CN111432799A - 包含干细胞来源外排体作为有效成分的组合物在使皮肤屏障增强和使其功能改善中的用途 - Google Patents

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Abstract

根据本发明的用于使皮肤屏障增强和使其功能改善的组合物增强与皮肤屏障的保护、增强和功能改善相关的客观指标。根据本发明的用于使皮肤屏障增强和使其功能改善的组合物可改善角质层的失水指标(例如经表皮失水(TEWL))并提高皮肤水合作用。另外，本发明的用于使皮肤屏障增强和使其功能改善的组合物表现出提高神经酰胺、二氢神经酰胺和鞘氨醇类碱之含量，提高参与其合成之酶的活性，以及降低参与其降解之酶的活性的效果。此外，本发明的用于使皮肤屏障增强或使其功能改善的组合物降低与皮肤屏障损伤密切相关的TSLP、IL‑4和IL‑13以阻断降低有助于皮肤屏障之脂质和蛋白质的恶性循环，并因此可有助于皮肤屏障功能的恢复。

Description

包含干细胞来源外排体作为有效成分的组合物在使皮肤屏障 增强和使其功能改善中的用途
技术领域
本发明涉及包含干细胞来源外排体作为活性成分的组合物在增强皮肤屏障或改善皮肤屏障功能中的用途。
此外，本发明涉及用于增强皮肤屏障或改善皮肤屏障功能的包含上述组合物的药物组合物、皮肤外用制剂和化妆品组合物。
背景技术
皮肤通常由三层构成：表皮、真皮和皮下脂肪组织。表皮从外到内分为角质层、透明层、颗粒层和基底层。角质层(stratum comeum)是表皮的最外层，是在皮肤屏障功能中发挥最重要作用的结构，并且由无核的扁平角质细胞(corneocytes)和角质层(SC)细胞间脂质构成。在角质层的角质细胞之间存在多种类型的脂质，例如鞘脂、磷脂、硫酸胆固醇、中性脂质等。存在于角质细胞之间的这些脂质发挥皮肤屏障的作用，防止皮肤水分蒸发并保护皮肤免受外部刺激物或污染物的侵害。
特别地，由角质细胞合成的细胞间脂质(例如神经酰胺、胆固醇和脂肪酸)形成的多层脂质层或多层结构发挥皮肤屏障的作用，防止皮肤水分过度丢失并保护皮肤免受外部变应原或可渗透到皮肤中的有害物质的侵害。神经酰胺是N-酰化的鞘氨醇化合物，其中脂肪酸与鞘氨醇类碱(phingoid base)(例如鞘氨醇、植物鞘氨醇或二氢鞘氨醇)酰胺结合。另外，已知角质细胞包膜由包膜蛋白(例如内披蛋白(involucrin)、兜甲蛋白(loricrin)和聚丝蛋白(filaggrin))构成，并且在神经酰胺中，羟基神经酰胺与这些蛋白质牢固地结合并增强皮肤屏障结构。因此，神经酰胺和羟基神经酰胺分别有助于形成多层脂质层的皮肤屏障和增强蛋白质皮肤屏障结构。因此，认为神经酰胺、羟基神经酰胺和/或鞘氨醇类碱的产生提高，参与其合成的酶的活性提高以及参与其降解的酶的活性降低有助于增强皮肤屏障。
同时，皮肤屏障可由于多种原因例如由多种应激或环境污染引起的皮肤应激、频繁洗脸、自然皮肤老化以及聚丝蛋白基因(FLG)的功能丧失突变而损坏。当皮肤屏障受到损伤时，化学物质和微生物可容易地渗透到皮肤中并引起皮炎、皮肤干燥等。
因此，为了在发生皮肤屏障的损伤之前先发制人地保护、增强或改善皮肤屏障，最近用于增强皮肤屏障或使皮肤保湿的组合物或功能性化妆品已引起了关注。例如，使用具有吸收水分特性的保湿剂(humectant)或防止水分蒸发的吸留保湿剂(occlusivemoisturizer)以增强皮肤屏障或改善皮肤屏障功能。一旦皮肤屏障受到损伤，即使施加保湿剂也不容易修复受损的皮肤屏障，并因此开出了类固醇药物的处方。然而，长期使用类固醇药物可导致皮肤萎缩或毛细血管扩张，并且反而可削弱皮肤屏障功能。因此，重要的是在皮肤屏障受到损伤之前保护或增强皮肤屏障或者改善皮肤屏障功能。
鉴于这些问题，已积极地进行了对基于天然物质的增强皮肤屏障或改善皮肤屏障功能的研究。在基于这些天然物质的用于增强皮肤屏障或改善皮肤屏障功能的组合物的情况下，天然提取物中活性成分的量低，并且因此需要使用大量的天然提取物来获得增强皮肤屏障或改善皮肤屏障功能的作用。在大多数情况下，在营销中已强凋了这些组合物是基于天然物质的事实，但是需要对天然物质对增强皮肤屏障或改善皮肤屏障功能的实际效力进行更多的科学研究。
同时，已提出了用于使用干细胞改善或治疗皮肤状况或疾病的方法。胚胎干细胞或胎儿组织来源干细胞具有优异的分化能力以及优异的再生和治疗能力，并且引起较少的排斥，但是由于伦理问题和潜在的肿瘤形成风险，这些干细胞在临床上不适用。作为其替代，已提出了用于使用成体干细胞改善或治疗皮肤状况或疾病的方法。然而，使用同种异体成体干细胞(不是患者的自体成体干细胞)可造成引起移植物抗宿主病的风险。当使用自体成体干细胞进行治疗时，产生了问题：必需进行培养从患者分离的成体干细胞的过程，这是复杂且昂贵的。
近年来，鉴于干细胞的上述问题，已作出尝试使用通过培养成体干细胞而获得的条件培养基来改善或治疗皮肤状况或疾病。然而，成体干细胞的条件培养基不仅包含由成体干细胞分泌的多种蛋白质、细胞因子和生长因子，而且还包含例如在细胞生长期间分泌的废物、为防止污染而添加的抗生素、动物来源血清等组分。因此，当将条件培养基用于皮肤上时，皮肤极有可能暴露于多种风险。
最近，有报道称细胞分泌组(secretome)包含调节细胞行为的多种生物活性分子。特别地，细胞分泌组包含具有细胞间信号传导功能的“外排体(exosome)”，并因此已积极地对其组分和功能进行了研究。
细胞将多种膜囊泡脱落到其细胞外环境中，并且这些释放的囊泡通常称为细胞外囊泡(Extracellular vesicle，EV)。EV也被称为细胞膜来源囊泡、核外颗粒体、脱落囊泡、微粒、外排体等，并且在一些情况下也与外排体区别使用。
外排体是尺寸为数十至数百纳米的囊泡，其由与细胞膜具有相同结构的磷脂双层膜组成。该外排体包含被称为外排体载物(cargo)的蛋白质、核酸(mRNA、miRNA等)等。已知外排体载物包括多种信号传导因子，并且这些信号传导因子对细胞类型具有特异性并且根据分泌细胞的环境而受到不同的调节。已知外排体是细胞分泌的细胞间信号传导介质，并且通过其传递的多种细胞信号调节细胞行为，包括靶细胞的活化、生长、迁移、分化、去分化、凋亡和坏死。根据外排体来源于的细胞的性质和状态，外排体包含特定的遗传物质和生物活性因子。来源于增殖干细胞的外排体调节细胞行为，例如细胞迁移、增殖和分化，并且重现参与组织再生的干细胞的特征(Nature Review Immunology 2002(2)569-579)。
然而，尽管已进行了表明使用外排体来治疗一些疾病的可能性的多种研究，但仍需要更详细的临床和非临床研究，并且特别地，需要开发可通过科学地确定外排体所作用的多种靶标而将外排体应用于多种疾病的治疗的技术。
本发明人已致力于开发新材料，其具有增强皮肤屏障或改善皮肤屏障功能的更好效果，并且在增强皮肤屏障或改善皮肤屏障功能方面比已知的常规保湿剂或类固醇药物更安全。因此，本发明人已对来源于干细胞的外排体的新用途进行了大量的研究，并且作为结果，已发现从干细胞的条件培养基分离的外排体可解决如上所述的干细胞本身或条件培养基的安全性问题，并且有效地用于增强皮肤屏障或改善皮肤屏障功能，从而完成了本发明。
同时，应理解的是，作为背景技术描述的内容仅旨在帮助理解本发明的背景，并不被认为是针对本发明的现有技术。
发明内容
技术问题
本发明的一个目的是提供包含干细胞来源外排体作为活性成分的组合物在增强皮肤屏障或改善皮肤屏障功能中的用途。
