DE68913520T2 - Konjugation der polymere an kolonien stimulierenden faktor. - Google Patents

Konjugation der polymere an kolonien stimulierenden faktor.

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Description

  • Diese Erfindung betrifft eine chemische Modifikation des biologisch aktiven, Kolonie stimulierenden Faktors-1 (CSF-1), die die chemischen und/oder physiologischen Eigenschaften dieses Proteins verändert. Diese Erfindung betrifft insbesondere die selektive Konjugation von CSF-1 an Polymere, um die Halbwertszeit des zirkulierenden Proteins in Säugern zu erhöhen.
  • Der Kolonie stimulierende Faktor-1 (CSF-1) (auch als M-CSF bezeichnet) ist einer von mehreren Proteinen, die die Koloniebildung von in halbfestem Kulturmedium plattierten Knochenmarkszellen stimulieren können. CSF-1 unterscheidet sich von anderen Kolonie stimulierenden Faktoren durch seine Fähigkeit, bevorzugt die Bildung von Makrophagen-Kolonien zu stimulieren. Andere CSFs stimulieren die Bildung von Kolonien, die aus neutrophilen Granulocyten und Makrophagen, ausschließlich aus neutrophilen Granulocyten, oder aus neutrophilen und eosinophilen Granulocyten und Makrophagen bestehen. Ein Übersichtsartikel über diese CSFs wurde von Dexter, T. M., Nature 309 (1984), 746, und Vadas, M. A., J. Immunol. 130 (1983), 793, veröffentlicht. Bisher ist kein für CSF-1-Aktivität spezifischer In vivo-Standardtest bekannt.
  • CSF-1 ist aus nativen Quellen (vgl. beispielsweise Csejtey et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 138 (1986), 238, und die PCT-Veröffentlichung Nr. WO 86/04587 vom 14. August 1986 hinsichtlich der Immunaffinitäts-Chromatographie von nativem CSF-1 zur Bestimmung partieller Aminosäuresequenzen) isoliert worden. CSF-1 ist auch aus rekombinanter DNA unter Verwendung von zwei anscheinend verwandten cDNA-Clonen hergestellt worden: (1) einer "kurzen" Form, die ein monomeres Protein von 224 Aminosäuren codiert, vor denen sich eine Signalsequenz von 32 Aminosäuren befindet (Kawasaki et al., Science 230 (1985), 292-296) und (2) einer "langen" Form, die ein monomeres Protein von 522 Aminosäuren codiert, vor denen sich ebenfalls die Signalsequenz von 32 Aminosäuren befindet. Die lange Form ist von zwei Gruppen cloniert und exprimiert worden, wie in der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 0 272 779, veröffentlicht am 29. Juni 1988, und von Ladner et al., EMBO J. 6 (1987), 2693, beschrieben ist, wobei beide durch Bezugnahme hier eingeschlossen sind, und von Wong et al., Science 235 (1987), 1504-1509, und in PCT WO 87/06954, veröffentlicht am 19. November 1987). (Die DNA- und Aminosäuresequenzen dieser beiden Clone sind in den Figuren 1 bzw. 2 dargestellt). Sowohl die lange als auch die kurze Form von CSF-1 sind von Clark und Kamen, Science 236 (1987), 1229-1237, beschrieben worden. Außerdem ist kürzlich eine "Übergangsform" beschrieben worden, die ein monomeres Protein von 406 Aminosäuren codiert, vor denen sich eine Signalsequenz von 32 Aminosäuren befindet (Cerretti et al., Mol. Immunol. 25 (1988), 761-770).
  • Die langen und kurzen Formen der CSF-1 codierenden DNA stammen anscheinend von einer variablen Spleißverbindung im stromaufwärts liegenden Bereich von Exon 6 der genomischen, CSF-1 codierenden DNA. Wenn CSF-1 in bestimmten eukaryotischen Zellen entweder von den langen oder kurzen cDNA-Formen exprimiert wird, wird es als ein dimeres Glycoprotein sezerniert und anscheinend am C-Terminus unterschiedlich prozessiert und/oder unterschiedlich glycosyliert. Dementsprechend werden bei der Durchführung einer Western-Analyse mit der reduzierten monomeren Form CSF-1 Proteine mit unterschiedlichen Molekulargewichten festgestellt.
  • Die Aminosäuresequenzen der langen und kurzen Formen, die aus der DNA-Sequenz der isolierten Clone und ihrem Bezug zur genomischen Sequenz abgeleitet worden sind, stimmen nach der Abspaltung des Signalpeptids am N-Terminus in den ersten 149 Aminosäuren überein und unterscheiden sich danach im Hinblick auf die Insertion eines zusätzlichen 894 bp- Fragments (das weitere 298 Aminosäuren codiert), die vor dem die Aminosäure 150 codierenden Codon im längeren Clon liegt. Daher codieren sowohl die kürzeren als auch die längeren Formen des Gens Bereiche mit einer identischen Sequenz sowohl am C-Terminus als auch am N-Terminus. Biologisch aktives Protein wurde erhalten, wenn zur Expression in eukaryotischen Zellen verkürzte cDNAs, die nur die ersten 145 oder 147 Aminosäuren der reifen kurzen Form (europäische Patentveröffentlichung Nr. 0 261 592 vom 30. März 1988; Cerretti et al., a. a. O.), oder die ersten 190 oder 221 Aminosäuren der reifen längeren Form codieren, verwendet wurden.
  • Der rekombinante CSF-1 wurde in E. coli durch Modifizierung eines kurzen cDNA-Clons exprimiert, der, wie ursprünglich von Kawasaki et al., Science 230 (1985), 291, beschrieben, Proteine codiert, die 1) den nativen N-Terminus und einen C-Terminus bei der Aminosäure 150 des reifen Proteins und 2) eine Verkürzung durch Entfernen der ersten beiden Aminosäuren am N-Terminus und einen C-Terminus bei der Aminosäure 150 des reifen Proteins enthielten. Diese Proteine wurden gereinigt und erneut gefalten, um Homodimere zu bilden, und es wurde festgestellt, daß sie in der Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) unter Größenausschluß relative Molekulargewichte von etwa 43 000 bzw. 40 000 Dalton aufwiesen. Es sind außerdem CSF-1- Proteine hergestellt worden, die so modifiziert wurden, daß der C-Terminus des exprimierten Proteins die Aminosäure 150 oder 158 und der N-Terminus eine Verkürzung um bis zu drei Aminosäuren aufwies.
  • Kleine Proteine (weniger als etwa 70 kd) weisen im Blut nach einer intravenösen Injektion häufig eine relativ kurze Halbwertszeit auf. Arzneimittel, die schnell aus dem Kreislauf verschwinden, zeigen häufig eine geringere Wirksamkeit. Es ist häufig wünschenswert, die Halbwertszeit eines zirkulierenden Polypeptids zu erhöhen, so daß unter Beibehaltung der gewünschten therapeutischen Wirkung kleinere Mengen des Polypeptids verabreicht werden können oder sich die Zahl der Injektionen verringert. Es wären Modifizierungen des CSF-1-Proteins wünschenswert, die die Halbwertszeit in vivo verändern, seine Immunogenität verringern oder die bei der In vivo-Verabreichung auftretende Zusammenlagerung des Proteins verringern oder beseitigen. Dazu gehören die Modifizierungen von Proteinen mit im wesentlichen linearen Kettenpolymeren, beispielsweise Polyethylenglycol (PEG), Polypropylenglycol (PPG), Dextran oder Polyvinylalkohol.
  • Beispielsweise offenbart das US-Patent Nr. 4,261,973 die Konjugation von immunogenen Allergen-Molekülen mit nicht-immunogenen wasserlöslichen Polymeren, beispielsweise PEG oder Polyvinylalkohol, wobei sich die Immunogenität des Allergens verringert. US-Patent Nr. 4,301,144 offenbart die Konjugation von Hämoglobin an PEG, PPG, ein Copolymer von Ethylenglycol mit Propylenglycol, oder Ether, Ester oder dehydratisierte Produkte solcher Polymere, wobei sich die Fähigkeit des Hämoglobinmoleküls zum Sauerstofftransport verbessert. US-Patent Nr. 4,609,546 offenbart, daß eine Konjugation eines Polypeptids oder Glycoproteins, beispielsweise eines Kolonie stimulierenden Faktors, an ein Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Copolymer die Dauer seiner physiologischen Aktivität erhöhen kann. Die einzigen dahingehend getesteten Proteine sind Enzyme oder natives Interferon, die leicht wasserlöslich sind. PCT WO 86/04145, veröffentlicht am 17. Juli 1986, offenbart die PEG- Modifizierung von Antikörpern, wobei sich die Bindung an Fc- Rezeptoren verringert. US-Patent Nr. 4,179,337 offenbart die Konjugation von wasserlöslichen Polypeptiden, beispielsweise von Enzymen und Insulin, an PEG oder PPG, wobei sich die Immunogenität der Polypeptide unter Erhalt eines wesentlichen Teils ihrer gewünschten physiologischen Aktivitäten verringert. EP 154 316, veröffentlicht am 11. September 1985, von Takeda Chemical Industries, Ltd., offenbart und beansprucht chemisch modifizierte Lymphokine, beispielsweise IL-2, die PEG enthalten, das direkt an mindestens eine primäre Aminogruppe des Lymphokins gebunden ist. Ferner beschreiben Katre et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 1487, die Modifikation von IL-2 mit PEG.
  • Viele andere Referenzen beschreiben das Konzept der Bildung von Protein-Derivaten mit PEG, beispielsweise alpha- 1-Proteinase-Inhibitor, Asparaginase, Uricase, Superoxid- Dismutase, Streptokinase, Plasminogen-Aktivator, IgG, Albumin, Lipoprotein-Lipase, Meerrettich-Peroxidase, Katalase, Arginase und Asparaginase, sowie Peptide. Es wurde gezeigt, daß die Bildung eines solchen Derivats über Lysine die Halbwertszeit erhöht, die Immunogenität verringert, die Löslichkeit und generell die Wirksamkeit erhöht (wodurch die Möglichkeit besteht, die Dosis seltener zu verabreichen). Bei den meisten Proteinen waren vielfältige Modifizierungen pro Molekül erforderlich, um in vivo eine bessere Leistung zu erreichen und in vitro war durch eine solche Modifizierung die Aktivität wesentlich erniedrigt.
  • Eine Modifizierung von IL-2, IFN-β und Immunotoxinen mit PEG über Cysteinreste eines Polypeptid wird in PCT WO 87/00056, veröffentlicht am 15. Januar 1987, offenbart.
  • Neben diesen Patenten und Patentveröffentlichungen werden in mehreren Artikeln das Konzept der Verwendung von aktiviertem PEG oder PPG als modifizierender Wirkstoff für Proteine, beispielsweise Enzyme, IgG und Albumin, erörtert. Inada et al., Biochem. and Biophys. Res. Comm. 122 (1984), 845-850, beschreiben beispielsweise die Modifizierung der wasserlöslichen Lipoprotein-Lipase, wodurch diese zur Konjugation mit PEG unter Verwendung von Cyanurchlorid in organischen Lösungsmitteln, beispielsweise Benzol, löslich wird. Takahashi et al., Biochem. and Biophys. Res. Comm. 121 (1984), 261-265, beschreiben die Modifizierung der Meerrettich-Peroxidase unter Verwendung von Cyanurchloridtriazin mit PEG, wodurch das wasserlösliche Enzym aktiv und in Benzol löslich wird.
  • Zu den Patenten und Patentveröffentlichungen, die die Verwendung von Polyvinylalkohol (PVA) in Protein- Konjugations-reaktionen offenbaren, gehören die US-Patente mit den Nrn. 4,296,097 und 4,430,260, die sich auf die Konjugation von Benzylpenicillin und PVA beziehen, US-Patent Nr. 4,496,689 (EP 147 761), die sich auf die Konjugation des alpha-1-Proteinase-Inhibitors mit einem Polymer bezieht, beispielsweise Heparin, PVA oder PEG, die am 22. Mai 1985 veröffentlichte EP 142 125, die die nicht-kovalente Bindung von Hämoglobin an PVA als Träger offenbart, DE 2 312 615 ("Exploaterings" AB TBF), die sich auf vernetztes, wasserunlösliches, an ein Protein gekuppeltes PVA bezieht, und die am 23. Mai 1985 veröffentlichte DE 3 340 592, die sich auf Konjugate von PVA mit menschlichem Hämoglobin A bezieht.
  • Zu den Artikeln, die sich auf Konjugate von Proteinen und PVA beziehen, gehören Sabet et al., Indian J. Chem., Sec. A (1984) 23A(5) (Beschreibung der Wechselwirkung von PVA und Protein), Wei et al., Immunol. 51(4) (1984), 687-696 (Beschreibung von Trimellit, das mit PVA konjugiert ist), Lee et al., J. Immunol. 126 (1981), 414-418, und Hubbard et al., J. Immunol. 126 (1981), 407-413 (beide beschreiben DNP, das mit PVA konjugiert ist), Lee et al., Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 63 (1980), 1-13 (Beschreibung von Antibenzylpenicilloyl IgE, das mit PVA konjugiert ist), Sehon, Prog. Allergy 32 (1982), 161-202 (Beschreibung eines Allergens und Haptens, das über PVA konjugiert ist), Holford-Strevens et al., Int. Arch. Allergy App. Immunol. 67 (1982), 109-116 (Beschreibung der Konjugation von PVA und eines Antigens/Haptens) und Sehon und Lee, Int. Arch. Allergy App. Immunol. 66 (Ergänzung 1) (1981), 39-42 (Beschreibung eines Haptens/Allergens, das mit PVA konjugiert ist).
  • PCT-Veröffentlichungen mit den Nrn. WO 86/04607 und WO 87/03204 und Ralph et al., Immunobiol. 172 (1986), 194, beschreiben mehrere mögliche Verwendungen von CSF-1, einschließlich einer Verwendung als ein Wirkstoff gegen Infektionen, gegen Tumore oder zur Wundheilung.
  • Keine dieser Referenzen erläutert jedoch detailliert, wie CSF-1 mit einem Polymer, beispielsweise mit PEG oder Polyvinylalkohol, unter Beibehaltung seiner biologischen Aktivität modifiziert werden kann, wobei außerdem seine Halbwertszeit während der Zirkulation oder Wirksamkeit erhöht wird. Ferner ist es üblicherweise nicht möglich, das Ausmaß der Proteinmodifizierung oder die Natur der Reaktionsbedingungen, die gewünscht werden, vorherzusagen, da einige Proteine empfindlicher gegen Inaktivierung durch Konjugation als andere sind.
  • Dementsprechend liefert die vorliegende Erfindung zur Erhöhung der Halbwertszeit in vivo eine Modifizierung des Kolonie stimulierenden Faktors-1, dessen nützliche biologische Aktivität gleichzeitig erhalten bleibt. Der modifizierte CSF-1 kann zur Stimulierung von Zellen in vivo in einer stark verringerten und/oder selteneren Dosierung als der unmodifizierte CSF-1 verwendet werden.
  • Als sekundären Vorteil kann die Modifizierung die Immunogenität des CSF-1 (besonders bei seiner Verwendung für heterologe Arten, beispielsweise bei der Verwendung von menschlichem CSF-1 für Vieh) und/oder die eventuell auftretende Zusammenlagerung des Proteins verringern.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein biologisch aktives Protein, das in vivo eine verlängerte Halbwertszeit in Säugern aufweist, wobei das Protein bevorzugt die Bildung von Makrophagen-Kolonien im In vitro- Test mit dem Kolonie stimulierenden Faktor-1 stimuliert und an ein wasserlösliches Polymer kovalent konjugiert ist, das aus einem Polyethylenglycol- oder Polypropylenglycol-Homopolymer, polyoxyethylierten Polyol und Polyvinylalkohol ausgewählt ist, wobei das Homopolymer unsubstituiert oder an einem Ende mit einem Alkylrest substituiert ist. Das CSF-1- Protein kann mit dem Polymer konjugiert werden über: (1) freie Aminogruppen, die Lysinreste und die N-terminale Aminosäure (vorzugsweise 1 bis 3 Stellen) einschließen, (2) (eine) Kohlenhydrateinheit(en) von eukaryotisch exprimiertem, glycosyliertem CSF-1 oder (3) freie Sulfhydrylgruppen, die in den CSF-1 eingebaut worden sind.
  • Das Polymer ist vorzugsweise unsubstituiertes Polyethylenglycol (PEG), Monomethyl-PEG (mPEG) oder polyoxyethyliertes Glycerin (POG), das an (1) den (die) Lysinrest(e) des CSF-1 über eine Amid- oder Urethanbindung gekuppelt ist, die von einem aktiven Ester (vorzugsweise dem N-Hydroxysuccinimid- oder Paranitrophenylester) von PEG-, mPEG- oder POG-Carbon- oder Kohlensäure gebildet wird, (2) Kohlenhydrat-Einheit(en) des CSF-1 über eine Amin-, Hydrazin- oder Hydrazid-Bindung oder (3) Cysteinrest(e) des CSF-1 über eine Maleimido- oder Haloacetyl- (wobei Halo Br, Cl oder I ist)-Gruppe.
  • Weitere erfindungsgemäße Gesichtspunkte betreffen die nachstehend beschriebenen konjugierten Proteine:
  • (1) wobei das Protein ein rekombinanter menschlicher CSF-1 ist, wobei das Protein wahlweise in Bakterien rekombinant exprimiert wird und ein Homodimer mit einer abgeleiteten Aminosäuresequenz ist, die aus LCSF/C 150 bis C 464, Tyr&sub5;&sub9;LCSF/C 150 bis C 464, SCSF/C 150 bis C 166, Asp&sub5;&sub9;SCSF/C 150 bis C 166 und den Gln&sub5;&sub2;-Muteinen und deren N 2 und N 3-Muteinen ausgewählt ist, wobei LCSF von der Sequenz codiert wird, die den in Figur 2 dargestellten Aminosäuren 1 bis 522 entspricht, und SCSF von der Sequenz, die den in Figur 1 dargestellten Aminosäuren 1 bis 224 entspricht.
  • (2) wobei das Protein eines der nachstehend beschriebenen ist:
  • (a) Homodimere mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz, die aus LCSF/C 150, Tyr&sub5;&sub9;LCSF/C 150, LCSF/C 190, Tyr&sub5;&sub9;LCSF/C 190, LCSF/C 191, Tyr&sub5;&sub9;LCSF/C 191, LCSF/C 221, Tyr&sub5;&sub9;LCSF/C 221, LCSF/C 223, Tyr&sub5;&sub9;LCSF/C 223, LCSF/C 236, Tyr&sub5;&sub9;LCSF/C 236, LCSF/C 238, Tyr&sub5;&sub9;LCSF/C 238, LCSF/C 249, Tyr&sub5;&sub9;LCSF/C 249, LCSF/C 258, Tyr&sub5;&sub9;LCSF/C 258, LCSF/C 411, Tyr&sub5;&sub9;LCSF/C 411, LCSF/C 464, Tyr&sub5;&sub9;LCSF/C 464, SCSF/C 150, SCSF/C 153, SCSF/C 158, den entsprechenden Asp&sub5;&sub9;SCSFs und den Gln&sub5;&sub2;-Muteinen und deren N 2 und N 3-Muteinen ausgewählt ist,
  • (b) Homodimere, die von einer Sequenz codiert sind, die aus LCSF/C 150, LCSF/C 190, LCSF/C 221, Tyr&sub5;&sub9;LCSF/C 150, Tyr&sub5;&sub9;LCSF/C 190, Tyr&sub5;&sub9;LCSF/C 221, SCSF/C 158, SCSF/C 150, Asp&sub5;&sub9;SCSF/C 158, Asp&sub5;&sub9;SCSF/C 150 und deren N 2- und N 3- Muteinen ausgewählt ist,
  • (c) Homodimere, die von einer Sequenz codiert sind, die aus SCSF/C 150, Asp&sub5;&sub9;SCSF/C 150, SCSF/N 3C 150, Asp&sub5;&sub9;SCSF/N 3C 150, SCSF/N 3C 158, Asp&sub5;&sub9;SCSF/N 3C 158, Asp&sub5;&sub9;SCSF/N 2C 150 und Asp&sub5;&sub9;SCSF/N 2C 158 ausgewählt ist.
