JP3280016B2 - ポリマーとコロニー刺激因子‐１との接合体 - Google Patents
ポリマーとコロニー刺激因子‐１との接合体Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は生物学的に活性なコロニー刺激因子−１（CS
F−１）の化学修飾に関し、この化学修飾はこの蛋白質
の化学的及び／又は生理学的性質を変更するものであ
る。さらに詳しくは、本発明はポリマーへのCSF−１の
選択的接合による哺乳類での該蛋白質の循環半減期の増
加に関する。
F−１）の化学修飾に関し、この化学修飾はこの蛋白質
の化学的及び／又は生理学的性質を変更するものであ
る。さらに詳しくは、本発明はポリマーへのCSF−１の
選択的接合による哺乳類での該蛋白質の循環半減期の増
加に関する。
コロニー刺激因子−１（CSF−１）（Μ−CSFとしても
知られている）は、半固体培地中にプレートされた骨髄
細胞によるコロニーの形成を刺激することができる幾つ
かの蛋白質の内の１つである。CSF−１は、主としてマ
クロファージコロニーの形成を刺激するその能力により
他のコロニー刺激因子から区別される。他のCSFは、好
中顆粒球とマクロファージ、もっぱら好中顆粒球、又は
好中顆粒球及び好酸顆粒球並びにマクロファージ、から
成るコロニーの生産を刺激する。これらのCSFの総説はD
exter,T.M.Nature（1984）309;746,及びVabas,M.A.J.Im
munol.（1983）130;793により発表されている。現在、C
SF−１活性に特異的であることが知られている日常的イ
ンビボ測定は存在しない。
知られている）は、半固体培地中にプレートされた骨髄
細胞によるコロニーの形成を刺激することができる幾つ
かの蛋白質の内の１つである。CSF−１は、主としてマ
クロファージコロニーの形成を刺激するその能力により
他のコロニー刺激因子から区別される。他のCSFは、好
中顆粒球とマクロファージ、もっぱら好中顆粒球、又は
好中顆粒球及び好酸顆粒球並びにマクロファージ、から
成るコロニーの生産を刺激する。これらのCSFの総説はD
exter,T.M.Nature（1984）309;746,及びVabas,M.A.J.Im
munol.（1983）130;793により発表されている。現在、C
SF−１活性に特異的であることが知られている日常的イ
ンビボ測定は存在しない。
CSF−１は天然源から精製されている〔例えば、Csejt
eyら、Biochem.Biophys.Res.Comm.（1986）138:238;及
び部分的アミノ酸決定を可能にする天然CSF−１のイム
ノアフィニティークロマトグラフィーに関する1986年８
月14日に公開されたPCT公開No.WO 86/04587を参照のこ
と〕。CSF−１はまた、２つの見かけ上関連しているcDN
Aクローン、すなわち（１）32個のアミノ酸のシグナル
配列により先行される224個のアミノ酸のモノマー蛋白
質をコードする「短い」形〔Kawasakiら、Science（198
5）230:292−296〕；及び（２）やはり32個のアミノ酸
のシグナル配列により先行される522個のアミノ酸のモ
ノマー蛋白質をコードする「長い」形を用いて組換DNA
から製造されている。この長い形は、1988年６月29日に
公開されたヨーロッパ特許出願公開No.0272779及びLadn
erらEMBO J.（1987）６:2693（それぞれ引用により本明
細書に組み入れる）；並びにWongらScience（1987）23
5:1504−1509及び1987年11月９日に公開されたPCT WO 8
7/06954に開示されているように、２つのグループによ
りクローニングされそして発現されている。（これらの
２つのクローンのDNA及びアミノ酸配列はそれぞれ第１
図及び第２図に示される。）CSF−１の長い形及び短い
形の両者はClark及びKamen,Science（1987）236:1229−
1237により記載されている。32個のアミノ酸のシグナル
配列により先行される406個のアミノ酸のモノマー蛋白
質をコードする「中間」形も最近報告されている〔Cerr
ettiら（1988）Mol.Immunol.25:761−770〕。
eyら、Biochem.Biophys.Res.Comm.（1986）138:238;及
び部分的アミノ酸決定を可能にする天然CSF−１のイム
ノアフィニティークロマトグラフィーに関する1986年８
月14日に公開されたPCT公開No.WO 86/04587を参照のこ
と〕。CSF−１はまた、２つの見かけ上関連しているcDN
Aクローン、すなわち（１）32個のアミノ酸のシグナル
配列により先行される224個のアミノ酸のモノマー蛋白
質をコードする「短い」形〔Kawasakiら、Science（198
5）230:292−296〕；及び（２）やはり32個のアミノ酸
のシグナル配列により先行される522個のアミノ酸のモ
ノマー蛋白質をコードする「長い」形を用いて組換DNA
から製造されている。この長い形は、1988年６月29日に
公開されたヨーロッパ特許出願公開No.0272779及びLadn
erらEMBO J.（1987）６:2693（それぞれ引用により本明
細書に組み入れる）；並びにWongらScience（1987）23
5:1504−1509及び1987年11月９日に公開されたPCT WO 8
7/06954に開示されているように、２つのグループによ
りクローニングされそして発現されている。（これらの
２つのクローンのDNA及びアミノ酸配列はそれぞれ第１
図及び第２図に示される。）CSF−１の長い形及び短い
形の両者はClark及びKamen,Science（1987）236:1229−
1237により記載されている。32個のアミノ酸のシグナル
配列により先行される406個のアミノ酸のモノマー蛋白
質をコードする「中間」形も最近報告されている〔Cerr
ettiら（1988）Mol.Immunol.25:761−770〕。
CSF−１の長い形及び短い形をコードするDNAは、ゲノ
ム性CSF−１コードDNAのエクソン６の上流部分の可変的
スプライシング連結から生ずるらしい。CSF−１がある
種の真核細胞において長いか又は短いcDNA形から発現さ
れる場合、このものはダイマー糖蛋白質として分泌さ
れ、そしてＣ−末端において多様にプロセシングされ、
そして／又は多様にグリコシル化されるようである。従
って、還元されたモノマー形がウエスタン分析にかけら
れる時、種々の分子量のCSF−１蛋白質が見出される。
ム性CSF−１コードDNAのエクソン６の上流部分の可変的
スプライシング連結から生ずるらしい。CSF−１がある
種の真核細胞において長いか又は短いcDNA形から発現さ
れる場合、このものはダイマー糖蛋白質として分泌さ
れ、そしてＣ−末端において多様にプロセシングされ、
そして／又は多様にグリコシル化されるようである。従
って、還元されたモノマー形がウエスタン分析にかけら
れる時、種々の分子量のCSF−１蛋白質が見出される。
長い形及び短い形のアミノ酸配列は、単離されたクロ
ーンのDNA配列から及びそれらとゲノム配列との関連性
により予想されるように、シグナルペプチドの開裂の後
のＮ−末端における最初の149アミノ酸において同一で
あり、そしてその後、アミノ酸150をコードするコドン
の前の追加の894bp断片（298個の追加のアミノ酸をコー
ドする）の長いクローンにおける挿入の結果として異
る。従って、遺伝子の短い形及び長い形の両者は、Ｃ−
末端及びＮ−末端において同一の配列の領域をコードす
る。成熟短形の最初の145又は147個のアミノ酸（1988年
３月30日に公開されたヨーロッパ特許出願公開No.02615
92;Cerrettiら、前掲）、又は成熟長形の最少の190又は
221アミノ酸、のみをコードする短縮されたcDNAが真核
細胞中で発現される場合、生物学的に活性な蛋白質が回
収されている。
ーンのDNA配列から及びそれらとゲノム配列との関連性
により予想されるように、シグナルペプチドの開裂の後
のＮ−末端における最初の149アミノ酸において同一で
あり、そしてその後、アミノ酸150をコードするコドン
の前の追加の894bp断片（298個の追加のアミノ酸をコー
ドする）の長いクローンにおける挿入の結果として異
る。従って、遺伝子の短い形及び長い形の両者は、Ｃ−
末端及びＮ−末端において同一の配列の領域をコードす
る。成熟短形の最初の145又は147個のアミノ酸（1988年
３月30日に公開されたヨーロッパ特許出願公開No.02615
92;Cerrettiら、前掲）、又は成熟長形の最少の190又は
221アミノ酸、のみをコードする短縮されたcDNAが真核
細胞中で発現される場合、生物学的に活性な蛋白質が回
収されている。
１）生来のＮ−末端及び成熟蛋白質のアミノ酸150に
おけるＣ−末端、並びに２）Ｎ−末端の最初のアミノ酸
を除去するための短縮及び成熟蛋白質のアミノ酸150に
おけるＣ−末端、を含む蛋白質をコードするように、最
初Kawasakiら、Science（1985）230:291により記載され
た短クローンcDNAを変更することにより、組換CSF−１
が大腸菌で発現された。これらの蛋白質は精製されそし
てホモダイマーを形成するように再生（refold）され、
そしてサイズ排除高速液体クロマトグラフィーにおいて
それぞれ約43,000及び40,000の見かけ分子量を有するこ
とが見出された。発現された蛋白質のＣ−末端がアミノ
酸150又は158でありそしてＮ−末端の３個までのアミノ
酸が除去されるように変形されたCSF−１蛋白質も調製
されている。
おけるＣ−末端、並びに２）Ｎ−末端の最初のアミノ酸
を除去するための短縮及び成熟蛋白質のアミノ酸150に
おけるＣ−末端、を含む蛋白質をコードするように、最
初Kawasakiら、Science（1985）230:291により記載され
た短クローンcDNAを変更することにより、組換CSF−１
が大腸菌で発現された。これらの蛋白質は精製されそし
てホモダイマーを形成するように再生（refold）され、
そしてサイズ排除高速液体クロマトグラフィーにおいて
それぞれ約43,000及び40,000の見かけ分子量を有するこ
とが見出された。発現された蛋白質のＣ−末端がアミノ
酸150又は158でありそしてＮ−末端の３個までのアミノ
酸が除去されるように変形されたCSF−１蛋白質も調製
されている。
小蛋白質（約70kd未満）はしばしば、静脈内注射の後
血中で比較的短い半減期を有する。薬物の循環からの急
速なクリアランスはしばしばその効力を低下せしめる。
所望の療法効果を維持しながらより少量のポリペプチド
又はより低頻度の注射が投与されるように循環ペプチド
の半減期を延長することがしばしば望ましい。その生体
内半減期を変更し、その免疫原性を低下せしめ、又はそ
れが生体内に導入された場合に生ずるかもしれない蛋白
質の凝集減少もしくは除去するであろうCSF−１蛋白質
の修飾が望ましいであろう。この様な修飾には、実質的
に直鎖のポリマー、例えばポリエチレングリコール（PE
G）、ポリプロピレングリコール（PPG）、デキストラン
又はポリビニルアルコールによる修飾が含まれる。
血中で比較的短い半減期を有する。薬物の循環からの急
速なクリアランスはしばしばその効力を低下せしめる。
所望の療法効果を維持しながらより少量のポリペプチド
又はより低頻度の注射が投与されるように循環ペプチド
の半減期を延長することがしばしば望ましい。その生体
内半減期を変更し、その免疫原性を低下せしめ、又はそ
れが生体内に導入された場合に生ずるかもしれない蛋白
質の凝集減少もしくは除去するであろうCSF−１蛋白質
の修飾が望ましいであろう。この様な修飾には、実質的
に直鎖のポリマー、例えばポリエチレングリコール（PE
G）、ポリプロピレングリコール（PPG）、デキストラン
又はポリビニルアルコールによる修飾が含まれる。
例えば、米国特許No.4,261,973は、免疫原性アレルゲ
ン分子と非免疫原性水溶性ポリマー、例えばPEG又はポ
リビニルアルコールによる該アレルゲンの免疫原性を減
少することを記載している。米国特許No.4,301,144は、
ヘモクロビンのPEG,PPG、エチレングリコールとプロピ
レングリコールとのコポリマー、又はこのようなポリマ
ーのエーテル、エステルもしくは脱水生成物への接合に
よる該ヘモグロビン分子の酸素運搬能力の増加を記載し
ている。米国特許No.4,609,546はペプチド又は糖蛋白質
例えばコロニー刺激因子とポリオキシエチレン−ポリオ
キシプロピレンコポリマーとの接合が生理的活性の持続
を増加させ得ることを記載している。この態様において
試験された蛋白質は、易水溶性の酵素類及び生来のイン
ターフェロンのみである。1986年７月17日に公開された
PCT WO 86/04145は、Fc受容体への結合を減少せしめる
ための抗体のPEG修飾を記載している。米国特許No.4,17
9,937は、所望の生理活性を実質的に維持しながらポリ
ペプチドの免疫原性を低下せしめるために、酵素及びイ
ンシュリンのごとき水溶性ポリペプチドとPEG又はPPGと
の接合を記載している。1985年９月11日に公開された武
田薬品工業のEP 154,316は、リンホカインの少なくとも
１個の一級アミノ基に直接結合したPEGを含有するIL−
２のごとき化学的に修飾されたリンホカインを開示し、
そしてクレームしている。さらにKatreら、Proc.Natl.A
cad.Sci.（1987）84:1487はPEGによるIL−２の修飾を記
載している。
ン分子と非免疫原性水溶性ポリマー、例えばPEG又はポ
リビニルアルコールによる該アレルゲンの免疫原性を減
少することを記載している。米国特許No.4,301,144は、
ヘモクロビンのPEG,PPG、エチレングリコールとプロピ
レングリコールとのコポリマー、又はこのようなポリマ
ーのエーテル、エステルもしくは脱水生成物への接合に
よる該ヘモグロビン分子の酸素運搬能力の増加を記載し
ている。米国特許No.4,609,546はペプチド又は糖蛋白質
例えばコロニー刺激因子とポリオキシエチレン−ポリオ
キシプロピレンコポリマーとの接合が生理的活性の持続
を増加させ得ることを記載している。この態様において
試験された蛋白質は、易水溶性の酵素類及び生来のイン
ターフェロンのみである。1986年７月17日に公開された
PCT WO 86/04145は、Fc受容体への結合を減少せしめる
ための抗体のPEG修飾を記載している。米国特許No.4,17
9,937は、所望の生理活性を実質的に維持しながらポリ
ペプチドの免疫原性を低下せしめるために、酵素及びイ
ンシュリンのごとき水溶性ポリペプチドとPEG又はPPGと
の接合を記載している。1985年９月11日に公開された武
田薬品工業のEP 154,316は、リンホカインの少なくとも
１個の一級アミノ基に直接結合したPEGを含有するIL−
２のごとき化学的に修飾されたリンホカインを開示し、
そしてクレームしている。さらにKatreら、Proc.Natl.A
cad.Sci.（1987）84:1487はPEGによるIL−２の修飾を記
載している。
他の多くの参考文献が、蛋白質、例えばα−１−プロ
テイナーゼインヒビター、アスパラジナーゼ、ウリカー
ゼ、スーパーオキサイドディスムターゼ、ストレプトキ
ナーゼ、プラスミノーゲン活性化因子、IgG、アルブミ
ン、リポプロテインリパーゼ、西洋ワサビパーオキシダ
ーゼ、カタラーゼ、アルギノーゼ及びアスパラギナー
ゼ、並びにペプチドのPEG誘導体化の概念を開示してい
る。リジンを介してこれらの誘導体化は、半減期を改善
し、免疫原性を低下せしめ、溶解度を上昇せしめ、そし
て一般に効力を増強する（これは少い頻度の投与を可能
にする）ものとして報告されている。ほとんどの場合、
生体内での改善された成能を達成するために蛋白質は分
子当り複数の修飾を必要とし、そして生体外活性はこの
様な修飾により有意に低下した。
テイナーゼインヒビター、アスパラジナーゼ、ウリカー
ゼ、スーパーオキサイドディスムターゼ、ストレプトキ
ナーゼ、プラスミノーゲン活性化因子、IgG、アルブミ
ン、リポプロテインリパーゼ、西洋ワサビパーオキシダ
ーゼ、カタラーゼ、アルギノーゼ及びアスパラギナー
ゼ、並びにペプチドのPEG誘導体化の概念を開示してい
る。リジンを介してこれらの誘導体化は、半減期を改善
し、免疫原性を低下せしめ、溶解度を上昇せしめ、そし
て一般に効力を増強する（これは少い頻度の投与を可能
にする）ものとして報告されている。ほとんどの場合、
生体内での改善された成能を達成するために蛋白質は分
子当り複数の修飾を必要とし、そして生体外活性はこの
様な修飾により有意に低下した。
ポリペプチドのシステイン残基を介してのPEGによるI
L−2,IFN−β及びイムノトキシンの修飾が1987年１月15
日に公開されたPCT WO 87/00056に記載されている。
L−2,IFN−β及びイムノトキシンの修飾が1987年１月15
日に公開されたPCT WO 87/00056に記載されている。
これらの特許又は特許公開に加えて、幾つかの論文が
酵素、IgG及びアルブミンのごとき蛋白質のための修飾
剤としての活性化されたPEG又はPPGの使用の概念を記載
している。例えば、Inadaら、Biochem.and Biophys.Re
s.Comm.,122 845−850（1984）は、PEGと接合するため
のシアヌル酸塩化物を使用することにより水溶性リポプ
ロテインリパーゼを修飾してそれをベンゼンのごとき有
機溶剤に可溶性にすることを記載している。Tokahashi
ら、Biochem.and Biophys.Res.Comm,121 261−265（198
4）は、シアヌル酸塩化トリアジンを用いてPEGにより西
洋ワサビパーオキシダーゼを修飾して、該水溶性酵素を
ベンゼン中で活性で且つ可溶性にすることを記載してい
る。
酵素、IgG及びアルブミンのごとき蛋白質のための修飾
剤としての活性化されたPEG又はPPGの使用の概念を記載
している。例えば、Inadaら、Biochem.and Biophys.Re
s.Comm.,122 845−850（1984）は、PEGと接合するため
のシアヌル酸塩化物を使用することにより水溶性リポプ
ロテインリパーゼを修飾してそれをベンゼンのごとき有
機溶剤に可溶性にすることを記載している。Tokahashi
ら、Biochem.and Biophys.Res.Comm,121 261−265（198
4）は、シアヌル酸塩化トリアジンを用いてPEGにより西
洋ワサビパーオキシダーゼを修飾して、該水溶性酵素を
ベンゼン中で活性で且つ可溶性にすることを記載してい
る。
蛋白質接合反応においてポリビニルアルコール（PV
A）の使用を開示している特許及び特許公開には、ベン
ジルペニシリンとPVAとの接合に関する米国特許No.4,29
6,097及びNo.4,430,260;α−１−プロテイナーゼインヒ
ビターとヘパリン、PVA又はPEGのごときポリマーとの接
合に関する米国特許No.4,496,689（EP 147,761）；ヘモ
グロビンとキャリヤーとしてのPVAとの非共有結合を開
示している1985年５月22日に公開されたEP 142,125;蛋
白質にカップリングした架橋されていない水不溶性PVA
に関するDE 2312615（Exploa−tering AB TBF）；並び
にPVAとヒトヘモグロビンＡとの接合に関する1985年５
月23日に公開されたDE 3,340,592が含まれる。
A）の使用を開示している特許及び特許公開には、ベン
ジルペニシリンとPVAとの接合に関する米国特許No.4,29
6,097及びNo.4,430,260;α−１−プロテイナーゼインヒ
ビターとヘパリン、PVA又はPEGのごときポリマーとの接
合に関する米国特許No.4,496,689（EP 147,761）；ヘモ
グロビンとキャリヤーとしてのPVAとの非共有結合を開
示している1985年５月22日に公開されたEP 142,125;蛋
白質にカップリングした架橋されていない水不溶性PVA
に関するDE 2312615（Exploa−tering AB TBF）；並び
にPVAとヒトヘモグロビンＡとの接合に関する1985年５
月23日に公開されたDE 3,340,592が含まれる。
蛋白質とPVAとの接合体に関する論文にはSabetら、In
dian J.Chem.Sec.A（1984）23A（５）（PVAと蛋白質と
の相互作用を開示する）、Weiら、Immunol.（1984）51
（４）:687−696（PVAに接合したトリメリチルを開示す
る）、Leeら、J.Immunol.（1981）126:414−418及びHub
bardら、J.Immunol.（1981）126:407−413（いずれもPV
Aに接合したDNPを開示する）、LeeらInt.Arch.Allergy
Appl.Immunol.（1980）63:1−13（PVAに接合したアンチ
ベンジルペニシロイルIgEを開示する）、Sehon,Prg.All
ergy（1982）32:161−202（PVAを介して接合したアレル
ゲン及びハプテンを開示する）、Holford−Strevens
ら、Int.Arch.Allergy App.Immunol.（1982）67:109−1
16（PVAと抗原／ハプテンとの接合を開示する）、並び
にSehon及びLee,Int.Arch.Allergy App.Immunol.（198
1）66（Sepp.1）,39−42頁（PVAに接合したハプテン／
アレルゲンを開示する）が含まれる。
dian J.Chem.Sec.A（1984）23A（５）（PVAと蛋白質と
の相互作用を開示する）、Weiら、Immunol.（1984）51
（４）:687−696（PVAに接合したトリメリチルを開示す
る）、Leeら、J.Immunol.（1981）126:414−418及びHub
bardら、J.Immunol.（1981）126:407−413（いずれもPV
Aに接合したDNPを開示する）、LeeらInt.Arch.Allergy
Appl.Immunol.（1980）63:1−13（PVAに接合したアンチ
ベンジルペニシロイルIgEを開示する）、Sehon,Prg.All
ergy（1982）32:161−202（PVAを介して接合したアレル
ゲン及びハプテンを開示する）、Holford−Strevens
ら、Int.Arch.Allergy App.Immunol.（1982）67:109−1
16（PVAと抗原／ハプテンとの接合を開示する）、並び
にSehon及びLee,Int.Arch.Allergy App.Immunol.（198
1）66（Sepp.1）,39−42頁（PVAに接合したハプテン／
アレルゲンを開示する）が含まれる。
PCT公開No. WO 86/04607及びWO 87/03204並びにRalph
ら、Immunobiol.（1986）172:194は、抗−感染剤、抗−
腫瘍剤又は創傷治癒剤としての使用を含む、CSF−１の
種々の潜在的用途を開示している。
ら、Immunobiol.（1986）172:194は、抗−感染剤、抗−
腫瘍剤又は創傷治癒剤としての使用を含む、CSF−１の
種々の潜在的用途を開示している。
しかしながら、これらの文献はいずれも、その循環半
減期又は効力を増加しながらその生物活性を保持するよ
うにポリマー、例えばPEG又はポリビニルアルコールに
よりCSF−１をいかに修飾するかについての詳細は開示
していない。さらに、幾つかの蛋白質は特に接合を介し
ての相互作用に一層感受性であるから、望ましい反応条
件の種類又は蛋白質修飾の程度を推定することは一般的
に不可能である。
減期又は効力を増加しながらその生物活性を保持するよ
うにポリマー、例えばPEG又はポリビニルアルコールに
よりCSF−１をいかに修飾するかについての詳細は開示
していない。さらに、幾つかの蛋白質は特に接合を介し
ての相互作用に一層感受性であるから、望ましい反応条
件の種類又は蛋白質修飾の程度を推定することは一般的
に不可能である。
従って本発明は、有用な生物活性を保持しながら生体
内半減期を延長するためにコロニー刺激因子を修飾する
ことを提供する。この修飾されたCSF−１は、未修飾CSF
−１に比べて減少したそして／又は低頻度の投与におい
て生体内で細胞を刺激するために使用することができ
る。
内半減期を延長するためにコロニー刺激因子を修飾する
ことを提供する。この修飾されたCSF−１は、未修飾CSF
−１に比べて減少したそして／又は低頻度の投与におい
て生体内で細胞を刺激するために使用することができ
る。
第二の利点として、この修飾はCSF−１の免疫原性を
低下せしめることができ（特に異種において使用される
場合、例えばヒトのCSF−１をウシに使用する場合）そ
して／又は起こるかもしれない蛋白質の凝集を減少せし
めることができる。
低下せしめることができ（特に異種において使用される
場合、例えばヒトのCSF−１をウシに使用する場合）そ
して／又は起こるかもしれない蛋白質の凝集を減少せし
めることができる。
さらに具体的には、本発明は、生物学的に活性な組成
物に関し、この組成物は哺乳類において延長された生体
内半減期を有し、インビトロコロニー刺激因子−１測定
において一次マクロファージコロニーの形成を刺激する
蛋白質を含んで成り、この蛋白質はポリエチレングリコ
ール又はポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリ
オキシエチル化ポリオール及びポリビニルアルコールか
ら成る群から選択された水溶性ポリマーに共有結合によ
り接合しており、ここで該ホモポリマーはその一端にお
いてアルキル基により置換されているか又は置換されて
いない。CSF−１蛋白質は、（１）リジン残基及びＮ−
末端アミノ酸を含めての遊離アミノ基（好ましくは１〜
３部位）、（２）真核細胞で発現されたグリコシル化さ
れたCSF−１の炭水化物成分（１又は複数）、又はCSF−
１に人為的に作られた遊離スルヒドリル基、を介してポ
リマーに接合させることができる。
物に関し、この組成物は哺乳類において延長された生体
内半減期を有し、インビトロコロニー刺激因子−１測定
において一次マクロファージコロニーの形成を刺激する
蛋白質を含んで成り、この蛋白質はポリエチレングリコ
ール又はポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリ
オキシエチル化ポリオール及びポリビニルアルコールか
ら成る群から選択された水溶性ポリマーに共有結合によ
り接合しており、ここで該ホモポリマーはその一端にお
いてアルキル基により置換されているか又は置換されて
いない。CSF−１蛋白質は、（１）リジン残基及びＮ−
末端アミノ酸を含めての遊離アミノ基（好ましくは１〜
３部位）、（２）真核細胞で発現されたグリコシル化さ
れたCSF−１の炭水化物成分（１又は複数）、又はCSF−
１に人為的に作られた遊離スルヒドリル基、を介してポ
リマーに接合させることができる。
好ましくは、ポリマーは非置換ポリエチレングリコー
ル（PEG）、モノメチルPEG（mPEG）、又はポリオキシエ
チル化グリセロール（POG）であり、これらは（１）PE
G,mPEG又はPOGカルボン酸又は炭酸の活性エステル（好
ましくはＮ−ヒドロキシサクシンイミドエステル又はパ
ラニトロフェニルエステル）から形成されるアミド又は
ウレタン結合を介してCSF−１のリジン残基に連結さ
れ；（２）アミン、ヒドラジン又はヒドラジド結合を介
してCSF−１の炭水化物成分に連結され；あるいは
（３）マレイミド基又はハロアセチル基（ここでハロゲ
ンは、Br,Cl又はＩである）を介してCSF−１のシステイ
ン残基に連結される。
ル（PEG）、モノメチルPEG（mPEG）、又はポリオキシエ
チル化グリセロール（POG）であり、これらは（１）PE
G,mPEG又はPOGカルボン酸又は炭酸の活性エステル（好
ましくはＮ−ヒドロキシサクシンイミドエステル又はパ
ラニトロフェニルエステル）から形成されるアミド又は
ウレタン結合を介してCSF−１のリジン残基に連結さ
れ；（２）アミン、ヒドラジン又はヒドラジド結合を介
してCSF−１の炭水化物成分に連結され；あるいは
（３）マレイミド基又はハロアセチル基（ここでハロゲ
ンは、Br,Cl又はＩである）を介してCSF−１のシステイ
ン残基に連結される。
本発明の他の観点は前記の接合した蛋白質の製造方法
に関し、この方法は、 （ａ）少なくとも１個の末端反応基を有する水溶性ポリ
マーを用意し、該ポリマーはポリエチレン又はポリプロ
ピレングリコールホモポリマー及びポリオキシエチル化
ポリオール並びにポリビニルアルコールから成る群から
選択されたものであり、該ホモポリマーはアルキル基に
より一端において置換されているか又は置換されておら
ず； （ｂ）蛋白質を前記ポリマーの反応性基と反応せしめる
ことにより該蛋白質を生物学的に活性にしそして選択に
接合せしめ；そして （ｃ）接合した蛋白質を精製する； ことを含んで成る。
に関し、この方法は、 （ａ）少なくとも１個の末端反応基を有する水溶性ポリ
マーを用意し、該ポリマーはポリエチレン又はポリプロ
ピレングリコールホモポリマー及びポリオキシエチル化
ポリオール並びにポリビニルアルコールから成る群から
選択されたものであり、該ホモポリマーはアルキル基に
より一端において置換されているか又は置換されておら
ず； （ｂ）蛋白質を前記ポリマーの反応性基と反応せしめる