本发明的另一个目的是提供用于增强皮肤屏障或改善皮肤屏障功能的包含以上组合物的药物组合物、皮肤外用组合物和化妆品组合物。
本发明的另一个目的是提供用于除治疗目的之外通过使用以上组合物增强皮肤屏障或改善皮肤屏障功能来调节哺乳动物皮肤状况的美容方法。
本发明的另一个目的是提供用于使用以上组合物预防、抑制、减轻、改善或治疗由皮肤屏障功能受损引起的皮肤疾病的方法。
然而，如上所述的本发明目的是举例说明性的并且本发明的范围不受此限制。此外，通过以下描述、所附权利要求书和附图，本发明的其他目的和优点将更加明显。
解决方案
为了实现以上目的，本发明提供了用于增强皮肤屏障或改善皮肤屏障功能的组合物，其包含干细胞来源外排体作为活性成分。
本文中使用的术语“外排体”是指尺寸为数十至数百纳米(优选地，约30至200nm)的囊泡，其由与细胞膜具有相同结构的磷脂双层膜组成(然而，根据分离出外排体的细胞的类型、分离方法和测量方法，外排体的颗粒尺寸是可变的)(Vasiliy S.Chernyshev etal.，“Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes”，Anal Bioanal Chem，(2015)DOI 10.1007/s00216-015-8535-3)。这些外排体包含被称为外排体载物的蛋白质、核酸(mRNA、miRNA等)等。已知，外排体的载物包括广泛多种信号传导因子，并且这些信号传导因子对细胞类型具有特异性且根据分泌细胞的环境而不同地调节。已知，外排体是由细胞分泌的细胞间信号传导介质，并且通过其传递的多种细胞信号调节细胞行为，包括靶细胞的活化、生长、迁移、分化、去分化、凋亡和坏死。
同时，本文中使用的术语“外排体”旨在包括从干细胞分泌并释放到细胞外空间中且具有纳米尺寸囊泡结构和与外排体的组成类似的组成的所有囊泡(例如，外排体样囊泡)。干细胞的类型没有特别限制，但是干细胞可优选地为间充质干细胞，例如，来源于脂肪、骨髓、脐带或脐带血的干细胞，更优选脂肪来源干细胞。对脂肪来源干细胞没有特别限制，只要其不造成感染病原体的风险并且不引起免疫排斥即可，但是其优选地为人脂肪来源干细胞。
然而，作为用于本发明的外排体，当然可使用本领域中正在使用或可在将来使用的多种外排体，只要其在增强皮肤屏障或改善皮肤屏障功能方面有效并且不对人体造成不良作用即可。因此，应当注意的是，根据下述实施例的分离方法分离的外排体应理解为可用于本发明的外排体的一个实例，并且本发明不限于此。
本文中使用的表述“增强皮肤屏障或改善皮肤屏障功能”意指保护角质层的皮肤屏障、增强角质层的皮肤屏障或改善角质层的皮肤屏障功能，并且不意味着再生真皮或皮下脂肪组织或改善其功能。例如，表述“增强皮肤屏障或改善皮肤屏障功能”意指通过改善皮肤屏障指标(例如改善神经酰胺、二氢神经酰胺和/或鞘氨醇类碱的生产)、防止角质层中水分的丢失、改善皮肤角质层中水分丢失的指标(例如，经表皮失水(TEWL，
Figure BDA0002502349670000051
))、提高皮肤水合作用等，在真正意义上实现保护角质层的皮肤屏障、增强角质层的皮肤屏障和/或改善皮肤屏障功能。
本文中使用的术语“皮肤保湿”意指适当地控制从皮肤的水分丢失(水分蒸发)等，并维持体内稳态。术语“皮肤问题
Figure BDA0002502349670000052
”是指皮肤状况，其中由于外部刺激或身体变化而使皮肤变红和发痒，并且在严重的情况下，出现小肿块或丘疹。
报道了干细胞来源外排体对皱纹改善和皮肤再生的有限作用。然而，常规技术中使用外排体的皮肤再生并非旨在保护角质层的皮肤屏障、增强角质层的皮肤屏障或改善角质层的皮肤屏障功能，而是旨在通过使皮下脂肪组织再生来改善皱纹或恢复皮肤弹性。另外，已尝试使用干细胞、干细胞条件培养基等通过再生皮肤的真皮层用于使伤口愈合，并通过使皮下脂肪组织再生用于改善皮肤弹性。然而，尚不知道使用从干细胞的条件培养基分离和纯化的外排体对于如上所述的“增强皮肤屏障或改善皮肤屏障功能”是有效的。
当根据本发明的用于增强皮肤屏障或改善皮肤屏障功能的组合物用作药物组合物、皮肤外用制剂或化妆品组合物时，组合物中作为活性成分包含的干细胞来源外排体对增强皮肤屏障或改善皮肤屏障功能表现出显著作用，并且可克服干细胞本身或干细胞的条件培养基的安全问题。因此，根据本发明用于增强皮肤屏障或改善皮肤屏障功能的组合物中所包含的干细胞来源外排体通过与常规技术中已知的有限的皱纹改善和皮肤再生机制完全不同的机制表现出增强皮肤屏障或改善皮肤屏障功能的作用，并且应当理解的是，这种作用根本无法从常规技术中预测。
根据本发明一个实施方案的用于增强皮肤屏障或改善皮肤屏障功能的组合物包含干细胞来源外排体作为活性成分。
在根据本发明一个实施方案的组合物中，外排体可降低经表皮失水(TEWL)并提高皮肤水合作用。
在根据本发明一个实施方案的组合物中，外排体可提高皮肤中选自神经酰胺、二氢神经酰胺和鞘氨醇类碱中至少一种的产生。
具体地，外排体可提高皮肤中选自C16神经酰胺、C18神经酰胺、C20神经酰胺、C22神经酰胺、C24神经酰胺和C24∶1神经酰胺中至少一种的产生以及总神经酰胺的量。另外，外排体可提高皮肤中选自C16二氢神经酰胺、C18二氢神经酰胺、C22二氢神经酰胺、C24二氢神经酰胺和C24二1二氢神经酰胺中至少一种的产生以及总二氢神经酰胺的量。另外，外排体可提高皮肤中鞘氨醇-1-磷酸(S1P)或鞘氨醇中至少一种的产生。
在根据本发明一个实施方案的组合物中，外排体可提高皮肤中鞘氨醇激酶1(SPHK1)的活性，并且降低皮肤中鞘氨醇-1-磷酸(S1P)裂合酶的活性，鞘氨醇-1-磷酸(S1P)裂合酶是降解鞘氨醇类碱的鞘氨醇-1-磷酸(S1P)的酶。
在根据本发明一个实施方案的组合物中，外排体可降低皮肤中胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)、白介素-4(IL-4)和白介素-13(IL-13)的表达或产生。
根据本发明一个实施方案的组合物可以是药物组合物。例如，药物组合物可制备成可注射制剂。
根据本发明一个实施方案的组合物可以是化妆品组合物或皮肤外用制剂。例如，化妆品组合物可以是霜或化妆水。
根据本发明一个实施方案的组合物可有效地用于预防、抑制、减轻或改善由多种因素引起的受损的皮肤屏障功能。
根据本发明一个实施方案的组合物可制备成药物组合物。当将根据本发明一个实施方案的组合物制备成药物组合物时，根据本发明一个实施方案的组合物可以是用于经口或肠胃外施用的任何制剂。
根据常规方法，根据本发明一个实施方案的药物组合物可包含可药用的载体、赋形剂或稀释剂。载体、赋形剂和稀释剂包括但不限于：乳糖、右旋糖、海藻糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、金合欢胶、藻酸类、明胶、磷酸钙、碳酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯酸甲酯、羟基苯酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。为了使用，根据本发明一个实施方案的药物组合物可配制成：经口剂型(例如散剂、丸剂、片剂、胶囊剂、混悬液、乳液、糖浆剂、颗粒剂、酏剂、气雾剂等)、皮肤外用制剂、栓剂、或无菌注射溶液剂。
