロードリンカーの腫瘍依存性ＩＳＡＣ活性を比較する。 ＳＫＢＲ３ ＨＥＲ２高発現腫瘍細胞株（Ａ）及びＨＣＣ１８０６ ＨＥＲ２超低発現腫瘍細胞株（Ｂ）における、抗ＨＥＲ２抗体にコンジュゲートされたさらなるペイロードリンカーの腫瘍依存性ＩＳＡＣ活性を比較する。 ＳＫＢＲ３ ＨＥＲ２高発現腫瘍細胞株（Ａ）及びＨＣＣ１８０６ ＨＥＲ２超低発現腫瘍細胞株（Ｂ）における、抗ＨＥＲ２抗体にコンジュゲートされたさらなるペイロードリンカーの腫瘍依存性ＩＳＡＣ活性を比較する。 ＳＫＢＲ３ ＨＥＲ２高発現腫瘍細胞株（Ａ）及びＨＣＣ１８０６ ＨＥＲ２超低発現腫瘍細胞株（Ｂ）における、抗ＨＥＲ２抗体にコンジュゲートされた３つの（３）ペイロードリンカーの腫瘍依存性ＩＳＡＣ活性を比較し、ＨＥＲ２－ＡＸＣ－８７９が最良のＩＳＡＣ活性を有することを示す。

Claims (81)

  1. 組み込まれた１つ以上の非天然コード化アミノ酸を有する、１つ以上の標的化ポリペプチドを含む、組成物であって、前記ポリペプチドのうちの少なくとも１つが、前記標的化ポリペプチドの前記非天然アミノ酸に共有結合されるリンカーを介して、ＴＬＲアゴニスト分子に連結されている、前記組成物。
  2. 前記１つ以上の標的化ポリペプチドが、同じまたは異なる標的化ポリペプチドである、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記１つ以上の標的化ポリペプチドが、細胞表面標的または腫瘍細胞標的に結合する、請求項１に記載の組成物。
  4. 前記１つ以上の標的化ポリペプチドが、単一特異性、二重特異性、または多特異性標的化ポリペプチドである、請求項１に記載の組成物。
  5. 前記単一特異性、二重特異性、または多特異性標的化ポリペプチドが、薬物コンジュゲートまたはチェックポイント阻害剤を含む、請求項４に記載の組成物。
  6. 前記標的化ポリペプチドが、抗体または抗体断片を含む、請求項１に記載の組成物。
  7. 前記標的化ポリペプチドが、細胞の抗原に結合する抗体または抗体断片である、請求項６に記載の組成物。
  8. 前記標的化ポリペプチドが、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＥＧＦＲ、ＴＲＯＰ２、ＰＳＭＡ、ＶＥＧＦＲ、ＣＴＬＡ－４、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ｃ－ｍｅｔ、ＧＰＣ３、ＥＮＰＰ３、ＴＩＭ－１、ＦＯＬＲ１、ＳＴＥＡＰ１、メソセリン、５Ｔ４、ＣＥＡ、ＣＡ９、カドヘリン６、ＲＯＲ１、ＳＬＣ３４Ａ２、ＳＬＣ３９Ａ６、ＳＬＣ４４Ａ４、ＬＹ６Ｅ、ＤＬＬ３、ｅＰｈＡ２、ＧＰＮＭＢ、ＳＬＩＴＲＫ６、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ９６、ＣＤ９７、ＣＤ９９、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１７９、ＣＤ２２３、及びＣＤ２７６からなる群から選択される標的に結合する抗体または抗体断片である、請求項６に記載の組成物。
  9. 前記標的化ポリペプチドが、ＨＥＲ２に結合する抗体または抗体断片を含む、請求項８に記載の組成物。
  10. 前記標的化ポリペプチドが、トラスツズマブである、請求項９に記載の組成物。
