JPH01193227A - 癌免疫療法補助剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 イ、利用分野 本発明は、コロニー形成刺激因子を有効成分とする免疫
賦活剤の癌免疫療法補助剤に関する。さらに詳しくは、
免疫賦活剤と併用することによって、免疫賦活剤の有効
性を増大させうる癌免疫療法補助剤に関する。

口、従来技術 ］ロニー形成刺激因子（以下、Ｃ３Ｆ）は顆粒球やマク
ロファージの増殖と分化を促進する内因性因子である。

Ｃ３Ｆは骨髄の顆粒球・マクロファージの幹細胞（ＧＭ
−ＣＦＵ）１．：働き、１）ｍ粒球を形成するＧ−Ｃ３
Ｆ　（ＩＩ粒球−Ｃ３Ｆ）、２）単球マクロファージを
形成するＭ−Ｃ５Ｆ（マクロファージ−Ｃ３Ｆ）　、３
）顆粒球とマクロファージも両方形成するＧＭ−Ｃ３Ｆ
などに分類される。また、直接骨髄のＧＭ−ＣＦＵには
作用せず、血液中の卓球に働きＧＭ−Ｃ３Ｆの分泌を促
し、間接的にマクロファージや顆粒球を増殖するＣ３Ｆ
−ＨＵも、人尿から精製されている。

免疫賦活剤は、癌免疫療法の一手段として使用されてお
り、現在、臨床用として、ピシバニール（ＯＫ−４３２
）　、クレスチン（ＰＳＫ）、レンチナン、シゾフィラ
ン（ＳＰＧ）などが市販されている。

この免疫賦活剤の作用機序としては、卓球、顆粒球、リ
ンパ球に作用して内因性ＴＮＦ　（腫瘍壊死因子）また
はＴＮＦ様物質を分泌させて、生体中のＴＮＦ活性を上
げることにより後腫瘍効果を奏すると考えられている。

免疫賦活剤は副作用が少なく、有用な抗腫瘍剤ではある
が、反面作用が弱く、必ずしも満足すべき効果が得られ
ていない。

ハ１発明が解決しようとする問題点 本考案者らは、免疫賦活剤の作用増強を図るべく鋭意研
究を行った結果、免疫賦活剤とＣ３Ｆを併用することに
より、生体内のＴＮＦ活性を上昇させることを今回初め
て見出した。

そして、さらに、免疫療法剤の抗腫瘍効果を顕著に増大
させること、従って当該Ｃ３Ｆが免疫療法剤による癌免
疫療法における補助剤、換言すれば免疫賦活剤の作用増
強剤として使用しうろことを見出して本発明を完成した
。

二０問題点を解決するための手段 （１）　ＣＳ　Ｆ 本発明のＣ３Ｆは、顆粒球やマクロファージの増殖と分
化を促進する蛋白質因子であれば特に限定されない。

このようなＣ３Ｆとして、公知のＧ−ＣＳ　Ｆ。

Ｍ−Ｃ３Ｆ、ＧＭ−Ｃ３Ｆ、Ｃ３Ｆ−ＨＵ　（人尿由来
Ｃ３Ｆともいう）などが例示される。

Ｃ３Ｆの調製方法としては、人尿からの精製、Ｃ３Ｆ産
生細胞の培養、遺伝子工学法などの手段が挙げられる。

具体的には 特開昭５４−１４０７０７で開示されたＣ３Ｆ　（ｉ）
特願昭６１−２０４１４で開示されたＣ５Ｆ　（ｉ）特
願昭６１−１２５５４８で開示されたＣ３Ｆ（ｉｉｉ）
などが挙げられる。

（ｉＨｌ）Ｃ３Ｆ　（ｉ） Ｃ３Ｆ　（ｉ）は以下の理化学的性質を有する糖蛋白質
である。

（ａ）　　分子量ニゲル濾過法による測定で７５．００
０〜９０、０００、 （ｂ）　　溶解性：水に溶解し、クロロホルムにやや溶
解し、エチルアルコール、アセトンに不溶、（Ｃ）　　
比旋光度：　〔α〕：＠＝Ｏ±４０　（０，２５％水溶
液）、 （ｄ）ｐＨ：１％（重量）水溶液で５．０〜６．０、（
ｅ）　　等電点：　ｐＨ４，７±０．２、（ｆ）　　温
度安定性：１％（重量）水溶液を６０℃±０．５℃で３
０分間加熱することにより人頴粒球の分化増殖作用を失
う、 （（至）電気泳動ニドデシル硫酸ナトリウム・ポリアク
リルアミドゲルを用いた電気泳動により分子量８５．０
００に測定される。