根据本发明一个实施方案的药物组合物的施用意指通过任何合适的方法将期望的物质引入到患者中，并且药物组合物可通过任何一般途径来施用，只要物质可到达靶组织即可。例如，根据本发明一个实施方案的药物组合物可经口或肠胃外施用。用于肠胃外施用的途径可包括经皮施用、腹膜内施用、静脉内施用、动脉内施用、淋巴内施用、肌内施用、皮下施用、皮内施用、表面施用、直肠内施用等。然而，本发明的范围不限于此，并且不排除本领域中已知的多种施用方法。此外，根据一个实施方案的药物组合物可通过可将活性成分递送到靶组织或细胞中的任何装置来施用。此外，根据本发明一个实施方案的药物组合物的有效量意指为了达到治疗疾病的效果而需要施用的量。
根据本发明药物组合物的用于肠胃外施用的制剂可以是经灭菌的水溶液剂、非水溶液剂、混悬液、乳液、冻干制剂、或栓剂。根据本发明一个实施方案的药物组合物的用于肠胃外施用的制剂还可制备成可注射制剂。根据本发明一个实施方案的可注射制剂可以是水性可注射制剂、非水性可注射制剂、水性混悬注射剂、非水性混悬注射剂、在溶解或混悬之后使用的固体可注射制剂等，但不限于此。根据本发明一个实施方案的可注射制剂根据其类型还可包含以下中的至少一种：注射用蒸馏水、植物油(例如，花生油、芝麻油、山茶油等)、甘油单酯、甘油二酯、丙二醇、樟脑、苯甲酸雌二醇、次水杨酸铋、砷酚胺钠、硫酸链霉素，并且还可任选地包含稳定剂或防腐剂。
制剂中根据一个实施方案的药物组合物的含量可根据如上所述的另外组分的种类、量、形式等适当地选择。例如，基于可注射制剂的总重量，本发明的药物组合物可以以约0.1wt％至99wt％、优选约10wt％至90wt％的量包含在内。此外，根据本发明一个实施方案的药物组合物的合适剂量可根据以下进行调整：患者的疾病的种类，疾病的严重程度，制剂的类型，配制方法，患者的年龄、性别、体重、健康状况、饮食、排泄率、施用时间和施用方案。例如，当将根据本发明一个实施方案的药物组合物施用于成人时，其可以以每天0.001mg/kg至100mg/kg的剂量施用一次至数次。
同时，当将根据本发明一个实施方案的组合物制备成皮肤外用制剂和/或化妆品组合物时，在不损害本发明效果的范围内，根据需要，其可适当地包含在化妆品产品或皮肤外用制剂中通常使用的组分，例如，保湿剂、抗氧化剂、油性组分、UV吸收剂、乳化剂、表面活性剂、增稠剂、醇、粉组分、着色剂、水性组分、水、以及多种皮肤营养素等。
此外，在不损害来源于干细胞的外排体的作用(即，增强皮肤屏障或改善皮肤屏障功能的作用等)的范围内，除来源于干细胞的外排体之外，根据本发明一个实施方案的皮肤外用制剂和/或化妆品组合物还可包含本领域中使用的用于增强皮肤屏障或改善皮肤屏障功能的试剂和/或保湿剂。例如，本发明的“外排体”可包含在以下中的至少一种中或与以下中的至少一种混合：水凝胶、透明质酸、透明质酸的盐(例如，透明质酸钠等)或透明质酸凝胶
Figure BDA00025023496700000820
。在根据本发明一个实施方案的皮肤外用制剂和/或化妆品组合物中，水凝胶的种类没有特别限制，但是水凝胶可优选地通过将胶凝聚合物分散在多元醇中来获得。胶凝聚合物可以是选自以下的至少一种：普朗尼克、纯化琼脂、琼脂糖、结冷胶、藻酸、卡拉胶、肉桂胶、黄原胶、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖、果胶、纤维素、瓜尔胶和槐豆胶，并且多元醇可以是选自以下的至少一种：乙二醇、丙二醇、1，3-丁二醇、异丁二醇、二丙二醇、山梨糖醇、木糖醇和甘油。
根据本发明一个实施方案的皮肤外用制剂和/或化妆品组合物可以以多种形式使用，例如，贴片
Figure BDA0002502349670000081
片装面膜
Figure BDA0002502349670000082
面膜巾
Figure BDA0002502349670000083
霜
Figure BDA0002502349670000084
活肤水
Figure BDA0002502349670000085
软膏
Figure BDA0002502349670000086
混悬液
Figure BDA0002502349670000087
乳液
Figure BDA0002502349670000088
糊剂
Figure BDA0002502349670000089
化妆水
Figure BDA00025023496700000810
凝胶剂
Figure BDA00025023496700000811
油剂
Figure BDA00025023496700000812
剥撕式面膜
Figure BDA00025023496700000813
喷雾剂
Figure BDA00025023496700000814
气雾剂
Figure BDA00025023496700000815
雾剂
Figure BDA00025023496700000816
粉底
Figure BDA00025023496700000817
粉
Figure BDA00025023496700000818
和油纸
Figure BDA00025023496700000819
例如，皮肤外用制剂和/或化妆品组合物可被施加至贴片、片装面膜或面膜巾的至少一个表面或浸透在贴片、片装面膜或面膜巾的至少一个表面中。
当将根据本发明一个实施方案的皮肤外用制剂制备成化妆品组合物时，其用于增强皮肤屏障、改善皮肤屏障功能和/或使皮肤保湿的目的，并且所述化妆品组合物可制备成本领域中通常制备的任何制剂。例如，其可配制成：贴片、片装面膜、面膜巾、皮肤软化剂、营养品、收敛化妆水、滋养霜、按摩霜、眼霜、清洁霜、精华、眼部精华、清洁化妆水、清洁泡沫、清洁水、防晒霜、唇膏、肥皂、洗发剂、含表面活性剂的清洁剂、浴用制剂、身体乳、身体霜、身体油、身体精华、身体清洁剂、染发剂、生发剂等，但不限于此。
根据本发明一个实施方案的皮肤外用制剂和/或化妆品组合物包含通常在皮肤外用制剂和/或化妆品产品中使用的组分。例如，皮肤外用制剂和/或化妆品组合物可包含常规的辅料和载体，例如抗氧化剂、稳定剂、增溶剂、维生素、色素和香料。此外，根据皮肤外用制剂和/或化妆品组合物的类型或预期用途，本领域技术人员可毫无困难地适当选择皮肤外用制剂和/或化妆品组合物的每种制剂中的其他组分。
本发明的另一个实施方案提供了用于除治疗目的之外通过使用用于增强皮肤屏障或改善皮肤屏障功能的组合物来增强皮肤屏障或改善皮肤屏障功能来调节哺乳动物皮肤状况的美容方法。在本发明的美容方法中，表述“调节皮肤状况”意指改善皮肤状况和/或预防性地调节皮肤状况，并且表述“改善皮肤状况”意指皮肤组织的外观和感觉发生视觉上和/或触觉上可感知的积极变化。例如，表述“改善皮肤状况”可包括改善皮肤保湿、改善皮肤光滑度、防止皮肤干燥、防止皮肤问题、减轻皮肤发红等。
根据本发明一个实施方案的美容方法包括：(a)直接将用于增强皮肤屏障或改善皮肤屏障功能的组合物施加至哺乳动物皮肤；或者(b)使贴片、片装面膜或面膜巾与所述哺乳动物皮肤接触或者附着至所述哺乳动物皮肤，所述贴片、片装面膜或面膜巾具有已向其施加的或浸透在其中的用于增强皮肤屏障或改善皮肤屏障功能的组合物；或者依次进行(a)和(b)。在步骤(a)中，用于增强皮肤屏障或改善皮肤屏障功能的组合物可以是化妆水或霜。
或者，根据本发明一个实施方案的美容方法还可包括：(c)在步骤(b)之后从哺乳动物皮肤上去除所述贴片、片装面膜或面膜巾，以及将用于增强皮肤屏障或改善皮肤屏障功能的组合物施加至所述哺乳动物皮肤。在步骤(c)中，用于增强皮肤屏障或改善皮肤屏障功能的组合物可以是化妆水或霜。
