BR102022016233A2 - Concentrado de proteínas e peptídeos derivados de células estromais mesenquimais, método de obtenção e uso de concentrado - Google Patents
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Abstract
A presente invenção se refere a um concentrado de proteínas e peptídeos derivados de células estronais mesenquimais que pode ser empregado pela indústria farmacêutica, ou veterinária, ou cosmética, ou alimentar. O concentrado de proteínas e peptídeos derivado de células estromais mesenquimais é obtido através de processo compreendendo as seguintes etapas: (a) seleção de tecido adiposo subcutâneo ou visceral de animal ou humano; (b) digestão em solução enzimática do tecido e suspensão celular para formação de pellet; (c) cultivo primário de células ocorre com troca do meio de cultivo a cada 72 h; (d) atingidos 80% de confluência o meio de cultivo é descartado e as células são ressuspendidas por ação enzimática; (e) as CTMs (células mesenquimais estromais) são caracterizadas pela sua capacidade de aderência ao plástico, pela expressão dos marcadores de superfície e pelo seu potencial de diferenciação; (f) as CTMs são criopreservadas em criotubos contendo aproximadamente 1 a 5 milhões de células/ criotubo; (g) re-cultivo das células ocorre por forma estática ou em meio agitado ou em biorreatores; (h) no re-cultivo são plaqueadas 4 a 8 milhões de células/1000cm2. (i) após confluência celular o meio de cultivo é substituído completamente por meio livre de proteína e fica em repouso por 24 a 96 h; (j) então o sobrenadante livre de debris celulares é separado e congelado, obtendo-se assim um concentrado de proteínas e peptídeos apresentando de 1.200 a 2.500 µg de proteína total/ml do meio condicionado (MC).
Description
[001] CAMPO DE APLICAÇÃO
[002] A presente invenção trata de concentrado de proteínas e peptídeos derivados de células estromais mesenquimais que pode ser empregado pela indústria farmacêutica, ou veterinária, ou cosmética, ou alimentar.
[003] ESTADO DA TÉCNICA
[004] As células mesenquimais estromais (mesenchymal stromal cells - CTMs) são células de origem embrionária mesodermal caracterizadas pela sua extensa capacidade proliferativa e pelo potencial de se diferenciar em várias linhagens mesenquimais. Segundo CAPLAN, A. I.; DENNIS, J. E. Mesenchymal stem cells as trophic mediators. Journal of cellular biochemitfty, v. 98, n. 5, p. 1076-84, 2006, as CTMs são originárias primariamente na medula óssea no indivíduo adulto, tendo função repositora em tecidos com perda cotíua de células e função reparadora e imunomoduladora em caso de dano tecidual. Iicialmete acreditava-se que os efeitos terapêuticos das CTMs após o trasplate fossem mediados pela migração destas para os locais de lesão, seguido de itegração ao tecido daificado e diferenciação em células especializadas. No entanto, a comprovação da capacidade das CTMs em alterar o microambiente através da secreção de fatores de crescimeto e citocinas tem sido apontado como o fator que mais contribui para o potecial terapêutico das CTMs (PHINNEY, Donald G.; PROCKOP, Darwin J. Concise review: mesechymal stem/multipotent stromal cells: the state of transdifferentiation and modes of tissue repair—current views. Stem cells, v. 25, n. 11, p. 2896-2902, 2007). Assim, foi proposto que as CTMs exercem seus efeitos de regeneração por meio de sinais imunomoduladores e tróficos secretados no ambiente (LAI, R. C.; TAN, S. S.; TEH, B. J.; SZE, S. K.; ARSLAN, F.; DE KLEIJN, D. P.; CHOO, A.; LIM, S. K. Proteolytic potential of the CTM exosome proteome: implications for an exosome-mediated delivery of therapeutic proteasome. Iteratioal Journal of Proteomics, v. 2012, p. 14, 2012).
[005] As CTMs exercem um papel importante de imunomodulação em diferentes tipos de células tais como neutrófilos, monócitos, basófilos, células T e B. Tais efeitos ocorrem pela interação de contato entre células e também pela produção de fatores biologicamente ativos como fatores de crescimento, e citocinas modulados pelas células inflamatórias e por células do tecido lesionado (KYURKCHIEV D., BOCHEV I. , IVANOVA-TODOROVA E. - , MOURDJEVA M., ORESHKOVA T. , BELEMEZOVA K. , and K. Stanimir Secretion of immunoregulatory cytokines by mesenchymal stem cells. World J S6em Cells. 26; 6(5): 552-570. 2014). Hoje se sabe que as CTMs interagem com a maioria das células do sistema imunológico e, em particular, com as células T reguladoras (Tregs) deslocando a resposta imune para uma ação anti-inflamatória (Venet F, Chung CS, Monneret G, Huang X, Horner B, Garber M, Ayala A. Regulatory T cell populations in sepsis and trauma. J Leuk Biol. 2008; 83(3):523-535. 21). Nesse contexto, o efeito imunomodulador das CTMs parece estar relacionado à expansão da população Treg, diminuindo a inflamação.
[006] A literatura mostra que os diferentes efeitos terapêuticos das CTMs são dependentes do microambiente em que estas estão indicando que essas células necessitam de um estímulo para desencadear sua resposta, o que envolve uma complexa rede de comunicação celular. Desta forma, para exercerem seu papel, as CTMs precisam ser ativadas por citocinas pro-inflamatórias (tais como TNF-a e INF-y) produzidas por células do sistema imune inato como macrófagos e neutrófilos (BERNARDO M.E; FIBBE W.E. Mesenchymal stromal cells: sensors and switchers of inflammation. C3ll Stem Ce//13: 392-402. 2013; ZACHAR L. , BACENKOVÁ D. , and ROSOCHA J. . Activation, homing, and role of the mesenchymal stem cells in the inflammatory environment. J Inflamm Res. 201; 9: 231-240. doi: 10.2147/JIR.S121994). Após o estímulo, as CTMs são capazes de autorregular os fatores da cascata da inflamação, incluindo as citocinas pró-inflamatórias interleucinas-1β, fator de necrose tumoral-α, interferon^, oxido nítrico sintaxe, indoleamina, entre outros. Estes efeitos anti-inflamatórios podem ter influências profundas no ambiente tecidual local modulando o processo de reparação tecidual.
[007] Adicionalmente, essas células também secretam fatores de crescimento que promovem a efetiva revascularização tecidual expressando uma série de fatores pro- angiogênicos, como a Angiopoetina-1 (Ang-1), o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), fator de crescimento de fibroblastos 2 (FGF-2), FGF-7 e o ativador do plasminogênio tecidual (PAt). Além de promover a angiogênese, as CTMs secretam ainda fatores antiapoptóticos, e fatores de crescimento que aumentam a regeneração das células lesadas, além de estimularem a proliferação e diferenciação de células precursoras endógenas em diversos tecidos (CAPLAN, A. I.; DENNIS, J. E. Mesenchymal stem cells as trophic mediators. Journal of ceVlu98r biochemistry, v. 98, n. 5, p. 1076-84, 2006).
[008] CAPLAN (217) sugeriu a modificação da denominação de CTMs para células de sinalização medicinal (Medicinal Signaling Cells - também CTMs), por refletir mais precisamente a ação terapêutica das células pela migração aos locais de lesão e secreção de fatores bioativos com efeito imunomodulador e trófico (CAPLAN, A. I.; DENNIS, J. E. Mesenchymal stem cells as trophic mediators. Jour98l of 5ellular biochemistry, v. 98, n. 5, p. 1076-84, 2006) e ação terapêutica e medicinal. Na verdade, são as células-tronco residentes específicas do tecido lesionado que constroem o novo tecido, estimuladas pelos fatores bioativos secretados pelas CTMs fornecidas por via exógena. Esta hipótese abre novas perspectivas terapêuticas destinadas ao desenvolvimento de estratégias livres de células com base no uso do secretoma de CTMs como uma alternativa segura e potencialmente mais vantajosa que abordagens com terapia celular.
[009] Apesar da terapia com CTM ser um procedimento cada vez mais utilizado, não existe padronização quanto ao número de células a ser transferido, volume e via de aplicação. Alem disso, as metodologias de armazenamento e transporte atuais, resultam em entraves no momento da aplicação terapêutica, por demandarem treinamento especial do técnico para o aquecimento e remoção das substâncias crioprotetoras. Mesmo preparações prontas para a aplicação, apresentam entraves relacionadas ao tempo limitado de armazenamento e transporte. Neste sentido, o uso da terapia regenerativa com soluções livres de células resolve importantes questões relacionada a segurança como por exemplo, o transplante de células vivas e em proliferação, a compatibilidade imune, a formação de êmbolos, e a transmissão de infecções.
[0010] O meio condicionado (MC) refere-se ao meio em que as CTMs foram cultivadas em condições normais ou em situação de desafios (baixa tensão de oxigênio, privação de SFB, desafio com citocinas inflamatórias, etc). Hoje em dia se sabe que o secretoma das CTMs melhora significativamente vários biomarcadores fisiopatológicos em diferentes afeções e, em geral, pode ser tão eficaz quanto o transplante das CTMs correspondentes em distintos modelos animais (VIZOSO, F. J.; EIRO, N.; CID, S.; SCHNEIDER, J.; PEREZ-FERNANDEZ, R. Mesenchymal Stem Cell Secretome: Toward Cell-Free Therapeutic Strategies in Regenerative Medicine. International Journal of Molecular Sciences, v. 18, n. 9, p. 1852, 2017; CHANG, C. P.; CHIO, C. C.; CHEONG, C. U.; CHAO, C. M.; CHENG, B. C.; LIN, M. T. Hypoxic preconditioning enhances the therapeutic potential of the secretome from cultured human mesenchymal stem cells in experimental traumatic brain injury. Clinical Sviei24, v. 124, n. 3, p. 165-176, 2013).