  11. 前記抗体または抗体断片が、ＩｇＧ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、または一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を含む、請求項６に記載の組成物。
  12. 前記抗体または抗体断片が、１つ以上のＦａｂ、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、または一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）変異を含む、請求項６に記載の組成物。
  13. 前記抗体または抗体断片が、１つ以上のＦｃ変異を含む、請求項６に記載の組成物。
  14. 前記抗体または抗体断片が、１～６つのＦｃ変異を含む、請求項６に記載の組成物。
  15. 前記抗体または抗体断片が、前記重鎖、軽鎖、または前記重鎖及び軽鎖の両方に組み込まれた１つ以上の非天然コード化アミノ酸を含む、請求項６に記載の組成物。
  16. 前記抗体または抗体断片が、１つ以上のＦｃ変異をさらに含む、請求項６に記載の組成物。
  17. 前記標的化ポリペプチドのうちの１つ以上が、パラ－アセチルフェニルアラニン、ｐ－ニトロフェニルアラニン、ｐ－スルホチロシン、ｐ－カルボキシフェニルアラニン、ｏ－ニトロフェニルアラニン、ｍ－ニトロフェニルアラニン、ｐ－ボロニルフェニルアラニン、ｏ－ボロニルフェニルアラニン、ｍ－ボロニルフェニルアラニン、ｐ－アミノフェニルアラニン、ｏ－アミノフェニルアラニン、ｍ－アミノフェニルアラニン、ｏ－アシルフェニルアラニン、ｍ－アシルフェニルアラニン、ｐ－ＯＭｅフェニルアラニン、ｏ－ＯＭｅフェニルアラニン、ｍ－ＯＭｅフェニルアラニン、ｐ－スルホフェニルアラニン、ｏ－スルホフェニルアラニン、ｍ－スルホフェニルアラニン、５－ニトロＨｉｓ、３－ニトロＴｙｒ、２－ニトロＴｙｒ、ニトロ置換Ｌｅｕ、ニトロ置換Ｈｉｓ、ニトロ置換Ｄｅ、ニトロ置換Ｔｒｐ、２－ニトロＴｒｐ、４－ニトロＴｒｐ、５－ニトロＴｒｐ、６－ニトロＴｒｐ、７－ニトロＴｒｐ、３－アミノチロシン、２－アミノチロシン、Ｏ－スルホチロシン、２－スルホオキシフェニルアラニン、３－スルホオキシフェニルアラニン、ｏ－カルボキシフェニルアラニン、ｍ－カルボキシフェニルアラニン、ｐ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－プロパルギル－フェニルアラニン、Ｏ－メチル－Ｌ－チロシン、Ｌ－３－（２－ナフチル）アラニン、３－メチル－フェニルアラニン、Ｏ－４－アリル－Ｌ－チロシン、４－プロピル－Ｌ－チロシン、トリ－Ｏ－アセチル－ＧｌｃＮＡｃβ－セリン、Ｌ－ドパ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アジド－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アシル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ－ヨード－フェニルアラニン、ｐ－ブロモフェニルアラニン、ｐ－アミノ－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－プロパルギルオキシ－Ｌ－フェニルアラニン、４－アジド－Ｌ－フェニルアラニン、パラ－アジドエトキシフェニルアラニン、及びパラ－アジドメチル－フェニルアラニンの群から選択される１つ以上の非天然コード化アミノ酸を含む、請求項１に記載の組成物。