本发明的另一个实施方案提供了用于预防、抑制、减轻、改善或治疗由皮肤屏障功能受损引起的皮肤疾病的方法，所述方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的药物组合物。哺乳动物可以是人、狗、猫、啮齿动物、马、牛、猴和猪。
有利效果
根据本发明的用于增强皮肤屏障或改善皮肤屏障功能的组合物能够改善与皮肤屏障的保护、皮肤屏障的增强和/或皮肤屏障功能的改善相关的客观指标。根据本发明的组合物能够改善角质层中水分丢失的指标(例如，经表皮失水(TEWL))并提高皮肤水合作用。
另外，根据本发明的组合物表现出提高神经酰胺、二氢神经酰胺和/或鞘氨醇类碱之量，提高参与其合成的酶之活性，以及降低参与其降解的酶之活性的效果。
此外，根据本发明的组合物能够通过降低与皮肤屏障损伤密切相关的TSLP、IL-4和IL-13，并因此中断其中有助于皮肤屏障之脂质和蛋白质降低的恶性循环而恢复皮肤屏障功能。
因此，根据本发明的组合物可用作用于增强皮肤屏障或改善皮肤屏障功能的药物组合物、皮肤外用制剂和化妆品组合物。
应当理解的是，本发明的范围不限于前述效果。
附图简述
图1示出了分析根据本发明一个实施方案获得的外排体的物理特性的结果。“图1A”示出了通过可调电阻脉冲传感(tunable resistive pulse sensing，TRPS)分析获得的颗粒尺寸分布和颗粒数目。“图1B”示出了通过纳米颗粒追踪分析(nanoparticle trackinganalysis，NTA)获得的颗粒尺寸分布和颗粒数目。“图1C”示出了通过透射电子显微术(transmitted electron microscopy，TEM)分析获得的不同放大率的颗粒图像。“图1D”示出了根据本发明一个实施方案获得的外排体的蛋白质印迹分析的结果。“图1E”示出了根据本发明一个实施方案获得的外排体的标志物的分析中CD63和CD81的流式细胞术的结果。
图2示出了显示当用根据本发明一个实施方案的外排体处理人真皮成纤维细胞HS68细胞时，该外排体不具有细胞毒性的结果。
图3示出了通过实时PCR结果获得的图，其显示当用LPS和本发明的外排体处理RAW264.7细胞时，TNF-α、IL-6、IL-1β和iNOS mRNA的LPS诱导的表达降低。
图4示出了显示根据本发明一个实施方案的外排体具有降低NO形成(一种炎性反应)的作用的实验结果。在图4中，PBS表示磷酸缓冲盐水。DEX表示地塞米松；EXO表示外排体；CM表示脂肪来源干细胞的条件培养基；并且CM-EXO表示脂肪来源干细胞的外排体耗尽的条件培养基。
图5示出了显示根据本发明一个实施方案的外排体具有降低TNF-α(一种炎性细胞因子)形成的作用的实验结果。在图5中，PBS表示磷酸缓冲盐水；DEX表示地塞米松；并且每个数字表示用于处理的外排体的量(μg/mL)。
图6示出了将根据本发明一个实施方案分离的外排体的NO形成降低作用与通过常规沉淀法(PPT)分离的外排体的NO形成降低作用进行比较的实验结果。图6A示出了通过常规沉淀法分离的外排体的NTA分析的结果；图6B示出了通过根据本发明一个实施方案的方法分离的外排体的NTA分析的结果；并且图6C是比较NO形成降低作用的图。NO形成降低的程度表示为与通过作为阳性对照的地塞米松(Dex)的NO形成降低程度的相对比率(％)。
图7描绘了显示以下的图：当用根据本发明一个实施方案的外排体处理在其中已诱导皮肤屏障损伤的小鼠时，经表皮失水(TEWL)以依赖于外排体剂量的方式降低。
图8描绘了显示以下的图：当用根据本发明一个实施方案的外排体处理在其中已诱导皮肤屏障损伤的小鼠时，皮肤水合作用以依赖于外排体剂量的方式提高。
图9描绘了显示测量在其中已诱导皮肤屏障损伤的小鼠的体重的结果的图。结果显示，用地塞米松处理的组由于副作用而具有体重减轻，而用根据本发明一个实施方案的外排体处理的测试组几乎没有体重减轻。
图10a至10g是显示以下的图：当用根据本发明一个实施方案的外排体处理在其中已诱导皮肤屏障损伤的小鼠时，皮肤中神经酰胺的量提高。
图11a至11f是显示以下的图：当用根据本发明一个实施方案的外排体处理在其中已诱导皮肤屏障损伤的小鼠时，皮肤中二氢神经酰胺的量提高。
图12描绘了显示以下的图：当用根据本发明一个实施方案的外排体处理在其中已诱导皮肤屏障损伤的小鼠时，皮肤中鞘氨醇类碱的量提高。图12A示出了皮肤中鞘氨醇-1-磷酸(S1P)的量提高，并且图12B示出了皮肤中鞘氨醇的量提高。
图13描绘了显示以下的图：当用根据本发明一个实施方案的外排体处理在其中已诱导皮肤屏障损伤的小鼠时，皮肤中SPHK1的活性提高并且皮肤中S1P裂合酶的活性降低。
图14a示出了在用H&E对每组的背部皮肤组织进行染色之后获得的组织切片图像，并且图14b是将每组的耳厚度与另一组的耳厚度进行比较的图。
图15示出了在用甲苯胺蓝对每组的皮肤组织进行染色之后获得的组织切片图像。
图16是将从每组获得的小鼠脾大小与从另一组获得的小鼠脾大小进行比较的照片。
图17是显示ELISA结果的图，其显示当用根据本发明一个实施方案的外排体处理在其中已诱导皮肤屏障损伤的小鼠时，皮肤中TSLP的水平降低。
图18是显示ELISA结果的图，其显示当用根据本发明一个实施方案的外排体处理在其中已诱导皮肤屏障损伤的小鼠时，皮肤中IL-4的水平降低。
图19是显示ELISA结果的图，其显示当用根据本发明一个实施方案的外排体处理在其中已诱导皮肤屏障损伤的小鼠时，皮肤中IL-13的水平降低。
图20是说明当皮肤屏障受到损伤时，重复出现恶性循环的图，在该恶性循环中TSLP、IL-4、IL-13等提高，并且提高的Th2型细胞因子(IL-4和IL-13)使有助于皮肤屏障之脂质和蛋白质降低，从而损伤皮肤屏障。
具体实施方式
在下文中，将参照以下实施例更详细地描述本发明。然而，以下实施例仅是举例说明本发明并且不旨在限制或约束本发明的范围。本领域技术人员可从本发明的详细描述和实施例中容易地推断出的那些被解释为落入本发明的范围内。本发明中提及的参考文献通过引用并入本文。
在本说明书通篇，应理解，除非另有指明，否则当任何部分被提及“包含/包括”任何组分时，其不排除其他组分，而是还可包含/包括其他组分。
实施例
实施例1：细胞培养
RAW 264.7细胞(小鼠巨噬细胞系)购自韩国细胞系库(Korean Cell Line Bank)并进行培养。对于细胞培养，将细胞在包含10％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS；购自ThermoFisher Scientific)和1％抗生素-抗真菌剂(购自ThermoFisher Scientific)的DMEM(购自ThermoFisher Scientific)培养基中在37℃、5％CO2下进行传代培养。
将购自ATCC的人真皮成纤维细胞(HDF)HS68细胞在包含10％胎牛血清(FBS；购自ThermoFisher Scientific)和1％抗生素-抗真菌剂(购自ThermoFisher Scientific)的DMEM(购自ThermoFisher Scientific)培养基中在37℃、5％CO2下进行传代培养。
根据本发明所属技术领域中已知的细胞培养方法，在37℃、5％CO2下培养脂肪来源干细胞。接下来，将细胞用磷酸缓冲盐水(购自ThermoFisher Scientific)洗涤，并随后用无血清、无酚红的培养基替代该培养基，并将细胞培养1至10天。回收上清液(在下文中称为“条件培养基(CM)”。
