ES2711893T3 - Procedimientos y composiciones de la pirrolisina - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para aumentar el rendimiento de la pirrolisina producida por Trueperella pyogenes, en el que el procedimiento comprende: A) cultivar T. pyogenes en un medio basal que contiene glucosa, así como una fuente de carbono concentrado adicional seleccionada entre el grupo que consiste en: glucosa, galactosa, sacarosa, maltosa, oligosacáridos, glicerol, lactosa, dextrano, dextrina, mono metil succinato y N-acetil glucosamina; B) añadir un agente quelante al medio antes del agotamiento de la glucosa en el medio; C) recolectar T. pyogenes, y D) aislar la pirrolisina.

Description

DESCRIPCION

Procedimientos y composiciones de la pirrolisina

Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a procedimientos para aumentar la cantidad de pirrolisina producida por Trueperella pyogenes, un agente causante de la metritis bovina. La invencion se refiere ademas a composiciones que comprenden pirrolisina, aisladas y purificadas usando los procedimientos descritos en el presente documento, y utiles para reducir o evitar la metritis bovina.

Antecedentes

La metritis es el resultado de una infeccion uterina en ganado lechero por diversos patogenos microbianos. Por lo general, se desarrolla despues del comienzo de la funcion lutea durante el penodo de posparto. Las bacterias que normalmente se encuentran en el ambiente en el que reside el ganado probablemente se introducen en el utero durante o despues del parto. En las vacas posparto que desarrollan infecciones bacterianas, las bacterias encuentran su camino hacia el utero, pero no comienzan a proliferar de inmediato. La metritis aguda se produce entre el dfa 0 y el dfa 21 despues del parto. La endometritis clmica (inflamacion o irritacion del revestimiento del utero o endometrio) se produce entre aproximadamente el dfa 21 y el dfa 35 despues del parto. Mas alla del dfa 35, la endometritis a menudo se vuelve subclmica.

Existen multiples factores asociados con la infeccion natural, tal como el estres del parto, la produccion de leche/lactancia, el balance energetico negativo, la inmunosupresion y el hecho de que un animal de este tipo sea mas susceptible a las infecciones naturales. Uno de los patogenos bacterianos responsables del comienzo de la metritis y la endometritis clmica es Trueperella pyogenes. Este organismo posee un numero de factores de virulencia que contribuyen a su potencial patogeno, uno de los cuales es la pirrolisina, una citolisina dependiente del colesterol. Esta protema es una hemolisina y es citolttica para las celulas inmunes, incluidos los macrofagos. La expresion de la pirrolisina es necesaria para la virulencia de esta bacteria. Esta protema parece ser la vacuna de subunidad candidata mas prometedora de T. pyogenes identificada hasta la fecha. Es cntico que la pirrolisina aislada sea conformacional e inmunologicamente similar/identica a la protema en su estado nativo. Por lo tanto, un procedimiento para producir, y si se requiere, aislar la pirrolisina nativa de T. pyogenes, asf como una vacuna eficaz basada en ella, son altamente deseables.

Sumario

Se desvela un procedimiento para aumentar el rendimiento de la pirrolisina producida por Trueperella pyogenes, en el que el procedimiento comprende usar un medio basal que contiene glucosa, asf como una fuente de carbono concentrado adicional seleccionada de entre el grupo que consiste en: glucosa, galactosa, sacarosa, maltosa, oligosacaridos, glicerol, lactosa, dextrano, dextrina, mono metil succinato y N-acetil glucosamina; anadir un agente quelante al medio antes del agotamiento de la glucosa en el medio; la recoleccion de T. pyogenes, y el aislamiento de la pirrolisina.

Se desvela un procedimiento en el que el agente quelante es acido etilenglicol tretraacetico (EGTA), acido etilendiaminotetraacetico (EDTA) o una combinacion de ambos.

Se desvela un procedimiento para aumentar el rendimiento de la pirrolisina producida por T. pyogenes, en el que T. pyogenes se replica en una densidad de celulas bacterianas mas alta que una densidad optica (DO) de 5 a 600 nm. Se desvela un procedimiento para aumentar el rendimiento de la pirrolisina producida por T. pyogenes, en el que el medio se mantiene a una temperatura de entre 28 °C y 32 °C.

Se desvela un procedimiento para aumentar el rendimiento de la pirrolisina producida por T. pyogenes, que comprende ademas el uso de un medio basal tamponado con fosfato en una concentracion de entre 10 mM y 200 mM.

Se desvela un procedimiento para aumentar el rendimiento de la pirrolisina producida por T. pyogenes, que comprende ademas el uso de un medio basal en el que el pH del medio esta entre 6,0 y 8,0.

Se desvela un procedimiento para aumentar el rendimiento de la pirrolisina producida por T. pyogenes, que comprende ademas el uso de un medio basal en el que el medio comprende hemina como fuente de hierro.

Se desvela un procedimiento para aumentar el rendimiento de la pirrolisina producida por T. pyogenes, que comprende ademas el uso de un medio basal que comprende polisorbato 80.

Se desvela un procedimiento para aumentar el rendimiento de la pirrolisina producida por T. pyogenes, que comprende ademas el uso de un medio basal que comprende una solucion de vitaminas.

Se desvela un procedimiento para aumentar el rendimiento de la pirrolisina producida por T. pyogenes, en el que la solucion de vitaminas comprende uno o mas de los siguientes: Vitamina B12; mioinositol; nucleobase del uracilo; acido nicotmico; pantotenato de calcio; piridoxal-HCl; piridoxamina-2HCl; riboflavina; tiamina-HCl; acido paminobenzoico; biotina; acido folico; niacinamida; y p-NAD.

Se desvela un procedimiento para aumentar el rendimiento de la pirrolisina producida por T. pyogenes, en el que la solucion de vitaminas comprende solo piridoxal-HCl.

Se desvela un procedimiento para aumentar el rendimiento de la pirrolisina producida por T. pyogenes, que comprende una suplementacion continua, semicontinua o de una sola vez con una fuente de carbono concentrada. Se desvela un procedimiento para aumentar el rendimiento de la pirrolisina producida por T. pyogenes, que comprende permitir que el pH del cultivo disminuya desde el medio basal inicial, comenzando el pH a un nivel entre 5,50 y 6,50 y luego controlar el pH entre 5,50 y 6,50 mediante la adicion automatica de un titulador basico.

Se desvela un procedimiento para aumentar el rendimiento de la pirrolisina producida por T. pyogenes, que comprende separar las proteasas de T. pyogenes de la pirrolisina.

Se desvela un procedimiento para aumentar el rendimiento de la pirrolisina producida por T. pyogenes, en el que la separacion de las proteasas de T. pyogenes de la pirrolisina se logra mediante una etapa de cromatograffa.

Se desvela un procedimiento para inactivar la pirrolisina, comprendiendo el procedimiento anadir formalina a una concentracion final de entre el 0,1 % y el 0,5 %.

Se desvelan composiciones inmunogenicas utiles para la vacunacion de un bovino, particularmente durante el penodo seco, para la reduccion o prevencion de la metritis.

Se desvelan composiciones inmunogenicas que comprenden pirrolisina, aisladas de T. pyogenes cultivadas en los medios descritos en el presente documento.

Se desvelan composiciones inmunogenicas que comprenden pirrolisina, obtenidas mediante cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento.

Se desvelan composiciones inmunogenicas que comprenden pirrolisina, obtenidas mediante cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, y un portador.

Se desvelan composiciones inmunogenicas que comprenden pirrolisina, obtenidas mediante cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, y un adyuvante.

Descripcion de las figuras

La Figura 1 es una comparacion del nivel de produccion de pirrolisina de Trueperella pyogenes en un medio que no contiene vitaminas, una solucion de vitaminas interna o una solucion de vitaminas comercial.

La Figura 2 es una comparacion del nivel de produccion de pirrolisina de Trueperella pyogenes en un medio que no contiene vitaminas, una solucion de vitaminas interna o una solucion de vitaminas comercial complementada con p-NAD y piridoxal.

La Figura 3 es una comparacion del nivel de produccion de pirrolisina de Trueperella pyogenes en un medio que contiene p-NAD, piridoxal o ambos.

La Figura 4 es una comparacion de la DO (600 nm) de Trueperella pyogenes en un medio que contiene piridoxal (Pir) que se ha esterilizado en autoclave (AC) o se ha anadido de forma esteril (SA) en combinacion con dextrosa (Dex).

La Figura 5 es una comparacion del nivel de produccion de pirrolisina de Trueperella pyogenes en un medio que contiene piridoxal (Pir) que se ha esterilizado en autoclave (AC) o se ha anadido de forma esteril (SA) en combinacion con dextrosa (Dex).

La Figura 6 es una comparacion de la DO (600 nm) de Trueperella pyogenes en un medio que contiene hemina que se ha irradiado durante diversos penodos de tiempo, o no se ha irradiado en absoluto.

La Figura 7 es una comparacion del nivel de produccion de pirrolisina de Trueperella pyogenes en un medio que contiene hemina que se ha irradiado durante diversos penodos de tiempo, o no se ha irradiado en absoluto. La Figura 8 es una comparacion del nivel de produccion de pirrolisina de Trueperella pyogenes en un medio que contiene hemina que se ha mantenido durante diversos penodos de tiempo antes de anadirla al medio.

Las Figuras 9 y 11 son comparaciones de la DO (600 nm) de Trueperella pyogenes en medio que se ha mantenido a diversas temperaturas.

Las Figuras 10 y 12 son comparaciones del nivel de produccion de pirrolisina de Trueperella pyogenes en un medio que se ha mantenido a diversas temperatures.

La Figura 13 es una comparacion del nivel de produccion de pirrolisina de Trueperella pyogenes en la que la temperatura del medio se ha mantenido a 32 °C, o se ha cambiado de 37 °C a 32 °C, durante el procedimiento de fermentacion.

Descripcion

Las siguientes definiciones pueden aplicarse a los terminos empleados en la descripcion de las realizaciones. Las siguientes definiciones reemplazan cualquier definicion contradictoria contenida en cada referencia individual incorporada en el presente documento por referencia.

A menos que se indique otra cosa en el presente documento, los terminos cientfficos y tecnicos usados en relacion con las presentes realizaciones tendran los significados que entienden comunmente los expertos en la tecnica. Ademas, a menos que el contexto indique otra cosa, los terminos en singular incluiran pluralidades, y los terminos en plural incluiran el singular.

Los terminos "sobre", "aproximadamente" y similares, como se usa en el presente documento, cuando se usa en relacion con una variable numerica medible, significan el valor indicado de la variable, y todos los valores de la variable que estan dentro del error experimental de valor indicado (por ejemplo, dentro del intervalo de confianza del 95 % para la media), o dentro del 10 por ciento del valor indicado, el que sea mayor. En terminos de dfas, "aproximadamente" se interpreta que significa mas o menos 1 dfa; por ejemplo, "aproximadamente 3 dfas" puede significar 2, 3 o 4 dfas.

El termino "animal", como se usa en el presente documento, significa cualquier animal que es susceptible a la endometritis, incluidos los mairnferos, tanto domesticados como naturales. Preferentemente, "animal", como se usa en el presente documento, se refiere a un bovino.