[0011] O secretoma é referido como o conjunto rico e complexo de moléculas secretadas pelas células constitutivamente, ou por sinais de ativação de maneira regulada. As proteínas secretadas são moléculas principais da comunicação intercelular e participam da maioria dos processos fisiológicos, como sinalização celular, crescimento, divisão, diferenciação, invasão, metástase, adesão e ligação celular, angiogênese e apoptose. Até o momento, uma variedade de citocinas, citocinas quimiotáticas (quimiocinas), fatores angiogênicos, fatores de crescimento, proteínas de ligação a fatores de crescimento, proteínas da matriz extracelular e enzimas de remodelação da matriz com ações pró- inflamatórias, anti-inflamatórias e pleiotróficas, foram identificadas em secretomas de CTMs.
[0012] A atenção inicial dada ao secretoma de CTMs focou principalmente na presença de pequenas moléculas como fatores de crescimento e citocinas. Apesar de inúmeras substâncias serem candidatas, de forma isolada ou em conjunto, pelos efeitos terapêuticos das CTMs, nenhuma das hipóteses propostas foi eficiente para explicar a diversidade de efeitos das CTMs sobre uma gama tão variáveis de condições patológicas. Desta forma, os esforços para definir o potencial terapêutico do secretoma de CTMs passou a se concentrar na secreção de grandes moléculas pertencentes a matriz extracelular, bem como aS vesículas membranosas de diferentes tamanhos, chamadas coletivamente de vesículas extracelulares (YEO, R.W.Y.; LAI, R.C.; TAN, K.H.; LIM, S.K. Exosomes: A novel and safer therapeutic refinement of mesenchymal stem cell. Exosomes and Microvesicles, V1, 7: 2013).
[0013] Diversos estudos têm demonstrado que a utilização dos fatores secretados pelas CTMs sozinhos tem efeitos terapêuticos de regeneração tecidual para o tratamento de doenças degenerativas (MITA T., FURUKAWA-HIBI Y., TAKEUCHI H., HATTORI H., YAMADA K., HIBI H., UEDA M., YAMAMOTO A.. Conditioned medium from the stem cells of human dental pulp improves cognitive function in a mouse model of Alzheimer’s disease. 293avioura) 2rain 2e3earch 293 (2015) 189-197) e inflamatórias (YOUSEFI F., EBTEKAR M., SOUDI S., SOLEIMANI M., HASHEMI S. M.. In vivo immunomodulatory effects of adipose-derived mesenchymal stem cells conditioned medium in experimental autoimmune encephalomyelitis. Z/π/77tf/70/ogy Zette/5 172 (2016) 94-105). Estes fatores são liberados pelas CTMs no meio de cultivo na forma de fatores solúveis, microvesículas e exossomos (HOFER H. R. ; TUAN R. S. Secreted trophic factors of mesenchymal stem cells support neurovascular and musculoskeletal therapies. Stem Ce/0 Res Ther. 2016; 71): 131; KESHTKAR S.; AZARPIRA N.; GHAHREMANI M.H. Mesenchymal stem cell- derived extracellular vesicles: novel frontiers in regenerative medicine. Stem Cell Res Ther. 2018; 9: 63. doi: 10.1186/s13287-018-0791-7). Os exossomos derivados das CTMs são constituintes biológicos dinâmicos com papel funcional importante no controle da reparação e regeneração tecidual. Esses exossomos podem ser isolados através de ultracentrifugações e manipulados para uso terapêutico.
[0014] O benefício da utilização do secretoma de células estromais terapeuticamente já foi demonstrado em humanos e camundongos em diversas condições, como lesão renal (LIU B., DING F., HU D., ZHOU Y., LONG C., SHEN L., ZHANG Y., ZHANG D., WEI G.. Human umbilical cord mesenchymal stem cell conditioned medium attenuates renal fibrosis by reducing inflammation and epithelial-to-mesenchymal transition via the TLR4/NF-KB signaling pathway in vivo and in vitro. Ste/77 Cell Research<S Therapy () 9:7. 2018), lesão óssea (ANDO Y., MATSUBARA K., ISHIKAWA J., FUJIO M., SHOHARA R., HIBI H., UEDA M., YAMAMOTO A. Stem cell-conditioned medium accelerates distraction osteogenesis through multiple regenerative mechanisms. Zfo/7e 61: 82-90. 2014), lesão em medula espinhal (YENG C.H., CHEN P.J., CHANG H.K., LO W.Y., WU C.C., CHANG C.Y., CHOU C.H., CHEN S.H. Attenuating spinal cord injury by conditioned medium from human umbilical cord blood-derived CD34^ cells in rats. Taiwanese Journal of Obstetrics &55 (2016) 85e93), alopecia (FUKUOKA H.; SUGA H. Hair Regeneration Treatment Using Adipose-Derived Stem Cell Conditioned Medium: Follow-up With Trichograms. Fp/asíy, 15: e10. 2015), lesão hepática (DU Z., WEI C., CHENG K., HAN B., YAN J., ZHANG M., PENG C., LIU Y. Mesenchymal stem cell conditioned medium reduces liver injury and enhances regeneration in reduced-size rat liver Transplantation. Journal of Si/rp/ca/ resea/r/7 183:907-915. 2013) e lesão pulmonar (IONESCU L., Byrne R. N., VAN HAAFTEN T., Vadivel A., Alphonse R. S., REY-PARRA G. J., WEISSMANN G., HALL A., EATON F., THÉBAUD B. Stem cell conditioned medium improves acute lung injury in mice: in vivo evidence for stem cell paracrine action. >4/77 J Phy:iolÁí//7g Ce// MV /ftysfo/ 303: L967-L977, 2012; mostrando-se ser eficiente na recuperação de modelos animais e apresentando efeitos similares ao tratamento com as próprias CTMs. Também, o uso do MC apresentou efeitos positivos sobre a modulação de genes relacionados a inflamação em modelo experimental de inflamação uterina em éguas (LANGE-CONSIGLIO, A.; PERRINI, C.; ESPOSTI, P.; DERIGIBUS, M.C.; CAMUSSI, G.; PASCUCCI, L.; MARINI, M.G.; CORRADETTI, B.; BIZARRO, D.; CREMONESI, F. Effects of microvesicles secreted from equine amniotic-derived progenitor cells on in vitro lipopolysaccharide-treated tendon and endometrial cells. Repmductwn Fertil8y and Deue/op/πenf, v.28, p.244-245, 2015), além de melhorar a taxa de proliferação de células endometriais em cultivo.
[0015] O uso do secretoma e/ou do concentrado de exossomos de CTMs em medicina regenerativa, além de oferecer vantagens em termos de segurança pode ser avaliado quanto à dosagem e potência de uma maneira análoga a agentes farmacêuticos convencionais. Adicionalmente o armazenamento pode ser feito sem o requerimento de agentes crioprotetores potencialmente tóxicos por um longo período sem perda da potência do produto (VIZOSO, F. J.; EIRO, N.; CID, S.; SCHNEIDER, J.; PEREZ- FERNANDEZ, R. Mesenchymal Stem Cell Secretome: Toward Cell-Free Therapeutic Strategies in Regenerative Medicine. International Journal of Molecular Sciences, v. 18, n. 9, p. 1852, 2017).
[0016] Entretanto, apesar de potencialmente o uso do secretoma de CTMs poder ser escalonado através do uso de linhagens celulares sob condições laboratoriais controladas, a purificação desses fatores é via de regra dispendiosa e lenta. Além disso, a quantidade de fatores secretados é variável e geralmente baixa. Como agravante o uso de SFB nos meios de cultivo, embora necessário para a boa viabilidade celular, leva a contaminação do MC com proteínas de origem bovina que podem provocar reações alérgicas e anafiláticas.
[0017] Adicionalmente, as técnicas necessárias para produção de uma fração rica em exossomos com grande quantidade de proteínas com efeito biológico são demoradas, requerem equipamento especializado de alto custo e não são escalonáveis, impedindo a produção desse concentrado para fins comerciais. Os métodos mais comuns para purificação de exossomos são a ultracentrifugação, ultrafiltração e filtração em gel. Com essa metodologia as células e grandes partículas são removidas por diferentes gradientes de filtração e/ou pela utilização de forças centrífugas crescentes, sendo que a fração de microvesículas rica em exossomos precipita após centrifugação a 100.000 x g. Embora essa metodologia resulte na obtenção eficiente de uma fração rica em exossomos, o custo de tais centrifugações é fator limitante para o uso da técnica em medicina veterinária.
[0018] Desta forma, apesar das inúmeras vantagens apontadas com o uso do secretoma das CTMs, sua produção ainda é limitada pelo tipo de cultivo celular utilizado, bem como por metodologias de preparação do MC que são pouco eficientes e caras. Nos cultivos tradicionais a expansão celular ocorre de forma estática em garrafas, sem agitação levando a falta de acompanhamento e controle das condições ambientais, limitando a produtividade. Além disso, o tempo prolongado de cultivo para a geração da quantidade adequada de células e a excessiva manipulação para a realização de um grande número de passagens aumenta o risco de contaminação, e perda do material. O escalonamento da produção também é limitado em função da razão área superficial/volume de cultivo ser reduzida, necessitando um grande número de garrafas.
[0019] Diante destas dificuldades, a presente invenção apresenta, de acordo com a primeira reivindicação, uma composição farmacêutica de fácil produção e baixo custo, compreendendo meio de cultura celular condicionado por células estromais mesenquimais, contendo grande quantidade de proteínas e peptídeos, com efeito regenerativo, imunomodulador e de proliferação celular, com ação estimuladora da cicatrização e da reparação tecidual, para ser utilizado na terapia regenerativa humana ou veterinária como produto final ou matéria prima, na forma líquida, congelada e/ou liofilizada, solucionando problemas relacionados ao custo de produção, estabilidade, armazenamento, transporte e segurança.
[0020] O estado da técnica descreve diferentes metodologias de obtenção e diferentes usos para o concentrado de proteínas produzido por células eucariotas.