ことにより該蛋白質を生物学的に活性にしそして選択に
接合せしめ；そして （ｃ）接合した蛋白質を精製する； ことを含んで成る。
他の観点において、本発明は、医薬として許容される
水性キャリヤー媒体に溶解した接合したCSF−１蛋白質
を含んで成る医薬製品の有効量を哺乳類に投与すること
を含んで成る、哺乳類における感染性疾患もしくは癌の
予防的又は治療的処置のための方法、及び哺乳類におけ
る癌治療、創傷治癒、骨粗鬆症治療、コレステロール低
下又は抗体依存性細胞毒性（ADCC）のために効果的な方
法に関する。
水性キャリヤー媒体に溶解した接合したCSF−１蛋白質
を含んで成る医薬製品の有効量を哺乳類に投与すること
を含んで成る、哺乳類における感染性疾患もしくは癌の
予防的又は治療的処置のための方法、及び哺乳類におけ
る癌治療、創傷治癒、骨粗鬆症治療、コレステロール低
下又は抗体依存性細胞毒性（ADCC）のために効果的な方
法に関する。
第１図は、pCSF−17のcDNA及び推定されるアミノ酸配
列（34アミノ酸リーダー配列及びアミノ酸１〜224）を
示す。
列（34アミノ酸リーダー配列及びアミノ酸１〜224）を
示す。
第２図は、CSF−４のcDNA及び推定されるアミノ酸配
列（部分的アミノ酸リーダー配列及びアミノ酸１−52
2）を示す。
列（部分的アミノ酸リーダー配列及びアミノ酸１−52
2）を示す。
第3A図は、誘導体化されていないCSF−１（rCSF−
１）（SCSF/N▽2C▽150）のサイズ排除HPLCクロマトグ
ラムを示す。第3B図は、平均分子量7000のPEG−NHSによ
り誘導体化された同じrCSF−１のHPLC−クロマトグラム
を示す。
１）（SCSF/N▽2C▽150）のサイズ排除HPLCクロマトグ
ラムを示す。第3B図は、平均分子量7000のPEG−NHSによ
り誘導体化された同じrCSF−１のHPLC−クロマトグラム
を示す。
第４図は、平均分子量11,000のPEG−NHSにより誘導体
化されたrCSF−１（SCSF/C▽150）のサイズ排除HPLCク
ロマトグラムを示す。
化されたrCSF−１（SCSF/C▽150）のサイズ排除HPLCク
ロマトグラムを示す。
第５図は、E.コリrCSF−１（SCSF/C▽150）、第２図
中の配列を有するrCSF−１に由来する二量体生成物〔リ
ーダー配列及びＣ−末端配列を欠くが、しかしE.コリ構
成物中に存在する末端メチオニンの本質上すべてを保持
している〕、グリコシル化された522−アミノ酸前駆体
（LCSF）から生ずる哺乳類細胞（COS）中で発現されたr
CSF−１、及びPEG−11,000で誘導体化されたE.コリrCSF
−１（SCSF/C▽150）について、ラット血漿中CSF−１濃
度対時間のグラフを示す。
中の配列を有するrCSF−１に由来する二量体生成物〔リ
ーダー配列及びＣ−末端配列を欠くが、しかしE.コリ構
成物中に存在する末端メチオニンの本質上すべてを保持
している〕、グリコシル化された522−アミノ酸前駆体
（LCSF）から生ずる哺乳類細胞（COS）中で発現されたr
CSF−１、及びPEG−11,000で誘導体化されたE.コリrCSF
−１（SCSF/C▽150）について、ラット血漿中CSF−１濃
度対時間のグラフを示す。
第６図は、PEG−11,000で誘導体化されたrCSF−１（S
CSF/C▽150）の静脈内注射の後120分でのラット血漿の
サイズ排除HPLCクロマトグラムを示す。ラジオイムノア
ッセイ（RIA）及び280nmにおける吸光度がプロットされ
ている。
CSF/C▽150）の静脈内注射の後120分でのラット血漿の
サイズ排除HPLCクロマトグラムを示す。ラジオイムノア
ッセイ（RIA）及び280nmにおける吸光度がプロットされ
ている。
第７図は、E.コリrCSF−１（SCSF/N▽3C▽158）及び1
1,000PEGにより誘導体化された同じ蛋白質について、ラ
ット血漿中CSF−１濃度対時間のグラフを示す。
1,000PEGにより誘導体化された同じ蛋白質について、ラ
ット血漿中CSF−１濃度対時間のグラフを示す。
第８図は、PEG−11,000で誘導体化されたrCSF−１（S
CSF/C▽150）のSDS−PAGE分析を示す。クマッシーブル
ーにより蛋白質について染色されたゲル（10％）は、ジ
スルフィド結合の還元を伴う又は伴わない、第５図にお
いて使用したサンプルについてである。
CSF/C▽150）のSDS−PAGE分析を示す。クマッシーブル
ーにより蛋白質について染色されたゲル（10％）は、ジ
スルフィド結合の還元を伴う又は伴わない、第５図にお
いて使用したサンプルについてである。
定 義 「コロニー刺激因子−１」というのは、Metcalf,J.Ce
ll Physiol.（1970年）、76:89の標準的な生体外コロニ
ー刺激アッセイ（このアッセイにおいてはポリペプチド
が一次的にマクロファージコロニーの形成を刺激する）
においてCSF−１に対する生物活性をもつ２量体（ダイ
マー）タンパク質又は糖タンパク質化合物のことであ
る。「生物活性CSF−１」は、同じCSF−１の非接合形態
のものと基本的に同じ比活性をマウスの骨髄コロニー形
成アッセイにおいて有するか或いはその比活性の約10％
以上を有する接合体CSF−１の化合物を意味する。「天
然の（生来の）」CSF−１は、非組換え型CSF−１であ
る。マウスのCSF−１は、欧州特許公開第0272779号、Ra
javashisth他、Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1987年）84;1
157及びDeLamarter他著のNucleic Acids Res.（1987
年）15:2389内に記述されている。
ll Physiol.（1970年）、76:89の標準的な生体外コロニ
ー刺激アッセイ（このアッセイにおいてはポリペプチド
が一次的にマクロファージコロニーの形成を刺激する）
においてCSF−１に対する生物活性をもつ２量体（ダイ
マー）タンパク質又は糖タンパク質化合物のことであ
る。「生物活性CSF−１」は、同じCSF−１の非接合形態
のものと基本的に同じ比活性をマウスの骨髄コロニー形
成アッセイにおいて有するか或いはその比活性の約10％
以上を有する接合体CSF−１の化合物を意味する。「天
然の（生来の）」CSF−１は、非組換え型CSF−１であ
る。マウスのCSF−１は、欧州特許公開第0272779号、Ra
javashisth他、Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1987年）84;1
157及びDeLamarter他著のNucleic Acids Res.（1987
年）15:2389内に記述されている。
「臨床的に純粋な」CSF−１というのは、RP−HPLCに
よるか又は還元的又は非還元的なSDS−PAGE分析により
少なくとも95％のCSF−１を含み、約1.0ng/mg CSF−１
未満の内毒素（エンドトキシン）を有する細菌内で組換
えにより生成される生物活性をもつヒトCSF−１の調製
剤を意味する。
よるか又は還元的又は非還元的なSDS−PAGE分析により
少なくとも95％のCSF−１を含み、約1.0ng/mg CSF−１
未満の内毒素（エンドトキシン）を有する細菌内で組換
えにより生成される生物活性をもつヒトCSF−１の調製
剤を意味する。
「選択的に接合された」というのは、タンパク質の遊
離アミノ基（好ましくは、最大の生物活性を保持するた
め１つ又は２つの遊離アミノ基）を介して、又は遊離ス
ルフヒドリル基（もしあれば）を介して、或いはタンパ
ク質中に存在する炭水化物部成分（もしあれば）を介し
て共有結合されたタンパク質のことである。
離アミノ基（好ましくは、最大の生物活性を保持するた
め１つ又は２つの遊離アミノ基）を介して、又は遊離ス
ルフヒドリル基（もしあれば）を介して、或いはタンパ
ク質中に存在する炭水化物部成分（もしあれば）を介し
て共有結合されたタンパク質のことである。
「有効量」及び「免疫療法上の有効量」は、腫瘍の削
減を促進するため或いは又感染性疾病を予防又は治療す
るためといった特定の機能を行なうのに有効な量を意味
する。
減を促進するため或いは又感染性疾病を予防又は治療す
るためといった特定の機能を行なうのに有効な量を意味
する。
「療法的処置」は、「予防的処置」が疾病の罹患を予
防するための処置を表わすのに対して、疾病の罹患した
後に処置することを表わす。
防するための処置を表わすのに対して、疾病の罹患した
後に処置することを表わす。
「哺乳動物」というのは、あらゆる哺乳類種を表わ
し、ウサギ、マウス、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、霊長
類及びヒトを含み、好ましくはヒトのことである。
し、ウサギ、マウス、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、霊長
類及びヒトを含み、好ましくはヒトのことである。
「ミューテイン」というのは、サイト特異性突然変異
誘発といった技法を用いて変性させられた核酸配列から
発現された遺伝子操作により作られたタンパク質であ
る。かかる遺伝的変性は、親タンパク質のアミノ酸配列
に対する１又は複数の置換、付加及び／又は欠失を結果
しとてひき起こすように設計されている。
誘発といった技法を用いて変性させられた核酸配列から
発現された遺伝子操作により作られたタンパク質であ
る。かかる遺伝的変性は、親タンパク質のアミノ酸配列
に対する１又は複数の置換、付加及び／又は欠失を結果
しとてひき起こすように設計されている。
「医薬として許容される」というのは、有効成分の生
物活性の有効性と干渉さず、安定性があり、しかもそれ
が投与される宿主にとって有毒でないような担体媒体に
関する。
物活性の有効性と干渉さず、安定性があり、しかもそれ
が投与される宿主にとって有毒でないような担体媒体に
関する。
「ホモダイマー」とは、それが、組換え型タンパク質
の生成又はプロセシングに際して場合によって生じるわ
ずかな微変異性をもつ２量体タンパク質をも含むが、そ
の２つのサブユニットについて基本的に同一である２量
体タンパク質のことである。
の生成又はプロセシングに際して場合によって生じるわ
ずかな微変異性をもつ２量体タンパク質をも含むが、そ
の２つのサブユニットについて基本的に同一である２量
体タンパク質のことである。
「ヘテロダイマー」というのは、アミノ酸配列、アミ
ノ酸の数又はその両方において異なっているサブユニッ
トをもつ２量体タンパク質である。換言すると、ヘテロ
ダイマーは２つの同一でないサブユニットを有してい
る。
ノ酸の数又はその両方において異なっているサブユニッ
トをもつ２量体タンパク質である。換言すると、ヘテロ
ダイマーは２つの同一でないサブユニットを有してい
る。
CSF−１−タンパク質 背景の節で記載したとおり、CSF−１はその２量体形
態で生物活性を有する。ここで用いられるCSF−１は
「天然の」２量体であっても組換えにより生成された２
量体であってもよい。天然の２量体CSF−１種は、ヒト
の尿、培養された単核細胞及びいくつかの細胞系の培養
上澄み液から得られたものである。さまざまなアミノ酸
配列及び長さから成るCSF−１単量体をコード化する組
換え型DNAを得ることが可能であった。第１図及び第２
図は、両者共にそのＮ末端に32−アミノ酸シグナル配列
を含んでいる、それぞれ最大長、プロセシングされてい
ない短形及び長形態に対するDNA配列及びそのDNA配列か
ら予測されたアミノ酸配列を示している。単量体CSF−
１タンパク質の配列はここでは便宜上、リーダー配列無
しの224−アミノ酸短形態配列（ここではSCSFと呼ぶ）
及びリーダー配列無しの522−アミノ酸長形態配列（こ
こではLCSFと呼ぶ）であるものとみなされている。点突
然変異、挿入、欠失及び／又は転座（トランスロケーシ
ョン）によって変更されたDNA配列から生成されたその
他のCSF−１二量体も同様に、それらが生物活性を有す
る場合に本発明の化学的変更から恩恵を受けるものと期
待されている。
態で生物活性を有する。ここで用いられるCSF−１は
「天然の」２量体であっても組換えにより生成された２
量体であってもよい。天然の２量体CSF−１種は、ヒト
の尿、培養された単核細胞及びいくつかの細胞系の培養
上澄み液から得られたものである。さまざまなアミノ酸
配列及び長さから成るCSF−１単量体をコード化する組
換え型DNAを得ることが可能であった。第１図及び第２
図は、両者共にそのＮ末端に32−アミノ酸シグナル配列
を含んでいる、それぞれ最大長、プロセシングされてい
ない短形及び長形態に対するDNA配列及びそのDNA配列か
ら予測されたアミノ酸配列を示している。単量体CSF−
１タンパク質の配列はここでは便宜上、リーダー配列無
しの224−アミノ酸短形態配列（ここではSCSFと呼ぶ）
及びリーダー配列無しの522−アミノ酸長形態配列（こ
こではLCSFと呼ぶ）であるものとみなされている。点突
然変異、挿入、欠失及び／又は転座（トランスロケーシ
ョン）によって変更されたDNA配列から生成されたその
他のCSF−１二量体も同様に、それらが生物活性を有す
る場合に本発明の化学的変更から恩恵を受けるものと期
待されている。
真核生物であれ原核生物であれあらゆる宿主の中で生
成される組換え型CSF−１は、選択されたアミノ酸側基
好ましくは遊離アミノ基を介して重合体へと接合されう
る。好ましくは、CSF−１をコードするDNAは細菌内で発
現され、結果として得られるCSF−１は、純化及び再生
の後のホモダイマーである。接合が炭水化物部分を介し
たものである場合、宿主は真核生物であってよく、或い
は又、生体外でグリコシル化が行なわれる可能性もあ
る。
成される組換え型CSF−１は、選択されたアミノ酸側基
好ましくは遊離アミノ基を介して重合体へと接合されう
る。好ましくは、CSF−１をコードするDNAは細菌内で発
現され、結果として得られるCSF−１は、純化及び再生
の後のホモダイマーである。接合が炭水化物部分を介し
たものである場合、宿主は真核生物であってよく、或い
は又、生体外でグリコシル化が行なわれる可能性もあ
る。
便宜上、記述されているさまざまなcDNA構成概念によ
りコード化されるタンパク質サブユニットの一次構造
は、ここでは以下のような短縮記号を用いて呼ぶことに
する。すなわち、LCSFは、完全なシグナル配列無しで第
２図に示されている上述の欧州特許公開第0272779号に
記載の、クローンCSF−４について開示された522−アミ
ノ酸配列を表わす。SCSFは、本書に同様に参考文献とし
て内含されている上述のカワサキ論文〔Science（1985
年）230:292−296〕内に記述され、シグナル配列無し
の、第１図に示されている、クローンpCSF−17について
開示された224−アミノ酸配列を表わす。
りコード化されるタンパク質サブユニットの一次構造
は、ここでは以下のような短縮記号を用いて呼ぶことに
する。すなわち、LCSFは、完全なシグナル配列無しで第
２図に示されている上述の欧州特許公開第0272779号に
記載の、クローンCSF−４について開示された522−アミ
ノ酸配列を表わす。SCSFは、本書に同様に参考文献とし
て内含されている上述のカワサキ論文〔Science（1985
年）230:292−296〕内に記述され、シグナル配列無し
の、第１図に示されている、クローンpCSF−17について
開示された224−アミノ酸配列を表わす。
１つの特定のpCSF−17クローン誘導体が、位置59にお
いてアスパラギン酸残基を有していることがわかるだろ
う。開示されているLCSFクローンは同様に、位置59にお
いてAspをコード化する。第１図及び第２図に示されて
いる配列内のアミノ酸置換に相応するミューテインは、
位置と共に指定されている置換によってそれ相応して呼
称される。CSF−１のミューテイン形態は、1988年６月2
9日に公開された欧州特許公開第0272779号内に開示され
ており、かかる開示は本書中に参考文献として内含され
る。これらのタンパク質をコードする構成物が細菌内で
発現される場合、最終生成物は、さまざまなレベルでＮ
末端メチオニンを保持することも可能である。Ｎ末端メ
チオニンの除去の程度は高い信頼性で予測できないこと
から、この可能性は表記中には含み入れられていない。
いてアスパラギン酸残基を有していることがわかるだろ
う。開示されているLCSFクローンは同様に、位置59にお
いてAspをコード化する。第１図及び第２図に示されて
いる配列内のアミノ酸置換に相応するミューテインは、
位置と共に指定されている置換によってそれ相応して呼
称される。CSF−１のミューテイン形態は、1988年６月2
9日に公開された欧州特許公開第0272779号内に開示され
ており、かかる開示は本書中に参考文献として内含され
る。これらのタンパク質をコードする構成物が細菌内で
発現される場合、最終生成物は、さまざまなレベルでＮ
末端メチオニンを保持することも可能である。Ｎ末端メ
チオニンの除去の程度は高い信頼性で予測できないこと
から、この可能性は表記中には含み入れられていない。
これらの基本的SCSF及びLCSF配列のＣ末端及びＮ末端
の切形は、それぞれＣ▽又はＮ▽と呼ばれる。Ｃ末端の
欠失の後には、残っている天然（未変性）構造のアミノ
酸の数を表わす数字が続く：すなわち、Ｎ末端欠失につ
いては、Ｎ▽の後にはＮ末端から欠失されたアミノ酸の
数が続くことになる。従って例えば、LCSF/C▽150は、
長いCSF配列の最初の150のアミノ酸残基を含むタンパク
質をコードする構成物を表わす。又SCSF/C▽158は、短
形態の最初の158のアミノ酸残基を含むタンパク質をコ
ード化する構成物を表わしている。さらに、SCSF/N▽２
は、２つのＮ末端アミノ酸が欠失させられた状態での短
形態をコードする構成物を表わしている。（前述のとお
り、LCSF及びSCSFは、位置150から始まって発散し、LCS
Fクローン内の298のアミノ酸の後に再収束する）。LCSF
/N▽2C▽150は、２つのＮ末端グルタミン酸残基が欠失
させられているという点を除いて、LCSF/C▽150と同じ
ものである１形態を表わしている。
の切形は、それぞれＣ▽又はＮ▽と呼ばれる。Ｃ末端の
欠失の後には、残っている天然（未変性）構造のアミノ
酸の数を表わす数字が続く：すなわち、Ｎ末端欠失につ
いては、Ｎ▽の後にはＮ末端から欠失されたアミノ酸の
数が続くことになる。従って例えば、LCSF/C▽150は、
長いCSF配列の最初の150のアミノ酸残基を含むタンパク
質をコードする構成物を表わす。又SCSF/C▽158は、短
形態の最初の158のアミノ酸残基を含むタンパク質をコ
ード化する構成物を表わしている。さらに、SCSF/N▽２
は、２つのＮ末端アミノ酸が欠失させられた状態での短
形態をコードする構成物を表わしている。（前述のとお
り、LCSF及びSCSFは、位置150から始まって発散し、LCS
Fクローン内の298のアミノ酸の後に再収束する）。LCSF
/N▽2C▽150は、２つのＮ末端グルタミン酸残基が欠失
させられているという点を除いて、LCSF/C▽150と同じ
ものである１形態を表わしている。
さまざまなCSF−１形態をコードするプラスミドが現
在使用可能であり、細菌系内で発現されうる。CSF−１
の長形態をコードするプラスミドの一形態は、真核生物
細胞内で発現される可能性があり、この場合、真核細胞
はクローンを「プロセシングし」、Ｃ末端で切断された
タンパク質を分泌し、Ｎ末端からリーダー配列が除去さ
れている。代替的には、クローンを切断して、真核細胞
又は原核細胞内で特異的なＣ末端欠失された形態を発現
することも可能である。さらに、大腸菌（E.Coli）内で
発現された結果として得たタンパク質がより相同である
ように、最初の２つ又は３つのＮ末端コドンを欠失させ
ることも可能である。限定的に言うと、大腸菌構成物内
の成熟した天然配列Ｎ末端のすぐ上流でコードされたＮ
末端メチオニン（これは、翻訳後プロセシングにより除
去されていないかぎり、タンパク質内に「Ｎ末端Met」
として保持されている）は、これらのＮ末端欠失構成物
からより容易に除去される。さらに、逆相HPLC（RP−HP
LC）を用いて検出できる有意な不均一性は、「天然の」
Ｎ末端配列をコードする遺伝子（例えば、短形態のも
の、ミュテインSCSF/C▽150）が大腸菌内で発現され、
精製された生成物が特徴づけされる場合に、見い出され
る。この不均一性は、２つのＮ末端コドンが欠けた相応
するCSF−１遺伝子（グルタミン酸）が発現される場合
に、無くなる。従って、その他の短い及び長いCSF−１
遺伝子構成物のＮ末端切除形も同様に用いることができ
る。
在使用可能であり、細菌系内で発現されうる。CSF−１
の長形態をコードするプラスミドの一形態は、真核生物
細胞内で発現される可能性があり、この場合、真核細胞
はクローンを「プロセシングし」、Ｃ末端で切断された
タンパク質を分泌し、Ｎ末端からリーダー配列が除去さ
れている。代替的には、クローンを切断して、真核細胞
又は原核細胞内で特異的なＣ末端欠失された形態を発現
することも可能である。さらに、大腸菌（E.Coli）内で
発現された結果として得たタンパク質がより相同である
ように、最初の２つ又は３つのＮ末端コドンを欠失させ
ることも可能である。限定的に言うと、大腸菌構成物内
の成熟した天然配列Ｎ末端のすぐ上流でコードされたＮ
末端メチオニン（これは、翻訳後プロセシングにより除
去されていないかぎり、タンパク質内に「Ｎ末端Met」
として保持されている）は、これらのＮ末端欠失構成物
からより容易に除去される。さらに、逆相HPLC（RP−HP
LC）を用いて検出できる有意な不均一性は、「天然の」
Ｎ末端配列をコードする遺伝子（例えば、短形態のも
の、ミュテインSCSF/C▽150）が大腸菌内で発現され、
精製された生成物が特徴づけされる場合に、見い出され
る。この不均一性は、２つのＮ末端コドンが欠けた相応
するCSF−１遺伝子（グルタミン酸）が発現される場合
に、無くなる。従って、その他の短い及び長いCSF−１
遺伝子構成物のＮ末端切除形も同様に用いることができ
る。
好ましい構成は、タンパク質が基本的に、LCSF/C▽15
0からＣ▽464,tyr59LCSF/C▽150からＣ▽464;asp59SCSF
/C▽150からＣ▽166から成るグループの中から選ばれた
１つのアミノ酸配列で構成されているようなものであ
る。さらに好ましいのは、基本的に、LCSF/C▽150;LCSF
/C▽190;LCSF/C▽221;LCSF/C▽223;LCSF/C▽236;LCSF/C
▽238;LCSF/C▽249;LCSF/C▽258;LCSF/C▽406;LCSF/C▽
411;LCSF/C▽464;asp59SCSF/C▽150;asp59SCSF/C▽153;
及びasp59SCSF/C▽158から成るグループの中から選択さ
れた１つのアミノ酸配列で構成されたCSF−１タンパク
質である。
0からＣ▽464,tyr59LCSF/C▽150からＣ▽464;asp59SCSF
/C▽150からＣ▽166から成るグループの中から選ばれた
１つのアミノ酸配列で構成されているようなものであ
る。さらに好ましいのは、基本的に、LCSF/C▽150;LCSF
/C▽190;LCSF/C▽221;LCSF/C▽223;LCSF/C▽236;LCSF/C
▽238;LCSF/C▽249;LCSF/C▽258;LCSF/C▽406;LCSF/C▽
411;LCSF/C▽464;asp59SCSF/C▽150;asp59SCSF/C▽153;
及びasp59SCSF/C▽158から成るグループの中から選択さ
れた１つのアミノ酸配列で構成されたCSF−１タンパク
質である。
本書において変更のためのCSF−１タンパク質を結果
としてもたらす特に好ましい構成には、LCSF/C▽190,LC
SF/C▽221,asp59SCSF/C▽158,asp59SCSF/C▽150及びこ
れらに相応するＮ▽２及びＮ▽３形態をコード化するク
ローンが含まれている。
としてもたらす特に好ましい構成には、LCSF/C▽190,LC
SF/C▽221,asp59SCSF/C▽158,asp59SCSF/C▽150及びこ
れらに相応するＮ▽２及びＮ▽３形態をコード化するク
ローンが含まれている。
最も好ましい出発物質は、asp59SCSF/C▽150;asp59SC
SF/C▽158;LCSF/C▽221及びその相応するＮ▽３形態を
コードするクローンの生成物である。
SF/C▽158;LCSF/C▽221及びその相応するＮ▽３形態を
コードするクローンの生成物である。
あるいは、CSF−１は、特にCSF−１ヘテロダイマーの
反応性システイン残基を通して接合が行なわれる場合、
CSF−１のさまざまな単量体ユニットの中から調製され
たヘテロダイマーの形をしていてもよい。プロセシング
の差異又はクローン構成上の差異によるＣ末端配列の変
化によって形成された数多くのCSF−１タンパク質は、
ヘテロダイマー形成に用いることのできるさまざまな出
発物質を提供する。従って、再生により新奇のヘテロダ
イマーを形成することができる。例えば、SCSF/C▽150
の単量体形態は、LCSF/C▽157の単量体形態と共に、本
書中に参考文献として内含されている1988年10月20日に
公示されたPCT公報WO 88/08003号の方法に従って、混合
及び処理されうる。次に、ヘテロダイマーを、さまざま
なクロマトグラフィ及びその他の方法によりホモダイマ
ー及びオリゴマー副生成物から分離することができる。
ヘテロダイマー（特にSCSF/C▽150及びLCSF/C▽157）
は、157位置において１つのサブユニット上で終結させ
ることができ、こうして、複合重合体との反応のための
潜在的に遊離したスルフヒドリル基を提供する。本発明
の方法を受けた同様の混合物は、アミノ酸置換を有する
成分のヘテロダイマー（例えば、glu52LCSF/C▽221及び
LCSF/C▽190）に導く可能性がある。
反応性システイン残基を通して接合が行なわれる場合、
CSF−１のさまざまな単量体ユニットの中から調製され
たヘテロダイマーの形をしていてもよい。プロセシング
の差異又はクローン構成上の差異によるＣ末端配列の変
化によって形成された数多くのCSF−１タンパク質は、
ヘテロダイマー形成に用いることのできるさまざまな出
発物質を提供する。従って、再生により新奇のヘテロダ
イマーを形成することができる。例えば、SCSF/C▽150
の単量体形態は、LCSF/C▽157の単量体形態と共に、本
書中に参考文献として内含されている1988年10月20日に
公示されたPCT公報WO 88/08003号の方法に従って、混合
及び処理されうる。次に、ヘテロダイマーを、さまざま
なクロマトグラフィ及びその他の方法によりホモダイマ
ー及びオリゴマー副生成物から分離することができる。
ヘテロダイマー（特にSCSF/C▽150及びLCSF/C▽157）
は、157位置において１つのサブユニット上で終結させ
ることができ、こうして、複合重合体との反応のための
潜在的に遊離したスルフヒドリル基を提供する。本発明
の方法を受けた同様の混合物は、アミノ酸置換を有する
成分のヘテロダイマー（例えば、glu52LCSF/C▽221及び
LCSF/C▽190）に導く可能性がある。
異なる単量体は、生体外で混合させてもよいし、又同
じ細菌内で生成させることもできる。同一細胞内で生成
される場合には、各々の単量体の発現のための構成物
が、同じ宿主内へ導入される。かかる実施態様において
は、各々の構成物が異なる標識（例えば、テトラサイク
リン耐性（TcR）及びアンピシリン耐性（AmpR））を持
ち、そのため同時形質転換され宿主が選択されるように
することが好ましい。次に、同時形質転換された細胞は
増殖させられ、２つの形態の混合物を得るべく誘導され
る。
じ細菌内で生成させることもできる。同一細胞内で生成
される場合には、各々の単量体の発現のための構成物
が、同じ宿主内へ導入される。かかる実施態様において
は、各々の構成物が異なる標識（例えば、テトラサイク
リン耐性（TcR）及びアンピシリン耐性（AmpR））を持
ち、そのため同時形質転換され宿主が選択されるように
することが好ましい。次に、同時形質転換された細胞は
増殖させられ、２つの形態の混合物を得るべく誘導され
る。
さらに、分子が生物活性を保持することを条件とし
て、PEG反応のためシステイン残基上に遊離スルフヒド
リル基を含むrCSF−１の構成物を生成するため、自然で
ない場所での単一のシステイン残基をCSF−１に誘導す
ることもできる。２つのサブユニットのうちの片方の中
にのみ一定の与えられたシステインの置換を含むヘテロ
ダイマー構成物も又同様に遊離スルフヒドリルの生成に
役立ちうる。同様に、炭水化物部分を、真核系からの発
現によって又は酵素での生体外グリコシル化によってCS
F−１タンパク質上に置くこともできる。
て、PEG反応のためシステイン残基上に遊離スルフヒド
リル基を含むrCSF−１の構成物を生成するため、自然で
ない場所での単一のシステイン残基をCSF−１に誘導す
ることもできる。２つのサブユニットのうちの片方の中
にのみ一定の与えられたシステインの置換を含むヘテロ
ダイマー構成物も又同様に遊離スルフヒドリルの生成に
役立ちうる。同様に、炭水化物部分を、真核系からの発
現によって又は酵素での生体外グリコシル化によってCS
F−１タンパク質上に置くこともできる。