Los terminos "bacterias", "especie bacteriana", "bacteria", y similares, como se usa en el presente documento, significan un gran dominio de microorganismos procarioticos. Preferentemente, "bacterias", como se usa en el presente documento, se refiere a microorganismos que incluyen Trueperella pyogenes y bacterias relacionadas. La expresion "densidad de celulas bacterianas", como se usa en el presente documento, significa el numero de bacterias presentes en un cultivo. Un procedimiento para cuantificar el numero de bacterias es medir la densidad optica de un cultivo en un espectrofotometro, tfpicamente a 600 nm.

La expresion "medio basal", como se usa en el presente documento, significa el medio en el que se inocula inicialmente un microorganismo. Aun no se ha producido ninguna replicacion del microorganismo, lo que podna tener un efecto sobre el pH y/o la concentracion de diversos componentes del medio.

El termino "bovino", como se usa en el presente documento, significa un grupo diverso de ungulados de tamano mediano a grande, generalmente con pezunas hendidas, y al menos uno de los sexos con cuernos verdaderos. Los bovinos incluyen, pero sin limitacion, ganado domestico, bisontes, bufalos africanos, bufalos de agua, yak, y antflopes de cuatro cuernos o cuernos de espiral.

Las expresiones "cultivo" o "medio de cultivo", como se usa en el presente documento, significan el medio que contiene un microorganismo.

La expresion "penodo seco", como se usa en el presente documento, significa el penodo durante el cual no se produce el ordeno en una vaca; este penodo es para preparar a la vaca y su ubre para la siguiente lactancia.

El termino "endometritis", como se usa en el presente documento, significa una inflamacion o irritacion del revestimiento interno del utero, tambien denominado "endometrio".

La expresion "agotamiento de la glucosa", como se usa en el presente documento, significa el consumo, el metabolismo o la descomposicion de la mayor parte o la totalidad de la glucosa disponible en un cultivo. Por ejemplo, el "agotamiento" puede ser cuando la concentracion de la fuente de carbono esta en o por debajo de 10 mM.

Las expresiones "hormona liberadora de gonadotropina", "GnRH", "hormona liberadora de hormona luteinizante", "LHRH" y similares, como se usa en el presente documento, significan una hormona peptfdica responsable de la smtesis y la secrecion de la pituitaria anterior de las gonadotropinas, la hormona estimulante del folfculo (FSH) y la hormona luteinizante (LH). La secrecion de GnRH es pulsatil en todos los vertebrados, y es necesaria para la correcta funcion reproductiva.

El termino "inoculo", como se usa en el presente documento, significa una cantidad o cultivo de un microorganismo. Preferentemente, "inoculo" se refiere a una cantidad de un cultivo bacteriano.

Las expresiones "intramuscular", "por via intramuscular" y similares, como se usa en el presente documento, significan la inyeccion de una sustancia en un musculo.

El termino "irritacion", como se usa en el presente documento, significa una condicion o reaccion a un estimulo o agente que causa dano a las celulas en la superficie de un tejido.

Los terminos "lactato", "lactancia" y "lactacion", como se usa en el presente documento, significan la secrecion de leche de las glandulas mamarias y el penodo de tiempo en que una hembra produce leche para alimentar a sus cnas.

El termino "parto", como se usa en el presente documento, significa el momento en que un bovino da a luz a un ternero.

Las expresiones "microorganismo patogeno" o "patogeno", como se usa en el presente documento, significan un microbio capaz de causar una enfermedad o una afeccion patologica en un animal. Estas pueden incluir, pero sin limitacion, una bacteria, un virus, un hongo o una levadura.

Los terminos "embarazada" o "embarazo", como se usa en el presente documento, significan la fertilizacion y el desarrollo de una o mas cnas, conocidas como embriones o fetos, en el utero de una mujer.

El termino "progesterona", como se usa en el presente documento, significa una hormona esteroide del ciclo estral, el embarazo y la embriogenesis de los animales. La progesterona pertenece a una clase de hormonas llamadas progestagenos.

Los terminos "utero", "uterino" y similares, como se usa en el presente documento, significan el organo reproductor femenino sensible a las hormonas de la mayona de los mairnferos que nutren el embrion y el feto durante el embarazo.

Las expresiones "portador veterinariamente aceptable" o "portador", como se usa en el presente documento, se refiere a sustancias que, dentro del ambito del buen criterio medico, son adecuadas para su uso en contacto con los tejidos de animales, sin toxicidad indebida, irritacion, respuesta alergica y similares, en proporcion con una relacion razonable entre beneficios y riesgos, y eficaz para el uso previsto.

Tecnicas de cultivo

Las bacterias, incluida la Trueperella pyogenes, se pueden cultivar en un vaso que contiene medio de crecimiento que permitira la replicacion de la bacteria a un numero elevado, facilitando el aislamiento de la(s) protema(s) deseada(s). El medio de crecimiento puede estar en forma de un caldo nutritivo y puede contener cualquier numero de diversos ingredientes que sirvan como fuentes para diversos compuestos y componentes necesarios o utiles para el crecimiento. Esto incluye una(s) fuente(s) de nutrientes. Los componentes nutritivos de los medios de cultivo se seleccionan cuidadosamente y pueden incluir protemas, peptidos y aminoacidos. Estos componentes pueden servir como fuentes de carbono y nitrogeno para las bacterias. Los organismos mas exigentes pueden requerir la adicion de fuentes de nutrientes suplementarios.

Una fuente de energfa tambien es cntica en el medio de crecimiento. A menudo se suministra en forma de un carbohidrato. La sustancia mas comun anadida a los medios de cultivo como fuente de energfa para aumentar la velocidad de crecimiento de los organismos es la glucosa. Otros carbohidratos tambien pueden ser usados o requeridos. Las fuentes de carbono alternativas pueden incluir, pero sin limitacion, galactosa, diversos disacaridos, tal como la sacarosa, la lactosa o la maltosa, y oligosacaridos. Otras fuentes de carbono tambien pueden incluir glicerol, dextrano, dextrina, mono metil succinato y N-acetil glucosamina.

Metales y minerales esenciales tambien se pueden anadir en el medio. Estos componentes inorganicos de los medios de cultivo pueden incluir macro-componentes, tales como Na, K, Cl, P, S, Ca, Mg y Fe. Tambien pueden requerirse diversos micro-componentes, tales como Zn, Mn, Br, B, Cu, Co, Mo, V y Sr. PO4 tambien pueden requerirse en el medio. Puede estar presente en una concentracion de entre 10 mM y 200 mM, incluyendo 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195 y 200 mM.

Tambien es importante que el pH de un medio de cultivo se mantenga alrededor del intervalo necesario para el crecimiento de las bacterias deseadas. El pH del medio de cultivo puede estar entre 6,0 y 8,0, incluyendo 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8. 7,9 y 8,0. El uso de compuestos tampon a valores de pK espedficos es especialmente importante cuando se anaden carbohidratos fermentables como fuentes de energfa. Los fosfatos, acetatos, citratos, compuestos zwitterionicos y aminoacidos espedficos son ejemplos de agentes de tamponamiento que pueden anadirse a los medios de cultivo. Un efecto secundario potencial de dichos compuestos es su capacidad para quelar (o unirse) a cationes divalentes (por ejemplo, Ca++ y Mg++). El efecto de estos agentes de union o quelantes se puede ver en el crecimiento disminuido o en la incapacidad de crecer en absoluto, a menos que se tenga cuidado de complementar los cationes esenciales en la formulacion. El pH tambien puede regularse mediante la adicion de diversas soluciones acidas o basicas, tales como el bicarbonato de sodio y el hidroxido de sodio. El CO2 disuelto tambien se puede usar para ajustar el pH de un cultivo.

El medio de crecimiento tambien puede contener sustancias indicadoras de color, que pueden servir como una forma efectiva de detectar la fermentacion de carbohidratos espedficos en un medio de cultivo. Dichos compuestos deben cambiar de color de manera clara y rapida a valores cnticos de pH. La mayona de estos compuestos usados, tal como el rojo fenol, el bromocresol purpura y la fucsina, pueden ser toxicos; por lo tanto, es esencial usar bajas concentraciones de los mismos.

Los agentes selectivos tambien pueden ser necesarios en el medio de crecimiento. Se anaden sustancias qmmicas o antimicrobianos a los medios de cultivo para que sean selectivos para determinados microorganismos. Los agentes selectivos se eligen y se anaden a concentraciones espedficas para suprimir el crecimiento de organismos no deseados, o para mejorar el crecimiento de organismos deseados, en una muestra polimicrobiana. Es esencial establecer que los agentes selectivos no solo inhibiran a los organismos no deseados, sino que tambien permitiran el crecimiento desinhibido de los organismos deseados.

Los agentes gelificantes tambien pueden ser utiles en medios de crecimiento. La sustancia formadora de gel mas comun usada en los medios de cultivo es el agar. El agar se obtiene de algas agarofitas, principalmente de las especies Gelidium, Gracilaria y Pterocladia. Se extrae como una solucion acuosa a mas de 100 °C, se decolora, se filtra, se seca y se muele hasta obtener un polvo. El agar no es un agente gelificante inerte, y puede aportar nutrientes y/o agentes toxicos a los medios de cultivo, dependiendo de los procedimientos qmmicos usados en su produccion.

Tambien se pueden anadir otros componentes a los medios de crecimiento, con una finalidad espedfica. Estos pueden incluir diversos factores de crecimiento, sangre completa o componentes de la sangre y hormonas.

La temperatura a la que se mantiene el medio de cultivo es un factor importante con respecto a la cantidad de toxina producida. Para maximizar la cantidad de toxina producida, la temperatura del medio se puede mantener a 37 °C o menos. Preferentemente, la temperatura se puede mantener entre 21 °C y 36 °C. Mas preferentemente, la temperatura se puede mantener entre 25 °C y 34 °C. Lo mas preferentemente, la temperatura se puede mantener entre 28 °C y 32 °C.

Tecnicas de purificacion de protemas

En el presente documento se contemplan diversos procedimientos preparativos de purificacion de proteinas. Dichos procedimientos tienen como objetivo recuperar cantidades relativamente grandes de protema(s) purificada(s) para su uso posterior, incluida la preparacion de composiciones inmunogenicas. (Los procedimientos de purificacion anafftica son mas para la produccion de pequenas cantidades de proteinas para una diversidad de fines de investigacion o anaffticos). Las etapas principales de la purificacion preparativa de proteinas incluyen la extraccion, la purificacion y, si es necesario, la concentracion.

Con el fin de extraer una protema, puede ser necesario llevarla a la solucion. Esto se puede lograr rompiendo o alterando el tejido o las celulas que lo contienen. Existen varios procedimientos para lograr esto: congelacion y descongelacion repetidas, tratamiento con ultrasonidos, homogeneizacion por alta presion, filtracion o permeabilizacion por disolventes organicos. El procedimiento de eleccion depende de que tan fragil es la protema y que tan resistentes son las celulas. Generalmente, para la mayona de los fines convencionales, la cromatograffa en columna se usa para lograr la purificacion. Despues de este procedimiento de extraccion, las proteinas solubles estaran en el disolvente y se pueden separar de las membranas celulares, el ADN, etc., mediante centrifugacion. Puede ser necesario, antes o junto con la extraccion de una protema, inhibir las proteasas que pueden estar presentes y ser capaces de degradar la(s) protema(s) que se purifican. Existen multiples clases de proteasas que pueden estar presentes, incluyendo serina proteasas, cistema proteasas, metaloproteasas y proteasas asparticas. Estan disponibles diversos procedimientos para inhibir las diversas clases de proteasas, y pueden incluir, pero sin limitacion, la adicion de otras protemas que actuan para inhibir las proteasas, o diversos compuestos qmmicos que pueden inhibir la actividad de las proteasas.

