KR101999043B1 - 피욜리신 방법 및 조성물 - Google Patents

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Abstract

트루에페렐라 피요제네스(Trueperella pyogenes)에 대한 개선된 배양 배지 및 배양 조건을 위한 방법이 본 명세서에 개시되어 있다. 트루에페렐라 피요제네스로부터의 피욜리신의 단리 및 정제를 위한 개선된 방법이 또한 개시되어 있다.

Description

피욜리신 방법 및 조성물
본 발명은 소 자궁염의 원인 물질인 트루에페렐라 피요제네스(Trueperella pyogenes)에 의해 생성된 피욜리신(pyolysin)의 양을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로, 소 자궁염을 감소시키거나 예방하기에 유용한, 본 명세서에 기재된 방법을 이용하여 단리되고 정제된, 피욜리신을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
자궁염은 다양한 미생물 병원균에 의한 젖소에서의 자궁 감염의 결과이다. 이것은 보통 산후 기간 동안 황체 기능의 시작 이후 발생한다. 가축이 사는 환경에서 보통 발견되는 박테리아는 아마도 송아지생산 동안 또는 이후에 자궁으로 도입된다. 박테리아 감염을 발생시키는 산후 소에서, 박테리아는 결국 자궁에 도달하지만, 즉시 증식하기 시작하지 않는다. 급성 자궁염은 분만 후 0일 내지 21일에 발생한다. 임상적 내자궁염(자궁의 내벽 또는 자궁내막의 염증 또는 자극)은 분만 후 대략 21일 내지 35일에 발생한다. 35일을 지나서는, 내자궁염이 대개 무증상이 된다.
자연 감염, 예컨대 송아지생산으로부터의 스트레스, 유생산/수유, 음의 에너지 균형, 면역억제 및 이러한 동물이 자연 감염에 더 감수성인 사실과 연관된 다수의 인자가 존재한다. 자궁염 및 임상적 내자궁염의 발병을 책임지는 박테리아 병원균 중 하나는 트루에페렐라 피요제네스이다. 이 유기체는 이의 병원균 가능성에 기여하는 다수의 병독성 인자를 보유하고, 이들 중 하나는 콜레스테롤 의존적 세포용해소인 피욜리신이다. 이 단백질은 헤몰리신이고, 마크로파지를 포함하는 면역 세포에 세포용해성이다. 피욜리신의 발현은 이 박테리아의 병독성에 필요하다. 이 단백질은 현재까지 확인된 가장 유망한 티. 피요제네스 하위단위 백신 후보인 것으로 보인다. 단리된 피욜리신이 이의 네이티브 상태에서 단백질과 구성적으로 및 면역학적으로 유사/동일하다는 것이 중요하다. 따라서, 티. 피요제네스로부터 네이티브 피욜리신을 제조하고, 필요한 경우 단리시키는 방법, 및 이에 기초한 효과적인 백신이 매우 요망된다.
트루에페렐라 피요제네스에 의해 생성된 피욜리신의 수율을 증가시키는 방법이 개시되고, 상기 방법은 포도당뿐만 아니라, 포도당, 갈락토스, 수크로스, 말토스, 올리고당, 글라이세롤, 락토스, 덱스트란, 덱스트린, 모노 메틸 숙시네이트 및 N-아세틸 글루코사민으로 이루어진 군으로부터 선택된 탄소의 추가적인 농축 소스를 함유하는 기본 배지를 사용하는 단계; 배지에서 포도당의 소진 전에 킬레이트화제를 배지에 첨가하는 단계; 티. 피요제네스를 수확하는 단계 및 피욜리신을 단리시키는 단계를 포함한다.
킬레이트화제가 에틸렌 글라이콜 테트라아세트산(EGTA), 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA), 또는 이들 2개의 조합인 방법이 개시된다.
티. 피요제네스에 의해 생성된 피욜리신의 수율을 증가시키는 방법이되, 티. 피요제네스가 600㎚에서 5의 광학 밀도(O.D.)보다 높은 박테리아 세포 밀도로 복제하는 방법이 개시된다.
티. 피요제네스에 의해 생성된 피욜리신의 수율을 증가시키는 방법이되, 배지는 28℃ 내지 32℃의 온도에서 유지되는 방법이 개시된다.
티. 피요제네스에 의해 생성된 피욜리신의 수율을 증가시키는 방법이되, 10mM 내지 200mM의 농도에서 포스페이트에 의해 완충된 기본 배지의 사용을 추가로 포함하는 방법이 개시된다.
티. 피요제네스에 의해 생성된 피욜리신의 수율을 증가시키는 방법이되, 기본 배지의 사용을 추가로 포함하고, 배지의 pH는 6.0 내지 8.0인 방법이 개시된다.
티. 피요제네스에 의해 생성된 피욜리신의 수율을 증가시키는 방법이되, 기본 배지의 사용을 추가로 포함하고, 배지는 철 공급원으로서 헤민(hemin)을 포함하는 방법이 개시된다.
티. 피요제네스에 의해 생성된 피욜리신의 수율을 증가시키는 방법이되, 폴리소르베이트(Polysorbate) 80을 포함하는 기본 배지의 사용을 추가로 포함하는 방법이 개시된다.
티. 피요제네스에 의해 생성된 피욜리신의 수율을 증가시키는 방법이되, 비타민 용액을 포함하는 기본 배지의 사용을 추가로 포함하는 방법이 개시된다.
티. 피요제네스에 의해 생성된 피욜리신의 수율을 증가시키는 방법이되, 비타민 용액은 비타민 B12; 미오-이노시톨; 유라실 핵염기; 니코틴산; 칼슘 판토테네이트; 피리독살-HCl; 피리독사민-2HCl; 리보플라빈; 티아민-HCl; p-아미노벤조산; 바이오틴; 엽산; 니아신아마이드; 및 β-NAD 중 1종 이상을 포함하는 방법이 개시된다.
티. 피요제네스에 의해 생성된 피욜리신의 수율을 증가시키는 방법이되, 비타민 용액은 오직 피리독살-HCl을 포함하는 방법이 개시된다.
티. 피요제네스에 의해 생성된 피욜리신의 수율을 증가시키는 방법이되, 농축 탄소원에 의한 연속, 반연속 또는 한 번의 보충을 포함하는 방법이 개시된다.
티. 피요제네스에 의해 생성된 피욜리신의 수율을 증가시키는 방법이되, 배양 pH가 초기 기본 배지 출발 pH로부터 5.50 내지 6.50의 수준으로 감소하도록 허용하는 단계 및 이후 pH를 염기성 적정제의 자동 첨가에 의해 5.50 내지 6.50으로 조절하는 단계를 포함하는 방법이 개시된다.
티. 피요제네스에 의해 생성된 피욜리신의 수율을 증가시키는 방법이되, 피욜리신으로부터 티. 피요제네스 프로테아제를 분리하는 단계를 포함하는 방법이 개시된다.
티. 피요제네스에 의해 생성된 피욜리신의 수율을 증가시키는 방법이되, 피욜리신으로부터의 티. 피요제네스 프로테아제의 분리가 크로마토그래피 단계에 의해 달성되는 방법이 개시된다.
피욜리신을 불활화하는 방법이되, 0.1% 내지 0.5%의 최종 농도로 포르말린을 첨가하는 단계를 포함하는 방법이 개시된다.
자궁염의 감소 또는 예방을 위한, 특히 건조 기간 동안 소의 백신화에 유용한 면역원성 조성물이 개시된다.
본 명세서에 기재된 배지에서 성장한 티. 피요제네스로부터 단리된, 피욜리신을 포함하는 면역원성 조성물이 개시된다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법에 의해 얻어진, 피욜리신을 포함하는 면역원성 조성물이 개시된다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법에 의해 얻어진 피욜리신, 및 담체를 포함하는 면역원성 조성물이 개시된다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법에 의해 얻어진 피욜리신, 및 아쥬번트를 포함하는 면역원성 조성물이 개시된다.
도 1은, 비타민을 함유하지 않고, 인하우스 비타민 용액, 또는 상업용 비타민 용액을 함유하는, 배지 중의 트루에페렐라 피요제네스에 의한 피욜리신 생성의 수준의 비교이다.
도 2는, 비타민을 함유하지 않고, 인하우스 비타민 용액, 또는 β-NAD 및 피리독살이 보충된 상업용 비타민 용액을 함유하는, 배지 중의 트루에페렐라 피요제네스에 의한 피욜리신 생성의 수준의 비교이다.
도 3은, β-NAD, 피리독살, 또는 둘 다를 함유하는, 배지 중의 트루에페렐라 피요제네스에 의한 피욜리신 생성의 수준의 비교이다.
도 4는, 덱스트로스(Dex)와 조합된, 오토클레이빙된 (AC) 또는 무균 첨가된 (SA)를 가지는, 피리독살(Pyr)을 함유하는, 배지 중의 트루에페렐라 피요제네스의 O.D.(600nm)의 비교이다.
도 5는, 덱스트로스(Dex)와 조합된, 오토클레이빙된 (AC) 또는 무균 첨가된 (SA)를 가지는, 피리독살(Pyr)을 함유하는, 배지 중의 트루에페렐라 피요제네스에 의한 피욜리신 생성의 수준의 비교이다.
도 6은, 다양한 시간 길이 동안 조사되거나, 결코 조사되지 않은 헤민을 함유하는, 배지 중의 트루에페렐라 피요제네스의 O.D.(600㎚)의 비교이다.
도 7은, 다양한 시간 길이 동안 조사되거나, 결코 조사되지 않은 헤민을 함유하는, 배지 중의 트루에페렐라 피요제네스에 의한 피욜리신 생성의 수준의 비교이다.
도 8은, 배지에 첨가하기 전에, 다양한 시간 길이 동안 유지된, 헤민을 함유하는, 배지 중의 트루에페렐라 피요제네스에 의한 피욜리신 생성의 수준의 비교이다.
도 9 및 도 11은, 다양한 온도에서 유지되는, 배지 중의 트루에페렐라 피요제네스의 O.D.(600㎚)의 비교이다.
도 10 및 도 12는, 다양한 온도에서 유지되는, 배지 중의 트루에페렐라 피요제네스에 의한 피욜리신 생성의 수준의 비교이다.
도 13은 트루에페렐라 피요제네스에 의한 피욜리신 생성의 수준의 비교이고, 여기서 배지의 온도는 발효 공정 동안 32℃에서 유지되거나, 37℃로부터 32℃로 이동한다.
본 명세서에 언급된 모든 공보, 특허 출원, 특허 및 다른 참고문헌은 그 전문이 참고문헌으로 포함된다.
하기 정의는 실시형태의 설명에서 사용되는 용어에 적용될 수 있다. 하기 정의는 본 명세서에서 참고문헌으로 포함된 각각의 개별 참고문헌에 함유된 임의의 모순되는 정의를 대체한다.
본 명세서에 달리 정의되지 않은 한, 본 실시형태와 연관되어 사용된 과학 용어 및 기술 용어는 당해 분야의 당업자가 보통 이해하는 의미를 가져야 한다. 추가로, 문맥에 의해 달리 필요하지 않은 한, 단수 형태는 복수를 포함해야 하고, 복수 용어는 단수를 포함해야 한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "약", "대략" 등은, 측정 가능한 숫자 변수와 연결되어 사용될 때, 변수의 표시된 값, 및 표시된 값의 실험 오차 내에(예를 들어, 평균에 대한 95% 신뢰 간격 내에), 또는 표시된 값의 10% 내에(어느 것이든 큰 것) 있는 변수의 모든 값을 의미한다. 날짜에 관해서, "약"은 1일 + 또는 -를 의미하는 것으로 해석되고; 예를 들어 "약 3일"은 2일, 3일 또는 4일을 의미할 수 있다.
용어 "동물"은, 본 명세서에 사용된 바와 같이, 가축 및 야생 둘 다의 포유류를 포함하는 내자궁염에 걸리기 쉬운 임의의 동물을 의미한다. 바람직하게는, "동물"은, 본 명세서에 사용된 바와 같이, 소를 의미한다.
용어 "박테리아", "박테리아 종", "세균" 등은, 본 명세서에 사용된 바와 같이, 원핵생물 미생물의 큰 도메인을 의미한다. 바람직하게는, "박테리아"는, 본 명세서에 사용된 바와 같이, 트루에페렐라 피요제네스 및 관련 박테리아를 포함하는 미생물을 의미한다.