  • (3) wobei das Protein ein menschlicher CSF-1 ist, der in einem eukaryotischen Wirt exprimiert und von ihm sezerniert wird, wahlweise ein Dimer ist, und von einer Sequenz codiert ist, die aus LCSF/C 150, Tyr&sub5;&sub9;LCSF/C 150, LCSF/C 190, Tyr&sub5;&sub9;LCSF/C 190, LCSF/C 191, Tyr&sub5;&sub9;LCSF/C 191, LCSF/C 221, Tyr&sub5;&sub9;LCSF/C 221, LCSF/C 223, Tyr&sub5;&sub9;LCSF/C 223, LCSF/C 236, Tyr&sub5;&sub9;LCSF/C 236, LCSF/C 238, Tyr&sub5;&sub9;LCSF/C 238, LCSF/C 249, Tyr&sub5;&sub9;LCSF/C 249, LCSF/C 258, Tyr&sub5;&sub9;LCSF/C 258, LCSF/C 411, Tyr&sub5;&sub9;LCSF/C 411, LCSF/C 464, Tyr&sub5;&sub9;LCSF/C 464, SCSF/C 150, SCSF/C 153, SCSF/C 158, den entsprechenden Asp&sub5;&sub9;SCSFs und deren Gln&sub5;&sub2;-Muteinen ausgewählt ist.
  • Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft ein Verfahren zur Herstellung des vorstehend beschriebenen konjugierten Proteins, das umfaßt:
  • (a) Bereitstellung eines wasserlöslichen Polymers, das mindestens eine reaktive terminale Gruppe aufweist, wobei das Polymer aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Polyethylenglycol- oder Polypropylenglycol-Homopolymeren, polyoxyethylierten Polyolen und Polyvinylalkohol besteht, wobei das Homopolymer unsubstituiert oder an einem Ende mit einem Alkylrest substituiert ist.
  • (b) Umsetzung des Proteins mit der reaktiven Gruppe des Polymers, wobei das Protein biologisch aktiviert und selektiv konjugiert wird und
  • (c) Reinigung des konjugierten Proteins, wahlweise durch Fraktionierung mit Ammoniumsulfat.
  • Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft die Verwendung des konjugierten CSF-1-Proteins zur Herstellung eines Arzneimittels für die prophylaktische oder therapeutische Behandlung von Infektionskrankheiten oder Krebs in Säugern, insbesondere Verfahren, die bei der Krebsbehandlung, Behandlung von Osteoporose, Wundheilung, Senkung des Cholesterin-Spiegels oder Antikörper-abhängigen, zellulären Cytotoxizität (ADCC) in Säugern wirksam sind, wobei sie die Verabreichung einer wirksamen Menge einer pharmazeutischen Präparation an den Säugern umfassen, die das in einem pharmazeutisch verträglichen wäßrigen Trägermedium gelöste konjugierte CSF-1-Protein umfaßt.
  • Figur 1 stellt die cDNA und die abgeleitete Aminosäuresequenz von pCSF-17 (Leadersequenz aus 32 Aminosäuren und die Aminosäuren 1-224) dar.
  • Figur 2 stellt die cDNA und die abgeleitete Aminosäuresequenz von CSF-4 (partielle Aminosäure- Leadersequenz und die Aminosäuren 1-522) dar.
  • Figur 3A stellt das Größenausschluß-HPLC-Chromatogramm von nicht modifiziertem, rekombinantem CSF-1 (rCSF-1) (SCSF/N 2C 150) dar. Figur 3B stellt das HPLC-Chromatogramm des gleichen rCSF-1 dar, der mit PEG-NHS mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 7000 Dalton ein Derivat gebildet hat.
  • Figur 4 stellt ein Größenausschluß-HPLC-Chromatogramm von rCSF-1 (SCSF/C 150) dar, der mit PEG-NHS mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 11 000 Dalton ein Derivat gebildet hat.
  • Figur 5 zeigt eine graphische Darstellung der CSF-1- Konzentration im Blutplasma von Ratten für den rCSF-1 von E. coli (SCSF/C 150) in Abhängigkeit von der Zeit, das dimere Produkt, das von rCSF-1 mit der Sequenz von Figur 2 stammt [dem die Leadersequenz und eine C-terminale Sequenz fehlen, sämtliches im E. coli-Konstrukt vorhandenes N- terminales Methionin jedoch im wesentlichen beibehalten hat), rCSF-1, der in Säugerzellen (COS) exprimiert wurde und von einem glycosylierten Vorläufer von 522 Aminosäuren (LCSF) stammt und von mit PEG-11 000 derivatisiertem E. coli-rCSF-1 (SCSF/C 150).
  • Figur 6 stellt ein Größenausschluß-HPLC-Chromatogramm von Blutplasma von Ratten 120 Minuten nach der intravenösen Injektion des PEG 11 000-Derivats von rCSF-1 (SCSF/C 150) dar. Radioimmuntest (RIA) und die Absorption bei 280 nm sind graphisch dargestellt.
  • Figur 7 stellt die CSF-1-Konzentration in Blutplasma von Ratten für rCSF-1 von E. coli (SCSF/N 3C 158) und für das PEG 11 000-Derivat des gleichen Proteins in Abhängigkeit von der Zeit dar.
  • Figur 8 stellt die SDS-PAGE-Analyse des PEG 11 000- Derivats von rCSF-1 (SCSF/C 150) dar. Das Gel (10 %), das zum Nachweis von Protein mit Coomassie-Blau angefärbt ist, ist von der in Figur 5 verwendeten Probe, mit und ohne Reduktion von Disulfidbrücken.
    • Definitionen
  • "Kolonie stimulierender Faktor-1" betrifft eine Zusammensetzung aus einem dimeren Protein oder Glycoprotein, das die biologische Aktivität von CSF-1 im Standard- In vitro-Test der Koloniestimulierung von Metcalf, J. Cell. Physiol. 76 (1970), 89, aufweist, worin das Polypeptid bevorzugt die Bildung von Makrophagen-Kolonien stimuliert. "Biologisch aktiver CSF-1" bezeichnet eine Zusammensetzung von konjugiertem CSF-1, die im wesentlichen die gleiche spezifische Aktivität in Tests der Koloniebildung von Maus- Knochenmarkszellen wie die nicht-konjugierte Form des gleichen CSF-1 oder mindestens etwa 10 % seiner spezifischen Aktivität aufweist. Ein "nativer" CSF-1 ist ein nicht- rekombinanter CSF-1. Maus-CSF-1 ist in der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 0 272 779, von Rajavashisth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 1157, und DeLamarter et al., Nucleic Acids Res. 15 (1987), 2389, beschrieben.
  • "Klinisch reiner" CSF-1 bezeichnet ein Präparat von biologisch aktivem menschlichem CSF-1, der rekombinant in Bakterien produziert wird, das heißt, mindestens 95 % CSF-1 bei der RP-HPLC oder entweder der reduzierenden oder nicht- reduzierenden SDS-PAGE-Analyse, und einen Endotoxin-Gehalt von weniger als etwa 1,0 ng/mg CSF-1 aufweist.
  • "Selektiv konjugiert" betrifft Proteine, die über freie Aminogruppen des Proteins (vorzugsweise eine oder zwei freie Aminogruppen, um die maximale biologische Aktivität zu erhalten), über freie Sulfhydrylgruppen (falls vorhanden) oder eine Kohlenhydrat-Einheit (falls vorhanden), die im Protein enthalten sind, kovalent gebunden sind.
  • "Wirksame Menge" und "immuntherapeutisch wirksame Menge" bezeichnen eine Menge, die die angegebene Funktion erfüllen kann, beispielsweise die Förderung der Tumorrückbildung oder die Verhinderung oder Heilung von Infektionskrankheiten. Das genaue Mengen-Optimum hängt von vielen Faktoren ab, einschließlich der Krankengeschichte des Patienten und der gegenwärtigen Erkrankung, dem Verabreichungsschema, dem Weg und der Reaktion des Patienten.
  • "Therapeutische Behandlung" bezeichnet die Behandlung nach dem Erwerb der Krankheit, während eine "prophylaktische" Behandlung die Behandlung zur Verhinderung des Erwerbs der Krankheit anzeigt.
  • "Säuger" bedeutet jede Säugerart und schließt Kaninchen, Mäuse, Hunde, Katzen, Vieh, Schafe, Primaten und Menschen, vorzugsweise Menschen, ein.
  • "Muteine" sind Proteine, die gentechnisch hergestellt und von einer Nucleinsäuresequenz exprimiert werden, die unter Verwendung von Verfahren, beispielsweise der Stellenspezifischen Mutagenese, verändert worden sind. Solche genetischen Veränderungen sollen eine oder mehrere Substitutionen, Additionen und/oder Deletionen der Aminosäuresequenz des parentalen Proteins ergeben.
  • "Pharmazeutisch verträglich" betrifft ein Trägermedium, das die biologische Aktivität des (der) aktiven Bestandteil(s)e nicht stört, stabil und für den Wirt, dem es verabreicht wird, nicht toxisch ist.
  • "Homodimer" betrifft ein dimeres Protein, dessen beide Untereinheiten im wesentlichen identisch sind, mit der Ausnahme, daß es auch dimere Proteine mit geringen Microheterogenitäten einschließt, die gelegentlich bei der Produktion oder Prüfung von rekombinanten Proteinen entstehen.
  • "Heterodimer" betrifft ein dimeres Protein, das Untereinheiten aufweist, die sich in der Aminosäuresequenz, der Zahl der Aminosäuren oder beidem unterscheiden. Mit anderen Worten, Heterodimere weisen zwei nicht-identische Untereinheiten auf.
    • CSF-1-Proteine
  • Wie im Abschnitt mit Hintergrundinformationen beschrieben, ist CSF-1 in seiner dimeren Form biologisch aktiv. Der hier verwendete CSF-1 kann das native oder das rekombinant hergestellte Dimer sein. Native dimere CSF-1- Arten sind aus menschlichem Urin, gezüchteten Monocyten und Kulturüberständen einiger Zellinien erhalten worden. Es konnte rekombinante DNA erhalten werden, die aus verschiedenen Aminosäuresequenzen und Längen bestehende CSF- 1-Monomere codiert. Die Figuren 1 und 2 stellen DNA- Sequenzen und Aminosäuresequenzen dar, die von den DNA- Sequenzen der Formen mit vollständiger Länge bzw. von nicht- prozessierten kurzen bzw. langen Formen abgeleitet wurden, wobei beide an ihren N-Termini eine Signalsequenz von 32 Aminosäuren enthalten. Wenn auf die Sequenzen des monomeren CSF-1-Proteins Bezug genommen wird, dann sind hier zweckmäßigerweise die kurze Form von 224 Aminosäuren ohne die Leadersequenz (hier als SCSF bezeichnet) und die lange Form von 522 Aminosäuren ohne Leadersequenz (hier als LCSF bezeichnet) gemeint. Es wird angenommen, daß auch andere CSF-1-Dimere, die von DNA-Sequenzen hergestellt werden, die durch Punktmutation(en), Insertion(en), Deletion(en) und/oder Translokation(en) modifiziert wurden, von der erfindungsgemäßen chemischen Modifizierung profitieren, wenn sie biologisch aktiv sind.
  • Der in jedem beliebigen eukaryotischen oder prokaryotischen Wirt produzierte rekombinante CSF-1 kann über ausgewählte Aminosäure-Seitengruppen, vorzugsweise freie Aminogruppen, an Polymere konjugiert werden. Die CSF-1 codierende DNA wird vorzugsweise in Bakterien exprimiert, und der erhaltene CSF-1 ist nach Reinigung und erneuter Faltung ein Homodimer. Wenn die Konjugation über eine Kohlenhydrat-Einheit erfolgt, kann der Wirt eukaryotisch sein, oder die Glycosylierung kann in vitro durchgeführt werden.
  • Zweckmäßigerweise werden zur Bezeichnung der Primärstruktur der von den verschiedenen cDNA-Konstrukten codierten Protein-Untereinheiten hier die nachstehend aufgeführten Abkürzungen verwendet: LCSF bezeichnet die 522 Aminosäuren lange, keine vollständige Signalsequenz aufweisende, für den Clon CSF-4 beschriebene Sequenz, die in der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 0 272 779 offenbart ist, auf die vorstehend Bezug genommen wurde und die in Figur 2 dargestellt ist. SCSF bezeichnet die 224 Aminosäuren lange, keine Signalsequenz aufweisende, für den Clon pCSF-17 beschriebene Sequenz, die in Figur 1 dargestellt und im vorstehend beschriebenen Artikel von Kawasaki, Science 230 (1985), 292-296, beschrieben ist, der hier ebenfalls durch Bezugnahme eingeschlossen ist.
  • Es dürfte bekannt sein, daß ein bestimmtes Derivat des Clons pCSF-17 an Position 59 einen Asparaginsäurerest aufweist. Der beschriebene LCSF-Clon codiert an Position 59 ebenfalls Asp. Zur Bezeichnung der Muteine, die den Aminosäure-Substitutionen innerhalb der in den Figuren 1 und 2 dargestellten Sequenzen entsprechen, wird folglich die Substitution mit der tiefgestellten Positionsangabe verwendet. Muteinformen von CSF-1 sind in der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 0 272 779, veröffentlicht am 29. Juni 1988, offenbart, deren Offenbarungsgehalt hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist. Bei der Expression dieser, diese Proteine codierenden Konstrukte in Bakterien können die Endprodukte in unterschiedlichem Ausmaß auch N-terminales Methionin beibehalten. Da der Grad der Entfernung von N-terminalem Methionin nicht verläßlich vorausgesagt werden kann, ist diese Möglichkeit in der Zeichnung nicht berücksichtigt.
  • Die Verkürzungen des C-Terminus bzw. N-Terminus dieser zugrundeliegenden SCSF- und LCSF-Sequenzen werden als C bzw. N bezeichnet. Auf die C-terminalen Deletionen folgt die Zahl, die die von der nativen Struktur verbliebene Zahl der Aminosäuren darstellt. Auf die N-terminalen Deletionen N folgt die Zahl der vom N-Terminus deletierten Aminosäuren. LCSF/C 150 bezeichnet daher beispielsweise ein Konstrukt, das ein Protein codiert, das die ersten 150 Aminosäurereste der langen CSF-Sequenz enthält. SCSF/C 158 bezeichnet ein Konstrukt, das ein Protein codiert, das die ersten 158 Aminosäurereste der kurzen Form enthält. SCSF/N 2 bezeichnet ein Konstrukt, das die kurze Form codiert, in der die beiden N-terminalen Aminosäuren deletiert sind. (Wie vorstehend beschrieben, unterscheiden sich LCSF und SCSF beginnend an der Position 150 und stimmen nach 298 Aminosäuren im LCSF-Clon wieder überein). LCSF/N 2C 150 bezeichnet eine Form, die der LCSF/C 150 entspricht, mit der Ausnahme, daß die beiden N-terminalen Glutaminsäurereste deletiert sind.
  • Plasmide, die mehrere CSF-1-Formen codieren, sind gegenwärtig verfügbar und können in bakteriellen Systemen exprimiert werden. Eine Plasmidform, die die lange Form von CSF-1 codiert, kann in eukaryotischen Zellen exprimiert werden, wobei die eukaryotische Zelle den Clon prozessiert, wobei ein Protein sezerniert wird, dessen C-Terminus verkürzt und dessen Leadersequenz vom N-Terminus entfernt ist. In einer anderen Ausführungsform kann der Clon verkürzt werden, um spezifische, am C-Terminus deletierte Formen in eukaryotischen oder prokaryotischen Zellen zu exprimieren. Ferner können die ersten beiden oder drei N-terminalen Codons deletiert werden, so daß das erhaltene, in E. coli exprimierte Protein homogener ist. Insbesondere wird das N- terminale Methionin, das in E. coli-Konstrukten unmittelbar stromaufwärts des N-Terminus der reifen nativen Sequenz codiert ist, (es bleibt im Protein als "N-terminales Met" erhalten, sofern es nicht durch posttranslationales Prozessieren entfernt wird) aus diesen Konstrukten mit N- terminalen Deletionen leichter entfernt. Ferner wird eine signifikante, unter Verwendung von Umkehrphasen-HPLC (RP- HPLC) nachweisbare Heterogenität festgestellt, wenn das Gen, das die "native" N-terminale Sequenz (beispielsweise der kurzen Form, Mutein SCSF/C 150) codiert, in E. coli exprimiert und das gereinigte Produkt charakterisiert wird. Diese Heterogenität wird beseitigt, wenn das entsprechende CSF-1-Gen, dem die beiden N-terminalen Codons (Glutaminsäure) fehlen, exprimiert wird. Dementsprechend können auch andere am N-Terminus verkürzte Formen von anderen kurzen und langen CSF-1-Genkonstruktionen verwendet werden.
  • Bevorzugte Konstruktionen sind die, in denen das Protein im wesentlichen aus einer Aminosäuresequenz besteht, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus LCSF/C 150 bis C 464, Tyr&sub5;&sub9;LCSF/C 150 bis C 464 und Asp&sub5;&sub9;SCSF/C 150 bis C 166 besteht. Stärker bevorzugt sind die CSF-1-Proteine, die im wesentlichen aus einer Aminosäuresequenz bestehen, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus LCSF/C 150, LCSF/C 190, LCSF/C 221, LCSF/C 223, LCSF/C 236, LCSF/C 238, LCSF/C 249, LCSF/C 258, LCSF/C 406, LCSF/C 411, LCSF/C 464, Asp&sub5;&sub9;SCSF/C 150, Asp&sub5;&sub9;SCSF/C 153 und Asp&sub5;&sub9;SCSF/C 158 besteht.
  • Zu den besonders bevorzugten Konstruktionen, die CSF- 1-Proteine für die hierin beschriebene Modifizierung ergeben, gehören Clone, die LCSF/C 190, LCSF/C 221, Asp&sub5;&sub9;SCSF/C 158, Asp&sub5;&sub9;SCSF/C 150 und ihre entsprechenden N 2- und N 3-Formen codieren.
  • Die am meisten bevorzugten Ausgangsmaterialien sind die Produkte der Clone, die Asp&sub5;&sub9;SCSF/C 150, Asp&sub5;&sub9;SCSF/C 158, LCSF/C 221 und ihre entsprechenden N 3-Formen codieren.
  • In einer anderen Ausführungsform kann das CSF-1 ein Heterodimer sein, das aus unterschiedlichen monomeren Einheiten von CSF-1 hergestellt ist, insbesondere wenn die Konjugation über einen reaktiven Cysteinrest des CSF-1- Heterodimers durchgeführt wird. Die große Zahl von CSF-1- Proteinen, die durch Variationen der C-terminalen Sequenz entweder aufgrund von Unterschieden beim Prozessieren oder der Clonkonstruktion gebildet werden, liefert eine Vielzahl von Ausgangsmaterialien, die bei der Bildung von Heterodimeren verwendet werden können. So können durch erneute Faltung neue heterodimere Stoffe gebildet werden. Die monomere Form von SCSF/C 150 kann beispielsweise mit der monomeren Form von LCSF/C 157 gemischt und gemäß dem Verfahren der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 88/08003, veröffentlicht am 20. Oktober 1988, behandelt werden, wobei deren Offenbarungsgehalt hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist. Das Heterodimer kann anschließend durch verschiedene chromatographische und andere Verfahren von den homodimeren und oligomeren Nebenprodukten getrennt werden. Das Heterodimer (insbesondere SCSF/C 150 und LCSF/C 157) kann so hergestellt werden, daß eine Untereinheit an der Position 157 endet, wobei eine potentiell freie Sulfhydrylgruppe zur Umsetzung mit dem konjugierenden Polymer entsteht. Ähnliche Gemische, die dem erfindungsgemäßen Verfahren unterworfen werden, können zu Heterodimeren aus Aminosäure-Substitutionen aufweisenden Bestandteilen führen, beispielsweise Glu&sub5;&sub2;LCSF/C 221 und LCSF/C 190.
