KR20180029894A - 유두진피 섬유아세포의 고순도 분리 방법 - Google Patents

유두진피 섬유아세포의 고순도 분리 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유두진피 섬유아세포의 분리방법 및 고순도 유두진피 섬유아세포 집단의 수득방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 유두진피 섬유아세포의 분리방법 및 고순도 유두진피 섬유아세포의 집단 수득방법은 섬유아세포 중 피부재생 효과가 우수한 유두진피 섬유아세포 부분을 순도 높게 분리할 수 있다. 또한 상기 방법에 의해 분리된 유두진피 섬유아세포 및 이의 집단을 포함하는 조성물은 기존의 섬유아세포 치료제에 비하여 피부재생 효과가 우수하여 의약품으로 이용가능 할 뿐만 아니라, 의약외품, 화장품에도 유용하게 이용될 수 있다.

Description

유두진피 섬유아세포의 고순도 분리 방법 {Method for Isolation of high purity papillary dermal fibroblasts from fibroblasts}
본 발명은 유두진피 섬유아세포의 분리방법 및 고순도 유두진피 섬유아세포 집단의 수득방법에 관한 것이다.
의약품시장은 화학합성 의약품에서 바이오 의약품으로 발전해가고 있다. 바이오 의약품은 사람이나 다른 생물체에서 유래된 단백질, 유전자 및 세포 등을 원료 또는 재료로 하여 만들어진 의약품으로 항체의약품, 세포치료제, 바이오 시밀러 등으로 나눌 수 있다.
세포치료제는 단백질의약품과는 다르게 질병의 근본적인 원인을 치료한다는 원리에서 출발하는 새로운 기술이다. 최근 섬유아세포를 이용한 흉터 치료제, 피부 각질세포를 이용한 피부화상 치료제, 줄기세포를 이용한 관절염 치료제 등에 대한 연구가 진행되고 있으며, 이를 이용한 제품 개발이 활발하게 이루어지고 있다. 기존 판매중인 자가 섬유아세포 치료제는 환자의 귀 뒤 진피 조직에서 섬유아세포를 1차적으로 분리한 후 증식 및 배양하여 환자 피부에 적용하는 방법으로 활용되고 있으며, 여드름에 의한 피부 함몰, 주름, 난치성 피부염 등의 치료에 사용되고 있다. 그러나 섬유아세포 치료제의 피부 함몰 등에 대한 피부재생 능력은 기존의 치료법 및 미용 필러와 비교하여 활성이 떨어진다는 문제점이 보고되고 있다. 이 기능의 차이를 극복하기 위해 자가 섬유아세포 외에 히알루론산 등의 첨가물 또는 고분자 혹은 저분자 복합물 지지체를 추가하여 활용하고 있지만 기능적으로 월등한 향상을 가져오지는 못하는 실정이다.
한편, 최근 연구에 의하면 섬유아세포는 위치에 따라 유두진피 섬유아세포 및 망상진피 섬유아세포로 나뉘며 기능 및 활성에서 차이가 발생한다는 점이 확인되었다. 그럼에도 불구하고 현재 판매되고 연구개발 중인 자가 섬유아세포 치료제는 여러 세포가 혼재되어 있는 형태의 섬유아세포를 이용한 것이 대부분이며, 이의 효능 또는 효과는 부족한 것으로 알려져 있다.