용어 "박테리아 세포 밀도"는, 본 명세서에 사용된 바와 같이, 배양물에 존재하는 박테리아의 수를 의미한다. 박테리아의 수를 정량화하는 일 방법은 통상적으로 600㎚에서 분광광도계에서의 배양물의 광학 밀도를 측정함으로써이다.
용어 "기본 배지"는, 본 명세서에 사용된 바와 같이, 미생물이 초기에 접종된 배지를 의미한다. 미생물의 복제가 아직 발생하지 않고, 이것은 다양한 배지 성분의 pH 및/또는 농도에 효과를 가질 수 있다.
용어 "소"는, 본 명세서에 사용된 바와 같이, 일반적으로 갈라진 발굽을 가지는 중간 내지는 큰 크기의 유제류의 다양한 그룹, 및 진각을 가지는 성별 중 적어도 하나를 의미한다. 소는 가축 소, 들소, 아프리카 소, 물소, 야크, 및 4개 뿔 또는 나선 뿔 영양을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
용어 "배양" 또는 "배양 배지"는, 본 명세서에 사용된 바와 같이, 미생물을 함유하는 배지를 의미한다.
용어 "건조 기간"은, 본 명세서에 사용된 바와 같이, 소에서 착유가 일어나지 않는 기간을 의미하고; 이 기간은 다음 수유를 위해 소 및 유방을 준비하기 위한 것이다.
용어 "내자궁염"은, 본 명세서에 사용된 바와 같이, "자궁내막"이라 또한 칭하는, 자궁의 내부 내벽의 염증 또는 자극을 의미한다.
용어 "포도당 소진"은, 본 명세서에 사용된 바와 같이, 배양물 중에 이용 가능한 포도당의 대부분 또는 전부의 소비, 대사 또는 분해를 의미한다. 예를 들어, "소진"은 탄소원의 농도가 10mM 이하일 때 일 수 있다.
용어 "고나도트로핀 방출 호르몬", "GnRH", "항체형성 호르몬 방출 호르몬", "LHRH" 등은, 본 명세서에 사용된 바와 같이, 고나도트로핀, 난포 자극 호르몬(follicle-stimulating hormone; FSH) 및 항체형성 호르몬(luteinizing hormone; LH)의 뇌하수체 전엽으로부터의 합성 및 분비를 담당하는 펩타이드 호르몬을 의미한다. GnRH 분비는 모든 척추동물에서 박동성이고, 정확한 생식 기능에 필요하다.
용어 "접종원"은, 본 명세서에 사용된 바와 같이, 미생물의 양 또는 배양물을 의미한다. 바람직하게는, "접종원"은 박테리아 배양물의 양을 의미한다.
용어 "근육내", "근육내로" 등은, 본 명세서에 사용된 바와 같이, 근육으로의 물질의 주사를 의미한다.
용어 "자극"은, 본 명세서에 사용된 바와 같이, 자극에 대한 조건 또는 반응, 또는 조직의 표면 상의 세포에 손상을 발생시키는 물질을 의미한다.
용어 "젖 생성", "젖 분비" 및 "수유"는, 본 명세서에 사용된 바와 같이, 유선으로부터의 젖의 분비, 및 수컷이 자식에게 먹이도록 젖을 생산하는 시간 기간을 의미한다.
용어 "분만"은, 본 명세서에 사용된 바와 같이, 소가 송아지를 생산할 때를 의미한다.
용어 "병원균성 미생물" 또는 "병원균"은, 본 명세서에 사용된 바와 같이, 동물에서 질환 또는 생리학적 병태를 발생시킬 수 있는 미생물을 의미한다. 이것은 박테리아, 바이러스, 진균 또는 효모를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
용어 "임신한" 또는 "임신"은, 본 명세서에 사용된 바와 같이, 암컷의 자궁에서, 배아 또는 태아로 공지된, 하나 이상의 자손의 수태 및 발생을 의미한다.
용어 "프로게스테론은", 본 명세서에 사용된 바와 같이, 동물의 발정 주기, 임신 및 배아발생에 관여한 스테로이드 호르몬을 의미한다. 프로게스테론은 프로게스토겐이라 불리는 호르몬의 종류에 속한다.
용어 "자궁", "자궁내" 등은, 본 명세서에 사용된 바와 같이, 임신 동안 배아 및 태아에서 키우는 대부분의 포유류의 암컷 호르몬 반응성 생식 장기를 의미한다.
용어 "수의학적으로 허용 가능한 담체" 또는 "담체"는, 본 명세서에 사용된 바와 같이, 합당한 의학 판단의 범위 내에 있고, 부당한 독성, 자극, 알레르기 반응 등 없이 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하고, 합당한 이익 대 위험 비율에 비례하고, 이의 의도된 사용에 효과적인 물질을 의미한다.
하기 설명은 본 발명을 실행하는 데 있어서 당해 분야의 당업자를 돕도록 제공된다. 그렇더라도, 본 발명의 발견의 사상 또는 범위로부터 벗어나지 않으면서, 당해 분야의 당업자에 의해 본 명세서에 기재된 실시형태에서의 변형 및 변경이 이루어질 수 있으므로, 이 설명은 본 발명을 부당하게 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
배양 기법
트루에페렐라 피요제네스를 포함하는 박테리아는, 높은 수로 박테리아의 복제를 허용하는 성장 배지를 함유하는 용기에서 상장할 수 있어서, 원하는 단백질(들)의 단리를 촉진시킨다. 성장 배지는 영양소 브로쓰의 형태일 수 있고, 성장에 필요하거나 유용한 다양한 화합물 및 성분에 대한 공급원으로서 작용하는 임의의 수의 다양한 성분을 함유할 수 있다. 이것은 영양소에 대한 공급원(들)을 포함한다. 배양 배지의 영양소 성분은 조심스럽게 선택되고, 단백질, 펩타이드 및 아미노산을 포함할 수 있다. 이 성분은 박테리아에 대한 탄소원 및 질소원으로서 작용할 수 있다. 더 수요가 많은 유기체는 보충적 영양소 공급원의 첨가를 필요로 할 수 있다.
에너지원은 성장 배지에서 또한 중요하다. 이것은 대개 탄수화물의 형태로 공급된다. 유기체의 성장의 속도를 증가시키기 위해 에너지원으로서 배양 배지에 첨가되는 가장 흔한 물질은 포도당이다. 다른 탄수화물이 또한 사용되거나 필요할 수 있다. 대안적인 탄소원은 갈락토스, 다양한 다이사카라이드, 예컨대 수크로스, 락토스 또는 말토스, 및 올리고당을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 다른 탄소원은 글라이세롤, 덱스트란, 덱스트린, 모노 메틸 숙시네이트 및 N-아세틸 글루코사민을 또한 포함할 수 있다.
필수 금속 및 미네랄은 배지에서 또한 첨가될 수 있다. 배양 배지의 이 무기 성분은 마크로-성분, 예컨대 Na, K, Cl, P, S, Ca, Mg 및 Fe를 포함할 수 있다. 다양한 마이크로-성분, 예컨대 Zn, Mn, Br, B, Cu, Co, Mo, V 및 Sr이 또한 필요할 수 있다. PO4는 배지에서 또한 필요할 수 있다. 이것은 10mM 내지 200mM, 예컨대 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195 및 200mM의 농도로 존재할 수 있다.
배양 배지의 pH가 원하는 박테리아의 성장에 필요한 범위 주위에서 유지되는 것이 또한 중요하다. 배양 배지의 pH는 6.0 내지 8.0, 예컨대 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9 및 8.0일 수 있다. 특정한 pK 값에서의 완충제 화합물의 사용은 발효 가능한 탄수화물이 에너지원으로서 첨가될 때 특히 중요하다. 포스페이트, 아세테이트, 시트레이트, 쌍성이온 화합물 및 특정한 아미노산은 배양 배지에 첨가될 수 있는 완충제의 예이다. 이러한 화합물의 하나의 가능한 부작용은 2가 양이온(예를 들어, Ca ++ 및 Mg ++)을 킬레이트화하는(또는 이에 결합하는) 이의 능력이다. 이 결합제 또는 킬레이트화제의 효과는, 제제에서 필수 양이온을 보충하고자 주의가 기울어지지 않으면, 결코 감소한 성장 또는 성장의 실패에서 보일 수 있다. pH는 다양한 산성 또는 염기성 용액, 예컨대 중탄산나트륨 및 수산화나트륨의 첨가에 의해 또한 조절될 수 있다. 용존 CO2는 배양의 pH를 조정하위해 또한 사용될 수 있다.
성장 배지는, 배양 배지에서의 특정한 탄수화물의 발효를 검출하기 위한 효과적인 방식으로서 작용할 수 있는, 착색된 표시자 물질을 또한 함유할 수 있다. 이러한 화합물은 중요한 pH 값에서 명확하게 및 신속하게 색상을 변경해야 한다. 사용된 대부분의 이들 화합물, 예컨대 페놀 레드, 브로모크레솔 퍼플 및 푹신은 독성일 수 있지만, 이들의 낮은 농도를 사용하는 것이 필수적이다.
선택적 물질은 성장 배지에서 또한 필요할 수 있다. 화학물질 또는 항미생물은 이것이 소정의 미생물에 대해 선택적이게 하도록 배양 배지에 첨가된다. 선택적 물질은 다균성 샘플에서 원치않는 유기체의 성장을 억제하기 위해, 또는 원하는 유기체의 성장을 증대시키기 위해 선택되고 특정한 농도로 첨가된다. 선택적 물질은 원치않는 유기체를 저해할 뿐만 아니라, 원하는 유기체의 저해되지 않은 성장을 또한 허용하는 것이 필수적이다.
겔화제는 성장 배지에서 또한 유용할 수 있다. 배양 배지에서 사용된 가장 흔한 겔 형성 물질은 한천이다. 한천은 한천원조 해초, 주로 겔리듐(Gelidium), 그라실라리아(Gracilaria) 및 프테로클라디아(Pterocladia) 종으로부터 얻어진다. 이것은 100℃ 초과에서 수성 용액으로부터 추출되고, 탈색되고, 여과되고 건조되고 분말로 분쇄된다. 한천은 불활성 겔화제가 아니고, 이의 제조에서 사용된 화학 공정에 따라 배양 배지에 대한 영양소 및/또는 독성 물질에 기여할 수 있다.
다른 성분은 또한 성장 배지에 첨가될 수 있어서, 특정한 목적을 제공한다. 이것은 다양한 성장 인자, 전혈 또는 혈액 성분, 및 호르몬을 포함할 수 있다.
배양 배지가 유지되는 온도는 생성된 독소의 양과 관련하여 중요한 인자이다. 생성된 독소의 양을 최대화하기 위해, 배지의 온도는 37℃ 이하에서 유지될 수 있다. 바람직하게는, 온도는 21℃ 내지 36℃에서 유지될 수 있다. 더 바람직하게는, 온도는 25℃ 내지 34℃에서 유지될 수 있다. 가장 바람직하게는, 온도는 28℃ 내지 32℃에서 유지될 수 있다.
단백질 정제 기법
단백질 정제의 다양한 제조 방법은 본 명세서에서 고려된다. 이러한 방법은, 면역원성 조성물의 제조에 대한 것을 포함하여, 후속하는 사용을 위한, 비교적 많은 분량의 정제된 단백질(들)을 회수하는 것을 목표로 한다. (분석 정제 방법은 더욱이 다양한 조사 또는 분석 목적을 위해 소량의 단백질의 제조를 위한 것이다.) 제조용 단백질 정제의 주요 단계는 추출, 정제, 및 필요한 경우, 농축을 포함한다.
단백질을 추출하기 위해, 용액으로 되는 것이 필요할 수 있다. 이것은 조직 또는 이것을 함유하는 세포를 파괴하거나 방해함으로써 달성될 수 있다. 이를 달성하기 위한, 반복 동결 및 해동, 음파처리, 고압에 의한 균질화, 여과, 또는 유기 용매에 의한 침투화의, 몇몇 방법이 존재한다. 선택의 방법은 단백질이 얼마나 취약한가 및 세포가 얼마나 튼튼한가에 따라 따라진다. 보통 대부분의 종래의 목적을 위해, 정제를 달성하기 위해 칼럼 크로마토그래피를 이용한다. 이 추출 공정 후, 가용성 단백질은 용매 중에 있을 것이고, 원심분리에 의해 세포 막, DNA 등으로부터 단리될 수 있다.