[0021] No documento BE1023155B1 faz-se referência a uma mistura de plasma rico em plaquetas (PRP) e MC por CTMs na relação de 3:1 a 1:3, sendo a invenção caracterizada por ser uma mistura desses dois fatores. A invenção se destina particularmente ao uso em lesões de pele como feridas e queimaduras.
[0022] O documento EP3695830A1 refere-se ao uso de vesículas extracelulares secretadas por células tronco com a função específica de utilização para tratamento de lesões de pele, reduzindo a desidratação e induzindo a formação de uma base de ceraminas, dihidroceraminas e esfingosonas na pele.
[0023] O documento EP3463395A1, refere-se ao meio condicionado por uma linhagem específica de células mesenquimais, depositada na “Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM)” com o número de acesso H-154.
[0024] O documento CN106701670A faz referência à utilização de tensões de oxigênio de 1 a 2% e cultivo celular livre de produtos derivados de animais. Adicionalmente, o concentrado bioativo de células tronco é filtrado por uma coluna de fibra oca de 50KD e concentrado antes do uso.
[0025] O documento RU2016148715A3 refere-se à produção de uma preparação regenerativa para uso veterinário baseada na mistura de um extrato de CTMs, obtido através de ciclos repetidos de congelação e descongelação associado a meio condicionado pelas CTMs.
[0026] O documento EP1178812B1 refere-se a utilização de MC por fibroblastos associado a um material biocompatível, formando um arcabouço tridimensional.
[0027] O documento US2012/0207705A1 faz referência ao uso de células da pele humana para produção de um concentrado de proteínas. Nesta invenção é especificado que o meio utilizado deve manter a viabilidade celular, mas impedir a multiplicação das células.
[0028]O documento US6372494B1 utiliza um sistema de cultivo tridimensional e de fluxo contínuo para produção de um concentrado de proteínas a partir de células eucariotas.
[0029] Nenhum dos documentos citados propõe a produção de um concentrado de proteínas e peptídeos bioativos produzidos por células estromais de forma customizada e com as características descritas na presente invenção.
[0030] PROBLEMA RESOLVIDO
[0031] Na presente invenção foi desenvolvido um método de produção em larga escala de MC por CTMs contendo alta concentração de proteínas e peptídeos, com ação regenerativa e terapêutica, como citocinas, fatores de crescimento e moléculas ligadas a matriz extracelular. O produto final apresenta excelente efeito na cicatrização tecidual, ação de diminuição de áreas de fibrose e regeneração, podendo ser aplicado na indústria farmacêutica e cosmética.
[0032] O método de produção supracitado envolve o plaqueamento das células em placas multicamadas em uma concentração de 6x106/1000cm2 e a obtenção de MC após 48 a 120 horas de cultivo em meio livre de SFB. Após a retirada do MC as CTMs podem ser re utilizadas para terapia celular e/ou para a produção de nova partida de MC.
[0033] EFEITO INUSITADO
[0034] Na presente invenção o método de produção em massa de CTMs através do plaqueamento de 6x106/1000cm2células em placas multicamadas e cultivo em meio livre de soro por 72 horas resultou na obtenção de um meio condicionado, contendo mais de uma grama de proteína/mL. Em particular, o MC produzido desta forma contem alta concentração de citocinas, fatores de crescimento e componentes da matrix extracelular, tais como: Biglican (BGN), Galectinas (LGAL), versican (VCAN), anexina 1 e 2 (ANXA1 e ANXA2), TGF-beta, IGF, TLBP, Galectinas (LGAL), Alfa2HS (AHSG), IGFBPs, cistatina (CSTB), SOD, Tireodoxina (TXN), decorina (DCN), vasorina (VASN), ANGPTL, SERPINA e VEGF; colágenos I, II, III e V (COL1A1, COL1A2, COL3 e COL5), elastina, actina G (ACTG1), fibronectina (FNPC1), lumican (LUM), fetuina B (FETUB), profilina (PFN1), periostina (POSTN), SPARC, HSPG, proteínas de matriz extra-celular (ECM1), matrix metaloproteinase 2 (MMP2), bem como inibidores de metaloproteinases (TIMP). Exercendo, portanto efeito regenerativo, antifibrótico, antioxidante, anti-inflamatório e cicatrizante. De acordo com o descrito, o MC obtido pode ser utilizado pela indústria farmacêutica e cosmética.
[0035] OBJETIVOS
[0036] O principal objetivo da presente invenção é apresentar uma solução que permita a obtenção de grandes quantidades de fatores bioativos a partir do cultivo de uma concentração conhecida de células em meio de cultivo livre de soro, mas que permite a reutilização das células, seguido de centrifugações simples sem a necessidade de ultra centrifugas. A metodologia ora descrita permite a obtenção de um concentrado de proteínas com baixo custo de produção e passível de utilização pela indústria farmacêutica e cosmética.
[0037] BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0038] A seguir um breve descritivo das figuras em anexo: - Figura 1: indica variação da frequência cardíaca (FC) e pressão arterial dos animais antes e após a primeira (lozangulo) e segunda (quadrado) aplicação endovenosa do concentrado proteico de CTMs. - Figura 2: indica as médias aritméticas dos resultados obtidos para hematócrito (em %), Proteína Total do plasma (em g/dL) e leucócitos (x103/μL) de cada animal, na primeira (1) aplicação intravenosa do Concentrado Proteico de CTMs. - Figura 3: indica as médias aritméticas dos resultados obtidos para hematócrito (em %), Proteína Total do plasma (em g/dL) e leucócitos (x103/μL) de cada animal, na segunda (2) aplicação intravenosa do Concentrado Proteico de CTMs. - Figura 4: indica as médias aritméticas dos resultados obtidos para os níveis de albumina, globulina e proteína total (soro), em g/dL, na primeira (1) aplicação intravenosa do Concentrado Proteico de CTMs. - Figura 5: indica as médias aritméticas dos resultados obtidos para os níveis de albumina, globulina e proteína total (soro), em g/dL, na segunda (2) aplicação intravenosa do Concentrado Proteico de CTMs. - Figura 6: indica médias aritméticas dos resultados obtidos para os níveis de uréia e creatinina, em mg/dL, de cada animal, na primeira (1) aplicação intravenosa do Concentrado Proteico de CTMs. - Figura 7: indica médias aritméticas dos resultados obtidos para os níveis de uréia e creatinina, em mg/dL, de cada animal, na segunda (2) aplicação intravenosa do Concentrado Proteico de CTMs. - Figura 8: indica as médias aritméticas dos resultados obtidos para os níveis de GGT, FA e ALT, em UI/L, de cada animal, na primeira (1) aplicação intravenosa do Concentrado Proteico de CTMs (secretoma). - Figura 9: indica as médias aritméticas dos resultados obtidos para os níveis de GGT, FA e ALT, em UI/L, de cada animal, na segunda (2) aplicação intravenosa do Concentrado Proteico de CTMs (secretoma). - Figura 10: indica a variação da pressão arterial (A) e da frequencia cardiaca (B) dos animais após a primeira (azul) e segunda (vermelha) aplicação intraocular do concentrado proteico de CTMs (p>0.05). - Figura 11: indica a média e erro padrão dos valores do teste de Schirmer de olhos tratados e controle ao longo de 04 momentos. - Figura 12: indica média e erro padrão dos valores de pressão intra-ocular (PIO) de olhos tratados e controle ao longo de 04 momentos.
[0039] RESUMO DA INVENÇÃO
[0040] A presente invenção trata de um concentrado de proteínas e peptídeos derivado de células estronais mesenquimais obtido através de processo compreendendo as seguintes etapas: (a) seleção de tecido adiposo subcutâneo ou visceral de animal ou humano; (b) digestão em solução enzimática do tecido e suspensão celular para formação de pellet; (c) cultivo primário de células ocorre com troca do meio de cultivo a cada 72 h; (d) atingidos 80% de confluência o meio de cultivo é descartado e as células são ressuspendidas por ação enzimática; (e) as CTMs (células mesenquimais estromais) são caracterizadas pela sua capacidade de aderência ao plástico, pela expressão dos marcadores de superfície e pelo seu potencial de diferenciação; (f) as CTMs são criopreservadas em criotubos contendo 1 a 5 milhões de células/ criotubo; (g) re-cultivo das células ocorre por forma estática ou em meio agitado ou em biorreatores; (h) no re-cultivo são plaqueadas 4 a 8 milhões de células/1000cm2. (i) após confluência celular o meio de cultivo é substituído completamente por meio livre de proteína e fica em repouso por 24 a 96 h; (j) então o sobrenadante é filtrado para remoção de debris celulares e congelado, obtendo-se assim um concentrado de proteínas e peptídeos apresentando de 1.200 a 2.500 μg de proteína total/ml do meio condicionado (MC), sendo: 10 a 30μg de proteínas relacionadas a modulação da resposta imunológica como o Biglican (BGN), Galectinas (LGAL), versican (VCAN), anexina 1 e 2 (ANXA1 e ANXA2), reguladores da cascata de complemento (CD55 e CD59) e as proteínas SPARC e LTBP; 20 a 60μg de proteínas e peptídeos relacionadas a proliferação celular, com efeito antiapoptótico, antioxidante e angiogenico como o TGF-beta, IGF, TLBP, Galectinas (LGAL), Alfa2HS (AHSG), IGFBPs, cistatina (CSTB), SOD, Tireodoxina (TXN), decorina (DCN), vasorina (VASN), ANGPTL, SERPINA e VEGF; e 15 a 40μg de proteínas de ação cicatrizante e antifibrótico como os colágenos I, II, III e V (COL1A1, COL1A2, COL3 e COL5), elastina, actina G (ACTG1), fibronectina (FNPC1), lumican (LUM), fetuina B (FETUB), profilina (PFN1), periostina (POSTN), SPARC, HSPG, proteínas de matriz extra-celular (ECM1), matrix metaloproteinase 2 (MMP2), bem como inibidores de metaloproteinases (TIMP).