为了在外排体分离过程中获得具有均一颗粒尺寸分布和高纯度的外排体，向条件培养基添加2wt％的海藻糖。在添加海藻糖之后，通过0.22μm过滤器过滤条件培养基以去除杂质，例如细胞碎片、废物、大颗粒等。立即从经过滤的条件培养基分离外排体。另外，将经过滤的条件培养基储存在冰箱(10℃或低于10℃)中，并随后用于外排体分离。此外，将经过滤的条件培养基冷冻储存在-60℃或低于-60℃的超低温冷冻箱中，解冻，并随后进行外排体分离。此后，通过TFF(Tangential Flow Filtration)从条件培养基分离外排体。
实施例2：通过TFF方法的外排体分离和纯化
为了从实施例1中经通过0.22μm过滤器过滤的条件培养基中分离外排体、对其进行浓缩和渗滤，使用了TFF法。作为用于TFF方法的过滤器，使用了筒式过滤器(也称为中空纤维过滤器；购自GE Healthcare)或盒式过滤器(购自Pall、Sartorius或MerckMillipore)。可选择具有不同截留分子量(MWCO)的TFF过滤器。使用具有所选MWCO的过滤器，将外排体分离并浓缩，并去除小于MWCO的颗粒、蛋白质、脂质、核酸、低分子量化合物等。
为了分离和浓缩外排体，使用MWCO为100,000Da(道尔顿)、300,000Da或500,000Da的TFF过滤器。通过TFF方法通过去除小于MWCO的物质并将条件培养基浓缩至约1/100至1/25的体积从条件培养基分离外排体。
对分离并浓缩的外排体溶液另外进行渗滤。渗滤使用体积为分离的外排体的至少4倍、优选至少6至10倍、更优选至少12倍的缓冲液连续地(连续渗滤)或不连续地(不连续渗滤)进行。为了获得具有均一颗粒尺寸分布和高纯度的外排体，向缓冲液添加在PBS中的2wt％海藻糖。
实施例3：分离的外排体的特征分析
分离的外排体的颗粒尺寸和浓度通过纳米颗粒追踪分析(NTA)(购自Malvern)或可调电阻脉冲传感(TRPS)(购自Izon Science)进行测量。分离的外排体的均一性和尺寸使用透射电子显微术(TEM)进行分析。根据本发明一个实施方案的分离的外排体的TRPS、NTA和TEM分析的结果示于图1A至1C中。
图1D示出了通过根据本发明一个实施方案的分离方法分离的外排体的蛋白质印迹分析的结果。如其中所示，确定了CD9、CD63、CD81和TSG101标志物的存在。作为针对每种标志物的抗体，分别使用抗CD9(购自Abcam)、抗CD63(购自System Biosciences)、抗CD81(购自System Biosciences)和抗TSG101(购自Abcam)。
图1E示出了通过根据本发明一个实施方案的分离方法分离的外排体的流式细胞术的结果。如其中所示，确定了CD63和CD81标志物的存在。为了分离CD63阳性外排体，根据制造商的说明书使用外排体-人CD63分离/检测试剂盒(购自ThermoFisher Scientific)。用PE-小鼠抗人CD63(购自BD)或PE-小鼠抗人CD81(购自BD)对标志物进行染色，并随后使用流式细胞仪(ACEA Biosciences)进行分析。
同时，应理解的是，本发明中使用的干细胞来源外排体不限于如上所述实施例的外排体，可使用本领域中正在使用或可在将来使用的来源于多种干细胞的外排体。另外，应当注意的是，根据以上实施例分离的干细胞来源外排体应理解为可用于本发明的干细胞来源外排体的一个实例，并且本发明的范围不限于此。
实施例4：外排体处理之后细胞毒性的测量
为了评价通过根据本发明一个实施方案的分离方法分离的外排体在人真皮成纤维细胞HS68细胞中的细胞毒性，将细胞用多种浓度的外排体处理，并检测细胞的增殖速率。将HS68细胞悬浮于含10％FBS的DMEM中，随后接种，产生80％至90％汇合，并在37℃、5％CO2下在培养箱中培养24小时。在24小时之后，去除培养基，并用实施例2中制备的多种浓度的外排体对细胞进行处理。然后，在细胞培养24至72小时时评价细胞的生存力。细胞生存力使用WST-1试剂(购自Takara)、MTT试剂(购自Sigma)、CellTiter-Glo试剂(购自Promega)或alamarBlue试剂(购自ThermoFisher Scientific)用微板阅读仪(购自MolecularDevices)进行测量。
使用未用外排体处理的在常规细胞培养基中培养的细胞作为对照。确定了本发明的外排体在该测试中使用的浓度范围内没有表现出细胞毒性(图2)。
实施例5：使用巨噬细胞
Figure BDA0002502349670000151
细胞系的炎性应答测量
将RAW 264.7细胞悬浮于含10％FBS的DMEM培养基中，并接种到多孔板的每个孔中，产生80％至90％汇合。第二天，将细胞用经在含有LPS的新鲜无血清培养基中稀释的合适浓度的本发明外排体(在实施例2中制备的外排体)进行处理，并与之一起培养1至24小时。培养完成之后，收集培养上清液，并测量培养基中存在的NO和炎性细胞因子以检查炎性应答。使用NO检测试剂盒(购自Intronbio或Promega)测量培养基中的炎性应答。使用ELISA试剂盒(购自R&D system)根据制造商的说明书测量用LPS单独处理的组和用LPS与本发明外排体一起处理的组中炎性细胞因子TNF-α的量。作为阳性对照，用地塞米松(购自Sigma)对细胞进行处理。另外，由从如上所述处理的RAW 264.7细胞获得的总RNA制备cDNA，并使用实时PCR方法测量iNOS、TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA表达水平的变化。使用GAPDH基因作为用于使以上基因归一化的参照基因。在实时PCR中使用的引物的序列示于下表1中。
表1：
在实时PCR中使用的引物的核苷酸序列
Figure BDA0002502349670000161
首先，如图3中所示，当用本发明外排体与LPS一起处理小鼠巨噬细胞RAW 264.7细胞时，LPS诱导的炎性细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA表达水平降低，并且iNOS(产生NO的酶)的mRNA表达水平降低。接下来，如图4中所示，确认了当在LPS存在下用本发明外排体处理小鼠巨噬细胞RAW 264.7细胞时，NO产生、LPS诱导的炎性应答以浓度依赖性方式降低。另外，如图5中所示，确认了当在LPS存在下用本发明外排体处理小鼠巨噬细胞RAW 264.7细胞时，LPS诱导的炎性细胞因子TNF-α的产生降低。
这些结果表明，本发明的外排体可预防、抑制、减轻或修复由炎性应答引起的受损的皮肤屏障功能。因此，认为根据本发明的用于增强皮肤屏障或改善皮肤屏障功能的组合物可用于保护皮肤屏障、增强皮肤屏障或改善皮肤屏障功能。
实施例6：分离方法之间NO形成降低作用的比较
为了在分离方法之间比较外排体的NO形成降低作用，除了通过根据本发明一个实施方案的TFF分离和纯化获得的外排体之外，还制备了通过常规沉淀法分离的外排体。沉淀法根据制造商(System Biosciences)的方案进行。确认了与通过本发明一个实施方案的TFF方法分离和纯化的外排体(参见图6B)相比，通过常规沉淀法分离的外排体(参见图6A)具有较低的颗粒尺寸分布均一性和多种颗粒尺寸。此外，如图6C中所示，确认了通过本发明一个实施方案的TFF方法分离和纯化的外排体比通过常规沉淀法获得的外排体以明显更高的水平抑制NO形成。这些结果表明，在颗粒尺寸分布均一性和对NO形成的抑制方面，根据本发明一个实施方案分离和纯化的外排体优于根据常规方法分离的外排体。