Las estrategias de purificacion generalmente involucran algun tipo de etapa(s) cromatografica(s) y equipo. Un procedimiento de purificacion generalmente utiliza tres propiedades para separar protemas. En primer lugar, las protemas se pueden purificar de acuerdo con sus puntos isoelectricos, por ejemplo, pasandolas a traves de un gel de pH graduado o una columna de intercambio ionico. En segundo lugar, las protemas se pueden separar segun su tamano o peso molecular, tal como por medio de cromatograffa de exclusion de tamano o por SDS-PAGE (electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio y poliacrilamida). En tercer lugar, las protemas se pueden separar por polaridad/hidrofobicidad, tal como la cromatograffa ffquida de alto rendimiento o la cromatograffa de fase inversa. Un protocolo de purificacion de protemas puede contener una o mas etapas cromatograficas. Tambien existen otros procedimientos cromatograficos, incluyendo la cromatograffa de interaccion hidrofobica (separacion de compuestos basandose en la hidrofobicidad de la superficie) y la cromatograffa de afinidad (separacion de compuestos usando diversas resinas que tienen especificidad para los ligandos unidos al compuesto).

Si fuera necesaria la concentracion de la protema, esto se puede lograr usando diversas tecnicas, que pueden incluir la liofilizacion (secado de una protema) y la ultrafiltracion (concentracion usando membranas permeables selectivas). Composiciones inmunoaenicas

Las composiciones inmunogenicas de la presente invencion pueden administrarse a animales para inducir una respuesta inmunitaria eficaz contra T. pyogenes. En consecuencia, la presente invencion proporciona procedimientos para desencadenar una respuesta inmunitaria eficaz administrando a un animal una cantidad terapeuticamente efectiva de una composicion inmunogenica de la presente invencion descrita en el presente documento.

La pirrolisina se puede inactivar antes de su uso en una composicion inmunogenica. Los procedimientos de inactivacion pueden incluir, pero sin limitacion, el tratamiento con calor, el tratamiento con luz UV, el ajuste del pH (hacia arriba o hacia abajo) o el tratamiento con diversos agentes qmmicos. Dichos agentes qmmicos pueden incluir, pero sin limitacion: agentes reductores, tales como el ditiotreitol (DTT) o el beta-mercaptoetanol (BME); detergentes, tales como dodecilsulfato de sodio (SDS), Triton X-100 o CHAPS; agentes caotropicos, tales como fenol o urea; y desinfectantes reactivos, tales como formaldelmdo o gluteraldel'ndo. Los procedimientos para el uso de dichos procedimientos y agentes se logran facilmente usando tecnicas convencionales bien conocidas por los expertos en la tecnica.

Las composiciones inmunogenicas de la presente invencion pueden incluir uno o mas adyuvantes. Los adyuvantes incluyen, pero sin limitacion, el sistema adyuvante RIBI (Ribi Inc.; Hamilton, MT), alumbre, gel de hidroxido de aluminio, emulsiones de aceite en agua, emulsiones de agua en aceite tales como, por ejemplo, la solucion completa e incompleta de Freund, copolfmero de bloque (CytRx; Atlanta, GA), SAF-M (Chiron; Emeryville, CA), adyuvante AMPHIGEN®, Bordetella muerta, saponinas, tales como Stimulon™ QS-21 (Antigenics, Framingham, MA.), descritas en la patente de EE.UU. n.° 5.057.540, que se incorpora en el presente documento por referencia, y partfculas generadas a partir del mismo, como ISCOMS (complejos inmunoestimulantes), GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc.; Birmingham, AL) u otras fracciones de saponina, monofosforil lfpido A, adyuvante de amina lipfdica avridina, enterotoxina labil al calor de Escherichia coli (recombinante o de otro tipo), toxina del colera o dipeptido muramilo. Tambien es util el MPL™ (monofosforil lfpido A 3-O-desacilado; Corixa, Hamilton, MT), que se describe en la patente de EE.UU. n.° 4.912.094 y por la presente se incorpora por referencia. Tambien son adecuados para su uso como adyuvantes los analogos de ifpidos A sinteticos o los compuestos de fosfato de aminoalquil glucosamina (AGP), o derivados o analogos de los mismos, que estan disponibles en Corixa (Hamilton, MT), y que se describen en la patente de EE.UU n.° 6.113.918, incorporada por la presente por referencia. Tambien se puede usar una combinacion de Quil A y colesterol como adyuvante.

Polinucleotidos sinteticos, tales como oligonucleotidos que contienen motivos CpG (documento US 6.207.646 incorporado por la presente por referencia), tambien pueden usarse como adyuvantes. Los oligonucleotidos CpG, tales como los oligonucleotidos inmunoestimuladores de clase P, son utiles, incluidos los oligonucleotidos inmunoestimuladores de la clase P modificados en E. Los esteroles tambien pueden ser utiles como adyuvantes. Los adecuados para su uso pueden incluir p-sitosterol, estigmasterol, ergosterol, ergocalciferol y colesterol. Las composiciones adyuvantes pueden incluir ademas uno o mas polfmeros tales como, por ejemplo, DEAE dextrano, polietilenglicol, acido poliacnlico y acido polimetacnlico (por ejemplo, CARBOPOL®). Las composiciones adyuvantes pueden incluir ademas uno o mas estimulantes Th2 tales como, por ejemplo, Bay R1005(R) y aluminio. Las composiciones adyuvantes pueden incluir ademas uno o mas agentes inmunomoduladores, tales como compuestos de amonio cuaternario (por ejemplo, DDA), interleucinas, interferones u otras citoquinas.

Se ha demostrado que varias citoquinas o linfoquinas tienen actividad moduladora de la inmunidad y, por lo tanto, pueden usarse como adyuvantes. Estas pueden incluir, pero sin limitacion, las interleucinas 1-a, 1-p, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12 (vease, por ejemplo, el documento US 5.723.127), 13, 14, 15, 16, 17 y 18 (y sus formas mutantes), los interferones-a, p y y, el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrofagos (vease, por ejemplo, el documento US 5.078.996 y ATCC numero de referencia 39900), el factor estimulante de colonias de macrofagos, el factor estimulante de colonias de granulocitos, GSF, y los factores de necrosis tumoral a y p. Otros adyuvantes utiles en la presente invencion incluyen quimiocinas, que incluyen, sin limitacion, MCP-1, MIP-1a, MIP-1p y RANTES. Las moleculas de adhesion, tales como una selectina, por ejemplo, L-selectina, P-selectina y E-selectina tambien pueden ser utiles como adyuvantes. Otros adyuvantes utiles incluyen, sin limitacion, una molecula similar a la mucina, por ejemplo, CD34, GlyCAM-1 y MadCAM-1; un miembro de la familia de integrinas tales como LFA-1, VLA-1, Mac-1 y p150.95; un miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas como PECAM, ICAM (por ejemplo, ICAM-1, ICAM-2 e ICAM-3), CD2 y LFA-3; moleculas coestimuladoras tales como CD40 y CD40L; factores de crecimiento que incluyen factor de crecimiento vascular, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento epidermico, B7.2, PDGF, BL-1 y factor de crecimiento endotelial vascular; moleculas receptoras que incluyen Fas, receptor de TNF, Fit, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2 y DR6. Otra molecula adyuvante mas incluye la caspasa (ICE).

Los portadores cationicos tambien pueden ser utiles en composiciones adyuvantes. Los portadores cationicos adecuados incluyen, sin limitaciones, dextrano, dextrano-DEAE (y derivados de los mismos), PEG, gomas de guar, derivados de quitosan, derivados de policelulosa como hidroxietilcelulosa (HEC), polietilenimeno, poliaminos, como polilisina y similares.

Las composiciones inmunogenicas de la presente invencion se pueden fabricar en diversas formas, dependiendo de la via de administracion. Por ejemplo, las composiciones inmunogenicas se pueden fabricar en forma de soluciones o dispersiones acuosas esteriles, adecuadas para su uso inyectable, o en formas liofilizadas usando tecnicas de liofilizacion. Las composiciones inmunogenicas liofilizadas se mantienen tipicamente a aproximadamente 4 °C, y pueden reconstituirse en una solucion estabilizadora, por ejemplo, una solucion salina o HEPES, con o sin adyuvante. Las composiciones inmunogenicas tambien pueden fabricarse en forma de suspensiones o emulsiones.

Estas composiciones inmunogenicas pueden contener aditivos adecuados para la administracion a traves de cualquier via de administracion convencional. Las composiciones inmunogenicas de la invencion pueden prepararse para la administracion a sujetos en forma de, por ejemplo, lfquidos, polvos, aerosoles, comprimidos, capsulas, comprimidos o capsulas con recubrimiento enterico, o supositorios. Por lo tanto, las composiciones inmunogenicas tambien pueden estar en forma de, pero sin limitacion, suspensiones, soluciones, emulsiones en vehmulos oleosos o acuosos, pastas y formulaciones implantables de liberacion sostenida o biodegradables. En una realizacion de una formulacion para la administracion parenteral, el principio activo se proporciona en forma seca (es decir, en polvo o granular) para la reconstitucion con un vehmulo adecuado (por ejemplo, agua esteril libre de pirogenos) antes de la administracion parenteral de la composicion reconstituida. Otras formulaciones utiles administrables por via parenteral incluyen aquellas que comprenden el principio activo en forma microcristalina, en una preparacion liposomal, o como un componente de un sistema de polfmero biodegradable. Las composiciones para liberacion sostenida o implantacion pueden comprender materiales polimericos o hidrofobos farmaceuticamente aceptables, tales como una emulsion, una resina de intercambio ionico, un polfmero poco soluble o una sal poco soluble.

Las composiciones inmunogenicas generalmente comprenden un portador veterinariamente aceptable. Dichos portadores incluyen, sin limitacion, agua, solucion salina, solucion salina tamponada, tampon fosfato, soluciones alcoholicas/acuosas, emulsiones o suspensiones. Otros diluyentes, adyuvantes y excipientes empleados convencionalmente pueden anadirse de acuerdo con tecnicas convencionales. Dichos portadores pueden incluir etanol, polioles y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales y esteres organicos inyectables. Tambien se pueden emplear tampones y agentes de ajuste de pH, e incluyen, sin limitacion, sales preparadas a partir de un acido o base organico. Los tampones representativos incluyen, sin limitacion, sales de acidos organicos, tales como sales de acido dtrico (por ejemplo, citratos), acido ascorbico, acido gluconico, acido carbonico, acido tartarico, acido succmico, acido acetico, acido ftalico, Tris, clorhidrato de trimetilamina o tampones de fosfato. Los portadores parenterales pueden incluir solucion de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa, trehalosa, sacarosa, Ringer lactato o aceites fijos. Los portadores intravenosos pueden incluir reabastecedores de lfquidos y nutrientes, reabastecedores de electrolitos, tales como los basados en la dextrosa de Ringer, y similares. Tambien se pueden proporcionar conservantes y otros aditivos tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes (por ejemplo, EGTA; EDTA), gases inertes y similares en los portadores farmaceuticos. La presente invencion no esta limitada por la seleccion del portador. La preparacion de estas composiciones farmaceuticamente aceptables, a partir de los componentes descritos anteriormente, que tienen un pH, isotonicidad, estabilidad y otras caractensticas convencionales adecuadas, esta dentro de la experiencia de la tecnica. Vease, por ejemplo, textos tales como Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a ed., Lippincott Williams & Wilkins, pub., 2000; y The Handbook of Pharmaceutical Excipients, 4a edicion, eds. R.C. Rowe y col., APhA Publications, 2003.