組換え型CSF−１タンパク質は、宿主によるプロセシ
ングのため、クローンにより規定された正確な長さを保
持している場合もあれば保持していない場合もある。従
って、出発物質であるタンパク質は同じ呼称で呼ばれる
が、実際にはこれらの呼称はクローンの構成物を表わし
ており、本書中に開示されている方法のための出発物質
の実際の長さは、Ｃ末端アミノ酸の数により規定される
ものよりも長い場合も短かい場合もある（それがＮ末端
Metを有する場合）ということを理解しておかなくては
ならない。
ングのため、クローンにより規定された正確な長さを保
持している場合もあれば保持していない場合もある。従
って、出発物質であるタンパク質は同じ呼称で呼ばれる
が、実際にはこれらの呼称はクローンの構成物を表わし
ており、本書中に開示されている方法のための出発物質
の実際の長さは、Ｃ末端アミノ酸の数により規定される
ものよりも長い場合も短かい場合もある（それがＮ末端
Metを有する場合）ということを理解しておかなくては
ならない。
上述のように、CSF−１は、例えば哺乳動物、昆虫又
は酵母菌の細胞といった真核性細胞の中で生成できる。
哺乳動物の細胞内での生産については、PCT特許公報WO
86/04607号に記述されている。CSF−１は、本書中にそ
の開示が参考文献として包含されているLuckow他著のBi
otechnol.（1988年）６:47中に記述されているように、
バキュロウイルスベクターを用いて、昆虫の細胞から生
成することができる。このタイプのCSF−１生産のその
他の記述は、Weaver他著のBio/Technology（1988年）
６:287内に含まれている。昆虫の細胞で生産されたCSF
−１（SCSF/C▽150）は、非常に短かい生体内半減期を
有することがわかったグリコシル化された２量体であ
る。SCSFのアミノ酸配列内の２つのＮ−連鎖グリコシル
化シグナル（Asn122及びAsn140）は、グリコシル化され
た生物活性ある昆虫細胞で生産されたCSF−１タンパク
質（Gln122,Gln140）を生成すべく、サイト指向性の突
然変異誘発を用いてDNA内で変更されうる。この後、こ
のタンパク質を、その生体内半減期を増大するため原核
生物にて発現されたrCSF−１について行なわれたように
１つの重合体とそのリジン又はシステイン残基を介して
反応させることができる。
は酵母菌の細胞といった真核性細胞の中で生成できる。
哺乳動物の細胞内での生産については、PCT特許公報WO
86/04607号に記述されている。CSF−１は、本書中にそ
の開示が参考文献として包含されているLuckow他著のBi
otechnol.（1988年）６:47中に記述されているように、
バキュロウイルスベクターを用いて、昆虫の細胞から生
成することができる。このタイプのCSF−１生産のその
他の記述は、Weaver他著のBio/Technology（1988年）
６:287内に含まれている。昆虫の細胞で生産されたCSF
−１（SCSF/C▽150）は、非常に短かい生体内半減期を
有することがわかったグリコシル化された２量体であ
る。SCSFのアミノ酸配列内の２つのＮ−連鎖グリコシル
化シグナル（Asn122及びAsn140）は、グリコシル化され
た生物活性ある昆虫細胞で生産されたCSF−１タンパク
質（Gln122,Gln140）を生成すべく、サイト指向性の突
然変異誘発を用いてDNA内で変更されうる。この後、こ
のタンパク質を、その生体内半減期を増大するため原核
生物にて発現されたrCSF−１について行なわれたように
１つの重合体とそのリジン又はシステイン残基を介して
反応させることができる。
例えばPEG−アミン、PEG−ヒドラジン又はPEG−ヒド
ラジドを、糖のビシナルジオールをアルデヒドに変換す
べく過ヨウ素酸塩で酸化されたCSF−１タンパク質と反
応させることにより、炭水化物上のグリコシル化された
CSF−１に対し重合体を共有結合させることができる。P
EG−アミンは、PEG−OHをまずPEG−トシル化物にそして
次にPEG−フタルイミドに変換することによって調製で
き、フタルイミドはヒドラジンで開裂されて、ガブリエ
ル合成でPEG−NH2を生成する。PEG−ヒドラジン及びPEG
−ヒドラジドは当業者にとっては周知の方法で調製する
ことができる。PEG誘導体は、ビシナルジオールがアル
デヒドに変換された炭水化物サイトでカップリングす
る。
ラジドを、糖のビシナルジオールをアルデヒドに変換す
べく過ヨウ素酸塩で酸化されたCSF−１タンパク質と反
応させることにより、炭水化物上のグリコシル化された
CSF−１に対し重合体を共有結合させることができる。P
EG−アミンは、PEG−OHをまずPEG−トシル化物にそして
次にPEG−フタルイミドに変換することによって調製で
き、フタルイミドはヒドラジンで開裂されて、ガブリエ
ル合成でPEG−NH2を生成する。PEG−ヒドラジン及びPEG
−ヒドラジドは当業者にとっては周知の方法で調製する
ことができる。PEG誘導体は、ビシナルジオールがアル
デヒドに変換された炭水化物サイトでカップリングす
る。
CSF−１が細菌宿主内で細胞内生産される場合には、P
CT公開WO 88/08003以前に記されているように、高い収
量で活性二量体を形成すべく、再生されなくてはならな
い。要するに、この手順においては、成熟タンパク質又
は融合タンパク質のいずれとして分泌又は生産されたか
に関わらず可溶化された単量体は、還元的条件の下でカ
オトロピック環境内に保たれる。かかる保持には、β−
メルカプトエタノール又はジチオスレイトール（DTT）
といった適当な還元剤の使用が関与している。可溶化さ
れたタンパク質は、標準的に、約２〜100mMのチオール
化合物が存在する中で約７〜8.6のpHで8Mの尿素又は7M
の塩酸グアニジウムといったもの中に維持される。この
可溶化された形態から出発して、単量体を直接再生する
こともできるし、或いは又吸収性ゲル上のクロマトグラ
フィ、イオン交換カラムを用いたクロマトグラフィ又は
ゲル透過クロマトグラフィといった適当な純化手順によ
り再生の前に残りのタンパク質から純化させることもで
きる。ゲル透過クロマトグラフィは、異なる分子量の不
純物から一般に予め分かっている望ましい単量体長さの
容易なサイズ分離を可能にするため、有用である。尿素
中のDEAEセファローズクロマトグラフィは、濃縮すると
同時に精製し、選別以上に容易にスケールアップできる
ことから、さらに有用である。Ｓ−Ｓ結合した集合体の
形成を防ぐため、還元的条件下で精製を行なうことが好
ましい。
CT公開WO 88/08003以前に記されているように、高い収
量で活性二量体を形成すべく、再生されなくてはならな
い。要するに、この手順においては、成熟タンパク質又
は融合タンパク質のいずれとして分泌又は生産されたか
に関わらず可溶化された単量体は、還元的条件の下でカ
オトロピック環境内に保たれる。かかる保持には、β−
メルカプトエタノール又はジチオスレイトール（DTT）
といった適当な還元剤の使用が関与している。可溶化さ
れたタンパク質は、標準的に、約２〜100mMのチオール
化合物が存在する中で約７〜8.6のpHで8Mの尿素又は7M
の塩酸グアニジウムといったもの中に維持される。この
可溶化された形態から出発して、単量体を直接再生する
こともできるし、或いは又吸収性ゲル上のクロマトグラ
フィ、イオン交換カラムを用いたクロマトグラフィ又は
ゲル透過クロマトグラフィといった適当な純化手順によ
り再生の前に残りのタンパク質から純化させることもで
きる。ゲル透過クロマトグラフィは、異なる分子量の不
純物から一般に予め分かっている望ましい単量体長さの
容易なサイズ分離を可能にするため、有用である。尿素
中のDEAEセファローズクロマトグラフィは、濃縮すると
同時に精製し、選別以上に容易にスケールアップできる
ことから、さらに有用である。Ｓ−Ｓ結合した集合体の
形成を防ぐため、還元的条件下で精製を行なうことが好
ましい。
従って、使用されるクロマトグラフィ手順の如何に関
わらず、クロマトグラフィ用カラム又はバッチに装入す
るのに用いられる溶液及び溶離用溶液中には、適当な還
元剤が含み入れられる。いくつかの例においては、基本
的に低いpHがジスルフィド結合の形成を防ぎいくつかの
クロマトグラフィシステムと適合性があることから、還
元剤の代わりに低いpHを用いてもよい。さらに、低濃度
のキレート剤の含有は、タンパク質の還元された形態を
保持する助けとなりうる。
わらず、クロマトグラフィ用カラム又はバッチに装入す
るのに用いられる溶液及び溶離用溶液中には、適当な還
元剤が含み入れられる。いくつかの例においては、基本
的に低いpHがジスルフィド結合の形成を防ぎいくつかの
クロマトグラフィシステムと適合性があることから、還
元剤の代わりに低いpHを用いてもよい。さらに、低濃度
のキレート剤の含有は、タンパク質の還元された形態を
保持する助けとなりうる。
次に部分的に精製された単量体は、二量体の形成のた
め再生条件に付される。この段階中のタンパク質濃度
は、きわめて重要である。一般に、CSF−１再生反応の
体積に対する最終百分率収量は、タンパク質濃度がCSF
−１タンパク質1mあたり約2mg未満になると増大す
る。0.03〜1.0mg/mという濃度範囲が好ましい。再生
条件には、適当な時間（通常数時間）にわたるカオトロ
ープ環境の漸進的な除去、或いは又タンパク質及びカオ
トロープ剤の望ましい濃度に至るまでの試料の希釈が含
まれるであろう。同様に可能であるのは、カオトロープ
がゆっくりと除去されていく間の透析又は中空ファイバ
ーダイアフィルトレーションといった、一定のタンパク
質濃度を与える方法である。このプロセスの終りに、カ
オトロープが逓減された時点で、比較的非変性のレベル
が達成される。例えば、塩酸グアニジンがカオトロープ
として用いられた場合、約２Μ未満好ましくは0.1〜１
Μの最終濃度が達成され、尿素がカオトロープとして用
いられた場合には、約１Μ未満好ましくは0.1〜0.5Μの
最終濃度が達成される。
め再生条件に付される。この段階中のタンパク質濃度
は、きわめて重要である。一般に、CSF−１再生反応の
体積に対する最終百分率収量は、タンパク質濃度がCSF
−１タンパク質1mあたり約2mg未満になると増大す
る。0.03〜1.0mg/mという濃度範囲が好ましい。再生
条件には、適当な時間（通常数時間）にわたるカオトロ
ープ環境の漸進的な除去、或いは又タンパク質及びカオ
トロープ剤の望ましい濃度に至るまでの試料の希釈が含
まれるであろう。同様に可能であるのは、カオトロープ
がゆっくりと除去されていく間の透析又は中空ファイバ
ーダイアフィルトレーションといった、一定のタンパク
質濃度を与える方法である。このプロセスの終りに、カ
オトロープが逓減された時点で、比較的非変性のレベル
が達成される。例えば、塩酸グアニジンがカオトロープ
として用いられた場合、約２Μ未満好ましくは0.1〜１
Μの最終濃度が達成され、尿素がカオトロープとして用
いられた場合には、約１Μ未満好ましくは0.1〜0.5Μの
最終濃度が達成される。
CSF−１の場合ジスルフィド結合の形成（そのうちの
単数又は複数は２つの鎖を結合する）を必要とするよう
な生物活性ある２量体構成を打ち立てるジスルフィドに
対するスルフヒドリル基の酸化を可能にするように、再
生が行なわれる。単数又は複数の鎖内ジスルフィドも形
成される。この２量体形成を促進する適当なレドックス
（酸化還元）条件には、酸化された及び還元されたグル
タチオニンといったスルフヒドリル／ジスルフィド試薬
の組合せが含まれる。還元グルタチオン対酸化グルタチ
オン又はその他のスルフヒドリル／ジスルフィドの組合
せの比率は標準的に約2mΜ/0.1mΜから0.5mΜ/1.0mΜで
ある。その他の酸化方法も同様に許容できる。いずれに
せよ、再生プロセス中の溶液のpHは、反応に有利に作用
するよう約7.5から9.0に保たれなくてはならない。初期
精製を行なったきわめて還元性の条件は、再生プロセス
中にはもはや用いられない、ということは明白である。
再生プロセス中塩化ナトリウムといった塩の重大な濃縮
を排除することにより、次に続く濃縮／精製段階として
イオン交換クロマトグラフィを用いることが可能とな
る。
単数又は複数は２つの鎖を結合する）を必要とするよう
な生物活性ある２量体構成を打ち立てるジスルフィドに
対するスルフヒドリル基の酸化を可能にするように、再
生が行なわれる。単数又は複数の鎖内ジスルフィドも形
成される。この２量体形成を促進する適当なレドックス
（酸化還元）条件には、酸化された及び還元されたグル
タチオニンといったスルフヒドリル／ジスルフィド試薬
の組合せが含まれる。還元グルタチオン対酸化グルタチ
オン又はその他のスルフヒドリル／ジスルフィドの組合
せの比率は標準的に約2mΜ/0.1mΜから0.5mΜ/1.0mΜで
ある。その他の酸化方法も同様に許容できる。いずれに
せよ、再生プロセス中の溶液のpHは、反応に有利に作用
するよう約7.5から9.0に保たれなくてはならない。初期
精製を行なったきわめて還元性の条件は、再生プロセス
中にはもはや用いられない、ということは明白である。
再生プロセス中塩化ナトリウムといった塩の重大な濃縮
を排除することにより、次に続く濃縮／精製段階として
イオン交換クロマトグラフィを用いることが可能とな
る。
再生プロセス中、CSF−１のより高いオリゴマ種が形
成される可能性がある。この凝縮（集合）プロセスは、
温度制御を通して最低限におさえられ、ここでは、約０
〜４℃という低い温度が25〜37℃というより高い温度よ
りも好ましい。
成される可能性がある。この凝縮（集合）プロセスは、
温度制御を通して最低限におさえられ、ここでは、約０
〜４℃という低い温度が25〜37℃というより高い温度よ
りも好ましい。
再生されたCSF−１調製物の中に存在する残留レドッ
クス剤は、次に続く精製段階中ジスルフィド交換を容易
にする可能性がある。望ましくないこのようなジスルフ
ィド交換を阻止するさらに２つの好ましい方法には、pH
を7.0以下に低下させること又はレドックス試薬を除去
するためのダイアフィルトレーションがある。
クス剤は、次に続く精製段階中ジスルフィド交換を容易
にする可能性がある。望ましくないこのようなジスルフ
ィド交換を阻止するさらに２つの好ましい方法には、pH
を7.0以下に低下させること又はレドックス試薬を除去
するためのダイアフィルトレーションがある。
例えば、再生された二量体CSF−１をさらに精製する
前に、例えばDEAEセファロースを用いたイオン交換クロ
マトグラフィへの再生された物質の直接装入により、レ
ドックス物質の除去及び再生されたタンパク質の濃縮を
行なうことができる。往々にしてこのような手順は８前
後のpHにて行なわれる。しかしながらpHを5.5から7.0の
範囲まで低下させることにより、オリゴマー形成は減少
し、２量体CSF−１収量は増大した。
前に、例えばDEAEセファロースを用いたイオン交換クロ
マトグラフィへの再生された物質の直接装入により、レ
ドックス物質の除去及び再生されたタンパク質の濃縮を
行なうことができる。往々にしてこのような手順は８前
後のpHにて行なわれる。しかしながらpHを5.5から7.0の
範囲まで低下させることにより、オリゴマー形成は減少
し、２量体CSF−１収量は増大した。
再生、濃縮及び精製の後、２量体はさらに残留レドッ
クス物質及びその他のタンパク質から、単量体について
前述したものと類似の手順を用いて精製される。適切な
手段の中には、特に、ゲル透過、疎水性相互作用クロマ
トグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ及び逆相HPLC
などが含まれる。
クス物質及びその他のタンパク質から、単量体について
前述したものと類似の手順を用いて精製される。適切な
手段の中には、特に、ゲル透過、疎水性相互作用クロマ
トグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ及び逆相HPLC
などが含まれる。
発熱物質又はその他のエンドトキシン（内毒素）とい
った望ましくない不純物の除去のための特に有効なプロ
トコルには、フェニル−TSK又はフェニル−セファロー
スカラム上のクロマトグラフィの使用がある。クロマト
グラフィは、基本的にエンドトキシンの無い試薬及び条
件を用いて行なわれる。望まれる２量体CSF−１は、中
性pHにて約1.5Mの硫酸アンモニウムの中で可溶性であり
かつ安定しており、約４℃から約10℃好ましくは約４℃
といった低い温度にてこれらの条件下でカラム上に装入
される。硫酸アンモニウムを付加した時点で形成する沈
殿物を除去すると、再生されたCSF−１の不安定な形態
及びいくつかの集合体が除去される。CSF−１タンパク
質は、中性緩衝液内でエチレングリコールが増大する
（０％から50％）状態で低減する硫酸アンモニウム（1.
5Mから0M）の勾配を用いて溶離させることができる。CS
F−１は、約0.6Mの硫酸アンモニウムで、フェニル−TSK
カラムから35％のエチレングリコールを溶離する。エチ
レングリコールの代りにプロピレングリコールを用いる
ことができるが、この場合溶離条件は幾分か異なる。代
替的な支持体も同様に用いることができ、実際フェニル
−セファロースは、精製CSF−12量体タンパク質のより
大規模な生産のために好まれる。
った望ましくない不純物の除去のための特に有効なプロ
トコルには、フェニル−TSK又はフェニル−セファロー
スカラム上のクロマトグラフィの使用がある。クロマト
グラフィは、基本的にエンドトキシンの無い試薬及び条
件を用いて行なわれる。望まれる２量体CSF−１は、中
性pHにて約1.5Mの硫酸アンモニウムの中で可溶性であり
かつ安定しており、約４℃から約10℃好ましくは約４℃
といった低い温度にてこれらの条件下でカラム上に装入
される。硫酸アンモニウムを付加した時点で形成する沈
殿物を除去すると、再生されたCSF−１の不安定な形態
及びいくつかの集合体が除去される。CSF−１タンパク
質は、中性緩衝液内でエチレングリコールが増大する
（０％から50％）状態で低減する硫酸アンモニウム（1.
5Mから0M）の勾配を用いて溶離させることができる。CS
F−１は、約0.6Mの硫酸アンモニウムで、フェニル−TSK
カラムから35％のエチレングリコールを溶離する。エチ
レングリコールの代りにプロピレングリコールを用いる
ことができるが、この場合溶離条件は幾分か異なる。代
替的な支持体も同様に用いることができ、実際フェニル
−セファロースは、精製CSF−12量体タンパク質のより
大規模な生産のために好まれる。
接 合 上述のCSF−１タンパク質は、（１）１又は複数の遊
離アミノ基、好ましくは生物活性の損失を最低限におさ
えるためわずか１つ又は２つの基、（２）タンパク質上
の少なくとも１つの炭水化物成分、又は（３）クローン
に誘導され再生の後遊離状態にとどまっている１又は複
数の遊離スルフヒドリル基のいずれかを介して、重合体
に接合される。
離アミノ基、好ましくは生物活性の損失を最低限におさ
えるためわずか１つ又は２つの基、（２）タンパク質上
の少なくとも１つの炭水化物成分、又は（３）クローン
に誘導され再生の後遊離状態にとどまっている１又は複
数の遊離スルフヒドリル基のいずれかを介して、重合体
に接合される。
タンパク質に接合された重合体分子の数は、例えば酸
の劣化又は消化及びそれに続くアミノ酸分析〔結合がマ
レイミド又はブロモアセチル対システインの結合であ
り、誘導体化が高い（４モル／モル以上）の場合〕を含
むさまざまな方法によって決定することができる。代替
的には、接合したタンパク質は、酵素（例えばトリプシ
ン）で小さなフラグメントに消化され、カラムクロマト
グラフィで分離されうる。修飾前後のタンパク質のペプ
チド地図を比較し、溶離時間を異にするフラグメントを
配列決定して重合体の付着場所を決定する。第３の変形
態様においては、重合体をカップリングに先立って放射
性標識付けし、CSF−１タンパク質１モルにつき何モル
の放射性重合体が付着されるかを決定することができ
る。比較的均等な分子量の重合体が均等な分子量のCSF
−１に対して接合される場合には、接合体の分子量の測
定が、CSF−1 1分子あたりの重合体数の見積りとして役
立つ。
の劣化又は消化及びそれに続くアミノ酸分析〔結合がマ
レイミド又はブロモアセチル対システインの結合であ
り、誘導体化が高い（４モル／モル以上）の場合〕を含
むさまざまな方法によって決定することができる。代替
的には、接合したタンパク質は、酵素（例えばトリプシ
ン）で小さなフラグメントに消化され、カラムクロマト
グラフィで分離されうる。修飾前後のタンパク質のペプ
チド地図を比較し、溶離時間を異にするフラグメントを
配列決定して重合体の付着場所を決定する。第３の変形
態様においては、重合体をカップリングに先立って放射
性標識付けし、CSF−１タンパク質１モルにつき何モル
の放射性重合体が付着されるかを決定することができ
る。比較的均等な分子量の重合体が均等な分子量のCSF
−１に対して接合される場合には、接合体の分子量の測
定が、CSF−1 1分子あたりの重合体数の見積りとして役
立つ。
接合させるべき残基は、以下のようなものであり得
る：（１）何らかの遊離アミノ基（リジン残基における
ε−アミノ基、又は場合によってはＮ末端における遊離
アミン基）、（２）CSF−１に導入又は構成されている
システイン残基上の遊離スルフヒドリル基、又は（３）
炭水化物成分（他の箇所で論述）。タンパク質は、PEG
により遊離アミノ基上で適度に誘導体化されている場合
（すなわち約１乃至３の修飾アミノ酸残基を含んでいる
場合）、誘導体化されていないCSF−１の生物活性の25
％から100％を保持しているということがわかってい
る。しかしながら、それがPEGで高度に誘導体化されて
いる場合、接合タンパク質に、CSF−１のタイプ、PEG重
合体の長さ及び使用されたリンカー及び反応条件に応じ
て、著しく低い可測生物活性を有する。
る：（１）何らかの遊離アミノ基（リジン残基における
ε−アミノ基、又は場合によってはＮ末端における遊離
アミン基）、（２）CSF−１に導入又は構成されている
システイン残基上の遊離スルフヒドリル基、又は（３）
炭水化物成分（他の箇所で論述）。タンパク質は、PEG
により遊離アミノ基上で適度に誘導体化されている場合
（すなわち約１乃至３の修飾アミノ酸残基を含んでいる
場合）、誘導体化されていないCSF−１の生物活性の25
％から100％を保持しているということがわかってい
る。しかしながら、それがPEGで高度に誘導体化されて
いる場合、接合タンパク質に、CSF−１のタイプ、PEG重
合体の長さ及び使用されたリンカー及び反応条件に応じ
て、著しく低い可測生物活性を有する。
タンパク質が付着される重合体は、あらゆる場合にお
いて室温で水溶性をもつことをその条件として、ポリエ
チレングリコール（PEG）のホモポリマー又はポリプロ
ピレングリコール（PPG）のホモポリマー、ポリオキシ
エチル化ポリオール又はポリビニル・アルコールであ
る。ポリオキシエチル化されたポリオールには、ポリオ
キシエチル化グリセロール、ポリオキシエチル化ソルビ
トール、ポリオキシエチル化グルコースなどがある。
いて室温で水溶性をもつことをその条件として、ポリエ
チレングリコール（PEG）のホモポリマー又はポリプロ
ピレングリコール（PPG）のホモポリマー、ポリオキシ
エチル化ポリオール又はポリビニル・アルコールであ
る。ポリオキシエチル化されたポリオールには、ポリオ
キシエチル化グリセロール、ポリオキシエチル化ソルビ
トール、ポリオキシエチル化グルコースなどがある。
ポリオキシエチル化グリセロールのグリセロールバッ
クボーンは、例えばモノ、ジ、及びトリグリセリドの形
で動物及びヒトなどの体内に天然に発生するものと同じ
バックボーンである。従ってかかる化合物は、人体内で
必ずしも異質のものとはみられない可能性がある。
クボーンは、例えばモノ、ジ、及びトリグリセリドの形
で動物及びヒトなどの体内に天然に発生するものと同じ
バックボーンである。従ってかかる化合物は、人体内で
必ずしも異質のものとはみられない可能性がある。
重合体の平均分子量は好ましくは、例えば使用される
特定のCSF−１の分子量に応じて約1000から100000ダル
トンの間好ましくは約4000から40000ダルトンの間であ
る。変更の目的は、生物活性が保持され未複合タンパク
質に比べ生体内半減期が高められ、しかも免疫原性が減
少した場合タンパク質を得ることにあるため、重合体の
分子量は、これらの条件を最適化するよう選択されるこ
とになる（例えば、約80kd以上の見かけの分子量の変更
２量体CSF−１タンパク質）。
特定のCSF−１の分子量に応じて約1000から100000ダル
トンの間好ましくは約4000から40000ダルトンの間であ
る。変更の目的は、生物活性が保持され未複合タンパク
質に比べ生体内半減期が高められ、しかも免疫原性が減
少した場合タンパク質を得ることにあるため、重合体の
分子量は、これらの条件を最適化するよう選択されるこ
とになる（例えば、約80kd以上の見かけの分子量の変更
２量体CSF−１タンパク質）。
天然の２量体CSF−１（すなわち組換え型でないタン
パク質）を誘導体化することによって得られるもう１つ
の利点は、精製のむずかしい希少なCSF−１の使用がか
かる変更により最大限になるということである。
パク質）を誘導体化することによって得られるもう１つ
の利点は、精製のむずかしい希少なCSF−１の使用がか
かる変更により最大限になるということである。
好ましくは、PEGホモポリマーはアルキル基で一端に
て置換されるが、これは未置換状態のままでもよい。好
ましくはアルキル基はC1−C4アルキル基であり、最も好
ましくはメチル基である。最も好ましくは、重合体はモ
ノメチル置換されたPEGホモポリマーであり、その分子
量は約4000乃至40000ダルトンである。
て置換されるが、これは未置換状態のままでもよい。好
ましくはアルキル基はC1−C4アルキル基であり、最も好
ましくはメチル基である。最も好ましくは、重合体はモ
ノメチル置換されたPEGホモポリマーであり、その分子
量は約4000乃至40000ダルトンである。
共有結合修飾反応は、上述の方法のいずれによって
も、好ましくは約pH5−９でさらに好ましくは７−９で
（タンパク質上の反応基が遊離アミノ基である場合）で
行なわれてよい。後者のアプローチを用いると、タンパ
ク質は、重合体に付加された少なくとも１つの末端反応
基を介して接合される。この反応基（単数又は複数）を
伴う重合体をここでは「活性化重合体」と呼ぶ。反応基
は、タンパク質の遊離アミノ又はその他の反応基と選択
的に反応する。（複数の反応基がある場合、架橋を防ぐ
ため複合条件を入念に制御しなくてはならない。しかし
ながら、１価の種が好まれる）。
も、好ましくは約pH5−９でさらに好ましくは７−９で
（タンパク質上の反応基が遊離アミノ基である場合）で
行なわれてよい。後者のアプローチを用いると、タンパ
ク質は、重合体に付加された少なくとも１つの末端反応
基を介して接合される。この反応基（単数又は複数）を
伴う重合体をここでは「活性化重合体」と呼ぶ。反応基
は、タンパク質の遊離アミノ又はその他の反応基と選択
的に反応する。（複数の反応基がある場合、架橋を防ぐ
ため複合条件を入念に制御しなくてはならない。しかし
ながら、１価の種が好まれる）。
使用される無傷の活性化重合体の量は、一般に、タン
パク質に対する活性重合体のモル過剰分の約１倍から30
倍である。使用される正確なモル比は、使用される活性
化重合体のタイプ、pH、タンパク質濃度及び使用される
CSF−１分子を含む数多くの変数によって左右される。P
EG−クロル蟻酸塩の活性エステル以外の活性化重合体に
ついては、タンパク質に対する活性化重合体のモル過剰
分は、好ましくはアミノ基の誘導体化のためのCSF−1 2
量体１モルあたり約11モル未満であり、さらに好ましく
はCSF−1 1モルあたり約１モルから８モルである。タン
パク質に対するPEG−クロロ蟻酸塩の活性エステル（PEG
−PNP）のモル過剰分は、好ましくは、アミノ基の誘導
体化のためのCSF−1 2量体１モルあたり約５モル未満で
あり、さらに好ましくはCSF−1 1モルあたり約１モルか
ら２モルである。
パク質に対する活性重合体のモル過剰分の約１倍から30
倍である。使用される正確なモル比は、使用される活性
化重合体のタイプ、pH、タンパク質濃度及び使用される
CSF−１分子を含む数多くの変数によって左右される。P
EG−クロル蟻酸塩の活性エステル以外の活性化重合体に
ついては、タンパク質に対する活性化重合体のモル過剰
分は、好ましくはアミノ基の誘導体化のためのCSF−1 2
量体１モルあたり約11モル未満であり、さらに好ましく
はCSF−1 1モルあたり約１モルから８モルである。タン
パク質に対するPEG−クロロ蟻酸塩の活性エステル（PEG
−PNP）のモル過剰分は、好ましくは、アミノ基の誘導
体化のためのCSF−1 2量体１モルあたり約５モル未満で
あり、さらに好ましくはCSF−1 1モルあたり約１モルか
ら２モルである。
一般に、この方法には、活性化重合体を調製すること
ならびにその後活性化重合体とタンパク質を反応させる
ことが関与している。標準的には、反応は約７〜９のpH
の緩衝液内、往々にして、内部エステルを含まないPEG
−NHS試薬が用いられる場合には約10mMのHepes（pH7.