因此，认为，与根据常规分离方法获得的外排体相比，根据本发明一个实施方案的分离方法获得的外排体具有优异的性能或功能活性(例如，颗粒尺寸分布均一性、对NO产生的抑制、炎性应答的降低等)，并且在预防、抑制、减轻或修复由炎性应答引起的受损的皮肤屏障功能的效果方面，包含如上所述具有优异功能活性的干细胞来源外排体作为活性成分的根据本发明的用于增强皮肤屏障或改善皮肤屏障功能的组合物比常规技术要优异得多。
实施例7：具有皮肤屏障损伤的动物模型
为了建立用于确定增强皮肤屏障或改善皮肤屏障功能的动物模型，使用了
Figure BDA0002502349670000171
唑酮。当将
Figure BDA0002502349670000172
唑酮施加至皮肤时，其可引起皮肤屏障功能的损伤，导致角质层的经表皮失水(TEWL)提高和水合作用降低、作为皮肤屏障的结构蛋白的兜甲蛋白、内披蛋白和聚丝蛋白的表达降低，以及角质层pH提高，由此提供其中皮肤屏障功能受到损伤的动物模型(参见Journal of Investigative Dermatology(2008)128(1)，79-86)。
购买雌性SKH-1小鼠(5周龄；购自Central Laboratory Animal Inc.)，使其适应7天，并随后用于该实验。在适应的小鼠中诱导皮肤屏障损伤之后，将小鼠分成如下六组。
(1)正常：正常对照组(在图7中用“N”表示)；
(2)对照(皮肤屏障损伤诱导组)：阴性对照组，其中皮肤屏障损伤已由
Figure BDA0002502349670000181
唑酮诱导(在图7中由“C”表示)；
(3)外排体低剂量：测试组，其中在由
Figure BDA0002502349670000182
唑酮诱导皮肤屏障损伤之后，以1μg/头的剂量皮下(SC)注射在实施例2中制备的外排体，一周3次，持续4周(在图7中由“L”表示)；
(4)外排体中等剂量：测试组，其中在由
Figure BDA0002502349670000183
唑酮诱导皮肤屏障损伤之后，以3μg/头的剂量皮下(SC)注射在实施例2中制备的外排体，一周3次，持续4周(在图7中由“M”表示)；
(5)外排体高剂量：测试组，其中在由
Figure BDA0002502349670000184
唑酮诱导皮肤屏障损伤之后，以10μg/头的剂量皮下(SC)注射在实施例2中制备的外排体，一周3次，持续4周(在图7中由“H”表示)；以及
(6)地塞米松：测试组(阳性对照组)，其中在由
Figure BDA0002502349670000185
唑酮诱导皮肤屏障损伤之后，以100μg/头的剂量皮下(SC)注射溶解在乙醇中的0.03％地塞米松(购自Sigma)，一周3次，持续4周(在图7中由“D”表示)。
通过将200μL的2％
Figure BDA0002502349670000186
唑酮(购自Sigma)施加至小鼠背部皮肤使测试组(2)至(6)中每一个中的小鼠致敏。在致敏之后，对小鼠进行皮肤屏障恢复，持续5至7天，并随后通过以下诱导皮肤屏障损伤：在测试组(2)至(6)中的每一个中，每隔一天向小鼠背部皮肤施加100μL的0.025％至0.05％
Figure BDA0002502349670000187
唑酮，持续约15天。此外，为了维持皮肤屏障损伤，在外排体处理期期间，在测试组(2)至(6)中每一个中每隔一天向小鼠背部皮肤施加100μL的0.025％至0.05％
Figure BDA0002502349670000188
唑酮。
在用本发明的外排体处理之前和之后，使用TEWL测量系统测量从皮肤的平均水分蒸发，并使用水合作用测量装置(Corneometer CM825；Courage-Khazaka ElectronicGmbH，Germany)测量皮肤的水合作用。每个测试组测量的小鼠数量为12(n＝12)。
作为结果，确定了在用根据本发明一个实施方案的外排体处理的测试组(3)至(5)中的TEWL(经表皮失水)(即，从角质层的水分蒸发)，与疾病对照组(皮肤屏障损伤诱导组)中的相比以依赖于外排体剂量的方式降低(图7)。另外，确定了在用根据本发明一个实施方案的外排体处理的测试组(3)至(5)中的皮肤水合作用，与疾病对照组中的相比以依赖于外排体剂量的方式提高(图8)。因此，包含根据本发明一个实施方案的外排体作为活性成分的组合物能够保护和增强皮肤屏障以降低从角质层的水分蒸发并提高皮肤水合作用。
同时，每个测试组(n＝12)的体重测量结果表明，在用地塞米松处理的测试组(6)中，由于副作用而存在体重减轻，但是在用根据本发明一个实施方案的外排体处理的测试组(3)至(5)中，与正常对照组相比，体重基本上没有降低(图9)。即，通常用于恢复或减轻皮肤屏障损伤的地塞米松显示出副作用例如体重减轻，而包含根据本发明一个实施方案的外排体作为活性成分的组合物具有以下优势：其可在保护和增强皮肤屏障的同时降低副作用例如体重减轻。
实施例8：皮肤屏障指标得到改善的确定
对实施例7的小鼠实施安乐死并收集其皮肤样品。然后，对于每个测试组，测量了神经酰胺、二氢神经酰胺、鞘氨醇和鞘氨醇-1-磷酸(S1P)的量，鞘氨醇激酶1(SPHK1)的活性，以及作为降解鞘氨醇-1-磷酸(S1P)的酶的S1P裂合酶的活性。对于每个测试组，测量中使用的小鼠数目为8只(n＝8)。
如下使用LC-MS/MS(API 3200Triple quadruple mass，AB/SCIEX)对神经酰胺(具有不同碳长度)、总神经酰胺、鞘氨醇和鞘氨醇-1-磷酸(S1P)的量进行分析。根据本领域中已知的文献(J Invest Dermatol.2010Oct，130(10)：2472-80)提取总脂质。将神经酰胺、鞘氨醇和鞘氨醇-1-磷酸用OPA(邻苯二甲醛)试剂进行衍生，并使用配备有荧光检测器的LC-MS/MS系统对其进行定量分析(J Invest Dermatol.2010Oct，130(10)：2472-80；ArchPharm Res.2009Dec，32(12)：1795-801；Proc Natl Acad Sci USA.2016Mar 8，113(10)：E1334-E1342)。鞘脂的量表示为“pmol/g蛋白质”，并且蛋白质的量化根据常规BCA方法进行。
如图10a至10g中所示，确定了用根据本发明一个实施方案的外排体处理的测试组(3)至(5)的皮肤组织中的C16神经酰胺、C18神经酰胺、C20神经酰胺、C22神经酰胺、C24神经酰胺或C24∶1神经酰胺的量以及总神经酰胺的量与疾病对照组中的那些相比提高了。另外，如图11a至11f中所示，确定了用根据本发明一个实施方案的外排体处理的测试组(3)至(5)的皮肤组织中的C16二氢神经酰胺、C18二氢神经酰胺、C22二氢神经酰胺、C24二氢神经酰胺或C24∶1二氢神经酰胺的量以及总二氢神经酰胺的量与疾病对照组中的那些相比提高了。此外，如图12A和12B中所示，确定了用根据本发明一个实施方案的外排体处理的测试组(3)至(5)的皮肤组织中的鞘氨醇-1-磷酸(S1P)和鞘氨醇的量与疾病对照组中的那些相比也提高了。