  • Die unterschiedlichen Monomere können in vitro vermischt oder in der gleichen Zelle produziert werden. Bei der Produktion in der gleichen Zelle wird in den gleichen Wirt ein Konstrukt zur Expression jedes Monomers eingeführt. In solchen Ausführungsformen wird es vorgezogen, daß jedes Konstrukt einen anderen Marker trägt (beispielsweise Tetracyclin-Resistenz (TcR) und Ampicillin-Resistenz (AmpR)), so daß cotransformierte Wirte selektiert werden. Die cotransformierten Zellen werden anschließend gezüchtet und induziert, um Gemische der beiden Formen zu erhalten.
  • Ferner können einzelne Cysteinreste an einer nicht- natürlichen Stelle in CSF-1 eingebaut werden, um ein Konstrukt von rCSF-1 zu erzeugen, das eine freie Sulfhydrylgruppe an einem Cysteinrest enthält, der mit PEG umgesetzt werden kann, vorausgesetzt, daß das Molekül seine biologische Aktivität behält. Heterodimere Konstrukte, die eine Substitution eines bestimmten Cysteins in nur einer der beiden Untereinheiten enthalten, können bei der Erzeugung von freien Sulfhydrylen ebenfalls nützlich sein. Auch Kohlenhydrat-Einheiten können, entweder durch Expression in eukaryotischen Systemen oder durch In vitro-Glycosylierung mit Enzymen, auf dem CSF-1-Protein angebracht werden.
  • Die rekombinanten CSF-1-Proteine können, müssen aber nicht die exakte, vom Clon vorgeschriebene Länge behalten aufgrund der Prozessierung durch den Wirt. Obwohl die als Ausgangsmaterial verwendeten Proteine die gleichen Bezeichnungen erhalten, sollte es daher klar sein, daß diese Bezeichnungen in Wirklichkeit das Clon-Konstrukt betreffen und die tatsächliche Länge des Ausgangsmaterials für das hier beschriebene Verfahren kürzer oder länger (wenn es ein Methionin am N-Terminus enthält) sein kann als durch die Zahl der C-terminalen Aminosäuren angegeben.
  • Wie vorstehend beschrieben, kann der CSF-1 in eukaryotischen Zellen, beispielsweise Säuger-, Insekten- oder Hefezellen, produziert werden. Die Herstellung in Säugerzellen wird in der PCT-Patent-Veröffentlichung Nr. WO 86/04607 offenbart. Der CSF-1 kann unter Verwendung eines Baculovirus-Vektors in Insektenzellen, wie von Luckow et al., Biotechnol. 6 (1988), 47, beschrieben, produziert werden, wobei deren Beschreibung durch Bezugnahme hier mit eingeschlossen ist. Weitere Beschreibungen dieser Herstellungsart für CSF-1 sind in Weaver et al., Bio/Technology 6 (1988), 287, enthalten. Der von Insektenzellen produzierte CSF-1 (SCSF/C 150) ist ein glycosyliertes Dimer, bei dem festgestellt wurde, daß er in vivo eine sehr kurze Halbwertszeit aufweist. Die beiden Signale in der Aminosäuresequenz von SCSF für N-gebundene Glycosylierung (Asn 122 und Asn 140) konnten unter Verwendung der Stellenspezifischen Mutagenese in der DNA modifiziert werden, wobei ein nicht- glycosyliertes, biologisch aktives, von Insektenzellen produziertes CSF-1-Protein (Gln 122, Gln 140) erzeugt wurde. Dieses Protein kann anschließend über seine Lysin- oder Cysteinreste mit einem Polymer umgesetzt werden, wie dies mit dem von Prokaryoten exprimierten rCSF-1 zur Erhöhung seiner Halbwertszeit in vivo geschehen ist.
  • Das Polymer kann an den glycosylierten CSF-1 an das Kohlenhydrat kovalent gebunden werden, beispielsweise durch Umsetzung, von PEG-Amin, PEG-Hydrazin oder PEG-Hydrazid, mit dem CSF-1-Protein, das zur Umwandlung von vizinalen Diolen der Zucker in Aldehyde mit Periodat oxidiert wurde. Das PEG- Amin kann durch Umwandlung von PEG-OH in PEG-Tosylat und anschließend in PEG-Phthalimid hergestellt werden, und das Phthalimid wird mit Hydrazin gespalten, um PEG-NH&sub2; in einer Gabriel-Synthese zu produzieren. PEG-Hydrazin und PEG- Hydrazid können durch Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, hergestellt werden. Das PEG-Derivat kuppelt an Kohlenhydrat-Stellen, deren vizinale Diole in Aldehyde umgewandelt wurden.
  • Bei der intrazellulären Produktion in bakteriellen Wirten muß der CSF-1 erneut gefalten werden, um aktive Dimere in hoher Ausbeute zu bilden, wie in der PCT- Veröffentlichung Nr. WO 88/08003, a. a. O., offenbart. Kurz gesagt, in diesem Verfahren wird das gelöste Monomer, ob sezerniert oder als reifes Protein oder Fusionsprotein produziert, unter reduzierenden Bedingungen in einem chaotropen Milieu gehalten. Ein solches Verfahren erfordert die Verwendung eines geeigneten Reduktionsmittels, beispielsweise β-Mercaptoethanol oder Dithiothreit (DTT). Das gelöste Protein wird üblicherweise in beispielsweise 8 M Harnstoff oder 7 M Guanidiniumhydrochlorid bei einem pH-Wert von etwa 7 bis 8,6 in Gegenwart von etwa 2 bis 100 mM Thiol- Verbindung gehalten. Ausgehend von dieser gelösten Form kann das Monomer entweder direkt erneut gefaltet oder von restlichen Proteinen durch ein geeignetes Reinigungsverfahren vor der erneuten Faltung gereinigt werden, beispielsweise durch Chromatographie an einem adsorbierenden Gel, Chromatographie unter Verwendung einer Ionenaustauschersäule oder Gel-Permeations-Chromatographie. Die Gel- Permeations-Chromatographie ist zweckmäßig, da sie eine leichte nach Größe erfolgende Abtrennung des Monomers mit der gewünschten, üblicherweise vorher bekannten Länge von Verunreinigungen mit unterschiedlichen Molekulargewichten ermöglicht. DEAE-Sepharose-Chromatographie in Harnstoff ist noch zweckmäßiger, da sie nicht nur reinigt, sondern auch konzentriert und leichter in größerem Maßstab durchgeführt werden kann als bei Verfahren nach Größenbestimmung. Es wird vorgezogen, die Reinigung unter reduzierenden Bedingungen durchzuführen, um die Bildung von über Disulfidbindungen zusammengehaltenen Aggregaten zu verhindern.
  • Daher wird ungeachtet des verwendeten chromatographischen Verfahrens ein geeignetes Reduktionsmittel den Lösungen beigefügt, die zur Beladung der Chromatographiesäulen oder Füllungen und in den Elutionslösungen verwendet werden. Gelegentlich kann das Reduktionsmittel durch einen niedrigen pH-Wert ersetzt werden, da ein niedriger pH-Wert die Bildung von Disulfidbindungen im wesentlichen verhindert und mit einigen chromatographischen Systemen verträglich ist. Ferner kann die Anwesenheit eines Chelatbildners in niedriger Konzentration helfen, die reduzierte Form des Proteins zu bewahren.
  • Das partiell gereinigte Monomer wird anschließend Bedingungen unterworfen, bei denen eine erneute Faltung zur Bildung des Dimers erfolgt. Die Proteinkonzentration bei diesem Schritt ist von beträchtlicher Wichtigkeit. Üblicherweise werden die Endausbeuten der Reaktion zur erneuten Faltung von CSF-1 (in Prozent pro Volumen) erhöht, wenn die Proteinkonzentration weniger als etwa 2 mg/ml CSF-1-Protein ist. Ein Konzentrationsbereich von 0,03 bis 1,0 mg/ml wird bevorzugt. Die Bedingungen zur erneuten Faltung können ein allmähliches Entfernen des chaotropen Milieus über einen geeigneten Zeitraum, üblicherweise mehrere Stunden, oder eine Verdünnung der Probe bis zur gewünschten Konzentration des Proteins und chaotropen Wirkstoffs einschließen. Es sind auch Verfahren möglich, die eine konstante Proteinkonzentration liefern, beispielsweise Dialyse oder Hohlfaser-Diafiltration, während das Chaotrop langsam entfernt wird. Am Ende des Verfahrens, wenn das Chaotrop erschöpft ist, ist ein relativ nicht-denaturierendes Niveau erreicht. Beispielsweise ist bei der Verwendung von Guanidinhydrochlorid als Chaotrop eine Endkonzentration von weniger als etwa 2 M und vorzugsweise 0,1 bis 1 M erreicht, und bei der Verwendung von Harnstoff als Chaotrop ist beispielsweise eine Endkonzentration von weniger als etwa 1 M und vorzugsweise 0,1 bis 0,5 M erreicht.
  • Die erneute Faltung erfolgt so, daß Oxidation der Sulfhydrylgruppen zu Disulfiden ermöglicht ist, die die biologisch aktive dimere Konfiguration ergeben, die bei CSF-1 die Bildung von Disulfidbindungen erfordert, wobei eine oder mehrere die beiden Ketten verbinden. Eine oder mehrere Disulfide bilden sich auch innerhalb der Kette. Geeignete, diese Dimerbildung unterstützende Redoxbedingungen schließen die Sulfhydryl/Disulfid-Reagenzkombinationen ein, beispielsweise oxidiertes und reduziertes Glutathion. Das Verhältnis von reduziertem zu oxidiertem Glutathion oder einer anderen Sulfhydryl/Disulfid-Kombination ist üblicherweise im Bereich von etwa 2 mM/0,1 mM bis 0,5 mM/1,0 mM. Andere Oxidationsverfahren sind ebenfalls akzeptabel. Auf jeden Fall sollte der pH-Wert der Lösung während der erneuten Faltung zur Unterstützung der Umsetzung bei etwa 7,5 bis 9,0 gehalten werden. Es ist klar, daß während der erneuten Faltung die stark reduzierenden Bedingungen, unter denen die anfängliche Reinigung durchgeführt wurde, nicht länger aufrechterhalten werden. Der Ausschluß von signifikanten Salzkonzentrationen, beispielsweise von Natriumchlorid, während der erneuten Faltung ermöglicht die Verwendung der Ionenaustausch-Chromatographie als einen nachfolgenden Konzentrierungs-/Reinigungsschritt.
  • Während der erneuten Faltung können höhere oligomere Arten von CSF-1 gebildet werden. Diese Aggregation wird durch Kontrolle der Temperatur minimiert, wobei niedrige Temperaturen von etwa 0 bis 4ºC höheren Temperaturen von 25 bis 37ºC vorgezogen werden.
  • Im erneut gefaltenen CSF-1-Präparat vorhandene Rückstände von Redoxreagentien können während der anschließenden Reinigungsschritte möglicherweise Disulfidaustausche erleichtern. Zwei stärker bevorzugte Verfahren zur Verhinderung solcher unerwünschter Disulfidaustausche schließen die Erniedrigung des pH-Werts auf weniger als 7,0 oder eine Diafiltration zur Entfernung der Redoxreagentien ein.
  • Vor der weiteren Reinigung des erneut gefaltenen, dimeren CSF-1 kann die Entfernung des Redoxmaterials und die Konzentrierung des erneut gefaltenen Proteins beispielsweise durch das direkte Auftragen des erneut gefaltenen Materials auf eine Ionenaustausch-Chromatographiesäule unter Verwendung von beispielsweise DEAE-Sepharose durchgeführt werden. Häufig werden solche Verfahren bei pH-Werten von etwa 8 durchgeführt. Die Erniedrigung des pH-Werts in den Bereich von 5,5 bis 7,0 reduzierte jedoch die Oligomerbildung und erhöhte die Ausbeute von dimerem CSF-1.
  • Nach Faltung, Konzentrierung und Reinigung wird das Dimer von Rückständen an Redoxmaterial und anderen Proteinen unter Verwendung ähnlicher wie vorstehend für das Monomer beschriebenen Verfahren weiter gereinigt. Zu geeigneten Verfahren gehören insbesondere die Gelfiltration, hydrophobe Wechselwirkungs-Chromatographie, Ionenaustausch-Chromatographie und Umkehrphasen-HPLC.
  • Ein besonders erfolgreiches Protokoll zur Entfernung von unerwünschten Verunreinigungen, beispielsweise fiebererregenden Stoffen oder anderen Endotoxinen, schließt die Verwendung einer Chromatographie auf einer Phenyl-TSK- oder Phenyl-Sepharosesäule ein. Die Chromatographie wird unter Bedingungen und mit Reagenzien durchgeführt, die im wesentlichen Endotoxin-frei sind. Der gewünschte dimere CSF-1 ist löslich und bei neutralem pH-Wert in etwa 1,5 M Ammoniumsulfat stabil und wird unter diesen Bedingungen bei niedrigen Temperaturen, d. h., bei etwa 4ºC bis etwa 10ºC und vorzugsweise bei etwa 4ºC, auf die Säulen aufgetragen. Durch Entfernung des Niederschlags, der sich nach Zusatz von Ammoniumsulfat bildet, wird ein Teil der Aggregate und der instabilen Formen des erneut gefaltenen CSF-1 beseitigt. Das CSF-1-Protein kann unter Verwendung eines abnehmenden Gradienten von Ammoniumsulfat (1,5 bis 0 M) mit zunehmendem Ethylenglycolgehalt (0 bis 50 %) in neutralem Puffer eluiert werden. Das CSF-1-Dimer eluiert von der Phenyl-TSK-Säule bei etwa 0,6 M Ammoniumsulfat und 35 % Ethylenglycol. Propylenglycol kann anstelle von Ethylenglycol verwendet werden, wobei die Elutionsbedingungen etwas unterschiedlich sein können. Alternative Hilfsstoffe können ebenfalls verwendet werden, und Phenyl-Sepharose wird zur Produktion des gereinigten dimeren CSF-1-Proteins in größerem Maßstab bevorzugt.
    • Konjugation
  • Das vorstehend beschriebene CSF-1-Protein wird entweder über (1) (eine) freie Aminogruppe(n), vorzugsweise nur eine oder zwei, um den Verlust der biologischen Aktivität zu minimieren, (2) mindestens eine Kohlenhydrateinheit auf dem Protein oder (3) (einer) freien Sulfhydrylgruppe(n), die in den Clon eingebaut worden (ist) sind und nach der Faltung frei bleiben, an das Polymer konjugiert.
  • Die Zahl der an das Protein konjugierten Polymermoleküle kann durch mehrere Verfahren ermittelt werden, dazu gehören beispielsweise ein Säureabbau oder eine Spaltung, woran sich eine Aminosäureanalyse anschließt, wenn die Bindungen Maleimido- oder Bromacetylbindungen an Cysteine sind und der Grad der Derivatbildung hoch ist (mehr als 4 Mole/Mol). In einer anderen Ausführungsform kann das konjugierte Protein mit einem Enzym (z. B. Trypsin) in kleine Fragmente gespalten und durch Säulenchromatographie getrennt werden. Peptidkarten des Proteins vor und nach einer Modifikation werden verglichen und Fragmente mit veränderten Elutionszeiten zur Bestimmung der Lage(n) der Polymeranknüpfungen sequenziert. In einer dritten Ausführungsform kann das Polymer vor der Kupplung radioaktiv markiert werden, um die Zahl an Molen des radioaktiven Polymers, die pro Mol CSF-1-Protein angeknüpft ist, zu ermitteln. Wenn Polymere von relativ einheitlichem Molekulargewicht an CSF-1 von relativ einheitlichem Molekulargewicht konjugiert werden, kann die Messung des Molekulargewichts des Konjugats zur Abschätzung der Zahl an Polymeren pro CSF-1-Molekül dienen.
  • Der (die) Rest(e) zur Konjugation kann (können) sein: (1) jede freie Aminogruppe (ε-Aminogruppen an Lysinresten oder eine eventuell vorhandene freie Aminogruppe am N-Terminus), (2) freie Sulfhydrylgruppen an Cysteinresten, die in CSF-1 eingebaut worden sind, oder (3) eine Kohlenhydrat-Einheit (an anderer Stelle besprochen). Es ist festgestellt worden, daß bei einer moderaten Derivatbildung von freien Aminogruppen mit PEG (d. h., bei einem Gehalt von einem bis drei modifizierten Aminosäureresten) das Protein 25 bis 100 % der biologischen Aktivität von nicht- derivatisiertem CSF-1 behält. Wenn das konjugierte Protein jedoch mit PEG stark derivatisiert ist, weist es eine signifikant niedrigere meßbare biologische Aktivität auf, je nach CSF-1-Typ, Länge des PEG-Polymers und Linkers und Reaktionsbedingungen, die verwendet werden.
  • Das Polymer, an das das Protein angeknüpft ist, ist ein Homopolymer von Polyethylenglycol (PEG) oder Polypropylenglycol (PPG), ein polyoxyethyliertes Polyol oder Polyvinylalkohol, vorausgesetzt, daß in sämtlichen Fällen das Polymer bei Raumtemperatur in Wasser löslich ist. Zu den Beispielen von polyoxyethylierten Polyolen gehören polyoxyethyliertes Glycerin, polyoxyethyliertes Sorbit, polyoxyethylierte Glucose und ähnliches.
  • Die Glycerin-Kette von polyoxyethyliertem Glycerin entspricht der gleichen Kette, die beispielsweise in Mono-, Di- und Triglyceriden in Tieren und Menschen natürlich vorkommt. Daher wird diese Verbindung nicht notwendigerweise im Körper als fremd erkannt.
  • Das Polymer weist vorzugsweise ein durchschnittliches Molekulargewicht von etwa 1000 bis 100 000 Dalton auf, stärker bevorzugt von 4000 bis 40 000 Dalton, beispielsweise je nach Molekulargewicht des bestimmten verwendeten CSF-1. Da das Ziel der Modifizierung der Erhalt eines konjugierten Proteins unter Beibehaltung der biologischen Aktivität bei einer erhöhten Halbwertszeit in vivo im Vergleich zum nicht- konjugierten Protein und einer verringerten Immunogenität ist, wird das Molekulargewicht des Polymers so ausgewählt, daß diese Bedingungen optimiert werden, z. B. ein modifiziertes dimeres CSF-1-Protein mit einem relativen Molekulargewicht von mehr als etwa 80 kd.
  • Ein weiterer Vorteil, der durch die Derivatbildung von nativem dimerem CSF-1 (d. h., nicht-rekombinantem Protein) erreicht wird, besteht darin, daß die Verwendung eines knappen, schwer zu reinigenden CSF-1 durch eine solche Modifizierung optimiert würde.
  • Vorzugsweise wird das PEG-Homopolymer an einem Ende mit einem Alkylrest substituiert, es kann jedoch auch unsubstituiert sein. Vorzugsweise ist der Alkylrest eine C&sub1;-C&sub4;-Alkylgruppe und besonders bevorzugt eine Methylgruppe. Das Polymer ist am stärksten bevorzugt ein Monomethylsubstituiertes PEG-Homopolymer und weist ein Molekulargewicht von etwa 4000 bis 40 000 Dalton auf.
  • Die kovalente Modifizierungsreaktion kann mit jedem der vorstehend beschriebenen Verfahren durchgeführt werden, vorzugsweise bei einem pH-Wert von etwa 5 bis 9, stärker bevorzugt von 7 bis 9, wenn die reaktive Gruppe auf dem Protein eine freie Aminogruppe ist. Bei Verwendung der letzteren Vorgehensweise wird das Protein über mindestens eine an das Polymer angefügte, terminale, reaktive Gruppe konjugiert. Das Polymer mit der (den) reaktiven Gruppe(n) wird hier als "aktiviertes Polymer" bezeichnet. Die reaktive(n) Gruppe(n) reagiert (reagieren) selektiv mit einer freien Amino- oder anderen reaktiven Gruppe des Proteins. (Wenn mehr als eine reaktive Gruppe vorhanden ist, müssen die Konjugationsbedingungen zur Verhinderung einer Vernetzung sorgfältig überwacht werden. Es werden allerdings monovalente Arten bevorzugt.) Die Menge an verwendetem intaktem, aktiviertem Polymer ist üblicherweise in einem etwa 1 bis 30fachen molaren Überschuß des aktiven Polymers über das Protein. Das verwendete genaue molare Verhältnis hängt von einer Zahl von Variablen ab, die den Typ des verwendeten, aktivierten Polymers, den pH-Wert, die Proteinkonzentration und das verwendete CSF-1-Molekül einschließen. Für andere aktivierte Polymere als der aktive PEG- Chlorformiatester ist der molare Überschuß des aktivierten Polymers über das Protein zur Bildung von Derivaten von Aminogruppen vorzugsweise nicht mehr als etwa 11 Mol pro Mol CSF-1-Dimer und besonders bevorzugt etwa 1 bis 8 Mol pro Mol CSF-1. Der molare Überschuß des aktiven PEG- Chlorformiatesters (PEG-PNP) über das Protein ist zur Bildung von Derivaten von Aminogruppen vorzugsweise nicht mehr als etwa 5 Mol pro Mol CSF-1-Dimer und am meisten bevorzugt etwa 1 bis 2 Mol pro Mol CSF-1.