（社）赤外線吸収：次の特徴的吸収値（ｃｒ’）を有す
る、 ３６００〜３２００　（強’）　、１７００〜１６００
　（強）、１５５０　（中）　、１４３０〜１３８０　
（中）　、１１５０〜１０００（ブロード） （ｉ）　　呈色反応：α−ナフトール硫酸反痣、インド
ール硫酸反応、アンスロン硫酸反応、フェノール硫酸反
応について糖類の呈色反応を示し、ローリイフォリン反
応法ならびに塩酸加水分解後のニンヒドリン反応につい
てペプチド結合ならびにアミノ酸の呈色反応を示す、０
）　　蛋白質部分の構成アミノ酸ニブロリン、アスパラ
ギン酸、スレオニン、セリン、グルタミン酸、グリシン
、アラニン、バリン、メチオニン、インロイシン、ロイ
シン、チロシン、フェニルアラニン、リジン、ヒスチジ
ン、トリプトファン、アルギニン、 （財）色及び形状：はぼ白色、不定形である、（１）　
　糖質部分の構成糖：中性糖（グルコース換算）’１０
．０〜１３．０％（重量）、シアル酸３．０〜７．０％
（重量）、アミノ糖１％（重量）以下（ホ）蛋白質と糖
質との比率：蛋白質７５〜８５％（重量）、糖質１３．
０〜２０．０％（重量）。

（ｎ）　　元素分析： 炭素：　４２．３〜４７．３％ 水素：５．７〜７．８％ 窒素：９．６〜１４．３％ イオウ：０．２％以下、 （０）　　ヒト骨髄細胞に作用して顆粒球の分化増殖を
促進する。

又、本発明において、その有効成分として、上記糖蛋白
質の活性ペプチド断片を利用してもよく、あるいはその
断片誘導体を利用してもよい。

本発明の糖蛋白質の製法としては、特開昭５４−１４０
７０４　、特開昭５５−２６５０３、特開昭５５−２６
５０４および特開昭５５−４５６１８にて開示されてい
る。

具体的には°人尿をケイ素含有吸着剤と接触させ、吸着
した有効物質をアルカリ水溶液で溶出せしめ、中性塩で
濃縮沈澱せしめた分画を分別し、該分画の分子量１０４
未満の物質を除去し、得られた分子量１０４以上の物質
を含有する分画を無機塩類緩衝液に溶解後隅イオン交換
体と接触させせ不純物を交換体に吸着せしめて除去し、
溶出した液を陰イオン交換体と接触させ、有効物質をイ
オン交換体に吸着せしめ、のち０．１〜０．３モルの無
機塩溶液にて溶出せしめ、得られた溶出液を水吸収度が
１０〜２０ｍ１／ｇの高架橋度重合ゲルを充填したカラ
ムに通液して溶出液中の有効物質を０．０５〜０．１モ
ルの塩類緩衝液にて展開せしめ、相対溶出液量が１．１
１〜１．６０である分画を分別し、ｐＨ６，０〜８．０
において糖親和性吸着体と分別分画を接触させ、２０〜
１００ｍＭの糖類を含む１．０〜２．０Ｍ塩添加緩衝液
（ｐＨ６，０〜８．０）で溶出し、次いで溶出液をｐ＋
７．０〜９．０において調製用電気泳動にかけ、希薄塩
溶層により溶出し、有効成分を回収する方法などが例示
される。

また、必要に応じて、ｐＨ５〜９にて５０〜７０℃で８
〜３０時間程時間熱処理することもできる。

（ｉｉ　）　ＣＳ　Ｆ　（ｉｉ　） Ｃ３Ｆ（ｉｉ）は以下の性質を有する糖蛋白質である。

（ａ）　　分子量ニゲル濾過法による測定で、約７０．
０００ （ｂ）　　等電点：ｐＨ約４．７ （Ｃ）　　Ｎ末のアミノ酸配列： １２３４５６’７ Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　　−Ｇｉｎ　　−Ｓ
ｅｒ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　　Ｖａｔ　　
Ｐｈｅ−　Ｔｈｒ　Ａｌａ　　−Ｇｉｎ　Ｇｌｙ（配列
中、−は測定不可能であにとを意味する）（ｄ）　　骨
髄細胞に作用して頚粒球系幹細胞の分化増殖を促進する
、 （ｅ）　　蛋白質と糖質の比率：糖含量的１３〜２０％
Ｃ３Ｆ（ｉｉ）の製法は特願昭６１−２０４１４等に開
示されている。具体的には次のような方法が例示される
。

