KR20190138640A - 피부 병변의 치료에 사용되는 박테리아성 세크레톰 - Google Patents

Abstract

본 발명은 피부 병변의 치료, 보다 구체적으로 상처 치유의 분야에서 박테리아성 세크레톰 (secretome)의 신규한 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 박테리아성 세크레톰을 활성 제제로서 포함하는 미용적 또는 피부과학적 조성물에 관한 것이다.

Description

피부 병변의 치료에 사용되는 박테리아성 세크레톰

본 발명은 피부 병변의 치료, 보다 구체적으로 상처 치유의 분야에서 박테리아성 세크레톰 (secretome)의 신규한 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 박테리아성 세크레톰을 활성 제제로서 포함하는 미용적 또는 피부과학적 조성물에 관한 것이다.

상처 치유는 정상 조직 복구에서 많은 국소적 및 전신적 요인의 상호작용이 관여하는 복잡하고 역동적인 생물학적 공정이다. 치유는 세 가지 상호의존적인 단계로 진행한다: 지혈 및 염증, 증식 및 리모델링 (General principles of wound healing. Witte MB, Barbul A. Surg Clin North Am. 1997 June; 77(3): 509-28.). 증식은 세 개의 명백하게 관찰가능한 공정을 수반한다: 과립화, 수축 및 재상피화.

과립화 동안, 복구 공정에 관여하는 세포는 증식하고 상처 베드로 이동하는 것으로 관찰된다. 예를 들면, 대식세포, 섬유모세포 및 내피 세포가 여기서 발견된다. 대식세포는 안정적으로 화학주성 인자 및 성장인자를 방출한다. 섬유모세포는 상처의 기저에서 세포 성장에 필요한 새로운 세포 기질을 구축한다. 이러한 스캐폴딩은 세포 이동을 지원한다. 마지막으로, 내피 세포는 새로운 모세혈관을 확립할 수 있는 혈관 발아의 형성을 촉발시키고, 이로써 관류를 회복시키고, 상처에서 세포의 대사적 활성에 필수적인 산소 및 영양분의 공급을 보장한다.

상처 수축은 상처 크기를 감소시키는 메커니즘이고, 섬유모세포는 이러한 수축에서 선도적 역할을 담당한다.

재상피화 (re-epithelialization)는 외부 환경에 대항하여 색소 침착되고, 이의 감각 및 면역 기능을 회복시킬 수 있는 효과적인 장벽을 형성하도록 상처를 커버하는 표피의 재생으로 구성된다. 따라서 이것은 각질형성세포 이동 및 증식의 세포 공정 뿐만 아니라, 이러한 신생-표피의 분화 및 진피와 표피를 연결하는 기저막의 회복을 수반한다. 상처의 중심으로 기저 세포의 이동이 두 개의 상처 말단이 조우하도록 만들 때, 체세포 분열의 파장이 발생하여 이동에 의해 생기는 공간을 채우고, 세포가 삼차원적 재생으로 상피 조직을 제공한다.

각질형성세포, 섬유모세포 및 내피 세포의 증식 단계는 활성 제제의 치유 활성을 보여주는 하나의 기능적 형상으로서 고려될 수 있다. 섬유모세포 증식의 증가는 (진피에 도달하는) 심부 상처의 치유에 참여하는 한편, 각질형성세포 증식의 증가는 재상피화에 참여할 것이다.

치유는 또한 치유 결함 또는 치유 부족이 두터운 흉터 또는 켈로이드와 같은 보기 싫은 거의 영구적인 가시적 흔적을 유발할 때 미용적 문제를 제시한다.

모든 미용적 및 피부과학적 수술 절차, 뿐만 아니라 병리학적 및 비의학적 외상 병변 (스크래치, 절단, 스크레이프, 화상)은 흉터를 남긴다. 성형외과 의사의 기본 기술 중 하나는 흉터 형성을 통제하는 것이다.

예를 들면, 압박이 오랫 동안 화상 흉터에 사용되었고, 최근에는 흉터 위에 직접적으로 놓이는 실리콘 시트와 조합되어 왔다.

여전히 손상된 피부의 치유를 촉진시키고, 흉터의 미용적 외양을 개선하기 위한 새로운 조성물을 제안할 필요성이 존재한다.

먼저 놀랍게도, 본 출원인은 조직 재생 및 피부 병변의 치유에서, 지표수로부터 단리된 박테리아 균주 (또는 박테리아), LMB64로부터 유래된 박테리아성 세크레톰의 유익한 성질을 관찰하였다.

본 박테리아는 본 출원인에 의해 국제특허출원 WO 2012/085182에 기술되었다. 보다 구체적으로, 본 박테리아는 이의 항-염증성 활성에 대해 마찬가지로 기술되었다. 보다 더 구체적으로, S0, E0 및 ES0이라고 명명된 추출물이 기술되고 예시되었으며, 상기 추출물은 염기성 pH에서 수 시간 동안 배양액의 항온 배양 이후에 바이오매스, 용해된 세포의 바이오매스 및 상청액으로부터 각각 분리된 배양 상청액으로 구성된다. 추출물 E0 및 ES0의 약리학적 활성만이 테스트되었고, 이들 추출물 E0 및 ES0이 사이토카인 및 랑게르한스 세포의 성숙 (E0의 경우), 뿐만 아니라 TLR2/TLR4/TLR5의 활성화, PAR의 길항제 및 항박테리아 펩티드의 유도 (ES0의 경우)를 유도할 수 있는 점이 확인되었다. 이들 결과는 소양증, 건선, 습진 또는 아토피 피부염과 같은 염증성 질환의 치료에서 이러한 추출물의 용도를 제시하였다.

모든 예상과 상반되게, 본 출원인은 본원에서 상기 언급된 추출물 ES0 및 E0과 동일한 성분으로 구성되지 않고, 상기 박테리아 LMB64에 의해 분비되고 배양 상청액 내로 내재화되는 생체 분자로 주로 구성되는 세크레톰이 놀라운 치유 성질을 갖는 점을 보여주고 있다.

제 1 구현예 (1)에 따르면, 본 발명은 피부 병변의 치료에 사용되는, 베타프로테오박테리아 (Betaproteobacteria) 강, 나이세리아시애 (Neisseriaceae) 아과에 속하고, 서열번호 1의 서열 또는 서열번호 1의 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 임의의 서열을 포함하는 16S rRNA를 포함하는, 비-병원성 그램-음성 박테리아의 세크레톰으로서,

a) 상기 박테리아를 이의 성장에 적합한 배양 배지 및 조건 하에서 배양하는 단계;

b) 액체/고체 분리 및 상기 액체상의 회수 단계; 및

c) 상기 액체상에서 상기 박테리아에 의해 분비된 생체 분자를 포함하는 상기 세크레톰을 획득하는 단계:

를 포함하는 공정에 의해 획득될 수 있거나 획득되는, 박테리아성 세크레톰에 관한 것이다.

