CN103937889B - 一种化脓隐秘杆菌lamp检测用引物及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种化脓隐秘杆菌LAMP检测用引物及检测方法，是通过A.pyogenes的PLO基因序列设计lamp引物，所建立适用于临床样品检测、特异性强、灵敏度高的化脓隐秘杆菌LAMP可视化检测方法。本发明设计和筛选的6条引物对靶序列的6个特异序列区的识别，保证了LAMP扩增的高度特异性；环引物的加入扩增效率大大提高，耗时短。

Description

一种化脓隐秘杆菌LAMP检测用引物及检测方法

技术领域

本发明属于化脓隐秘杆菌检测技术领域，涉及一种化脓隐秘杆菌LAMP检测用引物及检测方法。

背景技术

化脓隐秘杆菌(Arcanobacterium pyogenes,A.pyogenes)是一种多形性、无运动性的革兰氏阳性杆菌,曾经被认为是化脓棒状杆菌,而后被分类到放线菌属。Ramos根据16S rRNA基因进行系统进化分析后将其重新分类到隐秘杆菌属。化脓隐秘杆菌常寄生于上呼吸道、消化道等黏膜处，是一种条件性致病菌，能引起多种动物如猪、牛、羊、禽和人类的多种器官、黏膜的化脓性感染，如肺炎、乳房炎、子宫内膜炎、关节炎、外耳炎、膀胱炎及肝脏、肾脏脓肿等症状。唐婕等报道了化脓隐秘杆感染林麝可引起其颌下、鼻镜等处的脓肿。且与大肠杆菌、链球菌等混合存在，使感染加重，可导致麝的死亡，给麝养殖业带来较大的经济损失。

已发现的化脓隐秘杆菌毒力因子主要有溶血素(PLO)、神经氨酸酶(Nan)、胶原结蛋白(CbpA)及菌毛合成蛋白(Fim),其最主要的致病因子是细胞外毒素溶血素Pyolysin（PLO）。1997年,Billington等从野生型化脓隐秘杆菌BBR1中克隆了PLO全基因,并测定其核苷酸序列。

目前，化脓隐秘杆菌诊断技术主要有传统的细菌生化鉴定和PCR方法。传统细菌培养及生化鉴定需较长的时间，PCR检测需进行电泳及PCR仪等仪器，不便于目前野外临床快速的检测。

2000年，Notomi等开发了环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermalamplification,LAMP），其原理是针对目的基因的6个区域设计4条特异性引物，利用一种链置换DNA聚合酶在约62℃进行等温扩增。该方法具有灵敏度高，特异性好，反应时间短，判定结果方便、不需要昂贵仪器等优势，广泛应用于病毒、细菌、寄生虫的诊断。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种化脓隐秘杆菌LAMP检测用引物及检测方法，从而能够对化脓隐秘杆菌进行特异性强、灵敏度高的快速检测，而且还能够适用于野外临床样品的可视化检测。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种化脓隐秘杆菌LAMP检测用引物，包括以下3对引物：F3和B3、FIP和BIP1μL、FLP和BLP；其核苷酸序列分别为：

FIP：ttgcctccag ttgacgctta atagcaagta tcctgaccat g；

BIP：aaggtctcag ccaagctcaa cgaaggaagc gatagccac；

F3：taaggtcgtc atcaacaatc c；

B3：tatgtggaga tgtcggtgta；

LoopF：cgtcaccata gtctcatcgt ag；

LoopB：acttcgatgc aattcataag cg。

一种基于权利要求1所述化脓隐秘杆菌LAMP检测用引物的试剂盒，包括：

10×Thermopol buffer2.5μL、5μM的F3和B3各1μL、40μM的FIP和BIP各1μL、20μM的FLP和BLP各1μL、10mM的dNTPs4μL、5M的甜菜碱5μL、100mM的MgSO₄1μL、8U/μL的Bst DNA polymerase1μL、2μLDNA模板和3.5μL ddH₂O；共计25μL。