본 발명자는 섬유아세포 치료제의 효능 또는 효과 부족에는 원재료가 되는 섬유아세포의 혼재성(heterogeneity)에 있다고 판단하였다. 이에 본 발명자는, 섬유아세포로부터 피부 재생 효과가 우수한 유두진피 섬유아세포를 순도 높게 분리하기 위해 예의 노력한 결과, 트랜스웰 배양방법을 이용하면 쉽고 빠르게 유두진피 섬유아세포를 고순도로 분리할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 트랜스웰에서 혼재된 섬유아세포를 배양하고, 상부 챔버 상단에 존재하는 세포를 수득하여 유두진피 섬유아세포를 분리하는 분리방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 트랜스웰에서 혼재된 섬유아세포를 배양하고, 상부 챔버 상단에 존재하는 세포를 수득하여 고순도의 유두진피 섬유아세포 집단을 수득하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 수득된 유두진피 섬유아세포 집단을 포함하는 피부재생용 약학적 조성물, 의약외품 조성물, 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) 피부 조직으로부터 섬유아세포를 수득하는 단계; (2) 수득된 세포를 트랜스웰에 접종하는 단계; (3) 접종된 세포를 배양하는 단계; 및 (4) 트랜스웰 상부 챔버 상단에 존재하는 세포를 수득하는 단계; 를 포함하는 유두진피 섬유아세포의 분리방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) 피부 조직으로부터 섬유아세포를 수득하는 단계; (2) 상기 섬유아세포를 트랜스웰에 접종하는 단계; (3) 접종된 세포를 배양하는 단계; 및 (4) 트랜스웰 상부 챔버 상단에 존재하는 세포를 분리하는 단계; 를 포함하는 고순도 유두진피 섬유아세포 집단의 수득 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 수득된 유두진피 섬유아세포 집단을 포함하는 피부재생용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 수득된 유두진피 섬유아세포 집단을 포함하는 피부재생용 의약외품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 수득된 유두진피 섬유아세포 집단을 포함하는 피부재생용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 유두진피 섬유아세포의 분리방법 및 고순도 유두진피 섬유아세포의 집단 수득방법은 섬유아세포 중 피부재생 효과가 우수한 유두진피 섬유아세포 부분을 순도 높게 분리할 수 있다. 또한 상기 방법에 의해 분리된 유두진피 섬유아세포 및 이의 집단을 포함하는 조성물은 기존의 섬유아세포 치료제에 비하여 피부재생 효과가 우수하여 의약품으로 이용가능 할 뿐만 아니라, 의약외품, 화장품에도 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 섬유아세포의 접종 세포 수 및 트랜스웰 상부 챔버 상단 (top) 및 하단 (bottom) 위치에 따른 유두진피 섬유아세포 마커 NTN1, 망상진피 섬유아세포 마커 MGP 의 발현량을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명에 따른 유두진피 섬유아세포의 분리방법의 모식도이다.
도 3은 트랜스웰 상부 챔버 상단 (top) 및 하단 (bottom) 위치에 따른 세포의 증식능력을 배양 0 내지 9일 동안 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 트랜스웰 분리 횟수에 따른 유두진피 섬유아세포 마커 NTN1, 망상진피 섬유아세포 마커 MGP 의 발현량을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 트랜스웰 배양단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 유두진피 섬유아세포의 분리방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 유두진피 섬유아세포의 분리방법은 (1) 피부 조직으로부터 섬유아세포를 수득하는 단계; (2) 수득된 세포를 트랜스웰에 접종하는 단계; (3) 접종된 세포를 배양하는 단계; 및 (4) 트랜스웰 상부 챔버 상단에 존재하는 세포를 수득하는 단계; 를 포함하는 유두진피 섬유아세포의 분리방법을 포함한다.
본 발명의 분리방법에 따르면 유두진피 섬유아세포만을 선택적으로 고순도로 쉽게 분리할 수 있으며, 수득된 유두진피 섬유아세포만을 대량으로 배양할 수 있게 하고, 고순도의 유두진피 섬유아세포만을 이용하여 피부 재생 효과를 더욱 증가시킬 수 있다.
본 발명의 (1) 단계는 피부 조직으로부터 섬유아세포를 수득하는 단계이다. 이와 같은 섬유아세포를 수득하는 단계는 당 분야에 알려진 통상의 방법을 통해 수행될 수 있다. 예컨대 피부 조직을 세척한 후 피부의 진피층을 분리하고 배양 플레이트에 진피층을 고정시키고 세포를 해리시켜 섬유아세포 집단을 수득할 수 있다. 이때 피부 조직은 신체의 다양한 부위로부터 제한 없이 얻을 수 있으며, 피부조직 수득을 위한 개체는 인간을 포함한 포유류인 것이 바람직하다.
본 명세서에 사용된, 용어 '섬유아세포(fibroblast)'란 섬유성 결합조직의 중요한 성분을 이루는 세포로서, 섬유세포라고도 한다. 조직절편으로 관찰하면 편평하고 길쭉한 외형을 가지며 흔히 불규칙한 돌기를 보이며, 세포질은 미토콘드리아, 골지체, 중심체, 소지방체 등을 포함하고 그 밖에 특수한 분화는 나타내지 않는다. 핵은 염색성이 약하고 타원형이며 인을 함유한다. 교원섬유에 밀접해 있는 경우가 많고, 그 형성에 관계가 있다고 생각되므로 상기와 같은 명칭이 붙었다.
본 발명의 (1) 단계에서 수득되는 섬유아세포는 유두진피 섬유아세포(Papillary dermal fibroblast) 및 망상진피 섬유아세포(Reticular dermal fibroblast) 를 모두 포함하는 혼재된 상태일 수 있다.
섬유아세포는 크게 진피 조직의 상부와 하부의 위치에 따라 유두진피 섬유아세포(Papillary dermal fibroblast) 및 망상진피 섬유아세포(Reticular dermal fibroblast) 로 나뉘어 진다. 여기에서 유두 진피는 표피 바로 밑의 얇은 부위이고, 유두 진피에서 피하 지방층 표면까지의 두터운 부위가 망상 진피로 분류될 수 있다. 유두진피와 망상 진피는 크기와 형태가 서로 상이하고 각각 다른 기능적인 특성을 가지며, 예컨대 유두 진피의 교원질은 가는 섬유로 엮어진 망으로 존재하는 반면, 망상 진피의 교원질은 두터운 다발을 형성하며 피부 표면에 평행하게 나열될 수 있다.
