JPS6289621A - グラニユロサイト−マクロフア−ジ コロニ−刺激 因子によるマクロフア−ジ殺腫瘍作用の活性化 - Google Patents
グラニユロサイト−マクロフア−ジ コロニ−刺激 因子によるマクロフア−ジ殺腫瘍作用の活性化Info
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- JPS6289621A JPS6289621A JP61191561A JP19156186A JPS6289621A JP S6289621 A JPS6289621 A JP S6289621A JP 61191561 A JP61191561 A JP 61191561A JP 19156186 A JP19156186 A JP 19156186A JP S6289621 A JPS6289621 A JP S6289621A
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明はマクロファージの活性１ヒに関し、より詳細に
は、マクロファージおよび前駆体モノサイトを単にグラ
ニュロサイトーマクロファージ コロニー刺激因子（以
下、ＧＭ−Ｃ３Ｆと呼ぶ）で刺激することにより、殺腫
瘍活性Ｚあたえることに関する。
は、マクロファージおよび前駆体モノサイトを単にグラ
ニュロサイトーマクロファージ コロニー刺激因子（以
下、ＧＭ−Ｃ３Ｆと呼ぶ）で刺激することにより、殺腫
瘍活性Ｚあたえることに関する。
（従来技術）
マクロファージは骨髄に由来する血液中のモノサイトか
ら発達する、活発に動く、比較的大きい（１０〜２０μ
ｍ）食細胞である。マクロファージは、活性比により、
膜のしわ発生、過酸化物の同化、Ｉａ抗原の発現増大お
よびプラスミノーゲンの分泌増大などをふくむ数種の懺
能的、生比学的および形態豹変１ヒ’に５けることが観
原すれている。ま１こマクロファージは免疫系の重要要
素と考えられている。活性比されるとマクロファージは
外来の粒子や老化細胞の破壊に関連すると考えられてお
り、最近では新生物による病気に耐性ｔあγこえ、およ
び／または除去することがつきとめられている。これら
の活性を発揮する活性比マクロファージおよび前駆体モ
ノサイトの発生には、有効な活性比信号および受容単核
食細胞の共存が必要である。
ら発達する、活発に動く、比較的大きい（１０〜２０μ
ｍ）食細胞である。マクロファージは、活性比により、
膜のしわ発生、過酸化物の同化、Ｉａ抗原の発現増大お
よびプラスミノーゲンの分泌増大などをふくむ数種の懺
能的、生比学的および形態豹変１ヒ’に５けることが観
原すれている。ま１こマクロファージは免疫系の重要要
素と考えられている。活性比されるとマクロファージは
外来の粒子や老化細胞の破壊に関連すると考えられてお
り、最近では新生物による病気に耐性ｔあγこえ、およ
び／または除去することがつきとめられている。これら
の活性を発揮する活性比マクロファージおよび前駆体モ
ノサイトの発生には、有効な活性比信号および受容単核
食細胞の共存が必要である。
マクロファージの活性比はマクロファージ活性比因子ま
たはＭＡＦと呼ばれるある種のリンフ才力インにより誘
発されることは一般に認められている。カメｏ ｙ （
Ｃａｍｅｒｏｎ）等、Ｊ、ＣＩ ｉｎ。
たはＭＡＦと呼ばれるある種のリンフ才力インにより誘
発されることは一般に認められている。カメｏ ｙ （
Ｃａｍｅｒｏｎ）等、Ｊ、ＣＩ ｉｎ。
Ｉｎｖｅｓｔ、、 ６３：９７７（１９７９Ｌ マン
タバニ（Ｍａｎｔａｖａｎｉ）等、Ｉｎｔ、Ｓ、Ｃａｎ
ｃｅｒ、 ２５：６９１（１９８０）； およびフラ
イネルマン（Ｋｌｅｉｎｅｒｍａｎ）等、Ｊ、Ｃｌ１ｎ
、Ｉｎｖｅｓｔ、、 ７２：３０４（１９８３） ”；
ｌ参照。
タバニ（Ｍａｎｔａｖａｎｉ）等、Ｉｎｔ、Ｓ、Ｃａｎ
ｃｅｒ、 ２５：６９１（１９８０）； およびフラ
イネルマン（Ｋｌｅｉｎｅｒｍａｎ）等、Ｊ、Ｃｌ１ｎ
、Ｉｎｖｅｓｔ、、 ７２：３０４（１９８３） ”；
ｌ参照。
ＭＡＦが他のものとは別のリンフ才力インであるか又は
全体的にもしくは部分的に他のリンフ才力インでできて
いるかは解明されていない。成る研究者はネズミの系で
はＭＡＦがガンマ−インターフェロン（ＩＦＮ−γ）か
ら構成されていると示唆している。ロハートおよびバシ
ル（Ｒｏｂｅｒｔｓ ａｎｄＶａｓｉｌ）、Ｊ、Ｉｎｔ
ｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ、、 ２：５１９（１９８２）
およびスベデルスキー（Ｓｖｅｄｅｒｓｋｙ）等、Ｊ、
Ｅｘｐ。
全体的にもしくは部分的に他のリンフ才力インでできて
いるかは解明されていない。成る研究者はネズミの系で
はＭＡＦがガンマ−インターフェロン（ＩＦＮ−γ）か
ら構成されていると示唆している。ロハートおよびバシ
ル（Ｒｏｂｅｒｔｓ ａｎｄＶａｓｉｌ）、Ｊ、Ｉｎｔ
ｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ、、 ２：５１９（１９８２）
およびスベデルスキー（Ｓｖｅｄｅｒｓｋｙ）等、Ｊ、
Ｅｘｐ。
Ｍｅｄ、、１５９：８１’２（１９８４）Ｙ参照。
然しなからＩＦＮ−γ以外のリンフ才力インもマクロフ
ァージを庸瘍細胞を殺し５る程度まで活性比する可能性
があると考えられている。マクロファージは表皮細胞乞
刺激し、傷の治癒ヲ助け、炎症や発熱の原因となること
が知られているリンフ才力イン−インターロイキン１（
ＩＬ−１）ｗ生産する。オノザキ（Ｏｎｏｚａｋ ｉ
）等、Ｊ、Ｉｒｒｗｎｕｎｏｌ、。
ァージを庸瘍細胞を殺し５る程度まで活性比する可能性
があると考えられている。マクロファージは表皮細胞乞
刺激し、傷の治癒ヲ助け、炎症や発熱の原因となること
が知られているリンフ才力イン−インターロイキン１（
ＩＬ−１）ｗ生産する。オノザキ（Ｏｎｏｚａｋ ｉ
）等、Ｊ、Ｉｒｒｗｎｕｎｏｌ、。
１３５：３１４（１９８５）は、最近ＩＬ−１も新鮮な
モノサイトの殺朦瘍細胞活性を増大させることｔ示唆し
ている。
モノサイトの殺朦瘍細胞活性を増大させることｔ示唆し
ている。
マクロファージおよび前駆体モノサイトもま１こ種々の
物質での処理により活性比されて殺Ｊ事瘍細胞作用を示
しうると報告されている。例えばバクテリア産物リポポ
リサッカライド（ＬＰＳ）（シーｙ （Ｓｏｎｅ）等、
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、、 ４２：２２２７（１９８
２）上ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）のようなペプチド
グリカン〔ナガオ（Ｎａｇａｏ） 等、 Ｉｎｆｅｃ
、Ｉｒｒｍｕｎ、。
物質での処理により活性比されて殺Ｊ事瘍細胞作用を示
しうると報告されている。例えばバクテリア産物リポポ
リサッカライド（ＬＰＳ）（シーｙ （Ｓｏｎｅ）等、
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、、 ４２：２２２７（１９８
２）上ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）のようなペプチド
グリカン〔ナガオ（Ｎａｇａｏ） 等、 Ｉｎｆｅｃ
、Ｉｒｒｍｕｎ、。
２４：３０４（１９７９）、クライナー（Ｋｌｅｉｎｅ
ｒ）等。
ｒ）等。
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、、 ４３：２０１０（１９８３
）） 。
）） 。
他のマクロファージ活性比物質には、腫瘍プロモーター
・フォルボール・ミリステート・アセテ−１−（ＰＭＡ
）、 ピック（Ｐｉｃｋ）等、 Ａｎｎ、Ｎ、Ｙ。
・フォルボール・ミリステート・アセテ−１−（ＰＭＡ
）、 ピック（Ｐｉｃｋ）等、 Ａｎｎ、Ｎ、Ｙ。
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、３３２：３７８（１９７９）およ
びイオノフオア類、ピック等（同上）およびフンド（Ｈ
ｕｎｄ）等、 Ｎａｔｕｒｅ （ｏｙドｙ）、２６５：
５４３（１９７９）がある。
びイオノフオア類、ピック等（同上）およびフンド（Ｈ
ｕｎｄ）等、 Ｎａｔｕｒｅ （ｏｙドｙ）、２６５：
５４３（１９７９）がある。
最近の報告によれば、マクロファージが非特異的殺腫瘍
活性を発揮する−めの効果的活性比は率−の信号の結果
ではな（、一連の反応が必要であることか示唆され１こ
。メルツアー（Ｍｅｌｔｚｅｒ）は「リンフ才力イン」
、ピックおよびランデイー（Ｐｉｃｋ ａｎｄ Ｌａｎ
ｄｙ）編、アカデミツク プレス。
活性を発揮する−めの効果的活性比は率−の信号の結果
ではな（、一連の反応が必要であることか示唆され１こ
。メルツアー（Ｍｅｌｔｚｅｒ）は「リンフ才力イン」
、ピックおよびランデイー（Ｐｉｃｋ ａｎｄ Ｌａｎ
ｄｙ）編、アカデミツク プレス。
ニューヨーク、第６１９〜６４６頁のなかで、マクロフ
ァージが活性比されて殺腫瘍活性を示すには、反応場所
、例えば感染部位に血液のモノサイトが補給または集積
され、モノサイトがその場所で能力ある単核食細胞に分
化すると仮定している。この最初のモノサイトの分化段
階の後、モノサイトはリンフ才力インからの最初の信号
によって受容状態にとプライミングされる。このプライ
ムされたマクロファージが最終的に成熟して細胞毒性を
有するには、例えばＬＰＳから由来する第二の信号２通
した引金が必要である。一定レベルのマクロファージ活
性比に必要なプライミング信号（リンフ才力イン）と引
金信号の濃度は、これらヲ直列に使用すると、これらの
信号を単独で使用した場合に比べて遥かに低く、これら
の信号の間には相乗作用的協力が存在することが示唆さ
れる。
ァージが活性比されて殺腫瘍活性を示すには、反応場所
、例えば感染部位に血液のモノサイトが補給または集積
され、モノサイトがその場所で能力ある単核食細胞に分
化すると仮定している。この最初のモノサイトの分化段
階の後、モノサイトはリンフ才力インからの最初の信号
によって受容状態にとプライミングされる。このプライ
ムされたマクロファージが最終的に成熟して細胞毒性を
有するには、例えばＬＰＳから由来する第二の信号２通
した引金が必要である。一定レベルのマクロファージ活
性比に必要なプライミング信号（リンフ才力イン）と引
金信号の濃度は、これらヲ直列に使用すると、これらの
信号を単独で使用した場合に比べて遥かに低く、これら
の信号の間には相乗作用的協力が存在することが示唆さ
れる。
ＬＰＳとＪＦＮ−γについてもリンフ才力イン−ＬＰＳ
と似た関係が報告されている。シュルツ（Ｓｃｈｕｌｔ
ｚ）、 Ｊ、Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ、、 ２：
４５９（１９８２）。 組み換えＤＮＡ技術は、インビ
トロ細胞バイオアッセイの発達とともに、ＩＦＮ−γ。
と似た関係が報告されている。シュルツ（Ｓｃｈｕｌｔ
ｚ）、 Ｊ、Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ、、 ２：
４５９（１９８２）。 組み換えＤＮＡ技術は、インビ
トロ細胞バイオアッセイの発達とともに、ＩＦＮ−γ。
ＩＬ−１および他のリンフ才力インのｃＤＮＡのクロー
ニング？もたらした。高度に純粋な組み換え由来のＩＦ
Ｎ−γはそのＭＡＦ活性に関する従来の報告を確証し、
さらに非特異的殺腫瘍活性を発揮するために効果的にＩ
Ｆ’Ｎ−γ乞誘発するためにはＬＰＳのような第二の引
金信号が必要であるという報告も確証された。
ニング？もたらした。高度に純粋な組み換え由来のＩＦ
Ｎ−γはそのＭＡＦ活性に関する従来の報告を確証し、
さらに非特異的殺腫瘍活性を発揮するために効果的にＩ
Ｆ’Ｎ−γ乞誘発するためにはＬＰＳのような第二の引
金信号が必要であるという報告も確証された。
本発明は、ＧＭ−Ｃ８Ｆ ’Ｙ使用してマクロファージ
および前駆体モノサイ）Ｙ刺激し、非特異的殺腫瘍活性
を仲介させることに関し、この活性比は共同刺激因子、
例えばＬＰＳまたはＩＦＮ−γの存在には依存しない。
および前駆体モノサイ）Ｙ刺激し、非特異的殺腫瘍活性
を仲介させることに関し、この活性比は共同刺激因子、
例えばＬＰＳまたはＩＦＮ−γの存在には依存しない。
ＧＭ−Ｃ３Ｆは特定の種類のコロニー刺激因子（Ｃ８Ｆ
）である。Ｃ８Ｆはリンフ才力インの仲間であり骨髄中
に見出される親細胞を特定の種類の成熟血液細胞への分
化を誘発する。
）である。Ｃ８Ｆはリンフ才力インの仲間であり骨髄中
に見出される親細胞を特定の種類の成熟血液細胞への分
化を誘発する。