  18. 前記非天然アミノ酸が、パラ－アセチル－フェニルアラニン、４－アジド－Ｌ－フェニルアラニン、パラ－アジドエトキシフェニルアラニン、またはパラ－アジドメチル－フェニルアラニンからなる群から選択される、請求項１７に記載の組成物。
  19. 前記非天然コード化アミノ酸が、前記１つ以上の標的化ポリペプチドに部位特異的に組み込まれる、請求項１７に記載の組成物。
  20. 前記ＴＬＲアゴニストが、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、またはＴＬＲ７／ＴＬＲ８デュアルアゴニストである、請求項１に記載の組成物。
  21. 前記ＴＬＲアゴニストが、図１の構造１、２、３、４、または５のいずれか１つに記載の分子構造を含むＴＬＲアゴニストである、請求項１に記載の組成物。
  22. 前記ＴＬＲアゴニストが、表３、４、５、６、７に記載の構造の群から選択されるＴＬＲアゴニストのうちのいずれか１つである、請求項１に記載の組成物。
  23. 前記標的化ポリペプチドが、１つ以上のリンカー、ポリマー、または生物学的活性分子にコンジュゲートされる、請求項１に記載の組成物。
  24. 前記１つ以上のリンカーが、切断可能または切断不可能なリンカーである、請求項２３に記載の組成物。
  25. 前記１つ以上のリンカーが、０．０１ｋＤａ～５０ｋＤａである、請求項２３に記載の組成物。
  26. 前記１つ以上のリンカーが、０．０１ｋＤａ～１０ｋＤａである、請求項２５に記載の組成物。
  27. 前記１つ以上のリンカーまたはポリマーが、直鎖状、分枝状、多量体、またはデンドリマーである、請求項２３に記載の組成物。
  28. 前記１つ以上のリンカーまたはポリマーが、二官能性もしくは多官能性リンカーまたは二官能性もしくは多官能性ポリマーである、請求項２３に記載の組成物。
  29. 前記１つ以上のポリマーが、水溶性ポリマーである、請求項２３に記載の組成物。
  30. 少なくとも１つのリンカー、ポリマー、または生物学的活性分子が、少なくとも１つの非天然コード化アミノ酸に連結されている、請求項２３に記載の組成物。
  31. 前記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項２９に記載の組成物。
  32. 前記ＰＥＧが、０．１ｋＤａ～１００ｋＤａの分子量を有する、請求項３１に記載の組成物。
  33. 前記ＰＥＧが、０．１ｋＤａ～５０ｋＤａの分子量を有する、請求項３２に記載の組成物。
  34. 前記リンカーが、０．１ｋＤａ～５０ｋＤａの分子量を有するＰＥＧである、請求項２３に記載の組成物。
  35. 前記標的化ポリペプチドが、前記組成物の安定性または溶解性を増加させる１つ以上のアミノ酸置換、付加、または欠失を含む、請求項１に記載の組成物。
  36. 前記組成物が、組換え宿主細胞またはインビトロで合成された前記標的化ポリペプチドの発現を増加させる、１つ以上のアミノ酸置換、付加、または欠失を含む、請求項１に記載の組成物。
  37. 前記非天然コード化アミノ酸が、前記ポリペプチド内の２０個の一般的なアミノ酸のいずれかに対してさもなければ非反応性である、リンカー、ポリマー、または生物学的活性分子に対して反応性である、請求項１に記載の組成物。