본 발명의 (2) 단계는 수득된 세포를 트랜스웰에 접종하는 단계이다.
본 명세서에 사용되는 '트랜스웰' 또는 '트랜스웰 플레이트'는 당업계에서 널리 사용되는 것으로, 상업적으로 시판되는 제품을 사용할 수 있으며, 트랜스웰 플레이트에 대한 정보 및 사용법은 당 분야의 통상의 기술자의 기술 수준의 범위 내에 있다. 트랜스웰 플레이트는 하단부가 미세다공성 막으로 이루어진 상부 챔버(Top Chamber)와 배지를 함유하는 하부 챔버(Bottom Chamber)로 구성되며, 상부 챔버는 하부 챔버의 내부에 위치하고, 두 챔버는 배양배지를 공유한다. 트랜스웰 배양 시, 추가적으로 다른 성분들이 포함될 수 있으며, 본 발명의 목적을 달성하기 위해 추가적인 기질(substrate)을 포함할 수 있고, 예컨대, 각질세포 분비 인자(keratinocyte secretion factor) 또는 상피세포성장인자(Epidermal growth factor, EGF) 등을 포함할 수 있다.
여기서 미세다공성 막은 세포분비물질과 같은 세포성 물질, 배양배지, 줄기세포가 투과할 수 있는 지지체로써, 미세다공성 막의 구멍의 크기는 당업자가 적절히 채택할 수 있다. 상기 미세다공성 막의 공극 크기는 상부 챔버에 위치되는 혼재된 피부 섬유아세포가 하부 챔버로 모두 투과되지 않을 정도의 공극 크기를 갖는 것이 바람직하고, 예컨대 미세다공성 막의 공극 크기는 1 ㎛ 내지 10 ㎛, 바람직하게는 5.0 내지 10 ㎛, 더욱 바람직하게는 7.0 내지 8.5㎛일 수 있다.
트랜스웰 상부 챔버의 바닥면을 구성하는 미세다공성 막은 당 분야에서 통상적으로 사용되는 재료로 이루어진 막을 이용할 수 있으며, 예컨대, 폴리카르보네이트, 폴리에스테르, 콜라겐-코팅된 폴리테트라플루오로에틸렌 등이 미세다공성 막으로 이용될 수 있다.
본 발명의 분리방법 (1) 단계를 통해 수득된 섬유아세포를 트랜스웰에 접종하는 경우, 접종 세포 수는 배양에 적절하도록 조절될 수 있고, 세포는 1x104 내지 1×106cell, 바람직하게는 1x104 내지 2×105cell, 더욱 바람직하게는 0.2×105 내지 2×105cell 로 접종될 수 이다.
본 발명의 (3) 단계는 접종된 세포를 배양하는 단계이며, (4) 단계는 트랜스웰 상부 챔버 상단에 존재하는 세포를 수득하는 단계이다.
섬유아세포의 배양은 통상의 섬유아세포 배양 조건에 따라 수행될 수 있으며, 후 37℃ 5% CO2 조건의 세포 배양기에서 1 내지 5일, 바람직하게는 2 내지 5일, 더욱 바람직하게는 3일 동안 배양될 수 있다.
이러한 배양 단계 중 혼재되어 있는 피부 섬유아세포는 상부 챔버의 미세다공성 막을 통해 이동하게 되며, 그 결과 상부 챔버의 상단에는 유두진피 섬유아세포가 모이게 되고, 상부 챔버의 하단에는 망상진피 섬유아세포가 모이게 된다.
이렇게 이동된 세포 집단은 각각의 위치에서 발현되는 유듀진피 섬유아세포의 마커 또는 망상진피 섬유아세포의 마커 발현에 의해 확인할 수 있다.
상기 마커는 리포터 유전자일 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는, 유두진피 섬유아세포의 마커로서, NTN1(Netrin-1), 망상진피 섬유아세포의 마커로서 MGP(Matrix gla protein)을 사용하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 세포 수득 단계는 트랜스웰 상부 챔버 상단에 존재하는 세포를 수집하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어 트랜스웰 “상부 챔버 상단”이란, 상부 챔버의 세포 배양 공간에 면해있는 상부 챔버의 바닥부의 표면부를 의미한다. 반면 트랜스웰 “상부 챔버 하단”이란, 상부 챔버와 하부 챔버가 이루는 공간 쪽에 면해있는 상부 챔버 바닥부의 표면을 의미한다.