본 발명의 제 2 구현예에 따르면, 본 발명에 따라 피부 병변의 치료에 사용되는 박테리아성 세크레톰은 염기성 완충액이 단계 b)에서 획득된 액체상에 첨가되고, 획득된 완충된 액체상은 선택적으로 1 내지 7시간 동안, 바람직하게는 1 및 6℃ 범위에서 접촉하도록 방치되는 것을 특징으로 한다.

박테리아 LMB64는 베타프로테오박테리아 (Betaproteobacteria) 강, 나이세리아시애 (Neisseriaceae) 아과 및 아마도 아직 정의되지 않은 신규한 속에 속하는 것으로서 특성화되고 정의되었다. 16S 리보좀 RNA (rRNA)를 인코딩하는 유전자 서열의 분석은 본 박테리아를 크로모박테리움 (Chromobacterium), 팔루디모나스 (Paludimonas), 루텔리아 (Lutelia) 및 글루벤키아나 (Glubenkiana)와 근접하는 속으로 분류하는 것을 가능하게 하였고, 이들과는 95% 서열 유사성을 공유하고 있다.

이러한 비-병원성 박테리아는 그램-음성이고, 지표수로부터 단리되었다.

보다 구체적으로, 박테리아 LMB64는 대략 2.3　μm (± 0.3)의 길이 및 대략 1.0　μm (± 0.1)의 너비를 갖는 간균 형태이다. 본 박테리아의 특징적인 성질은 극성 편모의 존재이다.

16S rRNA를 인코딩하는 유전자는 거의 완벽하게 서열이 결정되었다 (서열번호 1의 서열에 상응하는 1487 bp). 박테리아 LMB64는 10948 bp의 원형 플라스미드를 갖는다. 이 플라스미드는 완벽하게 서열이 결정되었고, 서열은 서열번호 2의 서열로 나타낸다.

또 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 세크레톰이 유래된 박테리아는 서열번호 2의 서열 또는 서열번호 2의 서열과 적어도 80% 동일성, 유리하게는 서열번호 2의 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 심지어 적어도 97%, 보다 더 바람직하게는 적어도 98% 동일성을 갖는 임의의 서열을 포함하는 적어도 하나의 플라스미드를 포함한다.

또한 세크레톰이 유래되는 박테리아는 베타프로테오박테리아 강, 나이세리아시애 아과에 속하는 비-병원성 그램-음성 박테리아이고, 상기 박테리아는 서열번호 1의 서열 또는 서열번호 1의 서열과 적어도 80%, 심지어 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97% 동일성을 갖는 임의의 서열을 포함하는 16S rRNA를 포함하고, 또한 상기 박테리아는 서열번호 2의 서열 또는 서열번호 2의 서열과 적어도 80% 동일성, 유리하게는 서열번호 2의 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 심지어 적어도 97%, 보다 더 바람직하게는 적어도 98% 동일성을 갖는 임의의 서열을 포함하는 적어도 하나의 플라스미드를 포함한다.

예로서, 이러한 박테리아는 균주 LMB64로 예시되고, 이는 본 출원인의 이름으로 파리, 파스퇴르 연구소, 국립 미생물 배양의 수집기관 (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, CNCM)에 2010년 4월 8일자로 수탁번호 I-4920 하에 기탁되었다.

본 박테리아의 황이 없는 배지에서의 성장 및 비-필라멘트형 특성과 관련된 특징과 조합하여 이러한 유전형 정보를 갖기 때문에, 당업자라면 본 발명의 세크레톰이 획득되도록 허용하는 또 다른 박테리아를 발견하고/동정하는 것이 전혀 어렵지 않을 것이다. 당연하게 유전형으로는 약간 상이하지만 세크레톰의 견지에서 본 발명의 표현형 판정기준 모두를 소유하는 또 다른 박테리아의 이러한 동정은 항상 극복할 수 있는 선별 연구 이후에 이루어질 수 있으며, 이것은 당업자의 일반 지식을 조합하여, 본 출원에 포함되었고 국제특허출원 WO 2012/085182에 포함되었던 정보를 기초하고 있다.

본 발명의 맥락에서, 두 개의 핵산 서열 사이의 "동일성 백분율"은 최고의 정렬 (최적의 정렬) 이후에 획득된, 비교될 두 개의 서열 사이의 동일한 뉴클레오티드의 백분율을 말하고, 이러한 백분율은 단지 통계적이고, 두 개의 서열 사이의 차이는 무작위로 이들의 전체 길이에 걸쳐 분포된다. 두 개의 핵산 서열 사이의 서열 비교는 보통 이들을 최적의 방식으로 정렬한 이후에 이들 서열을 비교함으로써 시행되고, 여기서 상기 비교는 분절마다 또는 "비교창"마다 이루어진다. 비교를 위한 서열의 최적의 정렬은 수작업에 더하여, 스미스 및 워터맨 [Smith and Waterman (1981), Ad. App. Math. 2: 482]의 로칼 상동성 알고리즘에 의해, 니들만 및 운쉬 [Needleman and Wunsch (1970), J. Mol. Biol. 48: 443]의 로칼 상동성 알고리즘에 의해, 피어슨 및 립만 [Pearson and Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444]의 유사성 탐색 방법에 의해, 또는 이들 알고리즘을 사용하는 컴퓨터 소프트웨어 (GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA, 위스콘신 유전학 소프트웨어 패키지, 유전학 컴퓨터 그룹, 575 Science Dr., Madison, WI, 또는 BLAST N 또는 BLAST　P 비교 소프트웨어)에 의해 수행될 수 있다.

두 개의 핵산 서열 사이의 동일성 백분율은 이들 두 개의 정렬된 서열을 최적의 방식으로 비교함으로써 결정되고, 비교될 핵산 서열은 이들 두 개의 서열 사이의 최적의 정렬을 위한 기준 서열과 대비하여 첨가 또는 결실을 포함할 수 있다. 동일성 백분율은 뉴클레오티드가 두 개의 서열 사이에 일치하는 위치의 수를 결정하고, 이러한 일치하는 위치의 수를 비교창에서 총 위치의 수로 나누기 하고, 얻은 결과를 이들 두 개의 서열 사이의 동일성 백분율을 얻도록 100을 곱하기 함으로써 계산된다.

예를 들면, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/b12.html에서 입수가능한 BLAST 프로그램 "BLAST 2 서열" (Tatusova et al., "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences," FEMS Microbiol Lett. 174: 247-250)은 디폴트 매개변수 (구체적으로, 매개변수의 경우 "오픈 갭 패널티": 5 및 "연장 갭 패널티": 2; 예를 들면, 선별된 매트릭스는 프로그램에 의해 제안된 "BLOSUM 62" 매트릭스임)로 사용될 수 있다. 비교될 두 개의 서열 사이의 동일성 백분율은 프로그램에 의해 직접적으로 계산된다. "ALIGN" 또는 "메가얼라인" 소프트웨어 (DANSTAR)와 같은 다른 프로그램을 사용하는 것도 역시 가능하다.