この親細胞から生じる成熟血液細胞の特定種類は、存在
するＣ３Ｆの種類に依存する。例えば、エリスロポエチ
ンは親細胞を赤皿球に成熟させ、一方トロンボポエチン
は親細胞を血小板への過程へ誘導すると信じられている
。同様にグラニュロサイト−マクロファージコロニーの
形成は、 ＧＭ−Ｃ８Ｆの存在に依存する。ＧＭ−Ｃ３
Ｆ も含めｙ＝ｃｓｒが骨髄親細胞から白血球への成熟
および増殖へと誘発する能力は充分知られているが、Ｇ
Ｍ−Ｃ８Ｆが単独でマクロファージまたは前駆体上ノサ
イｌ’活性比して、非特異的殺腫瘍活性に介在すること
は従来知られていない。
するＣ３Ｆの種類に依存する。例えば、エリスロポエチ
ンは親細胞を赤皿球に成熟させ、一方トロンボポエチン
は親細胞を血小板への過程へ誘導すると信じられている
。同様にグラニュロサイト−マクロファージコロニーの
形成は、 ＧＭ−Ｃ８Ｆの存在に依存する。ＧＭ−Ｃ３
Ｆ も含めｙ＝ｃｓｒが骨髄親細胞から白血球への成熟
および増殖へと誘発する能力は充分知られているが、Ｇ
Ｍ−Ｃ８Ｆが単独でマクロファージまたは前駆体上ノサ
イｌ’活性比して、非特異的殺腫瘍活性に介在すること
は従来知られていない。
（発明の目的）
本発明によれば、マクロファージまたはモノサイト前駆
体がＧＭ −ＣＳ Ｆ信号のみにより、活性比され非特
異的殺腫瘍活性を介在する。活性比マクロファージまた
はモノサイト前駆体は、インビボまたはインビトロで腫
瘍細胞を不活性化するために使用出来る。＋＝ｍで苦し
んでいる患者の体内からマクロファージ、モノサイトま
たはその前駆体を取り出し、該細胞を治療有効量のＧＭ
−Ｃ８Ｆ とともに培養することにより、刺激して殺腫
瘍活性比を発現させることにより、該患者暑治療するこ
とができる。その後刺激された細胞をその患者に投与し
、活性比細胞により該患者を苦しめている腫瘍細胞を探
しだして破壊することができる。別の方法として、ＧＭ
−Ｃ８Ｆ ｙａｌ−直接静注、皮下注射。
体がＧＭ −ＣＳ Ｆ信号のみにより、活性比され非特
異的殺腫瘍活性を介在する。活性比マクロファージまた
はモノサイト前駆体は、インビボまたはインビトロで腫
瘍細胞を不活性化するために使用出来る。＋＝ｍで苦し
んでいる患者の体内からマクロファージ、モノサイトま
たはその前駆体を取り出し、該細胞を治療有効量のＧＭ
−Ｃ８Ｆ とともに培養することにより、刺激して殺腫
瘍活性比を発現させることにより、該患者暑治療するこ
とができる。その後刺激された細胞をその患者に投与し
、活性比細胞により該患者を苦しめている腫瘍細胞を探
しだして破壊することができる。別の方法として、ＧＭ
−Ｃ８Ｆ ｙａｌ−直接静注、皮下注射。
腹腔内注射または筋肉内注射によりまたは鼻腔からの吸
入により患者に投与してもよい。本発明によれば活性比
マクロファージを使用し℃、癌患者はエンドトキシン、
放射活性物質または他の有害な物質に接することなく治
療できることが重要である。
入により患者に投与してもよい。本発明によれば活性比
マクロファージを使用し℃、癌患者はエンドトキシン、
放射活性物質または他の有害な物質に接することなく治
療できることが重要である。
本発明に使用する充分な量の均一なＧＭ−Ｃ３Ｆは組換
えＤＮＡ技術により製造できる。ＧＭ −Ｃ８Ｆｔコー
ドする遺伝子を単離し、組み換え蛋白質を高いレベルで
発現できる系で使用するために遺伝子工学的に処理する
。発現宿主から回収したＧＭ−Ｃ８Ｆ”ｋ逆相高性能液
体クロマトグラフィーで均質に精製する〇 活性（ＩＺされたマクロファージまたは前駆体モノサイ
トが特定の腫瘍を破壊する効果を証明する方法は、マク
ロファージまたはモノサイト前駆体を種々の濃度のＧＭ
−Ｃ８Ｆ とともに培養する工程をふくむ。適当な培養
期間の後、ＧＭ−Ｃ８Ｆ ｗ除き、次に標的腫瘍細胞を
放射活性で標識してから、前記活性比マクロファージエ
フェクター（攻撃）細胞を作用させる。さらに培養した
のち、破壊された標的細胞音域り除き、残存する標的細
胞を溶解して、活性比マクロファージへの暴露に対して
生き残った細胞の数を定量的指標として計数した。
えＤＮＡ技術により製造できる。ＧＭ −Ｃ８Ｆｔコー
ドする遺伝子を単離し、組み換え蛋白質を高いレベルで
発現できる系で使用するために遺伝子工学的に処理する
。発現宿主から回収したＧＭ−Ｃ８Ｆ”ｋ逆相高性能液
体クロマトグラフィーで均質に精製する〇 活性（ＩＺされたマクロファージまたは前駆体モノサイ
トが特定の腫瘍を破壊する効果を証明する方法は、マク
ロファージまたはモノサイト前駆体を種々の濃度のＧＭ
−Ｃ８Ｆ とともに培養する工程をふくむ。適当な培養
期間の後、ＧＭ−Ｃ８Ｆ ｗ除き、次に標的腫瘍細胞を
放射活性で標識してから、前記活性比マクロファージエ
フェクター（攻撃）細胞を作用させる。さらに培養した
のち、破壊された標的細胞音域り除き、残存する標的細
胞を溶解して、活性比マクロファージへの暴露に対して
生き残った細胞の数を定量的指標として計数した。
前駆体モノサイトの調製
末梢血液モノサイトの形のマクロファージをフィコール
およびパーコール分離を含む標準的技術で精製し、引き
続＜ＧＭ−Ｃ３Ｆ での活性比に使用した。この操作に
おける最上のモノサイト層を培地にブレーティングし、
次いで非付着性細胞を除去し、のこりのモルレヤー細胞
ｖＧＭ−Ｃ８Ｆおよび他のＬＰＳやＩＦＮ−γをふ（む
活性比剤の添加によって活性比できるようにした。エン
ドトキシンなどの混在乞防止するＬめ、細胞分離工程に
使用した各試薬はリムラス・アメボサイト・リゼート（
Ｌｉｍｕｌｕｓ Ａｍｅｏｂｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ
）で試験シタ。
およびパーコール分離を含む標準的技術で精製し、引き
続＜ＧＭ−Ｃ３Ｆ での活性比に使用した。この操作に
おける最上のモノサイト層を培地にブレーティングし、
次いで非付着性細胞を除去し、のこりのモルレヤー細胞
ｖＧＭ−Ｃ８Ｆおよび他のＬＰＳやＩＦＮ−γをふ（む
活性比剤の添加によって活性比できるようにした。エン
ドトキシンなどの混在乞防止するＬめ、細胞分離工程に
使用した各試薬はリムラス・アメボサイト・リゼート（
Ｌｉｍｕｌｕｓ Ａｍｅｏｂｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ
）で試験シタ。
更に、細胞集団はエンドトキシンを含まない緩衝液およ
び培地で調製した。
び培地で調製した。
末梢血液から単離するかわりに、モノサイトまたは成熟
マクロファージは他の供給源、例えば肺臓細胞、リンパ
節細胞ま１こは肺洗浄物・て由来しても良い。
マクロファージは他の供給源、例えば肺臓細胞、リンパ
節細胞ま１こは肺洗浄物・て由来しても良い。
ＧＭ−Ｃ３Ｆは生体内では非常に少量しか生産されない
。本発明によれば、組換え技術により、モノサイトおよ
びマクロファージの活性比に使用するための比較的多量
の高度綿ＩＦＳＧＭ−Ｃ３Ｆが生産できる。そのような
蛋白質生産のための組換えＤＮＡ技術に関する議論は、
５ｃｉｅｎｃｅ、 １９６＋（１９７７年４月）の論説
および追加論文に記載されている。この参考文献で論じ
られている組換えＤＮＡ技術技術用利用ためＧＭ−Ｃ３
Ｆ Ｙコードする遺伝子ＹｃＤＮＡライブラリーから、
例えばニックトランスレーションされたｃＤＮＡプロー
フヲ使ってまず単離する必要がある。そのような標識グ
ローブは、ネズミＧＭ−Ｃ８Ｆのヌクレオチド配列部分
に相当する合成オリゴヌクレオチドプローブを使用し、
ネズミＧＭ−Ｃ８ＦのｃＤＮＡライブラリーから誘導さ
れた。
。本発明によれば、組換え技術により、モノサイトおよ
びマクロファージの活性比に使用するための比較的多量
の高度綿ＩＦＳＧＭ−Ｃ３Ｆが生産できる。そのような
蛋白質生産のための組換えＤＮＡ技術に関する議論は、
５ｃｉｅｎｃｅ、 １９６＋（１９７７年４月）の論説
および追加論文に記載されている。この参考文献で論じ
られている組換えＤＮＡ技術技術用利用ためＧＭ−Ｃ３
Ｆ Ｙコードする遺伝子ＹｃＤＮＡライブラリーから、
例えばニックトランスレーションされたｃＤＮＡプロー
フヲ使ってまず単離する必要がある。そのような標識グ
ローブは、ネズミＧＭ−Ｃ８Ｆのヌクレオチド配列部分
に相当する合成オリゴヌクレオチドプローブを使用し、
ネズミＧＭ−Ｃ８ＦのｃＤＮＡライブラリーから誘導さ
れた。
ヒトＧＭ−Ｃ３Ｆ遺伝子の分子クローンを単離するため
に、リンフオーマ細胞、例えばＨＵＴ−１０２゜Ｊｕｒ
ｋａｌまたはＨＬ６０または他の種類の供給源例えばヒ
ト末梢血液単核球細胞から全ＲＮＡ’に抽出した。鳥の
ミニロブラスト−シスウィルス（ＡＭＶ）の逆転写酵素
ヶ使用してポリアデニル比ｍ ＲＮＡの逆転写によりｃ
ＤＮＡライブラリーを作成した。このＤＮＡｖＤＮＡポ
リメラーゼＩ’Ｙ用いて二重鎖にし、適当なりローニッ
クベクター、例えばプラスミド、バクテリオファージま
たはゴスミツド中に挿入した。次いで得られた組換えク
ローニングベクター乞適当な宿主、例えば大腸菌 （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ、ｃｏｌｉ）
）、イーストまたは他の単細胞生物の形質転換に使用し
た。
に、リンフオーマ細胞、例えばＨＵＴ−１０２゜Ｊｕｒ
ｋａｌまたはＨＬ６０または他の種類の供給源例えばヒ
ト末梢血液単核球細胞から全ＲＮＡ’に抽出した。鳥の
ミニロブラスト−シスウィルス（ＡＭＶ）の逆転写酵素
ヶ使用してポリアデニル比ｍ ＲＮＡの逆転写によりｃ
ＤＮＡライブラリーを作成した。このＤＮＡｖＤＮＡポ
リメラーゼＩ’Ｙ用いて二重鎖にし、適当なりローニッ
クベクター、例えばプラスミド、バクテリオファージま
たはゴスミツド中に挿入した。次いで得られた組換えク
ローニングベクター乞適当な宿主、例えば大腸菌 （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ、ｃｏｌｉ）
）、イーストまたは他の単細胞生物の形質転換に使用し
た。
形質転換宿主を同定し、グループに分けてプールした。
これらのプールから調製し１こプラスミドＤＮＡを３２
Ｐ で放射標識したニックトランスレート比ｃＤＮＡネ
ズミＧＭ −ＣＳ Ｆ グローブとハイブリッド形成
させた。プローブに陽性の信号を与えたクローンのプー
ルを同定し、次いで候補のプールをさらに分割し、ハイ
ブリッド形成スクリーニングを繰り返した。最後にヒト
ＧＭ−Ｃ３Ｆ遺伝子に相当する単一の形質転換体が同定
された。この形質転換体からプラスミドＤＮＡ乞調製し
、例えばサンガー等、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。Ａｃａｄ
、 Ｓｃｉ。
Ｐ で放射標識したニックトランスレート比ｃＤＮＡネ
ズミＧＭ −ＣＳ Ｆ グローブとハイブリッド形成
させた。プローブに陽性の信号を与えたクローンのプー
ルを同定し、次いで候補のプールをさらに分割し、ハイ
ブリッド形成スクリーニングを繰り返した。最後にヒト
ＧＭ−Ｃ３Ｆ遺伝子に相当する単一の形質転換体が同定
された。この形質転換体からプラスミドＤＮＡ乞調製し
、例えばサンガー等、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。Ａｃａｄ
、 Ｓｃｉ。
（Ｕ、Ｓ、Ａ、）、７０：５４６３により、提唱された
標準的チェインターミネーション法を用いるＤＮＡ配列
決定により同定した。
標準的チェインターミネーション法を用いるＤＮＡ配列
決定により同定した。
第１図はヒトＧＭ−Ｃ３Ｆ遺伝子のヌクレオチド配列ン
示す。ヒトＧＭ−Ｃ８Ｆ遺伝子のコード領域はヌクレオ
チド腐１４からヌクレオチドΔ６６９４におよぶ。ヌク
レオチド配列から決定した相当するアミノ酸配列は、関
連コドンの下に示す。同定された陽性コロニーから調製
されＥ、ｃｏｌｉ中に形質転換され、ｐＨ０２３と命名
されγこプラスミドＤＮＡはアメリカン・タイプ力ルチ
ュア・コレクション（ＡＴＣＣ）、（１２３０１パーク
ローンドライブ、ロックビル、メリーランド２０８５２
米国〕に受託番号１ｖｘ３ｑ９０ｃＪとして寄託さ
れている。
示す。ヒトＧＭ−Ｃ８Ｆ遺伝子のコード領域はヌクレオ
チド腐１４からヌクレオチドΔ６６９４におよぶ。ヌク
レオチド配列から決定した相当するアミノ酸配列は、関
連コドンの下に示す。同定された陽性コロニーから調製
されＥ、ｃｏｌｉ中に形質転換され、ｐＨ０２３と命名
されγこプラスミドＤＮＡはアメリカン・タイプ力ルチ
ュア・コレクション（ＡＴＣＣ）、（１２３０１パーク
ローンドライブ、ロックビル、メリーランド２０８５２
米国〕に受託番号１ｖｘ３ｑ９０ｃＪとして寄託さ
れている。