본 발명에서 수득 대상으로 하는 유두진피 섬유아세포는 트랜스웰 배양을 통해 트랜스웰 상부 챔버의 상단에 모이게 되며, 목적하는 세포의 수득을 위해 트랜스웰 상부 챔버 상단에 위치하는 세포만을 선별하여 수득할 수 있고, 수득된 세포만을 배양하여 유두진피 섬유아세포만을 대량으로 수득할 수 있다.
또한 더욱 높은 순도로 유두진피 섬유아세포만을 선별하기 위하여 본 발명의 (2) 내지 (4) 단계를 1 내지 10회, 바람직하게는 1 내지 5회 반복하여 수행될 수 있다. 이를 반복 수행하는 경우, (4) 단계 트랜스웰 상부 챔버 상단에 존재하는 세포를 수득한 후, 다시 이를 (2) 단계에 적용하여 트랜스웰에 접종하고, 접종된 세포를 배양하는 단계를 반복하여 수행할 수 있다.
상기와 같은 방법에 따르면 혼재된 피부 섬유아세포로부터 목적하는 유두진피 섬유아세포만을 쉽게 분리할 수 있다.
따라서 본 발명은 상기와 같은 분리방법을 통해 달성할 수 있는 고순도 유두진피 섬유아세포 집단의 수득 방법을 제공한다. 보다 구체적으로 본 발명은 (1) 피부 조직으로부터 섬유아세포를 수득하는 단계; (2) 상기 섬유아세포를 트랜스웰에 접종하는 단계; (3) 접종된 세포를 배양하는 단계; 및 (4) 트랜스웰 상부 챔버 상단에 존재하는 세포를 분리하는 단계; 를 포함하는 고순도 유두진피 섬유아세포 집단의 수득 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 따르면, 혼재되어 있는 피부유래 섬유아세포 집단에서 망상진피 섬유아세포는 제거된 고순도의 유두진피 섬유아세포 집단을 효과적으로 수득할 수 있다. 따라서 본 발명에 따라 수득된 세포 집단에서는 유두진피 섬유아세포의 비율이 트랜스웰 배양 전과 비교하여 현저하게 증가되고 망상진피 섬유아세포의 비율은 현저하게 감소되어 있다.
본 발명에 있어 고순도란, 세포 집단 내에 다른 세포, 예컨대 망상진피 세포의 존재가 감소하고 높은 비율로 유두진피 섬유아세포만 존재하는 것을 의미하며, 감소 및 증가의 기준은 트랜스웰 배양 전 피부 조직으로부터 수득된 섬유아세포 집단일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 수득된 유두진피 섬유아세포를 포함하는 피부재생용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 유두진피 섬유아세포는 피부재생을 촉진하는 유효성분이며, 이의 배양액 등을 제한 없이 포함한다.
본 명세서에 사용된, 용어 '피부재생'이란 피부의 탄력성 증대, 주름 개선, 노화 진행 저해 등을 의미하는 것으로, 본 발명의 조성물을 피부에 적용하면 유두진피 섬유아세포에 의해 섬유아세포의 증식을 개시하고 기존 세포의 사멸을 감소시켜서 피부의 탄력성을 증가시키고 주름의 생성을 지연 및 방지하여 노화를 지연시키는 것을 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 조성물은 피부, 예컨대 모발 또는 두피에 직접 도포 또는 산포하는 등의 방법에 의해 투여할 수 있는 제형, 예를 들어, 크림, 로션, 연고, 에어로졸, 겔, 또는 팩의 제형을 갖는 것일 수 있다. 각각의 제형에 적합한 배합성분이나 제제를 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 당업자들은 이들 제제를 제조할 때, 통상의 외용제를 제조하는 데에 사용되는 각종 배합 성분을 적절히 선택하여 사용할 수 있다.
그러한 성분으로는 연고제ㆍ크림제ㆍ겔제ㆍ로션제의 경우에 있어서는, 백색 바셀린, 황색 바셀린, 라놀린, 표백 밀랍, 세탄올, 스테아릴알코올, 스테아르산, 경화유, 겔화 탄화수소, 폴리에틸렌글리콜, 유동 파라핀, 스쿠알란 등의 기제; 올레산, 미리스트산이소프로필, 트리이소옥탄산글리세린, 크로타미톤, 세바크산디에틸, 아디프산디이소프로필, 라우르산헥실, 지방산, 지방산 에스테르, 지방족 알코올, 식물유 등의 용제 및 용해 보조제; 토코페롤 유도체, L-아스코르브산, 디부틸하이드록시톨루엔, 부틸하이드록시아니솔 등의 산화 방지제; 파라하이드록시벤조산에스테르 등의 방부제; 글리세린, 프로필렌글리콜, 히알루론산나트륨 등의 보습제; 폴리옥시에틸렌유도체, 글리세린 지방산 에스테르, 자당 지방산 에스테르, 소르비탄 지방산 에스테르, 프로필렌글리콜 지방산 에스테르, 레시틴 등의 계면 활성제; 카르복시비닐 폴리머, 잔탄검, 카르복시메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스나트륨염류, 하이드록시프로필셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 등의 증점제 등이 있다.