  • Üblicherweise betrifft das Verfahren die Herstellung eines aktivierten Polymers und die anschließende Umsetzung des Proteins mit dem aktivierten Polymer. Üblicherweise wird die Umsetzung in einem Puffer bei einem pH-Wert von etwa 7 bis 9 durchgeführt, häufig in etwa 10 mM Hepes bei einem pH-Wert von 7,5, 100 mM NaCl, wenn ein intern esterfreies PEG-NHS-Reagenz verwendet wird, oder mit etwa 50 mM Natriumborat bei einem pH-Wert von 9, wenn das PEG-PNP-Reagenz verwendet wird, wobei beide Verfahren nachstehend beschrieben werden. Die Umsetzung wird üblicherweise etwa 20 Minuten bis 12 Stunden bei 0 bis 25ºC, vorzugsweise 25 bis 35 Minuten bei 20ºC oder drei Stunden bei 4ºC durchgeführt. Im Anschluß an die Konjugation wird das gewünschte Produkt gewonnen und durch Säulenchromatographie oder ein vergleichbares Verfahren gereinigt.
  • Die Umsetzung zur Modifizierung mit aktivem PEG kann in unterschiedlicher Weise, wie nachstehend beschrieben, unter Verwendung eines oder mehrerer Schritte durchgeführt werden. Zu den Beispielen von geeigneten modifizierenden Wirkstoffen, die zur Herstellung des aktivierten PEG in einem einzigen Reaktionsschritt verwendet werden können, gehören Cyanursäurechlorid (2,4,6-Trichlor-S-triazin) und Cyanursäurefluorid.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Modifizierungsreaktion in zwei Reaktionsschritten, wobei das PEG-OH zuerst mit einem Säureanhydrid, beispielsweise Bernsteinsäure- oder Glutarsäureanhydrid, umgesetzt wird, wobei Carbonsäure gebildet wird, und die Carbonsäure anschließend mit einer Verbindung umgesetzt wird, die mit der Carbonsäure reagieren kann, wobei ein aktiviertes PEG mit einer reaktiven, zur Reaktion mit dem Protein fähigen Estergruppe gebildet wird. Zu den Beispielen für solche Verbindungen gehören N-Hydroxysuccinimid, Sulfo-N-Hydroxysuccinimid, 4-Hydroxy-3-nitrobenzolsulfonsäure und vergleichbare Substanzen. Vorzugsweise wird N-Hydroxysuccinimid verwendet.
  • Monomethyl-substituiertes PEG kann beispielsweise vier Stunden bei erhöhten Temperaturen, vorzugsweise bei etwa 100 bis 110ºC, mit Glutarsäureanhydrid umgesetzt werden. Die so hergestellte Monomethyl-PEG-Glutarsäure wird anschließend in Gegenwart eines Carbodiimid-Reagenzes, beispielsweise Dicyclohexyl- oder Diisopropylcarbodiimid, mit N-Hydroxysuccinimid umgesetzt, um das aktivierte Polymer, Methoxypolyethylenglycolyl-N-succinimidylglutarat, herzustellen, das nach der Reinigung mit dem Protein umgesetzt werden kann. Dieses Verfahren ist von Abuchowski et al., Cancer Biochem. Biophys. 7 (1984), 175-186, genauer beschrieben.
  • In einem weiteren Beispiel kann das Monomethylsubstituierte PEG mit Glutarsäureanhydrid umgesetzt werden, woran sich zur Herstellung des aktivierten Polymers eine Umsetzung mit 4-Hydroxy-3-nitrobenzolsulfonsäure (HNSA) in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid anschließt. HNSA ist in Bhatnagar et al.,Peptides: Synthesis-Structure-Function, Proceedings of the Seventh American Peptide Symposium, Rich et al. (Hrsg.), (Pierce Chemical Co., Rockford IL, 1981), S. 97-100, in Nitecki et al., High-Technology Route to Virus Vaccines (American Society for Microbiology: 1985), Seiten 43-46 (auf einem Gespräch vom 8. bis 10. November 1984 beruhend), mit dem Titel "Novel Agent for Coupling Synthetic Peptides to Carriers and Its Application", und in Aldwin et al., Anal. Biochem. 164 (1987), 494-501, beschrieben. Sämtliche Beschreibungen sind hier durch Bezugnahme eingeschlossen.
  • Da Esterbindungen chemisch und physiologisch reaktiver als Amidbindungen sind, kann es vorgezogen werden, Protein- Derivate mit aktivierten Polyethylenglycol-Molekülen zu bilden, die im Endprodukt keine Ester erzeugen.
  • In einer Ausführungsform kann das PEG zur Anknüpfung an das Protein unter Verwendung von PEG-Amin oder PEG-OH als Ausgangsmaterial aktiviert werden. Das PEG-OH kann in PEG- Amin umgewandelt werden, wie in Pillar, V. N. R. et al., J. Organic. Chem. 45 (1980), 5364-5370, beschrieben, wobei die Beschreibung durch Bezugnahme hier eingeschlossen ist. Kurz zusammengefaßt, das Monomethyl-PEG-Amin (mPEG) wird durch Umwandlung von mPEG-OH in mPEG-Tosylat und anschließend in mPEG-Phthalimid hergestellt und das Phthalimid zur Herstellung von mPEG-NH&sub2; in einer Gabriel-Synthese mit Hydrazin gespalten. Das mPEG-Amin wird anschließend zur Herstellung von mPEG-NHCO(CH&sub2;)&sub3;COOH etwa vier Stunden bei Raumtemperatur mit Glutarsäureanhydrid umgesetzt. Nach der Umsetzung wird das Produkt ausgefällt, gereinigt und mit N-Hydroxysuccinimid und Dicyclohexylcarbodiimid umgesetzt, um
  • herzustellen. Diese Verbindung kann anschließend mit der (den) geeigneten freien Aminogruppe(n) des CSF-1-Polypeptids umgesetzt werden.
  • In einer anderen Ausführungsform sind für eine solche Konjugation nützliche Formen aktiver Ester aus Polyethylenglycolcarbonsäure in Nitecki et al., Peptide Chemistry 1987, Shiba & Sakakibara (Hrsg.), Protein Research Foundation, Osaka (1988), beschrieben. Kurz gesagt, die aktiven Ester weisen die nachstehend dargestellten Formeln auf:
  • R'-(O-CH&sub2;-CH&sub2;)n-O-(CHR&sub2;)-CO-OLG (I) oder
  • R'-(O-CH&sub2;-CH&sub2;)n-1-O-CH&sub2;-CO-OLG (II)
  • in der R' ein niederer Alkylrest von 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, R&sub2; ein H-Atom oder ein organischer Substituent, n etwa 8 bis 500 und LG eine austretende Gruppe ist, die aus Cyanomethyl ausgewählt ist, einer aromatischen Gruppe, die aus einer Phenyl- oder Naphthyl-Gruppe ausgewählt ist, die mit 1 bis 5 Substituenten substituiert ist, die die aromatische Gruppe labiler machen, und einer Pyridylgruppe, die wahlweise 1 bis 4 dieser Substituenten enthält. Diese Ester können für Verbindung (I) durch Alkylierung des Polyethylenglycols mit einer alpha-Halogenalkansäure oder deren Ester mit einer anschließenden Veresterung mit HO-CH&sub2;-CN oder einer der LG entsprechenden Gruppe oder für Verbindung (II) durch Oxidation des PEG zu seiner Säure mit einer anschließenden Veresterung mit HO-CH&sub2;-CN oder einer der LG entsprechenden Gruppe hergestellt werden. Die Formel I wird am meisten bevorzugt hergestellt, und der aktivierende Wirkstoff ist para-Nitrophenol oder ortho-Nitrophenol. Das Polymer ist am meisten bevorzugt über eine von dem para- Nitrophenylester des Polymers gebildete Amidbindung an das Protein konjugiert. Beispielsweise kann PEG-OH in PEG-O- umgewandelt und mit BrCH&sub2;CO&sub2;CH&sub3; umgesetzt werden, der Methylester kann hydrolysiert und die Säure mit p-Nitrophenol in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid umgesetzt werden, wobei
  • hergestellt wird. Dieses Polymer wird im Anschluß an die Reinigung wiederum mit einer verfügbaren freien Aminogruppe(n) des CSF-1 umgesetzt.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird PEG-OH mit einem Chlorkohlensäureester (auch als Chlorcarbonat bezeichnet) umgesetzt, wobei ein aktiver PEG-Ester (auch als PEG-PNP bezeichnet) gebildet wird. Nach der Bildung des aktiven PEG-Esters wird es mit CSF-1 umgesetzt, wobei ein PEG/CSF-1-Konjugat gebildet wird. Vgl. auch Veronese et al., Biochem. and Biotech. 11 (1985), 141-152, das durch Bezugnahme hier vollständig eingeschlossen ist. Chlorkohlensäureester sind von Firmen wie Aldrich erhältlich. Sie können auch wie in Gleichung (1) dargestellt hergestellt werden.
  • (1) Cl- -Cl + R-OH -> Cl- -O-R + HCl
  • Der Chlorkohlensäureester wird durch Umsetzung von auch als Carbonylchlorid bekanntem Phosgen mit einem Alkohol (R-OH), das Elektronen-entziehende Substituenten am -OH tragenden Kohlenstoffatom enthält, hergestellt. Der Alkohol ist vorzugsweise ein saurer Alkohol, stärker bevorzugt ein saurer Alkohol, der aromatische Ringe mit hohen Extinktionskoeffizienten enthält. Beispiele für R-Gruppen sind: N-Hydroxysuccinimid, N-Hydroxysulfosuccinimide, Cyanmethylester, sämtliche Nitro-, Chlor- und Cyan-Substitutionen an Benzol, Naphthalin oder größeren aromatischen Ringsystemen, die Heteroatome enthalten oder nicht enthalten können, beispielsweise Pyridin, para-Nitrophenol (PNP), ortho- Nitrophenol (ONP) etc.. Am meisten bevorzugte R-Gruppen sind PNP und ONP.
  • Nach Bildung des Chlorkohlensäureesters wird er mit PEG-OH umgesetzt, wobei, wie in Gleichung (2) dargestellt, ein aktiver PEG-Ester gebildet wird.
  • (2) PEG-OH + Cl- -O-R -> PEG-O- -O-R + HCl
  • Der Chlorkohlensäureester ist an zwei Stellen reaktionsfähig: an der Bindung zwischen dem Chlor und der Carbonylgruppe (stärker reaktionsfähig) und an der Bindung zwischen dem Carbonyl und der O-R-Gruppe (weniger reaktionsfähig). Die reaktionsfähigere Stelle befindet sich dort wo der Chlorkohlensäureester PEG bindet. PEG-OH und der Chlorkohlensäureester werden vorzugsweise bei Raumtemperatur in einem geeigneten Lösungsmittel vermischt, beispielsweise in CHCl&sub3; oder CH&sub2;Cl&sub2;. Ein die Acylierung katalysierender Stoff wird vorzugsweise 0 bis 1 Stunde später zugesetzt, der die Acylierung katalysierende Stoff ist vorzugsweise Pyridin oder Dimethylpyridin. Der Chlorkohlensäureester wird vorzugsweise in einem Überschuß von bis zu 12 M, stärker bevorzugt in einem Überschuß von 2 M, zugesetzt. Man läßt das Gemisch sich vorzugsweise 4 Stunden, stärker bevorzugt 16 Stunden, mischen. Zu diesem Zeitpunkt kann sich ein Niederschlag bilden. Er wird durch Filtration entfernt und verworfen. Filtriervorrichtungen wie beispielsweise Whatman- Glasfiber-Filter (GH/B) sind akzeptabel. Die erhaltene Lösung enthält den aktiven PEG-Ester, sowie nicht-umgesetztes PEG und Chlorkohlensäureester im Überschuß. Die Ausfällung erfolgt durch Zusatz eines Ethers, vorzugsweise ist der Ether Diethylether. Der Niederschlag enthält den aktiven PEG-Ester und kann mit geeigneten Lösungsmitteln, beispielsweise Ether, gewaschen, gegebenenfalls erneut gelöst und erneut ausgefällt werden.
  • Nachdem der aktive PEG-Ester gebildet worden ist, wird er, wie in Gleichung (3) dargestellt, mit CSF-1 konjugiert:
  • (3) PEG-O- -O-R + NH&sub2;-CSF-1 -> PEG-O- -NH-CSF-1 + ROH
  • Der Bereich des Chlorkohlensäureesters im aktiven PEG- Ester weist noch die weniger reaktionsfähige Stelle auf. An dieser Stelle wird die kovalente Bindung zwischen dem PEG und CSF-1 gebildet. Im Endprodukt ist die PEG-Einheit über eine Urethanbindung (auch als Carbamatbindung bezeichnet), die die Struktur
  • -O- -NH-
  • aufweist, an CSF-1 gebunden. Diese Bindung ist relativ stabil und erhält die Konjugation von PEG und CSF-1, wobei unter physiologischen Bedingungen eine geringe oder keine Hydrolyse eintritt.
  • Der homodimere rekombinante CSF-1 von E. coli enthält keine signifikante Zahl von reaktiven freien Sulhydrylgruppen mehr, nachdem die erneute Faltung korrekt abgeschlossen wurde. Der Clon kann jedoch genetisch modifiziert werden, so daß er einen oder mehrere neue Cysteinreste beinhaltet, die nach der erneuten Faltung noch Sulfhydrylgruppen aufweisen. Das so produzierte CSF-1-Mutein muß noch eine signifikante biologische Aktivität aufweisen, um hier von Nutzen zu sein.
  • In einer anderen Ausführungsform können freie Sulfhydrylgruppen durch Erzeugung von ausgewählten Heterodimeren oder durch partielle erneute Faltung von Homodimeren erzeugt werden, so daß bestimmte SH-Gruppen, beispielsweise am Cys&sub1;&sub5;&sub9;, zur Modifikation durch aktivierte Polymere verfügbar sind.
  • Bei der Konjugation des Proteins über einen Cysteinrest erfolgt die bevorzugte Art der Konjugation folgendermaßen: Das vorstehend beschriebene mPEG-NH&sub2; wird vorzugsweise 0,5 bis 1,5 Stunden bei Raumtemperatur mit N- Maleimido-6-aminocapronsäureester von 4-Hydroxy-3-nitrobenzolsulfonsäure (Mal-sac-HNSA) umgesetzt, was, wie vorstehend erwähnt, in Nitecki et al., High-Technology Route to Virus Vaccines (Amer. Soc. for Microbiol., 1985) S. 43-46, beschrieben ist. Die letztere Umsetzung wird vorzugsweise mit einem etwa 5fachen molaren Überschuß von Mal-sac-HNSA über PEG-NH&sub2; durchgeführt. Nach Entfernen von hydrolysiertem oder nicht-umgesetztem HNSA (z. B. durch Dialyse, Diafiltration oder durch Größenausschluß erfolgende Chromatographie) kann das Reagenz bei Raumtemperatur in einem Puffer unter Verwendung von äquimolaren Mengen Reagens und Protein mit dem Protein umgesetzt werden. Andere Reagenzien, beispielsweise N-Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexan-1-carboxylat (SMCC) oder XCH&sub2;CO-NH(CH&sub2;)&sub5;-HNSA-Ester, in dem X Br, Cl oder I ist, können die gleiche Funktion wie Mal-sac-HNSA unter einer Reihe von Reaktionsbedingungen erfüllen, die dem Fachmann bekannt sind.
    • Reinigung von Konjugaten
  • Nach der Konjugationsreaktion ist wahrscheinlich ein Gemisch von Molekülen vorhanden, deren Identität von den Reaktionsbedingungen abhängt. Diese Moleküle, die sich in der Zahl der an CSF-1 konjugierten PEG-Einheiten unterscheiden, können durch verschiedene Verfahren, zu denen Chromatographie, Elektrophorese und Salzfraktionierung gehören, getrennt werden. Hydrophobe Wechselwirkungschromatographie (HIC) unter Verwendung von Phenyl-Sepharose erwies sich als besonders nützlich. Die Trennung nach Größe kann auch unter Verwendung der nicht-reduzierenden SDS-PAGE oder der Chromatographie mit Molekularsieben erreicht werden. Ferner erwies sich das Aussalzen von CSF-1- Konjugaten, sowie von Konjugaten anderer Proteine, beispielsweise Interleukin-2 (IL-2), ebenfalls als nützlich. Üblicherweise werden Ammoniumsulfat [(NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;], Natriumsulfat [Na&sub2;SO&sub4;], Magnesiumsalze und Phosphate verwendet. Die stärker konjugierten Moleküle bildeten bei niedrigeren Salzkonzentrationen als das weniger konjugierte und nicht- konjugierte Protein einen Niederschlag. Das erneute Aufarbeiten von partiell gereinigten Molekülen durch eines dieser Verfahren kann im Hinblick auf die Zahl von Polymeren pro Molekül Protein zu einem im wesentlichen homogenen Molekül von konjugiertem Protein führen.
    • Formulierungen
  • Das so modifizierte und wahlweise nach dem Grad der Konjugation gereinigte Protein wird anschließend in ein nicht-toxisches, stabiles, pharmazeutisch verträgliches, wäßriges Trägermedium formuliert, vorzugsweise bei einem pH- Wert von etwa 3 bis 8, mehr bevorzugt von 5 bis 8. Die Verabreichung erfolgt nach üblichen Protokollen und Schemata, vorzugsweise systemisch, einschließlich der intravenösen Verabreichung. Für In vitro-Anwendungen, wie für diagnostische Zwecke, sind die Art der Verabreichung und Formulierung nicht kritisch. Üblicherweise werden wäßrige Formulierungen verwendet, die mit dem Kultur- oder Perfusionsmedium verträglich sind. Wenn die Zusammensetzung in vivo zur Therapie verwendet wird, kann sie übliche physiologisch verträgliche Exzipienten, beispielsweise Wasser zur Injektion, Puffer und Stabilisatoren einschließen, wie sie im Stand der Technik bekannt sind. Ein wasserlöslicher Träger, beispielsweise Mannit, kann dem Medium wahlweise zugesetzt werden.
  • Modifiziertes CSF-1 kann entweder als einziger aktiver Bestandteil oder in Kombination mit anderen Proteinen oder Verbindungen, die eine entsprechende Aktivität aufweisen, verwendet werden. Zu solchen anderen Verbindungen können Antitumor-Wirkstoffe, beispielsweise Adriamycin von Lymphokinen, beispielsweise IL-1, -2, -3, -4, Interferone (alpha, beta oder gamma), GM-CSF, G-GSF und der Tumornekrose-Faktor gehören. Die Wirkung des modifizierten CSF-1 kann durch die Gegenwart solcher weiteren Bestandteile verbessert werden. Eine Zusammenfassung von Formulierungsverfahren für pharmazeutische Zusammensetzungen, die Protein einschließen, gibt es beispielsweise in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, letzte Ausgabe.
  • Die Dosierungsmenge an Protein in der Formulierung hängt von den Daten der Wirksamkeit in vivo ab, die durch vorklinische Tests erhalten werden, und kann je nach klinischer Anwendung unterschiedlich sein. Das Medium, in dem das Protein gelöst ist, weist nach erneuter Auflösung des Gemisches einen pharmazeutisch verträglichen pH-Wert auf.