  38. 前記非天然コード化アミノ酸が、カルボニル基、アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、セミカルバジド基、アジド基、またはアルキン基を含む、請求項３７に記載の組成物。
  39. 前記非天然コード化アミノ酸が、カルボニル基を含む、請求項３８に記載の組成物。
  40. 前記標的化ポリペプチドが、細胞傷害性剤または免疫刺激剤に連結されている、請求項１に記載の組成物。
  41. 図１のいずれかの構造に記載の構造を含むＴＬＲアゴニストにコンジュゲートされた抗ＨＥＲ２抗体または抗体断片を含む、ＴＬＲアゴニストコンジュゲート（ＴＣ）であって、前記ＴＬＲアゴニストが、前記抗体または抗体断片に組み込まれた１つ以上の非天然コード化アミノ酸に共有結合されたリンカーを介して、前記抗体または抗体断片にコンジュゲートされる、前記ＴＬＲアゴニストコンジュゲート。
  42. 前記ＴＬＲアゴニストが、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、またはＴＬＲ７／ＴＬＲ８デュアルアゴニストである、請求項４１に記載のＴＣ。
  43. 前記ＴＬＲアゴニストが、図１の構造１に記載の構造を含む、請求項４１に記載のＴＣ。
  44. 構造１に記載の構造を含む前記ＴＬＲアゴニストが、ＡＸＣ－６２１、ＡＸＣ－６２２、ＡＸＣ－６２５、ＡＸＣ－６２６、ＡＸＣ－６２７、ＡＸＣ－６３８、ＡＸＣ－６３９、ＡＸＣ－６４０、ＡＸＣ－６４２、ＡＸＣ－６６２、ＡＸＣ－６６５、ＡＸＣ－６６６、ＡＸＣ－６６７、ＡＸＣ－６６８、ＡＸＣ－６６９、ＡＸＣ－６７０、ＡＸＣ－６７１、ＡＸＣ－６７２、ＡＸＣ－６７５、ＡＸＣ－６７８、ＡＸＣ－６７９、ＡＸＣ－６８１、ＡＸＣ－６８７、ＡＸＣ－６８８、ＡＸＣ－６８９、ＡＸＣ－６９０、ＡＸＣ－６９１、ＡＸＣ－６９６、ＡＸＣ－６９７、ＡＸＣ－６９８、ＡＸＣ－６９９、ＡＸＣ－７００、ＡＸＣ－７０１、ＡＸＣ－７０２、ＡＸＣ－７０９、ＡＸＣ－７１０、ＡＸＣ－７１１、ＡＸＣ－７１２、ＡＸＣ－７１３、ＡＸＣ－７１４、ＡＸＣ－７１５、ＡＸＣ－７１６、ＡＸＣ－７１７、ＡＸＣ－７１８、ＡＸＣ－７１９、ＡＸＣ－７２２、ＡＸＣ－７２３、ＡＸＣ－７２４、ＡＸＣ－７２５、ＡＸＣ－７２６、ＡＸＣ－７２７、ＡＸＣ－７２９、ＡＸＣ－７３１、ＡＸＣ－７３２、ＡＸＣ－７３３、ＡＸＣ－７３４、ＡＸＣ－７３５、ＡＸＣ－７３６、ＡＸＣ－７３７、ＡＸＣ－７３８、ＡＸＣ－７３９、ＡＸＣ－７４０、ＡＸＣ－７４１、ＡＸＣ－７４３、ＡＸＣ－７４２、ＡＸＣ－７４７、ＡＸＣ－７４８、ＡＸＣ－７４９、ＡＸＣ－７５０、ＡＸＣ－７５１、ＡＸＣ－７５２、ＡＸＣ－７５４、ＡＸＣ－７５５、ＡＸＣ－７５６、ＡＸＣ－７５７、ＡＸＣ－７５８、ＡＸＣ－７５９、ＡＸＣ－７６０、ＡＸＣ－７６１、ＡＸＣ－７６２、ＡＸＣ－７６４、ＡＸＣ－７７１、ＡＸＣ－７７２、ＡＸＣ－７７３、ＡＸＣ－７７７、ＡＸＣ－７７８、ＡＸＣ－７７９、ＡＸＣ－７８９、ＡＸＣ－７９３、ＡＸＣ－７９９、ＡＸＣ－８００、ＡＸＣ－８０１、ＡＸＣ－８０２、ＡＸＣ－８０３、ＡＸＣ－８０４、ＡＸＣ－８０５、ＡＸＣ－８０６、ＡＸＣ－８０７、ＡＸＣ－８０８、ＡＸＣ－８０９、ＡＸＣ－８１０、ＡＸＣ－８３１、及びＡＸＣ－９１０化合物の群から選択される、請求項４３に記載のＴＣ。
  45. 前記抗ＨＥＲ２抗体または抗体断片が、前記重鎖、軽鎖、または前記重鎖及び軽鎖の両方に組み込まれた１つ以上の非天然コード化アミノ酸を含む、請求項４１に記載のＴＣ。