에어로졸제의 경우에 있어서는, 연고제, 크림제, 겔제, 현탁제, 유제, 액제 및 로션제 등의 조제에 사용되는 백색 바셀린, 황색 바셀린, 라놀린, 표백 밀랍, 세탄올, 스테아릴알코올, 스테아르산, 경화유, 겔화 탄화수소, 폴리에틸렌글리콜, 유동 파라핀, 스쿠알란 등의 기제; 올레산, 미리스트산이소프로필, 아디프산디이소프로필, 세바크산이소프로필, 트리이소옥탄산글리세린, 크로타미톤, 세바크산디에틸, 라우르산헥실, 지방산, 지방산 에스테르, 지방족 알코올, 식물유 등의 용제 및 용해 보조제; 토코페롤 유도체, L-아스코르브산, 디부틸하이드록시톨루엔, 부틸하이드록시아니솔 등의 산화 방지제; 파라하이드록시벤조산에스테르 등의 방부제; 글리세린, 프로필렌글리콜, 히알루론산나트륨 등의 보습제; 폴리옥시에틸렌 유도체, 글리세린 지방산 에스테르, 자당 지방산에스테르, 소르비탄 지방산 에스테르, 프로필렌글리콜 지방산 에스테르, 레시틴 등의 계면 활성제; 카르복시비닐 폴리머, 잔탄검, 카르복시메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨염류, 하이드록시프로필셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 등의 증점제; 추가로 각종 안정제, 완충제, 교미제, 현탁화제, 유화제,방향제, 보존제, 용해 보조제, 그 밖의 적당한 첨가제를 배합할 수 있다.
또한, 필요에 따라 안정제, 보존제, 흡수 촉진제, pH 조정제, 그 밖의 적당한 첨가제를 배합할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다.
본 발명에서 용어, '약학적으로 유효한 양'은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질병의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르며, 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있으나, 일반적으로 1.0X103 내지 1.0X1010 Cell/ml 의 양, 바람직하게는 1.0X105내지 1.0X107 Cell/ml의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있으며, 이는 환자의 상태 및 처치의의 판단에 따라 다르게 결정될 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 방법은 특별한 제한이 있는 것은 아니며, 바람직하게는 경피투여 방식으로 피부 부위에 도포하는 형태로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 세포 주사제의 형태로 직접 주입하는 것도 가능하며, 투여방법에 특별한 제한이 있는 것은 아니다.
또한 상기 조성물로부터 선택되는 투여 수준은 유효성분의 활성, 투여 경로, 치료되는 피부의 병태 및 이전 병력에 따를 것이다. 그러나 원하는 치료 효과의 달성을 위해 요구되는 것보다 낮은 수준의 유효성분의 용량에서 시작하여, 원하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 서서히 증가시키는 것은 당업계의 지식 내에 있으며, 바람직한 투여량은 나이, 성별, 체형, 체중에 따라 결정될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 분리된 유두진피 섬유아세포를 포함하는 피부재생용 의약외품 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어, '의약외품'은 사람이나 동물의 질병을 치료, 경감, 처치또는 예방할 목적으로 사용되는 섬유, 고무제품 또는 이와 유사한 것, 인체에 대한 작용이 약하거나 인체에 직접 작용하지 않으며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염 예방을 위하여 살균, 살충 및 이와 유사한 용도로 사용되는 제제 중 하나에 해당하는 물품으로서, 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것 및 사람이나 동물의 구조와 기능에 약리학적 영향을 줄 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것을 제외한 물품을 의미하며, 피부 외용제 및 개인위생용품도 포함한다.
본 발명의 조성물을 피부재생을 목적으로 의약외품에 포함시킬 경우, 상기 조성물을 그대로 포함하여 사용하거나 다른 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정할 수 있다.
상기 피부외용제는 특별히 이에 제한되지 않으나, 예를 들어 연고제, 로션제, 스프레이제, 패치제, 크림제, 산제, 현탁제 또는 젤제의 형태로 제조되어 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 분리된 유두진피 섬유아세포를 포함하는 피부재생용 화장료 조성물을 제공한다. 본 발명의 유두진피 섬유아세포는 피부재생을 촉진하는 유효성분이며, 이의 배양액 등을 제한 없이 포함한다.