  • Wenn die Formulierung lyophilisiert wird, kann das lyophilisierte Gemisch erneut gelöst werden, indem eine übliche, parenteral verabreichbare, wäßrige Lösung, z. B. destilliertes Wasser zur Injektion, in das Röhrchen injiziert wird.
  • Die erneut gelöste, nach der vorstehenden Beschreibung hergestellte Formulierung ist zur Therapie zur parenteralen Verabreichung an Menschen oder anderen Säugern in therapeutisch wirksamen Mengen (d. h., Mengen, die den pathologischen Zustand des Patienten ohne Sterblichkeit oder unakzeptabler Morbidität beseitigen oder reduzieren) geeignet. Die CSF-1-Therapie kann für mehrere Indikationen geeignet sein, beispielsweise für eine Verbesserung des Immunsystems, Erhöhung der Cytotoxizität von Makrophagen, Erhöhung der Zahl der monocytischen und granulocytischen weißen Blutkörperchen, Behandlung von Infektionskrankheiten, beispielsweise Infektionen durch das Cytomegalovirus und Bakterien. (z. B. gramnegative Sepsis) durch therapeutische oder prophylaktische Verabreichung an Säuger, Behandlung einer Tumorbelastung, beispielsweise Sarkome oder Melanome in Säugern, Behandlung von Cholesterinämie (wie für GM-CSF von Nimer et al., JAMA 260 (1988), 3297-3300, beschrieben) und/oder Heilung von Wunden in Säugern. Ferner kann CSF-1 zur Stimulierung des Immunsystems mit G-CSF kombiniert werden, wie dies in der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 0 273 778, veröffentlicht am 6. Juli 1988, beschrieben ist, deren Offenbarungsgehalt durch Bezugnahme hier mit eingeschlossen ist.
  • Die Dosis und das Dosierungsschema des konjugierten CSF-1 hängen beispielsweise von der Pharmakokinetik des Arzneimittels, der Natur der Krankheit oder des körperlichen Zustandes, der Art und Länge des Polymers und den Eigenschaften des bestimmten CSF-1 ab, z. B. seinem therapeutischen Index und seinem Aktivitätsspektrum, dem Patienten und der Krankengeschichte des Patienten. Es wird angenommen, daß unterschiedlich modifizierte CSF-1-Proteine unterschiedliche pharmakokinetische und therapeutische Eigenschaften aufweisen, die für verschiedene Wege der Verabreichung vorteilhaft sind. Ein Arzneimittel mit Langzeitwirkung braucht nur alle 3 bis 4 Tage, wöchentlich oder einmal in zwei Wochen verabreicht werden. Die Clearance-Rate kann verändert werden, um ein Höchstmaß an Flexibilität zur Anpassung an das spezielle Bedürfnis des Patienten zu erhalten, z. B. durch Veränderung der Art des Polymers, der Größe des angeknüpften Polymers und der Aminosäuresequenz, an die das Polymer gebunden ist.
  • In den nachstehend beschriebenen Beispielen, die die Erfindung näher erläutern, sind sämtliche Anteile und Prozentsätze in Gewicht, sofern nicht anders angegeben, und sämtliche Temperaturen in Grad Celsius.
    • Beispiel 1 Herstellung von PEG-konjugiertem CSF-1 durch das Bindungsverfahren 1 A. Herstellung von aktiviertem PEG-NHS
  • Ein linearer Ester von Monomethyl-PEG mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 7000 kann erhalten werden, indem Monomethyl-PEG-7000 (Union Carbide) zunächst mit Glutarsäureanhydrid vier Stunden bei 100 bis 110ºC oder durch ein Verfahren umgesetzt wird, das dem von Abuchowski et al., Cancer Biochem. Biophys. 7 (1984), 175-186, gleicht, dessen Beschreibung durch Bezugnahme hier eingeschlossen ist. Das erhaltene PEG-Glutarat wurde nach einer genauen Beschreibung von Abuchowski et al., a. a. O., Seite 176, mit N-Hydroxysuccinimid in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid umgesetzt. Das erhaltene Produkt ist Methoxypolyethylenglycol-N-succinimidylglutarat, das hier nachstehend als PEG*-7000 bezeichnet wird. Die Umsetzung von PEG-4800 (Union Carbide) durch das gleiche Verfahren ergab PEG*-4800.
  • Eine PEG-11000-Glutaramid-NHS-Molekülart (PEG"-11000) wurde, wie nachstehend beschrieben, durch das Verfahren von Rajasekharam Pillai et al., J. Org. Chem. 45 (1980), 5364- 5370, hergestellt: Ein lineares Monomethyl-PEG mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 11000 Dalton (Union Carbide) (1,5 mmol) wurde zunächst in 10 ml Methylenchlorid gelöst, und anschließend wurden 1,8 ml (22,2 mmol) Pyridin und 6,0 g (31,6 mmol) p-Toluolsulfonylchlorid zugesetzt. Die Flasche wurde mit Stickstoff gespült und das Reaktionsgemisch über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde auf etwa 5 ml konzentriert und das Produkt mit 75 ml Ethylether ausgefällt. Der Niederschlag wurde gesammelt und mit Ether gewaschen. Das Produkt (mPEG-Tosylat) wurde in Ethanol umkristallisiert.
  • Das mPEG-Tosylat (etwa 1,5 mmol) wurde in 20 ml Dimethylformamid gelöst und 2,5 g (17,0 mmol) Kaliumphthalimid wurden zugesetzt. Die Lösung wurde vier Stunden unter Stickstoff unter Rückfluß erhitzt. Der gebildete Niederschlag wurde abfiltriert und das Filtrat zur Ausfällung des Produkts tröpfchenweise 300 ml Ether zugesetzt. Der Niederschlag wurde filtriert und mit Ether gewaschen. Das Produkt wurde in 30 ml Methylenchlorid suspendiert und 0,5 Stunden gerührt. Unlösliche Verunreinigungen wurden abfiltriert und das Produkt (mPEG-Phthalimid) mit Ether ausgefällt. Anschließend wurde das mPEG-Phthalimid (etwa 1,1 mmol) in 15 ml Ethanol gelöst, und 2,0 ml (41,2 mmol) Hydrazinhydrat wurden zugesetzt. Das Gemisch wurde über Nacht unter Rückfluß erwärmt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und das Produkt mit Ether ausgefällt.
  • Der Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt und in 25 ml Methylenchlorid resuspendiert. Unlösliche Verunreinigungen wurden abfiltriert und das Produkt mit Ether ausgefällt. Dieser Niederschlag, mPEG-11000-Amin, wurde in CH&sub2;Cl&sub2; suspendiert, filtriert und noch zweimal mit Ether ausgefällt. Das zweite Mal war er in Methylenchlorid vollständig löslich.
  • Insgesamt 0,5 g mPEG-11000-Amin wurden in 10 ml Dioxan gelöst, dem 0,25 g Glutarsäureanhydrid zugesetzt wurden. Die Umsetzung wurde vier Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach der Umsetzung wurde das Produkt, mPEG- NHCO(CH&sub2;)&sub3;COOH, mit etwa 100 ml Ether ausgefällt. Das Gemisch wurde filtriert und das Produkt in CH&sub2;Cl&sub2; erneut gelöst, in Ether filtriert, filtriert und getrocknet. Die Ausbeute des Produkts war 200 mg.
  • Das mPEG-NHCO(CH&sub2;)&sub3;COOH wurde anschließend mit N- Hydroxysuccinimid in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid, wie vorstehend zur Herstellung von PEG*-7000 beschrieben, umgesetzt. Das erhaltene Produkt wird hier als PEG"-11000 bezeichnet.
    • B. Reinigung und erneute Faltung von CSF-1
  • E. coli-Stamm HW22, der mit dem Plasmid pJN653 transformiert ist, das das SCSF/N 3C 158-Gen enthält (das Plasmid wurde am 12. November 1987 bei der ATCC unter der Nr. 67561 hinterlegt), wurde bei 30ºC bis zum Erhalt einer OD&sub6;&sub8;&sub0;nm von 10 in einem 10 Liter-Fermenter in einem Grundmedium gezüchtet, das 96 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 28 mM KH&sub2;PO&sub4;, 4 mM Na&sub3;-Citrat x 2 H&sub2;O, 1,7 ml/l TK9 (30 mM ZnSO&sub4;, 30 mM MgSO&sub4;, 1 mM CuSO&sub4;), mit sterilen Zusätzen von 6,5 g/l Glucose, 2,2 mM MgSO&sub4; x 7 H&sub2;O, 95 uM FeSO&sub4; x 7 H&sub2;O und 26 mg/l Thiamin HCl enthielt. Casaminosäuren wurden anschließend zu 2 % (Gew./Vol.) zugesetzt. Die Expression von CSF-1 wurde durch Veränderung der Züchtungstemperatur auf 37ºC induziert. Nach vier Stunden erreichte die Absorption bei 680 nm 79.
  • Die Zellen wurden in 5facher Konzentration geerntet und unter Verwendung einer tangentialen Kreuzstrom- Mikroporen-Filtration nach Dorr-Oliver gegen zehn Volumina 5 mM EDTA, pH-Wert 8,5, diafiltriert. Die Zellen wurden durch drei Durchgänge in einem mechanischen "Manton-Gaulin"- Hochdruck-Zellhomogenisator mit 7500 psi aufgebrochen. 1- Octanol wurde zu 0,1 % (Vol./Vol.) zugesetzt und das Homogenat über Nacht bei 4ºC gehalten.
  • Dem Homogenat wurden 63 % (gew./Vol.) Saccharoselösung bis zu einer Endkonzentration von 25 % Saccharose zugesetzt. Die unlösliche Proteinfraktion (refraktile Körperchen) wurde durch "Disk-stack"-Durchlaufzentrifugation (Westfalia SB7) mit 9000 x g, bei 1 Liter/Minute und 4 bis 6ºC, von den Zelltrümmern getrennt. Das nasse Pellet wurde mit entionisiertem Wasser 50:50 (Gew./Vol.) vermischt und bei -20ºC in Aliquots gelagert.
  • Eine Suspension aus fünfundzwanzig Gramm der refraktilen Körperchen (etwa 390 mg Protein) wurde in 250 ml 8 M Harnstoff gelöst, der 25 mM Tris, 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH-Wert 8,4), 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und 4 mM Dithiothreit (DTT) enthielt. Nach zwei Stunden bei Raumtemperatur wurde die Lösung 15 Minuten durch Zentrifugation mit 15 000 x g geklärt. Ein 150 ml-Aliquot des gelösten CSF-1 wurde anschließend auf eine 5 x 8 cm DEAE-Sepharose (Pharmacia)-Säule aufgetragen, die mit 6 M Harnstoff, der 25 mM Tris und 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH-Wert 7,0) enthielt, äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit 1 Bettvolumen der vorstehend beschriebenen Lösung gewaschen, die noch 1 mM DTT und 1 mM EDTA enthielt, und der CSF-1 wurde anschließend mit einem 1,4 Liter Salzgradienten von 0 bis 0,6 M Natriumchlorid im Waschpuffer eluiert. Der CSF-1-Peak eluierte bei etwa 0,06 M Natriumchlorid.
  • Der 90 ml Rückstand von gelösten refraktilen Körperchen wurde anschließend in identischer Weise durch die DEAE-Sepharose-Säule gereinigt. Die vereinigten CSF-1-Pools (165 ml) enthielten etwa 250 mg Protein mit einer Reinheit von etwa 50 %.
  • Der CSF-1 wurde anschließend erneut gefalten, indem der DEAE-Pool mit auf 4ºC vorgekühltem Puffer zur Faltung verdünnt wurde, der 50 mM Tris (pH-Wert 8,5), 5 mM EDTA, 2 mM reduziertes Glutathion und 1 mM oxidiertes Glutathion enthielt. Der CSF-1 konnte sich 30 Stunden bei 4ºC erneut falten. Der pH-Wert des gefaltenen CSF-1 wurde anschließend unter Verwendung einer 8,5 % Phosphorsäurelösung auf 6,8 eingestellt. Die Lösung wurde anschließend 10 Minuten durch Zentrifugation mit 15 000 x g geklärt und anschließend auf eine 5 x 4 cm DEAE-Sepharose-Säule aufgetragen, die zuvor mit 10 mM Natriumphosphat und 25 mM Tris (pH-Wert 6,8) äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit 300 ml dieses Puffers gewaschen und anschließend mit 700 ml eines 0 bis 0,6 M Natriumchlorid-Gradienten im gleichen Puffersystem eluiert. Der CSF-1 eluierte bei etwa 120 mM Natriumchlorid. Ammoniumsulfat (4 M Stammlösung, pH-Wert 7,0) wurde anschließend dem 95 ml DEAE-Pool zu einer Endkonzentration von 1 M zugesetzt. Der CSF-1 wurde anschließend durch einen Filter von 0,45 Micron (Nalgene) filtriert und auf eine 21,5 x 150 mm TSK-Phenyl-5-PW-Säule (Bio-Rad) aufgetragen, die mit pyrogenfreiem 1,5 M Ammoniumsulfat und 0,1 M Natriumphosphat (pH-Wert 7,0) äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit zwei Bettvolumina dieses Auftragspuffers gewaschen und anschließend in 0,1 M Natriumphosphat (pH-Wert 7,0) unter Verwendung eines 45 Minuten-Gradienten, in dem sich die Ammoniumsulfat-Konzentration von 1,5 auf 0 M verringerte und sich die Ethylenglycol-Konzentration von 0 auf 60 % (Vol./Vol.) erhöhte, eluiert. Sämtliche Arbeitsschritte wurden bei 4ºC unter im wesentlichen pyrogenfreien Bedingungen durchgeführt. Der CSF-1 eluierte bei etwa 0,6 M Ammoniumsulfat in 30 % Ethylenglycol. Der CSF-1 wurde anschließend in 10 mM, 150 mM Natriumchlorid enthaltendem Hepes-Puffer (pH-Wert 7,5) ausgiebig dialysiert und anschließend durch einen Filter von 0,45 Micron (Millex) steril filtriert.
  • Etwa 50 mg gereinigter SCSF/N 3C 158-CSF-1 wurde erhalten. Mehr als 90 % des CSF-1-Endprodukts wanderten als einzelne Bande in der SDS-PAGE, und das gleiche Produkt ergab in der Analyse durch RP-HPLC in Acetonitril/TFA etwa 96 % als eine einzige Fraktion. Die spezifische Aktivität war etwa 1,5 bis 1,7 x 10&sup8; Einheiten/mg (Einheiten wurden als äquivalente Einheiten der Koloniebildung unter Verwendung einer CSF-1-abhängigen Zellinie bestimmt und die Proleinkonzentration wurde unter Verwendung von A280nm und einem Extinktionskoeffizienten von 0,6 ermittelt, der aus Bestimmungen der Aminosäure-Zusammensetzung abgeschätzt wurde). Diese spezifische Aktivität ist der Aktivität des gereinigten nativen Mia-PaCa-CSF-1 mindestens äquivalent oder größer. Der Endotoxin-Gehalt des erneut gefaltenen, gereinigten CSF-1-Produkts war, wie durch einen LAL-Test ermittelt wurde, 0,5 bis 1 ng/mg CSF-1.
  • Auf eine ähnliche Weise wurde das E. coli-Protein, das unter der Kontrolle des PL-Promotors von der SCSF/N 2C 150 codierenden DNA produziert wurde, wie es in der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 0 272 779 offenbart ist, erneut gefaltet und in ähnlicher Weise gereinigt. Der zur Transformation von E. coli verwendete Vektor wurde durch die Substitution der ausgeschnittenen HindIII/BstXI-DNA des geeigneten CSF-17-Vektors gegen ein geeignetes synthetisches Fragment hergestellt, wobei CSF/N 2 codiert wird, dem Glu- Glu am N-Terminus fehlten.
    • C. Konjugation von PEG*-7000 an CSF-1
  • Das CSF-1-Protein (SCSF/N 2C 150) in Abschnitt B wurde in einem Medium aus 10 mM, 100 mM NaCl enthaltendem Hepes- Puffer, pH-Wert 7,2, dialysiert (1 mg Protein/ml). Das PEG*- 7000 wurde in einem kleinen Volumen Wasser schnell gelöst und der Proteinlösung sofort zugesetzt, wobei während der Umsetzung beständig gerührt wurde. Ein 3- bis 30facher molarer Überschuß von PEG*-7000 über das CSF-1-Dimer wurde verwendet. Die Umsetzung war nach etwa 30 Minuten bei 20ºC und in etwa drei Stunden bei 4ºC abgeschlossen.
  • Die Proben wurden durch eine auf Größenausschluß basierende HPLC analysiert. Figur 3A stellt das Chromatogramm der nicht-derivatisierten rCSF-1 (SCSF/N 2C 150)-Probe vor dem Experiment dar. Figur 3B stellt das Chromatogramm von 100 ug der gleichen CSF-1-Probe nach der 30 Minuten bei 20ºC durchgeführten Derivatbildung mit einem 5fachen molaren Überschuß von PEG*-7000 dar. Ein Radioimmuntest, der gemäß dem Verfahren von R. Stanley und Guilbert, J. Imm. Methods 42 (1981), 253-284, durchgeführt wurde, bestätigte, daß die ersten drei in Figur 3B beobachtbaren Hauptabsorptions-Peaks rCSF-1 enthielten. Vgl. Tabelle I.
  • Die Fraktionen 30, 32, 34, 36, 37, 38, 39, 41 und 42 wurden ebenfalls auf biologische Aktivität getestet, wobei der von Moore et al., J. Immunol. 131 (1983), 2397, und Prystowsky et al., Am. J. Pathol. 114 (1984), 149, beschriebene Test mit Mausknochenmark verwendet wurde, wobei der Inhalt dieser Veröffentlichungen durch Bezugnahme hier eingeschlossen ist. Tabelle I zeigt die Ergebnisse. Tabelle I Derivatbildung mit PEG*-7000 Clon: SCSF/N 2C 150 Biologische Aktivität Fraktion #a Knochenmark¹ RIA¹ Verhältnis² a Fraktionen wurden nach einer Verdünnung auf etwa 1000 RIA E/ml getestet. ¹ Einheiten/ml ² Verhältnis der Biologischen Aktivität Biologischer Test dividiert durch RIA Nb = Nicht bestimmt
  • Die in Tabelle I dargestellten und die nachstehenden Ergebnisse zeigen, daß das nicht-umgesetzte rCSF-1 und der Peak des rCSF-1-Derivats mit dem geringsten Molekulargewicht annähernd die vollständige biologische Aktivität (innerhalb der experimentellen Fehlergrenze) behielten. Größere Moleküle behielten eine viel geringere biologische Restaktivität. Die Umsetzung mit PEG*-7000 beeinflußte anscheinend die Reaktivität von CSF-1 im Radioimmuntest (RIA) nicht wesentlich, da das nicht-fraktionierte CSF-1- Derivat annähernd die vollständige Immunreaktivität im RIA pro mg Protein behielt.
    • D. Konjuciation von PEG"-11000 an CSF-1
  • Biologisch aktives Protein wurde nach der Expression eines SCSF/C 150 codierenden Konstrukts in E. coli unter der Kontrolle des PL-Promotors in einem Vektor, der nach der Offenbarung der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 0 272 779, veröffentlicht am 29. Juni 1988. konstruiert war, gereinigt und erneut gefalten. Es wurde ein λ-lysogener E. coli-Stamm, DG116, verwendet, der mit dem Plasmid O/EpPLCSF- 17 Asp&sub5;&sub9;/C 150 (ATCC Nr. 67389) transformiert ist. Das Protein wurde intrazellulär in einer monomeren, nicht- löslichen Form produziert, gereinigt und erneut gefalten, wie dies in der vorstehend beschriebenen PCT- Veröffentlichung Nr. WO 88/08003 offenbart ist.