Tecnicas recombinantes

En otras realizaciones mas de la invencion, la composicion inmunogenica puede comprender una vacuna recombinante. Dichas vacunas recombinantes podnan comprender una protema recombinante, o como alternativa un vector y una insercion heterologa que codifican dicha protema recombinante. Las inserciones heterologas en algunas realizaciones comprenden una o mas secuencias de acido nucleico que codifican las protemas de la presente invencion. La insercion puede comprender opcionalmente un promotor heterologo, tal como, por ejemplo, promotores sinteticos conocidos en la tecnica. Como alternativa, los promotores del vector huesped pueden ejercer control transcripcional sobre la expresion de las inserciones. Ejemplos no limitantes adecuados de promotores, que pueden ser nativos o heterologos, dependiendo de la eleccion del vector, son el promotor de vacuna H6, el promotor de vaccinia I3L, el promotor poxviral 42K, el promotor de vaccinia 7.5K, y el promotor de vaccinia Pi.

En algunas realizaciones, los vectores pueden ser vectores virales, que incluyen, sin limitaciones, vectores de virus vaccinia y pox, tales como parapox, racoonpox, swinepox y diferentes vectores avipox (por ejemplo, cepas de canarypox y fowlpox). En general, las secuencias que no son esenciales para el huesped viral son sitios de insercion adecuados para las inserciones de la presente invencion. Las cepas enumeradas anteriormente estan bien caracterizadas en la tecnica, y algunos sitios de insercion en estos vectores son bien conocidos.

Existen varios procedimientos o tecnicas conocidas que pueden usarse para clonar y expresar las secuencias de nucleotidos de la presente invencion. Por ejemplo, las secuencias pueden aislarse como fragmentos de restriccion y clonarse en vectores de clonacion y/o expresion. Las secuencias tambien pueden amplificarse por RCP y clonarse en vectores de clonacion y/o expresion. Como alternativa, pueden clonarse mediante una combinacion de estos dos procedimientos. Las tecnicas convencionales de biologfa molecular conocidas en la tecnica, y no descritas espedficamente, pueden seguirse generalmente como se describe en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1989); Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley & Sons, Nueva York (1988); Watson y col., Recombinant DNA, Scientific American Books, Nueva York; Birren y col (eds) Genome Analysis: A Laboratory Manual Series, vols. 1-4 Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1998); y la metodologfa expuesta en los documentos US 4.666.828; uS 4.683.202; US 4.801.531; US 5.192.659 y US 5.272.057. La reaccion en cadena de la polimerasa (RCP) se lleva a cabo generalmente como se describe en PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego, CA (1990).

La presente invencion abarca el uso de sistemas de expresion procarioticos y eucarioticos, incluidos vectores y celulas huesped, que pueden usarse para expresar formas truncadas y de longitud completa de los polipeptidos recombinantes expresados por las secuencias de nucleotidos de la presente invencion. Se puede utilizar una diversidad de sistemas de vectores de expresion de huesped para expresar los polipeptidos de la presente invencion. Dichos sistemas de expresion de huesped tambien representan vetffculos mediante los cuales se pueden clonar las secuencias codificantes de interes, y la(s) protema(s) expresada(s) se purifica(n) posteriormente. La presente invencion proporciona ademas celulas huesped que pueden, cuando se transforman o se transfectan con el vector o secuencia de nucleotidos adecuadas, expresar el producto genico del polipeptido codificado de la invencion. Dichas celulas huesped incluyen, pero sin limitacion, microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, Escherichia coli, Bacillus subtilis) transformados con ADN de bacteriofago recombinante, ADN plasirndico o vectores de expresion de ADN cosmido que contienen secuencias codificantes; levadura (por ejemplo, Saccharomyces, Pichia) transformada con vectores de expresion de levadura recombinantes que contienen las secuencias codificantes; sistemas de celulas de insecto infectados con vectores de expresion de virus recombinantes (por ejemplo, baculovirus) que contienen las secuencias codificantes; sistemas de celulas vegetales infectados con vectores de expresion de virus recombinantes (por ejemplo, el virus del mosaico de la coliflor, CaMV; el virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresion de plasmidos recombinantes (por ejemplo, plasmido Ti) que contienen secuencias codificantes; o sistemas celulares de marnfferos (por ejemplo, COS, ^c H^o , BHK, 293, 3T3) que albergan construcciones de expresion recombinante que contienen promotores procedentes del genoma de celulas de mamfferos (por ejemplo, el promotor de metalotionema), o de virus de mamfferos (por ejemplo, el promotor tardm del adenovirus; el promotor 7.5K del virus vaccinia), y las secuencias codificantes.

Los vectores de la invencion se pueden obtener de, pero sin limitacion, plasmidos bacterianos, bacteriofagos, episomas de levadura, elementos cromosomicos de levadura, virus de mamfferos, cromosomas de mamfferos y combinaciones de los mismos, tales como los derivados de elementos geneticos de plasmidos y bacteriofagos que incluyen, pero sin limitacion, cosmidos y fagemidos.

Los vectores de la presente invencion se pueden usar para la expresion de polipeptidos. En general, los vectores de la invencion incluyen regiones reguladoras que actuan en cis, unidas de forma operacional al polinucleotido que codifica los polipeptidos a expresar. Las regiones reguladoras pueden ser constitutivas o inducibles. Los factores que actuan en trans adecuados son suministrados por el huesped por un sistema de traduccion in vitro, por un vector complementario, o por el propio vector en la introduccion en el huesped.

Para facilitar el aislamiento de la pirrolisina, se puede fabricar un polipeptido de fusion, en el que la pirrolisina esta unida a un polipeptido heterologo, que permite el aislamiento mediante cromatograffa de afinidad. Preferentemente, un polipeptido de fusion se fabrica usando uno de los sistemas de expresion conocidos por los expertos en la tecnica. Por ejemplo, el polinucleotido que codifica la pirrolisina esta unido en su extremo 5' o 3' a un acido nucleico que codifica un polipeptido heterologo. Los acidos nucleicos estan unidos en el marco de lectura de codones adecuado, para permitir la produccion de un polipeptido de fusion, en el que el extremo amino y/o carboxilo de la pirrolisina se fusiona con un polipeptido heterologo, lo que permite la recuperacion simplificada del anffgeno como un polipeptido de fusion. El polipeptido de fusion tambien puede evitar que el anffgeno se degrade durante la purificacion. En algunos casos, puede ser deseable eliminar el polipeptido heterologo despues de la purificacion. Por lo tanto, tambien se contempla que el polipeptido de fusion comprenda un sitio de escision en la union entre la pirrolisina y el polipeptido heterologo. El sitio de escision consiste en una secuencia de aminoacidos que se escinde con una enzima espedfica para la secuencia de aminoacidos en el sitio. Ejemplos de dichos sitios de escision que se contemplan incluyen el sitio de escision de enterocinasa (escindido por enterocinasa), el sitio de escision del factor Xa (escindido por el factor Xa) y el sitio de escision GENENASE (escindido por GENENASE; New England Biolabs; Beverly, Mass.).

Un ejemplo de un sistema de expresion procariota para producir polipeptidos recombinantes para su uso en composiciones inmunogenicas es el sistema de fusion genica de glutation S-transferasa (GST) (Amersham Pharmacia Biotech; Piscataway, NJ). Otro procedimiento para producir la protema de fusion es un procedimiento que vincula una secuencia de ADN que codifica una etiqueta de polihistidina en el marco con el ^a Dⁿ que codifica el anffgeno. La etiqueta permite la purificacion del polipeptido de fusion mediante cromatograffa de afinidad de metales, preferentemente cromatograffa de afinidad de mquel. El sistema Xpress (Invitrogen; Carlsbad, CA) es un ejemplo de un kit comercial disponible para fabricar y luego aislar protemas de fusion polihistidina-polipeptido. Ademas, el sistema de purificacion y fusion pMAL (New England Biolabs; Beverly, MA) es otro ejemplo de un procedimiento para fabricar un polipeptido de fusion, en el que una protema de union a maltosa (MBP) se fusiona con el anffgeno. La MBP facilita el aislamiento del polipeptido de fusion por cromatograffa de afinidad de amilosa. Otros socios de fusion, y procedimientos para generar dichas fusiones, estan facilmente disponibles y son conocidos por los expertos en la tecnica. Estas fusiones se pueden usar en su totalidad como la composicion inmunogenica, o se pueden escindir en la union entre el anffgeno recombinante y el polipeptido heterologo.

Los vectores de la invencion pueden incluir cualquier elemento ffpicamente incluido en un vector de expresion o visualizacion, que incluyen, pero sin limitacion, origen de secuencias de replicacion, uno o mas promotores, genes de resistencia a antibioticos, secuencias pepffdicas Kder o senal, diversas secuencias de etiquetas, sitios de restriccion, sitios de union a ribosomas, potenciadores de la traduccion (secuencias capaces de formar estructuras de bucle de vastago para la estabilidad posterior de la transcripcion del ARNm), secuencias que codifican aminoacidos que carecen de un codon de parada, y secuencias que codifican una protema de la cubierta bacteriana.

La presente invencion se ilustra con mas detalle, pero no se limita de ningun modo a los siguientes ejemplos.

Ejemplos

Ejemplo 1. Procedimiento mejorado para la expresion, aislamiento y purificacion de la pirrolisina.

El medio usado para todas las etapas de fermentacion fue una solucion de triptonona/extracto de levadura/Tween 80/glucosa/fosfato/hemina esterilizada por calor. Se anadio una solucion esteril de vitaminas filtrada y otra solucion de glucosa esterilizada con filtro al medio despues de la esterilizacion por calor. Se descongelo una ampolla de Trueperella pyogenes de tipo natural congelada y se uso para inocular un matraz (a ~30 % de volumen de llenado) que contema el medio (0,5 % v/v); esto se incubo durante 16-28 horas, a 37 °C, 100 rpm en una incubadora de CO2 configurada al 5 %. Un segundo matraz que contema el medio fue luego inoculado con 10 % v/v de cultivo del primer matraz; esto se incubo luego durante 4 a 8 horas, nuevamente a 37 °C, 100 rpm en una incubadora de CO2 configurada al 5 %. A continuacion se inoculo un fermentador con 0,5 % v/v de cultivo del segundo matraz. La temperatura se mantuvo a 37 °C y el pH inicial fue de 7,2 a 7,4. Se dejo que el pH cayera a pH 6,15, y luego se controlo en una direccion solo con NaOH al 30 %. El oxfgeno disuelto se mantuvo al 5 % usando oxfgeno puro a un caudal maximo de 0,05 wm, y el vaso se agito a una velocidad lenta (20 rpm en la escala de 2 litros). El fermentador se enriquecio con una solucion de EGTA ajustada a pH 6,15, a una concentracion final de 2 g/l justo antes del agotamiento de la glucosa. En este mismo tiempo, se anadio solucion de lactosa filtrada esteril a una concentracion final de 4 a 8 g/l. Luego se determino el tiempo de recoleccion a traves de un analisis de cromatograffa lfquida de rendimiento ultra (UPLC) en proceso, nominalmente alrededor de 48 a 80 horas. El cultivo de recoleccion se enfrio entonces a < 20 °C, y luego las celulas fueron extrafdas por centrifugacion y filtracion. El sobrenadante se concentro de 10 a 30 veces mediante filtracion de flujo tangencial, usando membranas UF de acetato de celulosa modificadas a 10 kDa (corte). El sobrenadante se diafiltro luego con 4 a 5 lavados usando un tampon que contema MES 50 mM, Na2SO4500 mM, pH 5,8. El retenido diafiltrado se filtro luego de forma esteril y se preparo para la purificacion.