상기 화장료 조성물은 피부 외용제 제형으로서 당업계에 공지된 기술을 이용하여 일반적인 화장용 조성물의 제형(예를 들면 화장수, 로션, 크림, 젤 등)으로 제형화할 수 있다. 목적한 제형에 따라 이용할 수 있는 담체의 종류와 농도는 다양하지만 당업계의 통상의 기술자라면 용이하게 결정할 수 있다.
상기 '화장용으로 허용된 담체(cosmetically acceptable carrier)'는 정제수, 오일, 왁스, 지방산, 지방산 알콜, 지방산 에스테르, 계면활성제, 흡습제(humectant), 증점제(thickening agent), 항산화제, 점도 안정화제(viscosity stabilizer), 킬레이팅제, 완충제, 방부제, 저급 알콜 등이 포함될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 필요에 따라 미백제, 보습제, 항염증제, 항박테리아제, 항진균제, 비타민, 자외선 차단제, 항생제, 여드름 방지제, 향수, 염료가 포함될 수도 있으며, 이들은 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 양으로 본 발명에 따른 화장용 조성물에 포함될 수 있다. 조성물 총 중량 당 0.01 내지 20 중량%가 적합하다.
구체적으로 상기 오일로서 수소화 식물성유, 파마자유, 면실유, 올리브유, 야자인유, 호호바유, 아보카도유가 이용될 수 있으며 왁스로는 밀랍, 경랍, 카르나우바, 칸델릴라, 몬탄, 세레신, 액체 파라핀, 라놀린이 이용될 수 있다. 지방산으로는 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 올레산이 이용될 수 있고 지방산 알콜로는 세틸 알콜, 옥틸 도데칸올, 올레일 알콜, 판텐올, 라놀린 알콜, 스테아릴 알콜, 헥사데칸올이 이용될 수 있으며 지방산 에스테르로는 이소프로필 미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, 부틸 스테아레이트가 이용될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
계면 활성제의 예에는 소듐 스테아레이트, 소듐 세틸설페이트, 폴리옥시에틸렌 라우릴에테르 포스페이트, 소듐 N-아실 글루타메이트와 같은 음이온 계면활성제; 스테아릴디메틸벤질암모늄 클로라이드 및 스테아릴트리메틸암모늄 클로라이드와 같은 양이온 계면활성제; 알킬아미노에틸글리신 하이드로클로라이드 및 레시틴과 같은 양성 계면활성제; 글리세린 모노스테아레이트, 소르비탄 모노스테아레이트, 수크로오스 지방산 에스테르, 프로필렌 글리콜 모노스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 올레일에테르, 폴리에틸렌 글리콜 모노스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미테이트, 폴리옥시에틸렌 코코넛 지방산 모노에탄올아르니드(monoethanolarnide), 폴리옥시프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌 캐스터유, 폴리옥시에틸렌 라놀린과 같은 비이온성 계면활성제 등이 포함된다.
흡습제에는 글리세린, 1,3-부틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜이 이용될 수 있으며 저급 알콜로는 에탄올, 이소프로판올이 이용 가능하다. 증점제의 예에는 알긴산 나트륨, 카제인산 나트륨, 젤라틴 한천, 크산탄 고무, 전분, 셀룰로오스 에테르(예, 하이드록시에틸 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 카르복시메틸 셀룰로오스, 하이드록시 프로필메틸 셀룰로오스), 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스 등이 포함될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
항산화제로는 부틸레이티드 하이드록시톨루엔, 부틸레이티드 하이드록시아니솔, 프로필 갈레이트, 시트르산, 에톡시퀸(ethoxyquin)이 이용 가능하고, 킬레이팅제로는 디소듐 에데테이트, 에탄하이드록시 디포스페이트가 이용 가능하며, 완충제로는 시트르산, 소듐 시트레이트, 붕산, 보랙스(borax), 디소듐 하이드로젠 포스페이트가 이용 가능하고 방부제로는 메틸 파라하이드록시벤조에이트, 에틸 파라하이드록시벤조에이트, 디하이드로아세트산, 살리실산, 벤조산 등이 포함될 수 있으며 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 피부재생용 조성물은 그 제형을 달리하여 애완동물용으로 사용할 수 있다. 예를 들어, 애완동물용 샴푸 및 애완동물용 린스 등과 같이 용액, 솔젤, 에멀젼, 오일, 왁스, 에어졸 등 다양한 형태로 제조될 수 있고, 애완동물의 피부에 자극이 적고 보습력이 탁월한 중성의 세제를 첨가하여 제조할 수 있다.
본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 더욱 쉽게 이해할 수 있도록 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니며, 이 때, 사용되는 기술용어 및 과학용어에 있어 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 의미를 지닌다.