5）,100mMのNaClで、或いは又、PEG−PNP試薬が用いら
れる場合には約50mMのホウ酸ナトリウム（pH9）で行な
われる。これら両方について以下に記述する。反応は一
般に約20分から約12時間０℃から25℃で、好ましくは20
℃で25分から35分又は４℃で３時間、行なわれる。複合
の後、望ましい生成物が回収され、カラムクロマトグラ
フィなどによって純化される。
ならびにその後活性化重合体とタンパク質を反応させる
ことが関与している。標準的には、反応は約７〜９のpH
の緩衝液内、往々にして、内部エステルを含まないPEG
−NHS試薬が用いられる場合には約10mMのHepes（pH7.
5）,100mMのNaClで、或いは又、PEG−PNP試薬が用いら
れる場合には約50mMのホウ酸ナトリウム（pH9）で行な
われる。これら両方について以下に記述する。反応は一
般に約20分から約12時間０℃から25℃で、好ましくは20
℃で25分から35分又は４℃で３時間、行なわれる。複合
の後、望ましい生成物が回収され、カラムクロマトグラ
フィなどによって純化される。
活性PEGを用いた修飾反応は、単数又は複数の段階を
用いて、以下に記す数多くの方法で実行できる。一段階
反応で活性化PEGを生産するのに用いることのできる適
当な修飾剤の例としては、塩化シアヌール酸（2,4,6−
トリクロロ−Ｓ−トリアジン）及びフッ化シアヌール酸
がある。
用いて、以下に記す数多くの方法で実行できる。一段階
反応で活性化PEGを生産するのに用いることのできる適
当な修飾剤の例としては、塩化シアヌール酸（2,4,6−
トリクロロ−Ｓ−トリアジン）及びフッ化シアヌール酸
がある。
１つの好ましい実施態様においては、変更反応は２段
階で行なわれ、ここにおいてPEG−OHはまず第一に無水
コハク酸又は無水グルタル酸といった無水酸と反応させ
られてカルボキシル酸を形成し、次にカルボキシル酸は
これと反応できる１つの化合物と反応させられて、タン
パク質と反応しうる反応性エステル基と共に活性化され
たPEGを形成する。かかる化合物の例としては、Ｎ−ヒ
ドロキシスクシニミド、スルフォ−Ｎ−ヒドロキシスク
シニミド、４−ヒドロキシ−３−ニトロベンゼンスルフ
ォン酸などが挙げられる。好ましくは、Ｎ−ヒドロキシ
スクシニミドが用いられる。
階で行なわれ、ここにおいてPEG−OHはまず第一に無水
コハク酸又は無水グルタル酸といった無水酸と反応させ
られてカルボキシル酸を形成し、次にカルボキシル酸は
これと反応できる１つの化合物と反応させられて、タン
パク質と反応しうる反応性エステル基と共に活性化され
たPEGを形成する。かかる化合物の例としては、Ｎ−ヒ
ドロキシスクシニミド、スルフォ−Ｎ−ヒドロキシスク
シニミド、４−ヒドロキシ−３−ニトロベンゼンスルフ
ォン酸などが挙げられる。好ましくは、Ｎ−ヒドロキシ
スクシニミドが用いられる。
例えば、モノメチル置換PEGを高温例えば約100℃から
110℃で４時間、無水グルタル酸と反応させることがで
きる。こうして生産されたモノメチルPEG−グルタル酸
は、次にジシクロヘキシル又はジイソプロピルカルボジ
イミドといったカルボジイミド試薬の存在する中でＮ−
ヒドロキシスクシニミドと反応させられ、活性化重合
体、メトキシポリエチレングリコール−Ｎ−スクシニミ
ジルグルタル酸塩を生成し、これは次に純化後のタンパ
ク質と反応させることができる。この方法については、
Abuchowski他、Cancer Biochem,Biophys.７:175−186
（1984年）内に詳述されている。
110℃で４時間、無水グルタル酸と反応させることがで
きる。こうして生産されたモノメチルPEG−グルタル酸
は、次にジシクロヘキシル又はジイソプロピルカルボジ
イミドといったカルボジイミド試薬の存在する中でＮ−
ヒドロキシスクシニミドと反応させられ、活性化重合
体、メトキシポリエチレングリコール−Ｎ−スクシニミ
ジルグルタル酸塩を生成し、これは次に純化後のタンパ
ク質と反応させることができる。この方法については、
Abuchowski他、Cancer Biochem,Biophys.７:175−186
（1984年）内に詳述されている。
もう１つの例においては、モノメチル置換PEGを無水
グルタル酸と反応させ、その後ジシクロヘキシルカルボ
ジイミドの存在する中で４−ヒドロキシ−３−ニトロベ
ンゼンスルフォン酸（HNSA）と反応させて、活性化重合
体を生成することができる。HNSAについては、Bhatraga
r他著Peptides:Synthesis−Sturcture−Function,Proce
edings of Seventh American Peptide Symposium（ペプ
チド：その合成−構造−機能、第７回米国ペプチドシン
ポジウム議事録）、Rich他（eds.）（Pierce Chemical
Co.Rockford IL,1981年）、p97−100,Nitecki他著High
Technology Route to Virus Vaccines（ウイルスワクチ
ンへのハイテクの道）（American Society for Microbi
ology;1985年）、p43〜46（1984年11月８日〜10日の座
談会に基づく）、表題「Novel Agent for Coupling Syn
thetic Peptides to Carriers and Its Application
（担体に対する合成ペプチドの新しいカップリング剤と
その応用）」、ならびにAldwin他著、Anal.Biochem.（1
987年）164:494−501の中で記述されている。これら全
ての開示は、本書中に参考文献として内含されている。
グルタル酸と反応させ、その後ジシクロヘキシルカルボ
ジイミドの存在する中で４−ヒドロキシ−３−ニトロベ
ンゼンスルフォン酸（HNSA）と反応させて、活性化重合
体を生成することができる。HNSAについては、Bhatraga
r他著Peptides:Synthesis−Sturcture−Function,Proce
edings of Seventh American Peptide Symposium（ペプ
チド：その合成−構造−機能、第７回米国ペプチドシン
ポジウム議事録）、Rich他（eds.）（Pierce Chemical
Co.Rockford IL,1981年）、p97−100,Nitecki他著High
Technology Route to Virus Vaccines（ウイルスワクチ
ンへのハイテクの道）（American Society for Microbi
ology;1985年）、p43〜46（1984年11月８日〜10日の座
談会に基づく）、表題「Novel Agent for Coupling Syn
thetic Peptides to Carriers and Its Application
（担体に対する合成ペプチドの新しいカップリング剤と
その応用）」、ならびにAldwin他著、Anal.Biochem.（1
987年）164:494−501の中で記述されている。これら全
ての開示は、本書中に参考文献として内含されている。
エステル結合はアミド結合に比べて化学的及び生理学
的により反応性が高いため、最終生成物の中でエステル
を生成しない活性化ポリエチレングリコール分子とタン
パク質を誘導体化することが好ましい可能性がある。
的により反応性が高いため、最終生成物の中でエステル
を生成しない活性化ポリエチレングリコール分子とタン
パク質を誘導体化することが好ましい可能性がある。
１実施態様においては、PEGは、出発物質としてPEG−
アミン又はPEG−OHを用いてタンパク質に対する付着の
ために活性化されうる。PEG−OHは、本書中にその開示
が参考文献として内含されているV.N.R.Pillan他のJ.Or
ganic Chem.45:5364−5370（1980年）により記述されて
いるように、PEG−アミンに変換されうる。簡単に言う
と、mPEG−OHをmPEG−トシル化物にその後mPEGフタルイ
ミドに変換することによりモノメチルPEG−アミン（mPE
G）が調製され、フタルイミドはヒドラジンで分割され
て、ガブリエル合成でmPEG−NH2を生成する。次にmPEG
−アミンは室温にて約４時間無水グルタル酸と反応させ
られ、mPEG−NHCO（CH2）3COOHを生成する。反応後、生
成物を沈殿させ、純化させ、Ｎ−ヒドロキシスクシニミ
ド及びジシクロヘキシルカルボジイミドと反応させて、 を生成する。この化合物を次に、CSF−１ポリペプチド
の適当な遊離アミノ基と反応させることができる。
アミン又はPEG−OHを用いてタンパク質に対する付着の
ために活性化されうる。PEG−OHは、本書中にその開示
が参考文献として内含されているV.N.R.Pillan他のJ.Or
ganic Chem.45:5364−5370（1980年）により記述されて
いるように、PEG−アミンに変換されうる。簡単に言う
と、mPEG−OHをmPEG−トシル化物にその後mPEGフタルイ
ミドに変換することによりモノメチルPEG−アミン（mPE
G）が調製され、フタルイミドはヒドラジンで分割され
て、ガブリエル合成でmPEG−NH2を生成する。次にmPEG
−アミンは室温にて約４時間無水グルタル酸と反応させ
られ、mPEG−NHCO（CH2）3COOHを生成する。反応後、生
成物を沈殿させ、純化させ、Ｎ−ヒドロキシスクシニミ
ド及びジシクロヘキシルカルボジイミドと反応させて、 を生成する。この化合物を次に、CSF−１ポリペプチド
の適当な遊離アミノ基と反応させることができる。
もう１つの実施態様において、かかる接合に有用なポ
リエチレングリコールカルボキシル酸の活性エステル形
態は、Nitechi他、Peptide Chemistry 1987年、Shiba
＆ Sakakibara（Ed）,Protein Research Foundation
（タンパク質研究基金）、大阪（1988年）の中で記述さ
れている。簡単に言うと、活性エステルは以下のような
化学式を有している： Ｒ′−（Ｏ−CH2−CH2）ｎ−Ｏ−（CHR2）−CO−OLG
（Ｉ）又は Ｒ′−（Ｏ−CH2−CH2）ｎ−１−Ｏ−CH2−CO−OLG
（II） なお式中、Ｒ′は１〜４個の炭素原子の低級アルキル基
であり、R2はＨ又は一有機置換基であり、ｎは約８〜50
0、LGは、シアノメチルの中から選ばれた脱落基、芳香
族基をより不安定にする１〜５個の置換基と置換された
フェニル又はナフェニル基の中から選ばれる芳香族基及
びこれらの置換基を１〜４個選択的に含むピリジル基で
ある。これらのエステルは、化合物Ｉについてはアルフ
ァ−ハロアルカン酸又はそのエステルでのポリエチレン
グリコールのアルキル化とそれに続くHO−CH2−CN又はL
Gに相当する基でのエステル化によって、或いは又化合
物（II）についてはその酸へのPEGの酸化とそれに続くH
O−CH2−CN又はLGに相当する基でのエステル化によって
生成されうる。、最も好ましくは、化学式Ｉが調製さ
れ、活性化剤は、パラ−ニトロフェノール又はオルトニ
トロフェノールである。最も好ましくは、重合体のパラ
−ニトロフェニルエステルから形成されたアミド結合を
介して、重合体をタンパク質に接合させる。例えば、PE
G−OHをPEG−Ｏ−に変換させBrCH2CO2CH3と反応させた
り、メチルエステルを加水分解させたり、酸をジシクロ
ヘキシルカルボジイミドの存在する中でｐ−ニトロフェ
ノールと反応させて を生成することができる。この重合体の方は、精製の
後、CSF−１の利用可能な遊離アミノ基と反応させられ
る。
リエチレングリコールカルボキシル酸の活性エステル形
態は、Nitechi他、Peptide Chemistry 1987年、Shiba
＆ Sakakibara（Ed）,Protein Research Foundation
（タンパク質研究基金）、大阪（1988年）の中で記述さ
れている。簡単に言うと、活性エステルは以下のような
化学式を有している： Ｒ′−（Ｏ−CH2−CH2）ｎ−Ｏ−（CHR2）−CO−OLG
（Ｉ）又は Ｒ′−（Ｏ−CH2−CH2）ｎ−１−Ｏ−CH2−CO−OLG
（II） なお式中、Ｒ′は１〜４個の炭素原子の低級アルキル基
であり、R2はＨ又は一有機置換基であり、ｎは約８〜50
0、LGは、シアノメチルの中から選ばれた脱落基、芳香
族基をより不安定にする１〜５個の置換基と置換された
フェニル又はナフェニル基の中から選ばれる芳香族基及
びこれらの置換基を１〜４個選択的に含むピリジル基で
ある。これらのエステルは、化合物Ｉについてはアルフ
ァ−ハロアルカン酸又はそのエステルでのポリエチレン
グリコールのアルキル化とそれに続くHO−CH2−CN又はL
Gに相当する基でのエステル化によって、或いは又化合
物（II）についてはその酸へのPEGの酸化とそれに続くH
O−CH2−CN又はLGに相当する基でのエステル化によって
生成されうる。、最も好ましくは、化学式Ｉが調製さ
れ、活性化剤は、パラ−ニトロフェノール又はオルトニ
トロフェノールである。最も好ましくは、重合体のパラ
−ニトロフェニルエステルから形成されたアミド結合を
介して、重合体をタンパク質に接合させる。例えば、PE
G−OHをPEG−Ｏ−に変換させBrCH2CO2CH3と反応させた
り、メチルエステルを加水分解させたり、酸をジシクロ
ヘキシルカルボジイミドの存在する中でｐ−ニトロフェ
ノールと反応させて を生成することができる。この重合体の方は、精製の
後、CSF−１の利用可能な遊離アミノ基と反応させられ
る。
もう１つの実施態様においては、PEG−OHはクロロ蟻
酸塩（クロロカーボネートとも呼ばれる）と反応させら
れ（PEG−PNP）とも呼ばれるPEG活性エステルを形成す
る。PEG活性エステルが形成されると、これをCSF−１と
反応させてPEG/CSF−１接合体を形成する。その全体が
本書中に参考文献として内含されているVeronese他の19
85年、Biochem.and Biotech.11:141−152も同様に参照
されたい。クロル蟻酸塩は、Aldrichといった会社から
購入できる。これを以下に等式（１）に示されているよ
うに作ることも可能である。
酸塩（クロロカーボネートとも呼ばれる）と反応させら
れ（PEG−PNP）とも呼ばれるPEG活性エステルを形成す
る。PEG活性エステルが形成されると、これをCSF−１と
反応させてPEG/CSF−１接合体を形成する。その全体が
本書中に参考文献として内含されているVeronese他の19
85年、Biochem.and Biotech.11:141−152も同様に参照
されたい。クロル蟻酸塩は、Aldrichといった会社から
購入できる。これを以下に等式（１）に示されているよ
うに作ることも可能である。
クロル蟻酸塩は、塩化カルボニルとしても知られてい
るホスゲンを、−OHを有する炭素上に電子求引性置換体
を含むアルコール（Ｒ−OH）と反応させることによって
作られる。アルコールは好ましくは酸性アルコール、さ
らに好ましくは高い消衰係数をもつ芳香族環を含む酸性
アルコールである。Ｒ基の例は、以下のようなものであ
る:N−ヒドロキシ−スクシニミド、Ｎ−ヒドロキシ−ス
ルフォスクシニミド、シアノメチルエステル、ベンゼ
ン、ナフタレン上の全てのニトロ、クロロ及びシアノ置
換、又はピリジン、パラニトロフェノール（PNP）、オ
ルト−ニトロフェノール（ONP）などの、ヘテロ原子を
含んでいても含まなくてもよいさらに大きい芳香環系な
どである。最も好ましいＲ基はPNP及びONPである。
るホスゲンを、−OHを有する炭素上に電子求引性置換体
を含むアルコール（Ｒ−OH）と反応させることによって
作られる。アルコールは好ましくは酸性アルコール、さ
らに好ましくは高い消衰係数をもつ芳香族環を含む酸性
アルコールである。Ｒ基の例は、以下のようなものであ
る:N−ヒドロキシ−スクシニミド、Ｎ−ヒドロキシ−ス
ルフォスクシニミド、シアノメチルエステル、ベンゼ
ン、ナフタレン上の全てのニトロ、クロロ及びシアノ置
換、又はピリジン、パラニトロフェノール（PNP）、オ
ルト−ニトロフェノール（ONP）などの、ヘテロ原子を
含んでいても含まなくてもよいさらに大きい芳香環系な
どである。最も好ましいＲ基はPNP及びONPである。
クロル蟻酸塩が形成されると、これはPEG−OHと反応
させられて等式（２）に示されているようにPEG活性エ
ステルを形成する。
させられて等式（２）に示されているようにPEG活性エ
ステルを形成する。
クロル蟻酸塩は、２つのサイトすなわち塩素とカルボ
ニル基の間の結合（比較的反応性が高い）及びカルボニ
ルとＯ−Ｒ基の間の結合（比較的反応性が低い）におい
て反応性を有する。さらに反応性の高いサイトは、クロ
ル蟻酸塩がPEGに結合するところである。PEG−OH及びク
ロル蟻酸塩は好ましくは、CHCl3又はCH2Cl2といった適
当な溶剤中で室温にて同時に付加される。好ましくは、
０時間から１時間後までの間にアシル化触媒が加えられ
る。好ましくはこの触媒はピリジン又はジメチルピリジ
ンである。好ましくはクロル蟻酸塩は、最高12Mの過剰
分さらに好ましくは2Mの過剰分になるまで付加される。
この混合物を好ましくは４時間さらに好ましくは16時間
混合させる。この時点で、沈殿物が形成する可能性があ
る。この沈殿物は、ろ過により除去されるか又は廃棄さ
れる。ホワットマングラスファイバフィルタ（GH/B）と
いったろ過装置が受容可能である。結果として得られる
溶液にはPEG活性エステルならびに未反応のPEG及び過剰
のクロル蟻酸塩が含まれている。これはエーテルを付加
することにより沈殿させられる。好ましくはエーテルは
ジエチルエーテルである。沈殿物は、PEG活性エステル
を含み、エーテルといった適当な溶剤を用いて洗浄さ
れ、必要とあらば再度溶解又は再度沈殿させることがで
きる。PEG活性エステルが形成されると、等式（３）に
示されているようにCSF−１とこれを複合させる： PEG活性エステルのクロル蟻酸塩部分はなお、利用可能
な反応性の比較的低いサイトを有している。このサイト
では、PEGとCSF−１の間の共有結合が形成される。最終
生成物の中では、PEG部分はカルバミン酸塩とも呼ばれ
るウレタンによりCSF−１に結合され、結合は 構造をもつ。この結合は比較的安定しており、生理学的
条件の下でほとんど又は全く加水分解なくPEGをCSF−１
に複合された状態に保つことになる。
ニル基の間の結合（比較的反応性が高い）及びカルボニ
ルとＯ−Ｒ基の間の結合（比較的反応性が低い）におい
て反応性を有する。さらに反応性の高いサイトは、クロ
ル蟻酸塩がPEGに結合するところである。PEG−OH及びク
ロル蟻酸塩は好ましくは、CHCl3又はCH2Cl2といった適
当な溶剤中で室温にて同時に付加される。好ましくは、
０時間から１時間後までの間にアシル化触媒が加えられ
る。好ましくはこの触媒はピリジン又はジメチルピリジ
ンである。好ましくはクロル蟻酸塩は、最高12Mの過剰
分さらに好ましくは2Mの過剰分になるまで付加される。
この混合物を好ましくは４時間さらに好ましくは16時間
混合させる。この時点で、沈殿物が形成する可能性があ
る。この沈殿物は、ろ過により除去されるか又は廃棄さ
れる。ホワットマングラスファイバフィルタ（GH/B）と
いったろ過装置が受容可能である。結果として得られる
溶液にはPEG活性エステルならびに未反応のPEG及び過剰
のクロル蟻酸塩が含まれている。これはエーテルを付加
することにより沈殿させられる。好ましくはエーテルは
ジエチルエーテルである。沈殿物は、PEG活性エステル
を含み、エーテルといった適当な溶剤を用いて洗浄さ
れ、必要とあらば再度溶解又は再度沈殿させることがで
きる。PEG活性エステルが形成されると、等式（３）に
示されているようにCSF−１とこれを複合させる： PEG活性エステルのクロル蟻酸塩部分はなお、利用可能
な反応性の比較的低いサイトを有している。このサイト
では、PEGとCSF−１の間の共有結合が形成される。最終
生成物の中では、PEG部分はカルバミン酸塩とも呼ばれ
るウレタンによりCSF−１に結合され、結合は 構造をもつ。この結合は比較的安定しており、生理学的
条件の下でほとんど又は全く加水分解なくPEGをCSF−１
に複合された状態に保つことになる。
大腸菌からのホモダイマー組換え型CSF−１は、再生
が適切に完了された後は、多数の反応性遊離スルフヒド
リル基を含んでいない。しかしながら、クローンを遺伝
子的に変更して、再生の後もスルフヒドリル基を保持し
うる単数又は複数の新奇のシステイン残基を含み入れる
ことも可能である。このように生成されたCSF−１突然
変異タンパク質はなお、ここにおいて有用であるべく有
意な生物活性を保持していなくてはならない。
が適切に完了された後は、多数の反応性遊離スルフヒド
リル基を含んでいない。しかしながら、クローンを遺伝
子的に変更して、再生の後もスルフヒドリル基を保持し
うる単数又は複数の新奇のシステイン残基を含み入れる
ことも可能である。このように生成されたCSF−１突然
変異タンパク質はなお、ここにおいて有用であるべく有
意な生物活性を保持していなくてはならない。
あるいは、cys159上といったいくつかのSH基が活性化
重合体による変更に使用可能となるようにホモダイマー
を部分的に再生するか又は選択されたヘテロダイマーを
作り出すことによって、遊離スルフヒドリルを生成する
ことができる。
重合体による変更に使用可能となるようにホモダイマー
を部分的に再生するか又は選択されたヘテロダイマーを
作り出すことによって、遊離スルフヒドリルを生成する
ことができる。
システイン残基を介してタンパク質が複合される場
合、好ましい接合様式は以下のとおりである：すなわ
ち、上述のようなmPEG−NH2は、好ましくは0.5時間から
1.5時間室温で、Nitecki他、High−Technology Route t
o Virus Vaccines（Amer.Soc.for Microbiol.1985年）p
43〜46、（前述）により記述されている４−ヒドロキシ
−３−ニトロベンゼンスルフォン酸のＮ−マレイミド−
６−アミノカプロン酸エステル（mal−sac−HNSA）と反
応させられる。かかる反応は好ましくは、PEG−NH2に対
し約５倍のmal−sac HNSAのモル過剰分で、行なわれ
る。加水分解された又は未反応のmal−sac HNSAの除去
（例えば、透析、ダイアフィルトレーション又はサイズ
排除クロマトグラフィによる）の後、次に、等モル量の
試薬及びタンパク質を用いて緩衝液内で室温でタンパク
質と試薬を反応させることができる。Ｎ−スクシニミジ
ル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−
１−カルボキシル酸塩（SMCC）又はHCH2CO−NH（CH2）
５−HNSAエステル（なお式中ＸはBr,Cl又はＩである）
といったその他の試薬も、当業者にとっては周知のさま
ざまな反応条件の下でmal−sec HNSAと同じ機能を果た
すことができる。
合、好ましい接合様式は以下のとおりである：すなわ
ち、上述のようなmPEG−NH2は、好ましくは0.5時間から
1.5時間室温で、Nitecki他、High−Technology Route t
o Virus Vaccines（Amer.Soc.for Microbiol.1985年）p
43〜46、（前述）により記述されている４−ヒドロキシ
−３−ニトロベンゼンスルフォン酸のＮ−マレイミド−
６−アミノカプロン酸エステル（mal−sac−HNSA）と反
応させられる。かかる反応は好ましくは、PEG−NH2に対
し約５倍のmal−sac HNSAのモル過剰分で、行なわれ
る。加水分解された又は未反応のmal−sac HNSAの除去
（例えば、透析、ダイアフィルトレーション又はサイズ
排除クロマトグラフィによる）の後、次に、等モル量の
試薬及びタンパク質を用いて緩衝液内で室温でタンパク
質と試薬を反応させることができる。Ｎ−スクシニミジ
ル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−
１−カルボキシル酸塩（SMCC）又はHCH2CO−NH（CH2）
５−HNSAエステル（なお式中ＸはBr,Cl又はＩである）
といったその他の試薬も、当業者にとっては周知のさま
ざまな反応条件の下でmal−sec HNSAと同じ機能を果た
すことができる。
接合体の精製 接合反応の後、反応条件に応じて異なるアイデンティ
ティを有する種の混合物が存在する可能性がある。CSF
−１に対し接合されるPEG部分の数において異なるこれ
らの種は、クロマトグラフィ、電気泳動及び塩分別を含
むさまざまな方法により分離されうる。フェニル−セフ
ァロースを用いた疎水性相互作用クロマトグラフィ（HI
C）が特に有用であることが示される。非還元性SDS−PA
GE又は分子ふるいクロマトグラフィを用いてサイズ分離
を達成することもできる。さらにCSF−１接合体ならび
にインターロイキン−２（IL−２）といった他のタンパ
ク質の接合体の塩析も有用であることが立証された。一
般に用いられる塩は硫酸アンモニウム、（NH4）2SO4;硫
酸ナトリウム、Na2SO4;マグネシウム塩及びリン酸塩で