Ａ、出発原料 人尿等、特に人尿をＣ３Ｆの比活性が少なくとも約１０
００〜３０００単位／Ａ２８０程度に部分精製したヒト
のＣ３Ｆ活性を有する溶液が利用できる。部分精製法と
しては、公知の方法、例えば特開昭５４−１４０７０７
号（ケイ素含有吸着剤、陽イオン交換体、陰イオン交換
体、ゲル濾過の処理による精製）、特開昭５９−５８６
２９号（濃縮、加熱、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ
）、陰イオン交換体の処理による精製）等が挙げられる
。

Ｂ、精製・単離法 精製・単離は、部分精製Ｃ３ＦをＰＥＧ分画、エフノー
ル分画、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、疎
水クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグ
ラフィー）による処理を組み合わせて行う。

（ｉｉｉ）　Ｃ８Ｆ　（ｉｉｉ＞ Ｃ３Ｆ（ｉｉｉ）は単量体の糖蛋白質であって、以下の
性質を有する。

（ａ）　　分子量ニゲル濾過法による測定で、約７０．
０００ ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で、 非還元、還元条件下いずれにおい ても、約３４．０００ （ｂ）　　Ｎ末端のアミノ酸配列： ｌ５１０ Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｘ
−３ｅｒ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−１１ｅ−Ｇｌｙ−５ｅｒ−
Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−３ｅｒ−Ｌｅｒ−Ｇ
ｌｎ−Ｘ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ａｓｐ− （配列中、Ｘは未同定であることを意味する）（Ｃ）　
　骨髄細胞に作用して顧粒球系幹細胞の分化増殖を促進
する。

Ｃ３Ｆ（ｉｉｉ）の製法は特願昭６２−１２５５４８等
で開示されている。

（ｉｖ）　Ｃ３Ｆ　（ｉｖ） Ｃ３Ｆ（ｉｖ）は次の理化学的性質を有する糖蛋白質で
ある。

ａ）分子量 同一のサブユニット２個から成るホモ２量体であって、
ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気
泳動で測定した分子量が７０．０００〜９０、０００ダ
ルトンであり、還元剤で解離させて生物活性を消失させ
たサブユニットについてドデシル硫酸ナトリウム・ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動で測定した分子量は、３５
．０００〜４５．０００ダルトンである。

ｂ）サブユニットのアミノ酸配列 ホモ２量体を構成するサブユニット蛋白質は、次に示す
２１４個乃至２３８個のアミノ酸配列を有し、１２２番
目及び１４０番目のアスパラギンはそれぞれアスパラギ
ン（Ａｓｎ）−Ｘ−スレオニン（Ｔｈｒ）／セリン（Ｓ
ｅｒ）で表わされる典型的なＮ−グリコシド結合部位を
有する。ここでＸは任意のアミノ酸を示す。

Ｇ　１ｕ−Ｇ　Ｉｕ−Ｖａ　ｌ−３ｅｒ−Ｇ　Ｉｕ−Ｔ
ｙｒ−Ｃｙｓ−３ｅｒ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−Ｉ　Ｉｅ−Ｇ
ｌｙ−３ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−３ｅ
ｒ−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ａｓｐ
−３ｅｒ−Ｇ　Ｉｎ−Ｍｅｔ−Ｇ　１ｕ−Ｔｈｒ−３ｅ
ｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ
−Ｐｈｅ−Ｖａｔ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｇ　
Ｉｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−ｐｒｏ−Ｖａ　１−Ｃ
ｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌ　ｙｓ−Ｌｙｓ−Ａ　１ａ−
Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａ　１−Ｇ　Ｉｎ−Ａｓｐ
−１１ｅ−Ｍｅｔ−Ｇ　ｌｕ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ
−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−＾５ｎ−Ｔｈｒ−
Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ−１１ｅ−Ａｌａ−１１ｅ−Ｖ
ａｌ−Ｇｉｎ−Ｌｅｕ−ＧＩｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅ
ｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−３ｅｒ−Ｃｙｓ
０Ｏ −Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｇ　１ｕ
−Ｇ　１ｕ−Ｈｉｓ−＾５ｐ−Ｌｙｓ−Ａ　１ａ−Ｃｙ
ｓ−Ｖａ　１−Ａｒｇ−Ｔｈ　ｒ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｇ
　１ｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒ。

−Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇ　１ｕ−Ｌｙ
ｓ−Ｖａ　１−Ｌｙｓ−＾５ｎ−Ｖａ　１−Ｐｈｅ−Ａ
ｓｎ−Ｇ　１ｕ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌ
ｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−１ｉ
ｅ−Ｐｈｅ−３ｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ
５Ｏ −Ａｓｎ−３ｅｒ−Ｐｈｅ−Ａ　１ａ−Ｇ　１ｕ−Ｃｙ
ｓ−５ｅｒ−３ｅｒ−Ｇ　ｉｎ−＾５ｐ−Ｖａ　１−Ｖ
ａ　１−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ａ
ｓｎ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｌ
ａ−１１ｅ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−３ｅｒ−Ａｓｐ−Ｐｒ。

−Ａｌａ−５ｅｒ−Ｖａｌ−３ｅｒ−Ｐｒｏ−旧ｓ−Ｇ
ｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ｍｅ
ｔ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ
−Ｔｈｒ０Ｏ −Ｔｒｐ−Ｇ　１ｕ−Ａｓｐ−３ｅｒ−Ｇ　１ｕ−Ｇ　
１ｙ−Ｔｈｒ−Ｇ　１ｕ−Ｇ　１ｙ−３ｅｒ−３ｅｒ−
Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｐ
ｒｏ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒ
ｏ−Ｇｌｙ−５ｅｒ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ
−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−
Ｇ　Ｉｎ−３ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇ　ｌｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ
−Ｇ　Ｉｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｖａ　１−Ｖａ　１−Ｌ
ｙｓサブユニットのアミノ酸配列 Ｃ）等電点 ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動法及びシュクロ
ース密度勾配等電点電気泳動法で測定した等電点（ｐＩ
）は３．１〜３．７である。

ｄ）糖鎖の構成単糖 加水分解後高速液体クロマトグラフィーで分析したとこ
ろ、同定された糖鎖の構成単糖は、マンノース、ガラク
トース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラ
クトサミン及びＮ−アセチルノイラミン酸である。

ｅ）円二色性スペクトル 円二色性分散針による遠紫外部ＣＤスペクトルは波長２
０８ｎｍ及び２２２ｎｍにそれぞれ極少ピークがあり、
。α−ヘリックス構造を含んでいる。

ｆ）熱安定性 ６０±０．５℃で６０分間加熱しても生物活性は失わな
い。

ｇ）赤外線吸収 次の特徴的吸収値（ｃｍ−’）を有する。

３２５０、２９００．１６４０．１５２０．１４１０．
１１８０．１１２０．１０４０、 ｈ）生理活性 哺乳動物の単球−マクロファージ系細胞のコロニー形成
刺激作用を有する。

Ｃ３Ｆ（ｉｖ）の製法は具体的には、人尿をｐＨ８〜９
に調整し、不溶物を沈殿せしめ、その上澄を限外濾過膜
で脱塩し、少なくとも２００倍以上に濃縮した後、ｐＨ
を６．５〜７．５に調整し、６０℃で１０時間加熱処理
し、沈殿物を遠心除去後、陰イオン交換体に吸着させ、
０．２〜０．４Ｍ緩衝液で溶出させ、次いで１〜４Ｍ緩
衝液中でゲル濾過して分子量７０．０００ダルトン以上
の両分を回収し、該画分を疎水性親和体に吸着させ、０
．５〜ＩＭの緩衝液で溶出させ、該溶出物を高速液体ゲ
ル濾過にかけ、分子量７０．０００〜１５０．０００ダ
ルトンの両分を回収し、該両分をｐＨ１〜２に調整して
逆相高速液体クロマトグラフィーにかけ、有効成分を溶
出せしめることを特徴とする。こうして得られたＣ３Ｆ
は比活性１０万〜１０００万単位／　ｍｇ程度に精製さ
れている。

前記の製造法により製造されたＣ３Ｆは、バイアル増巾
で無菌的に凍結乾燥され、粉末状で密封される。凍結乾
燥に先だちＣ３Ｆの安定剤としての人血清アルブミン及
び溶解補助剤としてのアミノ酸又は糖類を含有する水溶
液を加え、無菌濾過し、のち無菌的に凍結乾燥してもよ
い。