一种化脓隐秘杆菌LAMP检测方法，包括以下操作：

1）提取待检测对象的DNA模板；

2）将以下组份进行混合，构建25μL的LAMP反应体系：

10×Thermopol buffer2.5μL、5μM的F3和B3各1μL、40μM的FIP和BIP各1μL、20μM的FLP和BLP各1μL、10mM的dNTPs4μL、5M的甜菜碱5μL、100mM的MgSO41μL、8U/μL的Bst DNA polymerase1μL、2μLDNA模板和3.5μL ddH₂O；

F3和B3、FIP和BIP1μL、FLP和BLP的核苷酸序列分别如SEQ.ID.NO.1～6所示；

3）将LAMP反应体系在63℃恒温反应60min，然后85℃加热2min，反应完成；

4）待反应完成后通过以下两种方式进行结果的判定：

方式之一：向反应终体系加入显色液，1～5min后观察是否有颜色的变化，若反应体系颜色发送变化则为阳性反应，表明待测对象中包含化脓隐秘杆菌；若反应体系颜色未发生变化则为阴性反应，表明待测对象中未检测到脓隐秘杆菌；

方式之二：将反应终体系进行琼脂糖凝胶电泳检测，若电泳结果呈梯形条带，表明待测对象中包含化脓隐秘杆菌；否则表明待测对象中未未检测到化脓隐秘杆菌。

所述的待检测对象的DNA模板的提取为：

将待测对象的组织液或化脓液接种于新鲜的BHI培养基中，37℃微需氧条件下培养48h，取菌液离心取上清；用DNA试剂盒提取DNA，或者将菌液煮沸10min离心取上清作为含DNA模板的提取液。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明提供的化脓隐秘杆菌LAMP检测用引物及检测方法，是通过A.pyogenes的PLO基因序列设计lamp引物，所建立适用于临床样品检测、特异性强、灵敏度高的化脓隐秘杆菌LAMP可视化检测方法，具有以下显著的优势：

（1）本发明设计和筛选的6条引物对靶序列的6个特异序列区的识别，保证了LAMP扩增的高度特异性；

（2）环引物的加入扩增效率大大提高，耗时短，在1h可将靶序列扩增至10⁹倍；

（3）在等温条件下采用特异性酶进行扩增，对实验仪器要求低，检测成本低；

（4）通过加入显色液，可通过肉眼快速观察结果，利于现场的临床样品快速检测。

附图说明

图1为各引物在PLO基因序列中对应的位置；

图2A、图2B分别为化脓隐秘杆菌LAMP方法的特异性检测结果；其中，M：marker，天恩泽基因70503x；1：阴性对照；2：化脓隐秘杆菌标准菌株；3：沙门氏菌；4：霍乱弧菌；5：单增李斯特氏菌；6：表皮葡萄球菌；7：金黄色葡萄球菌；8：嗜水气单孢菌；9：副溶血性弧菌；10：蜡样芽孢杆菌；

图3A、图3B分别为化脓隐秘杆菌LAMP方法的灵敏度检测结果；

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

本发明通过A.pyogenes的PLO基因序列设计lLAMP引物，通过LAMP检测方法建立适用于临床样品检测、特异性强、灵敏度高的化脓隐秘杆菌可视化检测方法。

化脓隐秘杆菌溶血素(Pyoly sin,PLO)是化脓隐秘杆菌一个主要的致病因子，PLO基因为化脓隐秘杆菌的特异性基因，目前对所有化脓隐秘杆菌分离株的检测发现,它们都能产生PLO。PCR等技术鉴定该菌大多采用该基因。

针对A.pyogenes的PLO基因(编号：U84782，长度1623bp)，采用PrimerExploer V4软件设计进行设计，通过筛选得到一套特异性的LAMP引物，包括外引物F3、B3和内引物FIP、BIP以及环引物LoopF、Loop B，具体的引物序列见图1、表1和SEQ.ID.NO.1～6。所选择的引物能进行LAMP扩增并得到预期的扩增片段。