機能性ＧＭ −ＣＳ Ｆの発現
宿主中のｐＨＧ２３中に含まれるＧＭ−Ｃ３Ｆ遺伝子の
発現により、機能性ＧＭ−Ｃ８Ｆを製造し、発現生産物
が寒天中で骨髄細胞コロニーの増殖を刺激する能力を試
験した。第１図に示すＧＭ−Ｃ８Ｆ遺伝子の実質的に完
全コード領域であるｃＤＮＡフラグメント（Ｓｆａ Ｎ
ＩからＮｃｏＩまでのフラグメント）ヲ酵母細胞からＧ
Ｍ−Ｃ８Ｆの合成および分泌を指令するようにデザイン
した発現ベクター（例えば第２図に示すようなｐｙαｆ
ＧＭ−２と命名されたベクター）中に挿入した。例えば
ｐＹαｆＧＭ−２のような発現ベクターは、好ましくは
複製起点およびアンピシリン−耐性遺伝子（Ａｐ？’Ｊ
Ｔ？ｒ：含むプラスミドｐＢＲ３２２由来の配列（第２
図の太線部分）を含む。理想的には、発現ベクターは酵
母からの配列例えば選択マーカーとしてのトリプトファ
ン−１遺伝子（ＴＲＰ−１）および複製の２μ酵母オリ
ジンをも含む。発現ベクターはまた好ましくは更に、酵
母ｐｒｅ−ｐｒｏ−α接合因子（α−ファクター）−（
点線枠部分）を効果的プロモーターとして、酵母宿主中
でＧＭ −ＣＳ Ｆの合成および分泌を指令゛するリー
ダー配列（その後に第１図のＧＭ−Ｃ８Ｆのコード領域
が続（（ハツチング枠部分））′とともに含む。α−フ
ァクター遺伝子の構造は、クルシャンおよびヘルスコビ
ッッ（Ｋｕｒ ｊ ａｎａｎｄ Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ
）、 Ｃｅ１ｌ、 ３０：９３３−９４３８（１９８２
） に記載されている。
発現により、機能性ＧＭ−Ｃ８Ｆを製造し、発現生産物
が寒天中で骨髄細胞コロニーの増殖を刺激する能力を試
験した。第１図に示すＧＭ−Ｃ８Ｆ遺伝子の実質的に完
全コード領域であるｃＤＮＡフラグメント（Ｓｆａ Ｎ
ＩからＮｃｏＩまでのフラグメント）ヲ酵母細胞からＧ
Ｍ−Ｃ８Ｆの合成および分泌を指令するようにデザイン
した発現ベクター（例えば第２図に示すようなｐｙαｆ
ＧＭ−２と命名されたベクター）中に挿入した。例えば
ｐＹαｆＧＭ−２のような発現ベクターは、好ましくは
複製起点およびアンピシリン−耐性遺伝子（Ａｐ？’Ｊ
Ｔ？ｒ：含むプラスミドｐＢＲ３２２由来の配列（第２
図の太線部分）を含む。理想的には、発現ベクターは酵
母からの配列例えば選択マーカーとしてのトリプトファ
ン−１遺伝子（ＴＲＰ−１）および複製の２μ酵母オリ
ジンをも含む。発現ベクターはまた好ましくは更に、酵
母ｐｒｅ−ｐｒｏ−α接合因子（α−ファクター）−（
点線枠部分）を効果的プロモーターとして、酵母宿主中
でＧＭ −ＣＳ Ｆの合成および分泌を指令゛するリー
ダー配列（その後に第１図のＧＭ−Ｃ８Ｆのコード領域
が続（（ハツチング枠部分））′とともに含む。α−フ
ァクター遺伝子の構造は、クルシャンおよびヘルスコビ
ッッ（Ｋｕｒ ｊ ａｎａｎｄ Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ
）、 Ｃｅ１ｌ、 ３０：９３３−９４３８（１９８２
） に記載されている。
ｐｙαｆＧＭ−２発現プラスミドを適当な株の酵母（Ｓ
、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中に形質転換した。好まし
い酵母株は腐７９．Ｘ２１８１−ＩＢ、ＤＢＹ７４６．
ＹＮＮ２８０ および２０Ｂ−１２が含まれる。これら
の株は、α−ファクタープロモーターとの適合性および
Ｔｒｐ十−形質転換体の選択に関して、全てα。
、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中に形質転換した。好まし
い酵母株は腐７９．Ｘ２１８１−ＩＢ、ＤＢＹ７４６．
ＹＮＮ２８０ および２０Ｂ−１２が含まれる。これら
の株は、α−ファクタープロモーターとの適合性および
Ｔｒｐ十−形質転換体の選択に関して、全てα。
Ｔｒｐ ｉ、Ｌｅｕ ２である。これらの株は全て
一般に入手可能であり、例えばストレイン／ｌ６７９は
Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ ５ｔｏｃｋ Ｃｅｎｔ
ｅｒ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔｏ（Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ
ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ。
一般に入手可能であり、例えばストレイン／ｌ６７９は
Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ ５ｔｏｃｋ Ｃｅｎｔ
ｅｒ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔｏ（Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ
ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ。
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ、
Ｂｅｒｋｅｌｅｙ。
Ｂｅｒｋｅｌｅｙ。
Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ ９４７０２ から入手出来る
。
。
ｂＩＬ−２遺伝子を含む組換え発現プラスミドによる酵
母宿主の形質転換は、スフェロプラスト乞形成させ、次
いでプラスミド取り込みの前に洗浄する公知の方法で行
った。この方法のための処方は確立されている。例えば
、ベッグス（Ｂｅｇｇｓ）。
母宿主の形質転換は、スフェロプラスト乞形成させ、次
いでプラスミド取り込みの前に洗浄する公知の方法で行
った。この方法のための処方は確立されている。例えば
、ベッグス（Ｂｅｇｇｓ）。
Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ） 、 ２７５ ： １０
’４（１９７８） およびヒンネン等、 Ｐｒｏｃ
、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。
’４（１９７８） およびヒンネン等、 Ｐｒｏｃ
、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。
（Ｕ、Ｓ、Ａ、）、７５：１９２９（１９７８）’ａ？
参照。
参照。
酵母醗酵上源の生物学的活性乞ヒト骨髄細胞からのグラ
ニュロサイトおよびマクロファージタイプコロニーの混
合形成の能力に関して検定した。
ニュロサイトおよびマクロファージタイプコロニーの混
合形成の能力に関して検定した。
対照として、プラスミドｐＹαｆＧＭ−２と同じ構造で
あるが、ＧＭ−Ｃ３Ｆ配列を欠失したプラスミドｐｙα
ｆもまた酵母宿主に形質転換して醗酵上澄の生物学的活
性乞検定した。ｐｙαｆＧＭ−２の上澄は骨髄アッセイ
において高レベルのＧＭ−Ｃ３Ｆ 活性の合成を指令す
ることが見出され（培養１１ｆＬｌ当たり１．２Ｘ１０
コロニー形成単位（ＣＦＵ−ｃ／ｍｌ） ）、これ
に対して、ｐｙαｆ対照プラスミドから誘導された上澄
には活性は全く検出されなかった。
あるが、ＧＭ−Ｃ３Ｆ配列を欠失したプラスミドｐｙα
ｆもまた酵母宿主に形質転換して醗酵上澄の生物学的活
性乞検定した。ｐｙαｆＧＭ−２の上澄は骨髄アッセイ
において高レベルのＧＭ−Ｃ３Ｆ 活性の合成を指令す
ることが見出され（培養１１ｆＬｌ当たり１．２Ｘ１０
コロニー形成単位（ＣＦＵ−ｃ／ｍｌ） ）、これ
に対して、ｐｙαｆ対照プラスミドから誘導された上澄
には活性は全く検出されなかった。
組換えＧＭ−Ｃ８Ｆの精製
発現宿主細胞の上澄の中て含まれる組換えＧＭ−Ｃ３Ｆ
は、逆相高性能の液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
で実質的に均一に精製した。本発明で使用するＨＰＬＣ
の方法においては、好ましくは逆相、テトラメチル、オ
クタデシル、オクチルメチルまたはジフェニル−結合シ
リカカラムであって、ＧＭ−Ｃ８Ｆ蛋白質への使用が最
適であるほど充分に大きい孔径、即ち少な（とも３ｏｏ
’ｈのものである。
は、逆相高性能の液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
で実質的に均一に精製した。本発明で使用するＨＰＬＣ
の方法においては、好ましくは逆相、テトラメチル、オ
クタデシル、オクチルメチルまたはジフェニル−結合シ
リカカラムであって、ＧＭ−Ｃ８Ｆ蛋白質への使用が最
適であるほど充分に大きい孔径、即ち少な（とも３ｏｏ
’ｈのものである。
本発明で使用しうる逆相ＨＰＬＣカラムは市販されてい
る。この目的のために好ましいカラムは、セパレーショ
ンズ グループ（ＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓＧｒｏｕｐ）
、 Ｈｅ５ｐｅｒｉａ、 ＣＡ から市販されている
ピダック（Ｖｙｄａｃ） 系列のカラムである。例え
ば、本発明は、平均粒子サイズ３０ないし６３ミクロン
に選別された孔径５ｏｏｉのシリカゲルの表面に結合さ
れたシロキサン（シリカン−酸素−シリカン）によって
共有結合したテトラメチルシラン基よりなるピダツクＣ
４またはＣ１６吸着逆相カラムを使用できる。
る。この目的のために好ましいカラムは、セパレーショ
ンズ グループ（ＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓＧｒｏｕｐ）
、 Ｈｅ５ｐｅｒｉａ、 ＣＡ から市販されている
ピダック（Ｖｙｄａｃ） 系列のカラムである。例え
ば、本発明は、平均粒子サイズ３０ないし６３ミクロン
に選別された孔径５ｏｏｉのシリカゲルの表面に結合さ
れたシロキサン（シリカン−酸素−シリカン）によって
共有結合したテトラメチルシラン基よりなるピダツクＣ
４またはＣ１６吸着逆相カラムを使用できる。
カラムに適用する前に、発現されたＧＭ −ＣＳ Ｆを
適当な酸、例えばトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）Ｙ使って
酸性にする。ＨＰＬＣカラムからの蛋白質の溶出は、公
知の方法で行う。カラムからの結合蛋白質を除去するた
めの溶出の適当な方法はアセトニトリルの直線勾配の使
用を含む。この目的のための好ましい勾配は、ＴＦＡ（
ｐＨ２，０−２，１）中の０−１００％（ｖ ｏ ｌ
／ｖ ｏ ｌ ）アセトニトリル勾配である。
適当な酸、例えばトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）Ｙ使って
酸性にする。ＨＰＬＣカラムからの蛋白質の溶出は、公
知の方法で行う。カラムからの結合蛋白質を除去するた
めの溶出の適当な方法はアセトニトリルの直線勾配の使
用を含む。この目的のための好ましい勾配は、ＴＦＡ（
ｐＨ２，０−２，１）中の０−１００％（ｖ ｏ ｌ
／ｖ ｏ ｌ ）アセトニトリル勾配である。
溶出された蛋白質は当業者に公知の検出手段で都合よ（
モニターできる。例えばＨＰＬＣカラムから溶出された
フラクション中の蛋白質の相対濃度は、溶出された材料
を光波長２１４ナノメーターの自動紫外線スペクトロフ
ォトメーターで吸光度を測定することによって決定する
ことかできる。
モニターできる。例えばＨＰＬＣカラムから溶出された
フラクション中の蛋白質の相対濃度は、溶出された材料
を光波長２１４ナノメーターの自動紫外線スペクトロフ
ォトメーターで吸光度を測定することによって決定する
ことかできる。
適当な自動紫外線光吸収検出手段は、Ｍｉｌｆｏｒｄ。
ＭＥのウォーターズ アンシェード社（ＷａｔｅｒｓＡ
ｓ ｓｏｃ ｉ ａ ｔｅｓ ）から入手できる。
ｓ ｓｏｃ ｉ ａ ｔｅｓ ）から入手できる。
ＨＰＬＣから回収したフラクションにつき、後記の実施
例４に示すとおり、フルオレスカミンアッセイおよびＳ
ＤＳ （ドデシル硫酸ナトリウム）ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動およびそれに続く銀染色で蛋白質の検出を
行う。回収されたＧＭ−Ｃ８ＦはＦｘｎと命名され、前
記および実施例乙のようにして骨髄コロニー形成アッセ
イにより、生物学的活性を調べる。
例４に示すとおり、フルオレスカミンアッセイおよびＳ
ＤＳ （ドデシル硫酸ナトリウム）ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動およびそれに続く銀染色で蛋白質の検出を