なお、生物活性の測定は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおけるマ
ウス骨髄細胞のコロニー形成をパラメーターとして行な
った。すなわち直径３５止のプラスチック培養皿に２０
％牛脂児血清、１０％糖蛋白質になるよう調整したＱ、
１ｍｌの試料、０．３％寒天を含むＭｃＣｏｙ’　ｓ５
Ａ培地及び７．５　ＸＩＯ’個のマウス骨髄細胞を加え
、全量を１ｍｌに調整し、３７℃７日間５％ＣＯ□を含
む湿潤した空気中で培養した。培養後、倒立顕微鏡下で
検鏡し、５０個以上の細胞集塊をコロニーとして計測し
た。

形成されたコロニー１個を１単位とする。

又、本発明においてその有効成分として当該糖蛋白質の
顆粒球分化増殖促進活性を有するペプチド断片又は当該
断片の誘導体も利用できる。断片化法としては既知酵素
処理による脱糖化、分解断片化処理等を施してもよい。

あるいは遺伝子組換え技術によって作られる顆粒球分化
増殖促進活性ペプチド断片を利用してもよい。

（２）免疫賦活剤 本発明の免疫賦活剤は、単球、顆粒球、リンパ球を介し
てＴＮＦ活性を上昇させ、抗腫瘍効果を奏するものであ
れば特に限定されない。

具体的にはピシバニール（ＯＫ−４３２）　、クレスチ
ン（ＰＳＫ）、レンチナン、シゾフィラン（ＳＰＧ）な
どが例示される。

これらの免疫賦活剤は市販品として入手することができ
る。

（３）用法・用量 本発明のＣ３Ｆは、例えば、注射用生理食塩水、注射用
蒸留水等に１０３〜１０６単位／ｍ　ｌとなるように溶
解して静注、点滴、筋注、皮下性などで投与される。

投与量は、１回１０００〜１５万単位／　ｋｇ体重を使
用するが、症状によっては適宜増・減量が可能である。

ホ、効果 Ｃ３Ｆを併用することにより、免疫賦活剤を単独で使用
する場合に比べて、生体中のＴＮＦ活性の上昇が確認さ
れ、抗腫瘍効果の増強が期待できる。

従って、本発明は、癌免疫療法において極めて有用と考
える。

へ、実験例・実施例 本発明をより詳細に説明するために、実験例および実施
例を挙げるが、本発明はこれらにより何ら限定されるも
のではない。

実験例１　（毒性） 実施例１により調製された糖蛋白質を用いて急性毒性を
リチャードらの方法（ジャーナル・オン・ファルマコロ
ジーφアンド・エクスヘリメンタル・セラピュティクス
、９０巻、９９頁、１９４９年）によりＣ３ｔＢＬ系雄
性マウスで試験した。

その結果を第１表に示す。

第１表 実験例２ 単核球とピシバ＝−ル（ＯＫ−４３２）　、Ｃ３Ｆとの
混合培養によるＴＮＦ活性の誘導（ｌ〕ヘハリン加末梢
血ヨリフィコール−ハイバーク勾配遠心分離にて単核球
を分離し、１０％ヒトアルブミン加ＲＰＭＩを用いて単
核球浮遊液（３゜２５Ｘ１０６細胞数／１０ｍ１）を作
成した。

（２）単核球浮遊液に、ピシバニール０．０１ＫＥ／ｍ
ｌと各濃度のＣ３Ｆを同時に添加した。なふ、ｃｓＦは
実施例４で得た人尿由来Ｃ３Ｆを用いた。

（３）５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で７２時間培養した
。

（４）上清中のＴＮＦ活性を経時的に測定した。

ＴＮＦ活性はり、２．細胞に対する殺細胞能をクリスタ
ルバイオレットの吸光度を利用して測定した。

結果を第１表に示す。

第１表から、 ■　Ｃ３Ｆ自身はＴＮＦ活性を発現させない、■　ビシ
バニールとＣＳＦの併用により、ＴＮＦ活性は増強する
、 ■　両者の併用により、ＴＮＦ活性は長時間維持される
、 ことが判明した。

なお、Ｃ３Ｆは単核球の細胞数には影響を与えないこと
が確かめられている。

実施例１ 健康な人から集めた新鮮な尿４００１に１０％水酸化ナ
トリウムを加えてｐＨを８に調整し０℃に冷却しながら
１５．　ｏｏｏｒ、　ｐ、　ｍ、で連続遠心分離機で遠
心し不溶物を除去し、上清を得た。