Con respecto a las mejoras del procedimiento corriente arriba, historicamente, el cultivo produce la cantidad maxima de pirrolisina a las 4 h en la fase estacionaria, que es cuando se produce el agotamiento de la glucosa. Sin embargo, el organismo comienza a producir proteasas, que con el tiempo degradan completamente la toxina. Por lo tanto, la recoleccion de las celulas se realizo ffpicamente de 3 a 4 h despues del agotamiento de la glucosa, cuando la DO a 600 nm fue ffpicamente H3,7. El pH se ajusto luego de 5,7 a 5,9 para inhibir aun mas las proteasas. Una mejora en este procedimiento fue el descubrimiento de que las proteasas se desactivaron con la adicion de EGTA. Por lo tanto, la adicion de EGTA antes o en el momento del agotamiento de la glucosa permitio que la recoleccion de las celulas coincidiera con el rendimiento maximo, ya que la inactivacion de las proteasas y la posterior alimentacion del cultivo con una fuente de carbono reciente, permitio el logro de rendimientos mas altos. Ademas, la concentracion del sobrenadante se realizo anteriormente usando casetes de ultrafiltracion con PES de 10 kDa; la recuperacion de la OLP fue de solo alrededor del 65 %. Sin embargo, el cambio a los casetes de ultrafiltracion con acetato de celulosa modificada (por ejemplo, Hydrosart) de 10 kDa, permitio mejorar la recuperacion de la OLP a aproximadamente el 100 %.

Otras mejoras a este procedimiento incluyeron el tamponamiento con fosfato, la adicion de una solucion de vitaminas, asf como la adicion de magnesio al cultivo. Con respecto al tamponamiento con fosfato, se determino que el fosfato de sodio 25 mM a pH 6,8 era optimo. En cuanto a la solucion de vitaminas, se anadio la siguiente composicion: Vitamina B12 (2,5 mg/l); mioinositol (50 mg/l); uracilo (50 mg/l); acido nicoffnico (10 mg/l); pantotenato de calcio (50 mg/l); piridoxal-HCl (25 mg/l); piridoxamina-2HCl (25 mg/l); riboflavina (50 mg/l); tiamina-HCl (25 mg/l); acido p-aminobenzoico (5 mg/l); biotina (5 mg/l); acido folico (20 mg/l); niacinamida (25 mg/l); y p-NAD (62.5 mg/l). Con respecto a la adicion de magnesio, esto podffa suministrarse en forma de citrato de magnesio, gluconato de magnesio o sulfato de magnesio.

Las mejoras adicionales a este procedimiento incluyeron estrategias de fermentacion por lotes y/o por lotes alimentados, usando una suplementacion de fuente de carbono unica o multiple. La fuente de carbono tambien puede contener factores nutricionales y/o sales adicionales, tal como la hemina y el fosfato. Las estrategias de optimizacion de la fermentacion planificadas para maximizar el crecimiento y la produccion de pirrolisina incluyen el control de los niveles de oxfgeno disuelto, redox, pH y dioxido de carbono. La temperatura de incubacion tambien se puede mejorar, ya que algunos trabajos experimentales han indicado que una temperatura de funcionamiento mas baja puede ser beneficiosa.

Con respecto al procesamiento corriente abajo y la purificacion de la pirrolisina, la protema se purifico a traves de cromatograffa de interaccion hidrofoba (HIC) usando una resina de fenil sefarosa equilibrada con MES 50 mM, Na2SO4500 mM, pH 5,8; se eluyo en MES 50 mM pH 5,8. La protema purificada se concentro luego, seguido de un intercambio de tampon en tampon fosfato (sodio o potasio). A continuacion se determino la actividad hemolftica, para asegurar que la protema activa se ha^a purificado. Esto se hizo por dilucion en serie de la pirrolisina con el tampon de ensayo, seguido de incubacion a 37 °C de la pirrolisina con globulos rojos de caballo. Luego se centrifugo para sedimentar los globulos rojos intactos, el material soluble (lisado) se transfirio a una placa nueva, se midio la DO a 405 nm y se representaron los resultados. Las unidades hemoltticas (UH) se determinaron en el punto medio de la curva, y la pirrolisina se considero desintoxicada cuando las unidades hemoltticas eran inferiores a 1000 UH. Luego se usaron UPLC y SDS-PAGE para confirmar la identidad de la protema aislada. Finalmente, la pirrolisina se inactivo mediante el tratamiento con 0,25-0,5 % (v/v) de formalina durante 24-48 h a 20 °C, y luego se filtro de forma esteril.

Ejemplo 2. Mejoras adicionales para aumentar el nivel de expresion de la pirrolisina.

Las materias primas necesarias para preparar el medio de semilla de metritis se muestran en las Tablas 1 y 2 (incluidas las concentraciones objetivo).

Tabla 1 Solucion de cloruro de hemina

Tabla 2 Medio de semilla de metritis

La solucion de cloruro de hemina siempre se prepara fresca el dfa requerido. El polvo de cloruro de hemina se disuelve primero en el volumen adecuado de NaOH 1 M y, cuando esta completamente disuelto, se completa el volumen con agua destilada.

Debido a la alta viscosidad del polisorbato 80, es mas facil pesar este componente directamente en un vaso de precipitados de vidrio como primera etapa para preparar el medio de semilla de metritis. Anada aproximadamente el 60 % del volumen final de agua destilada al vaso de precipitados con un agitador magnetico y proceda a mezclar y calentar la solucion a aproximadamente 50 a 60 °C. Tenga en cuenta que esta solucion se pondra turbia cuando se caliente. Anada lentamente todos los demas componentes en el orden que se muestra en la Tabla 2. Disuelva completamente todos los ingredientes y complete el volumen con agua destilada. Esterilice con calor el medio a 121 °C durante 15 a 20 minutos. El medio tiene una vida util de 7 dfas a temperatura ambiente. Esta corta vida util se debe al contenido de hemina. Si se prepara un medio basal sin hemina, esto prolongana la vida util a aproximadamente 3 meses a temperatura ambiente. La solucion de cloruro de hemina esterilizada con filtro se podna anadir a las porciones de un medio basal en volumen segun se requiera. Sin embargo, para determinados mercados, esto requerira la prueba del material por agentes extranos antes de su uso.

Para todos los estudios de fermentacion realizados hasta la escala piloto de 35 l inclusive, solo han sido necesarias dos etapas de semilla para proporcionar un volumen de inoculo suficiente. La primera etapa puede convertirse en fase estacionaria y tiene mucha flexibilidad en su penodo de incubacion. La segunda etapa se usa para "refrescar" las celulas y se transfiere a la etapa de fermentacion en crecimiento exponencial.

Los matraces desechables Corning Erlenmeyer con paredes lisas y tapas ventiladas se han usado para todos los estudios de fermentacion hasta la fecha. Sin embargo, otros matraces de cultivo desechables o no desechables deben ser igualmente buenos. Para todas las etapas de semillas, los matraces se llenaron hasta el 32 % del volumen total y despues de la inoculacion, se incubaron en una incubadora de agitacion de CO2 establecida al 5 % y 100 rpm. Una incubadora de CO2 se uso por primera vez debido a un crecimiento muy mejorado. Sin embargo, desde entonces se ha desarrollado un medio de crecimiento mucho mejor, por lo que una incubadora convencional ahora puede ser satisfactoria (estos estudios no se han realizado).

Un experimento que probo el numero maximo de pasajes de semillas de la semilla maestra de T. pyogenes mostro que no habfa ningun efecto perjudicial sobre el rendimiento de la pirrolisina. El diseno experimental se baso en un volumen teorico de cultivo de fermentacion final de 10.000 l, por lo que 7 pasajes de la semilla maestra senan suficientes para este procedimiento de ampliacion. Esto se baso en la preparacion de un banco de semillas de trabajo con 3 pasajes generosos de la semilla maestra.

El experimento probo la productividad de la pirrolisina en un fermentador piloto de 35 l inoculado con el 6° pasaje de la semilla maestra. Los primeros 5 pasajes eran volumenes de 40 ml en matraces de 125 ml y la 6a etapa de semilla fue de 320 ml en un matraz de 1000 ml.

Etapa de semilla 1 (125 ml: ejemplo de escala)

Descongele y abra la ampolla de semillas de trabajo de T. pyogenes asepticamente. Inocule 40 ml de medio de semilla de metritis en un matraz de pared lisa de 125 ml con un 0,5 % v/v de ampolla. Incube aerobicamente de 16­ 28 horas a 37 °C en una plataforma de agitacion a 100 rpm en una incubadora de CO2 al 5 %. La DO600 debe estar entre 3 y 7 y no debe haber glucosa residual restante (consulte la seccion 3.6.2). El cultivo debe probarse para determinar su pureza con estnas en placas de agar de sangre de oveja o caballo (consulte la seccion 3.6.5).

Etapa de semilla 2 (125 ml: ejemplo de escala)

Inocule 40 ml de medio de semilla de metritis en un matraz de pared lisa de 125 ml con 10 % v/v de la etapa de la semilla 1(SS1). Incube aerobicamente de 4-8 horas a 37 °C en una plataforma de agitacion a 100 rpm en una incubadora de CO2 establecida al 5 %. La DO600 debe estar entre 1 y 3 y asegurarse que queda algo de glucosa residual restante (consulte la seccion 3.6.2) en la etapa de semilla 2 (SS2) antes de inocular el(los) fermentador(es). El cultivo debe probarse para determinar su pureza con estnas en placas de agar de sangre de oveja o caballo (consulte la seccion 3.6.5).

Las materias primas necesarias para preparar el medio basal de produccion de metritis se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3 Medio basal de produccion de metritis (incluidas las concentraciones objetivo)

La preparacion general del medio basal de produccion de metritis es la misma que la descrita anteriormente para el medio de semilla de metritis. El medio es similar, pero no tiene adicion de cloruro de hemina y una concentracion de glucosa mas baja. Esterilice con calor el volumen requerido de medio basal en fermentadores a 121 °C durante 30 a 60 minutos.

Este medio reemplaza a un medio basado en caldo de soja tnptica (TSB) que era sensible a altas cargas de esterilizacion por calor, por lo que los rendimientos de toxinas se redujeron considerablemente. Este medio mejorado es mucho mas tolerante al calor, pero la hemina se excluyo deliberadamente de este estudio de desarrollo para comparar solo triptona con concentraciones de glucosa altas (equivalentes a TSB de aproximadamente 2,5 g/l) y bajas (0,5 g/l) versus TSB. La intencion fue luego comparar el medio mejorado esterilizado por calor con y sin hemina. Este trabajo ya se ha realizado.