본 발명의 박테리아는 서열번호 2의 서열 또는 서열번호 2의 서열과 적어도 80% 동일성, 바람직하게는 적어도 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 임의의 서열을 포함하는 적어도 하나의 플라스미드를 함유하는 박테리아 LMB64를 포함한다. 상기 박테리아 LMB64의 다른 특성은 하기 실시예에서 상술될 것이다.

또한, 박테리아 LMB64는 본 출원인의 이름으로 파리, 파스퇴르 연구소, 국립 미생물 배양의 수집기관 (CNCM)에 2010년 4월 8일자로 수탁번호 I-4920 하에 기탁되었다.

또 다른 구현예에 따르면, 본 발명은 또한 제 2 구현예에 따라 피부 병변의 치료에 사용되는, 염기성 완충액이 트리스 완충액, 아르기닌 완충액 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 박테리아성 세크레톰에 관한 것이다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 액체/고체 분리의 단계 b)는 이어서 단계 c) 이전에 여과에 의해 액체상 또는 완충된 액체상의 정화의 단계 b')로 진행되는 것을 특징으로 하는, 선행하는 구현예 중 어느 하나에 따라 피부 병변의 치료에 사용되는 박테리아성 세크레톰에 관한 것이다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 여과가 0.2 μm 컷오프로 수행되는 것을 특징으로 하는, 선행하는 구현예에 따른 피부 병변의 치료에 사용되는 박테리아성 세크레톰에 관한 것이다.

또 다른 구현예에 따르면, 본 발명은 또한 상기 생체 분자가 상기 박테리아에 의해 분비된 펩티드, 단백질 및 이차 대사물로 구성되는 것을 특징으로 하는, 선행하는 구현예 중 어느 하나에 따라 피부 병변의 치료에 사용되는 박테리아성 세크레톰에 관한 것이다.

또한 본 발명의 또 다른 구현예는 박테리아가 서열번호 2의 서열 또는 서열번호 2의 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 임의의 서열을 포함하는 적어도 하나의 플라스미드를 포함하는 것을 특징으로 하는, 선행하는 구현예 중 어느 하나에 따라 피부 병변의 치료에 사용되는 박테리아성 세크레톰을 제공하는 것이다.

또 다른 구현예에 따르면, 본 발명은 또한 박테리아가 CNCM에 2010년 4월 8일자로 수탁번호 I-4920 하에 기탁된 박테리아인 것을 특징으로 하는, 선행하는 구현예 중 어느 하나에 따라 피부 병변의 치료에 사용되는 박테리아성 세크레톰에 관한 것이다.

일반적으로, 용어 "세크레톰 (secretome)"은 세포, 조직 또는 유기체에 의해 배양 배지 내로 분비되고 배출되며, 이러한 배지에서 용해되는 생체 분자 모두를 기술하는데 사용된다. 본 경우에서, 세크레톰은 박테리아 LMB64 및 박테리아 세포의 변형, 퇴화 또는 용해가 없는 이러한 박테리아에 의해 분비되고 외재화된 모든 생체 분자를 말하는 것으로 이해되어야 한다. 보다 구체적으로, 이들 생체 분자는 박테리아에 의해 배양 배지 내로 분비되고 외재화된 단백질, 펩티드 및 이차 대사물로 주로 구성된다.

박테리아는 이분법에 의해 배가하고, 예로 각각의 박테리아는 성장한 다음 세포벽에 의해 형성된 분열 격막에 의해 분리되는 두 개의 딸세포로 분열한다. 분열 동안, DNA 및 다른 구성성분은 복제된다. 합성 및 분해의 다양한 효소적 시스템이 세포 분열에 관여한다.

박테리아 성장은 박테리아의 구성성분 모두의 순서화된 증가이다. 이것은 박테리아 수의 증가를 가져온다. 성장 동안, 한편으로 배양 배지로부터의 영양분의 고갈이 존재하고, 다른 한편으로는 박테리아에 의해 배양 배지로 분비되고 배출되며 이러한 배지에 용해된 생체 분자, 뿐만 아니라 대사적 부산물의 농축이 존재한다.

표현 "배양 배지" 또는 "배지"는 박테리아 성장 및 증식에 필요한 영양분을 적어도 포함하는 임의의 배지를 말하는 것으로 이해되어야 한다. 박테리아는 액체, 고체 또는 반-액체 배지에서 성장할 수 있다. 바람직하게, 배양 배지는 세크레톰을 포함하는 배양 상청액의 회수를 허용하는 액체 배지이다.

적합한 배양 배지는 박테리아 성장 및 증식을 촉진하는 영양분을 포함한다. 일반적으로, 적합한 배양 배지는 물, 탄소원, 질소원 및 염을 포함할 것이다. 예로서, 상세한 예시적인 배양 배지는 하기 실시예에 기술되어 있다.

표현 "이차 대사물"은 본 발명의 박테리아, 구체적으로 박테리아 LMB64가 생산하고, 배양 배지 내로 분비하고 배출하는 소분자를 말하는 것으로 이해되어야 한다. 예로서, 이러한 이차 대사물은 박테리오신 (bacteriocin), 비-리보좀 펩티드, 시데로포아 (siderophore), 리포펩티드 또는 폴리켑티드와 같은 가용성 분자 또는 테르펜, 피라진, 인돌 또는 설파이드 유도체와 같은 분자일 수 있다. 세크레톰에 존재하는 단백질은 10 kDa 내지 100 kDa, 바람직하게는 18 kDa 내지 98 kDa의 크기를 갖으며, 바람직하게 대부분의 단백질은 크기가 대략 38 kDa이다.

실제로, 본 발명의 박테리아, 예를 들면 구체적으로 박테리아 LMB64의 세크레톰은 (예를 들면 하기에 기술된 바와 같이) 박테리아의 성장, 발달 및 증식을 허용하는 배양 배지에서의 배양물로부터 본 발명의 세크레톰을 구성하는 분비된 생체 분자를 포함하는 배양 상청액을 단순히 회수함으로써 획득될 수 있다. 명확하게는, 이들 생체 분자가 박테리아에 의해 분비되고 외재화되며, 배지에서 용해되는 사실로 인해, 상기 박테리아를 처리하는 (전부 또는 일부 세포 용해 또는 세포벽, 세포막 또는 원형질주변 공간의 단백질 또는 구성성분의 방출을 유도하는, 기계적 또는 화학적) 단계를 수행하는 것이 필요하지 않다. 배양 상청액의 구성성분 (이하 본 명세서에서 세크레톰)은 임의의 액체/고체 분리 수단에 의해 불용성 고체 세포 구성성분으로부터 회수될 수 있다. 보다 구체적으로, 따라서 당업자라면 숙지하고 있는 기법에 의해 주로 세포 전체 또는 박테리아의 표면 단백질 및/또는 원형질주변 공간에 위치하는 단백질을 포함하는 세포 잔재물을 포함하는 고체 분획으로부터 용해된 생체 분자를 포함하는 액체 분획을 단리하는 것이 가능하다.