[0041] DESCRIÇÃO DETALHADA
[0042] Trata a presente invenção de um biofármaco composto por um concentrado de proteínas derivado de células estromais mesenquimais, produzido de forma customizada através da manipulação do sistema de produção e do ambiente de cultivo. Tipicamente a composição do concentrado, deve conter entre 1200 a 2500μg de proteína total/ml do meio de condicionado (MC), sendo a concentração de fatores bioativos relacionados à imunomodulação e regeneração tecidual entre 1.0 e 10% do total de proteínas e peptídeos.
[0043] Cultivo Primário e caracterização das CTMs
[001] As células para produção do concentrado são de origem mesenquimal obtidas de diversos tecidos animais como o adiposo subcutâneo ou visceral, sangue de medula óssea e/ou do cordão umbilical e tecidos placentários entre outros, de espécies de mamíferos domésticos (cão, gato, cavalo, boi, ovelha, cabra, coelho, alpaca), bem como da espécie humana.
[002] As amostras de sangue são obtidas com anticoagulante e submetidas a separação por gradiente de densidade. As amostras de tecido são digeridas em solução enzimática e a suspensão celular submetida à centrifugação formando um pellet, o qual é ressuspendido no meio de cultivo.
[003] Tipicamente, para o cultivo primário são coletadas amostras de tecido adiposo visceral em cadelas encaminhadas para o procedimento de ovariosalpingoesterectomia em clínicas veterinárias parceiras. Todos os animais doadores têm menos de 2 anos e são acompanhados do preenchimento do termo de “conscientização Livre e Esclarecido”. Todos os doadores precisam ser testados negativamente para Adenovirus canino tipo I, Babesia spp., Ehrlichia spp., Leptospira spp., Toxoplasma gondii, vírus da Cinomose e Mycoplasma spp.
[004] O fragmento de tecido coletado é lavado em solução de PBS acrescida de antibióticos e antifungicos e encaminhado ao laboratório. Com ajuda de uma lâmina de bisturi o tecido é macerado até ficar homogêneo e foram realizadas lavagens com PBS para eliminar restos de sangue, tecido conectivo e outros possíveis contaminantes.
[005] Após digestão enzimática a solução é centrifugada e o precipitado ressuspendido em meio de manutenção. Tipicamente é utilizada solução de Colagenase a temperatura de 30 a 44 oC.
[006] As células são plaqueadas em garrafas de cultura celular e mantidas em estufa à 37°c com 5% de CO2, com troca de meio de manutenção a cada 3 dias até alcançar 80% de confluência. Tipicamente é utilizado meio DMEM/F12 acrescido de 20% de SFB, antibióticos e antifúngico. Neste momento é realizada a primeira passagem, durante a qual as células são ressuspendidas por ação enzimática (tipicamente tripsina) e divididas para duas novas garrafas de cultivo.
[007] Ao final do segundo cultivo, as células são caracterizadas de acordo com as determinações da Sociedade Internacional de Terapia Celular e Células Tronco (ISSCR). Tipicamente as CTM apresentaram marcação acima de 80% para CD44, CD105 e acima de 50% para CD90, bem como baixa marcação para CD34 e MHCII (abaixo de 10% e abaixo de 20% respectivamente). As células apresentam, ainda, teste positivo de diferenciação induzida, in vitropara linhagem osteogênica e adipogênica.
[008] Formação do Banco de Células Mesenquimais
[009] Para o congelamento e composição do Banco de células tronco do Laboratório, as células em segunda ou terceira passagem são tripsinizadas, e contadas, com auxílio de uma Câmara de Neubauer e de corante Azul de Trypan, para estimar a concentração e a viabilidade celular.
[0010] As células tripsinizadas são acondicionadas em meio crioprotetor compreendendo SFB (serum fetal bovino) e dimetilsulfóxido para serem inicialmente refrigeradas lentamente até 80 oC e em seguida congeladas em nitrogênio líquido.
[0011] Segundo uma forma preferencial de realização da invenção, as células são acondicionadas em criotubos, contendo tipicamente uma concentração de 1 a 5 x106 células/criotubo, com 1,5 mL de meio crioprotetor composto por 90% de SFB (Gibco®) e 10% de Dimetilsulfóxido. Os criotubos são acondicionados em frasco apropriado (Mr. Frosty Nalgene™, Cat. 5100-001) e mantidos por 24 horas no Ultra Freezer -80°C resfriando gradualmente as células a aproximadamente 1°C por minuto. Em seguida os criotubos são transferidos para o nitrogênio líquido (-196°C).
[0012] Recultivo
[0013] As condições de cultivo são modificadas para customizar o concentrado de proteínas variando-se a concentração de nutrientes no meio de cultivo, tensão de oxigênio e concentração de soro fetal bovino.
[0014] Para a produção do MC é realizado o re-cultivo, que pode ser feito em frascos de cultivo estáticos ou de cultivo agitado ou biorreatores.
[0015] O cultivo celular é realizado em sistemas bidimensionais multicamadas ou tridimensionais, em presença de substratos, podendo ser em sistema estático ou em cultivo agitado. As condições de cultivo utilizadas para produção do concentrado poderão ser modificadas para modular a produção das proteínas e peptídeos. Assim, as células podem ser cultivadas com diferentes concentrações de nutrientes, em diferentes atmosferas, em monocamadas (cultivo em 2D) ou em cultivo tridimensional (3D) adicionado ou não de substratos e contendo um ou mais antimicrobianos ou moduladores do metabolismo celular. Além disso pode ser utilizado o cultivo estático ou em biorreatores.
[0016] Cultivo estático:
[0017] Tipicamente as amostras são reconstituídas a partir do Banco de células, utilizando o protocolo descrito por J.L. Chaytor, J.M. Tokarew, L.K. Wu, M. Leclre, R.Y. Tam, C.J. Capicciotti, L. Guolla, E. Von Moos, C.S. Findlay, D.S. Allan, R.N. Ben, Inhibiting ice recrystallization and optimization of cell viability after cryopreservation, Glycobiology. 22 (2012) 123-133. doi:10.1093/glycob/cwr115, onde as células são rapidamente descongeladas em banho-Maria (37°C) sob leve agitação, até permanecer uma pequena pedra de gelo, sendo, neste momento transferidas para tubos de centrifugas previamente preparados com meio basal a 37°C, e mantidos nessa temperatura por 3 minutos. Na sequência as células são submetidas a centrifugação de 580 g/ 10 minutos e em seguida realizado o teste de viabilidade. Para o teste de viabilidade pós descongelação é utilizando o Trypan Blue.
[0018] Uma quantidade total de 6x106/1000cm2 CTMs é plaqueada para o recultivo em placas multicamadas e mantidas em meio de cultivo (tipicamente DMEM/F12 acrescido de 20% de SFB, 1% de Pen-Strep e 1% de Fungizone) e incubadas em estufa a 37.5°, com 5% CO2 em ar e 100% de humidade por 72 horas.
[0019] Cultivo em meio agitado:
[0020] O cultivo em meio agitado é realizado em frascos modelo Spinner ou similar em agitadores mecânicos ou magnéticos em presença de microcarregadores. Após preparo dos microcarregadores de acordo com as recomendações do fabricante as células são plaqueadas em meio contendo os microcarregadores. Os microcarregadores podem ser de gelatina de origem natural ou sintética. Os microcarregadores de gelatina empregados na confecção da presente invenção são tipicamente de formato esférico podendo ser porosos ou sólidos. A agitação inicial deve ser intermitente para que ocorra a adesão. Após esse período manter em agitação leve overnight. No dia seguinte dobrar o volume de meio e após 24 horas completar para o volume total que é de 200 mL.
[0021] Etapa final de obtenção do concentrado de proteínas
[0022] Para obtenção do concentrado de proteínas e peptídeos, após confluência celular (entre 3 e 7 dias em agitação), o meio de cultivo é substituído completamente por meio livre de proteína animal por um período de 24 à 72 horas. Após este período o sobrenadante é colhido, filtrado em filtros de 0.22 μm para a remoção dos debris celulares e congelado.
[0023] Desta forma é obtido um biofármaco contendo entre 1200 e 2500μg de proteína total/ml de MC, sendo a concentração de fatores bioativos relacionados à imunomodulação e regeneração tecidual entre 1.0 e 10% do total de proteínas e peptídeos.
[0024] Os frascos contendo as amostras congeladas são colocados em bandejas de inox da câmera de acrílico do sistema de fechamento a vácuo. A liofilização é realizada de acordo com as especificações do equipamento, e após o fim do procedimento, os frascos são vedados a vácuo e armazenados.
[0025] O armazenamento da forma liofilizada pode ser feito a temperaturas de 15 a 5oC. A forma líquida pode ser armazenada a temperatura entre 22 e 5oC. O tempo de armazenamento é de até 4 a 12 meses.
[0026] Opcionalmente, após a produção do MC, as células podem ser reutilizadas, ou então tripsinizadas e congeladas para uso futuro.