ある。複合度の高い種は、接合度の低いタンパク質及び
未接合タンパク質に比べて低い塩濃度で沈殿した。部分
的に精製された種のこれらの技術のうちのいずれかを通
しての再循環は、結果として、タンパク質１分子あたり
の重合体数に関しほぼ相同の接合タンパク質種をもたら
す可能性がある。
ティを有する種の混合物が存在する可能性がある。CSF
−１に対し接合されるPEG部分の数において異なるこれ
らの種は、クロマトグラフィ、電気泳動及び塩分別を含
むさまざまな方法により分離されうる。フェニル−セフ
ァロースを用いた疎水性相互作用クロマトグラフィ（HI
C）が特に有用であることが示される。非還元性SDS−PA
GE又は分子ふるいクロマトグラフィを用いてサイズ分離
を達成することもできる。さらにCSF−１接合体ならび
にインターロイキン−２（IL−２）といった他のタンパ
ク質の接合体の塩析も有用であることが立証された。一
般に用いられる塩は硫酸アンモニウム、（NH4）2SO4;硫
酸ナトリウム、Na2SO4;マグネシウム塩及びリン酸塩で
ある。複合度の高い種は、接合度の低いタンパク質及び
未接合タンパク質に比べて低い塩濃度で沈殿した。部分
的に精製された種のこれらの技術のうちのいずれかを通
しての再循環は、結果として、タンパク質１分子あたり
の重合体数に関しほぼ相同の接合タンパク質種をもたら
す可能性がある。
製 剤 このように変更され選択的に接合程度に関し精製され
たタンパク質は、次に、好ましくは約３から８さらに好
ましくは５から８のpHで、非毒性の安定した薬学的に受
諾可能な水性担体媒質に製剤される。投与は、従来のプ
ロトコル及び養生法によるが、好ましくは静脈内投与を
含む全身系のものである。診断目的といった生体外応用
については、投与様式や製剤形態は重要ではない。一般
には、培養基又はかん流媒質と相容性のある水性製剤形
態が用いられる。治療のため生体内で用いられる場合、
かかる化合物は当該技術分野において既知のとおり、注
入用の水、緩衝液及び安定剤といった従来の生理学的に
受諾可能な賦形剤を含んでいてもよい。マンニトールと
いった水溶性の担体もオプションとして媒質に付加する
ことができる。
たタンパク質は、次に、好ましくは約３から８さらに好
ましくは５から８のpHで、非毒性の安定した薬学的に受
諾可能な水性担体媒質に製剤される。投与は、従来のプ
ロトコル及び養生法によるが、好ましくは静脈内投与を
含む全身系のものである。診断目的といった生体外応用
については、投与様式や製剤形態は重要ではない。一般
には、培養基又はかん流媒質と相容性のある水性製剤形
態が用いられる。治療のため生体内で用いられる場合、
かかる化合物は当該技術分野において既知のとおり、注
入用の水、緩衝液及び安定剤といった従来の生理学的に
受諾可能な賦形剤を含んでいてもよい。マンニトールと
いった水溶性の担体もオプションとして媒質に付加する
ことができる。
修飾CSF−１は、単独の有効成分としてでも又相補的
活性をもつその他のタンパク質又は化合物と組合わせた
形ででも使用可能である。かかるその他の化合物として
は、IL−1,−2,−3,−４インターフェロン（アルファ、
ベータ又はガンマ）といったリンフォカインのアドリア
マイシン、GM−CSF;G−CSF及び腫瘍壊死因子などの抗腫
瘍剤が含まれうる。変更CSF−１の効果は、このような
付加的な成分の存在により改良されうる。タンパク質を
含む薬学的化合物についての製剤技術の要約は、例え
ば、Remingtonの薬学（Reming−tor's Pharmacentical
Science）,Mack Publishing Co.,Easton,PA,最新版に記
されている。
活性をもつその他のタンパク質又は化合物と組合わせた
形ででも使用可能である。かかるその他の化合物として
は、IL−1,−2,−3,−４インターフェロン（アルファ、
ベータ又はガンマ）といったリンフォカインのアドリア
マイシン、GM−CSF;G−CSF及び腫瘍壊死因子などの抗腫
瘍剤が含まれうる。変更CSF−１の効果は、このような
付加的な成分の存在により改良されうる。タンパク質を
含む薬学的化合物についての製剤技術の要約は、例え
ば、Remingtonの薬学（Reming−tor's Pharmacentical
Science）,Mack Publishing Co.,Easton,PA,最新版に記
されている。
製剤内のタンパク質の用量レベルは、臨床前試験の後
に得られた生体内効力データにより左右され、臨床応用
に応じて変化する。タンパク質が中に溶解される媒質
は、混合物が再組成された時点で薬学的に受諾可能なpH
にある。
に得られた生体内効力データにより左右され、臨床応用
に応じて変化する。タンパク質が中に溶解される媒質
は、混合物が再組成された時点で薬学的に受諾可能なpH
にある。
製剤が凍結乾燥される場合、凍結乾燥された混合物
は、バイアル（小びん）の中に例えば注射用精製水とい
った従来の非経口水性溶剤を注入することによって再組
成されうる。
は、バイアル（小びん）の中に例えば注射用精製水とい
った従来の非経口水性溶剤を注入することによって再組
成されうる。
前述のように調製された再組成された製剤は、治療上
有効な量（すなわち、死亡率又は受諾不可能な罹病率な
く患者の病理状態を削除又は軽減する量）でヒト又はそ
の他の哺乳動物に対し経口外投与し治療を与えるのに適
している。CSF−１療法は、免疫系の強化、マクロファ
ージの細胞毒性作用の強化、単核細胞及び果粒細胞白血
球数の増加、サイトメガロウイルスや細菌感染（例えば
グラム陰性セプシス）といった感染性疾患の、哺乳動物
に対する治療的又は予防的投与による処置、哺乳動物に
おけるサルコーマ（肉腫）又はメラノーマ（黒色腫）と
いった腫瘍の苦しみの治療、コレステロール血症〔Nime
r他、（1988年）JAMA 260;3297−3300によりGM−CSFに
ついて記述されているようなもの〕の治療、及び／又
は、哺乳動物における創傷の治ゆといったさまざまな適
応症に対して適切でありうる。さらに、CSF−１は、本
書中にその開示が参考試料として内含されている、1988
年７月６日に公示された欧州特許公報第0273778号の中
に記述されているように、免疫系の刺激のためＧ−CSF
と組合わせることができる。
有効な量（すなわち、死亡率又は受諾不可能な罹病率な
く患者の病理状態を削除又は軽減する量）でヒト又はそ
の他の哺乳動物に対し経口外投与し治療を与えるのに適
している。CSF−１療法は、免疫系の強化、マクロファ
ージの細胞毒性作用の強化、単核細胞及び果粒細胞白血
球数の増加、サイトメガロウイルスや細菌感染（例えば
グラム陰性セプシス）といった感染性疾患の、哺乳動物
に対する治療的又は予防的投与による処置、哺乳動物に
おけるサルコーマ（肉腫）又はメラノーマ（黒色腫）と
いった腫瘍の苦しみの治療、コレステロール血症〔Nime
r他、（1988年）JAMA 260;3297−3300によりGM−CSFに
ついて記述されているようなもの〕の治療、及び／又
は、哺乳動物における創傷の治ゆといったさまざまな適
応症に対して適切でありうる。さらに、CSF−１は、本
書中にその開示が参考試料として内含されている、1988
年７月６日に公示された欧州特許公報第0273778号の中
に記述されているように、免疫系の刺激のためＧ−CSF
と組合わせることができる。
接合CSF−１の用量及び投与量法は、例えば、薬物速
度論、疾病又は状態の内容、重合体のタイプ及び長さ、
特定のCSF−１の特性例えばその治療指数、活性スペク
トル、患者及び患者の既往症などにより左右される。さ
まざまな変更CSF−１タンパク質は、異なる投与経路に
とって有利な異なる薬物速度論上及び治療上の特性を有
していると予想される。長く作用する薬物は、３〜４日
に一度、一週間に一度又は２週間に一度投与するだけで
よい。浄化率は、例えば重合体のタイプ、付着される重
合体のサイズ、及び重合体が付着されるアミノ酸配列を
変えることによって患者の特定的ニーズに合わせるべく
最大限の柔軟性を与えるよう変化させることができる。
度論、疾病又は状態の内容、重合体のタイプ及び長さ、
特定のCSF−１の特性例えばその治療指数、活性スペク
トル、患者及び患者の既往症などにより左右される。さ
まざまな変更CSF−１タンパク質は、異なる投与経路に
とって有利な異なる薬物速度論上及び治療上の特性を有
していると予想される。長く作用する薬物は、３〜４日
に一度、一週間に一度又は２週間に一度投与するだけで
よい。浄化率は、例えば重合体のタイプ、付着される重
合体のサイズ、及び重合体が付着されるアミノ酸配列を
変えることによって患者の特定的ニーズに合わせるべく
最大限の柔軟性を与えるよう変化させることができる。
本発明をさらに詳しく示す以下の例においては、全て
の割合及び百分率は相反する指示のないかぎり重量での
割合であり、全ての温度は摂氏温度である。
の割合及び百分率は相反する指示のないかぎり重量での
割合であり、全ての温度は摂氏温度である。
例 1. 結合方法１による、PEG化されたCSF1の調製 A.活性化されたPEG−NHSの調製 まず第１にUnion Carbide社から入手可能なモノメチ
ルPEG−7000を100℃から110℃で４時間無水グルタル酸
と反応させることによってか或いは又本書にその開示が
参考文献として内含されているAbuchowski他のCancer B
iochem.Biophys.7:175−186（1984年）の方法に類似し
た方法によって、平均分子量7000のモノメチルPEGの線
形エステルを得ることができる。結果として得られたPE
Gグルタル酸塩を、Abuchowski他（前述）がp176で詳述
しているように、ジシクロヘキシルカルボジイミドが存
在する中で、Ｎ−ヒドロキシスクシニミドと反応させ
た。その結果得られた生成物は、メトキシポリエチレン
グリコールＮ−スクシニミジルグルタル酸塩であり、以
下これをPEG★−7000と呼ぶ。PEG−4800（Union Carbid
e社から入手可能）を同じ方法で反応させた結果、PEG★
−4800が得られた。
ルPEG−7000を100℃から110℃で４時間無水グルタル酸
と反応させることによってか或いは又本書にその開示が
参考文献として内含されているAbuchowski他のCancer B
iochem.Biophys.7:175−186（1984年）の方法に類似し
た方法によって、平均分子量7000のモノメチルPEGの線
形エステルを得ることができる。結果として得られたPE
Gグルタル酸塩を、Abuchowski他（前述）がp176で詳述
しているように、ジシクロヘキシルカルボジイミドが存
在する中で、Ｎ−ヒドロキシスクシニミドと反応させ
た。その結果得られた生成物は、メトキシポリエチレン
グリコールＮ−スクシニミジルグルタル酸塩であり、以
下これをPEG★−7000と呼ぶ。PEG−4800（Union Carbid
e社から入手可能）を同じ方法で反応させた結果、PEG★
−4800が得られた。
PEG−11,000グルタルアミドNHS種（PEG″−11000）
は、Pillai他、J.Org.Chem.45:5364−5370（1980年）の
手順に従って以下のように調製された：すなわち、Unio
n Carbide社から入手した平均分子量11000ダルトンの線
形モノメチルPEG（1.5mmole）をまず10mの塩化メチレ
ン内で溶解させ、次に1.8m（22.2mmole）のピリジン
及び6.0g（31.6mmole）のｐ−トルエン−スルフォニル
塩化物を加えた。フラスコは窒素でフラッシングし、反
応混合物は一晩室温で撹拌した。混合物を約5mまで濃
縮し、生成物を75mのエチルエーテルで沈殿させた。
沈殿物を収集しエーテルで洗浄した。生成物（mPEGトシ
ル化物）は、エタノールから再晶出された。
は、Pillai他、J.Org.Chem.45:5364−5370（1980年）の
手順に従って以下のように調製された：すなわち、Unio
n Carbide社から入手した平均分子量11000ダルトンの線
形モノメチルPEG（1.5mmole）をまず10mの塩化メチレ
ン内で溶解させ、次に1.8m（22.2mmole）のピリジン
及び6.0g（31.6mmole）のｐ−トルエン−スルフォニル
塩化物を加えた。フラスコは窒素でフラッシングし、反
応混合物は一晩室温で撹拌した。混合物を約5mまで濃
縮し、生成物を75mのエチルエーテルで沈殿させた。
沈殿物を収集しエーテルで洗浄した。生成物（mPEGトシ
ル化物）は、エタノールから再晶出された。
20mのジメチルホルムアミドの中にmPEG−トシル化
物（約1.5mmole）を溶解し、2.5g（17.0mmole）のカリ
ウムフタルイミドを加えた。４時間、窒素下の還流で溶
液を加熱した。形成した沈殿物をろ過してとり除き、ろ
液を300mのエーテルに滴下して生成物を沈殿させた。
沈殿物をろ過してエーテルで洗浄した。30mの塩化メ
チレンの中で生成物を懸濁させ、0.5時間撹拌した。不
溶性の不純物をろ過してとり除き、生成物（mPEG−フタ
ルイミド）をエーテルで沈殿させた。次に、15mのエ
タノール内にmPEG−フタルイミド（約1.1mmole）を溶解
させ、2.0m（41.2mmole）のヒドラジン水和物を加え
た。混合物を一晩還流させた。反応混合物を室温で冷却
し、生成物をエステルで沈殿させた。
物（約1.5mmole）を溶解し、2.5g（17.0mmole）のカリ
ウムフタルイミドを加えた。４時間、窒素下の還流で溶
液を加熱した。形成した沈殿物をろ過してとり除き、ろ
液を300mのエーテルに滴下して生成物を沈殿させた。
沈殿物をろ過してエーテルで洗浄した。30mの塩化メ
チレンの中で生成物を懸濁させ、0.5時間撹拌した。不
溶性の不純物をろ過してとり除き、生成物（mPEG−フタ
ルイミド）をエーテルで沈殿させた。次に、15mのエ
タノール内にmPEG−フタルイミド（約1.1mmole）を溶解
させ、2.0m（41.2mmole）のヒドラジン水和物を加え
た。混合物を一晩還流させた。反応混合物を室温で冷却
し、生成物をエステルで沈殿させた。
沈殿物はろ過により収集し、25mの塩化メチレン内
で再度懸濁させた。不溶性の不純物をろ過して取り除
き、エーテルで沈殿させた。この沈殿物、mPEG−11000
アミンをCH2Cl2内で懸濁させ、ろ過し、エーテルでさら
に２回沈殿させた。２回目に、この沈殿物は塩化メチレ
ン中に完全に溶解できた。
で再度懸濁させた。不溶性の不純物をろ過して取り除
き、エーテルで沈殿させた。この沈殿物、mPEG−11000
アミンをCH2Cl2内で懸濁させ、ろ過し、エーテルでさら
に２回沈殿させた。２回目に、この沈殿物は塩化メチレ
ン中に完全に溶解できた。
10mのジオクサン中に合計0.5gのmPEG−11000−アミ
ンを溶解させ、これに0.25gの無水グルタル酸を加え
た。室温で４時間反応させた。反応後、生成物mPEG−NH
CO（CH2）3COOHを約100mのエーテルで沈殿させた。混
合物をろ過し、生成物をCH2Cl2内に溶解させ、エーテル
内にろ過し、ろ過、乾燥させた。生成物の収量は200mg
であった。
ンを溶解させ、これに0.25gの無水グルタル酸を加え
た。室温で４時間反応させた。反応後、生成物mPEG−NH
CO（CH2）3COOHを約100mのエーテルで沈殿させた。混
合物をろ過し、生成物をCH2Cl2内に溶解させ、エーテル
内にろ過し、ろ過、乾燥させた。生成物の収量は200mg
であった。
次にmPEG−NHCO（CH2）3COOHを、PEG★7000のため前
述したようにジシクロヘキシルカルボジイミドの存在す
る中でＮ−ヒドロキシスクシニミドと反応させた。結果
として得られた生成物は、ここではPEG″−11000と呼ば
れる。
述したようにジシクロヘキシルカルボジイミドの存在す
る中でＮ−ヒドロキシスクシニミドと反応させた。結果
として得られた生成物は、ここではPEG″−11000と呼ば
れる。
B.CSF−１の精製と再生 SCSF/N▽3C▽158遺伝子を含むプラスミドpJN653（か
かるプラスミドは1987年11月12日付でATCC第67561号と
して供託されている）で形質転換された大腸菌株HW22
を、6.5g/のグルコース、2.2mMのMgSO4・7H2O、95μ
ＭのFeSO4・7H2O、及び26mg/のチアミン・HClの無菌
付加を伴い、10というOD680nmに達するまで30℃で、96m
Mの（NH4）2SO4,28mMのKH2PO4,4mMのクエン酸Na3・2H
2O,1.7m／のTK9（30mMのZnSO4,30mMのMgSO4,1mMのC
uSO4）を含む基本培地の中で10リットル入り発酵槽内で
成長させた。次にカザミノ酸を２％w/v.まで付加した。
培養温度を37℃にまで上昇させることにより、CSF−１
表現を誘発した。４時間後、680nmでの吸収率は79に達
した。
かるプラスミドは1987年11月12日付でATCC第67561号と
して供託されている）で形質転換された大腸菌株HW22
を、6.5g/のグルコース、2.2mMのMgSO4・7H2O、95μ
ＭのFeSO4・7H2O、及び26mg/のチアミン・HClの無菌
付加を伴い、10というOD680nmに達するまで30℃で、96m
Mの（NH4）2SO4,28mMのKH2PO4,4mMのクエン酸Na3・2H
2O,1.7m／のTK9（30mMのZnSO4,30mMのMgSO4,1mMのC
uSO4）を含む基本培地の中で10リットル入り発酵槽内で
成長させた。次にカザミノ酸を２％w/v.まで付加した。
培養温度を37℃にまで上昇させることにより、CSF−１
表現を誘発した。４時間後、680nmでの吸収率は79に達
した。
細胞を５倍の濃度で収穫し、Dorr−Oliver接線交差流
微孔性ろ過を用いてpH8.5で5mMのEDTA10体積に対し分別
ろ過した。細胞をManton−Gaulinの高圧機械式細胞ホモ
ジナイザーの中に7500psiで３回通過させることにより
分析した。0.1％（v/v）まで１−オクタノールを付加
し、ホモゲネートを４℃で一晩保持した。
微孔性ろ過を用いてpH8.5で5mMのEDTA10体積に対し分別
ろ過した。細胞をManton−Gaulinの高圧機械式細胞ホモ
ジナイザーの中に7500psiで３回通過させることにより
分析した。0.1％（v/v）まで１−オクタノールを付加
し、ホモゲネートを４℃で一晩保持した。
このホモゲネートを、63％（w/v）のスクロース（し
ょ糖）溶液を付加することによって25％のスクロースに
した。9000×ｇ、１リットル／分及び４〜６℃での連続
流ディスクスタック遠心分離（Westphalia SB7）により
細胞デブリから不溶性タンパク質分画（屈折力ある物
質）を分離した。湿潤な沈殿物を50:50（w/v）で脱イオ
ン水と混合し、−20℃でアリコート内に保存した。
ょ糖）溶液を付加することによって25％のスクロースに
した。9000×ｇ、１リットル／分及び４〜６℃での連続
流ディスクスタック遠心分離（Westphalia SB7）により
細胞デブリから不溶性タンパク質分画（屈折力ある物
質）を分離した。湿潤な沈殿物を50:50（w/v）で脱イオ
ン水と混合し、−20℃でアリコート内に保存した。
屈折力ある物質の懸濁物25グラム（約390mgのタンパ
ク質）を、25mMのTris,10mΜのリン酸ナトリウム緩衝液
（pH8.4）、1mMのエチレンジアミンテトラ酢酸（EDTA）
及び4mMのジチオスレイトール（DTT）を含む8Mの尿素25
0mの中で可溶化した。室温で２時間置いた後、15分間
15000×ｇでの遠心分離により溶液を清澄させた。次
に、25mMのTris,10mMのリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.
0）を含む6Mの尿素内で平衡化された５×8mのDEAE−セ
ファロース（Pharmacia）カラム上に、可溶化したCSF−
１の150mのアリコートを装入した。カラムは1mMのDTT
と1mMのEDTAを含むよう変更された上述の溶液１ベッド
容積（bed volume）で洗浄し、次に、洗浄緩衝液内で０
〜0.6Mの塩化ナトリウムの1.4リットルの塩勾配でCSF−
１を溶離させた。CSF−１は、約0.06Mの塩化ナトリウム
でピーク溶離を示した。次に残りの90mの可溶化され
た屈折力ある物質を、同様のやり方でDEAE−セファロー
スカラム全体にわたり純化させた。組合わせたCSF−１
プール（165m）は、約50％の純度で約250mgのタンパ
ク質を含んでいた。
ク質）を、25mMのTris,10mΜのリン酸ナトリウム緩衝液
（pH8.4）、1mMのエチレンジアミンテトラ酢酸（EDTA）
及び4mMのジチオスレイトール（DTT）を含む8Mの尿素25
0mの中で可溶化した。室温で２時間置いた後、15分間
15000×ｇでの遠心分離により溶液を清澄させた。次
に、25mMのTris,10mMのリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.
0）を含む6Mの尿素内で平衡化された５×8mのDEAE−セ
ファロース（Pharmacia）カラム上に、可溶化したCSF−
１の150mのアリコートを装入した。カラムは1mMのDTT
と1mMのEDTAを含むよう変更された上述の溶液１ベッド
容積（bed volume）で洗浄し、次に、洗浄緩衝液内で０
〜0.6Mの塩化ナトリウムの1.4リットルの塩勾配でCSF−
１を溶離させた。CSF−１は、約0.06Mの塩化ナトリウム
でピーク溶離を示した。次に残りの90mの可溶化され
た屈折力ある物質を、同様のやり方でDEAE−セファロー
スカラム全体にわたり純化させた。組合わせたCSF−１
プール（165m）は、約50％の純度で約250mgのタンパ
ク質を含んでいた。
次に、４℃に予め冷却された50mMのTris（pH8.5）,5m
ΜのEDTA,2mMの還元グルタチオン、1mMの酸化グルタチ
オンを含む再生用緩衝液の中へDEAE−プールを希釈させ
ることによって、CSF−１を再生したあ。４℃で30時間C
SF−１を再生させた。再生されたCSF−１のpHを次に、
8.5％のリン酸溶液を用いて6.8に調整した。その後、15
000×ｇで10分間遠心分離により溶液を清澄させ、10mΜ
のリン酸ナトリウム、25mΜのTris（pH6.8）内で予備平
衡化された５×4cmのDEAEセファロースカラム上に装入
した。かかる緩衝液300mでカラムを洗浄し、次に同じ
緩衝液系内で700m,0〜0.6Mの塩化ナトリウム勾配で溶
離させた。CSF−１は、約120mMの塩化ナトリウムで溶離
した。次に、1Mの最終濃度に達するまで95mのDEAEプ
ールに対し硫酸アンモニウム14Mの原料（ストック）、p
H7.0）を加えた。次にNalgeneの0.45ミクロンのフィル
ターを通してCSF−１をろ過し、発熱物質が除去された
1.5Mの硫酸アンモニウム、0.1Mのリン酸ナトリウム（pH
7.0）内で平衡化された21.5×150mmのBio−Rad TSKフェ
ニル−５−PWカラム上に装入した（４℃で）。カラムを
かかる装入用緩衝液２ベッド容積（bed volume）で洗浄
し、次に、硫酸アンモニウム濃度が1.5Mから0Mに減少し
エチレングリコール濃度が０〜６％（v/v）から増加し
た45分の勾配を用いて、0.1Mのリン酸ナトリウム（pH7.
0）で溶離させた。全ての作業は、基本的に発熱物質の
無い条件の下で４℃で行なわれた。CSF−１は、30％の
エチレングリコール内で約0.6Mの硫酸アンモニウムで溶
離した。次に、150mMの塩化ナトリウムを含む10mMのHep
es緩衝液（pH7.5）内へCSF−１を広範に透析させ、その
後、Millexの0.45ミクロンのフィルターを通してフィル
ター滅菌した。
ΜのEDTA,2mMの還元グルタチオン、1mMの酸化グルタチ
オンを含む再生用緩衝液の中へDEAE−プールを希釈させ
ることによって、CSF−１を再生したあ。４℃で30時間C
SF−１を再生させた。再生されたCSF−１のpHを次に、
8.5％のリン酸溶液を用いて6.8に調整した。その後、15
000×ｇで10分間遠心分離により溶液を清澄させ、10mΜ
のリン酸ナトリウム、25mΜのTris（pH6.8）内で予備平
衡化された５×4cmのDEAEセファロースカラム上に装入
した。かかる緩衝液300mでカラムを洗浄し、次に同じ
緩衝液系内で700m,0〜0.6Mの塩化ナトリウム勾配で溶
離させた。CSF−１は、約120mMの塩化ナトリウムで溶離
した。次に、1Mの最終濃度に達するまで95mのDEAEプ
ールに対し硫酸アンモニウム14Mの原料（ストック）、p
H7.0）を加えた。次にNalgeneの0.45ミクロンのフィル
ターを通してCSF−１をろ過し、発熱物質が除去された
1.5Mの硫酸アンモニウム、0.1Mのリン酸ナトリウム（pH
7.0）内で平衡化された21.5×150mmのBio−Rad TSKフェ
ニル−５−PWカラム上に装入した（４℃で）。カラムを
かかる装入用緩衝液２ベッド容積（bed volume）で洗浄
し、次に、硫酸アンモニウム濃度が1.5Mから0Mに減少し
エチレングリコール濃度が０〜６％（v/v）から増加し
た45分の勾配を用いて、0.1Mのリン酸ナトリウム（pH7.