次にこの上清を１０％塩酸でｐＨを７とし、シリカゲル
を充填したカラム（１０Ｘ８０ｃｍ）　１．；通液し、
シリカゲルに吸着された成分を５％アンモニア水４０１
でカラムから溶出した。

このようにして得られた溶出液を１規定の硫酸でｐＨを
７．５に調整しこれに粉末硫酸アンモニウムを加えて７
０％飽和となし、０℃で一夜放置し生成した沈殿を濾別
した。

この沈澱物を５％アンモニア水２１に溶解し、透析チュ
ーブ（ビスキング社製）に入れ、０．０５Ｍリン酸塩緩
衝液（ｐＨ６，５）に対して充分透析し、透析内液に該
緩衝液を加えて全量をＩＯＪに調整し、あらかじめ０．
０５Ｍ！Ｊン酸塩緩衝液（ｐＨ６，５）で平衡化させた
ＣＭセファデックスＣ−５０イオン交換カラム（４０Ｘ
　４０　ａｍ　）に通液し、夾雑物を該イオン交換樹脂
に吸着せしめ、通過液を得た。

この通過液ＩＮをダイアフローホローファイバー濃縮装
置（アミコン社製、Ｄｏ−３０型）で濃縮し、前記と同
様に濃縮液を０．１Ｍ）’Ｊスス−酸緩衝液（ｐＨ７，
０）に対し一晩５℃で透析し、この透析内液に該緩衝液
を加えて３１に調整した。

この溶液をあらかじめ該緩衝液で平衡、活性化したＤＥ
ＡＥセルロースカラム（４，ＯＸ４０ｃｍ）に通液し、
０．１Ｍ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）でカラムを
充分洗浄した後、０．３Ｍの食塩を含む０．１Ｍトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）で溶出を行なった。

そして頚粒球の分化増殖促進効果を有する分画を集め、
０．ＬＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）に対して透
析し、透析内液を得た。

この透析内液を再び該緩衝液で平衡、活性化させたＤＥ
ＡＥセル０−スカラム（４，ＯＸ　４０　ｃｍ）　に通
液し、０．１Ｍから０．３Ｍの食塩の直線濃度勾配溶出
法により溶出させ、頚粒球の分化増殖促進効果を有する
分画を集め、この分画に粉末硫酸アンモニウムを加えて
７０％飽和となし、沈澱物を集め、この沈澱を少量の０
．１Ｍ）！Ｊスス−酸緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解し、
該緩衝液に対して透析し、透析内液を得た。

次にこの透析内液２０ｍ１を、あらかじめ０．１Ｍトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化したセファデッ
クスＧ−１５０カラム（４，ＯＸ　６０　ｃｍ）で展開
させ、相対溶出液量１．１１−１．４５の分画を集め、
この分画を蒸留水に対して充分透析し、透析内液を凍結
乾燥し、約５００■の粉末を得た。

次に、上記粉末２００ｍｇを１．０Ｍ食塩を含む０．０
２Ｍ’Ｊン酸塩緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解し、あらか
じめ該緩衝液で平衡化したコンカナバリンＡ−セファロ
ース４Ｂ（ファインケミカル・ラボラトリ−社ｍ）　１
００　ｍｌを含むカラムに通液し、１．０Ｍ食塩を含む
０．０２ＭＩＪン酸塩緩衝液（ｐＨ７，０）でカラムを
充分洗浄し、のち５０ｍＭα−メチル−Ｄ−グルコシド
及び１，０Ｍ食塩を含む０．０２Ｍ！Ｊン酸塩緩衝液（
ｐｌ（７，０）で溶出させ、後述する方法で測定して頚
粒球の分化増殖効果を有する分画を集め、これを蒸留水
に対して透析し、透析内液を凍結乾燥した。

更に、ここに得られた凍結乾燥粉末的５０■を、１０％
グリセリンを含む０．１２５　Ｍ　トＩＪスー塩酸緩衝
液（ｐＨ６，８）、１ｍｌに溶解し、８％アクリルアミ
ドゲル（ｐＨ８，９，２５ｍｍＸ１００　ｍｍ）を用い
た調整用電気泳動装置（ＬＫＢ、ユニフォーク９００型
）により、冷却水通水下、１０ｍＡの電流を通電し、泳
動させ、相対移動度０．４６の分画を０．０２５Ｍ）リ
ス−グリシン緩衝液（ｐＨ８，３）で回収し、蒸留水に
対して透析し、透析内液を凍結乾燥し、本発明からなる
糖蛋白質的１０ｍｇを得た。