表1扩增PLO基因的LAMP引物序列

图1所示的F1c为F1的互补链（箭头方向所示），B1c为B1的互补链（箭头方向所示）、F2、B2如图中1所示，他们分别组成FIP和BIP两条引物。

基于上述引物的化脓隐秘杆菌的LAMP检测方法，该方法包括以下步骤：

（1）细菌增菌及模板DNA的提取：

将待测对象的组织液或化脓液接种于新鲜的BHI培养基中，37℃微需氧条件下培养48h，取菌液离心取上清；用DNA试剂盒提取DNA，或者将菌液煮沸10min离心取上清作为含DNA模板的提取液。

出于对检测方法的验证，或者直接于血平板上挑取单个化脓隐秘杆菌接种于新鲜的BHI培养基中，37℃微需氧条件下培养48h。取1mL菌液离心取上清采用promega公司基因组DNA试剂盒提取DNA。或者取1mL菌液煮沸10min离心取上清作为DNA模板。

（2）进行LAMP反应，优化建立的25μLLAMP反应体系：

10×Thermopol buffer2.5μL、F3和B3各1μL（5μM）、FIP和BIP1μL（40μM）、FLP和BLP各1μL（20μM）、4μL dNTPs（10mM）、5μL甜菜碱（5M）、1μL MgSO4（100mM）、1μL Bst DNA polymerase（8U/μL）、2μL TemplateDNA（所制备的待检测物的模板）和3.5μL ddH2O。

（3）反应条件：63℃恒温反应60min，85℃加热2min使酶失活，反应即结束；

（4）检测结果的判定，采用以下两种方法之一进行结果判定：

1）颜色变化：向反应终体系加入显色液2μLSYBR green I（购自Invitrogen公司），1-5min观察结果，阳性反应呈现黄绿色，而阴性的反应保持橙色；

发生颜色变化是由于：SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有黄绿色激发波长的染料。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBR GreenI的荧光信号强度与双链DNA的数量相关。即LAMP反应后扩增了大量目标DNA，加入SYBR Green I即可与之反应产呈现黄绿色。

2）电泳检测：LAMP法扩增的产物是各种不同长度的茎-环状结构DNA，因此阳性反应的产物经过1.5%琼脂糖电泳检测呈梯形条带，而阴性反应则没有梯形扩增条带出现。

LAMP法扩增的产物是各种不同长度的茎-环状结构DNA，所以电泳后由于DNA片段长度不同，迁移速度不同而出现呈现梯子样状态。

实施例1：基于上述引物的化脓隐秘杆菌LAMP检测试剂盒的组成：

包括表1中所述引物（F3、B3、FIP、BIP、LoopF和LoopB），均由Invitrogen公司合成；10×Thermopol buffer、dNTPs（10mM）、甜菜碱（5M）、MgSO4（100mM）、Bst DNA polymerase、显色液1000×SYBR green I购自Invitrogen公司

阴性对照：DEPC水；

阳性对照：由化脓隐秘杆菌标准菌株ATCC19411提取的核酸作为阳性对照，采用promega基因组DNA提取试剂盒提取1mL该菌增菌液做为模板，核酸浓度约70ng/uL。

实施例2：检测化脓隐秘杆菌试剂盒的特异性和灵敏度试验

1、检测特异性分析

对表2中所列菌株分别进行LAMP检测，结果显示化脓隐秘杆菌标准菌株扩增产物经SYBR green I反应呈黄绿色（见图2A，其中只有2号检测管发生了颜色变化，而其他检测管均无颜色变化），经琼脂糖凝胶电泳检测由出现典型的梯状扩增带（见图2B，其中只有2号检测管发生了梯状扩增带，而其他检测管均无梯状扩增带），其他菌株无特异性扩增说明该方法检测化脓隐秘杆菌具有良好的特异性。

表2实验用菌株列表

序号	菌株名称	编号
			1	化脓隐秘杆菌	ATCC19411
2	鼠伤寒沙门氏菌	CMCC（B）50115
			3	非01霍乱弧菌	VB0
4	单增李斯特氏菌	ATCC15313

5	表皮葡萄球菌	CMCC26069
			6	金黄色葡萄球菌	ATCC6538
7	嗜水气单孢菌	ATCC7966
			8	副溶血性弧菌	ATCC17802
9	蜡样芽孢杆菌	ATCC11778