단백질의 추출 전에 또는 이것과 동시에, 존재할 수 있고 정제되는 단백질(들)을 분해할 수 있는 프로테아제를 저해하는 것이 필요할 수 있다. 세린 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 메탈로프로테아제 및 아스파르트 프로테아제를 포함하는, 존재할 수 있는 복수의 종류의 프로테아제가 있다. 다양한 방법은 다양한 종류의 프로테아제를 저해하기 위해 이용 가능하고, 프로테아제를 저해하도록 작용하는 다른 단백질, 또는 프로테아제의 활성을 저해할 수 있는 다양한 화학 화합물의 첨가를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
정제 전략은 일반적으로 크로마토그래피 단계(들) 및 설비의 몇몇 유형을 포함한다. 정제 공정은 일반적으로 단백질을 분리하기 위한 3개의 특성을 이용한다. 첫째로, 단백질은, 예컨대 pH 등급화 겔 또는 이온 교환 칼럼을 통해 이들을 실행함으로써, 이의 등점전에 따라 정제될 수 있다. 둘째로, 단백질은 예컨대 크기 배제 크로마토그래피를 통해 또는 SDS-PAGE(황산 도데실 나트륨-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동)에 의해 이의 크기 또는 분자량에 따라 분리될 수 있다. 셋째로, 단백질은 예컨대 고성능 액체 크로마토그래피 또는 역상 크로마토그래피에 의해 극성/소수성에 의해 분리될 수 있다. 단백질 정제 프로토콜은 하나 이상의 크로마토그래피 단계를 함유할 수 있다. 소수성 상호작용 크로마토그래피(표면 소수성에 기초한 화합물 분리) 및 친화도 크로마토그래피(화합물에 부착된 리간드에 대한 특이성을 가지는 다양한 수지를 사용한 화합물의 분리)를 포함하는, 다른 크로마토그래피 방법이 또한 존재한다.
단백질의 농축이 필요한 경우, 이것은, 동결건조(단백질의 건조) 및 한외여과(선택적 투과성 막을 사용한 농축)를 포함할 수 있는, 다양한 기법을 이용하여 달성될 수 있다.
면역원성 조성물
본 발명의 면역원성 조성물은 티. 피요제네스에 대한 효과적인 면역 반응을 유도하기 위해 동물에게 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 본 발명의 면역원성 조성물의 치료학적 유효량을 동물에게 투여함으로써 효과적인 면역 반응을 자극하는 방법을 제공한다.
피욜리신은 면역원성 조성물에서 이의 사용 전에 불활화될 수 있다. 불활화의 방법은 열 처리, UV 광 처리, pH의 조정(상향 또는 하향) 또는 다양한 화학 물질에 의한 처리를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 이러한 화학 물질은 환원제, 예컨대 다이티오트레이톨(DTT) 또는 베타-머캅토에탄올(BME); 세제, 예컨대 황산 도데실 나트륨(SDS), 트리톤(Triton) X-100, 또는 CHAPS; 카오트로픽 물질(chaotropic agent), 예컨대 페놀 또는 유레아; 및 반응성 소독제, 예컨대 폼알데하이드 또는 글루타르알데하이드를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 이러한 방법 및 물질을 사용하기 위한 방법은 당해 분야의 당업자에게 널리 공지된 표준 기법을 이용하여 용이하게 달성된다.
본 발명의 면역원성 조성물은 1종 이상의 아쥬번트를 포함할 수 있다. 아쥬번트는 RIBI 아쥬번트 시스템(Ribi Inc.(몬타나주 해밀턴)), 명반, 수산화알루미늄 겔, 수중유 에멀션, 유중수 에멀션, 예컨대, 예를 들어 프로인트(Freund) 완전 및 불완전 아쥬번트, 블록 공중합체(CytRx(조지아주 아틀란타)), SAF-M(Chiron(캘리포니아주 에머리빌)), AMPHIGEN(등록상표) 아쥬번트, 사멸된 보르데텔라(Bordetella), 사포닌, 예컨대 Stimulon(상표명) QS-21(Antigenics(메사추세츠주 프래밍햄))(미국 특허 제5,057,540호(본 명세서에 의해 참고문헌으로 포함됨)에 기재됨), 및 이로부터 생성된 입자, 예컨대 ISCOMS(면역자극 복합체), GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals, Inc.(앨라배마주 버밍햄)) 또는 다른 사포닌 분획, 모노포스포릴 지질 A, 아브리딘 지질-아민 아쥬번트, 에스체리치아 콜라이로부터의 열 불안정 내독소(재조합 또는 그 외), 콜레라 독소, 또는 뮤라밀 다이펩타이드를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. MPL(상표명)(3-O-데아실화 모노포스포릴 지질 A; Corixa(몬타나주 해밀턴))(미국 특허 제4,912,094호에 기재되어 있고, 본 명세서에 의해 참고문헌으로 포함됨)이 또한 유용하다. 합성 지질 A 유사체 또는 아미노알킬 글루코사민 포스페이트(AGP) 화합물, 또는 이의 유도체 또는 유사체(Corixa(몬타나주 해밀턴)로부터 구입 가능하고, US 제6,113,918호(본 명세서에 의해 참고문헌으로 포함됨)에 기재됨)가 아쥬번트로서 사용하기에 또한 적합하다. 아쥬번트로서 Quil A 및 콜레스테롤의 조합을 또한 사용할 수 있다.
CpG 모티프를 함유하는 합성 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 올리고뉴클레오타이드(US 제6,207,646호(본 명세서에 의해 참고문헌으로 포함됨))는 아쥬번트로서 또한 사용될 수 있다. E-변형된 P-클래스 면역자극 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, CpG 올리고뉴클레오타이드, 예컨대 P-클래스 면역자극 올리고뉴클레오타이드가 유용하다. 스테롤은 아쥬번트로서 또한 유용할 수 있다. 사용에 적합한 것은 β-시토스테롤, 스티그마스테롤, 에르고스테롤, 에르고칼시페롤 및 콜레스테롤을 포함할 수 있다. 아쥬번트 조성물은 1종 이상의 중합체, 예컨대 DEAE 덱스트란, 폴리에틸렌 글라이콜, 폴리아크릴산 및 폴리메타크릴산(예를 들어, CARBOPOL(등록상표)) 등을 추가로 포함할 수 있다. 아쥬번트 조성물은 1종 이상의 Th2 자극제, 예컨대 Bay R1005(R) 및 알루미늄 등을 추가로 포함할 수 있다. 아쥬번트 조성물은 1종 이상의 면역조절 물질, 예컨대 4차 암모늄 화합물(예를 들어, DDA), 인터류킨, 인터페론 또는 다른 사이토카인을 추가로 포함할 수 있다.
다수의 사이토카인 또는 림포카인은 면역조절 활성을 가지는 것으로 나타났고, 따라서 아쥬번트로서 사용될 수 있다. 이것은 인터류킨 1-α, 1-β, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12(예를 들어 US 제5,723,127호 참조), 13, 14, 15, 16, 17 및 18(및 이의 돌연변이체 형태), 인터페론-α, β 및 γ, 과립구-마크로파지 콜로니 자극 인자(예를 들어, US 제5,078,996호, 및 ATCC 수탁 번호 39900 참조), 마크로파지 콜로니 자극 인자, 과립구 콜로니 자극 인자, GSF, 및 종양 괴사 인자 α 및 β를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 본 발명에서 유용한 훨씬 다른 아쥬번트는 케모카인, 예컨대, 제한 없이, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β 및 RANTES를 포함한다. 부착 분자, 예컨대 셀렉틴, 예를 들어 L-셀렉틴, P-셀렉틴 및 E-셀렉틴은 아쥬번트로서 또한 유용할 수 있다. 훨씬 다른 유용한 아쥬번트는, 제한 없이, 뮤신 유사 분자, 예를 들어 CD34, GlyCAM-1 및 MadCAM-1; 인테그린 패밀리의 구성원, 예컨대 LFA-1, VLA-1, Mac-1 및 p150.95; 면역글로불린 슈퍼패밀리의 구성원, 예컨대 PECAM, ICAM(예를 들어, ICAM-1, ICAM-2 및 ICAM-3), CD2 및 LFA-3; 동시자극 분자, 예컨대 CD40 및 CD40L; 성장 인자, 예컨대 혈관 성장 인자, 신경 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, 상피 성장 인자, B7.2, PDGF, BL-1 및 혈관 내피 성장 인자; 수용체 분자, 예컨대 Fas, TNF 수용체, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2 및 DR6을 포함한다. 훨씬 또 다른 아쥬번트 분자는 카스파제(ICE)를 포함한다.
양이온성 담체는 아쥬번트 조성물에서 또한 유용할 수 있다. 적합한 양이온성 담체는, 제한 없이, 덱스트란, 덱스트란-DEAE(및 이의 유도체), PEG, 구아 검, 키토산 유도체, 폴리셀룰로스 유도체, 예컨대 하이드록시에틸 셀룰로스(HEC), 폴리에틸렌이멘, 폴리 아미노, 예컨대 폴리라이신 등을 포함한다.
본 발명의 면역원성 조성물은 투여 경로에 따라 다양한 형태로 제조될 수 있다. 예를 들어, 면역원성 조성물은, 주사용 용도에 적합한 무균 수성 용액 또는 분산액의 형태로, 또는 동결 건조 기법을 이용하여 동결건조 형태로 제조될 수 있다. 동결건조된 면역원성 조성물은 통상적으로 약 4℃에서 유지되고, 아쥬번트와 함께 또는 이것 없이, 안정화 용액, 예를 들어 식염수 또는 HEPES 중에 재구성될 수 있다. 면역원성 조성물은 현탁액 또는 에멀션의 형태로 또한 제조될 수 있다.
이 면역원성 조성물은 임의의 종래의 투여 경로를 통한 투여에 적합한 첨가제를 함유할 수 있다. 본 발명의 면역원성 조성물은 예를 들어 액체, 분말, 에어로졸, 정제, 캡슐, 장용 코팅 정제 또는 캡슐, 또는 좌제의 형태로 대상체에 대한 투여를 위해 제조될 수 있다. 따라서, 면역원성 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액, 에멀션, 페이스트, 및 이식형 서방형 또는 생분해성 제제(이들로 제한되지는 않음)의 형태로 또한 있을 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제의 일 실시형태에서, 활성 성분은 재구성된 조성물의 비경구 투여 전에 적합한 비히클(예를 들어, 무균 발열원 비함유 물)과의 재구성을 위한 건조(즉, 분말 또는 과립) 형태로 제공된다. 다른 유용한 비경구로 투여 가능한 제제는, 미정질 형태 중의, 리포솜 제제 중의, 또는 생분해성 중합체 시스템의 성분으로서, 활성 성분을 포함하는 것을 포함한다. 서방 방출 또는 이식을 위한 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 중합체 또는 소수성 재료, 예컨대 에멀션, 이온 교환 수지, 난용성 중합체, 또는 난용성 염을 포함할 수 있다.
면역원성 조성물은 일반적으로 수의학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 이러한 담체는, 제한 없이, 물, 식염수, 완충 식염수, 포스페이트 완충제, 알콜/수성 용액, 에멀션 또는 현탁액을 포함한다. 다른 종래에 사용된 희석제, 아쥬번트, 및 부형제는 종래의 기법에 따라 첨가될 수 있다. 이러한 담체는 에탄올, 폴리올, 및 이들의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 및 주사용 유기 에스터를 포함할 수 있다. 완충제 및 pH 조정제가 또한 사용될 수 있고, 제한 없이, 유기 산 또는 염기로부터 제조된 염을 포함한다. 대표적인 완충제는, 제한 없이, 유기산 염, 예컨대 시트르산(예를 들어, 시트레이트), 아스코르브산, 글루콘산, 카본산, 타르타르산, 숙신산, 아세트산, 프탈산, Tris, 트라이메틸아민 하이드로클로라이드 또는 포스페이트 완충제의 염을 포함한다. 비경구 담체는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스, 트레할로스, 수크로스, 락테이티드 링거 또는 고정유를 포함할 수 있다. 정맥내 담체는 유체 및 영양소 보충제, 전해질 보충제, 예컨대 링거 덱스트로스에 기초한 것 등을 포함할 수 있다. 보존제 및 다른 첨가제, 예컨대 항미생물제, 항산화제, 킬레이트화제(예를 들어, EGTA; EDTA), 불활성 가스 등은 약제학적 담체 중에 또한 제공될 수 있다. 본 발명은 담체의 선택에 의해 제한되지 않는다. 적절한 pH, 등장성, 안정성 및 다른 종래의 특징을 가지는, 상기 기재된 성분으로부터의 이 약제학적으로 허용 가능한 조성물의 제조는 당해 분야의 지식 내에 있다. 예를 들어 교재, 예컨대 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th ed, Lippincott Williams & Wilkins, pub., 2000; 및 The Handbook of Pharmaceutical Excipients, 4th edit., eds. R. C. Rowe et al, APhA Publications, 2003]을 참조한다.