行う。回収されたＧＭ−Ｃ８ＦはＦｘｎと命名され、前
記および実施例乙のようにして骨髄コロニー形成アッセ
イにより、生物学的活性を調べる。
もし、最初のＨＰＬＣで充分な蛋白質の精製が果たされ
なかったときは、同じカラム＝１！たは異なるタイプの
カラムヶ使用して操作を繰り逗子ことが出来る。さらに
同一または異なる溶出剤を使用してよい。ＨＰＬＣｖ二
段階で実施することによって、ＧＭ−Ｃ８Ｆは生物学的
活性が単一対称ピークを示すまでの均一度に精製された
。第５図に示すとおり、ポリアクリルアミドゲル電気泳
動により、分子量約２１，０００および１７，０００ダ
ルトンのＧＭ −ＣＳＦ活性を持つ二つのバンドが同定
された。これらのバンドは、酵母が製造したグリコジル
比（２１，０００）および非グリコジル比（１７，００
０）ＧＭ−Ｃ３Ｆに相当する。骨髄コロニー形成アッセ
イにおいて、Ｆｘｎ５７の活性程度は１．５ｘ１０７Ｃ
ＦＵ−Ｃ／〜であった。この均質ＧＭ −ＣＳ Ｆの比
活性は約１．５Ｘ１０’ＣＦＵ−ｃ／ｐｇ蛋白質または
３．ＯＸ １０１６ＣＦＵ−ｃ１モルであった。
なかったときは、同じカラム＝１！たは異なるタイプの
カラムヶ使用して操作を繰り逗子ことが出来る。さらに
同一または異なる溶出剤を使用してよい。ＨＰＬＣｖ二
段階で実施することによって、ＧＭ−Ｃ８Ｆは生物学的
活性が単一対称ピークを示すまでの均一度に精製された
。第５図に示すとおり、ポリアクリルアミドゲル電気泳
動により、分子量約２１，０００および１７，０００ダ
ルトンのＧＭ −ＣＳＦ活性を持つ二つのバンドが同定
された。これらのバンドは、酵母が製造したグリコジル
比（２１，０００）および非グリコジル比（１７，００
０）ＧＭ−Ｃ３Ｆに相当する。骨髄コロニー形成アッセ
イにおいて、Ｆｘｎ５７の活性程度は１．５ｘ１０７Ｃ
ＦＵ−Ｃ／〜であった。この均質ＧＭ −ＣＳ Ｆの比
活性は約１．５Ｘ１０’ＣＦＵ−ｃ／ｐｇ蛋白質または
３．ＯＸ １０１６ＣＦＵ−ｃ１モルであった。
標的細胞の調製
モノサイト／マクロファージの殺腫瘍状態への活性比は
裡々のタイプの腫瘍細胞乞使用してアッセイした；例え
ばＡ６７５ヒトメラノーマ細胞ライン（ＡＴＣＣＡＣＲ
Ｌ１６１９）、ヒト膀胱酸痛（ｂｌａｄｄｅｒ ｓｑ
ｕａｍｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ） ５ＣａＢＥ
Ｒ（ＡＴＣＣ況ＨＴＢ３）、ヒト星細胞腫膠芽腫Ｕ−８
７ＭＧおよびＵ−３７３ＭＧ（ＡＴＣＣ／ｌ６ＨＴＢ
１４および１７）、ヒトエビング（Ｅｗｉｎｇ）
ザルコーマＥｓａ−１および５Ｋ−ＥＳ−２（ＡＴＣＣ
ＡＨＴＢＩ：１３およびＨＴＢ８７）、ヒト悪性メラノ
ーマＳＫ−ＭＥＬ−２８およびＳＫ−ＭＥＬ−３１（Ａ
ＴＣＣ、％ＨＴＢ７２およびＨＴＢ７３）、ヒト肝臓癌
５Ｋ−Ｈｅｐ−１（ＡＴＣＣ、％ＨＴＢ−５２）、ヒト
膵臓癌ＭＩＡ ＰＡＣＡ−２（ＡＴＣＣ、、ｆＬｃＲ
Ｌ−１４２０） およびヒト膀胱癌５６３７（ＡＴＣ
Ｃ、％ＨＴＢ−９）を使用した。アッセイに先立って標
的細胞２種々の添加物、例えば胎児牛血清（Ｆｅ２）で
強化した培地中でモルレヤーに増殖させた。次に標的細
胞を例えば（１２５Ｉ ）ヨードウリジンＣ（１２５Ｉ
） ＩＵｄＲ） で放射標識しＬ０標識方法の標準
手順は、タライナーマン（Ｋｌｅｉｎｅｒｍａｎ）等、
前述、およびオノザキ、前述、に記載されている。
裡々のタイプの腫瘍細胞乞使用してアッセイした；例え
ばＡ６７５ヒトメラノーマ細胞ライン（ＡＴＣＣＡＣＲ
Ｌ１６１９）、ヒト膀胱酸痛（ｂｌａｄｄｅｒ ｓｑ
ｕａｍｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ） ５ＣａＢＥ
Ｒ（ＡＴＣＣ況ＨＴＢ３）、ヒト星細胞腫膠芽腫Ｕ−８
７ＭＧおよびＵ−３７３ＭＧ（ＡＴＣＣ／ｌ６ＨＴＢ
１４および１７）、ヒトエビング（Ｅｗｉｎｇ）
ザルコーマＥｓａ−１および５Ｋ−ＥＳ−２（ＡＴＣＣ
ＡＨＴＢＩ：１３およびＨＴＢ８７）、ヒト悪性メラノ
ーマＳＫ−ＭＥＬ−２８およびＳＫ−ＭＥＬ−３１（Ａ
ＴＣＣ、％ＨＴＢ７２およびＨＴＢ７３）、ヒト肝臓癌
５Ｋ−Ｈｅｐ−１（ＡＴＣＣ、％ＨＴＢ−５２）、ヒト
膵臓癌ＭＩＡ ＰＡＣＡ−２（ＡＴＣＣ、、ｆＬｃＲ
Ｌ−１４２０） およびヒト膀胱癌５６３７（ＡＴＣ
Ｃ、％ＨＴＢ−９）を使用した。アッセイに先立って標
的細胞２種々の添加物、例えば胎児牛血清（Ｆｅ２）で
強化した培地中でモルレヤーに増殖させた。次に標的細
胞を例えば（１２５Ｉ ）ヨードウリジンＣ（１２５Ｉ
） ＩＵｄＲ） で放射標識しＬ０標識方法の標準
手順は、タライナーマン（Ｋｌｅｉｎｅｒｍａｎ）等、
前述、およびオノザキ、前述、に記載されている。
殺腫瘍活性のアッセイ
候補アクチベーター物質、即ち、ＧＭ−Ｃ８Ｆ。
ＩＦＮ−γ、ＬＰＳの裡々の濃度を、上記で用意したブ
レーティングされたモノサイトに加えた。適当な培養期
間、即ち２４時間後に、試験物質を除去し、培養ウェル
に放射標識標的細胞を加えた。初期インキュベーション
期間ン更に置いた後、培養上澄を除去して新鮮な培地に
交換した。次いで最終培養期間の後、活性比モノサイト
で殺された標的細胞を除去し、各ウェル中の残存生存細
胞を適当な試薬、例えばＮａＯＨで溶解する。次いで溶
解物の放射活性をガンマカウンターで測定する。放射標
識標的細胞ン含むが活性比モノサイトヶ含まないウェル
を標的細胞の活性の対照として用いる。
レーティングされたモノサイトに加えた。適当な培養期
間、即ち２４時間後に、試験物質を除去し、培養ウェル
に放射標識標的細胞を加えた。初期インキュベーション
期間ン更に置いた後、培養上澄を除去して新鮮な培地に
交換した。次いで最終培養期間の後、活性比モノサイト
で殺された標的細胞を除去し、各ウェル中の残存生存細
胞を適当な試薬、例えばＮａＯＨで溶解する。次いで溶
解物の放射活性をガンマカウンターで測定する。放射標
識標的細胞ン含むが活性比モノサイトヶ含まないウェル
を標的細胞の活性の対照として用いる。
活性［ヒモノサイトに介在される殺細胞活性は次のよ５
に計算される： 無処理での殺細胞性％ ｇ３図および第４図は、種々の濃度の組換えヒトＧＭ−
Ｃ８Ｆ、ＬＰＳ、ＩＦＮ−γまたはＬＰＳとＩＦＮ−γ
とともに活性ｒｅ Ｌ ｒ、−ヒト末梢血液モノサイト
の殺腫瘍活性乞説明するものである。脣に第６図は、Ｌ
ＰＳおよびＩＦＮ−γの単独およびマクロファージ介在
腫瘍標的破壊馨誘発するために組合せたＬＰＳおよびＩ
ＦＮ−γの用量依存性効果ン示す。
に計算される： 無処理での殺細胞性％ ｇ３図および第４図は、種々の濃度の組換えヒトＧＭ−
Ｃ８Ｆ、ＬＰＳ、ＩＦＮ−γまたはＬＰＳとＩＦＮ−γ
とともに活性ｒｅ Ｌ ｒ、−ヒト末梢血液モノサイト
の殺腫瘍活性乞説明するものである。脣に第６図は、Ｌ
ＰＳおよびＩＦＮ−γの単独およびマクロファージ介在
腫瘍標的破壊馨誘発するために組合せたＬＰＳおよびＩ
ＦＮ−γの用量依存性効果ン示す。
第６図はまた、組換えＧＭ −ＣＳ Ｆを含む種々の濃
度の酵母上澄の活性も示す。第６図に描かれているとお
り、この酵母上澄は１：５００（２００ＣＦＵ−ｃ／ｒ
ｎｌ ）の希釈でマクロファージを活性比して約６５％
の特異的殺細胞性を発揮した。これもまた第６図に記載
されているとおり、対照酵母発酵上澄は、マクロファー
ジ細胞毒性乞誘発することはできなかった。粗酵母上澄
は、約１−２ｘ１０ ＣＦＵ−ｃ／ｌＡ’のタイターを
有していた。
度の酵母上澄の活性も示す。第６図に描かれているとお
り、この酵母上澄は１：５００（２００ＣＦＵ−ｃ／ｒ
ｎｌ ）の希釈でマクロファージを活性比して約６５％
の特異的殺細胞性を発揮した。これもまた第６図に記載
されているとおり、対照酵母発酵上澄は、マクロファー
ジ細胞毒性乞誘発することはできなかった。粗酵母上澄
は、約１−２ｘ１０ ＣＦＵ−ｃ／ｌＡ’のタイターを
有していた。
第４図は、精製組換えヒトＧＭ−Ｃ３Ｆの用量依存力価
の全範囲を示している。ＷＪ４図に説明したとおり、マ
クロファージ介在腫瘍細胞殺細胞性の最大誘発の％は、
均−ＧＭ −ＣＳ Ｆを含むカラムフラクションの約Ｃ
Ｉ、０００，０００希釈（１５ＣＦＵ−ｃ／’ｒｕｇ）
で生じた。ＩＦＮ−ｒ、ＬＰＳおよびＩＦＮ−γと組合
せたＬＰＳの殺細胞性乞説明する対照データもまた第４
図に示す。
の全範囲を示している。ＷＪ４図に説明したとおり、マ
クロファージ介在腫瘍細胞殺細胞性の最大誘発の％は、
均−ＧＭ −ＣＳ Ｆを含むカラムフラクションの約Ｃ
Ｉ、０００，０００希釈（１５ＣＦＵ−ｃ／’ｒｕｇ）
で生じた。ＩＦＮ−ｒ、ＬＰＳおよびＩＦＮ−γと組合
せたＬＰＳの殺細胞性乞説明する対照データもまた第４
図に示す。
上記から明らかなとおり、ＧＭ−Ｃ８Ｆはモノサイトの
殺腫瘍細胞活性を誘発する単一信号として効果的に作用
しγこ。このようなＧＭ−Ｃ８Ｆの生物学的活性は、従
来知られていなかった。
殺腫瘍細胞活性を誘発する単一信号として効果的に作用
しγこ。このようなＧＭ−Ｃ８Ｆの生物学的活性は、従
来知られていなかった。
独瘍患者力治療
上記のような調製した梢製組換えＧＭ −ＣＳ Ｆは、
腫瘍患者または哺乳動物を種々の治療法で治療する１こ
のに使用できる。治療を要する患者に治療有効量のＧＭ
−Ｃ３Ｆ ’に一般的な種々の経路、例えば非経口ま２
は経皮膚投与法で投与できる。一般に、組換えＧＭ−Ｃ
３Ｆは１日当り患者体重１ ｋｇにつき、約１．０ない
し１０ μｇの量で投与できる。好ましくは、治療はこ
の範囲の低用量で開始して、望まれろ治療効果が達成さ
れる用量まで増加される。
腫瘍患者または哺乳動物を種々の治療法で治療する１こ
のに使用できる。治療を要する患者に治療有効量のＧＭ
−Ｃ３Ｆ ’に一般的な種々の経路、例えば非経口ま２
は経皮膚投与法で投与できる。一般に、組換えＧＭ−Ｃ
３Ｆは１日当り患者体重１ ｋｇにつき、約１．０ない
し１０ μｇの量で投与できる。好ましくは、治療はこ
の範囲の低用量で開始して、望まれろ治療効果が達成さ
れる用量まで増加される。
さらに、用量の変更は種々の因子、例えば治療されろ患
者の状態によっても必要になろう。いずれにしても、投
与責任者が各患者について適当な用量乞央定するであろ
う。
者の状態によっても必要になろう。いずれにしても、投
与責任者が各患者について適当な用量乞央定するであろ
う。
非経口投与のためには、組換えＧＭ−Ｃ３Ｆは、例えば
皮下、筋注、腹腔、ま１こは静注により、率−もしくは
複数用量で患者に投与される。別法として、ＧＭ−Ｃ３
Ｆはエーロゾル吸入、経皮、経口腔ま１こは直腸坐剤と
して投与してもよい。注射用投与の１こめには、組換え
ＧＭ −ＣＳ Ｆのゴマ油、ピーナツ油または水性プロ
ピレングリコール中の溶液ならびに蒸留水、血清アルブ
ミン、リンゲル液。
皮下、筋注、腹腔、ま１こは静注により、率−もしくは
複数用量で患者に投与される。別法として、ＧＭ−Ｃ３
Ｆはエーロゾル吸入、経皮、経口腔ま１こは直腸坐剤と
して投与してもよい。注射用投与の１こめには、組換え
ＧＭ −ＣＳ Ｆのゴマ油、ピーナツ油または水性プロ
ピレングリコール中の溶液ならびに蒸留水、血清アルブ
ミン、リンゲル液。
ハンクス液、その他の無菌、非毒性、非アレルギー性溶
液を使用できる。そのような溶液は必要に応じて適当に
緩衝比でき、また液体希釈剤は十分量の食塩またはグル
コースで等張にしてお（こともできる。
液を使用できる。そのような溶液は必要に応じて適当に
緩衝比でき、また液体希釈剤は十分量の食塩またはグル
コースで等張にしてお（こともできる。
別の治療方法として、マクロファージまたはその前駆体
細胞を提供者から単離し、該細胞を治療有効量のＧＭ
−ＣＳ Ｆとともに培養することによって、殺腫瘍活性
をもつように刺激することができる。この活性比マクロ
ファージもしくは前駆体細胞を、次に上記技術の一つを
用いて受容者に投与することかできる。全ての場合では
ないが、典型的には提供者と受容者は同一個人である。
細胞を提供者から単離し、該細胞を治療有効量のＧＭ
−ＣＳ Ｆとともに培養することによって、殺腫瘍活性
をもつように刺激することができる。この活性比マクロ
ファージもしくは前駆体細胞を、次に上記技術の一つを
用いて受容者に投与することかできる。全ての場合では
ないが、典型的には提供者と受容者は同一個人である。
本発明の治療方法は、実質的に全ての型の腫瘍。
特に固型層に対して採用可能である。そのような腫瘍に
は、膀胱、’１ＩＩＦ臓、鱗状細胞、肺、肝臓、胸部、
および大腸の各所の癌ン全て含む。腫瘍には、全てのメ
ラノーマやザルコーマも含まれる。
は、膀胱、’１ＩＩＦ臓、鱗状細胞、肺、肝臓、胸部、
および大腸の各所の癌ン全て含む。腫瘍には、全てのメ