예로서, 액체/고체 분리는 예를 들면 원심분리법, 침전법, 여과법, 한외여과법, 따라내기 (decantation), 배출법 (draining)으로부터 선택된 기법에 의해 수행될 수 있다.

바람직하게, 액체/고체 분리는 고체상, 예로 세포 및 세포 잔재물을 포함하는 펠렛; 및 액체상, 예로 가용성 분자 예로 세크레톰을 포함하는 상청액을 분리하기 위하여 박테리아 배양물의 원심분리에 의해 수행된다.

상청액, 예로 액체상은 존재가능한 세포 잔재물을 제거하고 이를 무균화하기 위하여 이와 같이 또는 단순한 여과 이후에 사용될 수 있다. 또한 예를 들면, 투과여과법에 의해 이를 농축하는 것이 고려될 수 있다. 세크레톰을 구성하는 단백질은 또한 암모늄 설페이트로의 침전법에 의해 회수될 수 있다.

상기에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 박테리아성 세크레톰을 제조하는 방법은 염기성 완충액이 단계 b)에서 획득된 액체상에 첨가되고, 획득된 완충된 액체상은 선택적으로 1 내지 7시간 동안, 구체적으로 낮은 온도에서, 바람직하게는 1 및 6℃ 범위에서 접촉하도록 방치되는 것을 특징으로 한다.

상청액에 염기성 완충액의 첨가는 용액에서 단백질 및 펩티드의 가용성 및/또는 안정성을 개선한다.

바람직하게, 이러한 염기성 완충액은 트리스 완충액 또는 아르기닌 완충액 또는 트리스-아르기닌 혼합물이다. 바람직하게, 이것은 트리스-아르기닌 완충액이다.

액체상에 첨가되는, 염기성 완충액, 바람직하게는 트리스-아르기닌의 양은 획득된 완충된 액체상이 100 mM 내지 500 mM의 아르기닌 농도 및/또는 10 mM 내지 90 mM의 트리스 농도를 갖도록 이루어진다.

완충된 액체상의 pH는 8 내지 12, 바람직하게는 9 내지 11의 범위일 수 있다.

염기성 완충액은 (트리스, 아르기닌 또는 트리스-아르기닌)의 사용은 용액에서 단백질의 안정화를 허용하고, 장기간의 보관 동안 이들의 응집을 회피한다.

본 발명의 박테리아, 구체적으로 LMB64 균주를 배양하기 위한 바람직한 방법은 세 가지 단계를 포함할 수 있다.

* 제 1 접종물은 이러한 사전 배양에 적절한 미네랄, 단백질 및 탄수화물 물질을 함유하는 적합한 배지에서 얼렌메이어 플라스크로 제조될 수 있다.

* 제 1 사전-발효 배양물이 다음으로 제 1 배지 (또는 임의의 동등한 배지)와 유사하거나 일치하는 제 2 배지에서 회분식 방식으로 제조된다.

* 마지막으로, 제 1 배지와 일치하거나 유사한 배지에서 급식-회분식 방식으로 발효가 시행되어 높은 세포 밀도를 획득한다.

다음으로 원심분리 단계가 세포 및 세포 잔재물의 제거 및 배양 상청액의 회수를 허용한다.

이러한 완충된 상청액 또는 완충된 액체상은 다음으로 여과에 의해 정화될 수 있다.

상기에 나타낸 바와 같이, 액체/고체 분리의 단계 b)는 이어서 단계 c) 이전에 여과에 의해 액체상 또는 완충된 액체상의 정화의 단계 b')로 진행된다.

여과는 액체상 또는 적용가능하면 완충된 액체상의 정화를 허용하는 임의의 적합한 수단에 의해 수행될 수 있다. 이러한 여과에 의한 정화는 액체/고체 분리 단계 동안 제거되지 않은 보류된 입자를 제거하고, 투명한 세트레톰을 생산하는 것을 목표로 한다.

여과는 임의의 여과법, 한외여과법 또는 투과여과법 수단에 의해 수행될 수 있다.

유리하게, 여과는 0.4 μm 컷오프, 바람직하게는 0.2 μm 컷오프를 갖는 필터 또는 카트리지 필터를 통한 여과에 의해 수행된다. 이러한 경우에, 박테리아성 세트레톰은 분비된 펩티드, 단백질 및 이차 대사물이 0.2 μm 이하의 크기를 갖는 것을 특징으로 한다.

바람직하게, 비-정전기적으로 하전된 필터 또는 프리필터는 활성의 전부 또는 일부를 책임지는 생체 분자의 임의의 흡수를 회피하기 위하여 사용될 수 있다.

배지 및 다양한 단계의 정확한 내용은 실시예에서 더 자세하게 기술될 것이다. 본 상세한 설명과 관련하여 당업자에게 자명할 수 있는 배지 또는 단계의 순서의 임의의 공정 변형은 본 특허 출원의 범위 내에 속하는 것으로서 고려되어야 한다.

상기에 언급된 바와 같이, 본 발명은 또한 또 다른 구현예에서, 피부 병변이 찰과상, 화상, 일광 화상, 스크래치, 절단, 스크레이프, 봉합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 선행하는 구현예 중 어느 하나에 따라 피부 병변의 치료에 사용되는 박테리아성 세크레톰에 관한 것이다.

본 발명은 또한 치유 결함의 경감에 사용되는, 선행하는 구현예 중 어느 하나에 따라 피부 병변의 치료에 사용되는 박테리아성 세크레톰에 관한 것이다.

본 발명은 또한 또 다른 구현예에서, 피부 병변이 외상, 수술, 피부과학적 절차 또는 미용적 의약 절차로 진행되는 것을 특징으로 하는, 선행하는 구현예 중 어느 하나에 따라 피부 병변의 치료에 사용되는 박테리아성 세크레톰에 관한 것이다.

유리하게, 본 발명은 또한 박테리아성 세크레톰이 구리염 및/또는 아연염과 조합되는 것을 특징으로 하는, 선행하는 구현예 중 어느 하나에 따라 피부 병변의 치료에 사용되는 박테리아성 세크레톰에 관한 것이다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 또한 피부 병변의 치료가 치유 및 피부 복구를 개선하는 것으로 구성되는 것을 특징으로 하는, 선행하는 구현예 중 어느 하나에 따라 피부 병변의 치료에 사용되는 박테리아성 세크레톰에 관한 것이다.