재조합 기법
본 발명의 훨씬 다른 실시형태에서, 면역원성 조성물은 재조합 백신을 포함할 수 있다. 이러한 재조합 백신은 재조합 단백질, 또는 대안적으로 상기 재조합 단백질을 코딩하는 벡터 및 비상동성 삽입체를 포함할 수 있다. 비상동성 삽입체는 몇몇 실시형태에서 본 발명의 단백질을 코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함한다. 삽입체는 임의로 비상동성 프로모터, 예컨대 당해 분야에 공지된 합성 프로모터 등을 포함할 수 있다. 대안적으로, 숙주 벡터의 프로모터는 삽입체의 발현에 대해 전사 제어를 발휘할 수 있다. 벡터의 선택에 따라 네이티브 또는 비상동성일 수 있는, 프로모터의 적합한 비제한적인 예는 H6 백시니아 프로모터, I3L 백시니아 프로모터, 42K 폭스바이러스 프로모터, 7.5K 백시니아 프로모터 및 Pi 백시니아 프로모터이다.
몇몇 실시형태에서, 벡터는 바이러스 벡터, 예컨대 제한 없이 백시니아 및 폭스바이러스 벡터, 예컨대 파라폭스, 라쿤폭스, 돈두 및 상이한 조류폭스 벡터(예를 들어, 카나리아폭스 및 계두 균주)일 수 있다. 일반적으로, 바이러스 숙주에 비필수인 서열은 본 발명의 삽입체에 대한 적합한 삽입 자리이다. 상기 언급된 균주는 당해 분야에서 널리 규명되고, 이 벡터에서의 일부 삽입은 널리 공지되어 있다.
본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 클로닝하고 발현하기 위해 사용될 수 있는 몇몇 공지된 방법 또는 기법이 존재한다. 예를 들어, 서열은 제한 단편으로서 단리되고, 클로닝 및/또는 발현 벡터로 클로닝될 수 있다. 서열은 또한 PCR 증폭되고, 클로닝 및/또는 발현 벡터로 클로닝될 수 있다. 대안적으로, 이들은 이 2개의 방법의 조합에 의해 클로닝될 수 있다. 당해 분야에 공지되고 구체적으로 기재되지 않은 표준 분자 생물학 기법은 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., Recombinant DNA, Scientific American Books, New York; Birren et al (eds) Genome Analysis: A Laboratory Manual Series, Vols . 1-4 Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998)]; 및 US 제4,666,828호; US 제4,683,202호; US 제4,801,531호; US 제5,192,659호 및 US 제5,272,057호에 기재된 방법론에 기재된 바와 같이 일반적으로 따를 수 있다. 중합효소 사슬 반응(PCR)은 일반적으로 문헌[PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego, CA (1990)]에 기재된 바대로 수행된다.
본 발명은 본 발명의 뉴클레오타이드 서열에 의해 발현된 재조합 폴리펩타이드의 절두 및 전장 형태 둘 다를 발현하기 위해 사용될 수 있는, 벡터 및 숙주 세포를 포함하는, 원핵생물 및 진핵생물 발현 시스템의 용도를 포함한다. 다양한 숙주-발현 벡터 시스템은 본 발명의 폴리펩타이드를 발현하도록 사용될 수 있다. 이러한 숙주-발현 시스템은 또한 관심 있는 코딩 서열이 클로닝될 수 있는 비히클, 및 후속하여 정제된 발현된 단백질(들)을 나타낸다. 본 발명은 추가로, 적절한 벡터 또는 뉴클레오타이드 서열에 의해 형질전환되거나 형질감염될 때, 본 발명의 코딩된 폴리펩타이드 유전자 생성물을 발현할 수 있는, 숙주 세포를 제공한다. 이러한 숙주 세포는 미생물, 예컨대 코딩 서열을 함유하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA, 또는 코스미드 DNA 발현 벡터에 의해 형질전환된 박테리아(예를 들어, 에스체리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)); 코딩 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터에 의해 형질전환된 효모(예를 들어, 사카로마이세스(Saccharomyces), 피치아(Pichia)); 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 바큘로바이러스(baculovirus))에 의해 감염된 곤충 세포 시스템; 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus), CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)에 의해 감염되거나 재조합 플라스미드 발현 벡터(예를 들어, Ti 플라스미드)에 의해 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 포유류 세포(예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터), 또는 포유류 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터; 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)의 게놈으로부터 유래한 프로모터, 및 코딩 서열을 함유하는 재조합 발현 작제물을 보유하는, 포유류 세포 시스템(예를 들어, COS, CHO, BHK, 293, 3T3)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본 발명의 벡터는 박테리아 플라스미드, 박테리오파지, 효모 에피솜, 효모 염색체 요소, 포유류 바이러스, 포유류 염색체, 및 이들의 조합, 예컨대 플라스미드 및 박테리오파지 유전 요소로부터 유래한 것, 예컨대 코스미드 및 파지미드(이들로 제한되지는 않음)로부터 유래할 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본 발명의 벡터는 폴리펩타이드의 발현에 사용될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 벡터는, 발현되는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 작동적으로 연결된, 시스 작용 조절 영역을 포함한다. 조절 영역은 구성적 또는 유도적일 수 있다. 적절한 시스 작용 인자는 숙주에 의해, 시험관내 번역 시스템에 의해, 보완 벡터에 의해, 또는 숙주로의 도입 시 벡터 자체에 의해 공급된다.
피욜리신의 단리를 수월하게 하도록, 융합 폴리펩타이드가 제조될 수 있고, 피욜리신은 비상동성 폴리펩타이드에 연결되고, 이것은 친화도 크로마토그래피에 의한 단리를 허용한다. 바람직하게는, 융합 폴리펩타이드는 당해 분야의 당업자에게 공지된 발현 시스템 중 하나를 사용하여 제조된다. 예를 들어, 피욜리신을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 이의 5' 또는 3' 말단에서 비상동성 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산에 연결된다. 핵산은 적절한 코돈 리딩 프레임에서 연결되어서, 융합 폴리펩타이드의 제조가 가능하게 하고, 피욜리신의 아미노 및/또는 카복실 말단은 비상동성 폴리펩타이드에 융합되어서, 이것은 융합 폴리펩타이드로서의 항원의 단순화된 회수를 허용한다. 융합 폴리펩타이드는 또한 항원이 정제 동안 분해되는 것을 방지할 수 있다. 몇몇 경우에, 정제 후 비상동성 폴리펩타이드를 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 융합 폴리펩타이드가 피욜리신과 비상동성 폴리펩타이드 사이의 연접부에서 절단 부위를 포함하는 것이 또한 고려된다. 절단 부위는 그 부위에서 아미노산 서열에 특이적인 효소에 의해 절단된 아미노산 서열로 이루어진다. 고려되는 이러한 절단 부위의 예는 엔테로키나아제 절단 부위(엔테로키나아제에 의해 절단됨), Xa 인자 절단 부위(Xa 인자에 의해 절단됨), 및 GENENASE 절단 부위(GENENASE; New England Biolabs(메사추세츠주 버벌리)에 의해 절단됨)를 포함한다.
면역원성 조성물에서 사용하기 위한 재조합 폴리펩타이드를 제조하기 위한 원핵생물 발현 시스템의 예는 글루타티온 S-전환효소(GST) 유전자 융합 시스템(Amersham Pharmacia Biotech(뉴저지주 피츠카테웨이))이다. 융합 단백질을 제조하기 위한 또 다른 방법은 항원을 코딩하는 DNA와 인프레임인 폴리히스티딘 태그를 코딩하는 DNA 서열을 연결하는 방법이다. 태그는 금속 친화도 크로마토그래피, 바람직하게는 니켈 친화도 크로마토그래피에 의한 융합 폴리펩타이드의 정제를 허용한다. Xpress System(Invitrogen(캘리포니아주 칼스바드))은 폴리히스티딘-폴리펩타이드 융합 단백질을 제조하고 이후 이를 단리하기 위해 구입 가능한 상업용 키트의 예이다. 또한, pMAL 융합 및 정제 시스템(New England Biolabs(메사추세츠주 버벌리))은 융합 폴리펩타이드를 제조하기 위한 방법의 또 다른 예이고, 여기서 말토스 결합 단백질(MBP)은 항원에 융합된다. MBP는 아밀로스 친화도 크로마토그래피에 의한 융합 폴리펩타이드의 단리를 수월하게 한다. 다른 융합 파트너, 및 이러한 융합을 생성하는 방법은 용이하게 이용 가능하고, 당해 분야의 당업자에게 공지되어 있다. 이 융합은 면역원성 조성물로서 이의 전체로서 사용될 수 있거나, 이것은 재조합 항원과 비상동성 폴리펩타이드 사이의 연접부에서 절단될 수 있다.
본 발명의 벡터는 발현 또는 디스플레이 벡터에 통상적으로 포함된 임의의 요소, 예컨대 복제 기원 서열, 하나 이상의 프로모터, 항생제 내성 유전자, 리더 또는 신호 펩타이드 서열, 다양한 태그 서열, 제한 부위, 리보솜 결합 부위, 번역 인핸서(전사 후 mRNA 안정성에 대해 줄기 루프 구조를 형성할 수 있는 서열), 중지 코돈이 결여된 아미노산을 코딩하는 서열, 및 박테리아 코트 단백질을 코딩하는 서열(이들로 제한되지는 않음)을 포함할 수 있다.
본 발명은, 하기 실시예로 어떤 식으로든 제한되지 않지만, 이에 의해 추가로 예시된다.
실시예
실시예 1. 피욜리신의 발현, 단리 및 정제를 위한 개선된 방법.
모든 발효 단계에 사용된 배지는 열 무균화된 트립톤/효모 추출물/트윈(Tween) 80/포도당/포스페이트/헤민 용액이다. 무균 여과된 비타민 용액 및 추가의 필터 무균화된 포도당 용액을 열 무균화 후 배지에 첨가하였다. 냉동된 야생형 트루에페렐라 피요제네스 앰플을 해동하고, 배지(0.5% v/v)를 함유하는 플라스크를 (약 30% 충전 용적에서) 접종하도록 사용하고; 이것을 5%에서 설정된 CO2 항온처리장치에서 37℃, 100rpm에서 16 내지 28시간 동안 항온처리하였다. 이후, 배지를 함유하는 제2 플라스크를 제1 플라스크로부터 10% v/v의 배양물에 의해 접종하고; 이후 이것을 5%에서 설정된 CO2 항온처리장치에서 37℃, 100rpm에서 다시 4 내지 8시간 동안 항온처리하였다. 이후, 발효장치를 제2 플라스크로부터의 0.5% v/v의 배양물에 의해 접종하였다. 온도를 37℃에서 유지시키고, 출발 pH는 7.2 내지 7.4였다. pH가 pH 6.15로 하강하게 하고, 이후 30% NaOH에 의해 오직 1방향으로 제어하였다. 용존 산소를 0.05vvm의 최대 유속에서 순수한 산소를 사용하여 5%에서 유지시키고, 용기를 느린 속도(2리터 규모에서 20rpm)에서 교반하였다. 발효장치를 포도당 소진 바로 전에 2g/ℓ의 최종 농도로 pH 6.15로 조정된 EGTA 용액에 의해 스파이킹하였다. 이것 동시에, 무균 여과된 락토스 용액을 4 내지 8g/ℓ의 최종 농도로 첨가하였다. 이후, 보통 대략 48 내지 80시간 동안 인프로세스 초고성능 액체 크로마토그래피(in-process ultra performance liquid chromatography; UPLC) 분석을 통해 수확 시간을 결정하였다. 이후, 수확 배양물을 20℃ 미만으로 냉각시키고, 이후 세포를 원심분리 및 여과에 의해 제거하였다. 상청액을 10kDa(컷오프) 변형 셀룰로스 아세테이트 UF 막을 사용하여 접선 흐름 여과에 의해 10 내지 30배 농축시켰다. 이후, 상청액을 50mM MES, 500mM Na2SO4(pH 5.8)를 함유하는 완충제를 사용하여 4 내지 5회 세척에 의해 정용여과시켰다. 이후, 정용여과된 보유물을 무균 여과시키고, 정제에 준비시켰다.