ラノーマやザルコーマも含まれる。
以下の実施例により、本発明の方法および発明物乞詳述
する。実施例は単に例示の目的で記載するものである；
本発明乞説明し、当業者が本発明乞追試および利用する
助けとするために記載する。
する。実施例は単に例示の目的で記載するものである；
本発明乞説明し、当業者が本発明乞追試および利用する
助けとするために記載する。
実施例によって本発明の範囲を限定しよ５とするもので
はなく、特許権成立後の発明の範囲は、特許請求の範囲
によって定められる。
はなく、特許権成立後の発明の範囲は、特許請求の範囲
によって定められる。
実施例 １
末梢血液モノサイトの調製
リムラス・アメボサイト・リゼート〔ホイットテーカー
・エム・エイ・バイオグロダクツ（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ
Ｍ、Ａ、 Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）、ウォーカース
ピル、 Ｍ Ａ 、：ｌ 馨使用してパイロジエンを含
まないことヲ調べた試薬を使用して、末梢血液モノサイ
トのバフィーコート（白血球）部分〔ボートランド、オ
レゴンの赤十字から入手〕を精製した。
・エム・エイ・バイオグロダクツ（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ
Ｍ、Ａ、 Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）、ウォーカース
ピル、 Ｍ Ａ 、：ｌ 馨使用してパイロジエンを含
まないことヲ調べた試薬を使用して、末梢血液モノサイ
トのバフィーコート（白血球）部分〔ボートランド、オ
レゴンの赤十字から入手〕を精製した。
各バフィーコートχ、ロスウェル・パーク・メモリアル
・インスチチュート（ＲＰＭＩ）−１６４０培地とヘハ
リン（５０Ｕ／ｍｇ 、シグマ社、セントルイス。
・インスチチュート（ＲＰＭＩ）−１６４０培地とヘハ
リン（５０Ｕ／ｍｇ 、シグマ社、セントルイス。
ＭＯ）で希釈して細胞２００成とし、アイソリンフ（Ｉ
ｓｏｌｙｍｐｈ） （ギャラードーシュレジンガ−（Ｇ
ａｌｌａｒｄ−３ｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ）、カールプＶ
−ス、ニューヨーク）上に重ね、１４００ｘＪで２５分
間遠心した。層間の細胞（単核白血球）乞洗浄して、４
〜５Ｘ１０７細胞７２ｎＬｌの濃度で連続パーコール（
ファルマシア・ファイン・ケミカルズ）上に重ねて、２
０ＯＸ＆で２０分間４℃で遠心し、モノサイトを残りの
単核白血球から分離した。得られ１こ頂部のモノサイト
層ン回収し、５％ＦＳＣＹ含むＲＰＭＩ−１６４０で洗
浄し、ＲＰＭＩ−１６４０および５％ＦＣ３とともに９
６穴平底マイクロタイタープレート〔コスタ−（Ｃｏｓ
ｔａｒ）、ケムブリッジ、ＭＡ）中に１〜２Ｘ１０５細
胞／ウエルの濃度でブレーティングした。６７℃で１時
間インキュベートした後、１Ｂゲージ針を使って非付着
細胞を吸引除去し、次いでモノサイト層を血清不含のＲ
ＰＭＩ−１６４０培地で２回洗浄し、これにより、モノ
サイトに種々濃度の候補アクチベーター、例えばＧＭ−
Ｃ８Ｆ、ＩＦＮ−γ、ＬＰＳ−！たはＩＦＮ−γと組合
せｒ、＝ＬＰｓよりなる試験サンプル乞、以下に詳述す
る如（添加する準備を終了した。
ｓｏｌｙｍｐｈ） （ギャラードーシュレジンガ−（Ｇ
ａｌｌａｒｄ−３ｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ）、カールプＶ
−ス、ニューヨーク）上に重ね、１４００ｘＪで２５分
間遠心した。層間の細胞（単核白血球）乞洗浄して、４
〜５Ｘ１０７細胞７２ｎＬｌの濃度で連続パーコール（
ファルマシア・ファイン・ケミカルズ）上に重ねて、２
０ＯＸ＆で２０分間４℃で遠心し、モノサイトを残りの
単核白血球から分離した。得られ１こ頂部のモノサイト
層ン回収し、５％ＦＳＣＹ含むＲＰＭＩ−１６４０で洗
浄し、ＲＰＭＩ−１６４０および５％ＦＣ３とともに９
６穴平底マイクロタイタープレート〔コスタ−（Ｃｏｓ
ｔａｒ）、ケムブリッジ、ＭＡ）中に１〜２Ｘ１０５細
胞／ウエルの濃度でブレーティングした。６７℃で１時
間インキュベートした後、１Ｂゲージ針を使って非付着
細胞を吸引除去し、次いでモノサイト層を血清不含のＲ
ＰＭＩ−１６４０培地で２回洗浄し、これにより、モノ
サイトに種々濃度の候補アクチベーター、例えばＧＭ−
Ｃ８Ｆ、ＩＦＮ−γ、ＬＰＳ−！たはＩＦＮ−γと組合
せｒ、＝ＬＰｓよりなる試験サンプル乞、以下に詳述す
る如（添加する準備を終了した。
実施例 ２
組換えＧＭ −ＣＳ Ｆの調製
ＧＭ−Ｃ３Ｆ遺伝子の実質的完全コード領域および３′
−隣接領域を第１図のｃＤＮＡクローンから取り出し、
これを使用して酵母宿主細胞中でＧＭ−Ｃ３Ｆの発現乞
指令させるための、ｐＹαｆＧＭ−２と命名された組換
え発現プラスミド？形成した。
−隣接領域を第１図のｃＤＮＡクローンから取り出し、
これを使用して酵母宿主細胞中でＧＭ−Ｃ３Ｆの発現乞
指令させるための、ｐＹαｆＧＭ−２と命名された組換
え発現プラスミド？形成した。
ｐｙαｆ ＧＭ −２発現プラスミドは、受託番号腐５
３１５７でＡＴＣＣに寄託され１こ。第２図に示される
如く、ｐＹαｆＧＭ−２は、プラスミドｐＢＲ３２２か
らの複製起点およびＡｐｒ抵抗遺伝子を包含する（太線
部）。この発現プラスミドは酵母２μ環の複製起点およ
び形質転換酵母宿主の選択のためのＴｒｐＩ遺伝子（Ｔ
ＲＰ−（Ｔｒｐ−栄養要求株〕、第２図におけろ細線部
）も有する。この発現プラスミドはさらに、ＧＭ−Ｃ８
Ｆの転写および分泌を指令するために使用する酵母α−
因子プロモーターおよびリーダー配列（黒枠部）も含む
。ＧＭ−Ｃ８Ｆ配列（ハツチング枠部）は、後に詳述す
る如く、合成オリゴヌクレオチド（空枠部）によって、
α−因子配列と融合されている。
３１５７でＡＴＣＣに寄託され１こ。第２図に示される
如く、ｐＹαｆＧＭ−２は、プラスミドｐＢＲ３２２か
らの複製起点およびＡｐｒ抵抗遺伝子を包含する（太線
部）。この発現プラスミドは酵母２μ環の複製起点およ
び形質転換酵母宿主の選択のためのＴｒｐＩ遺伝子（Ｔ
ＲＰ−（Ｔｒｐ−栄養要求株〕、第２図におけろ細線部
）も有する。この発現プラスミドはさらに、ＧＭ−Ｃ８
Ｆの転写および分泌を指令するために使用する酵母α−
因子プロモーターおよびリーダー配列（黒枠部）も含む
。ＧＭ−Ｃ８Ｆ配列（ハツチング枠部）は、後に詳述す
る如く、合成オリゴヌクレオチド（空枠部）によって、
α−因子配列と融合されている。
上に述べたとおり、ＧＭ−Ｃ８Ｆ遺伝子の５ｆａＮ、Ｉ
からＮｃｏＩ部位までのコード領域は、ｐＨ０２３クロ
ーンから、５ｆａＮＩおよびＮｃｏＩ制限酵素を使用し
て標準手法、例えばマニアチル等、モレキュラークロー
ニング、アラポラトリーマニュアル。
からＮｃｏＩ部位までのコード領域は、ｐＨ０２３クロ
ーンから、５ｆａＮＩおよびＮｃｏＩ制限酵素を使用し
て標準手法、例えばマニアチル等、モレキュラークロー
ニング、アラポラトリーマニュアル。
コールドスプリングハーバ−ラボ：’ ト’） ｒコ
ールトスプリングツ・−バー、Ｎ、Ｙ、に記載された手
法で除去された。Ｓ ｆ ａＮＩ酵素は、ｐＨ０２３ク
ローンからＧＭ−Ｃ８Ｆ遺伝子Ｚ開裂するが、その部位
は成熟蛋白質（ヌクレオチド屑１４）のコード領域の５
′末端から２ヌクレオチド下流である；何故なら、ヌク
レオチド、４６１４には、厳密に相当する制限部位が存
在しないからである。成ｉＧＭ−Ｃ８Ｆ遺伝子のコード
領域の５′末端部に再付加するため、および第二α−因
子プロセシング部位乞付加して成熟型ＧＭ−Ｃ８Ｆの分
泌のためのシグナル配列の完全プロセシングを得るため
、一つのオリボヌクレオチド’Ｋ（ヒ学合成し１こ。こ
のオリゴヌクレオチドの組成は、下記表１および第２図
（空枠部）に示すとおり、ＨｉｎｄｌＩＩ接着５′末端
を有し、これに続＜ＴＣＴ ＴＴＧ ＧＡＴ ＡＡＡ
ＡＧＡの配列よりなるカテプシンＢ様成熟サイト、それ
に続く成熟ＧＭ−Ｃ５Ｆ蛋白質の最初の二つのアミノ酸
残基をコードするＳ ｆ ａＮＩ ３’接着末端乞有す
る。懺１に示すオリゴヌクレオチドは、スート（Ｓｏｏ
ｄ）等、 Ｎｕｃｌ、Ａｃａｄ、 Ｒｅｓ、、 ４：２
５５７（１９７７）およびヒｏ セ（Ｈｉ ｒｏｓｅ）
等、 Ｔｅｔ、 Ｌｅｔｔ、、 ２８：２４４９（１９
７８） により記載されているトリエステル法で化学
合成されγこ；このオリゴヌクレオチドは他の方法、例
えばホスホジエステル法で調製もできる。
ールトスプリングツ・−バー、Ｎ、Ｙ、に記載された手
法で除去された。Ｓ ｆ ａＮＩ酵素は、ｐＨ０２３ク
ローンからＧＭ−Ｃ８Ｆ遺伝子Ｚ開裂するが、その部位
は成熟蛋白質（ヌクレオチド屑１４）のコード領域の５
′末端から２ヌクレオチド下流である；何故なら、ヌク
レオチド、４６１４には、厳密に相当する制限部位が存
在しないからである。成ｉＧＭ−Ｃ８Ｆ遺伝子のコード
領域の５′末端部に再付加するため、および第二α−因
子プロセシング部位乞付加して成熟型ＧＭ−Ｃ８Ｆの分
泌のためのシグナル配列の完全プロセシングを得るため
、一つのオリボヌクレオチド’Ｋ（ヒ学合成し１こ。こ
のオリゴヌクレオチドの組成は、下記表１および第２図
（空枠部）に示すとおり、ＨｉｎｄｌＩＩ接着５′末端
を有し、これに続＜ＴＣＴ ＴＴＧ ＧＡＴ ＡＡＡ
ＡＧＡの配列よりなるカテプシンＢ様成熟サイト、それ
に続く成熟ＧＭ−Ｃ５Ｆ蛋白質の最初の二つのアミノ酸
残基をコードするＳ ｆ ａＮＩ ３’接着末端乞有す
る。懺１に示すオリゴヌクレオチドは、スート（Ｓｏｏ
ｄ）等、 Ｎｕｃｌ、Ａｃａｄ、 Ｒｅｓ、、 ４：２
５５７（１９７７）およびヒｏ セ（Ｈｉ ｒｏｓｅ）
等、 Ｔｅｔ、 Ｌｅｔｔ、、 ２８：２４４９（１９
７８） により記載されているトリエステル法で化学
合成されγこ；このオリゴヌクレオチドは他の方法、例
えばホスホジエステル法で調製もできる。
表１
５′−Ａ ＧＣＴ ＴＣＴ ＴＴＧ ＧＡＴ ＡＡＡ
ＡＧＡ ＧＣ−３’ＡＧＡ ＡＡＣＣＴＡ ＴＴＴ Ｔ
ＣＴ ＣＧＴ ＧＧＧＳｅｒ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ
Ａｒｇ Ａｌａ Ｐｒ。
ＡＧＡ ＧＣ−３’ＡＧＡ ＡＡＣＣＴＡ ＴＴＴ Ｔ
ＣＴ ＣＧＴ ＧＧＧＳｅｒ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ
Ａｒｇ Ａｌａ Ｐｒ。
同じ発現ベクターの製造の１こめ他のｇ準的組換えＤＮ
Ａ技術が使用できること、および上記詳述の製法は説明
のためのもので、ｐＹαｆＧＭ−２発現ベクターへの挿
入のためまたは他のバクテリアもしくは哺乳動物ベクタ
ー中での発現のための極々の方法の非限定的例示に丁ぎ
ないこと乞埋ｍ丁べきである。
Ａ技術が使用できること、および上記詳述の製法は説明
のためのもので、ｐＹαｆＧＭ−２発現ベクターへの挿
入のためまたは他のバクテリアもしくは哺乳動物ベクタ
ー中での発現のための極々の方法の非限定的例示に丁ぎ
ないこと乞埋ｍ丁べきである。
ｐ’ｙαｆＧＭ−２ベクターは、標準技術でＴｒｐ十形
質転換体の選択のため、Ｓ、セレビシェの酵母株７９（
王、シ」ｌ−１，ニ２−１）中に形質転換した。
質転換体の選択のため、Ｓ、セレビシェの酵母株７９（
王、シ」ｌ−１，ニ２−１）中に形質転換した。
形質転換の前に、７９株を選択培地（ＹＮ Ｂ −ｔ
ｒ ｐ ＊０．６７％イーストナイトロジエンベース（
ティフコラブズ、デトロイト、ＭＩ）、０．５％カザミ
ノ酸。
ｒ ｐ ＊０．６７％イーストナイトロジエンベース（
ティフコラブズ、デトロイト、ＭＩ）、０．５％カザミ
ノ酸。
２％グルコース、１０μｇ／ｌｎｌアデニンおよび２０
μｐ旬ウラシル）または富化培地（ＹＰＤ、１％イース
トエキス、２％ヘフトンおよび２％グルコース、８ｃｎ
ｇ／ｒｎｌアデニンおよび８ｃｎｇ／ｍｌウラシル補強
）のいずれかで増殖させた。細胞Ｙ２２℃で１０００ｘ
、Ｖ、５分間遠心して収穫し、次いで得られたペレット
乞滅菌蒸留水で洗浄した。
μｐ旬ウラシル）または富化培地（ＹＰＤ、１％イース
トエキス、２％ヘフトンおよび２％グルコース、８ｃｎ
ｇ／ｒｎｌアデニンおよび８ｃｎｇ／ｍｌウラシル補強
）のいずれかで増殖させた。細胞Ｙ２２℃で１０００ｘ
、Ｖ、５分間遠心して収穫し、次いで得られたペレット
乞滅菌蒸留水で洗浄した。
次いで酵母細胞を１／１０容量のＳＥＤ（１Ｍソルビト
ール、２５ｍＭエチレンジアミンテトラアセテート（Ｅ
ＤＴＡ）（ｐＨ８，０，ｌ、 および５０ｍＭジチオ