실시예 1. 섬유아세포의 수득
인간의 포피 또는 눈꺼풀 조직을 DPBS(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline)로 세척한 후, 가위와 면도칼을 이용하여 피부 조직 안쪽의 지방을 제거하여 피부의 진피층을 분리하였다. 분리된 조직을 잘게 자르고 진피층을 100mm 배양 플레이트 바닥에 부착시키기 위해 5~15분 동안 고정하였다. 고정된 조직에 10% 소태아혈청(fetal bovine serum)과 1% 페니실린 항생제가 포함된 DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium)을 조직이 충분히 잠길 만큼 (약 10ml) 공급(feeding) 하였다. 그 후, 2~4주의 기간 동안 조직에서 세포가 해리되어 플레이트에 부착 및 증식하는 것을 확인한 후, 충분한 양의 세포가 해리되면 조직을 플레이트에서 제거하고, 0.25% 트립신 EDTA(ethylenediaminetetra acetic acid)를 사용하여 혼재된 섬유아세포를 수득하였다.
실시예 2. 트랜스웰을 이용한 유두진피 섬유아세포의 분리
2.1 트랜스웰을 이용한 세포의 분리
실시예 1에서 수득한 혼재된 섬유아세포 집단으로부터 유두진피 섬유아세포와 망상진피 섬유아세포를 분리하기 위하여, 트랜스웰에 혼재된 섬유아세포 집단을 위치시키고 분리 효과를 관찰하였다. 구체적으로 혼재된 섬유아세포 집단을 6웰 플레이트를 갖는 트랜스웰 (falcon, 353093, 8.0 μm pore size (1 x 105 pores/cm2)) 에 각각 접종하여 배양하였다. 배양 배지로는 WELGENE 사의 DMEN high glucouse에 10% 소태아 혈청 1% 페니실린 스트렙토마이신이 보충된 배지를 사용하였다. 대조군으로 일반적 6well 배양 범위인 1×105 cell 을 접종하였고, 시험군으로 0.2, 0.4, 1, 2×105cell을 트랜스웰 상부 챔버에 접종하였다. 접종 후 37℃ 5% CO2 조건의 세포 배양기에서 3일간 배양하였다. 이후, 0.25% 트립신 EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)를 사용하여 대조군 및 트랜스웰 시험군의 상부 챔버의 상단 (Top layer) 및 하단 (bottom layer)을 각각 수득하였다.
2.2 트랜스웰을 이용한 세포 분리 효과 확인
수득된 각 부위의 세포들이 유두진피 섬유아세포와 망상진피 섬유아세포로 효과적으로 분리되었는지 확인하기 위하여, 각각의 부위로부터 수득한 세포에서 마커 발현을 분석하였다. 먼저 High pure RNA isolation kit (Roche, 11828665001)를 사용하여 각 부위에서 수득한 세포로부터 RNA를 분리하였다. 그 후 Transcriptor first strand cDNA synthesis kit(Roche, 4897030001)를 사용하여 분리한 RNA로부터 cDNA 합성하였다. 분리 및 합성된 cDNA에 대하여 RT-PCR을 수행하였으며, 유두진피 섬유아세포의 마커인 NTN1(Netrin-1) 와 망상진피 섬유아세포의 마커인 MGP(Matrix gla protein)의 발현을 EI24 유전자로 정량화한 뒤 상대 정량하여 분석하였다. RT-PCR 에 사용된 프라이머 서열은 다음과 같으며, 마커 발현을 비교한 결과를 도 1에 나타내었다.
Figure pat00001
도 1에 나타낸 바와 같이, 분석 결과 트랜스웰 상부 챔버 상단에서 분리된 세포에서는 유두진피 섬유아세포)의 마커인 NTN1의 증가 및 망상진피 섬유아세포의 마커인 MGP의 감소를 확인하였다. 이와 반대로 트랜스웰의 상부 챔버 하단에서 분리된 세포에서는 NTN1의 감소와 MGP의 증가를 확인하였다. 이러한 결과는 트랜스웰 배양에 의하여 혼재된 섬유아세포를 유두진피 섬유아세포와 망상진피 섬유아세포로 분리할 수 있음을 나타내는 결과이다. 본 발명에 따른 트랜스웰을 이용한 피부 섬유아세포 분리법의 모식도를 도 2에 나타내었다.