상류 공정 개선에 관해, 조직학적으로 배양물은 정지 단계로 4시간에 피욜리신의 최대 양을 생성하고, 이것은 포도당 소진이 발행할 때이다. 이후, 유기체는 프로테아제를 생성하기 시작하지만, 이것은 시간이 지나면서 독소를 완전히 분해한다. 따라서, 세포의 수확은, 600㎚에서의 O.D.가 통상적으로 약 3.7일 때 포도당 소진 후 통상적으로 3 내지 4시간에 수행된다. 이후, pH를 5.7 내지 5.9로 조정하여서, 프로테아제를 추가로 저해한다. 이 공정에서의 일 개선은 프로테아제가 EGTA의 첨가에 의해 불능이 된다는 발견이다. 따라서, 포도당 소진 전의 또는 이때의 EGTA의 첨가는, 프로테아제의 불활화로서, 최대 수율과 일치하도록, 세포의 수확에 허용되고, 새로운 탄소원을 가지는 배양물의 후속하는 공급은 더 높은 수율의 달성이 가능하게 하였다. 또한, 상청액의 농도는 10kDa PES 한외여과 카세트를 사용하여 이전에 실행되었고; PLO의 회수는 불과 약 65%였다. 그러나, 10kDa 변형 셀룰로스 아세테이트(예를 들어, Hydrosart) 한외여과 카세트로의 변화는 PLO의 회수가 약 100%로 개선이 가능하게 하였다.
이 공정의 추가의 개선은 포스페이트 완충, 배양물에 대한 비타민 용액의 첨가, 및 마그네슘의 첨가를 포함하였다. 포스페이트 완충과 관련하여, pH 6.8에서의 25mM 인산나트륨은 최적인 것으로 결정되었다. 비타민 용액에 관해서는, 하기 조성을 추가하였다: 비타민 B12(2.5㎎/ℓ); 미오-이노시톨(50㎎/ℓ); 유라실(50㎎/ℓ); 니코틴산(10㎎/ℓ); 칼슘 판토테네이트(50㎎/ℓ); 피리독살-HCl(25㎎/ℓ); 피리독사민-2HCl(25㎎/ℓ); 리보플라빈(50㎎/ℓ); 티아민-HCl(25㎎/ℓ); p-아미노벤조산(5㎎/ℓ); 바이오틴(5㎎/ℓ); 엽산(20㎎/ℓ); 니아신아마이드(25㎎/ℓ); 및 β-NAD(62.5㎎/ℓ). 마그네슘의 첨가와 관련하여, 이것은 시트르산마그네슘, 글루콘산마그네슘 또는 황산마그네슘의 형태로 제공될 수 있었다.
이 공정의 추가의 개선은, 단일 또는 다중 탄소원 보충을 이용하여, 회분식 및/또는 유가식 발효 전략을 포함하였다. 탄소원은 추가적인 영양 인자 및/또는 염, 예컨대 헤민 및 포스페이트를 또한 함유할 수 있다. 피욜리신의 성장 및 생성을 최대화하기 위한 계획된 발효 최적화 전략은 용존 산소, 레독스, pH 및 이산화탄소 수준의 조절을 포함한다. 일부 실험 작업이 더 낮은 조작 온도가 유리할 수 있다는 것을 나타내면서, 항온처리 온도는 또한 개선될 수 있다.
피욜리신의 하류 프로세싱 및 정제와 관련하여, 50mM MES, 500mM Na2SO4(pH 5.8)에 의해 평형화된 페닐 세파로스 수지를 사용하여 소수성 상호작용 크로마토그래피(hydrophobic interaction chromatography; HIC)를 통해 단백질을 정제하고; 이것을 50mM MES(pH 5.8) 중에 용리시켰다. 이후, 정제된 단백질을 농축시키고, 이후 포스페이트 완충제(나트륨 또는 칼륨)로 완충제 교환시켰다. 이후, 용혈성 활성을 결정하여서, 활성 단백질이 정제된다는 것을 보장한다. 이것은 검정 완충제에 의한 피욜리신의 연속 희석, 및 37℃에서의 말 적혈구와의 피욜리신의 항온처리에 의해 수행된다. 이후, 이것을 원심분리하여 온전한 적혈구를 펠렛화하고, 가용성 (용해된) 재료를 새로운 플레이트로 옮기고, 405nm에서의 O.D.를 측정하고, 결과를 작도하였다. 곡선의 중간점에서 용혈성 단위(haemolytic unit; HU)를 결정하고, 용혈성 단위가 1000HU 미만일 때 피욜리신은 해독되는 것으로 생각된다. 이후, UPLC 및 SDS-PAGE를 사용하여 단리된 단백질의 동일성을 확인하였다. 마지막으로, 피욜리신을 20℃에서 24-48시간 동안 0.25-0.5%(v/v) 포르말린에 의한 처리에 의해 불활화하고, 이후 무균 여과시켰다.
실시예 2. 피욜리신의 발현 수준을 증가시키기 위한 추가적인 개선.
자궁염 시드 배지를 제조하는 데 필요한 원료는 표 1 및 표 2(목표 농도 포함)에 기재되어 있다.
Figure 112017099992213-pct00001
Figure 112017099992213-pct00002
헤민 클로라이드 용액을 항상 필요한 날짜에 새로 제조하였다. 헤민 클로라이드 분말을 처음에 1M NaOH의 적절한 용적 중에 용해시키고, 완전히 용해될 때, 증류수에 의해 용적까지 채웠다.
폴리소르베이트 80의 높은 점도로 인해, 자궁염 시드 배지를 제조하는 데 있어서 제1 단계로서 유리 비이커에 이 성분을 직접 칭량하는 것이 더 쉽다. 증류수의 약 60%의 최종 용적을 자기 교반기를 가지는 비이커에 첨가하고, 용액을 혼합하고 약 50 내지 60℃로 가열하도록 진행시켰다. 이 용액이 가열될 때 혼탁해진다는 것에 주목한다. 표 2에 나타난 순서로 모든 다른 성분을 천천히 첨가하였다. 모든 성분을 완전히 용해시키고, 증류수에 의해 용적까지 채웠다. 121℃에서 15 내지 20분 동안 배지를 열 무균화시켰다. 배지는 실온에서 7일의 반감기를 가진다. 이 짧은 반감기는 헤민 함량으로 인한다. 기본 배지가 헤민 없이 제조되면, 이것은 실온에서 반감기를 약 3개월로 연장할 것이다. 필터 무균화된 헤민 클로라이드 용액을, 필요한 바대로, 벌크 기본 배지의 일부에 첨가할 수 있었다. 그러나, 소정의 시장에 대해, 이것은 사용 전에 재료의 이물질 시험을 요할 것이다.
35ℓ의 파일럿 규모를 포함하여 이것까지 수행된 모든 발효 연구에 대해, 충분한 접종원 용적을 제공하기 위해 오직 2개의 시드 단계가 필요하다. 제1 단계는 정지상 단계로 성장할 수 있고, 이의 항온처리 기간에서 많은 유연성을 가진다. 제2 단계는 세포를 "새롭게 하도록" 사용되고, 지수 성장에서 발효 단계로 이송될 것이다.
매끄러운 벽 및 배기 캡이 구비된 일회용 코닝(Corning) 엘렌마가어 플라스크가 현재까지 모든 발효 연구에 사용되었다. 그러나, 다른 일회용 또는 비일회용 배양 플라스크는 동등하게 우수해야 한다. 모든 시드 단계에 대해, 플라스크를 전체 용적의 32%까지 충전하고, 접종 후, 5% 및 100rpm으로 설정된 CO2 진탕 항온처리장치에서 항온처리하였다. 크게 개신된 성장으로 인해 CO2 항온처리장치를 처음에 사용하였다. 그러나, 훨씬 더 우수한 성장 배지가 이후에 개발되었는데, 그래서 표준 항온처리장치가 이제 성공적일 수 있다(이 연구는 수행되지 않았다).
티. 피요제네스 마스터 시드로부터의 시드 계대배양의 최대 수를 시험하는 실험은 피욜리신 수율에 해로운 효과가 없다는 것을 나타낸다. 실험 설계는 10,000ℓ의 이론적 최종 발효 배양 용적에 기초하고, 이로써 마스터로부터의 7회 계대배양은 이 규모확장 공정에 충분할 것이다. 이것은 마스터 시드로부터의 넉넉한 3회 계대배양에 의해 작업 시드 뱅크를 제조하는 것에 기초한다.
실험은 마스터 시드로부터의 6차 계대배양에 의해 접종된 35ℓ의 파일럿 발효장치에서 피욜리신 생산성을 시험하였다. 처음의 5회 계대배양은 125㎖ 플라스크에서 40㎖ 용적이고, 6차 시드 단계는 1000㎖ 플라스크에서 320㎖이었다.
시드 단계 1(125㎖ - 규모 실시예 )
티. 피요제네스 워킹 시드 앰플을 해동하고 무균으로 개방한다. 0.5% v/v의 앰플을 가지는 125㎖의 매끄러운 벽의 플라스크에서 40㎖의 자궁염 시드 배지를 접종한다. 5%로 설정된 CO2 항온처리장치에서 100rpm에서 진탕 플랫폼에서 37℃에서 16 내지 28시간 동안 호기성으로 항온처리한다. OD600은 3 내지 7이어야 하고, 잔류 포도당이 남아 있지 않아야 한다는 것을 보장한다(섹션 3.6.2 참조). 양 또는 말 혈액 한천 플레이트로 스트라이킹함으로써 순도에 대해 배양물을 시험해야 한다(섹션 3.6.5 참조).
시드 단계 2(125㎖ - 규모 실시예 )
10% v/v의 시드 단계 1(SS1)을 가지는 125㎖의 매끄러운 벽의 플라스크에서 40㎖의 자궁염 시드 배지를 접종한다. 5%로 설정된 CO2 항온처리장치에서 100rpm에서 진탕 플랫폼에서 37℃에서 4 내지 8시간 동안 호기성으로 항온처리한다. OD600은 1 내지 3이어야 하고, 발효장치/들의 접종 전에 시드 단계 2(SS2)에 약간의 잔류 포도당 남아 있다는 것을 보장한다(섹션 3.6.2 참조). 양 또는 말 혈액 한천 플레이트로 스트라이킹함으로써 순도에 대해 배양물을 시험한다(섹션 3.6.5 참조).
자궁염 생성 기본 배지를 제조하는 데 필요한 원료가 표 3에 기재되어 있다.
Figure 112017099992213-pct00003
자궁염 생성 기본 배지의 일반 제법은 자궁염 시드 배지에 대해 상기 기재된 것과 동일하다. 배지는 유사하지만, 헤민 클로라이드 첨가를 가지지 않고 더 낮은 포도당 농도를 가진다. 121℃에서 30 내지 60분 동안 발효장치에서 필요한 용적의 기본 배지를 열 무균화시킨다.
이 배지는 높은 열 무균화 로드에 민감한 트립톤 콩 브로쓰(Tryptone Soya Broth; TSB) - 기반 배지를 대체하고, 이로써 독소 수율은 크게 감소된다. 이 개선된 배지는 훨씬 더 열 내성이지만, 트립톤을 TSB에 비해 높은(약 2.5 g/ℓ의 TSB에 동등) 및 낮은(0.5 g/ℓ) 포도당 농도와 오직 비교하기 위해, 헤민은 이 개발 연구로부터 의도적으로 배제된다. 의도는 헤민과 함께 또는 이것 없이 열 무균화된 개선된 배지를 후에 비교하기 위한 것이다. 이 작업은 아직 수행되지 않았다.