2、检测灵敏度分析

化脓隐秘杆菌初始模板浓度经ND2000C测得其浓度为56ng/μL。经10倍梯度稀释模板进行检测。结果见图3A和图3B。其中图3A：从左至右分别为：112ng化脓杆菌DNA模板,11.2ng化脓杆菌DNA模板,112pg化脓杆菌DNA模板,11.2pg化脓杆菌DNA模板,112fg化脓杆菌DNA模板,11.2fg化脓杆菌DNA模板,112ag化脓杆菌DNA模板，DNA marker；

图3B：从左至右分别为：112ng化脓杆菌DNA模板,11.2ng化脓杆菌DNA模板,112pg化脓杆菌DNA模板,11.2pg化脓杆菌DNA模板,112fg化脓杆菌DNA模板,11.2fg化脓杆菌DNA模板,112ag化脓杆菌DNA模板，阴性对照。

可以看到在10^-6的稀释度还能够发生梯状扩增带和颜色变化，结果表明该方法可检测到10^-6的稀释度，即检测灵敏度为在DNA水平上为112fg。

Claims (4)

1.一种化脓隐秘杆菌LAMP检测用引物，其特征在于，包括以下3对引物：F3和B3、FIP和BIP1μL、FLP和BLP；其核苷酸序列分别为：

FIP：ttgcctccag ttgacgctta atagcaagta tcctgaccat g；

BIP：aaggtctcag ccaagctcaa cgaaggaagc gatagccac；

F3：taaggtcgtc atcaacaatc c；

B3：tatgtggaga tgtcggtgta；

LoopF：cgtcaccata gtctcatcgt ag；

LoopB：acttcgatgc aattcataag cg。

2.一种基于权利要求1所述化脓隐秘杆菌LAMP检测用引物的试剂盒，其特征在于，包括：

10×Thermopol buffer2.5μL、5μM的F3和B3各1μL、40μM的FIP和BIP各1μL、20μM的FLP和BLP各1μL、10mM的dNTPs4μL、5M的甜菜碱5μL、100mM的MgSO₄1μL、8U/μL的Bst DNA polymerase1μL、2μLDNA模板和3.5μL ddH₂O；共计25μL。

3.一种化脓隐秘杆菌LAMP非诊断目的检测方法，其特征在于，包括以下操作：

1)提取待检测对象的DNA模板；

2)将以下组份进行混合，构建25μL的LAMP反应体系：

10×Thermopol buffer2.5μL、5μM的F3和B3各1μL、40μM的FIP和BIP各1μL、20μM的FLP和BLP各1μL、10mM的dNTPs4μL、5M的甜菜碱5μL、100mM的MgSO41μL、8U/μL的Bst DNA polymerase1μL、2μLDNA模板和3.5μL ddH₂O；

F3和B3、FIP和BIP1μL、FLP和BLP的核苷酸序列分别如SEQ.ID.NO.1～6所示；

3)将LAMP反应体系在63℃恒温反应60min，然后85℃加热2min，反应完成；

4)待反应完成后通过以下两种方式进行结果的判定：

方式之一：向反应终体系加入显色液，1～5min后观察是否有颜色的变化，若反应体系颜色发送变化则为阳性反应，表明待测对象中包含化脓隐秘杆菌；若反应体系颜色未发生变化则为阴性反应，表明待测对象中未检测到脓隐秘杆菌；

方式之二：将反应终体系进行琼脂糖凝胶电泳检测，若电泳结果呈梯形条带，表明待测对象中包含化脓隐秘杆菌；否则表明待测对象中未检测到化脓隐秘杆菌。

4.如权利要求3所述的化脓隐秘杆菌LAMP非诊断目的检测方法，其特征在于，所述的待检测对象的DNA模板的提取为：

将待测对象的组织液或化脓液接种于新鲜的BHI培养基中，37℃微需氧条件下培养48h，取菌液离心取上清；用DNA试剂盒提取DNA，或者将菌液煮沸10min离心取上清作为含DNA模板的提取液。