  • Insgesamt 2 mg dieses gereinigten CSF-1 (1 mg/ml Protein) wurden in 100 mM NaCl enthaltendem Hepes-Puffer, pH-Wert 7,2, dialysiert. Das PEG"-11000 wurde in einem kleinen Volumen Wasser schnell gelöst und der Proteinlösung sofort zugesetzt, wobei während der Dauer der Umsetzung beständig gerührt wurde. Ein 8facher molarer Überschuß von PEG"-11000 über das CSF-1-Dimer wurde verwendet. Die Umsetzung war nach 30 Minuten bei 20ºC abgeschlossen. Dieses CSF-1 reagierte mit dem PEG"-11000 in einer der Umsetzung von SCSF/N 2C 150 mit dem PEG*-7000 annähernd gleichen Weise. Wie in Tabelle II dargestellt, wies die geringe Derivatbildung mit PEG (1 bis 2 pro Dimer) wiederum eine minimale Wirkung auf die biologische Aktivität auf, während der stark modifizierte Pool eine signifikant reduzierte Aktivität aufwies. Tabelle II Vergleich der Derivatbildung von rCSF-1 mit PEG"-11000 und PEG*-7000 Grad der Derivatbildung mit PEG¹ PEG*-7000 % biologisch aktiv (verglichen mit SCSF/N 2C 150 ohne Derivatbild.) PEG"-11000 % biologisch aktiv (verglichen mit SCSF/C 150 ohne Deriv.bild.) Mehrere 1 bis 2 pro CSF-1-Dimer ¹ Geschätzt nach dem nativen relativen Molekulargewicht, das durch SEC-HPLC und SDS-PAGE gemessen wurde.
  • Figur 4 stellt ein durch Größenausschluß-HPLC erhaltenes Chromatogramm von 8 mg rCSF-1 (SCSF/C 150)-Derivat mit PEG"- 11000 dar. Es wurde festgestellt, daß die Fraktion mit geringer Derivatbildung, die wie in der Figur dargestellt vereinigt wurde, im wesentlichen ihre vollständige biologische Aktivität behielt und mit einem relativen Molekulargewicht von 80 000 Dalton bei der Größenbestimmung nach Größenanschluß und 45 000 Dalton bei der nicht- reduzierten SDS-PAGE (Figur 8) wanderte. Diese Fraktion wurde in einer Gesamtausbeute von etwa 20 % gewonnen.
  • Der durch diese beiden Verfahren geschätzte Größenunterschied von PEG-CSF stimmt mit den von anderen gemachten Beobachtungen überein. PEG kann die Fähigkeit eines Proteins zur Bindung an SDS verändern, die Mobilität in der SDS-PAGE und auch die Schätzungen durch Größenausschluß beeinflussen, z. B. durch hydrophobe Wechselwirkungen mit der Matrix der Säule.
  • Es wurde festgestellt, daß die Endotoxin-Menge dieser Probe, wie durch den "Limulus-Amebocyte-Lysat" (LAL)-Test bestimmt, weniger als 1 ng/Absorptionseinheit Protein bei 280 nm (A&sub2;&sub8;&sub0;-Einheit) war. (Der LAL-Test ist in einer Produktanleitung (1982) für eine Pyrotell-Sorte von LAL (Associates of Cape Cod, Inc., Woods Hole, MA), von Watson et al. (Hrsg.), "Endotoxins and Their Detection with the Limulus Amebocyte Lysate Test", Proceedings of an International Conference on Endotoxin Standards and Limulus Amebocyte Lysate Use with Parenteral Drugs, Alan R. Liss, Inc., New York (1982) und von Levin et al., Bull. Johns. Hopkins Hosp. 115 (1964), 265, beschrieben).
    • E. Konjugation von PEG*-4800 an CSF-1
  • Die gleichen für PEG"-11000 verwendeten Bedingungen wurden zur Umsetzung des rCSF-1 vom Clon SCSF/C 150 mit PEG*-4800 verwendet. Das CSF-1-Derivat wurde erfolgreich hergestellt, und der Pool mit einer geringen Derivatbildung (an einer oder zwei Stellen) behielt eine im wesentlichen vollständige biologische Aktivität.
    • F. Pharmakokinetiken des CSF-1-Derivats mit PEG und des nicht-modifizierten CSF-1 in Ratten
  • Drei männlichen CD-Ratten (Charles River Breeding Labs, Wilmington, MA) mit einem Durchschnittsgewicht von 161 g wurde in die Schwanzvene 1 mg/kg der vorstehend beschriebenen und in Figur 8 dargestellten, gering derivatisierten Fraktion des PEG"-11000-Derivats von CSF-1 vom Clon SCSF/C 150 injiziert. Blutplasmaproben wurden durch einen eingeführten Katheder gesammelt und der CSF-1-Titer durch RIA bestimmt. Urinproben wurden nach 0, 30 und 120 Minuten gesammelt und getestet. Auch weitere Daten wurden unter Verwendung des nicht-derivatisierten rCSF-1 und des in Säugerzellen (COS) exprimierten rCSF-1, der von einem glycosylierten Vorläufer von 522 Aminosäuren (LCSF) stammt, gesammelt. Die Ratten in den Experimenten mit nicht- modifiziertem CSF-1 wiesen ein Durchschnittsgewicht von 178 g auf, und ihnen wurden 125 kg/kg des nicht-modifizierten CSF-1 injiziert. Alle anderen Bedingungen waren die gleichen.
  • Figur 5 vergleicht den Zeitverlauf der Blut-Clearance von modifiziertem und nicht-modiziertem CSF-1-Protein. Die systemische Clearance wird durch Division der Dosis durch die Fläche unter der Blutplasma-Kurve berechnet. Die Daten zeigen, daß die systemische Clearance von derivatisiertem rCSF-1 im Blut 0,302 ml/min/kg gegenüber 3,84 ml/min/kg für den nicht-derivatisierten rCSF-1 ist. Dies repräsentiert eine 12,7fach erhöhte Verweilzeit des derivatisierten im Vergleich zu dem nicht-derivatisierten Protein.
  • Figur 6 stellt eine Größenausschluß-HPLC des Blutplasmas von Ratten 120 Minuten nach der Injektion des CSF-1- Derivats (SCSF/C 150) dar. Diese Figur zeigt, daß das mit RIA nachweisbare rCSF-1-Signal im Blutplasma zwei Stunden nach der intravenösen Injektion eine relative Größe von 43 bis 80 kd aufwies. Diese Beobachtung weist darauf hin, daß das im pharmakokinetischen Experiment (nach 120 Minuten) gemessene RIA-Signal intaktes PEG-rCSF-1 und rCSF-1 repräsentiert. Western-Blotting nach dem Verfahren von Burnette, Anal. Biochem. 112 (1981), 195-203 (entwickelt mit einem Antiserum gegen rekombinanten CSF-1, das CSF-1- Fragmente nachweisen kann, gefolgt von ¹²&sup5;I-Protein A) von einem nicht-reduzierenden SDS-PAGE-Gel von Harn und Plasma bestätigte, daß das durch Western-Blotting nachgewiesene rCSF-1-Antigen anscheinend intakt und dimer war und die gleiche Größe wie das injizierte Material aufwies.
    • Beispiel II Herstellung des aktivierten CSF-1-Derivats mit PEG durch ein zweites Bindungsverfahren A. Herstellung des PEG-Esters 1. Herstellung des Carboxymethyl-Derivats von mPEG-5000:
  • Natriumnaphthalin wurde durch Zusatz von 0,15 g Na zu einer Lösung von 0,64 g Naphthalin in etwa 20 ml Tetrahydrofuran (THF) hergestellt, das aus Natriumbenzophenon frisch destilliert worden war. Monomethylpoly(ethylenglycol) mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 5000 ("mPEG-5000") wurde über Nacht in einem Vakuumexsikkator mit P&sub2;O&sub5; getrocknet. Die Na-Naphthalinlösung wurde einer Lösung aus 2,5 g mPEG-5000 in etwa 50 ml trockenem THF (frisch destilliert) tröpfchenweise zugesetzt. Wenn die grüne Farbe, die einen Überschuß anzeigt, in der Lösung erhalten blieb, wurde die Zugabe der Base beendet und 1,2 ml BrCH&sub2;COOCH&sub3; tröpfchenweise zugesetzt. Die grüne Farbe verschwand und das Gemisch wurde trübe. Das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das trübe Gemisch wurde in eine Flasche gegossen, die etwa 70 ml gekühlten Ether enthielt. Der Niederschlag wurde durch Vakuumfiltration gewonnen und mit Ether gewaschen. Der trockene Feststoff wurde in 75 ml 1 M NaOH gelöst und 2,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, um den Methylester zu hydrolysieren. Der pH-Wert wurde durch Zugabe von HCl auf etwa 3 eingestellt und die Lösung auf einem Rotationsverdampfer konzentriert. Der Rückstand wurde in CH&sub2;Cl&sub2; aufgenommen und etwa eine Stunde gerührt. Unlösliches Material wurde abfiltriert und die Lösung in Ether gegossen. Der Feststoff wurde durch Vakuumfiltration gewonnen, mit Ether gewaschen und in einem Vakuumexsikkator über P&sub2;O&sub5; getrocknet. Dies lieferte die gewünschte Carboxymethyl-mPEG-5000-Säure. Die Säure wurde titriert, um zu zeigen, daß eine vollständige Umwandlung stattgefunden hatte. Die Herstellung von mPEG-5000 wurde in einem größeren Maßstab wiederholt. Der Niederschlag wurde gesammelt und getrocknet. Die Ausbeute war 8,5 g. Die Titration zeigte etwa 102 % Säure. Dieses Experiment ist von Buckmann et al., Makromol. Chem. 182 (1981), 1379, beschrieben.
    • 2. Herstellung von Paranitrophenylester von Carboxymethyl- mPEG-5000:
  • Insgesamt 1 g mPEG-5000-Säure (2 x 10&supmin;&sup4; Mol) wurden in 3 ml CHCl&sub3; gelöst. Dieser Lösung wurden 0,28 g p-Nitrophenol (2 x 10&supmin;&sup4; Mol) zugesetzt. Die Lösung wurde hellgelb. Anschließend wurden 0,041 g Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) (2 x 10&supmin;&sup4; Mol) in einer kleinen Menge CHCl&sub3; gelöst und der PEG-Säurelösung bei Raumtemperatur tröpfchenweise zugesetzt. Nach 10 Minuten Rühren wurden 2 ul CHCl&sub3;-Gemisch 1,0 ml 0,01 M Phosphatpuffer, pH-Wert 7,0, zugesetzt. Die Absorption bei 400 nm des p-Nitrophenolanions war 0,2443. 5 N NaOH wurde zugesetzt, wobei sich die A&sub4;&sub0;&sub0; auf 0,5847 erhöhte (Der Estergehalt ist 58,2 %, wie durch die nachstehend dargestellte Formel berechnet:
  • % Ester = A&sub4;&sub0;&sub0; nach NaOH - A&sub4;&sub0;&sub0; vor NaOH/A&sub4;&sub0;&sub0; nach NaOH x 100
  • Nach einer Umsetzung von etwa drei Stunden wurde 1 ul CHCl&sub3;-Gemisch 1,0 ml 0,01 M Phosphat, pH-Wert 7,0, zugesetzt. Die A&sub4;&sub0;&sub0; war 0,2238. Bei Zugabe von 50 ul 5 N NaOH war die A&sub4;&sub0;&sub0; 1,154, mit 80,6 % Ester als Ausbeute.
  • Ein Niederschlag, Dicyclohexylharnstoff, entstand, der durch einen Glasfaserfilter abfiltriert und mit CHCl&sub3; gewaschen wurde. Der Ester wurde durch Zusatz von etwa 300 ml wasserfreiem Ethylether ausgefällt. Das Gemisch wurde etwa drei Stunden ausgefällt und anschließend durch eine Glasfritte filtriert. Der Niederschlag wurde anschließend in CHCl&sub3; erneut gelöst, mit etwa 100 ml Ethylether erneut ausgefällt und durch eine mittlere Glasfritte filtriert. Ein wenig feuchter Feststoff wurde in 0,01 M Phosphatpuffer, pH- Wert 7,0, gelöst. Die A&sub4;&sub0;&sub0; war 0,0240. Bei Zugabe von 50 ul 5 N NaOH erhöhte sich die A&sub4;&sub0;&sub0; auf 3,330 (Estergehalt war 99,3 %).
  • Der Hauptteil des Niederschlags wurde in einem Vakuumexsikkator über Nacht getrocknet. Die Flasche, in der er enthalten war, wurde mit Wasser gewaschen, und die Rückstände wurden gefriergetrocknet. Insgesamt 4 mg Niederschlag wurden anschließend in 2 ml 0,01 M Phosphat bei einem pH- Wert von 7,0 (A&sub4;&sub0;&sub0; = 0,0276) gelöst. Bei Zugabe von 50 ul 5 N NaOH war die A&sub4;&sub0;&sub0; 3,50 (außerhalb des Skalenbereichs). Insgesamt 200 ul Lösung wurden auf 800 ul 0,01 M Phosphat, pH-Wert 7,0, verdünnt. Die A&sub4;&sub0;&sub0; war 0,7985. Berechneter Estergehalt = 99,3 %.
  • Insgesamt 1,5 mg der gefriergetrockneten Rückstände wurden in 1,0 ml 0,01 M Phosphat, pH-Wert 7,0, gelöst. Die Absorption war 0,0680. Insgesamt 50 ul 5 N NaOH wurden zugesetzt, und die A&sub4;&sub0;&sub0; war 1,106 (Estergehalt = 93,9 %). Die Rückstände vom Hauptteil des Niederschlags auf dem Filter wurden mit Wasser gewaschen und über das Wochenende gefriergetrocknet. Ein lockeres weißes Pulver mit einem Gewicht von 131 mg wurde erhalten. Ein kleiner Teil wurde in 0,01 M Phosphat, pH-Wert 7, gelöst, und die A&sub4;&sub0;&sub0; war 0,0859. Bei Zugabe von 50 ul 5 N NaOH war die A&sub4;&sub0;&sub0; 0,6794 (Estergehalt = 87,4 %). Esterstruktur:
    • B. Derivatbildung von CSF-1-(Asp&sub5;&sub9;SCSF/C 150) mit PEG
  • Der zuvor beschriebene para-Nitrophenylester wurde, wie nachstehend beschrieben, an das in Beispiel I beschriebene, erneut gefaltene Asp&sub5;&sub9;SCSF/C 150-Protein gekuppelt:
  • Der rCSF-1 (200 ug bei 1 mg/ml) wurde in 100 mM NaCl enthaltendem 20 mM Hepes-Puffer, pH-Wert 7,2, dialysiert. Insgesamt 0,8 mg para-Nitrophenylester wurden in einem kleinen Volumen Wasser gelöst und 259 ug dieser Lösung dem SCSF/C 150 unmittelbar anschließend zugesetzt. Die Konjugation wurde vier Stunden bei 20ºC durchgeführt, und die Proben wurden durch Größenausschluß-HPLC analysiert. Der gering derivatisierte rCSF-1 (etwa 1 oder 2 PEG-Moleküle pro CSF-1) behielt im wesentlichen die vollständige biologische Aktivität, wie an Knochenmark von Mäusen getestet worden ist.
  • Bei der Durchführung der Reaktion in Küvetten in einem Doppelstrahl-Hewlett-Packard-Spektralphotometer kann die Freisetzung des para-Nitrophenolanions überwacht werden, wodurch es möglich ist, die Kupplungsreaktion nach Freisetzung einer bestimmten Menge reproduzierbar zu beenden.
    • Beispiel III Herstellung des PEG-Derivats von CSF-1 durch ein drittes Bindungsverfahren A. Herstellung des aktivierten PEG-Esters (PEG-PNP)
  • 25 Gramm (2,5 mmol) Monomethyl-PEG mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 10000 (mPEG 10000, Union Carbide), das lediglich geringe Diolkonzentrationen enthielt, wurden in einem 500 ml Dreihalsrundkolben in 250 ml CH&sub2;Cl&sub2; gelöst. 5 Gramm (25 mmol) p-Nitrophenylchloroformiat (PNP-Chloroformiat) und 3 Gramm (25 mmol) Dimethylaminopyridin (DMAP) wurden zugesetzt. Das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde zur Entfernung von DMAP HCl filtriert und auf 100 ml konzentriert. Die konzentrierte Lösung wurde unter Rühren 1 Liter Ether zugesetzt. Der Niederschlag wurde auf einem grobgesinterten Glasfilter gesammelt. Der Niederschlag wurde anschließend mit etwa 400 ml Methylenchlorid etwa 1 Stunde gerührt, anschließend filtriert und auf etwa 100 ml konzentriert. Der PEG-Ester wurde erneut ausgefällt, indem 1 Liter Ether der Lösung zugesetzt wurde. Der Niederschlag wurde unter Verwendung eines Glasfaserfilters gesammelt und in einem Vakuumexsikkator getrocknet. Die Ausbeute war 17,5 Gramm.
  • Das Produkt wurde auf den p-Nitrophenylcarbonat-Gehalt getestet. 10,3 mg (1,03 x 10&supmin;&sup6; Mol) wurden in 10 ml 0,1 M Natriumphosphat, pH-Wert 8, gelöst. Freie oder nicht- umgesetzte p-Nitrophenyl (PNP)-Verunreinigungen wurden durch Absorption bei 400 nm bestimmt. Die anfängliche A&sub4;&sub0;&sub0; war 0,37. Die Zugabe von 50 Microlitern 5 N NaOH zu 1,0 ml PEG- PNP hydrolysierte sämtliche vorhandenen Ester, und A&sub4;&sub0;&sub0; war 2,06. Wenn das gesamte gewogene Produkt (10,3 mg) PEG-PNP gewesen wäre (d. h., wenn kein freies PNP vorhanden gewesen wäre), wären 1,03 x 10&supmin;&sup4; Mol/Liter PNP mit einer A&sub4;&sub0;&sub0; = 1,85, wobei dies als das theoretische Maximum A&sub4;&sub0;&sub0; bezeichnet wird, freigesetzt worden. Daher waren
  • 2,06-0,37/1,85 x 100 = 91%
  • des gewogenen Materials tatsächlich PEG-PNP. Da die Anfangsabsorption (0,37) ziemlich hoch war, war anscheinend freies PNP vorhanden. Das Produkt wurde durch Auflösung in etwa 75 ml CH&sub2;Cl&sub2; und erneute Ausfällung durch Zugabe zu 1,2 Litern Ether weiter gereinigt. Der Niederschlag wurde gesammelt, getrocknet (15,8 Gramm) und erneut getestet.
  • A&sub4;&sub0;&sub0; nach NaOH - A&sub4;&sub0;&sub0; vor NaOH/Theoretisches Maximum der A&sub4;&sub0;&sub0; x 100
  • 1,78-0,157/1,82 x 100 = 89%
    • B. Herstellung des PEG-Derivats von CSF-1 (SCSF/N C 158)
  • CSF-1 wurde im wesentlichen wie in Beispiel I beschrieben produziert. CSF-1 wurde auf etwa 10 mg/ml in 0,05 M Na-Borat, pH-Wert 9,0, konzentriert. 5 mg PEG-PNP, das als Feststoff in Beispiel III Teil A erhalten wurde, wurden pro ml CSF-1 zugesetzt (etwa ein Verhältnis von 1:1 M). Die Umsetzung wurde 2 Std. bei Raumtemperatur fortgesetzt.
  • NaCl wurde dem Reaktionsgemisch zu einer Endkonzentration von etwa 5 M (Sättigung) zugesetzt und das Hochsalzgemisch auf eine Phenyl-Sepharose ("Pharmacia Fast Flow High Substitution")-Säule aufgetragen. Etwa 1 ml Phenyl- Sepharose war für 10 mg aufgetragenes Protein geeignet. CSF- 1 wurde mit einem Ammoniumsulfat-Gradienten von 1,2 bis 0 M in 0,1 M Tris, pH-Wert 8,5, von der Säule eluiert. Die Fraktionen wurden durch Coomassie-Färbung nach nicht- reduzierender SDS-PAGE analysiert und die biologische Aktivität im NFS-60-Biotest bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle III dargestellt. Die Plus-Zeichen stellen die relativen Mengen von verschiedenen CSF-1-Konjugaten in den Proben dar. Die Daten der biologischen Aktivität sind der Durchschnitt aus drei Tests. Tabelle III Biologische Aktivitäten von PEG-CSF-1-KoniugatenVorhandene CSF-1-Konjugate Fraktion #PEGs/CSF-1 Biologische Aktivität (E/mg)
    • Beispiel IV A. Herstellung des PEG-Derivats von CSF-1 (SCSF/N 3C 158)
  • Wachstum und Ernte des E. coli-Stamms HW22, der mit dem, das SCSF/N 3C 158-Gen enthaltenden pJN653 transformiert ist, erfolgte wie in Beispiel I beschrieben.