  46. 前記抗ＨＥＲ２抗体または抗体断片が、前記Ｆｃ領域に１つ以上の変異をさらに含む、請求項４５に記載のＴＣ。
  47. 前記１つ以上の非天然コード化アミノ酸が、パラ－アセチルフェニルアラニン、ｐ－ニトロフェニルアラニン、ｐ－スルホチロシン、ｐ－カルボキシフェニルアラニン、ｏ－ニトロフェニルアラニン、ｍ－ニトロフェニルアラニン、ｐ－ボロニルフェニルアラニン、ｏ－ボロニルフェニルアラニン、ｍ－ボロニルフェニルアラニン、ｐ－アミノフェニルアラニン、ｏ－アミノフェニルアラニン、ｍ－アミノフェニルアラニン、ｏ－アシルフェニルアラニン、ｍ－アシルフェニルアラニン、ｐ－ＯＭｅフェニルアラニン、ｏ－ＯＭｅフェニルアラニン、ｍ－ＯＭｅフェニルアラニン、ｐ－スルホフェニルアラニン、ｏ－スルホフェニルアラニン、ｍ－スルホフェニルアラニン、５－ニトロＨｉｓ、３－ニトロＴｙｒ、２－ニトロＴｙｒ、ニトロ置換Ｌｅｕ、ニトロ置換Ｈｉｓ、ニトロ置換Ｄｅ、ニトロ置換Ｔｒｐ、２－ニトロＴｒｐ、４－ニトロＴｒｐ、５－ニトロＴｒｐ、６－ニトロＴｒｐ、７－ニトロＴｒｐ、３－アミノチロシン、２－アミノチロシン、Ｏ－スルホチロシン、２－スルホオキシフェニルアラニン、３－スルホオキシフェニルアラニン、ｏ－カルボキシフェニルアラニン、ｍ－カルボキシフェニルアラニン、ｐ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－プロパルギル－フェニルアラニン、Ｏ－メチル－Ｌ－チロシン、Ｌ－３－（２－ナフチル）アラニン、３－メチル－フェニルアラニン、Ｏ－４－アリル－Ｌ－チロシン、４－プロピル－Ｌ－チロシン、トリ－Ｏ－アセチル－ＧｌｃＮＡｃβ－セリン、Ｌ－ドパ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アジド－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アシル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ－ヨード－フェニルアラニン、ｐ－ブロモフェニルアラニン、ｐ－アミノ－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－プロパルギルオキシ－Ｌ－フェニルアラニン、４－アジド－Ｌ－フェニルアラニン、パラ－アジドエトキシフェニルアラニン、及びパラ－アジドメチル－フェニルアラニンの群から選択される、請求項４１に記載のＴＣ。
  48. 前記非天然アミノ酸が、パラ－アセチル－フェニルアラニン、４－アジド－Ｌ－フェニルアラニン、パラ－アジドメチル－フェニルアラニン、またはパラ－アジドエトキシフェニルアラニンである、請求項４７に記載のＴＣ。
  49. 前記リンカーが、切断可能または切断不可能なリンカーである、請求項４１に記載のＴＣ。
  50. 前記リンカーが、二官能性リンカーである、請求項４９に記載のＴＣ。
  51. 前記ＴＬＲアゴニストが、図１の構造２に記載の構造を含む、請求項４１に記載のＴＣ。
  52. 構造２に記載の構造を含む前記ＴＬＲアゴニストが、ＡＸＣ－７４５、ＡＸＣ－７４６、及びＡＸＣ－７５３化合物の群から選択される、請求項５１に記載のＴＣ。
  53. 前記ＴＬＲアゴニストが、図１の構造３に記載の構造を含む、請求項４１に記載のＴＣ。
  54. 構造３に記載の構造を含む前記ＴＬＲアゴニストが、ＡＸＣ－８３７またはＡＸＣ－８４７化合物である、請求項５３に記載のＴＣ。