본 발명은 또한 또 다른 구현예에서, 선행하는 구현예 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은 박테리아성 세크레톰의 유효량을 미용적으로 허용가능한 부형제와 조합하여 함유하고, 국소적 적용에 적합한 형태로 제형화된 조성물의 유효량의 적용을 포함하는, 피부-치유 결합을 경감하기 위한 미용적 치료 방법에 관한 것이다.

유리하게, 본 발명은 또한 박테리아성 세크레톰이 구리염 및/또는 아연염과 조합되는 것을 특징으로 하는, 선행하는 구현예 중 어느 하나에 따라 피부 병변의 치료에 사용되는 박테리아성 세크레톰에 관한 것이다.

따라서, 본 발명은 또한 또 다른 구현예에서, 피부-치유 결함의 미용적 치료를 경감하기 위한, 선행하는 구현예 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은 박테리아성 세크레톰의 용도에 관한 것이다. 상세한 구현예에 따르면, 본 발명의 세크레톰은 구리염 및/또는 아연염과 조합하여 사용된다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 선행하는 구현예 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은 박테리아성 세크레톰 및 국소적 적용에 적합한 피부과학적 부형제를 포함하는 피부과학적 조성물에 관한 것이다. 유리한 구현예에서, 피부과학적 조성물은 아연염 및/또는 구리염을 더 포함한다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 피부 병변의 치료에 사용되는, 선행하는 구현예 중 어느 하나에서 따른 피부과학적 조성물에 관한 것이다. 유리한 구현예에서, 피부과학적 조성물은 아연염 및/또는 구리염을 더 포함한다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 선행하는 구현예 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은 박테리아성 세크레톰 및 국소적 적용에 적합한 미용적 부형제를 포함하는 미용적 조성물에 관한 것이다. 미용적 조성물은 아연염 및/또는 구리염을 더 포함한다.

마지막으로, 또 다른 구현예에서, 본 발명은 피부-치유 결함의 미용적 치료를 경감하기 위한, 선행하는 구현예에 따른 미용적 조성물의 용도에 관한 것이다.

일 구현예에 따르면, 본 발명은 섬유모세포 증식을 촉진하는 국소적 용도를 위한, 선행하는 구현예 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은 박테리아성 세크레톰에 관한 것이다.

일 구현예에 따르면, 본 발명은 각질형성세포 증식 및/또는 이동을 촉진하는 국소적 용도를 위한, 선행하는 구현예 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은 박테리아성 세크레톰에 관한 것이다.

일 구현예에 따르면, 본 발명은 피부 병변을 치료하는 국소적 용도를 위한, 선행하는 구현예 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은 박테리아성 세크레톰에 관한 것이다.

일 구현예에 따르면, 본 발명은 피부 치유 및 회복을 개선하는 국소적 용도를 위한, 선행하는 구현예 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은 박테리아성 세크레톰에 관한 것이다.

본 발명은 또한 피부 본성 및 품질을 회복하기 위하여 피부 복구를 가속하기 위한, 선행하는 구현예 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은 세크레톰을 활성 성분으로서 함유하는 조성물에 관한 것이다. 더욱 유리하게, 본 조성물은 구리염 및/또는 아연염을 더 포함할 수 있다.

바람직하게, 본 발명의 조성물에서 세크레톰의 농도는 0.05% 내지 10% 범위이다. 더욱 바람직하게, 이것은 0.1% 내지 5% 범위이다.

본 발명의 조성물은 국소적 적용을 위한 조성물을 획득하기 위하여 당업자에게 숙지되어 있는, 유화제, 비후제, 젤 형성제, 물 결합제, 분산제, 안정화제, 연료, 향료 및 보존제와 같은 통상적인 피부과학적으로 및/또는 미용적으로 적격한 하나 이상의 부형제를 더 포함한다.

본 발명에서, 표현 "피부과학적으로 및/또는 미용적으로 허용가능한"은 피부과학적 또는 미용적 조성물의 제조에 유용한 것이고, 이는 일반적으로 안전하고, 비독성이며, 생물학적으로 또는 달리 바람직하고, 구체적으로 국소적 적용에 의해 피부과학적 또는 미용적 용도, 구체적으로 피부과학적 또는 피부-미용적 용도에 허용가능한 것을 의미하도록 의도된다.

본 발명에 따른 조성물은 유리하게는, 구체적으로 피부에 대한 국소적 적용을 위한 것이다.

본 발명의 조성물은 에멀전, 분산제 또는 수성 또는 유성 로션의 형태로 제조될 수 있다.

또 다른 상세한 구현예에서, 본 발명의 피부과학적 또는 미용적 조성물은 적어도 하나의 다른 활성 성분, 보다 구체적으로는 적어도 하나의 습윤화 활성 성분을 포함한다.

따라서 이러한 다른 활성 성분은 구체적으로

* 잘 알려진 치유제 또는 회복제: 판테놀, 마데카소시드 (madecassoside), 알란토인, 알로에 베라, 꿀;

* 항-감염제: 구리-아연 유형의 미량 원소, 꿀;

* 습윤화제 및 영양제: 글리세린, 쉬어버터, 천연 왁스, 하이알루론산, 지방산;

* 진정제: 알란토인, 비스아보롤 (bisabolol), 판테놀, 에녹솔론;

* UV 필터:

로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

바람직하게, 제 2 활성 성분은 구리-아연 유형의 미량 원소일 것이다. 이러한 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 따라서 세크레톰 및 구리-아연 유형의 미량 원소를 포함할 것이다.

언급된 바와 같이, 본 발명의 세크레톰을 포함하는 피부과학적 또는 미용적 조성물은 구리염 또는 아연염을 포함할 수 있다. 바람직하게, 구리염은 구리 설페이트일 것이다. 유리하게, 아연염은 아연 옥사이드 및 아연 설페이트로부터 선택될 것이다.

본 발명의 조성물에서 구리 설페이트의 양은 조성물의 0.05 내지 0.5 wt%, 바람직하게는 조성물의 0.1 내지 0.25 wt%, 더욱 바람직하게는 조성물의 대략 0.2 wt% 범위로 달라질 수 있다.

본 발명의 조성물에서 아연 설페이트의 양은 조성물의 0.05 내지 0.5 wt%, 바람직하게는 조성물의 0.1 내지 0.4 wt%, 더욱 바람직하게는 조성물의 0.1 내지 0.2 wt% 범위로 달라질 수 있다.

본 발명의 조성물에서 아연 옥사이드의 양은 조성물의 0.5 내지 10 wt%, 바람직하게는 조성물의 1 내지 5 wt%, 더욱 바람직하게는 조성물의 대략 2 내지 4 wt% 범위로 달라질 수 있다.