  • Die Suspension der refraktilen Körperchen wurde anschließend, ebenfalls wie in Beispiel I beschrieben, gelöst, erneut gefalten und gereinigt. Die spezifische Endaktivität war in einem mit einer CSF-1-abhängigen Zellinie durchgeführten CSF-1-Biotest etwa 1,5 x 10&sup8; Einheiten/mg.
  • Bei einer Konzentration von 2,6 mg/ml in 10 mM Hepes- Puffer, pH-Wert 7,5, und 100 mM NaCl wurden 40 mg des vorstehend erneut gefaltenen CSF-1 bei 20ºC unter Rühren inkubiert. PEG"-11000 wurde in 200 ul destilliertem Wasser gelöst und unmittelbar anschließend in einem 11fachen molaren Überschuß von PEG"-11000 über das CSF-1-Dimer (das PEG"-11000 war zu etwa 55 % nicht-hydrolysiert und aktiv) der CSF-1-Lösung zugesetzt. Nach einer Inkubation von 30 Minuten wurde die Umsetzung durch Zugabe von 2 Mol ε- Aminocaproat pro Mol PEG"-11000 aus einer 1 M Stammlösung beendet. Die Probe wurde durch eine "Amicon-Centricon-30"- Zentrifugation auf 6 ml konzentriert und durch Größenausschluß-HPLC in drei identischen Läufen mit einer 2 ml Beschickung gereinigt. Die verwendete Säule war Bio-Sil TSK-250, 600 x 21,5 mm (BioRad), die mit 0,2 M Na&sub2;HPO&sub4;/NaH&sub2;PO&sub4;-Puffer, pH-Wert 7,0, äquilibriert war.
  • Die A&sub2;&sub8;&sub0;-Peaks des mit PEG nur gering derivatisierten Proteins der drei Läufe wurden vereinigt (Pool 1, SEC) und auf ein Endvolumen von 2 ml konzentriert, das auf die gleiche Säule erneut injiziert wurde. Die aktiven, mit PEG derivatisierten Fraktionen wurden vereinigt und konzentriert.
  • Der letzte Pool (Pool 2, SEC), der 15 % des Ausgangsmaterials darstellte, bestand aus 6 mg CSF-1, der etwa 100 % der ursprünglichen biologischen Aktivität des nicht- modifizierten CSF-1 aufwies und eine Hauptmolekülart des PEG-CSF-1 enthielt, das bei etwa 45 K relativem Mr in der SDS-PAGE wanderte. Geringe Mengen (etwa 10 %) von nicht- modifiziertem CSF-1 und von stärker-modifiziertem CSF-1 blieben in den vereinigten Produkten zurück. Die Charakterisierung der durch Größenausschluß-Chromatographie (SEC) erhaltenen Poole 1 und 2 sind nachstehend in den Tabellen IV und V dargestellt: Tabelle IV Probe A&sub2;&sub8;&sub0;-Einheiten Ausbeute (%) Endotoxin (LAL, wie vorstehend beschrieben (ng/mg Protein) Nichtmodifizierter rCSF-1 Pool, SEC *Nicht bestimmt Tabelle V Unabhängige Probe RIA (wie vorstehend beschrieben) ("Einheiten"/A&sub2;&sub8;&sub0;-Einheiten) Biotest (mit einer CSF-1-abhängigen Zellinie) ("Einheiten"/A&sub2;&sub8;&sub0;-Einheiten) (Einheiten/mg) Nichtmodifizierter rCSF-1 Pool, SEC
    • B. Pharmakokinetik des PEG-Derivats von CSF-1 (SCSF/N 3C 158)
  • Die gleichen vorstehend in Beispiel I beschriebenen Bedingungen wurden zur Abschätzung der durchschnittlichen Clearance-Rate von den in Abschnitt A dieses Beispiels beschriebenen CSF-1 und PEG-CSF-1 in drei Ratten verwendet, mit der Ausnahme, daß die Dosierungen sowohl für PEG- Derivate von CSF-1 als auch für nicht mit PEG derivatisierte CSF-1 6 mg/kg waren.
  • Figur 7 zeigt die Zeit-abhängige graphische Darstellung der relativen Konzentration von CSF-1 im Blut von drei Ratten nach einer intravenösen Injektion. Es wurde festgestellt, daß die Clearance-Rate etwa 0,63 ml/min/kg für das PEG-Derivat von CSF-1 und 7,50 ml/min/kg für nicht mit PEG derivatisierte CSF-1 war (drei Stunden im Gegensatz zu fünf Minuten). Dies stellt eine etwa 12fache Erhöhung der durchschnittlichen Verweilzeit im Blut für das mit PEG derivatisierte Molekül dar.
    • Beispiel V Ammoniumsulfat-Fraktionierung von PEG-CSF-1-Konjugaten A. Im kleinen Maßstab
  • 10 ml Reaktionsgemisch, das 0PEG-CSF-1 (nicht-konjugiertes CSF-1), 1PEG-CSF-1 (1 Mol PEG/Mol CSF-1), 2PEG-CSF-1 (2 Mol PEG/Mol CSF-1), 3PEG-CSF-1 (3 Mol PEG/Mol CSF-1) und 4PEG-CSF-1 (4 Mol PEG/Mol CSF-1) enthielt, war etwa 1 mg/ml Protein. Festes (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; wurde zu etwa 1,3 M zugesetzt. Ein Niederschlag bildete sich und wurde durch 10-minütige Zentrifugation mit 10 000 Upm entfernt. Das Pellet wurde gewonnen und dem Überstand (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; bis zur Eintrübung bei etwa 1,4 M zugesetzt. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugation entfernt. Dieses Verfahren wurde fortgesetzt, wobei weitere Fraktionierungen durch (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;-Zusätze bei etwa 1,5, 1,6 und 1,7 M erfolgten. Die Niederschläge wurden in 0,1 M Tris, pH-Wert 8,6, erneut suspendiert. Eine SDS- PAGE-Analyse der Niederschläge zeigte eine Anreicherung von nicht-konjugiertem CSF-1 im Niederschlag bei 1,7 M (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; und vom 1PEG-CSF-1-Molekül in den Niederschlägen bei 1,5 und 1,6 M. Der 2PEG-CSF-1 war das häufigste Molekül in den Niederschlägen bei 1,4 M, obwohl 1PEG- und 3PEG-CSF-1 auch vorhanden waren. Tabelle VI stellt die relativen Mengen von unterschiedlichen CSF-1-Konjugaten in Pellets bei sich erhöhender (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;-Konzentration dar, die durch Coomassie- Anfärbung nach nicht-reduzierender SDS-PAGE analysiert wurden. Eine wiederholte (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;-Fraktionierung von Fraktionen, die mehr als eine Art von CSF-1-Konjugaten enthielten, ergab im wesentlichen reines nicht-konjugiertes CSF-1 und 1PEG-CSF-1. Diese Wiederholung kann auch zur Produktion von im wesentlichen reinem 2PEG-CSF-1 oder 3PEG- CSF-1 verwendet werden. Tabelle VI Ammoniumsulfat-Fraktionierung von PEG-CSF-1-Konjugaten Fraktion Vorhandene CSF-1-Konjugate (#PEGs/CSF-1-Dimer)
    • B. Im großen Maßstab
  • Etwa 1 g CSF-1 (SCSF/N 3C 158) wurde gemäß Beispiel III konjugiert. Nach einer Fraktionierung durch (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, wie in Teil A beschrieben, wurden etwa 600 mg CSF-1 mit dem Molekulargewicht des an ein PEG konjugierten CSF-1-Dimers gereinigt. Dieses Konjugat wies eine spezifische Aktivität von etwa 6,2 x 10&sup7; E/mg auf. Etwa 80 mg eines Gemisches von CSF-1-Konjugaten, die 1, 2 oder 3 gebundene PEGs aufwiesen, wurden ebenfalls gewonnen und wiesen eine spezifische Aktivität von etwa 3,2 x 10&sup7; E/mg auf.
    • Beispiel VI Ammoniumsulfat-Fraktionierung von PEG-IL-2-Konjugaten A. PEG-IL-2-Konjugate mit einem Amid-Linker
  • Etwa 12 mg IL-2, das im wesentlichen wie in der PCT- Patentveröffentlichung Nr. WO 88/08849, veröffentlicht am 17. November 1988, beschrieben produziert und gereinigt und wie im US-Patent Nr. 7,766,106 beschrieben mit PEG modifiziert wurde, wurden in 1 ml 1,0 M Tris, pH-Wert 8, resuspendiert. Festes (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; wurde bis zur Eintrübung der Lösung zugesetzt. Die Probe wurde 12 Min. mit 12 000 Upm zentrifugiert. Das Pellet wurde in 0,1 M Tris, pH-Wert 8,6, resuspendiert. Die (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;-Fraktionierung wurde wie in Beispiel V beschrieben fortgesetzt, und die SDS-PAGE-Analyse der resuspendierten Pellets zeigte, daß nicht-konjugiertes IL-2 von konjugiertem IL-2 getrennt werden konnte. Ferner wurden entsprechend den in Beispiel V für CSF-1 beschriebenen Ergebnissen Fraktionen erhalten, die mit an 1PEG konjugiertem IL-2 angereichert waren. Das erneute Aufarbeiten von mit einem bestimmten Konjugat angereicherten Fraktionen sollte im wesentlichen reine Konjugate ergeben.
    • B. PEG-IL-2-Konjugate mit dem Urethan-Linker
  • Die PEG-Einheit wurde über den hier beschriebenen Urethan- Linker an IL-2 angeknüpft. Die (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;-Fällung, die im wesentlichen der in Beispiel VI, Teil A, und in Beispiel V beschriebenen entsprach, ergab eine Fraktionierung der unterschiedlichen PEG-IL-2-Konjugate.
    • Beispiel VII Wirksamkeit des PEG-Derivats von CSF-1 (SCSF/N 3C 158) in vivo: Modell einer bakteriellen Infektion
  • Gruppen von fünf Mäusen wurden am Tag -1 (ein Tag vor der Infektion mit einer lethalen Dosis von E. coli SM18) mit dem in Beispiel III beschriebenen SCSF/N 3C 158, mit dem wie in Beispiel III beschrieben hergestellten, PEG-modifizierten SCSF/N 3C 158 oder einer Kochsalzlösung (Kontrollgruppe) intraperitoneal (ip) geimpft. Zwei CSF-1-Dosierungsgruppen (10 ug/Maus und 50 ug/Maus) wurden verwendet. Am Tag 0 wurde sämtlichen Mäusen eine lethale Dosis (5 x 10&sup7; Zellen) von E. coli SM18 ip injiziert. Die Zahl der überlebenden Mäuse wurde fünf Tage kontrolliert. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle dargestellt. Tabelle VII Zahl der überlebenden Mäuse nach Tag: Kontrolle (mit injizierter Kochsalzlösung) Nicht-modifizierter CSF-1 Mit PEG modifizierter CSF-1
  • Die Ergebnisse zeigen ein Dosis-abhängige Wirkung von rCSF-1 auf die Überlebensrate. Die geringe unterschiedliche Wirksamkeit zwischen dem modifizierten und nicht- modifizierten CSF-1 in diesem Einzelexperiment ist statistisch nicht bedeutsam. Die Modifizierung von CSF-1 mit PEG verringerte weder die durch dieses Protokoll nachgewiesene Wirksamkeit noch erhöhte sie die in diesem Versuch beobachtbare Arzneimittel-abhängige Toxizität.
    • Beispiel VIII In vivo-Test von konjugiertem CSF-1 auf Anti-Tumor- Wirksamkeit A. Meth-A-Sarkom-Modell
  • Mit PEG modifizierter CSF-1 wird intraperitoneal, subcutan oder intravenös (i.p., s.c., i.v.) bis zu 50 ug/Dosis pro Maus (10 Mäuse pro Gruppe) mit einem 7 Tage zuvor subcutan implantierten Meth-A-Sarcom-Tumor injiziert. Die Dosierungsschemata hängen von der bestimmten verwendeten, mit PEG modifizierten CSF-1-Präparation ab. Das Tumorvolumen wird 14 Tage nach Beginn der CSF-1-Behandlung kontrolliert. Die Ergebnisse werden durch Vergleich der durchschnittlichen, Zeit-abhängigen Veränderung des Tumorvolumens* der CSF-1-behandelten und der zur Kontrolle behandelten Mäuse bewertet. *(ΔTV = Verhältnis des durchschnittlichen Tumorvolumens am angegebenen Tag zum durchschnittlichen Tumorvolumen am Tag 0 innerhalb einer einzigen Mäusegruppe).
    • B. B16-Metastasen-Modell
  • Ein zweites In vivo-Tumor-Modell unter Verwendung von mit PEG modifiziertem CSF-1 zur Verhinderung von Metastasen in der B16-Maus-Melanom-Zellinie ist ebenfalls nützlich.
  • 1 bis 10 x 10&sup4; Tumorzellen, die in 0,2 ml Ca&spplus;²- und Mg&spplus;²-freiem HBSS suspendiert sind, werden nicht-betäubten Mäusen in die laterale Schwanzvene injiziert. 14 bis 21 Tage nach der Injektion der Tumorzellen werden die Mäuse getötet und obduziert. Während der Obduktion werden Lungen und Gehirn entfernt, in Wasser gespült und gewogen. Die Lungen werden anschließend in Bouin-Lösung fixiert und die Zahl der auf der Oberfläche vorhandenen Tumorknötchen pro Lungenpaar mit Hilfe eines Seziermikroskops bestimmt.
  • Es wird der rekombinante, menschliche, mit PEG modifizierte CSF-1 verwendet, der gemäß Beispiel III hergestellt wird, eine Wirksamkeit von 1 bis 25 x 10&sup7; E/mg und pharmazeutisch verträgliche Endotoxinmengen aufweist. Der CSF-1 wird vor jedem Experiment frisch aus einem gefrorenen Vorrat erhalten und unmittelbar vor der Injektion mit "USP" 0,9 % Kochsalzlösung verdünnt. Mit PEG modifizierter CSF-1 wird i.v., i.p. oder s.c. nach Schemata injiziert, die von der bestimmten verwendeten, mit PEG modifizierten CSF-1-Präparation abhängen. Es werden Dosierungsmengen von bis zu 5 mg/kg verwendet. Als negative Kontrolle, die aus einem nicht-spezifischen und nicht- therapeutischen Protein besteht, wird "USP" menschliches Serumalbumin (HSA) oder gekochter, mit PEG modifizierter CSF-1 verwendet. Mit PEG modifizierter CSF-1 wird 30 Min. gekocht, um die CSF-1-Aktivität zu inaktivieren.
  • Die Daten über die Wirksamkeit zeigen, daß mit PEG modifizierter CSF-1 eine signifikante Verringerung der durchschnittlichen Zahl an Lungenmetastasen produziert.
    • Beispiel IX In vivo-Behandlung einer CMV-Infektion mit dem PEG-Derivat von CSF-1
  • Ausgewachsene CD-1-Mäuse werden mit dem PEG-Derivat von CSF-1 bei Dosierungen von bis zu 400 ug/kg i.p., i.v. oder s.c. behandelt, wobei zwei Tage vor der Infektion mit einer sublethalen Dosis Cytomegalovirus (CMV) begonnen wird. Dosierungsschemata sind von der bestimmten verwendeten Präparation des PEG-Derivats von CSF-1 abhängig, die Mäuse werden am dritten Tag nach der Infektion getötet und das Ausmaß der viralen Replikation in Zielorganen, beispielsweise der Milz, durch einen Plaque-Test bewertet. Die Ergebnisse zeigen, daß mit dem PEG-Derivat von CSF-1 behandelte Mäuse einen signifikant niedrigeren Virustiter im Organ im Vergleich zu mit Kochsalzlösung behandelten Kontrollmäusen aufweisen, wodurch angezeigt ist, daß die CMV-Infektion in mit dem PEG-Derivat von CSF-1 behandelten Mäusen weniger schwer ist.
  • Das PEG-Derivat von CSF-1 kann getrennt davon in einem lethalen Maus-CMV-Infektions-Modell in ausgewachsenen CD-1- Mäusen getestet werden (dies ist dem vorstehend beschriebenen Experiment entgegengesetzt, in dem sublethale Dosierungen von CMV verwendet und die Organtiter überwacht werden). Wenn mit PEG modifiziertes CSF-1 in Dosen von bis zu 4 mg/kg (pro Maus) an Mäuse i.p., s.c. oder i.v. verabreicht wird, wobei bis zu 24 Stunden vor dem Virus- Immuntest begonnen wird, gibt es verglichen mit der mit Kochsalzlösung behandelten Kontrolle eine signifikante Erhöhung der Überlebensrate.
  • Das PEG-Derivat von CSF-1 kann daher allein oder in Kombination mit einem anderen Lymphokin bei der Behandlung von viralen Infektionen im allgemeinen verwendet werden, und im besonderen kann es bei einer immunsuppressiven Virus- Infektion, beispielsweise dem erworbenen Immunschwächesyndrom (AIDS), nützlich sein.
    • Beispiel X In vivo-Stimulierung der Zahl von weißen Blutkörperchen
  • Ausgewachsenen CD-1-Mäusen wird gereinigter, rekombinanter, menschlicher CSF-1, der wie in Beispiel III beschrieben mit PEG modifiziert worden ist, in Mengen von bis zu etwa 2 mg/kg pro Dosis in unterschiedlichen Dosierungsschemata verabreicht, die von der verwendeten Präparation des PEG-Derivats von CSF-1 abhängen. Die Gesamtzahl der weißen Blutkörperchen, der Neutrophilen, Monocyten und Lymphocyten werden bestimmt. Erhöhungen in jedem beliebigen dieser Parameter können in der klinischen oder veterinären Medizin zur Stimulierung der Granulocyten- oder Monocyten-Produktion und zur Erhöhung der Zahl der weißen Blutkörperchen von Nutzen sein.
    • Beispiel XI Das PEG-Derivat von CSF-1 in der Wundheilung
  • Das PEG-Derivat von CSF-1 wird auf Wundheilung unter Verwendung von Tiermodellen und Protokollen getestet, beispielsweise dem Goretex-Miniatur-Wundheilungsmodel von Goodson und Hunt, J. Surg. Res. 33 (1982), 394, in dem implantierte Goretex-Röhrchen sich mit eindringenden Makrophagen, Fibroblasten und anderen Bindegewebszellen und Collagen- und Fibrin-Ablagerungen füllen. Die Heilung wird durch mikroskopische Untersuchung des Röhrcheninhalts beurteilt. Ein zweites Model ist das Einschnitt-Wundheilungs- Modell von Eisenger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 1937, in dem Wunden visuell beobachtet und Trokarbiopsien durchgeführt werden, um die Heilung, Zelldichte und Zahl der aus Haarfollikeln hervorgehenden Zellschichten der Epidermis zu überwachen. Am Ende des Experiments wird auch die Festigkeit der Wunde gegen Aufbrechen bestimmt. Ein drittes Modell ist ein Serosa-Modell, beispielsweise die Hitze-geschädigte Darm-Serosa von Fotev et al., J. Pathol. 151 (1987), 209, in dem die Heilung in festgelegten Abschnitten durch den Grad der erneuten Oberflächenbildung des Mesothels der verwundeten Stelle beurteilt wird. Die Lehren jedes dieser Modelle sind durch Bezugnahme hier mit eingeschlossen.
  • Üblicherweise wird der mit PEG modifizierte CSF-1 auf die Stelle der Wunde aufgetragen, indem ein nicht-klebender Wundverband unter sterilen Bedingungen mit Mengen des PEG- Derivats von CSF-1 von bis zu 1 000 000 E/ml in Kochsalzlösung getränkt wird, wie es in der Veröffentlichung über das Einschnitt-Wundheilungs-Modell unter Verwendung des von Epidermiszellen stammenden Faktors (EDF) für lokale Wunden beschrieben ist. In einer anderen Ausführungsform werden ähnliche Mengen des PEG-Derivats von CSF-1 vor einer anstehenden Implantation in Goretex-Röhrchen eingeführt, wie es von Goodson und Hunt, ebenda, beschrieben ist, oder der mit PEG modifizierte CSF-1 kann auch in eine Matrix mit verzögerter Freisetzung eingeschlossen und am Wundort aufgebracht werden (in Goretex-Röhrchen, in oder unter den Wundauflagen, oder durch Injektion in die Serosa-Höhle) oder das PEG-Derivat von CSF-1 wird systemisch (i.v., i.p. oder s.c.) in Dosen von bis zu 1000 ug/kg/Tag verabreicht.