  55. 前記ＴＬＲアゴニストが、図１の構造４に記載の構造を含む、請求項４１に記載のＴＣ。
  56. 構造４に記載の構造を含む前記ＴＬＲアゴニストが、ＡＸＣ－８４４、ＡＸＣ－８４２、ＡＸＣ－８４３、ＡＸＣ－８４５、ＡＸＣ－８４６、ＡＸＣ－８３６、またはＡＸＣ－８４１化合物の群から選択される、請求項５５に記載のＴＣ。
  57. 前記ＴＬＲアゴニストが、図１の構造５に記載の構造を含む、請求項４１に記載のＴＣ。
  58. 構造５に記載の構造を含む前記ＴＬＲアゴニストが、ＡＸＣ－８６２、ＡＸＣ－８６３、ＡＸＣ－８６７、ＡＸＣ－８６８、ＡＸＣ－８６９、ＡＸＣ－８７２、ＡＸＣ－８７３、ＡＸＣ－８７６、ＡＸＣ－８７７、ＡＸＣ－８７８、ＡＸＣ－８７９、ＡＸＣ－８８０、ＡＸＣ－８８１、ＡＸＣ－８８２、ＡＸＣ－８８３、ＡＸＣ－８８４、ＡＸＣ－８８５、ＡＸＣ－８８６、ＡＸＣ－８８７、ＡＸＣ－８８８、ＡＸＣ－８８９、ＡＸＣ－８９０、ＡＸＣ－８９１、ＡＸＣ－８９２、ＡＸＣ－８９３、ＡＸＣ－８９５、ＡＸＣ－８９６、ＡＸＣ－８９７、ＡＸＣ－８９８、ＡＸＣ－９０１、ＡＸＣ－９０３、ＡＸＣ－９０４、ＡＸＣ－９０５、ＡＸＣ－９０６、ＡＸＣ－９０７、ＡＸＣ－９０８、ＡＸＣ－９０９、ＡＸＣ－９１１、ＡＸＣ－９１２、ＡＸＣ－９１３、ＡＸＣ－９１４、ＡＸＣ－９１５、またはＡＸＣ－９１６化合物の群から選択される、請求項５７に記載のＴＣ。
  59. 前記抗ＨＥＲ２抗体または抗体断片が、配列番号１～１３のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、請求項４１～５８のいずれかに記載のＴＣ。
  60. 前記抗ＨＥＲ２抗体または抗体断片が、配列番号１～１３のうちの少なくとも２つのアミノ酸配列を含む、請求項４１～５９のいずれかに記載のＴＣ。
  61. 前記抗ＨＥＲ２抗体または抗体断片が、ａ）配列番号１または２、ならびにｂ）配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３のうちのいずれか１つを含む、請求項４１～６０のいずれかに記載のＴＣ。
  62. 化学療法剤または免疫療法剤をさらに含む、請求項４１に記載のＴＣ。
  63. 抗体薬物コンジュゲートをさらに含む、請求項４１に記載のＴＣ。
  64. がんまたは疾患もしくは状態を有する対象または患者を治療する方法であって、前記対象または患者に、治療有効量の、先行請求項のいずれかに記載の組成物またはＴＣを投与することを含む、前記方法。
  65. 化学療法剤または免疫療法剤をさらに含む、請求項６４に記載の方法。
  66. 抗体薬物コンジュゲート、細胞傷害性剤、またはチェックポイント阻害剤をさらに含む、請求項６４に記載の方法。
  67. 治療有効量の、先行請求項のいずれかに記載の組成物またはＴＣと、医薬的に許容される担体または賦形剤と、を含む、医薬組成物。
  68. 薬剤の製造における、請求項１～３９のいずれか一項に記載の組成物の使用。