Despues de que el medio basal de produccion de metritis se haya esterilizado por calor en(los) fermentador(es) y se haya enfriado, el medio de produccion completo de metritis se prepara anadiendo los componentes 1 y 2 esterilizados con filtro a las velocidades que se muestran en la Tabla 4. La concentracion de glucosa residual de este medio debe ser 14 ± 2 mM. Las soluciones de EGTA y lactosa se anaden aproximadamente de 10 a 12 horas despues de la inoculacion cuando la glucosa residual es inferior a 8 mM y la DO600 es mayor que 2,5 (consulte las secciones 3.5.4 y 3.5.6, respectivamente). La solucion de lactosa se anade como componente numero 4a o 4b, dependiendo de si se emplean estrategias en embolada o de alimentacion continua.

Tabla 4 Medio de produccion completo de metritis

Solucion madre de vitaminas

Las materias primas necesarias para preparar la solucion madre de vitaminas se muestran en la Tabla 5. La adicion combinada de vitamina K1 y K2 sf mostro mejoras en el rendimiento tanto en estudios de fermentacion como de matraz. Estos no se han incluido en la solucion madre de vitaminas actual, ya que se requiere mas trabajo para investigar si esta complejidad adicional esta justificada.

No se sabe si solo una o ambas de las vitaminas Ki y K2 son beneficiosas. Las vitaminas Ki y K2 no son solubles en agua y se disolvieron en DMSO para los experimentos realizados.

Tabla 5 Solucion madre de vitaminas (incluidas las concentraciones objetivo)

Es mas facil preparar una solucion madre no esteril de vitaminas que pueda congelarse a -20 °C y almacenarse hasta por 12 meses. Anada aproximadamente del 20 al 30 % del volumen final de agua destilada fna en un vaso de precipitados de vidrio, una botella Schott o un matraz Erlenmeyer de vidrio (o cualquier otro vaso adecuado) con un agitador magnetico. Pese cada componente de uno en uno y enjuague en el vaso con agua destilada fna con agitacion vigorosa. Complete el volumen y asegurese de que todos los ingredientes esten completamente disueltos y luego aplique 40 ml de partes alfcuotas no esteriles y congele a -20 °C (o mas fno, si lo desea).

Solucion de vitaminas/hemina

Es posible esterilizar por calor el componente de cloruro de hemina del medio basal de produccion de metritis durante 20 a 30 minutos sin afectar significativamente los rendimientos de toxinas. Se requiere trabajo adicional para determinar si el medio que contiene cloruro de hemina puede esterilizarse por calor usando cargas de calor mas altas sin afectar significativamente los rendimientos de la pirrolisina. Esta sera una parte importante del diseno de fabricacion de antfgenos para permitir la robustez y el establecimiento de una plataforma global de vacunas.

Australia, por ejemplo, solo aceptana una adicion de cloruro de hemina esterilizada por calor o irradiada con rayos gamma (es decir, la adicion de cloruro de hemina esterilizada con filtro no sena aceptable para las autoridades reguladoras australianas sin pruebas de agentes extranos). Sin embargo, hasta que esto se haya demostrado experimentalmente, se ha usado una solucion de vitaminas/hemina esterilizada por filtracion como un aditivo medio despues de la esterilizacion por calor. Es importante preparar esta solucion el dfa de la inoculacion del(de los) fermentador(es) debido a su corta vida util. Se uso una solucion combinada de hemina y vitaminas para minimizar el aumento de volumen en los fermentadores (de lo contrario, se requerinan 40 ml/l de una solucion de cloruro de hemina y vitaminas). Las materias primas necesarias para preparar la solucion de vitaminas/hemina se muestran en la Tabla 6.

Tabla 6 Solucion de vitaminas/hemina (incluidas las concentraciones objetivo)

La solucion de vitaminas/hemina siempre se prepara fresca en el dfa requerido. Descongele la cantidad requerida de solucion madre de vitaminas y mezcle agitando. El cloruro de hemina primero se disuelve en el volumen adecuado de NaOH 1 M y cuando esta completamente disuelto, se anade al volumen requerido de solucion de vitaminas no esteril. Esto produce un volumen ligeramente mayor que el total requerido por la cantidad de NaOH anadido, pero este aumento del 1 % es insignificante. Hasta que se resuelva el efecto de la esterilizacion por calor sobre la hemina en el medio basal, este procedimiento de preparacion es satisfactorio. Si se decide permanecer con una solucion de hemina/vitaminas esterilizada con filtro, entonces esto podna realizarse con mayor precision preparando la solucion madre de vitaminas a un 95 % de volumen y luego completando el volumen despues de la adicion de hemina. Esterilice con filtro la solucion y almacene de 2 a 8 °C hasta que este lista para su uso el dfa de la preparacion.

Tabla 7 Solucion de glucosa al 50 % (incluidas las concentraciones objetivo)

Coloque cerca del hervor aproximadamente el 50 % del volumen final de agua destilada en un vaso de precipitados de vidrio cubierto con papel de aluminio (o similar) con un agitador magnetico. Anada lentamente el polvo de glucosa y continue agitando mientras se cubre con calentamiento (evitando que la solucion hierva) hasta que este completamente disuelto. Complete el volumen, deje enfriar y esterilice por filtracion.

Tabla 8 Solucion de EGTA al 10 % pH 5,8 (incluidas las concentraciones objetivo)

Anada EGTA a aproximadamente el 60 % del volumen final de agua destilada fna en un vaso de precipitados de vidrio con un agitador magnetico. Con agitacion continua, mida el pH inicial de la solucion que aparecera como una suspension en esta etapa. Anada rapidamente el 80 % del 30 % p/v total de la solucion de NaOH requerida con un pH objetivo de 5,8 cuando este completamente disuelto. Cuando este casi disuelto, anada lentamente el resto del 30 % p/v de NaOH requerido para alcanzar el pH objetivo, asf como para lograr una disolucion completa. Es facil sobrepasar el pH objetivo al final de la preparacion, por lo que en este punto puede ser mejor usar NaOH 1 M para el ajuste final. Si el pH objetivo se sobrepasa ligeramente, se puede volver a ajustar con una solucion de HCl 2 M (o similar). Despues de ajustar con precision a un pH de 5,8, complete el volumen y esterilice con filtro.

Tabla 9 Solucion de lactosa al 50 % (incluidas las concentraciones objetivo)

Coloque cerca del hervor aproximadamente el 50 % del volumen final de agua destilada en un vaso de precipitados de vidrio cubierto con papel de aluminio (o similar) con un agitador magnetico. Anada lentamente el polvo de lactosa y continue agitando mientras se cubre con calentamiento (evitando que la solucion hierva) hasta que este completamente disuelto. Complete el volumen, deje enfriar y esterilice por filtracion.

Tabla 10 Solucion de lactosa al 6 % (incluidas las concentraciones objetivo)

Anada polvo de lactosa a aproximadamente el 80 % del volumen final de agua destilada en un vaso de precipitados con un agitador magnetico y mezcle hasta que este completamente disuelto. complete el volumen y esterilice con filtro.

Escalabilidad de la fermentacion

El procedimiento de fermentacion de T. pyogenes se ha desarrollado con exito a escalas de 0,5, 2, 5 y 35 l. Por lo general, los cambios en las propiedades fisicoqmmicas mas desafiantes se observan cuando los procedimientos de fermentacion se escalan de laboratorio a escala piloto. Sin embargo, no se observaron problemas durante el aumento a escala a una escala piloto de 35 l, y el procedimiento demostro una buena escalabilidad desde pequenos fermentadores a escala de laboratorio. Basandose en la buena escalabilidad del procedimiento observada hasta el momento, no se esperan problemas al aumentar a escala los vasos de produccion.

La Tabla 11 resume los parametros ffsicos clave de los fermentadores probados.

Tabla 11 Parametros ffsicos de los fermentadores

(continuacion)

Estrategia de fermentacion

Antes de la inoculacion, las condiciones de funcionamiento iniciales para los fermentadores probados hasta la fecha se muestran en la Tabla 12.

Tabla 12 Parametros de funcionamiento iniciales de los fermentadores

(continuacion)

Control del oxiaeno disuelto y ambiente de CO?

La estrategia actual para producir los rendimientos mas altos de pirrolisina a partir de T. pyogenes es inocular el medio de produccion completo de metritis en cada fermentador con un 0,5 % de celulas SS2 en crecimiento activo. El crecimiento inicial se inicia con una velocidad de agitacion lenta y el uso de oxfgeno puro a pedido para mantener un punto de referencia de oxfgeno disuelto del 5 % con un caudal maximo de 0,05 vvm. El concepto detras de esta estrategia es permitir que las celulas crezcan rapidamente, pero tambien minimizar la separacion del CO2 de la fase lfquida mediante burbujas de gas. Esta es la razon para usar oxfgeno en lugar de aire. Los problemas con el funcionamiento incorrecto de las sondas de OD han ocasionado problemas al usar esta estrategia, por lo que puede ser igualmente bueno implementar un caudal de oxfgeno continuo de 0,05 vvm hasta la fase de control redox.

Control redox

La razon por la que el control redox se emplea como parte de la estrategia de fermentacion para T. pyogenes es para mantener con precision las condiciones ambientales microaerofflicas optimas para maximizar la productividad de la pirrolisina. Aunque no es tecnicamente correcto, es un procedimiento para controlar niveles muy bajos de oxfgeno disuelto que no se pueden medir con una sonda de oxfgeno disuelto optica o polarizada convencional. El control redox tambien ayuda a impulsar reacciones catabolicas importantes tanto en cultivos microaerofflicos como aerobicos. La ventaja del control redox es una mayor mejora de la robustez del procedimiento, por lo que la variabilidad de los lotes de los componentes del medio complejo (por ejemplo, triptona y extracto de levadura) se minimiza mediante el autoajuste del sistema al nivel redox optimo. En un sistema sin control redox, los rendimientos celulares mas bajos observados con un lote pobre de triptona danan lugar a una condicion microaerofflica suboptima que causana rendimientos de pirrolisina reducidos. El control redox tiene la capacidad de ajustar automaticamente el ambiente microaerofflico de la fermentacion al nivel optimo sin reparar en pequenas variaciones en la calidad de las materias primas. La desventaja del control redox es que las sondas redox no se pueden calibrar, pero solo su salida se puede comparar con los valores teoricos de las soluciones convencionales. Estos valores tambien tienen un error bastante grande de aproximadamente ± 20 mV.

El control redox no se puede usar inmediatamente despues de la inoculacion, ya que el sistema requiere suficientes celulas en crecimiento activo para generar un ambiente gaseoso disuelto lo suficientemente grande como para proporcionar el "impulso" necesario para que el redox sea mas bajo que el punto de referencia de control. Esta es la razon por la que el control de pO^? se usa para la fase de crecimiento inicial de la fermentacion.

La estrategia actual de control redox se diseno usando cambios en la velocidad del agitador a una velocidad fija de rociado de aire para aumentar la redox, y reducir la velocidad de rociado de aire para disminuir la redox. Se uso aire en lugar de oxfgeno con un esfuerzo para eliminar por completo la necesidad de usar cualquier oxfgeno puro en el procedimiento final de fermentacion GMS. La desventaja de usar aire es que la concentracion optima de CO² disuelto para maximizar los rendimientos de pirrolisina puede no ser posible con la mayor velocidad de burbujeo del gas.