본 발명의 일 구현예는 치유제, 항-감염제, 습윤제, 진정제 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 적어도 하나의 다른 활성 성분을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 선행하는 구현예 중 하나에 따른 조성물을 착상하고 있다. 또 다른 상세한 구현예에 따르면, 적어도 하나의 다른 활성 성분은 습윤제, 치유제, 진정제 및 이들의 혼합물, 바람직하게는 습윤제로부터 선택될 것이다. 이러한 활성 성분은 바람직하게 피부과학적 조성물에 사용될 것이다.

본 발명은 또한 피부 병변을 치료하고 치유하는 방법으로서, 본 발명의 세크레톰을 활성 성분으로서 함유하는 조성물의 유효량의 투여, 바람직하게는 국소적 투여 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 조성물은 구체적으로 지속적인 병변을 갖는 피부의 관리를 위한 것이다.

피부 병변은 침습적 또는 비-침습적 여부와 상관없이, 치유적인 또는 미용적 목적을 위한 외상 또는 의학적 또는 수술적 절차 이후에 출현할 수 있다. 침습적인 의학적 또는 수술적 절차는 예를 들면, 봉합이 있거나 없는 수술적 절차 (적출, 면도), 냉동요법, 레이저 절제, 중등도 또는 강한 화학적 박피, 봉합, 메조요법 또는 소파술을 포함한다.

예를 들면, 피부에 경미한 외부적 손상 이후에 외상후 피부 병변은 예를 들면, 절단, 스크래치, 스크레이프 및 표재성 화상 또는 일광 화상을 포함한다.

피부 회복을 가속시키고 (피부가 완벽하게 복구될 때까지) 장기간 사용에 적합한 치유 산물을 요구하는 표재성 비-침습적인 의학적 절차는 예를 들면, 경미한 화학적 박피, 레이저 제모 및 표재성 혈관 (장미증) 치료를 포함한다.

본 발명의 피부 및 점막 병변의 치료는 구체적으로 수술 또는 미용적 피부과학 절차, 표재성 화상, 일광 화상 이후에 절단, 봉합, 찰과상, 스크레이트, 스크래치, 흉터의 치료를 포함한다.

본 발명은 또한 치유 및 피부 복구를 개선하기 위한, 구체적으로 치유 결함을 경감시키기 위한, 본 발명의 미용적 조성물의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 본 발명의 범위를 제한하지 않고 이를 설명하는 하기 실시예를 해석함으로써 더 잘 이해될 것이다.

실시예는 다음의 도면을 언급하고 있다.

도 1은 세크레톰 단백질의 SDS-PAGE 젤을 나타낸다.
레인 1 (M, 분자량 마커, Sea Blue);
레인 2 내지 5: (Sec, 아르기닌 완충액의 첨가 이전에 세크레톰) - 각각 10 μL, 15 μL, 20 μL 및 30 μL 로딩;
레인 6 내지 9 (Sec + Arg, 아르기닌 완충액의 첨가 이후에 세크레톰) - 각각 10 μL, 15 μL, 20 μL 및 30 μL 로딩.
도 2는 대조군 세포 (n = 3 공여자 풀)와 비교하여 다양한 산물로 처리된 정상 인간 섬유모세포의 증식의 자극% (평균 ± SEM)를 나타낸다.
도 3은 대조군 세포 (n = 2)와 비교하여 다양한 산물로 처리된 HaCaT 각질형성세포 세포주의 이동의 자극% (평균 ± SEM)를 나타낸다.
도 4는 기준 회복 크림과 비교하여 (n = 10 독립적인 공여자) 돼지 귀의 외부이식편 상의 48시간 동안 다양한 산물의 적용 이후에 상처 재상피화 (평균 ± SEM)을 나타낸다.

실시예 1: 박테리아 LMB64의 배양

비제한적인 예로서, 바람직한 배양 배지는 염화암모늄, 마그네슘 설페이트 및 효모 추출물을 포함한다. 무엇보다 국제특허출원 WO2012/085182로부터 나온 바와 같이, 다른 유사한 배지가 사용될 수 있고, 따라서 상세한 설명의 본질적인 부분을 형성하는 것으로서 고려되어야 하는 점도 역시 언급되어야 한다. 당업자에 의한 임의의 응용도 역시 본 발명의 일부로서 고려되어야 한다.

예시적인 배양 공정이 하기에 기술되어 있다. 본 명세서에서는 이러한 실시예가 단지 설명적 목적을 위한 것이고, 결코 제한하는 것으로 고려되어서는 안되는 점을 기억해야 한다.

균주 LMB64는 세 가지 단계, 즉 제 1 접종, 회분식 방식으로의 사전-배양 (또는 사전-발효) 및 마지막으로 급식-회분식 방식 (포도당의 첨가)이지만 배양으로 성장된다.

접종: WCB LMB64의 튜브가 1000 mL의 무균 배지를 포함하는 얼렌메이어 플라스크를 접종하는데 사용된다. 다음으로 얼렌메이어 플라스크는 진탕 배양기에 놓이고 진탕된다. 배양액의 세포 밀도가 충분할 때, 배양은 중지된다. 다음으로 사전-발효기로 이동될 때까지 냉각된다.

사전-배양: 사전-발효기는 다음으로 대략 16 L의 배지로 충전된 다음 완전히 멸균된다.

두 개의 종속 (satellite) 플라스크가 탱크 및 다음 순서의 첨가 블록의 멸균 이후에 사전-발효기에 연결된다.

* 무균의 50% 포도당 용액을 포함하는 플라스크. 이러한 용액 (포도당 회분 사전-배양)은 즉시 배양 배지로 이동되어 20 g/L의 초기 포도당 농도를 만든다.

* 상기 접종 단계에서 기술된 접종물을 포함하는 얼렌메이어 플라스크는 사전-발효기에 접종된다.

사전-배양이 착수되고, 다음으로 자동으로 조절된다. 예로서, 다음의 매개변수가 언급될 수 있다: 온도, 진탕 속도, 압력, 공기 유속 또는 PO₂.

세포 성장은 620 nm에서의 광학 밀도의 측정에 의해 모니터링된다. 사전-배양은 충분한 밀도에 도달할 때 냉각에 의해 중지된다.

배양: 발효기는 다음으로 pH 7.0으로 조정된 127 L의 배지로 충전된 다음 완전히 멸균된다. 세 개의 종속 플라스크가 사용된다:

* 무균의 포도당 용액을 포함하는 플라스크. 이러한 용액은 즉시 배양 배지로 이동되어 20 g/L의 초기 포도당 농도를 만든다.

* 거품제거제의 플라스크. 이 거품제거제는 배양 동안 자동으로 첨가되어 탱크에서 거품의 수준을 통제할 것이다.