  • Die Heilungsrate wird bei jedem Modell gemessen und die Gewebereparatur in Gegenwart und in Abwesenheit des PEG- Derivats von CSF-1 bewertet.
  • Das PEG-Derivat von CSF-1 kann auch in Kombination mit anderen Wachstumsfaktoren zur Förderung der Wundheilung verwendet werden, beispielsweise mit EDF, dem Epidermis-Wachstumsfaktor (EGF), Fibroblasten-Wachstumsfaktor (basischer und saurer FGF), mit dem von Blutplättchen stammenden Wachstumsfaktor (PDGF) oder den transformierenden Wachstumsfaktoren (TGF alpha und beta), mit IL-1 und anderen Substanzen, beispielsweise Somatomedin C und Vitamin C.
    • Beispiel XII Herstellung des PEG-Derivats von LCSF A. Konjugation
  • PEG"-11000 wurde wie in Beispiel IA beschrieben hergestellt. CSF-1 (LCSF/N 3C 221) wurde gemäß Züchtungs-, Reinigungs- und Faltungsverfahren hergestellt, die in der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 88/08003, veröffentlicht am 20. Oktober 1988, offenbart sind. 5 mg LCSF wurden in 50 mM NaCl enthaltendem Hepes-Puffer, pH-Wert 7,5, dialysiert. Das PEG"-11000 wurde in einem 6fachen molaren Überschuß über das LCSF-Dimer zugesetzt. Das trockene aktivierte PEG wurde bei 20ºC unter Rühren der 2 mg/ml LCSF-Lösung zugesetzt. Aliquots des Reaktionsgemisches wurden in Abständen von 10 Minuten durch Größenausschluß-HPLC (SEC) auf einem Zorbax GF250 (Dupont) analysiert. Die Umsetzung wurde durch Zusatz eines 10fachen Überschusses von ε-Aminocaproat über PEG beendet. Tabelle VIII zeigt Daten des NFS 60-Biotests der PEG-LCSF-Reaktionsgemische.
  • 2 mg/ml M-CSF enthaltende Proben wurden mit 12 mg/ml BSA enthaltender PBS verdünnt und im NFS 60-Test analysiert. Die Werte stellen den Mittelwert einer doppelten Bestimmung dar, die bei Verdünnungsreihen jeder Probe durchgeführt wurde. Tabelle VIII NFS-Biotest von PEG-LCSF/N 3C 221 Probe E/ml CSF-1-Aktivität Ausgangsmaterial
  • Eine Größenausschluß-Analyse der Modifizierungsreaktion mit PEG zeigte nach einer Umsetzung von 30 Minuten zwei Hauptmolekülarten von PEG-CSF. Ihre Größen stimmten mit einer Derivatbildung von ungefär 1 und 2 Mol PEG pro Mol CSF-1-Dimer überein. Das SEC-Profil nach 45 Minuten zeigte an, daß die Umsetzung nach etwa 30 Min. vollständig war.
    • B. Trennung von PEG-LCSF von nicht-modifiziertem LCSF
  • Die Probe wurde mit 1 M Tris-HCl auf einen pH-Wert von 8,3 eingestellt, zur Reduktion der Salzkonzentration auf 30 mM diafiltriert und auf eine 75 x 7,5 mm Bio-Gel "TSK-DEAE- 5-PW"-HPLC-Säule aufgetragen. Die Säule wurde in 30 mM Tris- HCl, pH-Wert 8,5, äquilibriert und 40 Minuten mit einem Gradienten von 0 bis 0,6 M NaCl entwickelt. Sämtliche Puffer wurden mit pyrogenfreiem Wasser hergestellt, das HPLC-System zuvor mit 0,1 H NaOH und mit 50 % Ethanol gewaschen, um Endotoxin zu entfernen. Fraktionen aus der Säule wurden durch SDS-PAGE analysiert. Mit PEG modifizierte Moleküle eluierten vor dem nicht-modifizierten CSF-1 aus der Säule. Einige PEG-CSF erschienen ebenfalls im Durchlauf der Säule und dieses Material band auch nicht bei einem erneuten Durchtritt durch die Säule. Die nicht-gebundene Fraktion enthielt auch freigesetztes NHS-Anion.
    • Weitere Ausführungsformen
  • Die hier beschriebene Umsetzung kann auch unter Verwendung von Polyvinylalkohol oder eienm polyoxyethylierten Polyol durchgeführt werden. Ein aktiver POG-CSF-1 kann wie nachstehend beschrieben hergestellt werden.
  • Polyoxyethyliertes Glycerin (POG) mit einem Molekulargewicht von 5000 ist bei Polysciences erhältlich. 10 g POG können 2,28 g Glutaranhydrid (ein 10facher Überschuß über POG) zugesetzt werden. Das Gemisch kann zwei Stunden bei 110ºC gerührt und gekühlt werden. Dies kann in 20 ml CHCl&sub3; gelöst und langsam in 500 ml Ether gegossen werden, wobei stark gerührt wird. Das Produkt kann gesammelt und mit Ether gespült werden, wobei etwa 90 % POG-Glutarat- Produkt erhalten werden. Dieses Produkt kann mit N-Hydroxysuccinimid, wie in Beispiel IA beschrieben, umgesetzt werden, wobei der aktive Ester POG-Glutaryl-N-Hydroxysuccinimid (POG*) erhalten wird. Anschließend kann eines der vorstehend beschriebenen CSF-1-Proteine mit POG* umgesetzt werden.
  • Mit Nitril substituierter Polyvinylalkohol kann ebenfalls verwendet werden, um einen aktivierten Polyvinylalkohol zur Konjugation an das CSF-1 herzustellen.
    • Hinterlegungen
  • Die nachstehend beschriebenen Kulturen, die ausführlicher in der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 86/04607 und der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 0 272 779 beschrieben sind, wurden bei der Cetus Master Culture Collection (CMCC), 1400 Fifty-Third Street, Emeryville, CA 94608 USA, und der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 USA, hinterlegt. Die CMCC- und ATCC-Hinterlegungsnummern und die ATCC- Hinterlegungsdaten der hinterlegten Proben sind: Bezeichnung der Kultur CMCC-Nr. ATCC-Nr. ATCC-Hinterlegungsdatum Phage in E.coli DG98 pHCSF-1 2 Charon 4A CSF-17 in E.coli MM294
  • Die vorstehend beschriebenen Hinterlegungen wurden nach den Bestimmungen eines Vertrags zwischen der ATCC und dem Inhaber dieser Patentanmeldung, der Cetus Corporation, vorgenommen. Der Vertrag mit der ATCC stellt die dauernde Zugänglichkeit der Nachkommenschaft dieser Plasmide und der Zellinie für die Öffentlichkeit sicher, nach Erteilung des US-Patentes, das die Hinterlegung beschreibt und identifiziert, oder den Veröffentlichungen oder nach der Offenlegung einer jeden US- oder ausländischen Patentanmeldung, welche auch immer zuerst erfolgt, und die Verfügbarkeit der Nachkommenschaft dieser plasmide und der Zellinie gegenüber dem, der durch Bestimmung des Präsidenten des US-Patentamtes dazu berechtigt ist, nach 35 USC Paragraph §122 und den dazu gehörigen Vorschriften des Präsidenten (einschließlich 37 CFR Paragraph §1.14 unter besonderer Bezugnahme auf 886 OG 638). Der Rechtsnachfolger der vorliegenden Anmeldung hat zugestimmt, daß, falls die hinterlegten Plasmide und die Zellinie absterben, verloren gehen oder vernichtet werden, wenn sie unter geeigneten Bedingungen gezüchtet wurden, sie nach Benachrichtigung sofort mit einer lebensfähigen Kultur der gleichen Plasmide und Zellinie zu ersetzen.
  • Faßt man zusammen, so soll die vorliegende Erfindung unterschiedliche rekombinante CSF-1-Moleküle bereitstellen, die unter Verwendung von unterschiedlichen chemischen Linkern mit wasserlöslichen Polymeren unterschiedlicher Größen selektiv Derivate gebildet haben. Die Derivatbildung des CSF-1 erhöht das relative Molekulargewicht des CSF-1 und erhöht seine Halbwertszeit in vivo im Plasma von Ratten. Die Derivatbildung kann auch die Löslichkeit des CSF-1 im wäßrigen Medium bei einem physiologischen pH-Wert erhöhen und seine Immunogenität durch Verringerung oder Beseitigung einer Zusammenlagerung oder durch Abschirmung seiner antigenen Determinanten verringern.
  • Die vorstehende schriftliche Beschreibung wird für ausreichend gehalten, einem Fachmann die Nacharbeitung der Erfindung zu ermöglichen. Der Schutzbereich der vorliegenden Erfindung soll durch die hinterlegten Kulturen nicht eingeschränkt werden, da die hinterlegten Ausführungsformen lediglich eine einzige Veranschaulichung eines erfindungsgemäßen Gesichtspunktes sein sollen, und alle funktionell äquivalenten Kulturen sind im Schutzbereich der Erfindung.
  • Die hier vorgenommene Hinterlegung von Materialien ist kein Eingeständnis, daß die hier enthaltene schriftliche Beschreibung unzureichend ist, um die Nacharbeitbarkeit jedes erfindungsgemäßen Gesichtspunktes zu ermöglichen, einschließlich der besten Ausführungsform.

Claims (20)

1. Biologisch aktives Protein, das die primäre Bildung von Macrophagenkolonien in dem in vitro-Test für Koloniestimulierenden Faktor-1 (CSF-1) stimuliert, wobei das Protein kovalent an ein wasserlösliches Polymer konjugiert ist, ausgewählt aus Polyethylen- oder Polypropylen-Glykol-Homopolymeren, polyoxyethylierten Polyolen und Polyvinylalkohol, wobei das Homopolymer nicht substituiert ist oder an einem Ende mit einem Alkylrest substituiert ist.
2. Konjugiertes Protein nach Anspruch 1, wobei das Protein ein natürlicher menschlicher CSF-1 oder ein Maus-CSF-1 ist.
3. Konjugiertes Protein nach Anspruch 1, wobei das Protein ein rekombinanter menschlicher CSF-1 ist, wobei gegebenenfalls das Protein rekombinant in Bakterien exprimiert und ein Homodimer mit einer vorhergesagten Aminosäuresequenz ist, ausgewählt aus LCSF/C 150 bis C 464; Tyr&sub5;&sub9;LCSF/C 150 bis C 464; SCSF/C 150 bis C 166; Asp&sub5;&sub9;SCSF/C 150 bis C 166; und den Gln&sub5;&sub2;-Muteinen und N 2- und N 3-Muteinen davon, wobei LCSF codiert wird von der in Figur 2 als Aminosäuren 1-522 gezeigten Sequenz und SCSF codiert wird von der in Figur 1 die Aminosäuren 1-224 gezeigten Sequenz.
4. Konjugiertes Protein nach Anspruch 3, wobei das Protein ausgewählt ist aus:
(a) Homodimeren mit einer vorhergesagten Aminosäuresequenz ausgewählt aus
LCSF/C 150; Tyr&sub5;&sub9;LCSF/C 150; LCSF/C 190;
Tyr&sub5;&sub9;LCSF/C 190; LCSF/C 191; Tyr&sub5;&sub9;LCSF/C 191;
LCSF/C 221; Tyr&sub5;&sub9;LCSF/C 221; LCSF/C 223;
Tyr&sub5;&sub9;LCSF/C 223; LCSF/C 236, Tyr&sub5;&sub9;CSF/C 236;
LCSF/C 238; Tyr&sub5;&sub9;LCSF/C 238; LCSF/C 249;
Tyr&sub5;&sub9;LCSF/C 249; LCSF/C 258; Tyr&sub5;&sub9;LCSF/C 258;
LCSF/C 411; Tyr&sub5;&sub9;LCSF/C 411; LCSF/C 464;
Tyr&sub5;&sub9;LCSF/C 464; SCSF/C 150; SCSF/C 153; SCSF/C 158;
den entsprechenden Asp&sub5;&sub9;SCSFs; und den Gln&sub5;&sub2;-Muteinen und N 2- und N 3-Muteinen davon;
(b) Homodimeren, die von einer Sequenz codiert werden ausgewählt aus LCSF/C 150, LCSF/C 190, LCSF/C 221, Tyr&sub5;&sub9;LCSF/C 150, Tyr&sub5;&sub9;LCSF/CW190, Tyr&sub5;&sub9;LCSF/C 221; SCSF/C 158, SCSF/C 150, Asp&sub5;&sub9;SCSF/C 158; Asp&sub5;&sub9;SCSF/C 150; und den N 2- und N 3-Muteinen davon;
(c) Homodimeren, die von einer Sequenz codiert werden, ausgewählt aus
SCSF/C 150, Asp&sub5;&sub9;SCSF/C 150, SCSF/N 3C 150,
Asp&sub5;&sub9;SCSF/N 3C 150, SCSF/N 3C 158,
Asp&sub5;&sub9;SCSF/N 3C 158, Asp&sub5;&sub9;SCSF/N 2C 150 und
Asp&sub5;&sub9;SCSF/N 2C 158.
5. Konjugiertes Protein nach Anspruch 1, wobei das Protein ein in einem eukaryontischen Wirt exprimierter und davon sezernierter menschlicher CSF-1 ist, gegebenenfalls ein Dimer, codiert von einer Sequenz, ausgewählt aus:
LCSF/C 150; Tyr&sub5;&sub9;LCSF/C 150; LCSF/C 190; Tyr&sub5;&sub9;LCSF/C 190;
LCSF/C 191; Tyr&sub5;&sub9;LCSF/C 191; LCSF/C 221; Tyr&sub5;&sub9;LCSF/C 221;
LCSF/C 223; Tyr&sub5;&sub9;LCSF/C 223; LCSF/C 236; Tyr&sub5;&sub9;LCSF/C 236;
LCSF/C 238; Tyr&sub5;&sub9;LCSF/C 238; LCSF/C 249; Tyr&sub5;&sub9;LCSF/C 249;
LCSF/C 258; Tyr&sub5;&sub9;LCSF/C 258; LCSF/C 411; Tyr&sub5;&sub9;LCSF/C 411;
LCSF/C 464; Tyr&sub5;&sub9;LCSF/C 464; SCSF/C 150; SCSF/C 153;
SCSF/C 158; den entsprechenden Asp&sub5;&sub9;SCFSs; und den Gln&sub5;&sub2;-Muteinen davon.
6. Konjugiertes Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Polymer ein durchschnittliches Molekulargewicht von etwa 1000 bis 100 000 Daltons, gegebenenfalls 4000 bis 40 000 Daltons hat.
7. Konjugiertes Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Polymer ein nicht-substituiertes Polyethylenglykol-Homopolymer, ein Monomethylpolyethylenglykol-Homopolymer oder ein polyoxyethyliertes Glycerin ist.
8. Konjugiertes Protein nach Anspruch 1, wobei das Protein ein rekombinantes Heterodimer ist, bestehend aus einer Untereinheit, die einen Cysteinrest mit einer freien Sulfhydrylgruppe enthält, die mit dem Polymer reagiert.
9. Konjugiertes Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Polymer an das Protein über eine Reaktion mit dem aktiven Ester einer Carbonsäure oder von Kohlensäure des Polymers oder durch eine Urethanbindung konjugiert ist.
10. Konjugiertes Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Protein entweder
(a) konjugiert ist über 1 bis 3 freie Aminogruppen davon und das Polymer eine N-Hydroxysuccinimidester-, p- Nitrophenylester- oder 4-Hydroxy-3-nitrobenzolsulfonsäureestergruppe enthält, die mit den freien Aminogruppen des Proteins reagiert, wobei sich die konjugierte(n) Aminogruppe(n) gegebenenfalls in einem Lysinrest oder in Lysinresten oder der N-terminalen Aminosäure oder in einer Kombination davon befinden; oder
(b) konjugiert ist über einen oder mehrere Cysteinrest(e) und das Polymer eine Maleimido- oder Haloacetyl-Gruppe enthält, die mit der freien Sulfhydrylgruppe des Cysteinrests reagiert; oder
(c) glykosyliert ist und an das Polymer konjugiert ist über mindestens eine der Kohlenhydrateinheiten des Proteins und das Polymer eine Amino-, Hydrazin- oder Hydrazidgruppe enthält, die mit den durch Oxidation der Kohlenhydrateinheiten gebildeten freien Aldehyden reagiert; wobei das Protein gegebenenfalls ein dimeres Produkt eines rekombinanten CSF-1-Clons ist, das in einer eukaryontischen Wirtszelle rekombinant exprimiert wird, z.B. in Säuger-, Insekten-, Hefe- oder Pilzzellen.
11. Konjugiertes Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei-pro Mol CSF-1-Dimer zwischen 1 und 3 Mol Polymer, einschließlich, enthalten sind.
12. Konjugiertes Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das kovalent konjugierte Protein im wesentlichen rein ist und erhalten wird durch Ammoniumsulfat-Fraktionierung.
13. Pharmazeutisches Präparat, enthaltend eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, gelöst in einem pharmazeutisch verträglichen wäßrigen Trägermedium.
14. Präparat nach Anspruch 13, wobei das Protein zurückgefaltet ist und in vitro gereinigt und das Produkt eines rekombinanten CSF-1-Clones ist, der rekombinant in Bakterien exprimiert wird, wobei das Protein gegebenenfalls ein biologisch aktives, zurückgefaltenes CSF-1-Dimer ist mit einem Endotoxingehalt von weniger als 1,0 ng/mg CSF- 1 und im wesentlichen frei ist von Pyrogenen.
15. Verfahren zur Herstellung eines konjugierten Proteins, wobei das Protein die primäre Bildung von Makrophagenkolonien in dem in vitro-Test für Kolonie-stimulierenden Faktor-1 (CSF-1) stimuliert, umfassend:
(a) Bereitstellung eines wasserlöslichen Polymers mit mindestens einer terminalen reaktiven Gruppe, wobei das Polymer ausgewählt ist aus Polyethylen- oder Polypropylenglykol-Homopolymeren, polyoxyethylierten Polyolen und Polyvinylalkohol, wobei das Homopolymer nicht substituiert ist oder an einem Ende mit einem Alkylrest substituiert ist;
(b) Umsetzung des Proteins mit der reaktiven Gruppen des Polymers, so daß das Polypeptid biologisch aktiv und selektiv konjugiert wird; und
(c) Reinigung des konjugierten Proteins, gegebenenfalls durch Ammoniumsulfat-Fraktionierung.
16. Verfahren nach Anspruch 15, weiterhin definiert durch das (die) spezifische(n) Merkmal(e) nach einem oder mehreren der Ansprüche 2 bis 12.
17. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, wobei das Protein über eine bis drei freie Aminogruppen davon konjugiert ist und das Polymer eine N-Hydroxysuccinimidester, p- Nitrophenylester- oder 4-Hydroxy-3-nitrobenzolsulfonsäureestergruppe enthält, die mit den freien Aminogruppen des Proteins reagiert, wobei sich die Aminogruppe(n) gegebenenfalls in einem Lysinrest oder in Lysinresten oder in der N-terminalen Aminosäure oder einer Kombination davon befindet und Schritt (b) bei einem pH-Wert von 7 bis 9 ausgeführt wird.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, das außerdem nach Schritt (c) den Schritt der Formulierung des Proteins in einem pharmazeutisch verträglichen wäßrigen Trägermedium umfaßt.
19. Verwendung eines wie in einem der Ansprüche 1 bis 12 definierten konjugierten Proteins bei der Herstellung eines Medikaments.
20. Verwendung nach Anspruch 19, wobei das Medikament zur Prophylaxe oder zur therapeutischen Behandlung von Infektionskrankheiten bei Säugern oder zur Behandlung von Tumorbelastungen bei Säugern ist.
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