Actualmente se esta usando un algoritmo para controlar la redox (consulte el apendice 2). Este tipo de algoritmo se puede mejorar en su nivel de sofisticacion y capacidad de autoajuste, sin embargo, si se toma la decision de avanzar con el control redox en el procedimiento de fabricacion final, existen alternativas mas solidas disponibles. Una solucion tal vez sea tener un proveedor de fermentadores adecuado para hacer un sistema de control PID en cascada similar al que ya esta instalado para el pO², por lo que el control tambien podna conectarse en cascada a traves del agitador, el aire y el rociado de oxfgeno. Como alternativa, hay fermentadores de control redox personalizados disponibles que controlan la redox pasando una corriente electrica a traves del cultivo.

Control del CO²

Aun no se ha probado una estrategia para controlar el CO². Sin embargo, se cree que controlar la concentracion de CO² disuelto puede ayudar a optimizar y mantener la uniformidad en los rendimientos de la pirrolisina. Si bien, probar la estrategia de control redox con una sonda de CO² disuelto Mettler Toledo InPro5000i in situ, se observo claramente que los caudales de rociado superior de gas teman un efecto significativo sobre las concentraciones de CO² disuelto. La velocidad del agitador parecio tener un efecto mmimo sobre los niveles de CO².

El algoritmo de control redox tambien podna usarse para controlar el CO² disuelto. Un algoritmo complementario escrito podna aumentar o disminuir los caudales de rociado de gas cuando se requiera para controlar una salida de una sonda de CO2 disuelto u otro dispositivo de medicion de CO2 (por ejemplo, medicion de gases de escape). Esto tambien podna realizarse desde un controlador de flujo masico separado, de modo que los controles redox y CO2 sean independientes entre sr Este concepto ha sido probado de forma manual y funciona, aunque se requiere un cierto esfuerzo para determinar, en primer lugar, si se disuelve o no concentracion de CO2 es importante para optimizar los rendimientos de pirrolisina, y si se descubre que es importante, entonces cual es el nivel de control optimo.

Si se descubre que el CO2 disuelto es importante para optimizar los rendimientos de la pirrolisina, probablemente sera mas facil controlar el nivel optimo usando rociado de oxfgeno puro en lugar de aire, debido al control mas fino habilitado a traves del caudal de gas mas bajo requerido.

Inhibicion de la proteasa

Se deben anadir veinte mililitros de solucion de EGTA al 10 % (pH 5,8) por litro de cultivo cuando la concentracion de glucosa residual sea inferior a 8 mM y la DO600 sea mayor que 2,5. Si la concentracion de glucosa inicial esta en el intervalo de inicio correcto de 14 ± 2 mM, entonces el momento de la adicion de EGTA es de aproximadamente 10 a 12 horas despues de la inoculacion. Esta es una parte cntica de la estrategia de fermentacion, y debe ser monitoreada y realizada cuidadosamente. Aunque EGTA quela muchos iones metalicos divalentes, tiene una afinidad muy alta por los iones Ca2+. La razon por la que EGTA se anade al cultivo es para inhibir la actividad (y posiblemente la formacion) de proteasas. Los investigadores han demostrado que el calcio es el principal metal implicado en la actividad de la proteasa en cultivos de T. pyogenes. Cuando se anade calcio extra a los matraces con la cantidad normal de EGTA, las concentraciones de pirrolisina se reducen rapidamente, pero la adicion de magnesio mejoro los rendimientos.

Lactosa

Es importante anadir la solucion de lactosa antes del agotamiento de la glucosa para que el crecimiento no se detenga, pero la estrategia empleada ha sido anadir lactosa al cultivo despues de la adicion de EGTA. Podna anadirse a la preinoculacion del cultivo, pero la unica razon para anadirla despues de la adicion de EGTA es permitir una monitorizacion precisa de la glucosa residual para la etapa de adicion de EGTA mucho mas cntica. Si es posible monitorizar la concentracion de glucosa en presencia de lactosa, entonces esta metodologfa podna cambiarse facilmente sin ningun efecto perjudicial sobre el rendimiento.

Se han realizado varios estudios usando la alimentacion de lactosa tanto por lotes como por lotes alimentados. En este momento, no se sabe si una estrategia de alimentacion por lotes proporciona algun beneficio sobre una o varias adiciones en embolada de lactosa. Las adiciones en embolada se han realizado usando adiciones de solucion de lactosa al 50 %. Debido a la muy baja velocidad de alimentacion requerida, se ha usado una solucion de lactosa al 6 % para las fermentaciones por lotes alimentados para permitir el uso de bombas peristalticas a un volumen de trabajo de 2 l. Una desventaja de este procedimiento es el mayor efecto de dilucion. Se podna anadir una solucion mas concentrada usando procedimientos de bombeo de mayor precision (por ejemplo, bombas de jeringa). Como alternativa, si se observan beneficios usando una estrategia de alimentacion por lotes, entonces podnan anadirse otros nutrientes y/o ingredientes al alimento (por ejemplo, triptona, magnesio, cloruro de hemina, etc.).

Magnesio

Se realizo un pequeno estudio en matraz usando diversas fuentes de magnesio. El sulfato de magnesio inorganico se comparo en concentraciones de magnesio equimolar con tres fuentes de magnesio organico (gluconato de magnesio, citrato de magnesio y clorofila). El gluconato de magnesio proporciono los mayores rendimientos de pirrolisina, sin embargo, si esta materia prima es diffcil de obtener, entonces los estudios de optimizacion podnan realizarse facilmente usando otras fuentes de magnesio ya disponibles. El concepto detras de la prueba de las fuentes de magnesio organico es que EGTA debena ser menos capaz de secuestrar el magnesio que esta mas estrechamente unido que con los enlaces ionicos debiles de las fuentes inorganicas. Hubo preocupacion de que la simple adicion de niveles mas altos de magnesio inorganico podna permitir una mayor produccion de proteasas (aunque esto puede ser infundado). Dado que el magnesio es necesario para el crecimiento, la mayor masa de celulas observada con la adicion de magnesio debena dar como resultado rendimientos de pirrolisina mas altos (como se observa en este estudio en matraz).

Procedimientos analiticos en proceso

Densidad optica

El crecimiento celular se determina por los cambios en la densidad optica medidos a 600 nm en un espectrofotometro. El agua se usa generalmente como diluyente cuando los valores exceden de 0,5 para asegurar que las muestras se mantengan dentro del intervalo lineal de precision de medicion de absorbancia. El uso del medio de crecimiento de produccion proporciona una leve mejora en la precision, de modo que se deduce la absorbancia de fondo. Esto generalmente no se considera necesario ya que solo afecta realmente los resultados de la etapa inicial de la fase de crecimiento del cultivo.

Glucosa residual

La glucosa residual se mide usando un analizador de glucosa en sangre de mano, disponible en el mercado. Despues de insertar la tira de prueba en el dispositivo y esperar una indicacion de que esta listo para una muestra, se colocan aproximadamente de 10 a 20 pl de cultivo de fermentacion sin filtrar en la punta de la tira de prueba y se proporciona un resultado en milimoles por litro.

Lactosa residual

El mismo analizador usado para la glucosa residual tambien da un resultado para la lactosa residual. El valor real proporcionado no es preciso, pero aun permite el monitoreo de niveles relativos de lactosa residual satisfactorios para el monitoreo de la fermentacion. Sin embargo, se ha observado que el crecimiento disminuye significativamente cuando los niveles de lactosa residual caen por debajo de 3 mM al usar este instrumento. Tanto para la alimentacion de lactosa en embolada como por lotes alimentados, es necesario mantener una concentracion de lactosa residual mayor que 3 mM.

Concentracion de pirrolisina

La principal tecnica analttica en proceso usada para medir las concentraciones de pirrolisina es la cromatograffa lfquida de fase inversa usando una CLAR. La otra tecnica altamente sensible es un ensayo de hemolisis que mide la concentracion de pirrolisina asignando una unidad de hemolisis arbitraria a un patron bruto y luego mide otras muestras haciendo referencia a este patron. Este ensayo es muy util para medir los niveles de inactivacion en muestras de toxoides de pirrolisina. Debido a su alta sensibilidad, los errores de dilucion se magnifican para las muestras de pirrolisina con altas concentraciones (por encima de H50 pg/ml), lo que hace que el ensayo sea bastante variable a menos que se tenga mucho cuidado.

Prueba de pureza

La pureza del cultivo se puede probar con estnas en placas de agar de sangre de oveja o caballo (SBA o HBA). Incube las placas aerobicamente durante 48 a 96 horas a 37 °C. La incubacion en un ambiente de CO2 aumenta la velocidad de crecimiento. Un cultivo puro aparecera como pequenas colonias blancas/cremas, convexas y brillantes. Las placas tambien pueden incubarse, sin embargo, las colonias de T. pyogenes tambien creceran (aunque mas lentamente) en estas condiciones. La contaminacion se identifica observando otros tipos de colonias en las placas. Recoleccion y extraccion de celulas

Actualmente, el momento de la recoleccion no esta bien definido, pero comienza cuando la concentracion de pirrolisina deja de aumentar en la fase estacionaria tardfa, aproximadamente 60 a 70 horas despues de la inoculacion.

La recoleccion de cultivos y la extraccion de celulas en las escalas de investigacion y desarrollo se han realizado enfriando el cultivo a menos de 20 °C, recolectando asepticamente y centrifugando en recipientes de centrifugacion preesterilizados a 6.000 x g durante 15 a 30 minutos a 4 °C. El sobrenadante se decanta luego asepticamente en un vaso esteril adecuado y se esteriliza por filtracion a traves de un filtro de grado de esterilizacion de baja union a protemas. Las membranas de acetato de celulosa han sido la primera opcion debido a su propiedad de union a protemas muy baja. Los filtros de Sartorius Sartobran se han usado generalmente con un area de membrana de filtro adecuada elegida para adaptarse al volumen que se filtra. Por ejemplo, un Sartorius Sartobran P de 500 cm2 tiene capacidad suficiente para filtrar al menos 5 l de sobrenadante de cultivo. Estos filtros tienen un prefiltro de 0,45 pm y un filtro de esterilizacion de 0,2 pm, pero el sobrenadante no es diffcil de filtrar, cuando los equivalentes de otros proveedores debenan ser igualmente adecuados.

Concentracion y diafiltracion

La concentracion del producto se ha realizado usando un dispositivo de filtracion de flujo tangencial Sartorius Alpha con casetes Sartocon Slice Sartorius de 10 kDa Hydrosart (acetato de celulosa modificado) y 10 kDa PES (polietersulfona) como un procedimiento no esteril. Los casetes Hydrosart demostraron un rendimiento superior a los casetes PES con una recuperacion del 100 % en comparacion con solo aproximadamente del 70 % para PES. Este resultado se basa en un numero limitado de ejecuciones de procesamiento, en las que se requieren pruebas experimentales mas rigurosas para comparar cuidadosamente los rendimientos de la membrana.