0）で溶離させた。全ての作業は、基本的に発熱物質の
無い条件の下で４℃で行なわれた。CSF−１は、30％の
エチレングリコール内で約0.6Mの硫酸アンモニウムで溶
離した。次に、150mMの塩化ナトリウムを含む10mMのHep
es緩衝液（pH7.5）内へCSF−１を広範に透析させ、その
後、Millexの0.45ミクロンのフィルターを通してフィル
ター滅菌した。
約50mgの精製SCSF/N▽3C▽158 CSF−１を得た。90％
以上の最終CSF−１生成物がSDS−PAGE上で単一の種とし
て移行し、同じ生成物は、アセトニトリル/TFA内でRP−
HPLCにより分析した場合約96％が単一種であった。比活
性は約1.5−1.7×108単位/mgであった（単位は、CSF−
１依存型細胞系を用いて単位当量を形成するコロニーと
して決定され、タンパク質濃度はA280mmを用いて決定さ
れ、0.6という消衰係数はアミノ酸化合物の決定から見
積られた）。この比活性は、純化された天然のMia PaCa
CSF−１のものよりも大きくはないにせよ、少なくとも
同等である。LALアッセイにより決定される、再生され
純化されたCSF−１生成分のエンドトキシン（内毒素）
含有量は、CSF−１ 1mgあたり0.5〜1ngであった。
以上の最終CSF−１生成物がSDS−PAGE上で単一の種とし
て移行し、同じ生成物は、アセトニトリル/TFA内でRP−
HPLCにより分析した場合約96％が単一種であった。比活
性は約1.5−1.7×108単位/mgであった（単位は、CSF−
１依存型細胞系を用いて単位当量を形成するコロニーと
して決定され、タンパク質濃度はA280mmを用いて決定さ
れ、0.6という消衰係数はアミノ酸化合物の決定から見
積られた）。この比活性は、純化された天然のMia PaCa
CSF−１のものよりも大きくはないにせよ、少なくとも
同等である。LALアッセイにより決定される、再生され
純化されたCSF−１生成分のエンドトキシン（内毒素）
含有量は、CSF−１ 1mgあたり0.5〜1ngであった。
同様の要領で、欧州特許公報第0272779号に記述され
ているようなSCSF/N▽2C▽150をコード化するDNAからPL
プロモータの制御下で生産された大腸菌タンパク質を、
同様に再生させ純化させた。大腸菌を形質転換するのに
用いたベクターは、Ｎ末端glu−gluを欠失したCSF/N▽
２をコード化するため適当なCSF−17ベクターの切除さ
れたHind III/Bst XI DNAに対し適当な合成フラグメン
トを置換することにより調製された。
ているようなSCSF/N▽2C▽150をコード化するDNAからPL
プロモータの制御下で生産された大腸菌タンパク質を、
同様に再生させ純化させた。大腸菌を形質転換するのに
用いたベクターは、Ｎ末端glu−gluを欠失したCSF/N▽
２をコード化するため適当なCSF−17ベクターの切除さ
れたHind III/Bst XI DNAに対し適当な合成フラグメン
トを置換することにより調製された。
C.CSF−１に対するPEG★−7000の接合 第Ｂ節中のCSF−１タンパク質（SCSF/N▽2C▽150）
を、100mMのNaClを含むpH7.2の10mMのHepes緩衝液の媒
質内に透析させた（1mgのタンパク質/m）。PEG★−70
00を急速に少量の水の中に溶解させ、直ちにタンパク質
溶液に付加し、これを反応中連続的に撹拌した。CSF−1
2量体に対し３倍から30倍のモル過剰分のPEG★−7000
を用いた。反応は20℃で約30分、４℃で約３時間で完了
した。
を、100mMのNaClを含むpH7.2の10mMのHepes緩衝液の媒
質内に透析させた（1mgのタンパク質/m）。PEG★−70
00を急速に少量の水の中に溶解させ、直ちにタンパク質
溶液に付加し、これを反応中連続的に撹拌した。CSF−1
2量体に対し３倍から30倍のモル過剰分のPEG★−7000
を用いた。反応は20℃で約30分、４℃で約３時間で完了
した。
サイズ除外HPLCで試料を分析した。第3A図は、実験に
先立っての誘導体化されていないrCSF−１（SCSF/N▽2C
▽150）試料のクロマトグラムを示している。第3B図
は、20℃で30分間PEG★−7000の５倍のモル過剰分で誘
導体化された後の同じCSF−１試料100μｇクロマトグラ
ムを示している。
先立っての誘導体化されていないrCSF−１（SCSF/N▽2C
▽150）試料のクロマトグラムを示している。第3B図
は、20℃で30分間PEG★−7000の５倍のモル過剰分で誘
導体化された後の同じCSF−１試料100μｇクロマトグラ
ムを示している。
Stanley,R.及びGuilbertの方法、J.Imm.Methods42:25
3−284（1981年）に従って行なわれた放射線免疫検定法
は、第3B図に見られる最初の３つの主要な吸収ピークが
rCSF−１を含んでいることを確認した。表Ｉを参照のこ
と。
3−284（1981年）に従って行なわれた放射線免疫検定法
は、第3B図に見られる最初の３つの主要な吸収ピークが
rCSF−１を含んでいることを確認した。表Ｉを参照のこ
と。
分画30,32,34,36,37,38,39,41及び42も同様に、本書
にその開示が参考文献として内含されているMoore他、
J.Immunol.（1983年）131;2397及びPrystowsky他Am.J.P
athol.（1984年）114:149により記述されているマウス
骨髄検定法を用いて、生物活性について分析された。表
Ｉが、結果を示している。
にその開示が参考文献として内含されているMoore他、
J.Immunol.（1983年）131;2397及びPrystowsky他Am.J.P
athol.（1984年）114:149により記述されているマウス
骨髄検定法を用いて、生物活性について分析された。表
Ｉが、結果を示している。
表Ｉの結果及び以下の結果をみると、未反応のrCSF−
１及び、誘導体化されたrCSF−１の最小分子量ピークが
ほぼ完全な生物活性（実験誤差内で）を保持したことが
わかる。より大きい種は、はるかに小さい残留生物活性
を保持した。PEG★−7000との反応は、明らかにCSF−１
の放射線免疫検定（RIA）反応性に著しい影響を及ぼさ
なかったが、これは、分割されていない誘導体化された
rCSF−１がタンパク質1mgあたりほぼ完全なRIA免疫反応
性を保持していたからである。
１及び、誘導体化されたrCSF−１の最小分子量ピークが
ほぼ完全な生物活性（実験誤差内で）を保持したことが
わかる。より大きい種は、はるかに小さい残留生物活性
を保持した。PEG★−7000との反応は、明らかにCSF−１
の放射線免疫検定（RIA）反応性に著しい影響を及ぼさ
なかったが、これは、分割されていない誘導体化された
rCSF−１がタンパク質1mgあたりほぼ完全なRIA免疫反応
性を保持していたからである。
D.CSF−１に対するPEG″−11000の接合 1988年６月29日に公開された欧州特許公報第0272779
号の中に記述されているように構成されたベクター内で
のPLプロモータの制御下での大腸菌内のSCSF/C▽150を
コード化する構成物の発現の後、生物活性あるタンパク
質を精製し再生した。使用した菌株は、プラスミド0/E,
pPL CSF−17 asp59/C▽150（ATCC No.67,389）で形質転
換された大腸菌λ溶原、DG116であった。タンパク質
は、単量体不溶性形態で細胞内で生産され、PCT公報第W
O 88/08003号（前述）の中に記述されているように純化
され再生された。
号の中に記述されているように構成されたベクター内で
のPLプロモータの制御下での大腸菌内のSCSF/C▽150を
コード化する構成物の発現の後、生物活性あるタンパク
質を精製し再生した。使用した菌株は、プラスミド0/E,
pPL CSF−17 asp59/C▽150（ATCC No.67,389）で形質転
換された大腸菌λ溶原、DG116であった。タンパク質
は、単量体不溶性形態で細胞内で生産され、PCT公報第W
O 88/08003号（前述）の中に記述されているように純化
され再生された。
100mMのNaClを含むpH7.2のHepes緩衝液の中に、タン
パク質1mあたり1mgの割合で、この純化CSF−１を合計
2mg透析した。PEG″−11000を少量の水の中で急速に溶
解させ、タンパク質溶液内に直ちに加え、これを反応中
連続的に撹拌した。CSF−1 2量体に対してPEG″−11000
の８倍のモル過剰分を用いた。反応は20℃で30分で完了
した。このCSF−１は、SCSF/N▽2C▽150とPEG★−7000
の反応ときわめて類似した形で、PEG″−11000と反応し
た。表IIが示しているように、穏やかなPEG化（２量体
１つあたり１〜２）はここでも生物活性に対しわずかな
影響しか及ぼさなかったが、一方高度に変更されたプー
ルの活性は著しく低下した。
パク質1mあたり1mgの割合で、この純化CSF−１を合計
2mg透析した。PEG″−11000を少量の水の中で急速に溶
解させ、タンパク質溶液内に直ちに加え、これを反応中
連続的に撹拌した。CSF−1 2量体に対してPEG″−11000
の８倍のモル過剰分を用いた。反応は20℃で30分で完了
した。このCSF−１は、SCSF/N▽2C▽150とPEG★−7000
の反応ときわめて類似した形で、PEG″−11000と反応し
た。表IIが示しているように、穏やかなPEG化（２量体
１つあたり１〜２）はここでも生物活性に対しわずかな
影響しか及ぼさなかったが、一方高度に変更されたプー
ルの活性は著しく低下した。
第４図はPEG″−11,000で誘導体化されたrCSF−１（S
CSF/C▽150）8mgのサイズ除外HPLCクロマトグラフを示
している。図中に示されているようにプールされた穏や
かに誘導体化された分画は、基本的に完全な生物活性を
保持し、サイジング時点で80000ダルトン又還元されな
いSDS−PAGE上で45000ダルトンの見かけの分子量で移動
することがわかっている。この分画は、約20％の全体的
収量で回収された。
CSF/C▽150）8mgのサイズ除外HPLCクロマトグラフを示
している。図中に示されているようにプールされた穏や
かに誘導体化された分画は、基本的に完全な生物活性を
保持し、サイジング時点で80000ダルトン又還元されな
いSDS−PAGE上で45000ダルトンの見かけの分子量で移動
することがわかっている。この分画は、約20％の全体的
収量で回収された。
これら２つの技術により見積られたPEG−CSFのサイズ
の差異は、その他のものにより行なわれた観察と一貫し
ている。PEGは、SDSと結合するタンパク質の能力を変
え、SDS−PAGE上での移動度に影響を及ぼすことができ
る。又、PEGは、カラムマトリクスとの疎水性相互作用
などによってサイズ除外見積りにも影響を及ぼしうる。
の差異は、その他のものにより行なわれた観察と一貫し
ている。PEGは、SDSと結合するタンパク質の能力を変
え、SDS−PAGE上での移動度に影響を及ぼすことができ
る。又、PEGは、カラムマトリクスとの疎水性相互作用
などによってサイズ除外見積りにも影響を及ぼしうる。
リムルスアメーバ様細胞リゼイト（LAL）検定法によ
り検定されたこの試料の内毒素レベルは、280nm（A280
単位）のタンパク質で１吸光単位あたり1ng未満である
ことがわかった。〔LAL検定法は、Associates of Cape
Cod Inc.,Woods Hole,MAから入手可能なPyrotellブラン
ドについての製品カタログ（1982年）により記述されて
いる：又これはWatson他（eds）「エンドトキシン及び
リムルスアメーバ様細胞リゼイトテストによるその検
出」、エントトキシン基準及び経口外投与約でのリムル
スアメーバ様細胞リゼイトの使用に関する国際会議議事
録、Alan R.Liss Inc.,ニューヨーク（1982年）及びLev
in他（1964年）Bull Johns,Hopkins Hosp.,115:265によ
っても記述されている〕。
り検定されたこの試料の内毒素レベルは、280nm（A280
単位）のタンパク質で１吸光単位あたり1ng未満である
ことがわかった。〔LAL検定法は、Associates of Cape
Cod Inc.,Woods Hole,MAから入手可能なPyrotellブラン
ドについての製品カタログ（1982年）により記述されて
いる：又これはWatson他（eds）「エンドトキシン及び
リムルスアメーバ様細胞リゼイトテストによるその検
出」、エントトキシン基準及び経口外投与約でのリムル
スアメーバ様細胞リゼイトの使用に関する国際会議議事
録、Alan R.Liss Inc.,ニューヨーク（1982年）及びLev
in他（1964年）Bull Johns,Hopkins Hosp.,115:265によ
っても記述されている〕。
E.CSF−１に対するPEG★−4800の接合 PEG★−4800とクローンSCSF/C▽150からのrCSF−１と
反応させるために、PEG″−11000の場合と同じ条件が用
いられた。CSF−１をうまく誘導体化し、穏やかに誘導
体化されたプール（１つ又は２つのサイトにて）は基本
的に完全な生物活性を保持した。
反応させるために、PEG″−11000の場合と同じ条件が用
いられた。CSF−１をうまく誘導体化し、穏やかに誘導
体化されたプール（１つ又は２つのサイトにて）は基本
的に完全な生物活性を保持した。
F.ラットにおける未修飾CSF−１とPEG化されたCSF−１
の薬理動態 平均体重が161gの３匹の雄のラット（Charles River
Breeding Labs.Wilmington,MA）に対し、第８図に示さ
れた前述のSCSF/C▽150クローンからのPEG″−11000誘
導体化されたCSF−１の穏やかに誘導体化された分画を
体重1kgあたり1mgの割合で、尾の静脈内に注射した。留
置カテーテルにより血漿試料を収量し、RIAによりCSF−
１の力価を測定した。０分、30分及び120分の時点で尿
試料を収集し検定した。グリコシル化された522アミノ
酸前駆物質（LCSF）から生じる哺乳動物の細胞（COS）
内で発現される誘導体化されていないrCSF−１とrCSF−
１を用いて、付加的なデータも収集した。未修飾のCSF
−１を用いた実験においてラットの平均体重は178gであ
り、未修飾CSF−１を体重1kgあたり125μｇの割合で注
射した。その他の条件は全て同じであった。
の薬理動態 平均体重が161gの３匹の雄のラット（Charles River
Breeding Labs.Wilmington,MA）に対し、第８図に示さ
れた前述のSCSF/C▽150クローンからのPEG″−11000誘
導体化されたCSF−１の穏やかに誘導体化された分画を
体重1kgあたり1mgの割合で、尾の静脈内に注射した。留
置カテーテルにより血漿試料を収量し、RIAによりCSF−
１の力価を測定した。０分、30分及び120分の時点で尿
試料を収集し検定した。グリコシル化された522アミノ
酸前駆物質（LCSF）から生じる哺乳動物の細胞（COS）
内で発現される誘導体化されていないrCSF−１とrCSF−
１を用いて、付加的なデータも収集した。未修飾のCSF
−１を用いた実験においてラットの平均体重は178gであ
り、未修飾CSF−１を体重1kgあたり125μｇの割合で注
射した。その他の条件は全て同じであった。
第５図は、修飾及び未修飾CSF−１タンパク質の血液
浄化の時間的推移を比較している。血漿曲線の下の面積
で用量を除することにより全身浄化値が計算される。こ
のデータにより、血液中の誘導体化されたrCSF−１の全
身浄化値は、誘導体化されていないrCSF−１の3.84m
／分/kgに対し、0.302m／分/kgであることがわかる。
このことはすなわち誘導体化されていないタンパク質に
比較した場合誘導体されたタンパク質の滞留時間が12.7
倍延びていることを表わしている。第６図は、誘導体化
されたCSF−１（SCSF/C▽150）の注射から120分後のラ
ットの血漿のサイズ除外HPLCを示している。この図によ
ると、血漿内のRIA検出可能なrCSF−１シグナルの静脈
内注射から２時間後に見かけのサイズが43−80kdであっ
たことがわかる。この観察は、薬理動態の実験（120分
で）において測定されたRIAシグナルが無傷のPEG−rCSF
−１及びrCSF−１を表わしていることを示唆している。
Burmette技法（1981年）、Anal.Biochem,112:195−203
による（CSF1フラグメントを検出することのできる組換
え型CSF−１とそれに続く125Iタンパク質Ａに対する抗
血清を用いて開発されたもの）尿及び血漿の非還元SDS
−PAGゲルのウェスタンブロッティング法は、かかる方
法により検出されたrCSF−１抗原が見かけ上無傷で２量
体でありかつ、注入された物質と同じサイズを有するこ
とを確認した。
浄化の時間的推移を比較している。血漿曲線の下の面積
で用量を除することにより全身浄化値が計算される。こ
のデータにより、血液中の誘導体化されたrCSF−１の全
身浄化値は、誘導体化されていないrCSF−１の3.84m
／分/kgに対し、0.302m／分/kgであることがわかる。
このことはすなわち誘導体化されていないタンパク質に
比較した場合誘導体されたタンパク質の滞留時間が12.7
倍延びていることを表わしている。第６図は、誘導体化
されたCSF−１（SCSF/C▽150）の注射から120分後のラ
ットの血漿のサイズ除外HPLCを示している。この図によ
ると、血漿内のRIA検出可能なrCSF−１シグナルの静脈
内注射から２時間後に見かけのサイズが43−80kdであっ
たことがわかる。この観察は、薬理動態の実験（120分
で）において測定されたRIAシグナルが無傷のPEG−rCSF
−１及びrCSF−１を表わしていることを示唆している。
Burmette技法（1981年）、Anal.Biochem,112:195−203
による（CSF1フラグメントを検出することのできる組換
え型CSF−１とそれに続く125Iタンパク質Ａに対する抗
血清を用いて開発されたもの）尿及び血漿の非還元SDS
−PAGゲルのウェスタンブロッティング法は、かかる方
法により検出されたrCSF−１抗原が見かけ上無傷で２量
体でありかつ、注入された物質と同じサイズを有するこ
とを確認した。
例 II 第２の結合方法による活性化されPEG化されたCSF−１の
調製 Ａ PEGエステルの調製 1.mPEG−5000のカルボキシメチル誘導体を調製した。
調製 Ａ PEGエステルの調製 1.mPEG−5000のカルボキシメチル誘導体を調製した。
ベンゾフェノンナトリウムから精製されたばかりのテ
トラヒドロフラン（THF）約20m中に0.64gのナフタレ
ンの溶液に対して0.15gのNaを加えることにより、ナト
リウム−ナフタレンを調製した。平均分子量5000のモノ
メチルポリ（エチレングリコール）（「mPEG5000」）を
P2O5の入った真空乾燥器の中で一晩乾燥した。50mま
での乾燥THF（精製されたばかりの）中に2.5gのmPEG500
0の溶液に対してNa−ナフタレン溶液を滴下した。過剰
を示すべく溶液内に緑色が持続した時点で、塩基の付加
を止め、1.2mのBrCH2COOCH3を滴下した。緑色は消
え、混合物は曇った。この混合物を一晩室温で撹拌し
た。曇った混合物を、約70mの低温エーテルの入った
フラスコに注ぎ込んだ。真空ろ過により沈殿物を収集
し、エーテルで洗浄した。乾燥した固体を75mの1MのN
aOH内で溶解させ、室温で2.5時間撹拌してメチルエステ
ルを加水分解した。HClを加えてpHを約３に調整し、溶
液を回転式蒸発器で凝縮させた。残留物をCH2Cl2内にと
り込み、約１時間撹拌した。不溶性物質をろ過して除去
し、溶液をエーテル内に注ぎこんだ。真空ろ過で固体を
収集し、これをエーテルで洗浄しP2O5上で真空乾燥器内
にて乾燥させた。こうして、望まれたカルボキシメチル
mPEG−5000酸が生み出された。この酸を滴定して、完璧
な変換が起こったことを立証した。さらに大きな規模で
カルボキシメチルmPEG−5000の調製をくり返した。沈殿
物を収集し乾燥させた。収量は8.5g。滴定は約102％の
酸を示した。かかる実験についての参考文献はBuckmann
他、Makromol.Chem.182:1379（1981年）である。
トラヒドロフラン（THF）約20m中に0.64gのナフタレ
ンの溶液に対して0.15gのNaを加えることにより、ナト
リウム−ナフタレンを調製した。平均分子量5000のモノ
メチルポリ（エチレングリコール）（「mPEG5000」）を
P2O5の入った真空乾燥器の中で一晩乾燥した。50mま
での乾燥THF（精製されたばかりの）中に2.5gのmPEG500
0の溶液に対してNa−ナフタレン溶液を滴下した。過剰
を示すべく溶液内に緑色が持続した時点で、塩基の付加
を止め、1.2mのBrCH2COOCH3を滴下した。緑色は消
え、混合物は曇った。この混合物を一晩室温で撹拌し
た。曇った混合物を、約70mの低温エーテルの入った
フラスコに注ぎ込んだ。真空ろ過により沈殿物を収集
し、エーテルで洗浄した。乾燥した固体を75mの1MのN
aOH内で溶解させ、室温で2.5時間撹拌してメチルエステ
ルを加水分解した。HClを加えてpHを約３に調整し、溶
液を回転式蒸発器で凝縮させた。残留物をCH2Cl2内にと
り込み、約１時間撹拌した。不溶性物質をろ過して除去
し、溶液をエーテル内に注ぎこんだ。真空ろ過で固体を
収集し、これをエーテルで洗浄しP2O5上で真空乾燥器内
にて乾燥させた。こうして、望まれたカルボキシメチル
mPEG−5000酸が生み出された。この酸を滴定して、完璧
な変換が起こったことを立証した。さらに大きな規模で
カルボキシメチルmPEG−5000の調製をくり返した。沈殿
物を収集し乾燥させた。収量は8.5g。滴定は約102％の
酸を示した。かかる実験についての参考文献はBuckmann
他、Makromol.Chem.182:1379（1981年）である。
2.カルボキシメチルmPEG−5000のパラ−ニトロフェニル
エステルを調製した。
エステルを調製した。
3mのCHCl3の中に合計1gのmPEG−5000酸（２×10-4
モル）を溶解させた。この溶液に対して、0.28gのｐ−
ニトロフェノール（２×10-4モル）を加えた。溶液は薄
黄色になった。次に0.041gのジシクロヘクシルカルボジ
イミド（DCC）（２×10-4モル）を少量のCHCl3内に溶解
させ、室温でPEG−酸溶液に滴下した。約10分間撹拌し
た後、２μのCHCl3混合物を10mの0.01Mのリン酸塩
緩衝液（pH7.0）に加えた。ｐ−ニトロフェノール陰イ
オンの400nmにおける吸光度は0.02443であった。5NのNa
OHを加え、A400を0.5847にまで増大させた（エステルの
％は以下の公式で計算して58.2％である： ）。
モル）を溶解させた。この溶液に対して、0.28gのｐ−
ニトロフェノール（２×10-4モル）を加えた。溶液は薄
黄色になった。次に0.041gのジシクロヘクシルカルボジ
イミド（DCC）（２×10-4モル）を少量のCHCl3内に溶解
させ、室温でPEG−酸溶液に滴下した。約10分間撹拌し
た後、２μのCHCl3混合物を10mの0.01Mのリン酸塩
緩衝液（pH7.0）に加えた。ｐ−ニトロフェノール陰イ
オンの400nmにおける吸光度は0.02443であった。5NのNa
OHを加え、A400を0.5847にまで増大させた（エステルの
％は以下の公式で計算して58.2％である： ）。
約３時間の反応後、１μのCHCl3混合物を1.0mの0.0
1Mリン酸塩（pH7.0）に加えた。A400は0.2238であっ
た。50μの5N NaOHを加えたところ、A400は1.154で8
0.6％のエステルを生み出した。
1Mリン酸塩（pH7.0）に加えた。A400は0.2238であっ
た。50μの5N NaOHを加えたところ、A400は1.154で8
0.6％のエステルを生み出した。
１つの沈殿物、ジシクロヘキシル尿素が現われ、グラ
スファイバフィルターを通してこれをろ過してとり除
き、CHCl3で乾燥させた。約300mの無水エチルエーテ
ルを加えることによりエステルを沈殿させた。３時間混
合物を沈殿させ、次にガラスフリットを通してろ過させ
た。次に、CHCl3内で沈殿物を再度溶解させ、約100m
のエチルエーテルで再度沈殿させ、中ガラスフリットを
通してろ過させた。少量の湿った固体を0.01Mのリン酸
塩緩衝液、pH7.0内で溶解させた。A400は0.0240であっ
た。５μの5N NaOHを付加すると、A400は3.330まで
増加した（エステル％は99.3であった）。
スファイバフィルターを通してこれをろ過してとり除
き、CHCl3で乾燥させた。約300mの無水エチルエーテ
ルを加えることによりエステルを沈殿させた。３時間混
合物を沈殿させ、次にガラスフリットを通してろ過させ
た。次に、CHCl3内で沈殿物を再度溶解させ、約100m
のエチルエーテルで再度沈殿させ、中ガラスフリットを
通してろ過させた。少量の湿った固体を0.01Mのリン酸
塩緩衝液、pH7.0内で溶解させた。A400は0.0240であっ
た。５μの5N NaOHを付加すると、A400は3.330まで
増加した（エステル％は99.3であった）。
主沈殿物を真空乾燥器内で一晩乾燥させた。この沈殿
物が入っていたフラスコを水で洗浄し、残留物を凍結乾
燥させた。次に、pH7.0で2mの0.01Mのリン酸塩内で合
計4mgの沈殿物を溶解させた（A400＝0.0276）。50μ
の5NのNaOHを付加したところ、A400は3.50であった（目
盛外）。合計200μの溶液を800μの0.01Mのリン酸
塩（pH7.0）になるまで希釈させた。A400は0.7985であ
った。計算されたエステル％＝99.3％。
物が入っていたフラスコを水で洗浄し、残留物を凍結乾
燥させた。次に、pH7.0で2mの0.01Mのリン酸塩内で合
計4mgの沈殿物を溶解させた（A400＝0.0276）。50μ
の5NのNaOHを付加したところ、A400は3.50であった（目
盛外）。合計200μの溶液を800μの0.01Mのリン酸
塩（pH7.0）になるまで希釈させた。A400は0.7985であ
った。計算されたエステル％＝99.3％。
合計1.5mgの凍結乾燥された残留物を、1.0mの0.01M
のリン酸塩（pH7.0）内に溶解させた。吸光度は0.0680
であった。合計50μの5N NaOHを加えると、A400は1.
106（エステル％−93.9）であった。主要沈殿物からの
フィルタ上の残留物を水で洗い、週末をかけて凍結乾燥
させた。重量は131mgのふわふわした白色粉末であっ
た。少量を0.01Mのリン酸塩、pH7の中に溶解させ、A400
は0.0859であった。50μの5N・NaOHを付加した時点で
A400は0.6794であった（エステル87.4％）。
のリン酸塩（pH7.0）内に溶解させた。吸光度は0.0680
であった。合計50μの5N NaOHを加えると、A400は1.
106（エステル％−93.9）であった。主要沈殿物からの
フィルタ上の残留物を水で洗い、週末をかけて凍結乾燥
させた。重量は131mgのふわふわした白色粉末であっ
た。少量を0.01Mのリン酸塩、pH7の中に溶解させ、A400
は0.0859であった。50μの5N・NaOHを付加した時点で
A400は0.6794であった（エステル87.4％）。
エステルの構造： B.CSF−１（asp59SCSF/C▽150）のPEG化 前述のパラ−ニトロフェニルエステルを、以下のよう
にして例Ｉに記されているasp59SCSF/C▽150の再生タン
パク質とカップリングさせた。
にして例Ｉに記されているasp59SCSF/C▽150の再生タン
パク質とカップリングさせた。
rCSF−１（1mg/mの割合で200μｇ）を、100mMのNaC
lを含む20mMのHepes緩衝液（pH7.2）内に透析した。合
計0.8mgのパラ−ニトロフェニルエステルを少量の水の
中に溶解させ、この溶液250μｇを直ちにSCSF/C▽150に
加えた。４時間20℃で接合を行ない、サイズ除外HPLCで
試料を分析した。穏やかに誘導体されたrCSF−１（CSF
−1 1つあたり１又は２のPEG分子に相当するもの）は、
マウス骨髄で検定したところ基本的に完全な生物活性を
保持していた。
lを含む20mMのHepes緩衝液（pH7.2）内に透析した。合
計0.8mgのパラ−ニトロフェニルエステルを少量の水の
中に溶解させ、この溶液250μｇを直ちにSCSF/C▽150に
加えた。４時間20℃で接合を行ない、サイズ除外HPLCで
試料を分析した。穏やかに誘導体されたrCSF−１（CSF
−1 1つあたり１又は２のPEG分子に相当するもの）は、
マウス骨髄で検定したところ基本的に完全な生物活性を
保持していた。
反応を、２重ビームのHewlett−Packard分光計内のキ
ュベット内で行なう場合、パラ−ニトロフェノール陰イ
オンの放出を監視することができ、こうしてカップリン
グ反応は、一定の与えられた量の放出が起こった後再現
可能な形で停止させることが可能となる。
ュベット内で行なう場合、パラ−ニトロフェノール陰イ
オンの放出を監視することができ、こうしてカップリン
グ反応は、一定の与えられた量の放出が起こった後再現
可能な形で停止させることが可能となる。
例 III 第３結合（連鎖）方法による、PEG化されたCSF−１の調
製 Ａ 活性化されたPEGエステル（PEG−PNP）の調製 低濃度のジオールしか含まない平均分子量10000のモ
ノメチルPEG（ｍ−PEG10000;Union Carbide社）25グラ
ム（2.5m.mole）を500m入りの３つ口丸底フラスコ内
で250mのCH2Cl2中に溶解させた。５グラム（25m.mole
s）のｐ−ニトロフェニルクロル蟻酸塩（PNP−chlorofo
rmate）と３グラム（25mmole）のジメチルアミノピリジ
ン（DMAP）を付加した。混合物を窒素下で室温で一晩撹
拌した。反応混合物をろ過してDMAP−HClを除去し、100
mまで濃縮させた。濃縮溶液を撹拌しならが１リット
ルのエーテルに付加した。粗焼結ガラスフィルター上で
沈殿物を収集した。次に沈殿物を約１時間約400mの塩
化メチレンと共に撹拌し、次にろ過して約100mになる
まで濃縮した。溶液を１リットルのエーテルに付加する
ことによりPEGエステルを再度沈殿させた。グラスファ
イバーフィルタを用いて沈殿物を収集し、真空乾燥器内
で乾燥させた。収量は17.5グラムであった。
製 Ａ 活性化されたPEGエステル（PEG−PNP）の調製 低濃度のジオールしか含まない平均分子量10000のモ
ノメチルPEG（ｍ−PEG10000;Union Carbide社）25グラ
ム（2.5m.mole）を500m入りの３つ口丸底フラスコ内
で250mのCH2Cl2中に溶解させた。５グラム（25m.mole
s）のｐ−ニトロフェニルクロル蟻酸塩（PNP−chlorofo
rmate）と３グラム（25mmole）のジメチルアミノピリジ
ン（DMAP）を付加した。混合物を窒素下で室温で一晩撹
拌した。反応混合物をろ過してDMAP−HClを除去し、100
mまで濃縮させた。濃縮溶液を撹拌しならが１リット
ルのエーテルに付加した。粗焼結ガラスフィルター上で
沈殿物を収集した。次に沈殿物を約１時間約400mの塩
化メチレンと共に撹拌し、次にろ過して約100mになる
まで濃縮した。溶液を１リットルのエーテルに付加する
ことによりPEGエステルを再度沈殿させた。グラスファ
イバーフィルタを用いて沈殿物を収集し、真空乾燥器内
で乾燥させた。収量は17.5グラムであった。
生成物をｐ−ニトロフェニル炭酸塩の含有量について
検定した。10mの0.1Μリン酸ナトリウム（pH8）の中
に10.3mg（1.03×10-6モル）を溶解させた。400nmでの
吸光度により、遊離又は未反応ｐ−ニトロフェニル（PN
P）不純物を測定した。初期A400は0.37であった。1.0m
のPEG−PNPに対し50マイクロリットルの5N NaOHを加
えたところ、存在する全てのエステルは加水分解され、
A400は2.06であった。秤量された全ての生成物（10.3m
g）がPEG−PNPであったならば（すなわち遊離PNPが全く
存在しなかった場合）、理論上の最大A400と呼ばれるA
400＝1.85を有する1.03×10-4モル／リットルのPNPが放
出されただろう。
検定した。10mの0.1Μリン酸ナトリウム（pH8）の中
に10.3mg（1.03×10-6モル）を溶解させた。400nmでの
吸光度により、遊離又は未反応ｐ−ニトロフェニル（PN
P）不純物を測定した。初期A400は0.37であった。1.0m
のPEG−PNPに対し50マイクロリットルの5N NaOHを加
えたところ、存在する全てのエステルは加水分解され、
A400は2.06であった。秤量された全ての生成物（10.3m
g）がPEG−PNPであったならば（すなわち遊離PNPが全く
存在しなかった場合）、理論上の最大A400と呼ばれるA
400＝1.85を有する1.03×10-4モル／リットルのPNPが放
出されただろう。
が実際にPEG−PNPであった。初期吸光度（0.37）はかな
り高いものであったため、遊離PNPは見かけ上存在して
いた。生成物を、約75mのCH2Cl2内で溶解させ1.2リッ
トルのエーテルを加えて沈殿させることによりさらに純
化した。沈殿物を収集し、乾燥させ（15.8グラム）、再
度検定した。
り高いものであったため、遊離PNPは見かけ上存在して
いた。生成物を、約75mのCH2Cl2内で溶解させ1.2リッ
トルのエーテルを加えて沈殿させることによりさらに純
化した。沈殿物を収集し、乾燥させ（15.8グラム）、再
度検定した。
B.PEG化されたCSF−１（SCSF/N▽Ｃ▽158）の調製 基本的に例Ｉに記述されているとおりにCSF−１を生
産した。CSF−１を0.05Mのホウ酸ナトリウム（pH9.0）
の中で約10mg/mまでCSF−１を濃縮させた。例III,A部
から固体として得られたPEG−PNP5mgをCSF−1 1mにつ
き付加した（約1:1Mの比率）。反応を２時間室温で続け
た。
産した。CSF−１を0.05Mのホウ酸ナトリウム（pH9.0）
の中で約10mg/mまでCSF−１を濃縮させた。例III,A部
から固体として得られたPEG−PNP5mgをCSF−1 1mにつ
き付加した（約1:1Mの比率）。反応を２時間室温で続け
た。
NaClを、約5Mの最終濃度（飽和）に至るまで反応混合
物に付加し、フェニルセファロース（Pharmacia Fast F
low High Substitution）カラムに高塩混合物を装入し
た。装入された10mgのタンパク質について約1mのフェ
ニル・セファロースが適当であった。0.1M Tris,pH8.5
内で1.2から0Mの硫酸アンモニウム勾配でカラムからCSF
−１を溶離させた。Coomassie−染色された非還元性SDS
−PAGEにより分画を分析し、NFS60生物検定での生物活
性を測定した。結果は表IIIに示されている。プラス
は、試料中の異なるCSF−１複合体の相対量を示してい
る。生物活性データは、３回の検定の平均である。
物に付加し、フェニルセファロース（Pharmacia Fast F
low High Substitution）カラムに高塩混合物を装入し
た。装入された10mgのタンパク質について約1mのフェ
ニル・セファロースが適当であった。0.1M Tris,pH8.5
内で1.2から0Mの硫酸アンモニウム勾配でカラムからCSF
−１を溶離させた。Coomassie−染色された非還元性SDS
−PAGEにより分画を分析し、NFS60生物検定での生物活
性を測定した。結果は表IIIに示されている。プラス
は、試料中の異なるCSF−１複合体の相対量を示してい
る。生物活性データは、３回の検定の平均である。
例 IV A.PEG化されたCSF−１（SCSF/N▽3C▽158）の調製 SCSF/N▽3C▽158遺伝子を含むpJN653で形質転換され
た大腸菌株HW22の増殖及び収量は、例Ｉにおいて記述し
たとおりであった。
た大腸菌株HW22の増殖及び収量は、例Ｉにおいて記述し
たとおりであった。
次に屈折体懸濁物を、同様に例Ｉに記されているとお
りに可溶化し、再生し精製させた。最終比活性は、CSF
−１依存型細胞系統について行なわれたCSF−１生物検
定において約1.5×108単位/mgであった。
りに可溶化し、再生し精製させた。最終比活性は、CSF
−１依存型細胞系統について行なわれたCSF−１生物検
定において約1.5×108単位/mgであった。
10mMのHepes緩衝液（pH7.5）及び100mMのNaCl中で2.6
mg/mの濃度で、上述の再生されたCSF−1 40mgを20℃
で撹拌しながら保温した。200μの精製水内にPEG″−
11,000を溶解させ、CSF−1 2量体に対してPEG″−11000
の11倍のモル過剰分でCSF−１溶液に直ちに付加した。
（PEG″−11000は約55％加水分解されておらず、活性で
あった。30分の保温の後、1Mの原料（ストック）溶液か
らPEG″−11000 1モルにつき２モルのε−アミノカプロ
ン酸塩を加えて、反応を停止させた。Amicon Centricon
−30遠心分離により試料を6mまで濃縮させ、３回の同
じ2m装入ランでサイズ除外HPLCにより純化させた。使
用したカラムは、0.2MのNa2HPO4/NaH2PO4緩衝液（pH7.