  69. 構造１に記載の構造を含む前記ＴＬＲアゴニストが、ＡＸＣ－６２５、ＡＸＣ－６２６、ＡＸＣ－６３８、ＡＸＣ－６３９、ＡＸＣ－６４０、ＡＸＣ－６４２、ＡＸＣ－６６２、ＡＸＣ－６６７、ＡＸＣ－６６８、ＡＸＣ－６６９、ＡＸＣ－６７０、ＡＸＣ－６７１、ＡＸＣ－６７２、ＡＸＣ－６７５、ＡＸＣ－６８１、ＡＸＣ－６８７、ＡＸＣ－６８８、ＡＸＣ－６８９、ＡＸＣ－６９０、ＡＸＣ－６９１、ＡＸＣ－６９７、ＡＸＣ－６９９、ＡＸＣ－７００、ＡＸＣ－７０１、ＡＸＣ－７０２、ＡＸＣ－７０９、ＡＸＣ－７１０、ＡＸＣ－７１１、ＡＸＣ－７１３、ＡＸＣ－７１４、ＡＸＣ－７１７、ＡＸＣ－７１９、ＡＸＣ－７２２、ＡＸＣ－７２３、ＡＸＣ－７２４、ＡＸＣ－７２５、ＡＸＣ－７２６、ＡＸＣ－７２７、ＡＸＣ－７３１、ＡＸＣ－７３２、ＡＸＣ－７３３、ＡＸＣ－７３４、ＡＸＣ－７３５、ＡＸＣ－７３６、ＡＸＣ－７３７、ＡＸＣ－７３８、ＡＸＣ－７３９、ＡＸＣ－７４０、ＡＸＣ－７４１、ＡＸＣ－７４３、ＡＸＣ－７４２、ＡＸＣ－７４７、ＡＸＣ－７４８、ＡＸＣ－７５０、ＡＸＣ－７５１、ＡＸＣ－７５２、ＡＸＣ－７５４、ＡＸＣ－７５５、ＡＸＣ－７５６、ＡＸＣ－７５７、ＡＸＣ－７５８、ＡＸＣ－７５９、ＡＸＣ－７６０、ＡＸＣ－７６１、ＡＸＣ－７６２、ＡＸＣ－７６４、ＡＸＣ－７７１、ＡＸＣ－７７２、ＡＸＣ－７７３、ＡＸＣ－７７７、ＡＸＣ－７７８、ＡＸＣ－７７９、ＡＸＣ－７８９、ＡＸＣ－７９３、ＡＸＣ－８００、ＡＸＣ－８０１、ＡＸＣ－８０２、ＡＸＣ－８０３、ＡＸＣ－８０４、ＡＸＣ－８０５、ＡＸＣ－８０６、ＡＸＣ－８０７、ＡＸＣ－８０８、ＡＸＣ－８０９、ＡＸＣ－８１０、ＡＸＣ－８３１、及びＡＸＣ－９１０化合物の群から選択される、請求項４４に記載のＴＣ。
  70. 構造１に記載の構造を含む前記ＴＬＲアゴニストが、ＡＸＣ－８０１、ＡＸＣ－８０２、ＡＸＣ－８３１、及びＡＸＣ－９１０化合物の群から選択される、請求項４４に記載のＴＣ。
  71. 前記ＴＬＲアゴニストが、ＡＸＣ－８４７化合物の構造を含む、請求項５４に記載のＴＣ。
  72. 構造５に記載の構造を含む前記ＴＬＲアゴニストが、ＡＸＣ－８６２、ＡＸＣ－８６３、ＡＸＣ－８６７、ＡＸＣ－８６８、ＡＸＣ－８６９、ＡＸＣ－８７３、ＡＸＣ－８７６、ＡＸＣ－８７９、ＡＸＣ－８８０、ＡＸＣ－８８２、ＡＸＣ－８８９、ＡＸＣ－８９３、ＡＸＣ－８９６、ＡＸＣ－８９７、ＡＸＣ－９０１、ＡＸＣ－９０７、ＡＸＣ－９０９、ＡＸＣ－９１３、及びＡＸＣ－９１４化合物の群から選択される、請求項５８に記載のＴＣ。
  73. リンカーをさらに含む、請求項４３もしくは４４、５１～５８、または６９～７２のいずれか一項に記載のＴＣ。
  74. 請求項４１～６３のいずれか一項に記載の免疫刺激抗体コンジュゲート（ＩＳＡＣ）。
  75. 前記ＴＬＲアゴニストが、ＡＸＣ－８６２、ＡＸＣ－８６３、ＡＸＣ－８６７、ＡＸＣ－８６８、ＡＸＣ－８６９、ＡＸＣ－８７４、ＡＸＣ－８７５、ＡＸＣ－８７６、ＡＸＣ－８７９、ＡＸＣ－８８０、ＡＸＣ－８８２、ＡＸＣ－８９３、ＡＸＣ－８９６、ＡＸＣ－８９７、ＡＸＣ－９０１、ＡＸＣ－９０７、及びＡＸＣ－９１０化合物の群から選択される化合物を含む、請求項７４に記載のＩＳＡＣ。
  76. 図１に記載の構造を有する化合物のうちのいずれか１つの塩。
  77. 表３、４、５、６、７の化合物のうちのいずれか１つの塩。
  78. 細胞を請求項４１に記載のＴＣと接触させることを含む、細胞を死滅させる方法。
  79. 前記細胞が、腫瘍またはがん細胞である、請求項７８に記載の方法。
  80. 請求項４１に記載の医薬組成物またはその塩。
  81. 医薬的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項８０に記載の医薬組成物または塩。
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