Antes de comenzar la concentracion, el volumen del sobrenadante inicial se mide cuidadosamente en un cilindro medidor de vidrio, se dispensa en el dispositivo de filtracion de flujo tangencial y luego se acondiciona a traves de la(s) membrana(s) circulando durante 10 minutos con la lmea de permeado cerrada. Despues de esta configuracion inicial, todo el procesamiento de ultrafiltracion se realizo con las presiones de alimentacion, retenido y permeado mantenidas a 150, 50 y cero kPa, respectivamente, y la temperatura del producto se mantuvo a 15 ± 2 °C. El sobrenadante de pirrolisina bruto generalmente se concentra aproximadamente 10 veces y luego se diafiltra 4 a 5 veces con MES 50 mM/Na2SO4500 mM, pH 5,8 (el tampon de inicio de la purificacion). Al concluir las etapas de concentracion y diafiltracion, el sistema se drena cuidadosamente para minimizar la formacion de espuma del producto, lo que puede reducir las velocidades de recuperacion. El volumen del producto se mide luego en un cilindro medidor de vidrio para calcular con precision la concentracion final. A continuacion, el producto se esteriliza por filtracion a traves de un filtro de esterilizacion con acetato de celulosa (generalmente un filtro Sartorius Sartobran) y, si no se purifica de inmediato, se divide en partes almuotas en volumenes adecuados (generalmente de 100 a 250 ml) y se congela a -70 °C hasta que este listo para la purificacion.

Ejemplo 3. Otras mejoras para aumentar el nivel de expresion de la pirrolisina.

Antes de la evaluacion de diversas materias primas en los medios, se realizaron mejoras adicionales a los parametros de fermentacion. Con respecto a los parametros de control, se determino que para el trabajo de desarrollo a escala experimental, una estrategia de control redox que usa el rociado de O2, limitado a 0,1 wm con agitacion, pero que aumentara si fuera necesario para mantener el punto de referencia redox, fue optima. El punto de referencia redox usado para el trabajo de desarrollo fue de -447 mV. Se llevaran a cabo trabajos adicionales para establecer el intervalo redox (mv) y otros procedimientos potenciales de control de oxfgeno y agitacion.

Con respecto a los parametros de control de la fermentacion, el pH inicial del cultivo fue de 7,2, y se dejo caer hasta un pH de 6,15 durante el procedimiento de fermentacion, en el que se mantuvo. Se realizara un trabajo adicional para establecer el intervalo de control del pH y el control constante del pH. Durante la fase de crecimiento de la fermentacion inicial, el oxfgeno disuelto (OD) se mantuvo al 5 %, con un rociado de oxfgeno limitado a 0,1 vvm; la agitacion era limitada tambien. Cuando la densidad optica objetivo (600 nm) del cultivo alcanzo al menos 2,5, el cultivo se alimento con lactosa hasta una concentracion final de 30 g/l y EGTA hasta una concentracion final de 2 g/l. En este momento, el control se cambio del punto de referencia de OD al programa de control redox, para el crecimiento continuo y la fase de produccion de toxinas de la fermentacion. La fase de produccion de toxinas se continuo durante 30-70 horas adicionales, para la recoleccion en el momento maximo de produccion de la pirrolisina. Con estos parametros mejorados implementados, se realizo la evaluacion de diversas materias primas en los medios, con el fin de determinar si las fuentes existentes aprobadas por la fabricacion senan adecuadas. Despues de multiples ejecuciones de fermentacion, se concluyo que se usana polisorbato 80 a base de verduras, en lugar de polisorbato 80 a base de animales. Tambien se determino que se prefena el extracto de levadura procedente de Becton Dickinson, valorado a una concentracion de 5 gramos/litro. Tambien se determino que se usana Oxoid™ triptona.

Anteriormente, la solucion de vitaminas anadida al cultivo de fermentacion para aumentar el rendimiento de la pirrolisina se preparaba internamente. En un esfuerzo por simplificar el procedimiento de fermentacion, se penso que sena util comprar una solucion de vitaminas disponible en el mercado. Se eligio una solucion de vitaminas premezclada de Sigma, "RPMI 1640", debido a que es la mas parecida a la preparacion de vitaminas interna. Se diseno un experimento para probar el rendimiento de la pirrolisina usando vitaminas RPMI 1640 frente a las vitaminas internas en fermentadores de 2 l. Los resultados de ese experimento, mostrados en la Figura 1, demostraron que la solucion de vitaminas RPMI 1640 se desempenaba mal en comparacion con la solucion de vitaminas interna. Cuatro componentes que estaban presentes en la solucion de vitaminas interna no se incluyeron en la solucion de vitaminas RPMI 1640 (p-NAD, piridoxal, uracilo y acido nicotmico). Dado que se demostro que el uracilo y el acido nicotmico no se consumen durante la fermentacion (datos no mostrados), se penso que la falta de p-NAD y/o piridoxal era la causa mas probable de la reduccion del rendimiento. Se diseno un experimento para probar la hipotesis de que la adicion de p-NAD y/o la suplementacion con piridoxal de las vitaminas RPMI 1640 puede aumentar el rendimiento de esta solucion de vitaminas. Como se muestra en la Figura 2, el rendimiento de la pirrolisina fue similar entre la solucion de vitaminas interna y la solucion de vitaminas RPMI 1640 complementada. Se diseno un experimento adicional para probar si el p-NAD y/o el piridoxal pueden ser los unicos componentes vitammicos requeridos para complementar el medio de cultivo. Los resultados de este experimento (Fig. 3) confirmaron que el piridoxal era la unica vitamina requerida para ser complementada en el medio de cultivo para aumentar el rendimiento de la pirrolisina. En cuanto a cuando se anade piridoxal a los medios, debe hacerse como una solucion esteril despues de la esterilizacion por calor, sin embargo, como autoclave, sin afectar la DO del cultivo (Fig. 4), condujo a una disminucion en el nivel de produccion de la pirrolisina (Fig. 5).

Con respecto a la hemina utilizada en los medios, se determino que la irradiacion de la materia prima en polvo no parecfa tener un efecto directo ni en la DO del cultivo ni en el nivel de produccion de la pirrolisina, como se muestra en las Fig. 6 y Fig. 7. La Fig. 8 demuestra que la produccion de pirrolisina disminuye a medida que aumenta la vida util de la solucion de hemina; por lo tanto, la hemina se anadio inmediatamente antes de la esterilizacion por calor. Ademas de los diversos componentes de los medios, se llevaron a cabo investigaciones adicionales sobre la temperatura a la que se produjo la fermentacion. Anteriormente, las fermentaciones se realizaban a 37 °C. Los experimentos posteriores, sin embargo, indicaron que un punto de referencia inferior de 36 °C (versus las temperaturas mas altas), si bien no tienen un efecto significativo en la DO del cultivo (Fig. 9), resultaron en un aumento en la cantidad de pirrolisina producida (Fig. 10). Luego se planteo la cuestion de que efecto podna tener una temperatura aun mas baja en el nivel de produccion de la pirrolisina. El resultado de estos experimentos lleva a la conclusion de que si bien las temperaturas mas bajas conducen a una disminucion en la DO del cultivo (Fig. 11), tambien conducen a un aumento en el nivel de la pirrolisina producida, con una temperatura optima actual de 32 °C (Fig. 12). En cuanto a si mantener la temperatura del cultivo a 32 °C, o cambiarla de 37 °C a 32 °C durante el procedimiento de fermentacion, que da como resultado mejores rendimientos de pirrolisina, se determino que la temperature constante era mejor que el cambio (Fig. 13).

Ejemplo 4. Mejoras adicionales en el procedimiento de purificacion de la pirrolisina.

La concentracion de la recoleccion de fermentacion clarificada se realizo usando cartuchos de fibra hueca de polisulfona de 10 kDa, con> 95 % de recuperacion de pirrolisina. Despues de la concentracion, se anadio una solucion de MES 50 mM, Na2SO4 1,2 M, pH 5,8, al concentrado para lograr una concentracion final de sulfato de sodio 0,425 M. El material tratado con Na2SO4 se filtro antes de la aplicacion a la columna de cromatograffa.

La pirrolisina se purifico a traves de cromatograffa de interaccion hidrofoba (HIC) usando una resina de fenil sefarosa equilibrada con MES 50 mM, Na2SO4425 mM, pH 5,8. La pirrolisina se cargo en la columna a una concentracion desde 1 G de pirrolisina/ litro de resina hasta 12 G de pirrolisina/litro de resina. Luego se eluyo en MES 50 mM, pH 5,8, con un rendimiento de pirrolisina> 80 %. La protema purificada se concentro luego, seguido de un intercambio de tampon en tampon fosfato (sodio o potasio). A continuacion se determino la actividad hemolftica, para asegurar que la protema activa se habfa purificado. Esto se hizo por dilucion en serie de la pirrolisina con el tampon de ensayo, seguido de incubacion a 37 °C de la pirrolisina con globulos rojos de caballo. Luego se centrifugo para sedimentar los globulos rojos intactos, el material soluble (lisado) se transfirio a una placa nueva, se midio la Do a 405 nm y se representaron los resultados. Las unidades hemoltticas se determinaron en el punto medio de la curva, y la pirrolisina se considero desintoxicada cuando las unidades hemolfticas eran inferiores a 1000. Luego se usaron UPLC y SDS-PAGE para confirmar la identidad de la protema aislada. Finalmente, la pirrolisina se inactivo mediante tratamiento con 0,10 % a 0,5 % (v/v) de formalina durante 20-48 h a 20 °C, y luego se filtro de forma esteril.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para aumentar el rendimiento de la pirrolisina producida por Trueperella pyogenes, en el que el procedimiento comprende: A) cultivar T. pyogenes en un medio basal que contiene glucosa, asf como una fuente de carbono concentrado adicional seleccionada entre el grupo que consiste en: glucosa, galactosa, sacarosa, maltosa, oligosacaridos, glicerol, lactosa, dextrano, dextrina, mono metil succinato y N-acetil glucosamina; B) anadir un agente quelante al medio antes del agotamiento de la glucosa en el medio; C) recolectar T. pyogenes, y D) aislar la pirrolisina.

2. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la fuente de carbono concentrado adicional es lactosa.

3. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el agente quelante es acido etilenglicoltretraacetico (EGTA), acido etilendiaminotetraacetico (EDTA) o una combinacion de los dos.

4. El procedimiento de la reivindicacion 3, en la que el agente quelante es EGTA.

5. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que T. pyogenes se replica en una densidad de celulas bacterianas mas alta que una densidad optica (DO) de 5 a 600 nm.

6. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el medio se mantiene a una temperatura entre 21-37 °C.

7. El procedimiento de la reivindicacion 6, en el que el medio se mantiene a una temperatura entre 28-32 °C.

8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que comprende ademas el uso del medio basal, en el que el pH del medio esta entre 6,0 y 8,0.

9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, que comprende ademas el uso del medio basal, en el que el medio comprende hemina como fuente de hierro.

10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, que comprende ademas el uso del medio basal que comprende Polisorbato 80 (Tween 80).

11. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, que comprende ademas el uso del medio basal que comprende una solucion de vitaminas.

12. El procedimiento de la reivindicacion 11, en el que la solucion de vitaminas comprende uno o mas de los siguientes: Vitamina B12; mioinositol; nucleobase del uracilo; acido nicotmico; pantotenato de calcio; piridoxal-HCl; piridoxamina-2HCl; riboflavina; tiamina-HCl; acido p-aminobenzoico; biotina; acido folico; niacinamida; y p-NAD.

13. El procedimiento de la reivindicacion 11, en el que la solucion de vitaminas comprende piridoxal-HCl.

14. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, que comprende ademas permitir que el pH del cultivo disminuya desde el medio basal inicial, comenzando el pH a un nivel entre 5,50 y 6,50 y a continuacion controlar el pH entre 5,50 y 6,50 mediante la adicion automatica de un titulador basico.

15. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, que comprende ademas separar las proteasas de T. pyogenes de la pirrolisina mediante una etapa de cromatograffa.