スレイトール）に濃度を高めて懸濁し、３０℃で１０分
間インキュベートシタ。細胞−バッファー混合物を次に
５分間３００ｘ、９で遠心した。ペレツｌ’１ｆｆ１／
１０容量の１Ｍソルビトールで洗浄し、細胞をＳＣＥ（
ＩＭ ンルビトール、 ０．１ Ｍクエン酸ナトリウム
（ｐＨ５，８：） 、０．０１ＭＥＤＴＡ）２０ｍＡ
！中に再懸濁した。細胞壁欠破壊するため、グルスラー
ゼを１０ 容量で溶液に加え、次いで時々おだやかに振
りながら３０℃で６０分間インキュベートし１こ。スフ
二ロプラストの存在は、１０μｌの酵母細胞を５％ＳＤ
Ｓ（ｗ／ｖ） １滴中に希釈し、顕微鏡スライド上で４
００倍位相コントラストでゴーストの存在乞観察して確
認した。細胞混合物を次いで３００Ｘｇで６分間遠心し
た。得られたベレット’ａ＝１７１０答ｆｔの１Ｍソル
ビトールで２回、セしてＣａ５（１ＭツルピトーＡ／
、 １ ［］ｍＭ ＣａＣ１２）で１回洗浄した。
ール、２５ｍＭエチレンジアミンテトラアセテート（Ｅ
ＤＴＡ）（ｐＨ８，０，ｌ、 および５０ｍＭジチオ
スレイトール）に濃度を高めて懸濁し、３０℃で１０分
間インキュベートシタ。細胞−バッファー混合物を次に
５分間３００ｘ、９で遠心した。ペレツｌ’１ｆｆ１／
１０容量の１Ｍソルビトールで洗浄し、細胞をＳＣＥ（
ＩＭ ンルビトール、 ０．１ Ｍクエン酸ナトリウム
（ｐＨ５，８：） 、０．０１ＭＥＤＴＡ）２０ｍＡ
！中に再懸濁した。細胞壁欠破壊するため、グルスラー
ゼを１０ 容量で溶液に加え、次いで時々おだやかに振
りながら３０℃で６０分間インキュベートし１こ。スフ
二ロプラストの存在は、１０μｌの酵母細胞を５％ＳＤ
Ｓ（ｗ／ｖ） １滴中に希釈し、顕微鏡スライド上で４
００倍位相コントラストでゴーストの存在乞観察して確
認した。細胞混合物を次いで３００Ｘｇで６分間遠心し
た。得られたベレット’ａ＝１７１０答ｆｔの１Ｍソル
ビトールで２回、セしてＣａ５（１ＭツルピトーＡ／
、 １ ［］ｍＭ ＣａＣ１２）で１回洗浄した。
次に、ベッグス（Ｂｅｇｇｓ ） （前衛）の方法を応
用して、先に製造したプラスミドベクターで形質転換し
た。ペレット比したスフェロプラスト馨１／２００容量
のＣａＳ中に懸濁し、１００μｌ’）７１Ｊコートに分
けて１．５ ｍｌエツベンドルフ管に入れた。
用して、先に製造したプラスミドベクターで形質転換し
た。ペレット比したスフェロプラスト馨１／２００容量
のＣａＳ中に懸濁し、１００μｌ’）７１Ｊコートに分
けて１．５ ｍｌエツベンドルフ管に入れた。
各アリコートに１〜１０μｌ のプラスミドＤＮＡ （
０，５ないし５ｎｇ）を添加した。混合物を室温で１０
分間インキユヘートシ、次いで各アリコートへＤＮＡの
取り込みを促進するため１ａのＰＥＧ（２０％ＰＥＧ４
０００，１０ｍＭＣａＣ１１２，１０ｍＭ トリス−
ＨＣｌ（ｐＨ７，４１）Ｙ加えた。室温で１０分間装い
た後、混合物を５分間３５０ｘ、９で遠心した。得られ
たベレット’ｔ’１５０μＡのＳＯ８（１０ｒｒＬｌ
の２Ｍソルビトール、 ６．７ｒｎｌ ＹＥＰＤ（１
％（ｗ／ ｖ ） イー ス） 、：ｃ キス。
０，５ないし５ｎｇ）を添加した。混合物を室温で１０
分間インキユヘートシ、次いで各アリコートへＤＮＡの
取り込みを促進するため１ａのＰＥＧ（２０％ＰＥＧ４
０００，１０ｍＭＣａＣ１１２，１０ｍＭ トリス−
ＨＣｌ（ｐＨ７，４１）Ｙ加えた。室温で１０分間装い
た後、混合物を５分間３５０ｘ、９で遠心した。得られ
たベレット’ｔ’１５０μＡのＳＯ８（１０ｒｒＬｌ
の２Ｍソルビトール、 ６．７ｒｎｌ ＹＥＰＤ（１
％（ｗ／ ｖ ） イー ス） 、：ｃ キス。
２％（Ｗ／Ｖ）ペプトン、２％（Ｗ／Ｖ）グ＃：Ｉ−ス
）。
）。
０、１３ ｍ１ｃｎ １Ｍ ＣａＣｌ２．２７ μｌｌ
の１％トリプトファンおよび”）、７ ｍｌの水）中
に再懸濁させた。この混合物ケ３０℃で２０分間インキ
ュベートした。
の１％トリプトファンおよび”）、７ ｍｌの水）中
に再懸濁させた。この混合物ケ３０℃で２０分間インキ
ュベートした。
次いで細胞のグレーティングを行った。
グレーティング前に、プロトプラス）／ＤＮＡ混合物の
選択プレートｔ６７℃で予備インキュベートシタ。１８
．２ｍｌのンルビト−ｙ、２ｙ（ｇ（ｎ寒天。
選択プレートｔ６７℃で予備インキュベートシタ。１８
．２ｍｌのンルビト−ｙ、２ｙ（ｇ（ｎ寒天。
０．６９のｆイフコイーストナイトロジエンベース（ア
ミノ酸不含）、２ｇのグルコース、 Ｑ、 ｉ ｍｅの
１％アデニン、Ｑ、４ｍｌの１％ウラシルおよび必要な
アミノ酸よりなる５ｍｌの溶融重層用寒天（４５’Ｃ）
を、各アリコートの形質転換細胞に加え、試験管内容物
を上記選択プレート上に注加した。プレート乞６０℃で
２ないし４日間インキュベートした。
ミノ酸不含）、２ｇのグルコース、 Ｑ、 ｉ ｍｅの
１％アデニン、Ｑ、４ｍｌの１％ウラシルおよび必要な
アミノ酸よりなる５ｍｌの溶融重層用寒天（４５’Ｃ）
を、各アリコートの形質転換細胞に加え、試験管内容物
を上記選択プレート上に注加した。プレート乞６０℃で
２ないし４日間インキュベートした。
このＴｒｐマイナス培地中で増殖するコロニーが、Ｔｒ
ｐｌ遺伝子′？：有するプラスミド即ち、形質転換され
たプラスミドを含んでいた。
ｐｌ遺伝子′？：有するプラスミド即ち、形質転換され
たプラスミドを含んでいた。
生物学的および殺腫瘍アッセイの前に、形質転換体を、
２０〜５ＱｉＪの富比培地中で６０℃で定常段階まで増
殖させた。収穫の時点でプロテアーゼインヒビターのフ
ェニルメチルスルホニル・フルオリド（ＰＭＳＦ）およ
びペプスタチンＡ乞、終濃度が夫々１ｒｒＭ および
１０μＭとなるよう添加した。
２０〜５ＱｉＪの富比培地中で６０℃で定常段階まで増
殖させた。収穫の時点でプロテアーゼインヒビターのフ
ェニルメチルスルホニル・フルオリド（ＰＭＳＦ）およ
びペプスタチンＡ乞、終濃度が夫々１ｒｒＭ および
１０μＭとなるよう添加した。
次いで細胞’＆４００Ｘ＆の遠心分離で除去し、培地’
Ｙ０．４５μセルロースアセテートフィルター（コーニ
ング・クラス・ワークス、コーニング、ＮＹ）で濾過し
た。除菌した上澄を４℃で保存した。
Ｙ０．４５μセルロースアセテートフィルター（コーニ
ング・クラス・ワークス、コーニング、ＮＹ）で濾過し
た。除菌した上澄を４℃で保存した。
実施例 ６
コロニーアッセイ
実施例６における酵母の培養物から収穫したヒトＧＭ−
Ｃ３Ｆの存在を、培養物上澄が寒天中でヒト骨髄細胞コ
ロニーの増殖を刺激する能力の検定により確認した。こ
の検定で使用するため、健康提供者の腸骨稜からのヒト
骨髄をヘパリン比シリンジで採取した。この骨髄χ室温
でリン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）で１＝６に希釈し、５４
％パーコール（ファルマシア・ファイン・ケミカルス）
の溶液上へ重ねた。５００Ｘ＆で２０分間室温で遠心分
離した後、層間部分を回収し、２０倍量のＰＢＳで洗浄
した。次に懸濁液を室温で２５０Ｘ、Ｖ 、 １０分間
遠心した。次に細胞χヌクレオチドを含むα−ミニマル
・エッセンシャル・メチイウム（α−Ｍｅｍ、ギプコ）
１０属に再懸濁し、細胞数と生存数を測定した。次にＦ
Ｃ８′（ｌ−加え、細胞懸濁液をアッセイのときまで氷
上に保存した。
Ｃ３Ｆの存在を、培養物上澄が寒天中でヒト骨髄細胞コ
ロニーの増殖を刺激する能力の検定により確認した。こ
の検定で使用するため、健康提供者の腸骨稜からのヒト
骨髄をヘパリン比シリンジで採取した。この骨髄χ室温
でリン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）で１＝６に希釈し、５４
％パーコール（ファルマシア・ファイン・ケミカルス）
の溶液上へ重ねた。５００Ｘ＆で２０分間室温で遠心分
離した後、層間部分を回収し、２０倍量のＰＢＳで洗浄
した。次に懸濁液を室温で２５０Ｘ、Ｖ 、 １０分間
遠心した。次に細胞χヌクレオチドを含むα−ミニマル
・エッセンシャル・メチイウム（α−Ｍｅｍ、ギプコ）
１０属に再懸濁し、細胞数と生存数を測定した。次にＦ
Ｃ８′（ｌ−加え、細胞懸濁液をアッセイのときまで氷
上に保存した。
アッセイにおいては、上記のように調製した骨髄細胞を
、次の組成のインキュベーション培地に最終濃度１Ｘｉ
Ｑ５／ｍＪとなるように添加した：（ａ）２８．１％Ｆ
Ｃ８、０，７ｘ １０−’Ｍ の２−メルカプトエタ
ノール、 ０．１２ｍｇ／ｒｎｌア名パラギン、 ０．
７ｍｇ／ｒｕｂグルタミン、１５０単位のペニシリンＧ
、 １５０単位のストレプトマイシン、ヌクレオチド含
有の１．１×α−ＭＥＭ、および２．２×ビタミン（ギ
ブコ）を含む溶液７部；および（ｂ） １．４％バクト
ーアガー溶液（ディフコ）３部。培養物を５％ＣＯ２の
存在する湿潤空気下で３７℃でインキュベートした。
、次の組成のインキュベーション培地に最終濃度１Ｘｉ
Ｑ５／ｍＪとなるように添加した：（ａ）２８．１％Ｆ
Ｃ８、０，７ｘ １０−’Ｍ の２−メルカプトエタ
ノール、 ０．１２ｍｇ／ｒｎｌア名パラギン、 ０．
７ｍｇ／ｒｕｂグルタミン、１５０単位のペニシリンＧ
、 １５０単位のストレプトマイシン、ヌクレオチド含
有の１．１×α−ＭＥＭ、および２．２×ビタミン（ギ
ブコ）を含む溶液７部；および（ｂ） １．４％バクト
ーアガー溶液（ディフコ）３部。培養物を５％ＣＯ２の
存在する湿潤空気下で３７℃でインキュベートした。
７ないし１４日間の培養の後、コロニーの数およびタイ
プ（グラニュロサイト、マクロファージま１こは混合グ
ラニュロサイトーマクロファージ）ヲ決定した。本発明
者らは、ｐＹαｆＧＭ−２クローンからのＧＭ −ＣＳ
Ｆ遺伝子が１．２５ｘ １０６コロニ一形成率位／
１０５（ＣＦＵ −ｃ／ｍｌ ）の高し’ベルでＧＭ−
Ｃ８Ｆ活性の生産を指令することを見出した。この活性
レベルは、最大コロニー数の５０％ヲ与える希釈の逆数
を５０倍して求めた値である。不発明者らは、ｌＸ１０
’骨髄細胞からの平均コロニー数は９６±２９であるこ
とを見出し１こ。組換えＧＭ−Ｃ８Ｆにより１４日日月
形成されたコロニーは、区別可能であり、次の三種のタ
イプよりなっていた：約％の混合グラニュロサイト−マ
クロファージコロニー；約％のかたまったグラニュロサ
イトコロニー；および約％の分散したマクロファージコ
ロニー０ 本発明の発現系の対照として、ＧＭ−Ｃ８Ｆ配列を欠（
こと以外はｐＹαｆＧＭ−２と同一のプラスミドも酵母
７９株中に形質転換した。この酵母からの培養上澄は、
骨髄コロニー形成試験でＧＭ−Ｃ８Ｆ活性を示さなかっ
た。
プ（グラニュロサイト、マクロファージま１こは混合グ
ラニュロサイトーマクロファージ）ヲ決定した。本発明
者らは、ｐＹαｆＧＭ−２クローンからのＧＭ −ＣＳ
Ｆ遺伝子が１．２５ｘ １０６コロニ一形成率位／
１０５（ＣＦＵ −ｃ／ｍｌ ）の高し’ベルでＧＭ−
Ｃ８Ｆ活性の生産を指令することを見出した。この活性
レベルは、最大コロニー数の５０％ヲ与える希釈の逆数
を５０倍して求めた値である。不発明者らは、ｌＸ１０
’骨髄細胞からの平均コロニー数は９６±２９であるこ
とを見出し１こ。組換えＧＭ−Ｃ８Ｆにより１４日日月
形成されたコロニーは、区別可能であり、次の三種のタ
イプよりなっていた：約％の混合グラニュロサイト−マ
クロファージコロニー；約％のかたまったグラニュロサ
イトコロニー；および約％の分散したマクロファージコ
ロニー０ 本発明の発現系の対照として、ＧＭ−Ｃ８Ｆ配列を欠（
こと以外はｐＹαｆＧＭ−２と同一のプラスミドも酵母
７９株中に形質転換した。この酵母からの培養上澄は、
骨髄コロニー形成試験でＧＭ−Ｃ８Ｆ活性を示さなかっ
た。
実施例 ４
組換えＧＭ −ＣＳ Ｆの精製
分泌された組換えＧＭ−Ｃ８Ｆ ｙｔ金含有る実施例２
からの培地ｖＴＦＡ中で１％にして、０゜４５μのフィ
ルター（コーニング・グラス・ワークス）テ沢過した。
からの培地ｖＴＦＡ中で１％にして、０゜４５μのフィ
ルター（コーニング・グラス・ワークス）テ沢過した。
次いでこの培地を直接にビグツクＣ４逆相カラム（１０
μバッキング付きの１．ＯＸ３０ｃｍステンレススチー
ルカラムま１こはウォーターズ・ラジアル・コン７’Ｖ
ツシヨン・カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ ｒａｄｉａｌ
ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｒｔｒｉｄｇｅ）（ウ
ォーターズ・アソシエート、ミルフォード。
μバッキング付きの１．ＯＸ３０ｃｍステンレススチー
ルカラムま１こはウォーターズ・ラジアル・コン７’Ｖ