[0027] Segundo uma forma particular de realização da invenção, o concentrado de proteínas e peptídeos derivado de células estronais mesenquimais é obtido através de processo compreendendo as seguintes etapas: (a) seleção de tecido adiposo subcutâneo ou visceral de animal ou humano; (b) digestão em solução enzimática do tecido para formação de pellet celular; (c) cultivo primário de células ocorre com troca do meio de cultivo a cada 72 h; (d) atingidos 80% de confluência o meio de cultivo é descartado e as células são ressuspendidas por ação enzimática de tripsina; (e) as CTMs (células mesenquimais estromais) são caracterizadas pela sua capacidade de aderência ao plástico, pela expressão dos marcadores de superfície e pelo seu potencial de diferenciação; (f) as CTMs são criopreservadas em criotubos contendo aproximadamente 1 a 5 milhões de células/ criotubo; (g) as células são congeladas em meio compreendendo SFB (sérum bovino fetal) e DMSO (dimetilsufóxido); (h) o re-cultivo das células ocorre por forma estática ou em meio agitado ou em biorreatores; (i) no re-cultivo são plaqueadas 4 a 8 milhões de células/1000cm2, (j) após confluência celular o meio de cultivo é substituído completamente por meio livre de proteína e fica em repouso por 24 a 96 h; (k) então o sobrenadante é filtrado para remoção de debris celulares, separado e congelado, obtendo-se assim um concentrado de proteínas e peptídeos apresentando de 1.200 a 2.500 μg de proteína total/ml do meio condicionado (MC), sendo: 10 a 30μg de proteínas relacionadas a modulação da resposta imunológica como o Biglican (BGN), Galectinas (LGAL), versican (VCAN), anexina 1 e 2 (ANXA1 e ANXA2), reguladores da cascata de complemento (CD55 e CD59) e as proteínas SPARC e LTBP; 20 a 60μg de proteínas e peptídeos relacionadas a proliferação celular, com efeito antiapoptótico, antioxidante e angiogenico como o TGF-beta, IGF, TLBP, Galectinas (LGAL), Alfa2HS (AHSG), IGFBPs, cistatina (CSTB), SOD, Tireodoxina (TXN), decorina (DCN), vasorina (VASN), ANGPTL, SERPINA e VEGF; e 15 a 40μg de proteínas de ação cicatrizante e antifibrótico como os colágenos I, II, III e V (COL1A1, COL1A2, COL3 e COL5), elastina, actina G (ACTG1), fibronectina (FNPC1), lumican (LUM), fetuina B (FETUB), profilina (PFN1), periostina (POSTN), SPARC, HSPG, proteínas de matriz extra-celular (ECM1), matrix metaloproteinase 2 (MMP2), bem como inibidores de metaloproteinases (TIMP).
[0028] A presente invenção é caracterizada por um concentrado de proteínas e peptídeos derivado de células estromais mesenquimais, com efeito imunomodulador e de proliferação celular, com ação angiogênica e estimuladora da proliferação celular e cicatrização.
[0029]A composição do concentrado segundo a presente invenção é livre de células.
[0030] O concentrado de proteínas e peptídeos compreende muitos dos componentes do meio de crescimento de cultura de células originais, mas, além disso, também contêm metabólitos celulares, proteínas e peptídios secretados pelas células. As proteínas biologicamente ativas secretadas são fatores de crescimento, citocinas, proteases e outras proteínas e peptídeos.
[0031] Tipicamente a composição do concentrado, de acordo com o primeiro aspecto da presente invenção, deve conter de 1200 a 2500μg de proteína total/ml de MC.
[0032] As proteínas compreendidas no concentrado segundo a invenção, devem estar preferencialmente relacionadas a processos biológicos celulares, de regulação e processos metabólicos.
[0033] As principais funções moleculares as quais as proteínas presentes na invenção estão ligadas as atividades catalíticas e de ligação.
[0034] Tipicamente a composição do concentrado de proteínas deve conter de 10 a 30μg de proteínas relacionadas a modulação da resposta imunológica como o Biglican (BGN), Galectinas (LGAL), versican (VCAN), anexina 1 e 2 (ANXA1 e ANXA2), reguladores da cascata de complemento (CD55 e CD59) e as proteínas SPARC e LTBP.
[0035] A composição do concentrado deve conter ainda entre 20 a 60μg de proteínas e peptídeos relacionadas a proliferação celular, com efeito antiapoptótico, antioxidante e angiogenico como o TGF-beta, IGF, TLBP, Galectinas (LGAL), Alfa2HS (AHSG), IGFBPs, cistatina (CSTB), SOD, Tireodoxina (TXN), decorina (DCN), vasorina (VASN), ANGPTL, SERPINA e VEGF.
[0036] De acordo com o primeiro aspecto o concentrado de proteínas deve conter ainda 15 a 40μg de proteínas de ação cicatrizante e antifibrótico como os colágenos I, II, III e V (COL1A1, COL1A2, COL3 e COL5), elastina, actina G (ACTG1), fibronectina (FNPC1), lumican (LUM), fetuina B (FETUB), profilina (PFN1), periostina (POSTN), SPARC, HSPG, proteínas de matriz extra-celular (ECM1), matrix metaloproteinase 2 (MMP2), bem como inibidores de metaloproteinases (TIMP).
[0037] O concentrado de proteínas e peptídeos pode ser utilizado na concentração de 2 a 100%, associado à um ou mais agente antimicrobiano, regulador do metabolismo celular e/ou substância que aumente a absorção celular.
[0038] A utilização do concentrado de proteínas e peptídeos da invenção não gera efeitos colaterais, semelhantes aos tipicamente observados com a utilização compostos sintéticos, seja a curto ou longo prazo para a formação de um pó.
[0039] O concentrado de proteínas e peptídeos pode ser utilizado poder se apresentar no estado congelado, ou resfriado, ou liofilizado, ou desidratado, ou líquido, ou sólido, para uso tópico ou oral, ou ainda na forma de cápsulas, ou comprimidos, ou injetáveis.
[0040] O concentrado de proteínas e peptídeos derivado de células estromais mesenquimais pode ser utilizado para tratamento de doenças neurológicas, osteoarticulares, dermatológicas, oftálmicas, do sistema imune, do sistema urinário, do sistema digestivo e do aparelho reprodutor, podendo ser utilizado ainda para tratamento cosmético, crescimento capilar e associado a colas cirúrgicas.
[0041] Adicionalmente o concentrado de proteínas pode ter apresentação injetável, tópica ou oral, associado a um ou mais antimicrobianos, biopolímeros, substratos cosméticos, colas cirúrgicas ou suplementos alimentares.
[0042] O concentrado de proteínas e peptídeos da invenção não induz resposta imunológica sendo seguro para utilização em aplicações endovenosas, subcutânea, intra- articulares, oculares, intra-testiculares, intra-ovariana, intra-uterina e intra-mamária.
[0043] O concentrado de proteínas derivado de células estromais mesenquimais pode ser utilizado para tratamento cosmético, de doenças neurológicas, osteoarticulares, dermatológicas, oftálmicas, do sistema imune, do sistema urinário, do sistema digestivo e do sistema reprodutor da espécie humana ou de espécies domésticas (cão, gato, cavalo, boi, ovelha, cabra, coelho, alpaca), podendo ainda ser utilizado para crescimento capilar.
[0044] A invenção pode ainda ser utilizada para fins cosméticos, incluindo crescimento capilar, bem como associada a colas cirúrgicas, hidrogéis e/ou biopolímeros.
[0045] Em uma forma adicional de uso da invenção, esta pode ser utilizada em formulações orais, em sua forma pura ou microcapsulada, associada ou não a suplementos alimentares.
[0046] Adicionalmente a presente invenção pode ser utilizada como meio de cultivo celular, bem como de criopreservação de células, associada a crioprotetores, açúcares e macromoléculas inertes.
[0047] O concentrado de proteínas e peptídeos pode ser utilizado na concentração de 2 a 100%, associado a um ou mais agente antimicrobiano, regulador do metabolismo celular e/ou substância que aumente a absorção celular.
[0048] A presente invenção se insere no campo médico, mais precisamente no campo da imunomodulação e reparação tecidual e descreve um concentrado de proteínas e peptídeos produzidos por células estromais de eucariotos cultivadas in vitro.
[0049] A presente invenção pode ser utilizada pela medicina humana e veterinária.
[0050] Seguem exemplos que visam apresentar de forma minuciosa da invenção, não devendo ser utilizados para efeito limitativo do escopo da invenção.
[0051] EXEMPLOS
[0052] As condições de cultivo são modificadas para customizar o concentrado de proteínas variando-se a concentração de nutrientes no meio de cultivo, tensão de oxigênio e concentração de soro fetal bovino.
[0053] As células para produção do concentrado foram de origem mesenquimal obtidas de tecido adiposo canino e felino.
[0054] Foram coletados fragmentos de tecido adiposo subcutâneo ou visceral de aproximadamente 2cm3 de fêmeas caninas submetidas a ovariosalpingohisterectomia eletiva. Todas as doadoras eram animais saudáveis e com menos de dois anos de idade, e foram submetidas a um exame clínico com hemograma e bioquímica. Todos os animais apresentaram termo de consentimento assinado pelo proprietário responsável. Cada amostra de célula-tronco mesenquimal derivada de tecido adiposo (AD-CTMs) canina foi testada por PCR para Adenovirus tipo I, Eriichia spp., Babesia spp., Anapiasma spp., Leptospira spp., Toxvpiasma gondíi. e vírus da cinomose, além de cultura bacteriana e micológica
[0055] As amostras de células utilizadas foram inicialmente isoladas, expandidas, caracterizadas e congeladas, para posterior degelo e produção do meio condicionado. Para tal, as amostras de tecido adiposo foram digeridas em solução de colagenase a temperatura de 37,5°C. A suspensão celular foi então submetida à centrifugação formando um pellet, o qual foi ressuspendido no meio de cultivo (tipicamente DMEM/F12 acrescido de 20% de SFB, 1% de Pen-Strep e 1% de Fungizone), e cultivada por 7 dias a 38,5oC em atmosfera com 5% de CO2 em ar.
[0056] Esse cultivo primário foi realizado em frascos estáticos do tipo T com 25 cm2. O meio foi trocado a cada 72 horas de cultivo. Quando as células atingiram 80% de confluência as células foram submetidas a primeira passagem, passando a ser cultivadas em frasco T de 175 cm2 até novamente atingirem 80% de confluência.
[0057] Para a caracterização das CTMs foram coletadas amostras do cultivo de cada doador para realização da contagem celular, viabilidade e caracterização, através de citometria de fluxo e diferenciação celular.