실시예 3. 분리된 유두진피 섬유아세포의 증식력 평가
실시예 2의 방법으로 분리된 세포의 증식력 차이를 평가하였다. 상부 챔버 상단과 하단의 세포를 각각 수득한 뒤 트랜스웰로 배양하지 않은 혼재된 상태의 피부 섬유아세포 (none), 상단 세포(top), 하단 세포(bottom) 를 각각 계대 배양하였다. 배양 배지로는 WELGENE 사의 DMEN high glucose에 10% 소태아 혈청, 1% 페니실린 스트렙토마이신이 보충된 배지를 이용하였다. 60mm dish 에 5x103 cells를 접종하였으며, 37℃, CO2 5% 의 항온 및 항습 세포 배양기에서 배양을 수행하였다. 배양배지는 2~3일 간격으로 교체하고, 세포 접종일로부터 3, 6, 9일간격으로 Trypsin EDTA 0.25% 를 사용하여 부유시켰다. 수득된 세포를 계수하여 세포 수를 측정하였으며, 이를 통해 세포의 증식능력을 평가하고 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 상부 챔버 상단에서 분리된 세포의 증식률은 트랜스웰을 이용하지 않은 대조군의 세포보다 뛰어났으며, 하단에서 분리된 세포들보다 뛰어난 것으로 나타났다. 반면 하단에서 분리된 세포들의 증식률은 대조군 세포보다도 감소되는 양상을 확인하였다. 이러한 결과는 트랜스웰을 이용한 배양법을 통해 분리되는 상부 챔버 상단의 분리된 유두진피 섬유아세포가 혼재된 상태 및 하단의 망상진피 섬유아세포와 비교하여 증식력이 우수한 세포임을 보여주는 결과이다. 즉, 트랜스웰 배양법을 이용하면 혼재된 피부 섬유아세포로부터 증식력이 우수한 유두진피 섬유아세포만을 효과적으로 분리, 선별할 수 있으며, 분리된 유두진피 섬유아세포를 이용하면 혼재된 상태의 피부 섬유아세포를 이용하는 것과 비교하여 피부 재생을 더욱 촉진할 수 있다.
실시예 4. 트랜스웰을 이용한 세포분리 반복 시험
트랜스웰 배양에 의하여, 유두진피 섬유아세포와 망상진피 섬유아세포를 효과적으로 분리할 수 있음을 확인하였으므로, 트랜스웰 분리 횟수에 따라 분리 수율이 변화하는지 여부를 확인하여 최적의 분리 조건을 확인하였다. 이를 위하여 트랜스웰을 이용한 분리 회수를 0, 1, 2회로 변경하며 피부 섬유아세포를 배양하였고, 분리 횟수에 해당하는 세포 집단에서 마커 NTN1 및 MGP 의 발현량을 확인하고 비교하였다. 발현 량의 확인을 위한 RT-PCR은 실시예 2의 방법에 따라 수행하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 트랜스웰 분리 횟수를 증가시킬수록 분리 수율은 증가하였다. 이러한 결과는 트랜스웰 배양을 통해 혼재된 상태의 피부 섬유아세포를 유두진피 섬유아세포와 망상진피 섬유아세포로 분리할 수 있음을 뒷받침하는 결과이다.

Claims (10)

  1. (1) 피부 조직으로부터 섬유아세포를 수득하는 단계;
    (2) 수득된 세포를 트랜스웰에 접종하는 단계;
    (3) 접종된 세포를 배양하는 단계; 및
    (4) 트랜스웰 상부 챔버 상단에 존재하는 세포를 수득하는 단계; 를 포함하는 유두진피 섬유아세포의 분리방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 (1) 단계의 섬유아세포는 유두진피 섬유아세포 및 망상진피 섬유아세포를 포함하는 것인, 유두진피 섬유아세포의 분리방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 (2) 단계의 트랜스웰은 5.0 내지 10.0 μm의 공극을 갖는 것을 특징으로 하는, 유두진피 섬유아세포의 분리방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 (2) 단계의 세포는 1x104 내지 2×106cell 로 접종되는 것인, 유두진피 섬유아세포의 분리방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 (3) 단계의 배양은 1 내지 5일간 배양하는 것을 특징으로 하는, 유두진피 섬유아세포의 분리방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 (2) 내지 (4) 단계를 1회 내지 5회 반복하는 것을 특징으로 하는, 유두진피 섬유아세포의 분리방법.
  7. (1) 피부 조직으로부터 섬유아세포를 수득하는 단계;
    (2) 상기 섬유아세포를 트랜스웰에 접종하는 단계;
    (3) 접종된 세포를 배양하는 단계; 및
    (4) 트랜스웰 상부 챔버 상단에 존재하는 세포를 분리하는 단계; 를 포함하는 고순도 유두진피 섬유아세포 집단의 수득 방법.
  8. 제7항의 방법으로 수득된 유두진피 섬유아세포 집단을 포함하는 피부재생용 약학적 조성물.
  9. 제7항의 방법으로 수득된 유두진피 섬유아세포 집단을 포함하는 피부재생용 의약외품 조성물.
  10. 제7항의 방법으로 수득된 유두진피 섬유아세포 집단을 포함하는 피부재생용 화장료 조성물.
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