この方法を反復して実施し、約１ｇの糖蛋白質を得た。

このようにして得た精製糖蛋白質１ｇに水ＩＱｍｌを加
え、糖蛋白質を完全に溶解し、１０％水酸化ナトリウム
水溶液を加え、ｐＨを６．８に調整した。

次いでこの溶液を６０℃で１０時間加熱し、のち氷水で
急冷し、滅菌水を加えて１０倍に希釈し、孔径０．４５
μのメンブランフィルタ−を装着した濾過除菌装置（ミ
リポア社製）を用いて濾過して除菌し、あらかじめ１８
０℃で２時間乾熱滅菌したガラス製バイアル壜へ１ｍｌ
ずつ無菌的に分注し、無菌的に凍結乾燥し、バイアル壜
を密封し、１　ｍｇの加熱処理された糖蛋白質を含有す
る製剤約９７本を得た。

実施例２ 健康な人から集めた新鮮な尿１０００１から実施例１と
同様の方法で糖蛋白質粗製物を含有する水溶液２．５１
を得た。この水溶液２５βの０．ＩＭ）！Ｊスス−酸緩
衝液（ｐＨ７，０）を加え、充分撹拌し、再びダイアフ
ローホローファイバー高速濃縮装置で約ｌ／２５に濃縮
した。次いでこの濃縮液に０．１ＭＭＪスー塩酸緩衝液
（ｐＨ７，０）　５１及びあらかじめ０．１Ｍ）　ＩＪ
スス−酸緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化したＤＥＡＥセ
ルロース液（乾燥重量としてＤＥＡＥを２００ｇ＞！ｌ
を加え、３０分間撹拌し、静置した後、吸引濾過して該
セルロースを濾別した。濾別した該セルロースに１０ｆ
の０．１Ｍ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）を加えて
洗浄し、再度吸引濾過して該セルロースを濾別し、０．
０５Ｍ食塩を含む０．　ＩＭ　）　！Ｊス塩酸緩衝液（
ｐＨ７，０）　１０４２で洗浄し、吸引濾過して該セル
ロースを濾別した。濾別した該セルロースに０．３Ｍ食
塩を含む０．１Ｍ）ＩＪスス−酸緩衝液（ｐＨ７，０）
　１０　Ａを加え、撹拌して糖蛋白質を含有する分画を
該ＤＥＡＥセルロースより溶出させ、得られた溶出液を
、ダイアフローホローファイバー高速濃縮装置（ＤＣ−
３０型）を用いて蒸留水による希釈、濃縮を繰り返し、
脱塩し、のち凍結乾燥し、粉末約１５ｇを得た。得られ
た凍結乾燥粉末を１５０　ｍｌの蒸留水に溶解し、あら
かじめ０．１Ｍ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）で平
衡化したセファデックスＧ−１５０カラム（６，ＯＸ　
８０　ｃｍ）　に通液してゲル濾過し相対溶出液量１．
１１−１．６０の糖蛋白質を含有する分画を集めた。次
いで該分画を蒸留水に対して充分透析し、透析内液をダ
イアフローホローファイバー濃縮装置（ＤＣ２型）で濃
縮し、糖蛋白質粗製物的９ｇを含む濃縮液１００　ｍｌ
を得た。この濃縮液に０．１Ｍクエン酸−リン酸ナトリ
ウム緩衝液を加え、ｐＨを６．１に調整し、実施例１と
同様の方法で加熱処理し、濾過除菌して無菌的にバイア
ル壜に２．５ｍｌずつ分注し、無菌的に凍結乾燥し、バ
イアル壜を密封し、約３．８ｍｇの加熱処理された糖蛋
白質を含有する製剤４０本を得た。

実施例３ （１〕　　精製バルクの調製 健康人の新鮮床１７００１をｐＨ６、５以下に調整後に
濾過した。限外濾過膜（分子量２万以下カツト）で濃縮
後、０．０７Ｍリン酸緩衝液（以下ＰＢ）　　（ｐＨ６
，５）で押出した。

ＰＨ６，５に調整後、ＱＡＥ−カートリッジに接触、吸
着させた。０．０４Ｍ　Ｐ　Ｂ　（ｐＨ６，５）で洗浄
後、１ＭＮａＣ１含有０．０４Ｍ　Ｐ　Ｂ　（ｐＨ６，
５）で溶出した。