[0058] As CTMs são caracterizadas pela sua capacidade de aderência ao plástico, pela expressão dos marcadores de superfície CD44, CD73, CD90 e CD105, entre outros, e pela não expressão de MHC II, CD45 e CD34 entre outros. Esta análise foi realizada nas células no Banco e repetida nas células cultivadas em placas multicamadas e em cultivo agitado.
[0059] Para diferenciação osteogênica e adipogênica, as AD-CTMs de segunda passagem foram semeadas em placas de 12 poços com meio de manutenção. Após 48 horas de incubação, o meio foi substituído pelo meio de diferenciação osteogênico ou adipogênico STEMPRO® (Thermo Fisher Scientific®, EUA), de acordo com as recomendações do fabricante. Os meios adipogênico e osteogênico foram suplementados com 20% de SFB. O meio de diferenciação foi trocado a cada dois a três dias e a confirmação da diferenciação osteogênica e adipogênica foi confirmada de acordo com L. Maia, M.C. Dias, C.N. de Moraes, C. de Paula Freitas-Dell’Aqua, L.S.L.S. da Mota, V. Santiloni, F. da Cruz Landim- Alvarenga, Conditioned medium: a new alternative for cryopreservation of equine umbilical cord mesenchymal stem cells, Cell Biol. Int. 41 (2017) 239-248. doi:10.1002/cbin.10708, respectivamente, pela observação de depósitos de cálcio na matriz extracelular usando coloração com vermelho de alizarina a 2%, pH 4,2 (Sigma-Aldrich®, EUA) e presença de gotículas de lipídios intracitoplasmáticas usando 0,5% de óleo vermelho (Sigma-Aldrich®, EUA). Esta análise foi realizada nas células no Banco e repetida nas células cultivadas em placas multicamadas e em cultivo agitado.
[0060] Formação do Banco de CTMs
[0061] Após a tripsinização, em segunda passagem, as células de cada doador foram divididas em criotubos contendo aproximadamente 6 milhões de células/criotubo, e criopreservadas. Para tanto, os criotubos foram mantidos por 24 horas no Ultra Freezer - 80°C (Thermo Scientific - Forma 8800 Series), resfriando gradualmente as células a aproximadamente - 1°C por minuto. Em seguida os criotubos foram colocados no nitrogênio líquido (-196°C), e mantidos até o momento da utilização.
[0062] Etapa final de obtenção do concentrado de proteínas
[0063] No momento do plaqueamento as amostras do banco foram descongeladas em banho-maria e submetidas a contagem celular e teste de viabilidade por coloração com Trypan Blue, no aparelho Countess II FL Automated Cell Counter.
[0064] Para obtenção do concentrado de proteínas e peptídeos, foram utilizados dois sistemas de cultivo estático: em frascos T de 175cm2, e em frascos multicamadas Cell Disc (Greiner CAT n° 678104/ LOT E18093RJ) com 4 camadas totalizando 1000cm2por tipo de frasco. Para padronizar a área de cultivo total em 1000cm2, em cada repetição do experimento foram utilizados 6 frascos T e 1 frasco Cell Disc. Foram plaqueadas 6 milhões de células/1000cm2.
[0065] O Tempo de cultivo foi padronizado de acordo com o comportamento das células nos frascos T de 175 cm2. Quando o cultivo celular em frascos T atingiu aproximadamente 60% de confluência, o meio de cultivo foi trocado para meio sem adição de SFB. Desta forma, em todos os grupos, para obtenção do meio condicionado, após 4 dias de cultivo, o meio foi substituído completamente por meio livre de soro fetal bovino durante 72 horas, totalizando 200ml de meio condicionado por tipo de frasco.
[0066]Cultivo em meio agitado:
[0067] O cultivo em meio agitado foi realizado em frascos modelo Spinner ou similar em agitadores mecânicos ou magnéticos em presença de microcarregadores do tipo Citodex1. Após preparo dos microcarregadores de acordo com as recomendações do fabricante as células foram plaqueadas em meio contendo os microcarregadores em uma concentração de 6X106. Os microcarregadores de gelatina empregados na confecção da presente invenção são tipicamente de formato esférico podendo ser porosos ou sólidos. A agitação inicial foi intermitente para que ocorresse a adesão. Após esse período manteve-se em agitação leve overnight. No dia seguinte o volume de meio foi dobrado (de 50 para 100 mL) e após 24 horas foi completado para o volume total (200mL).
[0068] Tanto nos sistemas estáticos como no agitado, as células foram cultivadas por 4 dias em meio contendo 20% de SFB. Após esse período o sobrenadante foi removido e substituído por meio DMEM/F12 livre de Soro. Ao final das 72 horas de cultivo sem SFB, o meio de cultivo foi recolhido, filtrado filtros de 0.22μm para remoção dos debris celulares e as amostras aliquotadas em frascos tipo penicilina contendo 6ml/cada e armazenadas em freezer -80°C para posterior liofilização, testes de estabilidade e testes de segurança.
[0069] Desta forma foi obtido um biofármaco contendo 1.850 μg de proteína total/ml de MC, sendo a concentração de fatores bioativos relacionados à imunomodulação e regeneração tecidual de 7 % do total de proteínas e peptídeos.
[0070] O concentrado utilizado nos exemplos que seguem compreendeu: 10 a 30μg de proteínas relacionadas a modulação da resposta imunológica como o Biglican (BGN), Galectinas (LGAL), versican (VCAN), anexina 1 e 2 (ANXA1 e ANXA2), reguladores da cascata de complemento (CD55 e CD59) e as proteínas SPARC e LTBP; 20 a 60μg de proteínas e peptídeos relacionadas a proliferação celular, com efeito antiapoptótico, antioxidante e angiogenico como o TGF-beta, IGF, TLBP, Galectinas (LGAL), Alfa2HS (AHSG), IGFBPs, cistatina (CSTB), SOD, Tireodoxina (TXN), decorina (DCN), vasorina (VASN), ANGPTL, SERPINA e VEGF; e 15 a 40μg de proteínas de ação cicatrizante e antifibrótico como os colágenos I, II, III e V (COL1A1, COL1A2, COL3 e COL5), elastina, actina G (ACTG1), fibronectina (FNPC1), lumican (LUM), fetuina B (FETUB), profilina (PFN1), periostina (POSTN), SPARC, HSPG, proteínas de matriz extra-celular (ECM1), matrix metaloproteinase 2 (MMP2), bem como inibidores de metaloproteinases (TIMP).
[0071] Foi realizada a análise das proteínas em amostras de CTMs de Canis lupus /&/77/7/ar/5 submetidas a diferentes condições de cultivo e armazenamento, em amostras CTMs de Feiis catus submetidas a diferentes condições de cultivo.
[0072] Devido a indisponibilidade de equipamentos foram utilizadas 2 metodologias de Espectometria de Massa (MS). Nas amostras de Canis iúpus familiaris Q processamento dos dados, a identificação de proteínas e as análises de quantificação relativa foram realizadas utilizando-se o So/Twsre PEAKS studio, Version 10.6, Bioinformatics Solutions Inc., Waterloo, ON. Os parâmetros de processamento incluíram: carbamidometilação da cisteína como modificação fixa de aminoácidos. A oxidação da metionina e acetilação da região N-terminal foram consideradas como variações variáveis. A tripsina foi utilizada como enzima proteolítica, com o máximo de 2 possíveis erros de clivagem. A tolerância de desvio de massa de íons para peptídeos e fragmentos foi ajustada para 20 ppm e 0,05 Da, respectivamente.
[0073] Uma taxa máxima de falsos positivos (FDR) de 1% foi utilizada para identificação de peptídeos e proteínas, considerando-se como critério, ao menos um peptídeo único para identificação de proteínas. Todas as proteínas foram identificadas com um grau de confiança > 95%, utilizando-se o algoritmo do PEAKS Software e busca dentro da base de dados de Ca/7/s/^^fè/n/7/ar/sdo UniProt (Uniprot Consortium,2018).
[0074] Os dados foram então processados e padronizados utilizando o programa RStudio (^tatf/0 Team,2015), ambiente de desenvolvimento integrado para linguagem de programação R (R Team, 2013). Os metadados das proteínas foram obtidos no banco de dados de proteínas UniProt (Uniprot Consortium,2CV6). Valores foram tabulados por Gis^e/Va/πe (GN) e filtrados por ProteinExistence (PE) e SevuenceVension (SV). Para cada proteína, foi considerado um único valor registrado com melhor categoria de evidência experimental (menor valor para PE) e versão da sequência mais recente (maior valor para SV). Para cada proteína, os valores de um grupo amostral foram omitidos se apresentaram ausência de dados em 50% ou mais das amostras. Foram mantidas no conjunto de dados final apenas proteínas que apresentaram valor não-ausente em no mínimo dois grupos. A normalização dos valores por proteína foi obtida dividindo o valor da j-ésima proteína da i-ésima amostra pela somatória dos valores da j-ésima proteína.
[0075] Nas amostras de FeZ/scaft/sa quantificação relativa de cada proteína na mistura foi determinada pelo índice de abundância proteica exponencialmente modificado (emPAI) obtido pelo software Mascot Distiller. Os parâmetros de pesquisa incluíram tripsina como protease, com um máximo de 1 clivagem perdida; carbamidometilação da cisteína como modificação fixa e oxidação da metionina como uma modificação variável, e uma tolerância de 0,1 Da para precursores e fragmentos de íons e monoisótopo de peso molecular. Os resultados do Mascot foram submetidos ao programa Protein Pilot Software 4.0 (AB Sciex, Framingham, EUA) para realizar a análise do conjunto de dados para validar peptídeos de base MS/MS e identificação de proteínas.
[0076] Em todas as amostras as interseções de proteínas entre os secretomes foram analisadas pela ferramenta de diagrama de Venn, facilitada pela Bioinformtics & Systems Biology. Os resultados da identificação de proteínas foram inseridos nas bases de dados UniprotKB (www.uniprot.org.br) e Phanter (www.pantherdb.org), para analisá-las por sua ontologia genética (GO), levando em consideração sua função molecular, processo biológico e componente celular.