0）内で平衡化されたBio−Sil TSK−250,600×21.5mm
（BioRad）であった。
mg/mの濃度で、上述の再生されたCSF−1 40mgを20℃
で撹拌しながら保温した。200μの精製水内にPEG″−
11,000を溶解させ、CSF−1 2量体に対してPEG″−11000
の11倍のモル過剰分でCSF−１溶液に直ちに付加した。
（PEG″−11000は約55％加水分解されておらず、活性で
あった。30分の保温の後、1Mの原料（ストック）溶液か
らPEG″−11000 1モルにつき２モルのε−アミノカプロ
ン酸塩を加えて、反応を停止させた。Amicon Centricon
−30遠心分離により試料を6mまで濃縮させ、３回の同
じ2m装入ランでサイズ除外HPLCにより純化させた。使
用したカラムは、0.2MのNa2HPO4/NaH2PO4緩衝液（pH7.
0）内で平衡化されたBio−Sil TSK−250,600×21.5mm
（BioRad）であった。
３回の試行における穏やかにPEG化されたタンパク質
のA280ピークをプールし（プール1,SEC）、最終的な2m
体積まで濃縮させ、これを同じカラム上で再注入させ
た。活性のPEG化された分画をプールし濃縮させた。
のA280ピークをプールし（プール1,SEC）、最終的な2m
体積まで濃縮させ、これを同じカラム上で再注入させ
た。活性のPEG化された分画をプールし濃縮させた。
出発物質の15％を占める最終プール（プール2,SEC）
は、未修飾CSF−１の初期生物活性の約100％を有する6m
gのCSF−１から成り、SDS−PAGE上で約45kの見かけのMr
で移動する主要なPEG−CSF−１種を含んでいた。少量の
未修飾CSF−１及びさらに高度に変更されたCSF−１（約
10％）がプールされた生成物の中に残っていた。サイズ
除外クロマトグラフィ（SEC）プール１及び２の特徴づ
けは、以下の表IV及びＶに示されている。
は、未修飾CSF−１の初期生物活性の約100％を有する6m
gのCSF−１から成り、SDS−PAGE上で約45kの見かけのMr
で移動する主要なPEG−CSF−１種を含んでいた。少量の
未修飾CSF−１及びさらに高度に変更されたCSF−１（約
10％）がプールされた生成物の中に残っていた。サイズ
除外クロマトグラフィ（SEC）プール１及び２の特徴づ
けは、以下の表IV及びＶに示されている。
B.PEG化されたCSF−１（SCSF/N▽3C▽158）の薬理動態 PEG化されたCSF−１とされていないCSF−１の両方に
ついての用量が6mg/kgである点を除いて、本例の第Ａ節
で記述されているCSF−１とPEG−CSF−１の３匹とラッ
トにおける平均静脈内浄化を見積るために、例Ｉに記さ
れているものと同じ条件が用いられた。
ついての用量が6mg/kgである点を除いて、本例の第Ａ節
で記述されているCSF−１とPEG−CSF−１の３匹とラッ
トにおける平均静脈内浄化を見積るために、例Ｉに記さ
れているものと同じ条件が用いられた。
第７図は、静脈内注射後の時間数と３匹のラットの血
液からのCSF−１の相対的濃度の関係を表わす曲線を示
している。浄化は、PEG化されたCSF−１については約0.
63m／分/kgでありPEG化されていないCSF−１について
は7.50m／分/kgである（５分に対し３時間）ことがわ
かった。このことは、PEG化された分子について血液内
平均滞留時間の約12倍の増大を表わしている。
液からのCSF−１の相対的濃度の関係を表わす曲線を示
している。浄化は、PEG化されたCSF−１については約0.
63m／分/kgでありPEG化されていないCSF−１について
は7.50m／分/kgである（５分に対し３時間）ことがわ
かった。このことは、PEG化された分子について血液内
平均滞留時間の約12倍の増大を表わしている。
例 Ｖ PEG/CSF−１接合体の硫酸アンモニウム分別 A.小規模 0PEG−CSF−１（未接合CSF−１）,1PEG−CSF−１（CS
F−1 1モルあたりPEG 1モル）,2PEG−CSF−１（CSF−1
1モルあたりPEG 2モル）,3PEG−CSF−１（CSF−1 1モル
あたりPEG 3モル）及び4PEG−CSF−１（CSF−1 1モルあ
たりPEG4モル）を含む10mの反応混合物は、タンパク
質1mあたり約1mgであった。約1.3Mまで、固体（NH4）
2SO4を付加した。沈殿物を形成させ、10000rpmで10分間
遠心分離により除去した。沈殿物（ペレット）を貯え、
約1.4Μで濁るまで上澄みに対し（NH4）2SO4を加えた。
沈殿物を遠心分離でとり除いた。この手順を続行し、約
1.5,1.6及び1.7Mで付加的な（NH4）2SO4カットを行なっ
た。0.1MのTris pH8.6内で沈殿物を再度懸濁させた。沈
殿物のSDS−PAGE分析は、1.7Mの（NH4）2SO4の沈殿物に
おける未接合CSF−１の濃縮及び1.5及び1.6Mの沈殿物に
おける1PEG−CSF−１種の濃縮を示した。1PEG−及び3PE
G−CSF−１も存在していたもの、1.4Mの沈殿物の中での
優占種は2PEG−CSF−１であった。表VIは、Coomassie染
色された非還元性SDS−PAGEにより分析された場合の、
増大する（NH4）2SO4濃度の沈殿物（ペレット）内のさ
まざまなCSF−１の相対量を示している。CSF−１複合体
を１種以上含む分画の反復的（NH4）2SO4分別の結果、
基本的に純粋な未接合CSF−１及び1PEG−CSF−１が得ら
れた。この反復は同様に、ほぼ純粋な2PEG−CSF−１又
は3PEG−CSF−１を生産するためにも用いることができ
る。
F−1 1モルあたりPEG 1モル）,2PEG−CSF−１（CSF−1
1モルあたりPEG 2モル）,3PEG−CSF−１（CSF−1 1モル
あたりPEG 3モル）及び4PEG−CSF−１（CSF−1 1モルあ
たりPEG4モル）を含む10mの反応混合物は、タンパク
質1mあたり約1mgであった。約1.3Mまで、固体（NH4）
2SO4を付加した。沈殿物を形成させ、10000rpmで10分間
遠心分離により除去した。沈殿物（ペレット）を貯え、
約1.4Μで濁るまで上澄みに対し（NH4）2SO4を加えた。
沈殿物を遠心分離でとり除いた。この手順を続行し、約
1.5,1.6及び1.7Mで付加的な（NH4）2SO4カットを行なっ
た。0.1MのTris pH8.6内で沈殿物を再度懸濁させた。沈
殿物のSDS−PAGE分析は、1.7Mの（NH4）2SO4の沈殿物に
おける未接合CSF−１の濃縮及び1.5及び1.6Mの沈殿物に
おける1PEG−CSF−１種の濃縮を示した。1PEG−及び3PE
G−CSF−１も存在していたもの、1.4Mの沈殿物の中での
優占種は2PEG−CSF−１であった。表VIは、Coomassie染
色された非還元性SDS−PAGEにより分析された場合の、
増大する（NH4）2SO4濃度の沈殿物（ペレット）内のさ
まざまなCSF−１の相対量を示している。CSF−１複合体
を１種以上含む分画の反復的（NH4）2SO4分別の結果、
基本的に純粋な未接合CSF−１及び1PEG−CSF−１が得ら
れた。この反復は同様に、ほぼ純粋な2PEG−CSF−１又
は3PEG−CSF−１を生産するためにも用いることができ
る。
Ｂ 大規模 例IIIに従って約1gのCSF−１（SCSF/N▽3C▽158）を
接合させた。第Ａ部に記されているような（NH2）SO4に
よる分別の後、１つのPEGに対して接合されたCSF−1 2
量体の分子量をもつCSF−１約600mgを純化した。この接
合体は約6.2×107U/mgの比活性を有していた。結合され
た１つ、２つ又は３つのPEGを有するCSF−１の混合物約
80mgも又回収され、これは約3.2×107U/mgの比活性を有
していた。
接合させた。第Ａ部に記されているような（NH2）SO4に
よる分別の後、１つのPEGに対して接合されたCSF−1 2
量体の分子量をもつCSF−１約600mgを純化した。この接
合体は約6.2×107U/mgの比活性を有していた。結合され
た１つ、２つ又は３つのPEGを有するCSF−１の混合物約
80mgも又回収され、これは約3.2×107U/mgの比活性を有
していた。
例 VI PEG−IL−２接合体の硫酸アンモニウム分別 A.アミドリンカーを有するPEG−IL−２接合体 基本的に1988年11月17日に公示されたPCT特許公報第W
O.88/08849号に記されているように生産され純化され、
基本的に米国特許第7,766,106号に記述されているよう
にPEG化された約12mgのIL−２を、1mの1.0M Tris pH8
内で再度懸濁させた。溶液が濁るまで固体の（NH2）SO4
を付加した。試料を12分間12000rpmで遠心分離した。沈
殿物（ペレット）を0.1MのTris pH8.6内で再度沈殿させ
た。例Ｖに記述されているように（NH2）SO4分別を続行
し、再沈殿した沈殿物（ペレット）のSDS−PAGE分析
は、未接合IL−２を接合IL−２から分離できることを示
していた。さらに、CSF−１について例Ｖに記述されて
いる結果と同様に、1PEGに対して複合されたIL−２につ
いて濃縮された分画が得られた。特定の複合体について
濃縮された分画の再循環が、結果としてほぼ純粋な複合
体をもたらすものと予想される。
O.88/08849号に記されているように生産され純化され、
基本的に米国特許第7,766,106号に記述されているよう
にPEG化された約12mgのIL−２を、1mの1.0M Tris pH8
内で再度懸濁させた。溶液が濁るまで固体の（NH2）SO4
を付加した。試料を12分間12000rpmで遠心分離した。沈
殿物（ペレット）を0.1MのTris pH8.6内で再度沈殿させ
た。例Ｖに記述されているように（NH2）SO4分別を続行
し、再沈殿した沈殿物（ペレット）のSDS−PAGE分析
は、未接合IL−２を接合IL−２から分離できることを示
していた。さらに、CSF−１について例Ｖに記述されて
いる結果と同様に、1PEGに対して複合されたIL−２につ
いて濃縮された分画が得られた。特定の複合体について
濃縮された分画の再循環が、結果としてほぼ純粋な複合
体をもたらすものと予想される。
B.ウレタンリンカーを有するPEG−IL−２接合体 1989年１月20日に提出された同一所有権者の同時係属
米国特許出願第 号に記述されている手順によ
り、PEG−IL−２を得た。ここで記述するウレタンリン
カーを介してPEG部分をIL−２に付着させた。基本的に
例VI第Ａ部及び例Ｖに記述されているとおりの（NH2）S
O4沈殿の結果、さまざまなPEG−IL−２接合体の分別が
得られた。
米国特許出願第 号に記述されている手順によ
り、PEG−IL−２を得た。ここで記述するウレタンリン
カーを介してPEG部分をIL−２に付着させた。基本的に
例VI第Ａ部及び例Ｖに記述されているとおりの（NH2）S
O4沈殿の結果、さまざまなPEG−IL−２接合体の分別が
得られた。
例 VII PEG化されたCSF−１（SCSF/N▽3C▽158）の生体内効
力：細菌感染モデル 例IIIに記述されているSCSF/N▽3C▽158、例IIIに記
述されているとおりに調製されたPEG化されたSCSF/N▽3
C▽158又は食塩水（対照グループ）を、５匹のマウスか
ら成るグループに対し第１日目に（致死量の大腸菌SM18
に感染させる前の日）腹腔内注射した。２つのCSF−１
用量グループ（マウス一匹あたり10μｇと50μｇ）を用
いた。第０日目に、致死量（５×107細胞）の大腸菌SM1
8を全てのマウスに腹腔内注射した。生きのびたマウス
の数を５日間にわたり追跡調査した。結果は下表に示さ
れている。
力：細菌感染モデル 例IIIに記述されているSCSF/N▽3C▽158、例IIIに記
述されているとおりに調製されたPEG化されたSCSF/N▽3
C▽158又は食塩水（対照グループ）を、５匹のマウスか
ら成るグループに対し第１日目に（致死量の大腸菌SM18
に感染させる前の日）腹腔内注射した。２つのCSF−１
用量グループ（マウス一匹あたり10μｇと50μｇ）を用
いた。第０日目に、致死量（５×107細胞）の大腸菌SM1
8を全てのマウスに腹腔内注射した。生きのびたマウス
の数を５日間にわたり追跡調査した。結果は下表に示さ
れている。
結果は、生存率に対するrCSF−１の用量依存型効果が
存在することを示している。変更CSF−１と未変更CSF−
１の間でのこの単一の実験における効力のわずかな差
は、充分有意なものではない。CSF−１のPEG化は、この
プロトコルにより検知された効力を減少させず、又、当
該実験において観察可能な薬物依存型毒性を増大するこ
ともなかった。
存在することを示している。変更CSF−１と未変更CSF−
１の間でのこの単一の実験における効力のわずかな差
は、充分有意なものではない。CSF−１のPEG化は、この
プロトコルにより検知された効力を減少させず、又、当
該実験において観察可能な薬物依存型毒性を増大するこ
ともなかった。
例 VIII. 抗腫瘍効力についての接合CSF−１の生体内試験 Ａ Meth（メチオニン）Ａ肉腫モデル ７日前にMethA肉腫を皮下移植したマウス（１グルー
プにマウス10匹）１匹１回あたり最高50μｇの用量で、
PEG化されたCSF−１を腹腔内、皮下又は静脈内（i.p.,
s.c.,i.v.）注射した。投薬計画は、使用された特定のP
EG化CSF−１調製により左右される。CSF−１処置の開始
以後14日間、腫瘍の大きさを追跡調査する。CSF処理さ
れたマウス及び対照処理されたマウスにおける時間の経
過につれての腫瘍の大きさの平均的変化を比較すること
によって、結果を評価する。★（ΔTV＝単一のマウスグ
ループ内の第０日目の平均腫瘍体積に対する指定の日に
おける平均腫瘍体積の比）。
プにマウス10匹）１匹１回あたり最高50μｇの用量で、
PEG化されたCSF−１を腹腔内、皮下又は静脈内（i.p.,
s.c.,i.v.）注射した。投薬計画は、使用された特定のP
EG化CSF−１調製により左右される。CSF−１処置の開始
以後14日間、腫瘍の大きさを追跡調査する。CSF処理さ
れたマウス及び対照処理されたマウスにおける時間の経
過につれての腫瘍の大きさの平均的変化を比較すること
によって、結果を評価する。★（ΔTV＝単一のマウスグ
ループ内の第０日目の平均腫瘍体積に対する指定の日に
おける平均腫瘍体積の比）。
B.B16転移モデル B16のネズミ黒色腫細胞系内の転移を防ぐためPEG化CS
F−１を用いた第２の生体内腫瘍モデルも同様に有用で
ある。
F−１を用いた第２の生体内腫瘍モデルも同様に有用で
ある。
0.2mのCa+2及びMg+2を含まないHBSS内で懸濁された
１−10×104の腫瘍を、麻酔をかけていないマウスの尾
の側静脈に接種する。腫瘍細胞の接種後14日から21日目
に、マウスを安楽死させ、剖検する。剖検の間、肺と脳
を除去し、水で洗浄し秤量する。次に肺をブアン溶液内
で固定し、一対の肺についての表面腫瘍小結節の数を解
剖顕微鏡を用いて見極める。
１−10×104の腫瘍を、麻酔をかけていないマウスの尾
の側静脈に接種する。腫瘍細胞の接種後14日から21日目
に、マウスを安楽死させ、剖検する。剖検の間、肺と脳
を除去し、水で洗浄し秤量する。次に肺をブアン溶液内
で固定し、一対の肺についての表面腫瘍小結節の数を解
剖顕微鏡を用いて見極める。
例IIIに従って調節され、１−25×107U/mgの潜在能を
薬学的に受容可能なエンドトキシンレベルを有するPEG
化された組換え型ヒトCSF−１を用いる。CSF−１は、実
験毎に直前に凍結原料（ストック）から得たばかりのも
のであり、USP0.9％食塩水内で注射直前に希釈される。
PEG化されたCSF−１は、使用される特定のPEG化CSF−１
調製に応じた計画に基づいて、静脈内、腹腔内又は皮下
注射させる。使用される投薬レベルは、最高5mg/kgまで
である。非特異的で非治療的なタンパク質から成る陰性
対照としては、USPヒト血漿アルブミン（HSA）又は煮沸
したPEG化CSF−１を用いる。PEG化CSF−１は、CSF−１
活性を不活性にするため30分間煮沸される。
薬学的に受容可能なエンドトキシンレベルを有するPEG
化された組換え型ヒトCSF−１を用いる。CSF−１は、実
験毎に直前に凍結原料（ストック）から得たばかりのも
のであり、USP0.9％食塩水内で注射直前に希釈される。
PEG化されたCSF−１は、使用される特定のPEG化CSF−１
調製に応じた計画に基づいて、静脈内、腹腔内又は皮下
注射させる。使用される投薬レベルは、最高5mg/kgまで
である。非特異的で非治療的なタンパク質から成る陰性
対照としては、USPヒト血漿アルブミン（HSA）又は煮沸
したPEG化CSF−１を用いる。PEG化CSF−１は、CSF−１
活性を不活性にするため30分間煮沸される。
効力データは、PEG化CSF−１が肺転移の中央数を著し
く減少させるということを立証している。
く減少させるということを立証している。
例 IX PEG化CSF−１を用いたCMV感染の生体内処置 亜致死量のサイトメガロウイルス（CMV）に感染させ
る２日前から始めて、異系交配のCD−１マウスに、最高
400μg/kgの用量でPEG化CSF−１を、腹腔内、静脈内又
は皮下注射する。投薬計画は、使用される特定のPEG化C
SF−１の調製により左右される。マウスは、感染後３日
目に安楽死させ、脾臓といった標的器官内のウイルス複
製の範囲をプラーク測定法で評価する。結果は、PEG化C
SF−１での処置を受けたマウスが、食塩水での処置を受
けたマウスに比べて器官ウイルス力価を著しく下げたこ
とを示しており、これはすなわちPEG化CSF−１で処置さ
れたマウスにおいてCMV感染が比較的軽度であることを
表わしている。
る２日前から始めて、異系交配のCD−１マウスに、最高
400μg/kgの用量でPEG化CSF−１を、腹腔内、静脈内又
は皮下注射する。投薬計画は、使用される特定のPEG化C
SF−１の調製により左右される。マウスは、感染後３日
目に安楽死させ、脾臓といった標的器官内のウイルス複
製の範囲をプラーク測定法で評価する。結果は、PEG化C
SF−１での処置を受けたマウスが、食塩水での処置を受
けたマウスに比べて器官ウイルス力価を著しく下げたこ
とを示しており、これはすなわちPEG化CSF−１で処置さ
れたマウスにおいてCMV感染が比較的軽度であることを
表わしている。
別途に、異系交配されたCD−１マウスにおいて、致死
量のネズミCMV感染モデルでのPEG化CSF−１をテストす
ることが可能である（これは、器官力価を監視している
亜致死量のCMVを用いた前述の実験と対照的である）。
ウイルスの攻撃誘発より最高24時間前に始めて、最高4m
g/kg（マウス一匹あたり）の用量でマウスにPEG化CSF−
１を腹腔内、皮下又は静脈内投与した場合、食塩水で処
置された対照に比べて生存率の著しい増大がみられる。
量のネズミCMV感染モデルでのPEG化CSF−１をテストす
ることが可能である（これは、器官力価を監視している
亜致死量のCMVを用いた前述の実験と対照的である）。
ウイルスの攻撃誘発より最高24時間前に始めて、最高4m
g/kg（マウス一匹あたり）の用量でマウスにPEG化CSF−
１を腹腔内、皮下又は静脈内投与した場合、食塩水で処
置された対照に比べて生存率の著しい増大がみられる。
従って、PEG化CSF−１は、ウイルス感染全般の治療に
おいて単独で或いは又もう１つのリンフォカインと組合
わせた形で使用でき、特に、後天性免疫不全症候群（AI
DS）といった免疫抑制ウイルス感染において有益であり
うる。
おいて単独で或いは又もう１つのリンフォカインと組合
わせた形で使用でき、特に、後天性免疫不全症候群（AI
DS）といった免疫抑制ウイルス感染において有益であり
うる。
例 Ｘ 白血球数の生体内シミュレーション 使用するPEG化CSF−１の調製によって異なるさまざま
な投薬計画に基づき一回の投与あたり最高約2mg/kgの量
で、例IIIに記述されているようにPEG化された純化され
た組換え型ヒトCSF−１を、異系交配のCD−１マウスに
投与する。合計の白血球数、好中球数、単球数及びリン
パ球数を測定する。これらのパラメータのうちのいずれ
かにおける増加は、果粒細胞又は単球の生産の刺激及び
白血球数の増強構造（エンハンサー）として臨床医学及
び獣医学の分野で有用である可能性がある。
な投薬計画に基づき一回の投与あたり最高約2mg/kgの量
で、例IIIに記述されているようにPEG化された純化され
た組換え型ヒトCSF−１を、異系交配のCD−１マウスに
投与する。合計の白血球数、好中球数、単球数及びリン
パ球数を測定する。これらのパラメータのうちのいずれ
かにおける増加は、果粒細胞又は単球の生産の刺激及び
白血球数の増強構造（エンハンサー）として臨床医学及
び獣医学の分野で有用である可能性がある。
例 XI 創傷治ゆにおけるPEG化CSF−１ 移植されたゴアテックス管が侵入マクロファージ、線
維芽細胞及びその他の結合組織細胞及びコラーゲン及び
フィブリン沈着で一杯になる、Goodson及びHunt,1982
年、J.Surg.Res.,33:394のゴアテックスミニチュア創傷
治ゆモデルといったプロトコル及び動物モデルを用い
て、PEG化CSF−１を創傷治ゆについて検定する。治ゆ
は、顕微鏡で管の内容物を検査することにより評価され
る。第２のモデルは、Eisenger他、1988年、Proc.Natl.
Acad.Sci.USA85;1937の切開創治ゆモデルであり、ここ
では、創傷は目で観察され、治ゆ、細胞密度及び毛包か
ら発生する表皮細胞層数を監視するためパンチ生検（細
切採取法）が行なわれる。同様に実験の終りには、創傷
の破断強度が測定される。第３のモデルは、傷害部位の
中皮再生度によって、定められた断面内の治ゆが評価さ
れるような、Fotev,他、1987年、J.Pathol.151:209の火
傷を受けた精巣漿膜といった漿膜モデルである。これら
のモデルの各々による教示は本書に参考文献として内含
されている。
維芽細胞及びその他の結合組織細胞及びコラーゲン及び
フィブリン沈着で一杯になる、Goodson及びHunt,1982
年、J.Surg.Res.,33:394のゴアテックスミニチュア創傷
治ゆモデルといったプロトコル及び動物モデルを用い
て、PEG化CSF−１を創傷治ゆについて検定する。治ゆ
は、顕微鏡で管の内容物を検査することにより評価され
る。第２のモデルは、Eisenger他、1988年、Proc.Natl.