同时，如下使用LC-MS/MS对鞘氨醇激酶1(SPHK1)的活性进行分析。将包含5mMEDTA、5mM EGTA、3mM β-巯基乙醇、5％甘油、蛋白酶抑制剂(Sigma-Aldrich)和磷酸酶抑制剂(Roche)的20mM Tris缓冲液(pH 7-4)中的皮肤组织裂解物与10μL的200μM C17-鞘氨醇(SPHK1底物)(Avanti Polar Lipids)一起孵育。为了评价SPHK1的活性，向测定缓冲液添加0.5％Triton X-100，并在37℃下孵育30分钟。通过添加CHCl3：MeOH：HCl(8∶4∶3，v/v/v)使酶促反应终止。添加1-磷酸C17-二氢鞘氨醇(100pmol；Avanti Polar Lipids)作为内标物。将通过添加CHCl3分离的有机相在真空下干燥，并将干燥的产物重新溶解在甲醇中，并随后通过LC-ESI-MS/MS(API 3200Triple quadruple mass，AB/SCIEX)进行分析。SPHK1的活性表示为“C17-S1P pmol/mg蛋白质/分钟”，并且蛋白质的量化根据常规BCA方法进行。
另外，如下使用LC-MS/MS对S1P裂合酶的活性进行分析。将皮肤组织的裂解物与10nmol的S1P(Avanti Polar Lipids)一起孵育20分钟。添加100pmol的(2E)-d5-十六烯醛(Avanti Polar Lipids)作为内标物，并通过脂质提取使反应终止。将总脂质提取物在40℃下用包含5％甲酸的甲醇中的5-mM盐酸氨基脲(Avanti Polar Lipids)进行衍生化2小时，并通过LC-ESI-MS/MS进行分析。S1P裂合酶的活性表示为“十五烯醛
Figure BDA0002502349670000201
pmol/mg蛋白质/分钟”，并且蛋白质的量化根据常规BCA方法进行。
如图13中所示，确定了在用根据本发明一个实施方案的外排体处理的测试组(3)至(5)的皮肤组织中，与疾病对照组中的那些相比，SPHK1的活性提高(28.79％提高)，并且S1P裂合酶的活性降低。由于SPHK1是参与构成皮肤屏障的鞘脂的合成的酶，因此其活性的提高意味着神经酰胺的合成提高并因此增强了皮肤屏障。另外，由于S1P裂合酶是通过使鞘氨醇-1-磷酸降解而干扰鞘脂的合成的酶，因此其活性的降低意味着神经酰胺合成的干扰的降低并因此增强了皮肤屏障。
从上述结果可看出，包含根据本发明一个实施方案的外排体作为活性成分的组合物改善了与皮肤屏障的保护、皮肤屏障的增强和/或皮肤屏障功能的改善相关的客观指标，并显示出例如神经酰胺、二氢神经酰胺和鞘氨醇类碱的产生提高，涉及其合成的酶的活性提高以及涉及其降解的酶的活性降低。因此，包含根据本发明一个实施方案的外排体作为活性成分的组合物可用作用于增强皮肤屏障或改善皮肤屏障功能的药物组合物、皮肤外用制剂和化妆品组合物。
实施例9：动物模型的耳厚度和脾大小的比较
使用卡尺测量实施例7的小鼠的耳厚度，并且对小鼠实施安乐死。然后，对于每个测试组，通过本领域中已知的H&E染色方法对背部皮肤组织进行染色。每个测试组的小鼠数目为8只(n＝8)。
图14a示出了用H&E对小鼠的皮肤组织进行染色之后获得的切片的图像。图14b描绘了显示在测试组(2)至(6)中的每个中测量的耳厚度与在正常组(1)中测量的耳厚度进行比较的曲线图。确定了用根据本发明一个实施方案的外排体处理的测试组(3)至(5)中的每一个的耳厚度与疾病对照组中的相比以依赖于外排体剂量的方式降低。
同时，用甲苯胺蓝对安乐死小鼠的皮肤组织进行染色，并随后测量肥大细胞(一种炎性细胞)的浸润。图15示出了用甲苯胺蓝对小鼠的皮肤组织进行染色之后获得的切片的图像，并且如其中所示，用根据本发明一个实施方案的外排体处理的测试组(5)(用高剂量外排体处理的组)中肥大细胞的浸润显著降低。然而，在用地塞米松处理的阳性对照组中，肥大细胞的浸润没有降低。
结果表明，根据本发明一个实施方案的外排体能够抑制或防止由炎性应答和肥大细胞的浸润引起的表皮厚度的提高。
另外，确定了用根据本发明一个实施方案的外排体处理的测试组(3)至(5)中的每一个的脾大小与疾病对照组中的相比以依赖于外排体剂量的方式降低(图16)。这表明根据本发明一个实施方案的外排体抑制或防止与炎性应答或免疫应答密切相关的脾大小的提高。
测试结果表明，包含根据本发明一个实施方案的外排体的组合物能够预防、抑制、减轻或修复炎性应答或由炎性应答引起的受损的皮肤屏障功能。因此，根据本发明的用于增强皮肤屏障或改善皮肤屏障功能的组合物可用于保护皮肤屏障、增强皮肤屏障或改善皮肤屏障功能。
实施例10：与皮肤屏障损伤密切相关的细胞因子的降低
对实施例7的小鼠实施安乐死并收集其皮肤样品。然后，对于每个测试组，通过ELISA测量皮肤组织中的胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)、IL-4、IL-13等的水平。对于每个测试组，测量中使用的小鼠数目为8只(n＝8)。将每个皮肤组织样品置于冰上的5mL RIPA缓冲液(包含1×蛋白酶抑制剂)中并切碎，并随后在4℃下以2,000rpm离心5分钟以去除杂质。使用BCA试剂盒对蛋白质进行量化，并用包含蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液将蛋白质浓度调整至100μg/mL。然后，将100μL(10μg的蛋白)用于ELISA测定。使用TSLP ELISA试剂盒，IL-4ELISA试剂盒和IL-13ELISA试剂盒(购自ThermoFisher)进行实验，并在450nm处测量吸光度以量化组织中的TSLP、IL-4和IL-13水平。
同时，当皮肤屏障受到损伤时，促进了TSLP从角质形成细胞和肥大细胞的分泌，并且分泌的TSLP与抗原呈递细胞(例如，树突细胞、朗格汉斯细胞等)的成熟有关。成熟的抗原呈递细胞活化Th细胞，并且活化的Th细胞提高Th2型细胞因子，例如IL-4、IL-13等。在这种情况下，重复出现恶性循环，其中IL-4和IL-13通过降低有助于皮肤屏障的脂质(例如，神经酰胺)和蛋白质(例如，聚丝蛋白、内披蛋白和兜甲蛋白)进一步损伤皮肤屏障(参见图20)。因此，认为，如果可能参与皮肤屏障功能的恢复的候选物质降低了TSLP、IL-4和/或IL-13的表达和/或产生，则其可中断前述恶性循环，并因此有助于恢复皮肤屏障功能和增强皮肤屏障。
如图17至19中所示，确定了用根据本发明一个实施方案的外排体处理的测试组(3)至(5)的皮肤组织中的TSLP、IL-4和IL-13的水平与疾病对照组中的那些相比显著降低。即，认为，根据本发明一个实施方案的外排体显著降低皮肤组织中TSLP的水平，并因此抑制抗原呈递细胞的成熟，从而抑制Th2活化。另外，认为，通过用根据本发明一个实施方案的外排体处理的Th2活化抑制以及由此导致的IL-4和IL-13的Th2细胞因子降低，可通过中断其中有助于皮肤屏障之脂质和蛋白质降低的恶性循环而恢复皮肤屏障功能。
实施例11：包含本发明外排体的化妆品组合物的制备
(化妆水的制备)
将1704μg/mL的在以上实施例2中制备的未经稀释的外排体稀释，与下表2中所示的组分混合并悬浮在其中，从而制备化妆品组合物(化妆水)。制备最终的化妆品组合物以包含浓度为2×104个颗粒/mL的外排体。每种组分的含量示于下表2中。
表2：
化妆水的组分及其含量
Figure BDA0002502349670000231
Figure BDA0002502349670000241
(霜的制备)
将1704μg/mL的在以上实施例2中制备的未经稀释的外排体稀释，与下表3中所示的组分混合并悬浮在其中，从而制备化妆品组合物(霜)。制备最终的化妆品组合物以包含浓度为2×104个颗粒/mL的外排体。每种组分的含量示于下表3中。
表3：
霜的组分及其含量