[0077]As principais proteínas identificadas para a espécie Canis Lupus são apresentadas na Tabela 1.
[0078] Na análise proteômica geral,de todos os grupos estudados foram identificadas 3033 proteínas. Após normalização dos dados este número foi reduzido para 1187 proteínas. De acordo com o sistema de cultivo foi observado que no grupo Frasco T (FT) foram identificadas 1079 proteínas, no grupo Cell Disk (CD) foram identificadas 905 proteinas e no grupo Cytodex (CX) foram identificadas 763 proteínas.
[0079] Foi utilizado, o programa Bioinformatics (http://bioinformatics.psbMgentbe/webtools/Venn/) para gerar um diagrama de VENN comparando os 3 conjuntos de proteínas. Nesta análise foram encontradas 603 proteínas comuns aos 3 sistemas de cultivo (Figura 1). O número de proteínas que foram encontradas em cada grupo e número de proteínas que são exclusivas de cada um dos tratamentos estão indicados na Tabela 1: TABELA 1
[0080]Estas proteínas encontravam-se ligadas principalmente às funções moleculares de ligação, função catalítica e de atividade estrutural. Os processos biológicos aos quais as 603 proteínas compartilhadas entre os 3 sistemas de cultivo se encontravam ligadas foram principalmente os processos celulares, metabólicos e de regulação biológica.
[0081] Em caninos, as principais proteínas ligadas às funções moleculares de ligação foram aquelas associadas a matriz extra-celular (MEC), incluindo proteínas relevantes como ITIH2 que atua como um transportador de hialuronan no soro ou como uma proteína de ligação entre o hialuronan e outras proteínas da MEC, inclusive aquelas nas superfícies celulares dos tecidos para regular a localização, síntese e degradação do hialuronan o que é essencial para as células controlarem seus processos biológicos como resposta ao estresse e estímulos. Outra função molecular importante é a de atividade estrutural molecular, que inclui os constituintes estruturais da MEC como os colágenos (COL1A1 e COL1A2).
[0082] O processo biológico mais importante ao qual as principais proteínas identificadas se encontravam ligadas foi o processo celular. Proteínas relevantes relacionadas à (MEC) foram as de adesão celular, migração celular e morfogênese. No organismo, as CTMs estão em constante contato com a MEC, que serve não apenas como suporte estrutural, mas também como reservatório de muitos sinais bioquímicos e mecânicos que são traduzidos para criar as interações que influenciam as vias e funções de sinalização celular. Essas proteínas funcionais, que são principalmente colágenos, elastina, proteoglicanos, hialuronanos e outras glicoproteínas de matriz não colágena, circundam as células e criam áreas semelhantes a nichos. No nicho celular, as interações célula-MEC influenciam e modulam a auto-renovação e diferenciação de CTMs. Uma dessas proteínas é a SPARC, uma glicoproteína de ligação ao Ca2 que influencia a formação, manutenção e reparo ósseo, através da regulação do processamento e montagem do procolágeno na matriz óssea, e a regulação da mineralização, diferenciação e atividade de osteoblastos e osteoclastos (Rosset EM, Bradshaw AD. SPARC/osteonectin in mineralized tissue. Matrix Biol 2016;52-54:78- 87.). Em tecidos não mineralizados, a SPARC, assim como a Decorina (DCN), tem sido implicadas como contribuintes significativos para lesões fibróticas, além de regular a atividade de fatores de crescimento que são importantes para a homeostase vascular (Raines EW, Lane TF, Iruela-Arispe ML, et al. The extracellular glycoprotein SPARC interacts with platelet-derived growth factor (PDGF)-AB and -BB and inhibits the binding of PDGF to its receptors. Proc Natl Acad Sci 1992;89:1281-1285). Normalmente, a expressão de SPARC está intimamente alinhada com a de colágenos fibrilares, como colágeno I, III e V, indicando envolvimento de SPARC na estrutura da MEC (Bradshaw AD. The Extracellular Matrix. Encycl. Cell Biol., 2015:694-703).
[0083] Outra proteína abundante identificada além da DCN foi a Biglicana (BGN), membros da família de proteoglicanos pequenos ricos em leucina e reguladores negativos JAK-STAT. A via JAK-STAT desempenha um papel importante na sinalização dos receptores de citocinas durante a resposta imune e, também pode promover a diferenciação celular. Devido ao seu extenso repertório de ligações a componentes da MEC, fatores de crescimento e receptores de superfície celular, as DCN e BGN são considerados "os guardiões e orquestradores da matriz extracelular". Uma das principais características da DCN é sua capacidade antifibrótica, razão pela qual se tornou alvo para o tratamento de diversas doenças. A DCN também inibe a expressão de citocinas pró-inflamatórias e aumenta a expressão de citocinas anti-inflamatórias para melhorar as funções de CTMs (LIU B., DING F., HU D., ZHOU Y., LONG C., SHEN L., ZHANG Y., ZHANG D., WEI G.. Human umbilical cord mesenchymal stem cell conditioned medium attenuates renal fibrosis by reducing inflammation and epithelial-to-mesenchymal transition via the TLR4/NF-KB signaling pathway in vivo and in vitro. Stem Cell ^e^arch & Th9rapy () 9:7. 2018). O BGN atua na regulação da reação da resposta inflamatória inata, atuando especificamente nas relações entre a resposta imune inata e adaptativa e como um ligante endógeno para os receptores da imunidade inata em macrófagos (Popovic Z V., Wang S, Papatriantafyllou M, et al. The Proteoglycan Biglycan Enhances Antigen-Specific T Cell Activation Potentially via MyD88 and TRIF Pathways and Triggers Autoimmune Perimyocarditis. J Immunol 2011;187:6217-6226). A presença de DCN e BGN indica que, em condições de cultura sem soro, as CTMs produzem grandes quantidades de proteínas que são relevantes para a imunomodulação e regeneração tecidual. De fato, estudos relacionados às intrincadas interações entre BGN e receptores da imunidade inata tem revelado perspectivas significativas úteis para o desenvolvimento de novos medicamentos no tratamento de doenças inflamatórias (Nastase M V, Young MF, Schaefer L. Biglycan: a multivalent proteoglycan providing structure and signals. J Histochem Cytochem 2012;60:963-975).
[0084] Dentre as proteínas importantes com função sobre células do sistema imunológico destaca-se a Galectina 1 (LGALS1). Essa proteína desempenha um papel na regulação da apoptose, proliferação celular e diferenciação celular sendo um forte indutor de apoptose de células T (He J., Baum L.G. Presentation of galectin-1 by extracellular matrix triggers T cell death. J. Biol. Chem. 279:4705-4712(2004)).
[0085] Adicionalmente foi constatada a presença de actina gama (ACTG1) que faz parte do citoesqueleto celular, participa da regulação da transdução de sinais, transporte de proteínas e compartimentalização de sinais, e sofre reorganização em resposta ao seu microambiente. Uma vez que a actina está no núcleo, ela pode ser encontrada em formas filamentosas, contribuindo para eventos fisiológicos para controlar a diferenciação de CTMs. Tem sido sugerido que o aumento do citoesqueleto devido ao acréscimo das fibras de actina aumenta a proporção de células que se diferenciam em direção a uma linhagem osteoblástica, impedindo a diferenciação adipogênica (Sen B, Xie Z, Uzer G, Thompson WR, Styner M, Wu X, et al. Intranuclear Actin Regulates Osteogenesis. Stem Cells. 2015; 33(10): 3065-3076. https://doi.org/10.1002/stem.2090 PMID: 26140478). A actina também é crítica para a divisão e mobilidade celular, e sua polimerização dinâmica demonstrou regular a e refinar aspectos específicos da transdução do sinal genético. Esses resultados suportam a hipótese de que a privação do soro induz as CTMs a produzir proteínas importantes para a proliferação celular e regeneração tecidual.
[0086] Outra proteína ligada a MEC encontrada em abundância no presente invento foi a Alpha 2 HS (AHSG). A principal função fisiológica da AHSG é a remodelação óssea e a inibição da calcificação ectópica indesejada. A AHSG bloqueia as vias de sinalização osteogênica ligando-se ao TGF-β e BMPs relacionados ao TGF-β, inibindo assim a angiostenose e a diferenciação osteogênica de CTMs( Swallow CJ, Partridge EA, Macmillan JC, Tajirian T, DiGuglielmo GM, Hay K, et al. α2HS-glycoprotein, an Antagonist of Transforming Growth Factor β In vivo, Inhibits Intestinal Tumor Progression. Cancer Res. 2004; 64(18): 6402-6409. https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-04-1117 PMID: 15374947). AHSG pode estabilizar metaloproteinases de matriz e prevenir sua degradação por autólise. Também está associada ao desenvolvimento cerebral e à função imunológica, atuando como um mediador anti-inflamatório envolvido na inibição de a apoptose de células musculares lisas vasculares e no aumento da resposta imune.
[0087] A família de proteínas transportadoras de solutos 15 (SLC15A1) é parte de um conjunto de proteínas transportadoras de soluto, no caso a histidina, expresso pelos macrófagos e células dendríticas, importantes para a função dos lisossomos e associado a distúrbios autoimunes, como doenças inflamatórias intestinais e lúpus eritematoso sistêmico. A presença dessa proteína no MC produzido indica que as CTMs, em determinadas condições, podem apresentar também um efeito estimulador, sobre o sistema imunológico.