ツシヨン・カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ ｒａｄｉａｌ
ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｒｔｒｉｄｇｅ）（ウ
ォーターズ・アソシエート、ミルフォード。
ＭＥ）に５０μビダツクＣ４バッキング乞付け１こカラ
ム）へ、ミルトン嗜ロイｅポン７” （Ｍｉ Ｉ ｔｏ
ｎＲｏｙ ｐｕｍｐＸラブ・データ・コントロール（Ｌ
ａｂ。
ム）へ、ミルトン嗜ロイｅポン７” （Ｍｉ Ｉ ｔｏ
ｎＲｏｙ ｐｕｍｐＸラブ・データ・コントロール（Ｌ
ａｂ。
Ｄａｔａ Ｃｏｎｔｒｏｌ） 、 リベリア・ビーチ
、ＦＬｍＩＹ便って、５ ｒｎｌ ７分の流速で送った
。１度に１１までの培地を適用し、カラムへの全蛋白負
荷量は、一般に約２０ｍｇであつ１こ。このカラムを０
．１％ＴＦＡで洗浄して２１４ｎｍの吸光度がベースラ
イン（蛋白負荷前）にもどるまで洗浄を続け、非結合サ
ンプル成分を除去した。結合蛋白質の磐田は、０．１％
ＴＦＡ中の０−９５％（ｖ／ｖ）アでトニトリルの直線
勾配（１％アセトニトリル／分）で行った。
、ＦＬｍＩＹ便って、５ ｒｎｌ ７分の流速で送った
。１度に１１までの培地を適用し、カラムへの全蛋白負
荷量は、一般に約２０ｍｇであつ１こ。このカラムを０
．１％ＴＦＡで洗浄して２１４ｎｍの吸光度がベースラ
イン（蛋白負荷前）にもどるまで洗浄を続け、非結合サ
ンプル成分を除去した。結合蛋白質の磐田は、０．１％
ＴＦＡ中の０−９５％（ｖ／ｖ）アでトニトリルの直線
勾配（１％アセトニトリル／分）で行った。
この勾配は、モデル６８０グラジエントフオーマ−４２
Ｍ−４５ポンプおよび２１４ｎｍでモニターするモデル
４１４デイテクターにより構成されたウォーターズ・リ
フイド・クロマトグラフによって作成し１こ。ピークの
蛋白フラクションは５０ないし６０％アセトニトリルで
見られ１こ。
Ｍ−４５ポンプおよび２１４ｎｍでモニターするモデル
４１４デイテクターにより構成されたウォーターズ・リ
フイド・クロマトグラフによって作成し１こ。ピークの
蛋白フラクションは５０ないし６０％アセトニトリルで
見られ１こ。
第１回のＨＰＬＣかも得られγこＧＭ−Ｃ３Ｆ ’ａ’
含むピークフラクションを集めて０．１％’ｉ’ＦＡ水
浴液（ｖ／ｖ ）で１：乙に希釈し、この活性部分を、
同様のＴＦＡとアセトニトリルの勾配で、ビダツクＣＩ
８カラム（３，９＋ｑｍＸ １５ｃＩｒＬカラム、５μ
バツキング）での再クロマトグラフィーおよび再溶出し
た。
含むピークフラクションを集めて０．１％’ｉ’ＦＡ水
浴液（ｖ／ｖ ）で１：乙に希釈し、この活性部分を、
同様のＴＦＡとアセトニトリルの勾配で、ビダツクＣＩ
８カラム（３，９＋ｑｍＸ １５ｃＩｒＬカラム、５μ
バツキング）での再クロマトグラフィーおよび再溶出し
た。
各フラクションの蛋白質をフルオレスカミンのアッセイ
により分析した。また、ピークフラクションは再度ＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動およびひき続く銀染
色によって分析した。この電気泳動ン行うにあたり、溶
出の間に各フラクションから２０Ｍ４分を取り出して、
その各々に１０％ＳＤＳ２ｍＪを添加し７：後真空乾燥
した。乾燥残渣を、０．０６２５Ｍ ）リス（ｐＨ６
，８） ； ２％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）；１０％グリセロ
ール（Ｖ／Ｖ）；５％２−メルカプトエタノール（Ｖ／
Ｖ）よりなる非還元性サンプル緩衝液４０μｌに溶解し
Ｌｏこの溶液を６分間煮沸し、レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ
）、 Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）。
により分析した。また、ピークフラクションは再度ＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動およびひき続く銀染
色によって分析した。この電気泳動ン行うにあたり、溶
出の間に各フラクションから２０Ｍ４分を取り出して、
その各々に１０％ＳＤＳ２ｍＪを添加し７：後真空乾燥
した。乾燥残渣を、０．０６２５Ｍ ）リス（ｐＨ６
，８） ； ２％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）；１０％グリセロ
ール（Ｖ／Ｖ）；５％２−メルカプトエタノール（Ｖ／
Ｖ）よりなる非還元性サンプル緩衝液４０μｌに溶解し
Ｌｏこの溶液を６分間煮沸し、レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ
）、 Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）。
２２７：６８０Ｃ１９７０）に記載された方法による１
２ ？２．ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動を行
った。各フラクション番号についてゲルサンプル’ｖオ
ークリ−（Ｏａｋｌｅｙ）等、 Ａｎａｌ 、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、 。
２ ？２．ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動を行
った。各フラクション番号についてゲルサンプル’ｖオ
ークリ−（Ｏａｋｌｅｙ）等、 Ａｎａｌ 、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、 。
１０５：３６１−３６４（１９８０）に記載された方法
で銀染色した。ＧＭ−Ｃ８Ｆの実質的均一性は、電気泳
動および銀染色によって確認され、それによればグリコ
ノル１ヒ（２１，０００ダルトン）および非グリコジル
［ヒ（１７，０００ダルトン）のＧＭ −ＣＳ Ｆに相
当てる二つの蛋白バンド２生じた（第５図参照）。
で銀染色した。ＧＭ−Ｃ８Ｆの実質的均一性は、電気泳
動および銀染色によって確認され、それによればグリコ
ノル１ヒ（２１，０００ダルトン）および非グリコジル
［ヒ（１７，０００ダルトン）のＧＭ −ＣＳ Ｆに相
当てる二つの蛋白バンド２生じた（第５図参照）。
この均一物質の活性乞前記実施例乙のコロニー形成試験
で分析したところ、約１．５ｘ １０７ＣＦＵ−Ｃ／〜
であり、比活性は１．５ｘ１０６ＣＦＵ−０／μｇ蛋白
質であつγこ。ｐＩ値は約５．０ないし５．４であった
。
で分析したところ、約１．５ｘ １０７ＣＦＵ−Ｃ／〜
であり、比活性は１．５ｘ１０６ＣＦＵ−０／μｇ蛋白
質であつγこ。ｐＩ値は約５．０ないし５．４であった
。
実施例 ５
標識標的細胞の調製
標的細胞は、５％血清強１ヒＲＰＭ１１６４０培地中、
５％ＣＯ７を宮む湿潤空気中で６７°Ｃに保持した。
５％ＣＯ７を宮む湿潤空気中で６７°Ｃに保持した。
培養標的細胞が対数増殖期にあるとき、則胞壽性試験を
行った。標的細胞は、ヒトメラノーマ細胞ラインＡ３７
５（ＡＴＣＣ／ｆ６ｃＲＬ１６１９）、ヒト肝滅癌細胞
ライｙＳＫ−Ｈｅｐ−１（ＡＴＣＣ、％ＨＴＢ−５２）
、ヒト膵臓癌ＭＩＡ−ＰＡＣＡ−２（ＡＴＣＣＡＣＲＬ
−１４２０）およびヒト膀胱癌５６３７（ＡＴＣＣ、＋
１ＴＢ−９） を含む。
行った。標的細胞は、ヒトメラノーマ細胞ラインＡ３７
５（ＡＴＣＣ／ｆ６ｃＲＬ１６１９）、ヒト肝滅癌細胞
ライｙＳＫ−Ｈｅｐ−１（ＡＴＣＣ、％ＨＴＢ−５２）
、ヒト膵臓癌ＭＩＡ−ＰＡＣＡ−２（ＡＴＣＣＡＣＲＬ
−１４２０）およびヒト膀胱癌５６３７（ＡＴＣＣ、＋
１ＴＢ−９） を含む。
対数増殖期の標的細胞’ａ−Ｉ−ＩＵｄＲで放射標識し
た。放射標識操作において、 Ｉ−ＩＵｄＲ（０，３
μｃｉ ／ｒｒＬｌ；比活性２００ｍＣ１／ｒＩＬＡ
；ニューイングランド・ニュークリアー、ボストン、Ｍ
Ａ、）乞含む５％ＦＣ３強比ＲＰＭＩ培地中で６７°Ｃ
９２４時間インキュベートシ１こ。次に細胞を２回洗っ
て未結合放射標識ヲ除き０．２５％トリプシン（ディフ
コ・ラプス、デトロイト２Ｍ１）および０．０２％ＥＤ
ＴＡによるトリプシン処理７１分間行って収穫し１こ。
た。放射標識操作において、 Ｉ−ＩＵｄＲ（０，３
μｃｉ ／ｒｒＬｌ；比活性２００ｍＣ１／ｒＩＬＡ
；ニューイングランド・ニュークリアー、ボストン、Ｍ
Ａ、）乞含む５％ＦＣ３強比ＲＰＭＩ培地中で６７°Ｃ
９２４時間インキュベートシ１こ。次に細胞を２回洗っ
て未結合放射標識ヲ除き０．２５％トリプシン（ディフ
コ・ラプス、デトロイト２Ｍ１）および０．０２％ＥＤ
ＴＡによるトリプシン処理７１分間行って収穫し１こ。
標識細胞乞５％ＦＣ８で強化したＲＰＭＩ−１６４０培
地に再懸濁した。
地に再懸濁した。
実施例 ６
殺腫瘍活性のアッセイ
殺腫瘍活性のアッセイ操作におい℃、実施例４からの組
換えＧＭ−Ｃ８Ｆの試験サンプルの独々の１度／希釈の
もの２００μｌ、積装天然ＩＦＮ−γ〔メロイ・ラボラ
トリーズ（Ｍｅｌｏｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。
換えＧＭ−Ｃ８Ｆの試験サンプルの独々の１度／希釈の
もの２００μｌ、積装天然ＩＦＮ−γ〔メロイ・ラボラ
トリーズ（Ｍｅｌｏｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。
スプリングフィールド、ＶＡ）、ＬＰＳ （ディ７＝＋
・ラブズ、、デトロイト、 ＭＩ 、 Ｅ、ｃｏｌｉ
ＬＰＳ−Ｎ）およびＩＦＮ−γと組合せたＬＰＳを、プ
レートにまかれたモノサイトを含む培養ウェルに添加し
１こ。実施例１で記載したとおり、モノサイトに試験サ
ンプルを加える前に、非付着モノサイト細胞は１８ゲー
ジ針で吸引して培養ウェルから除去し、次いでモルレヤ
ー馨血清不含のＲＰＭＩ−１６４０で２回ゆ丁いだ。Ｇ
Ｍ−Ｃ３Ｆに関して、アッセイは種々の希釈度の、実施
例２で製造し１こＧＭ−Ｃ８Ｆ プラスミドを含む酵母
の生産する上澄（第６図）および実施例５で製造した精
製組換えＧＭ−Ｃ３Ｆ （第４図）の両方について行
った。第６図および第４図には、ＬＰＳ、ＩＦＮ−γ２
よびＩＦＮ−γと一緒にしたＬＰＳの希釈物も示されて
いる。対照として、ＧＭ−Ｃ８Ｆ プラスミドを含まな
い酵母が生産した上澄のアッセイも行った。試験サンプ
ルを静止中のモノサイトと２４時間インキュベートし１
こ後、試験サンプルを吸引除去し１こ。
・ラブズ、、デトロイト、 ＭＩ 、 Ｅ、ｃｏｌｉ
ＬＰＳ−Ｎ）およびＩＦＮ−γと組合せたＬＰＳを、プ
レートにまかれたモノサイトを含む培養ウェルに添加し
１こ。実施例１で記載したとおり、モノサイトに試験サ
ンプルを加える前に、非付着モノサイト細胞は１８ゲー
ジ針で吸引して培養ウェルから除去し、次いでモルレヤ
ー馨血清不含のＲＰＭＩ−１６４０で２回ゆ丁いだ。Ｇ
Ｍ−Ｃ３Ｆに関して、アッセイは種々の希釈度の、実施
例２で製造し１こＧＭ−Ｃ８Ｆ プラスミドを含む酵母
の生産する上澄（第６図）および実施例５で製造した精
製組換えＧＭ−Ｃ３Ｆ （第４図）の両方について行
った。第６図および第４図には、ＬＰＳ、ＩＦＮ−γ２
よびＩＦＮ−γと一緒にしたＬＰＳの希釈物も示されて
いる。対照として、ＧＭ−Ｃ８Ｆ プラスミドを含まな
い酵母が生産した上澄のアッセイも行った。試験サンプ
ルを静止中のモノサイトと２４時間インキュベートし１
こ後、試験サンプルを吸引除去し１こ。
約１０４個の１２５Ｉ−ＵｄＲ−標識標的細胞（実施例
５からのもの）２各モノサイトのウェルに添加し、初期
の標的−エフエクタ−（活性比モノサイト）の比率を１
＝１０ないし１：２０にし１こ。また、放射標識標的細
胞単独についても、別の対照群としてブレーティングし
た。このアッセイは付着標的細胞の溶解乞測定するもの
であり、そのためにはエフェクター細胞と標的細胞との
細胞−細胞接触が必要であるＴこめ、２４時間後に培養
上澄を吸引除去して新１こなＲＰＭＩ−１６４０培地に
置き代えることにより、付着せずにこの試験で殺され得
ない細胞により生じる可能性のある誤差を防止した。さ
らに４８時間後にモルレキー乞激しくゆ丁いで、モノサ
イトにより殺された標的細胞乞除去した。
５からのもの）２各モノサイトのウェルに添加し、初期
の標的−エフエクタ−（活性比モノサイト）の比率を１
＝１０ないし１：２０にし１こ。また、放射標識標的細
胞単独についても、別の対照群としてブレーティングし
た。このアッセイは付着標的細胞の溶解乞測定するもの
であり、そのためにはエフェクター細胞と標的細胞との