Figure BDA0002502349670000242
Figure BDA0002502349670000251
(片装面膜的制备)
将1704μg/mL的在以上实施例2中制备的未经稀释的外排体稀释，与下表4中所示的组分混合并悬浮在其中。然后，将获得的化妆品组合物施加至片装面膜或浸透在片装面膜中。将外排体以4×103个颗粒/mL的浓度施加至片装面膜或浸透在片装面膜中。每种组分的含量示于下表4中。
表4：片装面膜的组分及其含量
Figure BDA0002502349670000261
Figure BDA0002502349670000271
尽管已参照一些实施方案描述了本发明，但是本发明的范围不限于这些实施方案。本领域的任何技术人员将理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可进行多种修改和改变，并且这些修改和改变也落入本发明的范围内。
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TNF-α正向引物
<400> 1
tctcatcagt tctatggccc agac 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TNF-α反向引物
<400> 2
ggcaccacta gttggttgtc tttg 24
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> iNOS正向引物
<400> 3
gctaccacat tgaagaagct ggtg 24
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> iNOS反向引物
<400> 4
ccataggaaa agactgcacc gaag 24
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAPDH正向引物
<400> 5
gacatcaaga aggtggtgaa gcag 24
<210> 6
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 6
ccctgttgct gtagccgtat tcat 24
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-6正向引物
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gccagagtcc ttcagagaga taca 24
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<211> 24
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<213> 人工序列
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attggatggt cttggtcctt agcc 24
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<400> 9
gcaacgacaa aatacctgtg gcct 24
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-1β反向引物
<400> 10
agttggggaa ctctgcagac tcaa 24

Claims (20)

1.用于增强皮肤屏障或改善皮肤屏障功能的组合物，所述组合物包含来源于干细胞的外排体作为活性成分。
2.权利要求1所述的组合物，其中所述组合物降低经表皮失水(TEWL)并提高皮肤水合作用。
3.权利要求1所述的组合物，其中所述组合物提高皮肤中选自神经酰胺、二氢神经酰胺和鞘氨醇类碱中至少一种的产生。
4.权利要求3所述的组合物，其中所述组合物提高皮肤中选自C16神经酰胺、C18神经酰胺、C20神经酰胺、C22神经酰胺、C24神经酰胺和C24∶1神经酰胺中至少一种的产生以及总神经酰胺的量。
5.权利要求3所述的组合物，其中所述组合物提高皮肤中选自C16二氢神经酰胺、C18二氢神经酰胺、C22二氢神经酰胺、C24二氢神经酰胺和C24∶1二氢神经酰胺中至少一种的产生以及总二氢神经酰胺的量。
6.权利要求3所述的组合物，其中所述组合物提高皮肤中鞘氨醇-1-磷酸(S1P)或鞘氨醇中至少一种的产生。
7.权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述组合物提高皮肤中鞘氨醇激酶1(SPHK1)的活性，并且降低皮肤中鞘氨醇-1-磷酸(S1P)裂合酶的活性。
8.权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述组合物降低皮肤中胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)、IL-4和IL-13的产生或表达。
9.权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述组合物是药物组合物。
10.权利要求9所述的组合物，其中所述药物组合物制备成可注射制剂。
11.权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述组合物以选自以下的至少一种形式使用：贴片、片装面膜、面膜巾、霜、活肤水、软膏、混悬液、乳液、糊剂、化妆水、凝胶剂、油剂、剥撕式面膜、喷雾剂、气雾剂、雾剂、粉底、粉和油纸。
12.权利要求11所述的组合物，其中所述组合物被施加至所述贴片、片装面膜或面膜巾的至少一个表面或者浸透在所述贴片、片装面膜或面膜巾的至少一个表面中。
13.权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述组合物是皮肤外用制剂或化妆品组合物。
14.权利要求13所述的组合物，其中所述化妆品组合物是霜或化妆水。
15.用于除治疗目的之外通过增强皮肤屏障或改善皮肤屏障功能来调节哺乳动物皮肤状况的美容方法，所述美容方法包括：(a)直接将权利要求1至6中任一项中限定的组合物施加至哺乳动物皮肤；或者(b)使贴片、片装面膜或面膜巾与哺乳动物皮肤接触或者附着至哺乳动物皮肤，所述贴片、片装面膜或面膜巾具有已向其施加的或浸透在其中的所述组合物；或者依次进行(a)和(b)。
16.权利要求15所述的美容方法，其中在步骤(a)中，所述组合物是化妆水或霜。
17.权利要求15所述的美容方法，其还包括：(c)在步骤(b)之后从哺乳动物皮肤上去除所述贴片、片装面膜或面膜巾，以及将所述组合物施加至哺乳动物皮肤。
18.权利要求17所述的美容方法，其中在步骤(c)中，所述组合物是化妆水或霜。
19.用于预防、抑制、减轻、改善或治疗由皮肤屏障功能受损引起的皮肤疾病的方法，所述方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的权利要求1至6中任一项限定的组合物。
20.权利要求19所述的方法，其中所述哺乳动物是选自以下的至少一种：人、狗、猫、啮齿动物、马、牛、猴和猪。
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