* 급식-회분 포도당의 플라스크. 이러한 용액은 배양 동안 첨가되어 세포 성장을 촉진할 것이다. 배양이 착수되고, 다음으로 자동으로 조절된다. 예로서, 다음의 매개변수가 역시 언급될 수 있다: 온도, 진탕, 압력, 공기 유속 또는 PO₂.

배지에 초기에 존재하는 포도당이 소모된 이후에 (PO₂의 상승), 급식-회분 포도당 용액의 첨가가 촉발되고, 따라서 높은 농도의 세포 성장이 가능하게 된다. 발효는 포도당의 전부 소비 이후에 정지된다. 이 단계에서, 발효는 자동으로 냉각되어야 한다. 배양 과정 전체를 통하여, 세포 성장은 620 nm에서의 광학 밀도의 측정에 의해 모니터링된다. 배양 종결 시 획득된 건조 바이오매스의 양 (g/L)은 계량 방법을 사용하여 결정된다.

실시예 2: 세크레톰의 추출

하기 실시예는 바람직한 구현예의 예로서 주어지지만, 제한하는 것으로서 고려되어서는 안된다.

세크레톰은 일반적으로, 박테리아의 세포, 표면 단백질 및 원형질주변 공간에 위치하는 단백질을 제거하기 위하여 배양 단계의 결과물의 원심분리 이후에 획득된다. 이러한 원심분리 단계는 이어서 상청액에 트리스-아르기닌 염기성 완충액의 첨가로 진행된다. 상청액의 마지막 여과 단계도 역시 가능하다. 당업자에 의한 임의의 응용도 역시 본 발명의 일부로서 고려되어야 한다.

원심분리: 발효기로부터 원심분리기로의 이동선이 무균화된다. 다음으로 발효는 원심분리기 상에서의 연속적인 원심분리에 의해 분리된다. 원심분리는 150 L/h (± 30 L/h)에서 10900±1000 rpm의 보울 회전 속도로 수행된다. 상청액이 일회용 파우치가 장착된 용기에 수집된다. 상청액의 무게가 저울 플랫폼 상에서 측정된다.

아르기닌의 첨가: 트리스 아르기닌 추출 완충액이 멸균되고, 다음으로 배양 상청액을 포함하는 일회용 파우치로 이동된다. 필요한 접촉 시간은 1 내지 7시간이다. 일회용 파우치의 첨가 이후에 트리스 및 아르기닌의 목표 농도는 대략 0.3 M L - 아르기닌 및 20 mM 트리스이다.

추출 완충액의 첨가 이후에 총 부피는 대략 240 L이다.

여과: 두 번의 여과 단계가 상청액을 정화하고, 투명한, 무균 세크레톰을 생산하기 위하여 온라인으로 수행된다. 여과는 여과/배분 시스템에 의해 제어된다. 일회용 심부-여과 (depth-filtration) 카트리지가 필터 하우징에 배치된다. 여과된 산물 모두가 일회용 파우치가 장착된 용기에 무균적으로 회수된다. 여과된 산물의 파우치가 저울 플랫폼 상에서 무게 측정된 다음 배분 때까지 +5℃에서 보관된다.

세크레톰 단백질의 젤 전기영동: 도 1 참조.

비스-트리스 SDS-PAGE 젤 (4 내지 12%)이 변성 및 환원 조건 하에서 아르기닌 완충액의 첨가 이전 및 이후에 다양한 부피의 배양 상청액 (각각 10, 15, 20, 30 μL) 로딩을 쿠마시 블루 염색에 의해 검출한다. 둘 다의 경우에, 크기 14 내지 100 kDa의 다양한 단백질 밴드가 대략 38 kDa의 주요한 밴드를 포함하여 관찰된다.

실시예 3: 정상 인간 섬유모세포의 증식에 미치는 세크레톰의 효과

사용된 기법은 S기 세포의 DNA에 37℃로 뉴클레오티드, 5-브로모-2'-데옥시우리딘 (BrdU), 티미딘 유사체의 도입 기법이다. 이러한 기법은 세포 주기에서의 진행이 증식성 세포 (S 또는 DNA 합성기)의 특징을 갖는 세포의 정량화를 허용한다.

섬유모세포는 96-웰 플레이트에 접종되고, 다음으로 테스트될 화합물, 양성 대조군으로서 EGF 및 0.4, 0.6 및 1% 세크레톰의 존재 시 72시간 동안 배양된다. BrdU 도입은 마지막 24시간 동안 수행되고, BrdU ELISA 키트 (항목 번호 11647229001, Roche Diagnostics)를 사용하여 정량된다.

대조군의 %가 공식에 따라 계산된다:

(측정값 / 대조군의 평균) × 100

자극 %가 공식에 따라 계산된다:

평균 자극 % = (평균 (측정값 / 대조군의 평균) × 100) - 100

SEM = 표준 편차 /

통계적 분석은 스튜던트 t-테스트를 사용하여 수행된다. 연구는 3명의 공여자 풀 상에서 수행되었다.

양성 대조군 EGF는 섬유모세포 증식을 3명의 공여자 풀 상에서 강하고 유의하게 재현가능한 방식으로 자극하였다 (95% 자극). 이것은 실험을 입증한다. 결과가 0.4%, 0.6% 및 1%에서 테스트된 세크레톰이 정상 인간 섬유모세포의 증식을 유의하게 자극하였던 점을 보여준다. 하기 표 1은 테스트된 화합물의 존재 시 72시간의 배양 이후에 (n = 3 공여자 풀) 정상 인간 섬유모세포에 의한 (ELISA에 의해) BrdU 도입의 결과 (평균 ± SEM)를 요약하고 있다. 결과는 도 2에 나타낸다.

실시예 4: HaCaT 각질형성세포 세포주의 이동에 미치는 세트레톰의 효과

연구는 제조사가 추천하는 표준 프로토콜에 따라 오리스 세포 이동 검정법 (Platypus Technologies)을 사용하여 수행되었다. 먼저, HaCaT 세포 (인간 각질형성세포 세포주)가 96-웰 플레이트에 접종된다. 오리스^TM 마개가 제거되고, 평가될 화합물이 배양 배지에 첨가된다. 배양이 세포 이동을 허용하도록 24시간 동안 진행된다. 세포 투과가능한 형광성 추적자, 칼세인이 다음으로 마개로 구획된 영역에서 세포의 영상화를 허용하도록 첨가된다.

세포 이동은 웰을 촬영하고, mm²으로의 이동 표면 면적을 측정함으로써 평가된다.

대조군의 %가 공식에 따라 계산된다:

(측정값 / 대조군의 평균) × 100

자극 %가 공식에 따라 계산된다:

평균 자극 % = (평균 (측정값 / 대조군의 평균) × 100) - 100

SEM = 표준 편차 /

통계적 분석은 스튜던트 t-테스트를 사용하여 수행된다.

연구는 6번의 기술적 사본 상에서 n = 2 독립적인 실험으로 수행된다.