細胞−細胞接触が必要であるＴこめ、２４時間後に培養
上澄を吸引除去して新１こなＲＰＭＩ−１６４０培地に
置き代えることにより、付着せずにこの試験で殺され得
ない細胞により生じる可能性のある誤差を防止した。さ
らに４８時間後にモルレキー乞激しくゆ丁いで、モノサ
イトにより殺された標的細胞乞除去した。
各ウェル中に残存する付着生存細胞を５０μｌの０．５
ＭＮａＯＨで溶解した。綿棒で残存放射活性細胞を集め
、放射活性をγカウンターで測定した。
ＭＮａＯＨで溶解した。綿棒で残存放射活性細胞を集め
、放射活性をγカウンターで測定した。
次の式欠用いてモノサイト介在細胞毎性を次の式によっ
て測定した： 発揮され１こ細胞毒性のパーセント 第６図および第４図にアッセイの結果を示す。
て測定した： 発揮され１こ細胞毒性のパーセント 第６図および第４図にアッセイの結果を示す。
第３図に示すとおり、また予測されるとおり、ＬＰＳお
よびＩＦＮ−γは殺腫瘍活性を介在する程度にはマクロ
ファーシン活性【ヒしなかつ１こ。さらに既に報告され
ているとおり、マクロファージ活性比剤としてのＩＦＮ
−γは、少量のＬＰＳと共に加えたときのみ効果を示し
た。第６図に更に示すとおり、ＧＭ−Ｃ８Ｆ プラスミ
ドン含む酵母が生産し１こ上澄は、マクロファージの腫
瘍細胞を殺丁作用を誘発し１こが、対照上澄（ＧＭ−Ｃ
８Ｆ プラスミドを含まない酵母が生産したもの）は、
マクロファージの細胞男性を誘発しなかった。
よびＩＦＮ−γは殺腫瘍活性を介在する程度にはマクロ
ファーシン活性【ヒしなかつ１こ。さらに既に報告され
ているとおり、マクロファージ活性比剤としてのＩＦＮ
−γは、少量のＬＰＳと共に加えたときのみ効果を示し
た。第６図に更に示すとおり、ＧＭ−Ｃ８Ｆ プラスミ
ドン含む酵母が生産し１こ上澄は、マクロファージの腫
瘍細胞を殺丁作用を誘発し１こが、対照上澄（ＧＭ−Ｃ
８Ｆ プラスミドを含まない酵母が生産したもの）は、
マクロファージの細胞男性を誘発しなかった。
第４図は精製組換えＧＭ−Ｃ８Ｆのドーズタイトレージ
ョンの全コースを示す。第４図に示すとおり、ｉ：ｓｏ
ｏ、ｏｏｏの希釈においてもなお、精製組換えＧＭ−Ｃ
８Ｆはマクロファージを活性比して殺腫瘍活性（３０Ｃ
ＦＵ−ｃＡ）乞発揮させる能カン有し、生じた特異的殺
細胞活性の最大値の半分の誘発は、約１：１，０００，
０００（１５ＣＦＵ−ｃＡ）にカラムからのフラクショ
ンを希釈し１ことき得らｔｌ、Ｌ。
ョンの全コースを示す。第４図に示すとおり、ｉ：ｓｏ
ｏ、ｏｏｏの希釈においてもなお、精製組換えＧＭ−Ｃ
８Ｆはマクロファージを活性比して殺腫瘍活性（３０Ｃ
ＦＵ−ｃＡ）乞発揮させる能カン有し、生じた特異的殺
細胞活性の最大値の半分の誘発は、約１：１，０００，
０００（１５ＣＦＵ−ｃＡ）にカラムからのフラクショ
ンを希釈し１ことき得らｔｌ、Ｌ。
第６図におけろと同様に第４図においてもＬＰＳ。
ＩＦＮ−γおよびＩＦＮ−γプラスＬＰＳの適当な対照
が示されている。ＩＦＮ−γと異なり、ＧＭ−Ｃ３Ｆは
外からのＬＰＳの不存在下でマクロファージを殺腫瘍性
に活性比する効果的単一シグナルとして作用した。
が示されている。ＩＦＮ−γと異なり、ＧＭ−Ｃ３Ｆは
外からのＬＰＳの不存在下でマクロファージを殺腫瘍性
に活性比する効果的単一シグナルとして作用した。
実施例 ７
殺腫瘍活性のアッセイ−ヒト癌細胞ライン実施例６に記
載されている殺腫瘍活性のアッセイを、ヒト膀胱鱗状カ
ルシノーマ５ＣａＢＥＲ（ＡＴＣＣ／ｌ６ＨＴＢ５）に
関しても実施した。これらの標的細胞は実施例５に記載
されているようにして放射標識した。アッセイを実施例
６の方法で、但しＡ６７５標的細胞の代りに放射標識し
た５ＣａＢＥＲ標的細胞を使用して実施し１こ。
載されている殺腫瘍活性のアッセイを、ヒト膀胱鱗状カ
ルシノーマ５ＣａＢＥＲ（ＡＴＣＣ／ｌ６ＨＴＢ５）に
関しても実施した。これらの標的細胞は実施例５に記載
されているようにして放射標識した。アッセイを実施例
６の方法で、但しＡ６７５標的細胞の代りに放射標識し
た５ＣａＢＥＲ標的細胞を使用して実施し１こ。
実施例 ８
殺Ｍ！活性のアツセイーヒトメラノーマ実施例６および
７の殺腫瘍活性のアッセイ法を、ヒト悪性ミエローマＳ
Ｋ−ＭＥＬ−２８（ＡＴＣＣＡ６ＨＴＢ７２） とと
もに使用した。標的細胞乞実施例５に記載したようにし
て放射標識した。アッセイは実施例６および７に記載し
１こ方法で行つ１こが、標的細胞としてはＳＫ−ＭＥＬ
−２８細胞乞使用した。
７の殺腫瘍活性のアッセイ法を、ヒト悪性ミエローマＳ
Ｋ−ＭＥＬ−２８（ＡＴＣＣＡ６ＨＴＢ７２） とと
もに使用した。標的細胞乞実施例５に記載したようにし
て放射標識した。アッセイは実施例６および７に記載し
１こ方法で行つ１こが、標的細胞としてはＳＫ−ＭＥＬ
−２８細胞乞使用した。
実施例 ９
殺ａ 瘍活ａのアッセイ−ヒトへバトーマヒト膵臓癌５
Ｋ−Ｈｅ ｐ −１（ＡＴＣＣ／ｌ６ＨＴＢ −５２）
＃Ｌ関しても、実施例６の殺腫瘍活性のアッセイ法を実
施した。標的細胞は実施例５の方法で放射標識した。こ
のアッセイにおいては、ＧＭ−Ｃ８Ｆは１０ｎｇ／ｒｎ
ｌアッセイ容量の濃度で用いた。各アッセイに２いて約
１０４個の１２”Ｉ Ｕｄ ｒ−標識標的細胞、を各ア
ッセイで使用して、初期の標的−エフエクタ−（活性比
モノサイト）細胞の比率を１：２０ないし１：６０にし
た。また、放射標識標的＃ｌ胞のみも、対照としてブレ
ーティングした。このアッセイにおいて、ＧＭ−Ｃ３Ｆ
活性比モノサイトは、千羽して約１４％のレベルの腫瘍
細胞の特異的殺細胞性を介在し１こ。
Ｋ−Ｈｅ ｐ −１（ＡＴＣＣ／ｌ６ＨＴＢ −５２）
＃Ｌ関しても、実施例６の殺腫瘍活性のアッセイ法を実
施した。標的細胞は実施例５の方法で放射標識した。こ
のアッセイにおいては、ＧＭ−Ｃ８Ｆは１０ｎｇ／ｒｎ
ｌアッセイ容量の濃度で用いた。各アッセイに２いて約
１０４個の１２”Ｉ Ｕｄ ｒ−標識標的細胞、を各ア
ッセイで使用して、初期の標的−エフエクタ−（活性比
モノサイト）細胞の比率を１：２０ないし１：６０にし
た。また、放射標識標的＃ｌ胞のみも、対照としてブレ
ーティングした。このアッセイにおいて、ＧＭ−Ｃ３Ｆ
活性比モノサイトは、千羽して約１４％のレベルの腫瘍
細胞の特異的殺細胞性を介在し１こ。
実施例 １０
殺腫瘍活性のアッセイ−ヒト膵臓癌
実施例９グ）殺腫瘍アッセイ法を、ヒト膵臓癌細 −胞
ラインＭＩＡＰＡＣＡ−２（ＡＴＣＣＡ６ＣＲＬ１４２
０）について行つ１こ。標的細胞は実施例５に詳述した
とおり放射標識し１こ。アッセイは実施例９の方法で行
つ−が、但し標的細胞にはＭＩＡＰＡＣＡ−２細胞乞用
いＬｏこの特定のアッセイにおいて、生じ１こ細胞毒性
の平均パーセントは約６８％でありに。
ラインＭＩＡＰＡＣＡ−２（ＡＴＣＣＡ６ＣＲＬ１４２
０）について行つ１こ。標的細胞は実施例５に詳述した
とおり放射標識し１こ。アッセイは実施例９の方法で行
つ−が、但し標的細胞にはＭＩＡＰＡＣＡ−２細胞乞用
いＬｏこの特定のアッセイにおいて、生じ１こ細胞毒性
の平均パーセントは約６８％でありに。
実施例 １１
殺腫瘍活性のアッセイ−ヒト膀胱癌
実施例９の殺腫瘍活性アツセイン、ヒト膀胱癌細胞ライ
ン５６３７（ＡＴＣＣ／１６ＨＴＢ−９）についても使
用した。標的細胞は実施例５のようにして標識し１こ。
ン５６３７（ＡＴＣＣ／１６ＨＴＢ−９）についても使
用した。標的細胞は実施例５のようにして標識し１こ。
アッセイは実施例９のようにして行つ−が、但し標的細
胞には５６６７細胞を用いた。このアッセイにおいて、
生じた細胞考性のノ（−セントは約６０％であった。こ
のアッセイ並びに上述のアッセイは、ＧＭ −ＣＳ Ｆ
がマクロファージぞ殺腫瘍イヘ活性ｆヒする有効な単独
シグナルとして作用することχ示している。
胞には５６６７細胞を用いた。このアッセイにおいて、
生じた細胞考性のノ（−セントは約６０％であった。こ
のアッセイ並びに上述のアッセイは、ＧＭ −ＣＳ Ｆ
がマクロファージぞ殺腫瘍イヘ活性ｆヒする有効な単独
シグナルとして作用することχ示している。
第１図は、６′非コード領域乞含む、ヒトＧＭ−ＣＳ
Ｆｆｆｉ伝子のヌクレオチド配列および相当するアミノ
酸配列を示す図であり、 第２図は、機能的ヒｌ−ＧＭ−ＣＳＦ ′ｆｆ：発現さ
せる１こめに宿主細胞を形質転換する１こめに挿入され
１こＱＭ−Ｃ３Ｆ遺伝子のコード領域を有するｐＹαｆ
ＧＭ−２発現プラスミドの模式図であり、 第６図は、組換えヒトＧＭ−Ｃ３Ｆで活性［ｌＺされた
ヒト末梢血液マクロファージにより介在される腫瘍細胞
の特異的溶解のパー七ントχ示すグラフであり、 第４図は、精製され一組換えヒトＧＭ−Ｃ８Ｆの種々の
濃度で活性１ヒされ１こヒト末梢血液マクロファージに
介在される腫瘍細胞の特異的溶解およびＬＰＳ、ＩＦＮ
−γおよびＬＰＳと組合せ１こＩＦＮ−γで活性比され
たマクロファージに介在される同様な溶解を示すグラフ
であり、 第５図は、精製された均一組換えＧＭ−Ｃ３Ｆの銀染色
されＴこポリアクリルアミドゲルバンドを示す電気泳動
図である。 「′ 代理人 弁理士 湯 浅 恭 三１．１（外５名つ−′ 図面の浄書（内容に変更なし） ｈ外じワ７ 乙−デ２− ＱＭ−（−５Ｆｔ：Ｊ＆ 返しｉイＬ’Ｉ％−Ｐ１１’
ｒｊ５Ｎ”ｈ−ｂＴ’ｆＸ 釣％Ｊ ｍビｂ）ｔＺ手
続 補 正 書 昭和ｇ／年Ｚ月２１７日
Ｆｆｆｉ伝子のヌクレオチド配列および相当するアミノ
酸配列を示す図であり、 第２図は、機能的ヒｌ−ＧＭ−ＣＳＦ ′ｆｆ：発現さ
せる１こめに宿主細胞を形質転換する１こめに挿入され
１こＱＭ−Ｃ３Ｆ遺伝子のコード領域を有するｐＹαｆ
ＧＭ−２発現プラスミドの模式図であり、 第６図は、組換えヒトＧＭ−Ｃ３Ｆで活性［ｌＺされた
ヒト末梢血液マクロファージにより介在される腫瘍細胞
の特異的溶解のパー七ントχ示すグラフであり、 第４図は、精製され一組換えヒトＧＭ−Ｃ８Ｆの種々の
濃度で活性１ヒされ１こヒト末梢血液マクロファージに
介在される腫瘍細胞の特異的溶解およびＬＰＳ、ＩＦＮ
−γおよびＬＰＳと組合せ１こＩＦＮ−γで活性比され
たマクロファージに介在される同様な溶解を示すグラフ
であり、 第５図は、精製された均一組換えＧＭ−Ｃ３Ｆの銀染色
されＴこポリアクリルアミドゲルバンドを示す電気泳動
図である。 「′ 代理人 弁理士 湯 浅 恭 三１．１（外５名つ−′ 図面の浄書（内容に変更なし） ｈ外じワ７ 乙−デ２− ＱＭ−（−５Ｆｔ：Ｊ＆ 返しｉイＬ’Ｉ％−Ｐ１１’
ｒｊ５Ｎ”ｈ−ｂＴ’ｆＸ 釣％Ｊ ｍビｂ）ｔＺ手
続 補 正 書 昭和ｇ／年Ｚ月２１７日
Claims (10)
- （１）マクロファージ系細胞を有効量のグラニュロサイ
ト−マクロファージ コロニー刺激因子で処理すること
よりなる、マクロファージ系の細胞の殺腫瘍活性を増大
する方法。 - （２）特許請求の範囲第１項の方法で製造した細胞と共
に腫瘍細胞をインキュベートする工程よりなる腫瘍細胞
を不活性化する方法。 - （３）ａ）提供者の体内からマクロファージ系の細胞を
単離し、 ｂ）該単離細胞を有効量のグラニュロサイト−マクロフ
ァージ コロニー刺激因子と接触させ、そして ｃ）該細胞を受容者の体内に導入する、 ことよりなる、癌の治療方法。 - （４）哺乳動物の体内に有効量のグラニュロサイト−マ
クロファージ コロニー刺激因子を導入する工程よりな
る、癌の治療方法。 - （５）グラニュロサイト−マクロファージ コロニー刺
激因子の体内への導入を、注射、経口投与、煙霧剤の吸
入、経皮吸収、口腔吸収または直腸坐剤により行う、特
許請求の範囲第４項記載の方法。 - （６）注射の方法が、皮下、筋肉内、腹腔内、および静
脈内注射から選ばれる、特許請求の範囲第５項記載の方
法。 - （７）グラニュロサイト−マクロファージ コロニー刺
激因子が組換えＤＮＡ技術で製造される、特許請求の範
囲第１項ないし第６項のいずれか１項に記載の方法。 - （８）グラニュロサイト−マクロファージ コロニー刺
激因子を、骨髄細胞コロニー形成試験で測定したとき少
なくとも約１．５×１０＾６コロニー形成単位／μｇ蛋
白質の比活性を示すまで精製する、特許請求の範囲第１
項ないし第７項のいずれか１項記載の方法。 - （９）マクロファージが末梢血液のモノサイト由来であ
る特許請求の範囲第１項ないし第８項のいずれか１項記
載の方法。 - （１０）マクロファージ系細胞の２×１０５細胞あたり
、約０．０１ないし１００ナノグラムのグラニュロサイ
ト−マクロファージ コロニー刺激因子を使用する、特
許請求の範囲第１項ないし第６項または第７項ないし第
９項のいずれか１項記載の方法。
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