자궁염 생성 기본 배지를 발효장치/들에서 열 무균화시키고 냉각시킨 후, 표 4에 기재된 비율로 필터 무균화된 성분 1 및 2를 첨가함으로써 자궁염 컴프리트 생성 배지를 제조한다. 이 배지의 잔류 포도당 농도는 14±2mM이어야 한다. 잔류 포도당이 8mM 미만이고, OD600가 2.5 초과일 때, 접종 후 대략 10 내지 12시간에 EGTA 및 락토스 용액을 첨가한다(각각 섹션 3.5.4 및 3.5.6 참조). 락토스 용액은, 볼루스 또는 연속 공급 전략이 이용되는지에 따라, 성분 번호 4a 또는 4b로서 첨가된다.
Figure 112017099992213-pct00004
비타민 스톡 용액
비타민 스톡 용액을 제조하는 데 필요한 원료는 표 5에 기재되어 있다. 조합된 비타민 K1 및 K2 첨가는 플라스크 및 발효 연구 둘 다에서 수율 개선을 나타내지 않았다. 이 추가적인 복잡함이 정당화되는지를 조사하는 데 추가의 작업이 필요하므로, 이것은 현재의 비타민 스톡 용액에 포함되지 않는다. 비타민 K1 및 K2 중 오직 하나 또는 둘 다가 유리한지가 공지되어 있지 않다. 비타민 K1 및 K2는 수용성이 아니고, 수행된 실험에 대해 DMSO 중에 용해된다.
Figure 112017099992213-pct00005
-20℃에서 냉동되고 12개월 이하 동안 저장될 수 있는 비타민의 비무균 스톡 용액을 제조하는 것이 더 쉽다. 차가운 증류수의 최종 용적의 약 20 내지 30%를 자기 교반기를 가지는 유리 비이커, 스카치 병 또는 유리 엘렌마가어 플라스크(또는 임의의 다른 적합한 용기)에 첨가한다. 각각의 성분을 차례로 칭량하고, 격렬한 교반에 의해 차가운 증류수에 의해 용기로 세정한다. 용적까지 채우고, 모든 성분이 완전히 용해되도록 보장하고, 이후 40㎖의 비무균 분취량으로서 분배하고, -20℃에서(또는 원하는 경우 더 차갑게) 동결시킨다.
비타민/ 헤민 용액
독소 수율에 상당히 영향을 미치지 않으면서, 20 내지 30분 동안 자궁염 생성 기본 배지의 헤민 클로라이드 성분을 열 무균화할 수 있다. 피욜리신 수율에 상당히 영향을 미치지 않으면서, 더 높은 열 로드를 사용하여 헤민 클로라이드를 함유하는 배지가 열 무균화될 수 있다는 것을 결정하기 위해 추가의 작업이 필요하다. 이것은 전체적 백신 플랫폼의 확립 및 튼튼함 둘 다가 가능하게 하도록, 항원 제조 설계의 중요한 일부일 것이다. 호주는 예를 들어 열 무균화된 또는 감마 조사된 헤민 클로라이드 첨가를 오직 허용할 것이다(즉, 필터 무균화된 헤민 클로라이드 첨가는 이물질 시험 없이 호주 규제 기관에 허용 가능하지 않을 것이다). 그러나, 이것이 실험적으로 입증될 때까지, 필터 무균화된 비타민/헤민 용액은 열 무균화 후 배지 첨가제로서 사용된다. 이의 짧은 반감기로 인해 발효장치/들을 접종하는 날에 이 용액을 제조하는 것이 중요하다. 조합된 헤민 및 비타민 용액은 발효장치에서 용적 증가를 최소화하도록 사용된다(달리 헤민 클로라이드 및 비타민 용액 둘 다의 40㎖/ℓ가 필요할 것이다). 비타민/헤민 용액을 제조하는 데 필요한 원료는 표 6에 기재되어 있다.
Figure 112017099992213-pct00006
비타민/헤민 용액을 필요한 날에 항상 새로 제조한다. 필요한 양의 비타민 스톡 용액을 해동하고 진탕시킴으로써 혼합한다. 헤민 클로라이드를 처음에 1M NaOH의 적절한 용적 중에 용해시키고, 완전히 용해될 때, 필요한 용적의 비무균 비타민 용액에 첨가한다. 이것은, 첨가된 NaOH의 양만큼 필요한, 전체보다 약간 더 큰 용적을 만들지만, 이 1% 증가는 무시할만하다. 기본 배지에서의 헤민에 대한 열 무균화 효과가 해결될 때까지, 이 제조 방법은 성공적이다. 필터 무균화된 헤민/비타민 용액에 의해 남도록 결정되는 경우, 용적의 95%에서 비타민 스톡 용액을 제조하고 이후 헤민 첨가 후 용적까지 채움으로써, 이것은 더 정확히 수행될 수 있다. 용액을 필터 무균화하고, 제조 일에 사용에 준비될 때까지 2 내지 8℃에서 저장한다.
Figure 112017099992213-pct00007
자기 교반기를 가지는 알루미늄 호일(또는 유사)에서 커버된 유리 비이커에서 증류수의 최종 용적의 약 50%가 비등에 가깝게 한다. 포도당 분말을 천천히 첨가하고, 완전히 용해될 때까지 (용액이 비등하는 것을 피하면서) 가열에 의해 커버하면서 계속해서 교반한다. 용적까지 채우고, 냉각되게 하고, 필터 무균화한다.
Figure 112017099992213-pct00008
자기 교반기를 가지는 유리 비이커에서 차가운 증류수의 최종 용적의 약 60%까지 EGTA를 첨가한다. 연속 교반에 의해 용액의 초기 pH를 측정하고, 이 용액은 이 단계에서 슬러리로 보일 것이다. 완전히 용해될 때 5.8의 목표 pH에 의해 필요한 전체 30% w/v NaOH 용액의 80%를 신속히 첨가한다. 거의 용해될 때, 목표 pH를 달성하는 데 필요한 30% w/v NaOH의 잔량을 천천히 첨가하면서, 완전 용해를 달성한다. 제조의 거의 종료 시 목표 pH를 오버슈트하는 것이 쉽고, 그래서 이때에 최종 조정에 대해 1M NaOH를 사용하는 것이 더 좋을 수 있다. pH 목표가 약간 오버슈트되는 경우, 이것은 2M HCl 용액(또는 유사)에 의해 뒤로 조정될 수 있다. 5.8의 pH로 정확하게 조정한 후, 용적까지 채우고 필터 무균화시킨다.
Figure 112017099992213-pct00009
자기 교반기를 가지는 알루미늄 호일(또는 유사)에서 커버된 유리 비이커에서 증류수의 최종 용적의 약 50%가 비등에 가깝게 한다. 락토스 분말을 천천히 첨가하고, 완전히 용해될 때까지 (용액이 비등하는 것을 피하면서) 가열에 의해 커버하면서 계속해서 교반한다. 용적까지 채우고, 냉각되게 하고, 필터 무균화한다.
Figure 112017099992213-pct00010
자기 교반기를 가지는 비이커에 증류수의 최종 용적의 대략 80%로 락토스 분말을 첨가하고, 완전히 용해될 때까지 혼합한다. 용적까치 채우고 필터 무균화시킨다.
발효 확장성
티. 피요제네스 발효 공정은 0.5, 2, 5 및 35ℓ의 규모에서 성공적으로 성장되었다. 발효 공정이 실험실로부터 파일럿 규모로 규모확장될 때 보통 가장 도전적인 물리화학적 능력 변화가 관찰된다. 그러나, 상기 공정에 의한 35ℓ의 파일럿 규모로의 규모확장 동안 문제가 관찰되지 않아서, 작은 실험실 규모 발효장치로부터 완전히 우수한 확장성을 입증한다. 지금까지 관찰된 우수한 공정 확장성에 기초하여, 제조 용기까지 확장할 때 문제가 예상되지 않았다.
표 11은 시험된 발효장치의 중요한 물리적 매개변수를 요약한다.
Figure 112017099992213-pct00011
Figure 112017099992213-pct00012
발효 전략
접종 전에, 현재까지 시험된 발효장치에 대한 출발 조작 조건이 표 12에 기재되어 있다.
Figure 112017099992213-pct00013
용존 산소 제어 및 CO 2 환경
티. 피요제네스로부터 피욜리신의 가장 높은 수율을 생성하기 위한 현재의 전략은 0.5%의 활발히 성장하는 SS2 세포에 의해 각각의 발효장치에서 자궁염 컴플리트 생성 배지를 접종하는 것이다. 초기 성장은, 0.05vvm의 최대 유속으로, 5%의 용존 산소 설정점을 유지시키기 위해, 요구 시, 순수한 산소의 사용 및 느린 교반 속도에 의해 시작한다. 이 전략 배후의 개념은 세포가 신속히 성장하게 허용하는 것뿐만 아니라, 가스 버블에 의해 액상으로부터 스트리핑되는 CO2를 최소화하는 것이다. 이것은 공기 대신에 산소를 사용하는 것에 대한 이유이다. DO 프로브 기능이상에 의한 문제는 이 전략을 이용하여 때때로 문제를 발생시키고, 그래서, 레독스 제어 단계까지 0.05vvm 이상의 연속 산소 유속을 시행하기에 이것은 동등하게 우수할 수 있다.
레독스 제어
티. 피요제네스에 대한 발효 전략의 일부로서 레독스 제어를 이용하는 이유는, 피욜리신 생산성을 최대화하기 위해, 최적 미호기성 환경 조건을 정확하게 유지시키는 것이다. 기술적으로 정확하지 않지만, 이것은 표준 광학 또는 폴라로그래피 용존 산소 프로브에 의해 측정될 수 없는 매우 낮은 수준의 용존 산소를 제어하는 방법이다. 레독스 제어는 또한 미호기성 배양물 및 호기성 배양물 둘 다에서 중요한 이화 반응을 추진하는 것을 돕는다. 레독스 제어의 이점은 매우 개선된 공정 견고성이고, 이로써 복잡한 배지 성분(예를 들어, 트립톤 및 효모 추출물)의 뱃치마다의 가변성은 최적 레독스 수준에 대한 시스템 자가 조율에 의해 최소화된다. 레독스 제어가 없는 시스템에서, 트립톤의 불량한 뱃치에 의해 관찰된 더 낮은 세포 수율은 준최적 미호기성 조건을 생성시켜서 더 낮은 피욜리신 수율을 생성시킨다. 레독스 제어는, 원료의 품질의 작은 변동과 무관하게, 최적 수준으로 발효 미호기성 환경을 자동으로 조정하는 능력을 가진다. 레독스 제어의 단점은 레독스 프로브가 보정될 수 없을 뿐만 아니라, 오직 이의 출력이 표준 용액의 이론적 값에 대해 확인된다는 것이다. 이 값은 또한 약 ±20mV의 꽤 큰 오차를 가진다.
제어 설정점보다 낮게 레독스를 추진하는 데 필요한 "모멘텀"을 제공하기 위해 시스템이 충분히 큰 용존 가스 환경을 생성하기 위해 충분히 활발히 성장하는 세포를 요하므로, 레독스 제어는 접종 직후 사용될 수 없다. 이것은 pO2 제어가 발효의 초기 성장 단계에 사용되는 이유이다.
레독스를 증가시키기 위해 고정된 공기 스파징 속도에서의 교반기 속도의 변경을 이용함으로써 그리고 레독스를 감소시키기 위해 공기 스파징 속도를 감소시켜서, 현재의 레독스 제어 전략이 설계된다. 최종 GMS 발효 방법에서 임의의 순수한 산소를 사용하기 위한 필요를 전체적으로 제거하기 위한 노력으로 산소 대신에 공기가 사용된다. 공기를 사용하는 것의 단점은, 피욜리신 수율을 최대화하기 위한 최적 용존 CO2 농도가 고조된 가스 버블링 속도에 의해 가능하지 않을 수 있다는 것이다.
현재 알고리즘은 레독스를 제어하기 위해 사용된다(부록 2 참조). 알고리즘의 이 유형은 이의 세련의 수준 및 자가 조율하는 능력에서 개선될 수 있지만, 레독스 제어에 의해 최종 제조 공정으로 진행하도록 결정이 이루어진 경우, 더 견고한 대안이 이용 가능하다. 일 해결책은 적절한 발효장치 벤더 커스텀이 pO2 제어에 대해 이미 설치된 것과 유사한 캐스케이드 PID 제어 시스템을 만들게 하는 것일 수 있고, 이로써 제어는 교반기, 공기 및 산소 스파징에 걸쳐 또한 케스케이드할 수 있다. 대안적으로, 배양물에 걸쳐 전기 전류를 통과시킴으로써 레독스를 제어하는, 이용 가능한 고객화된 레독스 제어 발효장치가 존재한다.