양성 대조군 TGF-b 및 우태아 혈청 (FCS)은 세포 이동을 강하고 유의하게 재현가능한 방식으로 자극하였다 (각각 51% 및 176% 자극). 이것은 실험을 입증한다. 결과가 0.4%, 0.6% 및 1%에서 테스트된 세크레톰이 HaCaT 각질형성세포 이동을 유의하게 자극하였던 점을 보여준다. 하기 표 2는 다양한 화합물과 24시간의 배양 이후에 (n = 2) HaCaT 세포 이동의 결과를 요약하고 있다. 결과는 도 3에 나타낸다.

실시예 5: 치유의 생체외 모델 상에서 상처 봉합에 미치는 세크레톰의 효과

돼지 귀의 피부 외부이식편이 생존 조건에서 유지된다. 6 밀리미터 생검이 원형의 3 mm 성처가 형성된 중심에서 수행된다. 상처는 표피 전체 및 상부 진피를 손상시킨다. 평가될 산물이 국소적으로 적용된다. 48시간 이후에, 생검편이 냉동되고, 헤마톡실린-에오신 염색이 절편 상에서 수행된다. 재상피화의 역학이 다음의 공정에 따라 평가된다.

1) 브랜드너 (J. Brandner, Pollok et al., 2010, J Cell Mol Med)에 의해 개발된 프로토콜에 따라 0 내지 3으로 정의되는 점수의 기여.

상처 주변으로부터 재상피화된 영역의 μm 단위의 정확한 측정. 스튜던트 t-테스트가 유의성에 적용된다.

2) 상처 주변에서 형태학적 외양도 역시 조직 보존 품질을 조사하기 위하여 평가된다.

적용될 산물의 제조: 세크레톰이 동시에 테스트될 기준 회복 크림 (시칼페이트® (Cicalfate®) 크림)의 제형물과 동일한 베이스 제형물에 0.4, 0.6 및 1 wt%로 첨가되었다. 재상피화는 이러한 기준 크림과 비교하여 평가된다.

결과는 상처 재상피화의 진행에 미치는 세크레톰으로의 용량 효과를 보여준다. 1% 세크레톰을 포함하는 제형물은 기준 회복 크림과 비교하여 상처 봉합의 진행을 유의하게 가속시킨다 (p = 0.043). 또한, 조직의 형태학적 분석은 세크레톰을 포함하는 제형물의 탁월한 내성을 보여준다. 결과는 도 4에 나타낸다.

예시적인 조성물: 물-내-오일 에멀전

실시예 2에 따른 세크레톰: 0.1 내지 5%

글리세린: 1 내지 30%

헥실렌 글리콜 0.1 내지 7%

세테아릴 글루코시드 0.1 내지 1%

세테아릴 알코올 0.9 내지 4%

스테아르산 0.5 내지 4%

글리세릴 스테아레이트 0.1 내지 4%

식물성 오일 0.1 내지 10%

물 qs 100%

Claims (15)

1. 피부 병변의 치료에 사용되는, 베타프로테오박테리아 (Betaproteobacteria) 강, 나이세리아시애 (Neisseriaceae) 아과에 속하고, 서열번호 1의 서열 또는 서열번호 1의 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 임의의 서열을 포함하는 16S rRNA를 포함하는, 비-병원성 그램-음성 박테리아의 세크레톰으로서,
   a) 상기 박테리아를 이의 성장에 적합한 배양 배지 및 조건 하에서 배양하는 단계;
   b) 액체/고체 분리 및 상기 액체상의 회수 단계; 및
   c) 상기 액체상에서 상기 박테리아에 의해 분비된 생체 분자를 포함하는 상기 세크레톰을 획득하는 단계:
   를 포함하는 공정에 의해 획득되는, 박테리아성 세크레톰.
2. 제 1항에 있어서,
   염기성 완충액이 상기 단계 b)에서 획득된 액체상에 첨가되고, 상기 획득된 완충된 액체상은 선택적으로 1 내지 7시간 동안, 바람직하게는 1 내지 6℃에서 접촉하도록 방치되는 것을 특징으로 하는, 피부 병변의 치료에 사용되는 박테리아성 세크레톰.
3. 제 2항에 있어서,
   상기 염기성 완충액은 트리스 완충액, 아르기닌 완충액 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 피부 병변의 치료에 사용되는 박테리아성 세크레톰.
4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 액체/고체 분리의 단계 b)는 이어서 단계 c) 이전에 여과에 의해 상기 액체상 또는 상기 완충된 액체상의 정화의 단계 b')로 진행되는 것을 특징으로 하는, 피부 병변의 치료에 사용되는 박테리아성 세크레톰.
5. 제 4항에 있어서,
   상기 여과는 0.2 μm 컷오프로 수행되는 것을 특징으로 하는, 피부 병변의 치료에 사용되는 박테리아성 세크레톰.
6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 생체 분자는 상기 박테리아에 의해 분비된 상기 펩티드, 단백질 및 이차 대사물로 구성되는 것을 특징으로 하는, 피부 병변의 치료에 사용되는 박테리아성 세크레톰.
7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 박테리아는 서열번호 2의 서열 또는 서열번호 2의 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 임의의 서열을 포함하는 적어도 하나의 플라스미드를 포함하는 것을 특징으로 하는, 피부 병변의 치료에 사용되는 박테리아성 세크레톰.
8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 박테리아는 CNCM에 2010년 4월 8일자로 수탁번호 I-4920 하에 기탁된 박테리아인 것을 특징으로 하는, 피부 병변의 치료에 사용되는 박테리아성 세크레톰.
9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 피부 병변은 찰과상, 화상, 일광 화상, 스크래치, 절단, 스크레이프, 봉합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 피부 병변의 치료에 사용되는 박테리아성 세크레톰.
10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 피부 병변은 외상, 수술, 피부과학적 절차 또는 미용적 의약 절차로 진행되는 것을 특징으로 하는, 피부 병변의 치료에 사용되는 박테리아성 세크레톰.
11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 피부 병변의 치료는 치유 및 피부 복구를 개선하는 것으로 구성되는 것을 특징으로 하는, 피부 병변의 치료에 사용되는 박테리아성 세크레톰.
12. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 박테리아성 세크레톰은 구리염 및/또는 아연염과 조합되는 것을 특징으로 하는, 피부 병변의 치료에 사용되는 박테리아성 세크레톰.
13. 피부 병변의 치료에 사용되는, 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 박테리아성 세크레톰 및 국소적 적용에 적합한 피부과학적 부형제를 포함하는, 피부과학적 조성물.
14. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 박테리아성 세크레톰, 구리염 및/또는 아연염 및 적합한 피부과학적 부형제를 포함하는, 피부과학적 조성물.
15. 제 14항에 있어서,
    피부 병변의 치료에 사용되는, 피부과학적 조성물.

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