Acad.Sci.USA85;1937の切開創治ゆモデルであり、ここ
では、創傷は目で観察され、治ゆ、細胞密度及び毛包か
ら発生する表皮細胞層数を監視するためパンチ生検（細
切採取法）が行なわれる。同様に実験の終りには、創傷
の破断強度が測定される。第３のモデルは、傷害部位の
中皮再生度によって、定められた断面内の治ゆが評価さ
れるような、Fotev,他、1987年、J.Pathol.151:209の火
傷を受けた精巣漿膜といった漿膜モデルである。これら
のモデルの各々による教示は本書に参考文献として内含
されている。
一般に、PEG化CSF−１は、居所的創傷についての表皮
細胞誘導因子（EDF）を用いた切開創治ゆモデルの参考
文献中に記述されているような無菌条件下で食塩水中に
最高PEG化CSF−1 1mあたり1000000U/mの量で非付着
性外科包帯を浸漬させることにより、創傷部位に適用さ
れる。代替的には、同量のPEG化CSF−１を、Goodson及
びHunt（同書）に記述されているような移植の時点でゴ
アテックス管内に導入する。或いは又、PEG化CSF−１を
低速放出マトリクス内に内含させて創傷部位に（ゴアテ
ックス管内、包帯内又は包帯下又は漿液窩内注入によ
り）適用することもできる。又、PEG化CSF−１は、最高
1000μg/kg/日の用量で全身的に（静脈内、腹腔内又は
皮下）投与される。
細胞誘導因子（EDF）を用いた切開創治ゆモデルの参考
文献中に記述されているような無菌条件下で食塩水中に
最高PEG化CSF−1 1mあたり1000000U/mの量で非付着
性外科包帯を浸漬させることにより、創傷部位に適用さ
れる。代替的には、同量のPEG化CSF−１を、Goodson及
びHunt（同書）に記述されているような移植の時点でゴ
アテックス管内に導入する。或いは又、PEG化CSF−１を
低速放出マトリクス内に内含させて創傷部位に（ゴアテ
ックス管内、包帯内又は包帯下又は漿液窩内注入によ
り）適用することもできる。又、PEG化CSF−１は、最高
1000μg/kg/日の用量で全身的に（静脈内、腹腔内又は
皮下）投与される。
各モデルの治油速度を測定し、PEG化CSF−１が存在す
る場合又は存在しない場合の組織の修復を評価する。
る場合又は存在しない場合の組織の修復を評価する。
PEG化CSF−１は、EDF、表皮細胞成長因子（EGF）、線
維芽細胞成長因子（塩基性及び酸性FGF）、血小板誘導
成長因子（PDGF）又は転質転換成長因子（TGFアルファ
及びベータ）といった創傷治ゆを促進するその他の成長
因子、IL−１（インターロイキン１）及びその他のソマ
トメジンＣやビタミンＣといった物質と組合せて用いる
こともできる。
維芽細胞成長因子（塩基性及び酸性FGF）、血小板誘導
成長因子（PDGF）又は転質転換成長因子（TGFアルファ
及びベータ）といった創傷治ゆを促進するその他の成長
因子、IL−１（インターロイキン１）及びその他のソマ
トメジンＣやビタミンＣといった物質と組合せて用いる
こともできる。
例 XII PEG化されたLCSFの調製 A.接合 PEG″−11000は、例I Aに記されているとおりに調製
した。1988年10月20日に公示されたPCT公報WO 88/08003
号内に開示されている発酵純化及び再生手順に従って、
CSF−１（LCSF/N▽33C▽221）を調製した。5mgのLCSF
を、50mMのNaClを含むHEPES緩衝液（pH7.5）20mM内に透
析した。LCSF 2量体に対し６倍のモル過剰分でPEG″−1
1000を加えた。20℃で撹拌している2mg/mのLCSF溶液
に対し、乾燥した活性化PEGを付加した。Zorbax GF250
（Dupont社）上のサイズ除外HPLC（SEC）により10分毎
に反応混合物のアリコートを分析した。PEGに対して10
倍のε−アミノカプロン酸塩過剰分を付加することで、
反応を停止させた。表VIIIは、PEG−LCSF反応混合物のN
FS60生物検定データを示している。
した。1988年10月20日に公示されたPCT公報WO 88/08003
号内に開示されている発酵純化及び再生手順に従って、
CSF−１（LCSF/N▽33C▽221）を調製した。5mgのLCSF
を、50mMのNaClを含むHEPES緩衝液（pH7.5）20mM内に透
析した。LCSF 2量体に対し６倍のモル過剰分でPEG″−1
1000を加えた。20℃で撹拌している2mg/mのLCSF溶液
に対し、乾燥した活性化PEGを付加した。Zorbax GF250
（Dupont社）上のサイズ除外HPLC（SEC）により10分毎
に反応混合物のアリコートを分析した。PEGに対して10
倍のε−アミノカプロン酸塩過剰分を付加することで、
反応を停止させた。表VIIIは、PEG−LCSF反応混合物のN
FS60生物検定データを示している。
2mg/mのＭ−CSFを含む試料を、12mg/mのBSAを含
むPBS内に希釈させ、NFS60検定法で検定した。値は、各
試料の段階希釈について行なわれた重複測定の平均を表
わしている。
むPBS内に希釈させ、NFS60検定法で検定した。値は、各
試料の段階希釈について行なわれた重複測定の平均を表
わしている。
PEG化反応のサイズ除外分析は、30分の反応の後の２
つの主要なPEG−CSF種と示した。そのサイズは、CSF−1
2量体１モルあたり１モル及び２モルのPEGのおおよそ
の誘導体化と矛盾していなかった。45分後のSECプロフ
ィールは、約30分で反応が完了したことを示していた。
つの主要なPEG−CSF種と示した。そのサイズは、CSF−1
2量体１モルあたり１モル及び２モルのPEGのおおよそ
の誘導体化と矛盾していなかった。45分後のSECプロフ
ィールは、約30分で反応が完了したことを示していた。
Ｂ 未修飾LCSFからのPEG−LCSFの分離 試料を1MのTris−HClでpH8.3にまで調整し、30mMまで
の塩濃度を引き出すため分別ろ過し、Bio−Gel TSK−D
EAE−５−PW HPLC 75×7.5mmのカラムに適用した。カラ
ムを30mMのTris−HCl,pH8.5内で平衡化させ、０から0.6
M NaClの40min勾配で展開させた。全ての緩衝液は、発
熱物質を除いた水で調製し、HPLAシステムは予め0.1Μ
のNaOH及び50％のエタノールで洗浄し、エンドトキシン
を除去した。カラム外の分画をSDS−PAGEで分析した。P
EG化された種は、未修飾CSF−１よりも早くカラムから
溶離した。カラムの開口部内にも、或る程度のPEG−CSF
が現われ、この物質は、カラムへ再度適用しても再度結
合しなかった。結合しなかった分画も同様に、放出され
たNHS陰イオンを含んでいた。
の塩濃度を引き出すため分別ろ過し、Bio−Gel TSK−D
EAE−５−PW HPLC 75×7.5mmのカラムに適用した。カラ
ムを30mMのTris−HCl,pH8.5内で平衡化させ、０から0.6
M NaClの40min勾配で展開させた。全ての緩衝液は、発
熱物質を除いた水で調製し、HPLAシステムは予め0.1Μ
のNaOH及び50％のエタノールで洗浄し、エンドトキシン
を除去した。カラム外の分画をSDS−PAGEで分析した。P
EG化された種は、未修飾CSF−１よりも早くカラムから
溶離した。カラムの開口部内にも、或る程度のPEG−CSF
が現われ、この物質は、カラムへ再度適用しても再度結
合しなかった。結合しなかった分画も同様に、放出され
たNHS陰イオンを含んでいた。
その他の実施例 本書中の反応は、ポリビニルアルコール又はポリオキ
シエチル化ポリオールを用いても行なうことができる。
活性POG−CSF−１は次のように調製できる。
シエチル化ポリオールを用いても行なうことができる。
活性POG−CSF−１は次のように調製できる。
分子量5000のポリオキシエチル化グリセロール（PO
G）は、Polysciencesから入手可能である。POG 10gに対
し、2.28gのグルタル酸無水物（POGに対し10倍の過剰
分）を加えることができる。この混合物を２時間110℃
で撹拌し、冷却することができる。これを20mのCHCl3
の中に溶解させ、激しく撹拌しながら500mのエーテル
内にゆっくりと注ぎこむ。生成物を収集して、エーテル
で洗い、約90％のPOG−グルタル酸塩生成物を生み出す
ことができる。この生成物を例I Aで記述されているよ
うにＮ−ヒドロキシスクシニミドと反応させ、活性エス
テルPOG−グルタリルＮ−ヒドロキシスクシニミド（PO
G″）を生み出す。次に上述のCSF−１タンパク質のうち
の１つをPOG★と反応させることができる。
G）は、Polysciencesから入手可能である。POG 10gに対
し、2.28gのグルタル酸無水物（POGに対し10倍の過剰
分）を加えることができる。この混合物を２時間110℃
で撹拌し、冷却することができる。これを20mのCHCl3
の中に溶解させ、激しく撹拌しながら500mのエーテル
内にゆっくりと注ぎこむ。生成物を収集して、エーテル
で洗い、約90％のPOG−グルタル酸塩生成物を生み出す
ことができる。この生成物を例I Aで記述されているよ
うにＮ−ヒドロキシスクシニミドと反応させ、活性エス
テルPOG−グルタリルＮ−ヒドロキシスクシニミド（PO
G″）を生み出す。次に上述のCSF−１タンパク質のうち
の１つをPOG★と反応させることができる。
CSF−１に対する接合のための活性化されたポリビニ
ルアルコールを調製するのにニトリル置換のポリビニル
アルコールも使用できる。
ルアルコールを調製するのにニトリル置換のポリビニル
アルコールも使用できる。
寄 託 PCT公報WO 86/04607号及び欧州特許公報0272779号に
より詳しく記述されている以下の培養物は、Cetus Mast
er Culture Collection（CMCC）,1400,Fifty−Third St
reet,Emeryvill,CA.94608 USA及びAmerican Type Cultu
re Collection（ATCC）,12301 Parklawn Drive,Rockvil
le,MD.20852 USAに供託された。供託された試料のCMCC
及びATCCの受入れ番号及びATCC寄託年月日は以下のとお
りである。
より詳しく記述されている以下の培養物は、Cetus Mast
er Culture Collection（CMCC）,1400,Fifty−Third St
reet,Emeryvill,CA.94608 USA及びAmerican Type Cultu
re Collection（ATCC）,12301 Parklawn Drive,Rockvil
le,MD.20852 USAに供託された。供託された試料のCMCC
及びATCCの受入れ番号及びATCC寄託年月日は以下のとお
りである。
上記寄託は、ATCCと本特許出願の譲受人であるCetus
Corporationの間の契約に基づき行なわれたものであ
る。ATCCとの契約は、寄託又は刊行物を記述し識別する
米国特許の発行或いは何れかの米国又は外国特許出願明
細書の公開のうちいずれか先に発生した方の時点でかか
るプラスミドの後代及び細胞系を一般大衆に対し永久に
利用可能な状態におくこと、ならびに、35USC§122及び
それに基づく特許局長規則（37CFR §1,14特に8860G638
を含む）に従って米国特許局長が権利有りと認めた者に
対してかかるプラスミドの後代及び細胞系を利用可能な
状態におくことを規定している。本出願明細書の譲受人
は、供託中のプラスミド及び細胞系が適切な条件下で培
養されている間に死滅又は損失した場合、通知に基づい
て同じプラスミド及び細胞系の存続可能な培養ですみや
かにこれらを置換することに同意した。
Corporationの間の契約に基づき行なわれたものであ
る。ATCCとの契約は、寄託又は刊行物を記述し識別する
米国特許の発行或いは何れかの米国又は外国特許出願明
細書の公開のうちいずれか先に発生した方の時点でかか
るプラスミドの後代及び細胞系を一般大衆に対し永久に
利用可能な状態におくこと、ならびに、35USC§122及び
それに基づく特許局長規則（37CFR §1,14特に8860G638
を含む）に従って米国特許局長が権利有りと認めた者に
対してかかるプラスミドの後代及び細胞系を利用可能な
状態におくことを規定している。本出願明細書の譲受人
は、供託中のプラスミド及び細胞系が適切な条件下で培
養されている間に死滅又は損失した場合、通知に基づい
て同じプラスミド及び細胞系の存続可能な培養ですみや
かにこれらを置換することに同意した。
要約すると、本発明は、異なる化学リンカーを用いて
異なるサイズの水溶性重合体で選択的に誘導体化された
さまざまな組換え型CSF−１分子を提供するものと考え
られている。CSF−１の誘導体化は、CSF−１の見かけの
分子量を増大させ、ラットの血漿中のその生体内半減期
を増大させる。誘導体化は又、生理学的pHでの水性媒質
中のCSF−１の可溶性も増大し、集合体を減少又は除去
するか又はその抗原決定基を遮へいすることによってそ
の免疫原性を減少させることができる。
異なるサイズの水溶性重合体で選択的に誘導体化された
さまざまな組換え型CSF−１分子を提供するものと考え
られている。CSF−１の誘導体化は、CSF−１の見かけの
分子量を増大させ、ラットの血漿中のその生体内半減期
を増大させる。誘導体化は又、生理学的pHでの水性媒質
中のCSF−１の可溶性も増大し、集合体を減少又は除去
するか又はその抗原決定基を遮へいすることによってそ
の免疫原性を減少させることができる。
上述の明細は、当業者が本発明を実施できるのに充分
なものであると考えられる。供託された実施例は本発明
の一態様の単なる一例として示されているものにすぎ
ず、機能的に同等のあらゆる培養が本発明の範囲内に入
ることから、本発明は、寄託された培養により範囲の制
限を受けるものではない。本書中の物質の寄託は、本書
に含まれている記述が本発明の最良の様式を含む全ての
態様の実施を可能にするのに適切でないということの認
知を成すものではなく、又、それによってそれが代表す
る特定的な例にクレームの範囲が制限されることになる
と考えてはならない。実際、薬学製剤の分野又はそれに
関連する分野の当業者にとっては明白な本発明の上述の
実施態様のさまざまな変更が、以下のクレームの範囲内
に入るものと意図されている。
なものであると考えられる。供託された実施例は本発明
の一態様の単なる一例として示されているものにすぎ
ず、機能的に同等のあらゆる培養が本発明の範囲内に入
ることから、本発明は、寄託された培養により範囲の制
限を受けるものではない。本書中の物質の寄託は、本書
に含まれている記述が本発明の最良の様式を含む全ての
態様の実施を可能にするのに適切でないということの認
知を成すものではなく、又、それによってそれが代表す
る特定的な例にクレームの範囲が制限されることになる
と考えてはならない。実際、薬学製剤の分野又はそれに
関連する分野の当業者にとっては明白な本発明の上述の
実施態様のさまざまな変更が、以下のクレームの範囲内
に入るものと意図されている。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 14/53 Ａ６１Ｋ 37/02 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ５３１４９ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ６７１３９ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ６７１４０ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ６７１４５ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ６７３８９ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ６７１４１ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ６７２５０ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ６７３８３ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ６７１４２ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ６７３９１ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ６７５６１ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ６７１４４ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ６７３９０ (72)発明者 コーツ，カーストン イー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94530，エル セリト，ミラ ビスタ ドライブ 2646 (72)発明者 モアランド，マーガレット アメリカ合衆国，カリフォルニア 94702，バークレイ，エベリン アベニ ュ 1320 (72)発明者 キャトル，ナンディニ アメリカ合衆国，カリフォルニア 94530，エル セリト，ジョーダン ア ベニュ 6107 (72)発明者 レアード，ウォルター ジェイ. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94564，ピノール，ラッセン ウェイ 2660 (72)発明者 アルドウィン，ロイス アメリカ合衆国，カリフォルニア 94402，サン マテオ，レイクショア ドライブ 179 (72)発明者 ニテキ，ダヌーテ イー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94709，バークレイ，バージニア スト リート 2296 (72)発明者 ヤング，ジョン ディー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94596，ウォルナット クリーク，ピエ ドラ ドライブ 1430 (56)参考文献 特開 昭58−225025（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−59629（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−226821（ＪＰ，Ａ) 特表 昭62−501607（ＪＰ，Ａ) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳ Ａ，ｖｏｌ84（1987）Ｐ1487−1491 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) A61K 38/19 A61K 47/48 A61P 31/00 A61P 35/00 A61P 37/04 ＣＡ（ＳＴＮ) Ｍｅｄｌｉｎｅ（ＳＴＮ)
Claims (45)
- 【請求項１】コロニー刺激因子−１（CSF−１）あるい
はCSF−１において１〜複数個のアミノ酸の欠失、付加
及び／又は置換により変形されているCSF−１変異体を
含んで成る、修飾された蛋白質であって、この修飾され
た蛋白質が、 （ａ）１又は２個のアミノ酸残基への水溶性ポリマーの
共有結合により修飾されており、この水溶性ポリマーが
ポリエチレングリコールホモポリマー、ポリプロピレン
グリコールホモポリマー及びポリオキシエチル化ポリオ
ールから成る群から選択されたものであり、そして該ポ
リマーは一端においてアルキル基により置換されている
か又は置換されておらず、 （ｂ）上記（ａ）に記載の修飾がなされていない蛋白質
に比べて延長された循環半減期を示し、そして （ｃ）CSF−１と実質的に同じ生物活性レベルを維持し
ている、 ことを特徴とする修飾された蛋白質。 - 【請求項２】前記CSF−１が生来のヒトCSF−１である請
求項１に記載の蛋白質。 - 【請求項３】前記CSF−１又はCSF−１変異体が組換ヒト
CSF−１である請求項１に記載の蛋白質。 - 【請求項４】前記CSF−１変異体が細菌中で組換発現さ
れたものであり、そしてLCSF/C▽150ないしＣ▽464;tyr
59LCSF/C▽150ないしＣ▽464;SCSF/C▽150ないしＣ▽16
6;asp95SCSF/C▽150ないしＣ▽166;並びにこれらのglu
52変異体及びＮ▽３及びＮ▽３変異体から成る群から選
択された予想アミノ酸配列を有するホモダイマーであ
り、ここでLCSFは第２図のアミノ酸１−522として示さ
れる配列によりコードされており、そしてSCSFは第１図
のアミノ酸１−224として示される配列によりコードさ
れている、請求項３に記載の蛋白質。 - 【請求項５】前記CSF−１変異体が、LCSF/C▽150;tyr59
LCSF/C▽150;LCSF/C▽190;tyr59LCSF/C▽190;LCSF/C▽1
91;tyr59LCSF/C▽191;LCSF/C▽221;tyr59LCSF/C▽221;L
CSF/C▽223;tyr59LCSF/C▽223;LCSF/C▽236;tyr59LCSF/
C▽236;LCSF/C▽238;tyr59LCSF/C▽238;LCSF/C▽249;ty
r59LCSF/C▽249;LCSF/C▽258;tyr59LCSF/C▽258;LCSF/C
▽411;tyr59LCSF/C▽411;LCSF/C▽464;tyr59LCSF/C▽46
4;SCSF/C▽150;SCSF/C▽153;SCSF/C▽158;対応するasp
59SCF;並びにそのgln52変異体及びＮ▽２及びＮ▽３変
異体から成る群から選択される予想アミノ酸配列を有す
るホモダイマーである、請求項４に記載の蛋白質。 - 【請求項６】前記CSF−１変異体が、LCSF/C▽150,LCSF/
C▽190,LCSF/C▽221,tyr59LCSF/C▽150,tyr59LCSF/C▽1
90,tyr59LCSF/C▽221,SCSF/C▽158,SCSF/C▽150,asp59S
CSF/C▽158;asp59SCSF/C▽150;並びにそのＮ▽2N及びＮ
▽３変異体から成る群から選ばれた配列によりコードさ
れたホモダイマーである、請求項５に記載の蛋白質。 - 【請求項７】前記CSF−１変異体が、SCSF/C▽150,asp59
SCSF/C▽150,SCSF/N▽3C▽150,asp59SCSF/N▽3C▽150,S
CSF/N▽3C▽158,asp59SCSF/N▽3C▽158asp59SCSF/N▽2C
▽150及びasp59SCSF/N▽2C▽158から成る群から選択さ
れた配列によりコードされたホモダイマーである、請求
項６に記載の蛋白質。 - 【請求項８】前記CSF−１又はCSF−１変異体が、ポリマ
ーと反応性の遊離スルヒドリル基と共にシステイン残基
を含有する１個のサブユニットから成る組換ヘテロダイ
マーである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の蛋白
質。 - 【請求項９】前記CSF−１又はCSF−１変異体がネズミCS
F−１である、請求項１に記載の蛋白質。 - 【請求項１０】前記CSF−１又はCSF−１変異体が真核性
宿主中で発現されそこから分泌されたヒトCSF−１であ
る、請求項１〜３及び５〜９のいずれか１項に記載の蛋
白質。 - 【請求項１１】前記CSF−１変異体が、LCSF/C▽150;tyr
59LCSF/C▽150;LCSF/C▽190;tyr59LCSF/C▽190;LCSF/C
▽191;tyr59LCSF/C▽191;LCSF/C▽221;tyr59LCSF/C▽22
1;LCSF/C▽223;tyr59LCSF/C▽223;LCSF/C▽236;tyr59LC
SF/C▽236;LCSF/C▽238;tyr59LCSF/C▽238;LCSF/C▽24
9;tyr59LCSF/C▽249;LCSF/C▽258;tyr59LCSF/C▽258;LC
SF/C▽411;tyr59LCSF/C▽411;LCSF/C▽464;tyr59LCSF/C
▽464;SCSF/C▽150;SCSF/C▽153;SCSF/C▽158;対応する
asp59SCSF;並びにそれらのgln52変異体から成る群から
選択された配列によりコードされたダイマーである、請
求項10に記載の蛋白質。 - 【請求項１２】前記ポリマーが約1000〜100,000ダルト
ンの平均分子量を有するものである、請求項１〜11のい
ずれか１項に記載の蛋白質。 - 【請求項１３】前記ポリマーが4000〜40,000ダルトンの
平均分子量を有するものである、請求項１〜12のいずれ
か１項に記載の蛋白質。 - 【請求項１４】前記ポリマーが該ポリマーのカルボン酸
の活性エステルによる反応を介して蛋白質に接合してい
る、請求項１〜13のいずれか１項に記載の蛋白質。 - 【請求項１５】前記ポリマーが非置換ポリエチレングリ
コールホモポリマー、モノメチルポリエチレングリコー
ルホモポリマー又はポリオキシエチル化グリセロールで
ある、請求項14に記載の蛋白質。 - 【請求項１６】前記CSF−１又はCSF−１変異体がその１
〜３個の遊離アミノ基を介して接合しており、そして前
記ポリマーが該蛋白質の該遊離アミノ基と反応するＮ−
ヒドロキシサクシンイミドエステル、ｐ−ニトロフェニ
ルエステル又は４−ヒドロキシ−３−ニトロベンゼンス
ルホン酸エステル基を含有している、請求項１に記載の
蛋白質。 - 【請求項１７】接合する前記アミノ基がリジン残基もし
くはＮ−末端アミノ酸又はその組合せに存在する、請求
項16に記載の蛋白質。 - 【請求項１８】前記CSF−１又はCSF−１変異体が１又は
複数のシステイン残基を介して接合しており、そして前
記ポリマーが該システイン残基の遊離スルヒドリル基と
反応するマレイミド基又はハロアセチル基を含有する、
請求項１〜15のいずれか１項に記載の蛋白質。 - 【請求項１９】前記CSF−１又はCSF−１変異体がグリコ
シル化されており、そして該蛋白質上の炭水化物成分の
少なくとも１つを介してポリマーに接合しており、そし
て該ポリマーが、該炭水化物成分の酸化により形成され
る遊離アルデヒドと反応するアミノ、ヒドラジン又はヒ
ドラジド基を含有する、請求項１〜15のいずれか１項に
記載の蛋白質。 - 【請求項２０】前記CSF−１又はCSF−１変異体が真核性
宿主において組換え発現される組換えCSF−１のダイマ
ー生成物である、請求項１〜19のいずれか１項に記載の
蛋白質。 - 【請求項２１】前記真核宿主が哺乳類、昆虫、酵母又は
真菌の細胞である、請求項20に記載の蛋白質。 - 【請求項２２】前記CSF−１又はCSF−１変異体がウレタ
ン結合を介して前記ポリマーに結合している、請求項１
〜15のいずれか１項に記載の蛋白質。 - 【請求項２３】前記ポリマーが該ポリマーのカルボン酸
の活性エステルとの反応を介してて蛋白質に接合してい
る、請求項１〜15のいずれか１項に記載の蛋白質。 - 【請求項２４】前記ポリマーが非置換ポリエチレングリ
コールホモポリマー、モノメチルポリエチレングリコー
ルホモポリマー又はポリオキシエチル化グリセロールで
ある、請求項22に記載の蛋白質。 - 【請求項２５】１モルのCSF−１ダイマー当り１〜２モ
ルのポリマーが存在する、請求項23に記載の蛋白質。 - 【請求項２６】前記共有結合により接合した蛋白質がCS
F−１モル当りポリマーのモル数に関して実質的に純粋
である、請求項１〜25のいずれか１項に記載の蛋白質。 - 【請求項２７】前記実質的に純粋な接合した蛋白質が硫
酸アンモニウム分画により得られたものである、請求項
26に記載の蛋白質。 - 【請求項２８】医薬として許容されるキャリヤー媒体と
共に請求項１〜27のいずれか１項に記載の修飾された蛋
白質を含んで成る医薬製剤。 - 【請求項２９】前記蛋白質が再生されておりそしてイン
ビトロで精製されており、そして細菌において組換発現
される組換CSF−１クローンの生成物である、請求項28
に記載の製剤。 - 【請求項３０】前記蛋白質が、1.0ng/mg CSF−１未満の
エンドトキシン含量を有しそして実質的にパイロジエン
を含有しない生物学的に活性な再生されたCSF−１ダイ
マーである、請求項28又は29に記載の製剤。 - 【請求項３１】哺乳類における感染性疾患の予防的又は
治療的処置のための請求項28〜30のいずれか１項に記載
の製剤。 - 【請求項３２】哺乳類における腫瘍の治療のための請求
項28〜30のいずれか１項に記載の製剤。 - 【請求項３３】請求項１〜27のいずれか１項に記載の修
飾された蛋白質の製造方法であって、 （ａ）少なくとも１個の末端反応基を有する水溶性ポリ
マーを用意し、該ポリマーは、ポリエチレン又はポリプ
ロピレングリコールホモポリマー及びポリオキシエチル
化ポリオールから成る群から選択されたものであり、該
ホモポリマーはアルキル基により一端において置換され
ているか又は置換されておらず； （ｂ）請求項１〜27のいずれか１項に記載のCSF−１又
はCSF−１変異体を前記ポリマーの反応性基と反応せし
めることにより該蛋白質を生物学的に活性にしそして選
択に接合せしめ；そして （ｃ）接合した蛋白質を精製する； ことを含んで成る方法。 - 【請求項３４】前記ポリマーが約1,000〜100,000ダルト
ンの平均分子量を有する、請求項33に記載の方法。 - 【請求項３５】前記蛋白質がその１〜２個の遊離アミノ
基を介して接合しており、そして前記ポリマーが該蛋白
質の遊離アミノ基と反応するＮ−ヒドロキシサクシンイ
ミドエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、又は４−
ヒドロキシ−３−ニトロベンゼンスルホン酸エステル基
を含有する、請求項33又は34に記載の方法。 - 【請求項３６】前記アミノ基がリジン残基もしくはＮ−
末端アミノ酸又はその組合せであり、そして段階（ｂ）
が約７〜９のpHにおいて行われる、請求項35に記載の方
法。 - 【請求項３７】前記ポリマーが非置換ポリエチレングリ
コールホモポリマー、モノメチルポリエチレングリコー
ルホモポリマー又はポリオキシエチル化グリセロールで
ある、請求項33に記載の方法。 - 【請求項３８】前記CSF−１又はCSF−１変異体が組換ヒ
トCSF−１である、請求項33に記載の方法。 - 【請求項３９】前記CSF−１又はCSF−１変異体が細菌中
で組換発現されたものであり、そしてLCSF/C▽150ない
しＣ▽464;tyr59LCSF/C▽150ないしＣ▽464;SCSF/C▽15
0ないしＣ▽166;asp59SCSF/C▽150ないしＣ▽166;並び
にこれらのglu52変異体及びＮ▽３及びＮ▽３変異体か
ら成る群から選択された予想アミノ酸配列を有するホモ
ダイマーであり、ここでLCSFは第２図のアミノ酸１−52
2として示される配列によりコードされており、そしてS
CSFは第１図のアミノ酸１−224として示される配列によ
りコードされている、請求項33〜38のいずれか１項に記
載の方法。 - 【請求項４０】前記CSF−１又はCSF−１変異体が真核性
宿主中で発現されそこから分泌されたヒトCSF−１であ
る、請求項33〜38のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項４１】段階（ｃ）の後、医薬として許容される
水性キャリヤー媒体中に蛋白質に製剤化する段階をさら
に含んで成る、請求項33〜40のいずれか１項に記載の方
法。 - 【請求項４２】前記CSF−１又はCSF−１変異体がグリコ
シル化されており、そして該蛋白質上の炭水化物成分の
少なくとも１つを介してポリマーに接合しており、そし
て該ポリマーが、該炭水化物成分の酸化により形成され
る遊離アルデヒドと反応するアミノ、ヒドラジン又はヒ
ドラジド基を含有する、請求項33〜41のいずれか１項に
記載の方法。 - 【請求項４３】前記蛋白質が真核性宿主において組換え
発現される組換えCSF−１のダイマー生成物である、請
求項33〜38及び40〜42のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項４４】前記真核宿主が哺乳類、昆虫、酵母又は
真菌の細胞である請求項43に記載の方法。 - 【請求項４５】段階（ｃ）が硫酸アンモニウム分画を含
んで成る、請求項38〜44のいずれか１項に記載の方法。
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