CO 2 제어
CO2를 제어하기 위해 전략이 아직까지 시험되지 않았다. 그러나, 용존 CO2 농도를 제어하는 것이 피욜리신 수율에서의 일치도를 최적화하고 유지시키는 것 둘 다에서 도울 수 있다고 생각된다. 동일계로 Mettler Toledo InPro5000i 용존 CO2 프로브에 의해 레독스 제어 전략을 시험하면서, 더 높은 가스 스파징 유속이 용존 CO2 농도에 상당한 효과를 가지는 것이 명확히 관찰되었다. 교반기 속도는 CO2 수준에 최소 효과를 가지는 것으로 나타났다.
레독스 제어 알고리즘은 용존 CO2를 제어하기 위해 또한 사용될 수 있다. 기재된 보완 알고리즘은 용존 CO2 프로브 또는 다른 CO2 측정 장치(예를 들어, 배기가스 측정)로부터의 출력을 제어하기 위해, 필요한 바대로, 가스 스파징 유속을 증가시키거나 감소시킬 수 있다. 이것은 또한 별개의 질량 흐름 제어장치로부터 수행될 수 있어서, 레독스 및 CO2 제어는 서로 독립적이다. 이 개념은 수동으로 시험되고 일하지만, 처음에 용존 CO2 농도가 피욜리신 수율을 최적화하는 데 중요한지 여부 및, 중요한 것으로 발견된 경우, 최적 제어 수준이 무엇인지를 결정하기 위해 약간의 노력이 필요하다.
용존 CO2가 피욜리신 수율을 최적화하는 데 필요한 것으로 발견되는 경우, 필요한 더 낮은 가스 유속을 통해 가능해진 더 미세한 제어로 인해, 공기보다는 순수한 산소 스파징을 사용하여 최적 수준을 제어하는 것이 아마도 더 쉬울 것이다.
프로테아제 저해
20밀리리터의 10% EGTA 용액(pH 5.8)은 잔류 포도당 농도가 8mM 미만이고, OD600이 2.5 초과일 때 배양물의 리터당 첨가되어야 한다. 초기 포도당 농도가 14±2mM의 정확한 출발 범위인 경우, EGTA 첨가의 시기는 접종 후 약 10 내지 12시간이다. 이것은 발효 전략의 중요한 일부이고, 면밀히 모니터링되고 조심스럽게 수행되어야 한다. EGTA가 많은 2가 금속 이온에 킬레이트화지만, 이것은 Ca2 + 이온에 대한 매우 높은 친화도를 가진다. EGTA가 배양물에 첨가되는 이유는 프로테아제의 활성(및 가능하게는 형성)을 저해하는 것이다. 본 발명자들은 칼슘이 티. 피요제네스 배양물에서 프로테아제 활성에 관여한 주요 금속이라는 것을 입증하였다. 추가의 칼슘이 보통 양의 EGTA를 가지는 플라스크에 첨가될 때, 피욜리신 농도는 신속히 감소하지만, 마그네슘 첨가는 수율을 개선한다.
락토스
성장이 지연되지 않도록 포도당 소진 전에 락토스 용액을 첨가하는 것이 중요하지만, 이용된 전략은 EGTA 첨가 후 락토스를 배양물에 첨가하는 것이다. 이것은 배양 예비 접종에 첨가될 수 있지만, EGTA 첨가 후 이것을 첨가하는 유일한 이유는 훨씬 더 중요한 EGTA 첨가 단계에 대한 정확한 잔류 포도당 모니터링이 가능하게 하는 것이다. 락토스의 존재 하에 포도당 농도를 모니터링할 수 있지만, 이 방법론은 수율에 대한 임의의 해로운 효과 없이 용이하게 변할 수 있다.
회분식 및 유가식 락토스 공급 둘 다를 이용하여 몇몇 연구가 수행되었다. 이때에 유가식 전략이 락토스의 단일 또는 몇몇 볼루스 첨가에 대해 임의의 이익을 제공하는지에 대해 공지되어 있지 않다. 50% 락토스 용액 첨가를 사용하여 볼루스 첨가가 수행된다. 필요한 매우 낮은 공급 속도로 인해, 6% 락토스 용액은 유가식 발효에 사용되어서, 2ℓ의 워킹 용적에서 연동 펌프의 사용이 가능하게 한다. 이 방법의 단점은 더 높은 희석 효과이다. 더 농축된 용액은 더 높은 정확도 펌핑 방법(예를 들어, 시린지 펌프)을 이용하여 첨가될 수 있다. 대안적으로, 유가식 전략을 이용하여 이익이 관찰되는 경우, 다른 영양소 및/또는 성분(예를 들어, 트립톤, 마그네슘, 헤민 클로라이드 등)이 공급물에 첨가될 수 있다.
마그네슘
다양한 마그네슘 공급원을 사용하여 작은 플라스크 연구를 수행한다. 무기 황산마그네슘은 3개의 유기 마그네슘 공급원(마그네슘 글루코네이트, 마그네슘 시트레이트 및 엽록소)에 등몰량의 마그네슘 농도에서 비교된다. 마그네슘 글루코네이트는 가장 높은 피욜리신 수율을 제공하지만, 이 원료가 공급받기에 어려운 경우, 최적화 연구는 이미 이용 가능한 다른 마그네슘 공급원을 사용하여 용이하게 수행될 수 있다. 유기 마그네슘 공급원을 시험하는 것 배후의 개념은 EGTA가 무기 공급원의 약한 이온 결합에 의한 것보다 더 단단히 결합된 마그네슘을 덜 봉쇄해야 한다는 것이다. (사실무근일 수 있지만) 단순히 더 높은 수준의 무기 마그네슘을 첨가하는 것이 더 많은 프로테아제 생성을 허용할 수 있다는 우려가 존재한다. 마그네슘이 성장에 필요하므로, 마그네슘 첨가에 의해 관찰된 증가한 세포 질량은 (이 플라스크 연구에서 관찰된 바대로) 더 높은 피욜리신 수율을 생성시켜야 한다.
인프로세스 분석 방법
광학 밀도
분광광도계에서 600㎚에서 측정된 광학 밀도의 변화에 의해 세포 성장을 결정한다. 샘플이 흡수 측정 정확성의 직선 범위 내에 유지된다는 것을 보장하기 위해, 값이 0.5 초과할 때, 물은 일반적으로 희석제로서 사용된다. 제조 성장 배지를 사용하는 것은 정확성에서 약간의 개선을 제공하여서, 배경 흡수가 공제된다. 이것이 배양 성장 단계의 초기 단계의 결과에 실제로 오직 영향을 미치면서, 이것은 일반적으로 필요한 것으로 생각되지 않는다.
잔류 포도당
상업적으로 구입 가능한 휴대용 혈액 포도당 분석장치를 사용하여 잔류 포도당를 측정한다. 시험 스트립을 장치로 삽입하고 표시를 기다린 후, 이것은 샘플에 준비되고, 약 10 내지 20㎕의 비여과된 발효 배양물은 시험 스트립의 선단에 위치하고, 결과는 리터당 밀리몰로 제공된다.
잔류 락토스
잔류 포도당에 사용된 동일한 분석장치는 또한 잔류 락토스에 대한 결과를 제공한다. 제공된 실제 값은 정확하지 않지만, 이것은 여전히 상대 잔류 락토스 수준의 모니터링이 발효 모니터링에 성공적이게 한다. 그러나, 이 장치를 사용하여 잔류 락토스 수준이 3mM 아래로 떨어질 때, 성장이 상당히 느려진다는 것이 관찰되었다. 볼루스 및 유가식 락토스 공급 둘 다에 대해, 3mM 초과의 잔류 락토스 농도를 유지시키는 것이 필요하다.
피욜리신 농도
피욜리신 농도를 측정하기 위해 사용된 주요 인프로세스 분석 기법은 UPLC를 사용한 역상 액체 크로마토그래피이다. 다른 매우 민감한 기법은, 임의의 용혈 단위를 미정제 표준품으로 배정함으로써 피욜리신 농도를 측정하고, 이후 이 표준품에 참고함으로써 다른 샘플을 측정하는, 용혈 검정이다. 이 검정은 피욜리신 톡소이드 샘플에서 불활화 수준을 측정하는 데 있어서 매우 유용하다. 이의 높은 민감도로 인해, 희석 오차는 높은 농도(약 50㎍/㎖ 초과)를 가지는 피욜리신 샘플에 대해 확대되어서, 극심한 주의가 취해지지 않는 한, 검정이 꽤 가변적이게 만든다.
순도 시험
배양 순도를 양 또는 말 혈액 한천 플레이트(SBA 또는 HBA)로 스트라이킹함으로써 시험할 수 있다. 플레이트를 37℃에서 48 내지 96시간 동안 호기성으로 항온처리한다. CO2 환경에서의 항온처리는 성장 속도를 증가시킨다. 순수한 배양물은 작은 백색/크림색의 볼록한 빛나는 콜로니로 보일 것이다. 플레이트는 또한 항온처리될 수 있지만, 티. 피요제네스 콜로니가 이 조건 하에 (비록 더 느리지만) 또한 성장할 것이다. 오염은 플레이트 상의 다른 콜로니 유형을 관찰함으로써 확인된다.
수확 및 세포 제거
수확의 시간은 현재 잘 규명되지 않았지만, 피욜리신 농도가 접종 후 약 60 내지 70시간에 후기 정지 단계에서의 증가를 중단시킬 때 시작한다.
조사 및 개발 규모 둘 다에서의 배양 수확 및 세포 제거는, 배양물을 20℃ 미만으로 냉각시키고, 4℃에서 15 내지 30분 동안 6,000 x g에서 예비멸균 원심분리 포트에서 무균으로 수확하고 원심분리함으로써, 수행된다. 이후, 상청액을 적합한 무균 용기로 무균으로 경사여과시키고, 낮은 단백질 결합 무균화 등급 필터를 통해 필터 무균화시켰다. 셀룰로스 아세테이트 막은, 이의 매우 낮은 단백질 결합 능력으로 인해, 제1 선택이다. 일반적으로 여과되는 용적에 알맞게 선택된, 적절한 필터 막 구역을 가지는 Sartorius Sartobran 필터가 사용된다. 예를 들어, 500㎠ Sartorius Sartobran P는 적어도 5ℓ의 배양 상청액을 여과시키기 위한 충분한 역량을 가진다. 이 필터는 0.45㎛ 전치필터 및 0.2㎛ 무균 필터를 가지지만, 상청액은 여과시키기에 어렵지 않고, 여기서 다른 벤더 균등물이 동등하게 적합해야 한다.
농축 및 정용여과
비무균 공정으로서 Sartorius 10kDa Hydrosart(변형 셀룰로스 아세테이트) 및 10kDa PES(폴리에터 설폰) Sartocon Slice 카세트 둘 다에 의해 Sartorius 알파 접선 흐름 여과 장치를 사용하여 생성물 농축을 수행한다. Hydrosart 카세트는, PES에 대한 오직 약 70%와 비교하여, 100% 회수로 PES 카세트에 더 탁월한 성능을 입증한다. 이 결과는 제한된 수의 프로세싱 실행에 기초하고, 여기서 막 성능을 조심스럽게 비교하기 위해 더 격렬한 실험 시험이 필요하다.
농축 시작 전에, 초기 상청액 용적을, 접선 흐름 여과 장치로 분배된, 유리 측정 실린더에서 조심스럽게 측정하고, 이후 투과액 라인을 폐쇄한 채 10분 동안 순환시킴으로써 막/들에 걸쳐 컨디셔닝한다. 이 초기 설정 후, 모든 한외여과 프로세싱을 수행하고, 공급물, 보유액 및 투과액 압력은 각각 1.5, 0.5 및 0bar에서 유지되고, 생성물 온도는 15±2℃에서 유지된다. 피욜리신 미정제 상청액을 일반적으로 약 10배 농축시키고, 이후 50mM MES/500mM Na2SO4(pH 5.8)(정제 출발 완충제)에 의해 4 내지 5회 정용여과시킨다. 농축 및 정용여과 단계의 종결 시, 회수 속도를 감소시킬 수 있는 생성물 포밍을 최소화하도록 시스템을 조심스럽게 배수시킨다. 이후, 생성물 용적을 유리 측정 실린더에서 측정하여 최종 농도를 정확히 계산한다. 이후, 생성물을 셀룰로스 아세테이트 무균화 필터(일반적으로 Sartorius Sartobran 필터)를 통해 필터 무균화시키고, 즉시 정제되지 않는 경우, 이후 적합한 용적(보통 100 내지 250㎖)으로 분취하고, 정제에 준비될 때까지 -70℃에서 동결시킨다.