ｐＨ７，’０に調整後、Ａｍ５Ｏ，を５３２　ｇ／βと
なるように添加し、塩析を行い、沈澱を回収した。

沈澱を０．０５ＭＰＢ　（ｐＨ７，０）で抽出した。

限外濾過膜（分子量１万以下カツト）で濃縮し、０．１
　ＭＰＢ　（ｐＨ７，０＞で透析後、０．１　ＭＰＢ　
（ｐＨ７，０）で押出した（総容量４０１）。

（２）精製バルクの調製 粗製バルク４０１をｐＨ７に調整後、ＤＥＡＥ−セルロ
ースに接触・吸着させる。０．０２ＭＰＢ　（ｐ）１７
．０）で洗浄後、０．３ＭＮａＣ：ｌ含有０．０２ＭＦ
Ｂ　（ｐＨ７，０）で溶出した。

６０℃で１０時間加熱処理した後、Ｔ　Ｓ　Ｋ　　Ｇ３
０００ＳＷ（東洋曹達社）を用いてゲル濾過による高速
液体クロマ）　（ＨＰＬＣ）で精製し、限外濾過膜（分
子量１万以下カツト）で濃縮・透析した。

（３）製剤化 精製バルク（溶液）にリン酸塩、マンニトールを添加後
、ｐＨを７．５に調整して除菌濾過した。分注後、凍結
乾燥および窒素置換を行い施栓した。

実施例４ 精製バルクの調製を以下のように行う以外は全て実施例
３゛に準じて行った。

粗製バルク４０１をｐＨ７，０に調製後、ＤＥＡＥ−セ
ルロファインに接触り１５℃、３０分間）・吸着させた
。０．０５ＭＮ　ａ　Ｃ１含有０．０２ＭＰＢ　（ｐＨ
７，０）で洗浄後、０．３ＭＮａＣ１含有０．０２ＭＰ
Ｂ　（ｐＨ７，０）で溶出した。

限外濾過膜（分子量３万以下カツト）で濃縮後、精製水
で透析し、回収する。

ｐＨ７，０に調整後、除菌濾過し、６０℃で１０時間加
熱処理を行う。

ｐＨ４，５に調整後、Ｑ−セファロースに接触・吸着さ
せる。０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐ）１４．５）で洗浄後
、０．２ＭＮａＣ１含有０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４
，５）で溶出した。

ｐＨ７，０に調整後、限外濾過膜（分子量１万以下カツ
ト）で濃縮した。

ＴＳＫ　　Ｇ３０００ＳＷ　（前述）を用いてゲル濾過
によるＨＰＬＣを行い、溶出係数（Ｖｅ／Ｖｏ）１．２
６〜１．６０の溶出画分を回収した。

限外濾過膜（分子量１万以下カツト）で濃縮後、精製水
で透析した。ｌ　Ｑ　ｍｇ　７ｍ　ｌアルブミン溶液で
回収した後、除菌濾過した（総容量１０１）。

実施例５ 精製バルクの調製を以下のように行う以外は全て実施例
３に準じて行った。

実施例４の限外濾過膜による濃縮液に硫安を１Ｍとなる
ように添加した後、フェニル−セファロースに接触・吸
着させる。０．８Ｍ硫安で洗浄後、０．５Ｍ硫安で溶出
した。限外濾過膜（分子量１万以下カツト）で濃縮後、
精製水で透析した。

逆相ＨＰＬＣ用０４カラムにアプライし、０．１％酢酸
含有アセトニトリル（０から７０％までの直線勾配、ｐ
Ｈ２，０）で溶出を行い、アセトニ）　ＩＪル濃度４０
〜４５％の溶出画分を回収する。

ＮａＣ１を０．２Ｍとなるように添加後、限外濾過膜（
分子量１万以下カツト）で濃縮した。さらに０．２ＭＮ
ａＣ１含有０．０２ＭＰＢ　（ｐ）１７．０）で透析後
、１０ｍｇ／ｍｌアルブミン溶液で押出した。

（ほか３名）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）コロニー形成刺激因子を有効成分とする免疫賦活
   剤の癌免疫療法補助剤。
2. （２）免疫賦活剤がピシバニール、クレスチン、レンチ
   ナンおよびシゾフィランから選ばれる一種である特許請
   求の範囲第（１）項記載の癌免疫療法補助剤。