실시예 3. 피욜리신의 발현 수준을 증가시키기 위한 추가의 개선.
배지에서의 다양한 원료의 평가 전에, 발효 매개변수에 대한 추가의 개선이 이루어진다. 제어 매개변수와 관련하여, 벤치 규모 개발 작업에 대해, 교반에 의해 0.1vvm로 제한되지만, 레독스 설정점을 유지시키기 위해 필요한 경우 증가시키는, O2 스파징을 이용한 레독스 제어 전략은 최적인 것으로 결정되었다. 개발 작업에 사용된 레독스 설정점은 -447mV이었다. 레독스(mv) 범위를 확립하기 위한 추가의 작업, 및 산소 및 교반 제어의 잠재적 다른 방법이 수행될 것이다.
발효 제어 매개변수와 관련하여, 배양물의 출발 pH는 7.2였고, 발효 공정 동안 6.15의 pH로 하강하도록 허용되고, 여기서 이것은 유지된다. pH 제어 범위 및 일정한 pH 제어를 확립하기 위한 추가의 작업이 수행될 것이다. 초기 발효 성장 단계 동안, 용존 산소(D.O.)를 5%에서 유지시키고, 산소 스파징은 0.1vvm로 제한되고; 교반도 또한 제한된다. 배양물의 목표 광학 밀도(600㎚)가 적어도 2.5에 도달할 때, 배양물은 30g/ℓ의 최종 농도로 락토스 공급되고, 2g/ℓ의 최종 농도로 EGTA 공급된다. 이때에, 제어는, 발효의 연속된 성장 및 독소 제조 단계에 대해, D.O. 설정점로부터 레독스 제어 프로그램으로 스위칭된다. 피욜리신 생성의 피크 시간에 수확하기 위해, 독소 제조 단계가 추가적인 30-70시간 동안 계속된다.
가동 중인 이 개선된 매개변수와 관련하여, 기존의 제조 허가 공급원이 적합한지를 결정하기 위해, 배지 중의 다양한 원료의 평가를 수행하다. 다중 발효 실행 후, 동물 기반 폴리소르베이트 80 대신에 식물 기반 폴리소르베이트 80이 사용된다고 결론지어진다. 5그램/리터의 농도로 적정된, Becton Dickinson사 제공의 효모 추출물이 바람직한 것으로 또한 결정되었다. Oxoid(상표명) 트립톤이 사용되는 것으로 또한 결정되었다.
이전에, 피욜리신의 수율을 증가시키기 위해 발효 배양물에 첨가되는 비타민 용액을 인하우스로 제조한다. 발효 공정을 단순화하기 위한 노력으로, 상업적으로 구입 가능한 비타민 용액을 구입하는 것이 유용하다고 생각된다. "RPMI 1640"인, 시그마(Sigma)사제의 예비 혼합된 비타민 용액은, 인하우스 비타민 제조에 가장 가깝게 일치하므로, 선택된다. 2ℓ 발효장치에서 인하우스 비타민에 대해 RPMI 1640 비타민을 사용하여 피욜리신 수율을 시험하도록 실험을 설계하였다. 도 1에 도시된, 이 실험의 결과는 RPMI 1640 비타민 용액이 인하우스 비타민 용액과 비교하여 불량하게 수행된다는 것을 입증한다. 인하우스 비타민 용액에 존재하는 4개의 성분은 RPMI 1640 비타민 용액(β-NAD, 피리독살, 유라실 및 니코틴산)에 포함되지 않았다. 유라실 및 니코틴산이 발효 동안 소모되지 않는 것으로 나타나므로(데이터 비도시), β-NAD 및/또는 피리독살의 결여는 감소한 성능의 가장 그럴듯한 원인이라고 생각된다. β-NAD의 첨가 및/또는 RPMI 1640 비타민의 피리독살 보충이 이 비타민 용액의 성능을 증가시킬 수 있다는 가설을 시험하도록 실험을 설계하였다. 도 2에 도시된 바대로, 인하우스 비타민 용액과 보충된 RPMI 1640 비타민 용액 사이에 피욜리신 수율은 유사하였다. β-NAD 및/또는 피리독살이 배양 배지를 보충하기 위해 필요한 유일한 비타민 성분일 수 있는지를 시험하도록 추가의 실험을 설계하였다. 이 실험(도 3)의 결과는 피리독살이 피욜리신의 수율을 증가시키기 위해 배양 배지로 보충되는 데 필요한 유일한 비타민이라는 것을 확인시켜준다. 피리독살이 배지에 첨가될 때에 관해서, 이것은 열 무균화 후 무균 용액으로서 그렇게 되어야 하지만, 이것을 오토클레이빙함으로써, 배양물의 O.D.에 영향을 미치지 않으면서(도 4), 피욜리신 생성의 수준의 감소를 발생시키지 않았다(도 5).
배지에서 사용된 헤민과 관련하여, 분말화 원료의 조사가 도 6 및 도 7에 도시된 바대로 피욜리신 생성의 수준 또는 배양물의 O.D.에 직접적인 효과를 가지는 것으로 나타나지 않은 것으로 결정되었다. 도 8은 헤민 용액의 반감기가 증가하면서 피욜리신 생성이 감소한다는 것을 입증하고; 따라서, 헤민은 열 무균화 직전에 첨가된다.
다양한 배지 성분 이외에, 발효가 발생한 온도에 관한 추가의 조사를 수행한다. 이전에, 37℃에서 발효를 수행한다. 그러나, 후속하는 실험은 (더 높은 온도에 대한) 36℃의 더 낮은 설정점이, 배양물의 O.D.에 대한 상당한 효과를 가지지 않지만(도 9), 생성된 피욜리신의 양의 증가를 발생시키지 않는다는 것을 나타낸다(도 10). 심지어 더 낮은 온도가 피욜리신 생성의 수준에 가지는 효과가 어떤지에 대한 질의가 제기된다. 이 실험의 결과는, 더 낮은 온도가 배양물의 O.D.를 감소시키지만(도 11), 이것이 또한 생성된 피욜리신의 수준을 증가시키고, 현재의 최적 온도가 32℃(도 12)라는 결론을 발생시킨다. 32℃에서의 배양물의 온도를 유지시키는 것, 또는 이것을 발효 공정 동안 37℃로부터 32℃로 이동하는 것이 더 우수한 피욜리신 수율을 생성시키는지에 대해, 일정한 온도가 이동보다 더 우수하다는 것이 결정되었다(도 13).
실시예 4. 피욜리신 정제 공정에 대한 추가의 개선 .
95% 초과의 피욜리신 회수로, 10kDa 폴리설폰 중공 섬유 카트리지를 사용함으로써 청징된 발효 수확물의 농축을 수행한다. 농축 후, 0.425M 황산나트륨의 최종 농도를 달성하도록 50mM MES, 1.2M Na2SO4(pH 5.8)의 용액을 농축물에 첨가한다. 크로마토그래피 칼럼으로 적용 전에 Na2SO4 처리된 재료를 여과시킨다.
50mM MES, 425mM Na2SO4(pH 5.8)에 의해 평형화된 페닐 세파로스 수지를 사용하여 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)를 통해 피욜리신을 정제한다. 피욜리신을 1G 피욜리신/리터의 수지로부터 12G 피욜리신/리터의 수지까지의 농도로 칼럼에 로딩한다. 이후, 이것을 50mM MES(pH 5.8) 중에 용리시키고, 피욜리신 수율은 80% 초과이다. 이후, 정제된 단백질을 농축시키고, 이후 포스페이트 완충제(나트륨 또는 칼륨)로 완충제 교환시켰다. 이후, 용혈성 활성을 결정하여서, 활성 단백질이 정제된다는 것을 보장한다. 이것은 검정 완충제에 의한 피욜리신의 연속 희석, 및 37℃에서의 말 적혈구와의 피욜리신의 항온처리에 의해 수행된다. 이후, 이것을 원심분리하여 온전한 적혈구를 펠렛화하고, 가용성 (용해된) 재료를 새로운 플레이트로 옮기고, 405㎚에서의 O.D.를 측정하고, 결과를 작도하였다. 곡선의 중간점에서 용혈성 단위를 결정하고, 용혈성 단위가 1000 미만일 때 피욜리신은 해독되는 것으로 생각된다. 이후, UPLC 및 SDS-PAGE를 사용하여 단리된 단백질의 동일성을 확인하였다. 마지막으로, 피욜리신을 20℃에서 20-48시간 동안 0.10% 내지 0.5%(v/v) 포르말린에 의한 처리에 의해 불활화하고, 이후 무균 여과시켰다.
본 발명의 다른 실시형태 및 용도는 본 명세서의 고려사항 및 본 명세서에 개시된 본 발명의 실행으로부터 당해 분야의 당업자에게 명확할 것이다. 본 명세서에 인용된 모든 참고문헌, 예컨대 모든 공보, 미국 및 외국 특허 및 특허 출원은 구체적으로 및 전체로 참고문헌으로 포함된다. 본 명세서 및 실시예는, 하기 청구항에 표시된 본 발명의 진정한 범위 및 정신에 의해, 오직 예시적인 것으로 생각되는 것으로 의도된다.

Claims (17)

  1. 트루에페렐라 피요제네스(Trueperella pyogenes)(이하, "티. 피요제네스"라 약칭함)에 의해 생성된 피욜리신(pyolysin)의 수율을 증가시키는 방법으로서,
    A) 포도당뿐만 아니라, 포도당, 갈락토스, 수크로스, 말토스, 올리고당, 글라이세롤, 락토스, 덱스트란, 덱스트린, 모노 메틸 숙시네이트 및 N-아세틸 글루코사민으로 이루어진 군으로부터 선택된 추가적인 농축 탄소원을 함유하는 기본 배지에서 티. 피요제네스를 배양하는 단계;
    B) 상기 배지 중의 포도당의 소진 전에 킬레이트화제(chelating agent)를 상기 배지에 첨가하는 단계;
    C) 티. 피요제네스를 수확하는 단계; 및
    D) 피욜리신을 단리하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 추가적인 농축 탄소원은 락토스인, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 킬레이트화제는 에틸렌 글라이콜 테트라아세트산(EGTA), 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA), 또는 이들 2종의 조합물인, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 킬레이트화제는 EGTA인, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 티. 피요제네스는 600㎚에서 5의 광학 밀도(O.D.)보다 높은 박테리아 세포 밀도로 복제되는, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 배지는 21 내지 37℃의 온도에서 유지되는, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 배지는 28 내지 32℃의 온도에서 유지되는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, pH가 6.0 내지 8.0인 기본 배지를 사용하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 철 공급원으로서 헤민(hemin)을 포함하는 기본 배지를 사용하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리소르베이트(Polysorbate) 80(트윈(Tween) 80)을 포함하는 기본 배지를 사용하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 비타민 용액을 포함하는 기본 배지를 사용하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 비타민 용액은 비타민 B12; 미오-이노시톨; 유라실 핵염기; 니코틴산; 칼슘 판토테네이트; 피리독살-HCl; 피리독사민-2HCl; 리보플라빈; 티아민-HCl; p-아미노벤조산; 바이오틴; 엽산; 니아신아마이드; 및 β-NAD 중 1종 이상을 포함하는, 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 비타민 용액은 피리독살-HCl을 포함하는, 방법.
  14. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 배양물의 pH가 초기 기본 배지 출발 pH로부터 5.50 내지 6.50의 수준으로 감소하도록 하는 단계, 및 이후 pH를 염기성 적정제의 자동 첨가에 의해 5.50 내지 6.50으로 조절하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  15. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 피욜리신으로부터 티. 피요제네스 프로테아제를 크로마토그래피에 의해 분리시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
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