[0088] Outras proteínas importantes encontradas foram as da família das metaloproteinases de matriz (MMP), como a MMP2, que estão envolvidas na quebra da matriz extracelular (MEC) em processos fisiológicos normais, como desenvolvimento embrionário, reprodução e remodelação tecidual, bem como em processos patológicos, como artrite e metástase. Ao degradar a MEC, as MMPs liberam fatores de crescimento que estavam previamente ligados à MEC, permitindo que elas se liguem aos receptores celulares e influenciem a sinalização celular (Giannelli G., Falk-Marzillier J., Schiraldi O., Stetler-Stevenson W.G., Quaranta V. Induction of cell migration by matrix metalloprotease-2 cleavage of laminin- 5. Science. 1997;277:225-228). A MMP-2 também desempenha um papel importante na formação de novos vasos sanguíneos, um processo conhecido como angiogênese e foi demonstrado que esta proteína participa da linfangiogênese. A MMP-2 e MMP-9 foram reguladas positivamente durante a angiogenese e a regulação positiva dessas MMPs desencadeou a liberação de VEGF bioativo, um potente estimulador da angiogênese (Detry, B., Erpicum, C., Paupert, J, et al. (2012) Matrix metalloproteinase-2 governs lymphatic vessel formation as an interstitial collagenase Blood 119(21): 5048-5056).
[0089] A Tabela 2 indica as principais proteínas presentes no secretoma das CTMs Caninas. As Proteínas caracterizadas pela primeira vez na espécie estão marcadas com asterisco (*).
[0090]No meio condicionado por células mesenquimais de gatos domésticos foram
[0091]A função molecular predominante destas proteínas está relacionada às atividades catalítica, de ligação e estrutural. O processo biológico predominante foi o processo celular e sistema imunológico. A proteína não caracterizada (PRDX1) foi considerada crítica para os processos catabólicos celulares, homeostase, respostas ao estresse oxidativo, ativação de leucócitos, homeostase de eritrócitos, processos metabólicos reativos de oxigênio e ativação de células natural killer. Outras proteínas relevantes foram MMP2, por responder à hipóxia, e TIMP2, por responder a hormônios e citocinas. A presença dessas proteínas indica que os secretomas de AD-CTM felino produzidos sob condições de inanição de soro podem ter um nível mais alto de propriedades de imunomodulação em comparação com aquelas de células cultivadas na presença de FBS.
[0092] Em relação as proteínas mais relevantes relacionadas à MEC, novamente a SPARC apareceu em destaque. Como já ressaltado anteriormente a SPARC regula interações entre as células e a MEC circundante. Esta proteína governa, portanto, funções celulares fundamentais, como adesão, proliferação e diferenciação celular. A SPARC também regula a expressão e atividade de numerosos fatores de crescimento e metaloproteinases essenciais para a degradação e renovação da MEC.
[0093] Assim como em cães a Decorina (DCN) foi uma proteína relevante encontrada no secretoma das CTMs. O DCN é um proteoglicano intimamente relacionado ao Biglican (BGN) que parece influenciar a fibrilogênese, interagindo com a fibronectina, a trombospondina, o componente C1q do complemento, o receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) e o fator de crescimento transformador beta (TGF-beta). Esta molécula está envolvida na regulação da autofagia da célula endotelial inibindo a angiogenese. Esse processo é mediado por uma interação de alta afinidade com o VEGFR2 (Buraschi S, Neill T, Goyal A, Poluzzi C, Smythies J, Owens RT, Schaefer L, Torres AT, Iozzo RV. Decorin causes autophagy in endothelial cells via Peg3. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2013;110:E2582-E2591.) Outros fatores de crescimento angiogênicos que a decorina inibe são angiopoietina, fator de crescimento de hepatócitos (HGF) e fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF). O DCN e o BGN também têm função reguladora da via JAK-STAT, importante reguladora da sinalização de receptores de citocinas durante a resposta imune.
[0094] Uma outra proteoglicana importante que foi grandemente expressa no MC produzido por CTMs tanto de gatos como de cães foi a versicana (VCAN). Os pesquisadores propuseram várias funções adicionais para o versican. Alem de participar da geração da MEC essa proteína provavelmente ajuda a regular o crescimento e a divisão celular, a ligação das células umas às outras (adesão celular) e o movimento celular (migração). Estudos sugerem que a VCAN desempenha um papel na formação de novos vasos sanguíneos (angiogênese), cicatrização de feridas, inflamação e prevenção do crescimento de tumores cancerígenos. A VCAN também regula a atividade de vários fatores de crescimento, que controlam uma gama diversificada de processos importantes para o crescimento celular (Lili Zhai 1, Wenjing Chen 1, Boshu Cui 1, Bing Yu 1, Yang Wang 1, Huiming Liu Overexpressed versican promoted cell multiplication, migration and invasion in gastric cancer. Tissue Cell. 2021 Dec;73:101611. doi:10.1016/j.tice.2021.101611).
[0095] A actina gama (ACTG1), componente do citoesqueleto encontrada no citoplasma foi encontrada no MC de CTMs de ca~es e também em gatos, sendo que esta é uma proteína ainda não caracterizada em felinos. Como já ressaltado anteriormente essa proteína, por ser componente do citoesqueleto celular, participa do transporte intracelular de organelas e proteínas bem como da regulação da transdução de sinais genéticos.
[0096] Outras proteínas encontradas em abundância no MC por CTMs de gatos foram a AHSG e a proteína não caracterizada AQP7, críticas para a atividade do canal de água, glicerol e transporte de membrana, sendo importantes também para a remodelação óssea.
[0097] A Cistatina (CST3) é um inibidor das proteinases de cisteína. A expressão dessa proteína nas células musculares lisas da parede vascular é severamente reduzida em lesões ateroscleróticas e aneurismáticas da aorta, estabelecendo seu papel na proteção vascular (Wang Y, Li W, Yang J, Zhang M, Tian C, Ma M, Zhang Q. Association Between Cystatin C and the Risk of Ischemic Stroke: a Systematic Review and Meta-analysis. 2019 Journal of Molecular Neuroscience volume 69, pages444-449). Além disso, esta proteína demonstrou ter uma função antimicrobiana, inibindo a replicação do vírus herpes simples. Seu papel em conjunto com a Catepsina B (CTSB) tem sido estudado na previsão da deterioração de doenças cardiovasculares. Também parece desempenhar um papel em distúrbios cerebrais envolvendo amilóide (um tipo específico de deposição de proteínas), como a doença de Alzheimer (Patrick L.J.M. Zeeuwen, ... Joost Schalkwijk The Biology of Cystatin M/E and its Cognate Target Proteases. 2009. Journal of Investigative Dermatology).
[0098] No estudo de células caninas foi observada a SLC15A1, que faz parte de um conjunto de proteínas transportadoras. No gato foi observada a presença da SLC25A19 que também é membro da família de proteínas transportadoras de soluto (SLC). A proteína produzida a partir do gene SLC25A19 transporta uma molécula chamada pirofosfato de tiamina para as mitocôndrias, os centros produtores de energia das células. Acredita-se que o transporte de pirofosfato de tiamina para as mitocôndrias seja importante no desenvolvimento do sistema nervoso (Nabokina Svetlana M., Valle Judith E., Said Hamid M. Characterization of the human mitochondrial thiamine pyrophosphate transporter SLC25A19 minimal promoter: A role for NF-Y in regulating basal transcription 2013. Gene. V 528, Issue 2: 248-255. doi.org/10.1016/j.gene.2013.06.073).
[0099] As galectinas são uma família de proteínas de ligação a carboidratos com afinidade por beta-galactosídeos. A galectina-1 (LGALS1) foi descrita como um dos principais reguladores de respostas imunes como homeostase e sobrevivência de células T, distúrbios imunológicos de células T, inflamação e alergias, bem como interações patógeno-hospedeiro. A superexpressão (ou entrega) direcionada de Gal-1 é considerada como um método de para o tratamento de alguns tipos de doenças relacionadas à inflamação, patologias neurodegenerativas e distrofias musculares. Em contraste, a inibição direcionada da expressão de Gal-1 deve ser desenvolvida para aplicações terapêuticas contra a progressão do câncer. LGALS1 é, portanto, um alvo molecular promissor para o desenvolvimento de novas e originais ferramentas terapêuticas (Camby I, Lemercier M, Lefranc F, Kiss R. 2006. Galectin-1: A small protein with major functions. Glycobiology. 16:137R-157R).
[00100] EXEMPLO 2
[00101] TESTE DE SEGURANÇA:
[00102] APLICAÇÃO IV
[00103] Objetivos
[00104] O presente experimento teve como objetivo avaliar por meio de exames clínicos e laboratoriais (hemograma, bioquímico, perfis renal e hepático) a segurança clínica da aplicação do secretoma de CTMs pela via intravenosa (IV) em cães.
[00105] Materiais e Métodos
[00106] Participaram do estudo oito cães. Todos os cães foram submetidos a exame clínico, hemograma e bioquímico antes do início do experimento.
[00107] Os animais receberam duas aplicações intravenosas, com intervalo de 15 dias entre elas, do concentrado de proteína (secretoma) derivado de CTMs. Para tanto, foi realizada tricotomia no local de aplicação e assepsia local com algodão embebido em álcool 70%. Antes da aplicação, foi canulada a veia cefálica do animal e engatado um equipo com solução salina tamponada. O frasco do produto foi previamente homogeneizado golpeando-se gentilmente com os dedos, observando-se a total suspensão do conteúdo; em seguida, foi retirado o lacre de alumínio, e o conteúdo removido com uma seringa e agulha, e aplicado diretamente no engate lateral do equipo.
[00108] O protocolo de exames clínicos e laboratoriais foi realizado da seguinte forma: aferição da frequência cardíaca (FC, em batimentos cardíacos por minuto - bpm), frequência respiratória (FR, em movimentos por minuto - mpm),FC e Pressão Arterial sistólica (PA, em mmHg, por Doppler) monitoradas durante todo o período e até 15 minutos após a aplicação; temperatura retal (TR, em °C), tempo de preenchimento capilar (TPC) e coloração de mucosas (oculopalpebrais e bucal); coleta de sangue venoso para Hemograma completo e Bioquímico nos momentos 0h, 24h e 7 dias da aplicação.
[00109] RESULTADOS E DISCUSSÃO
[00110] Não foram observadas, durante os exames clínicos gerais, anormalidades no comportamento, nos sistemas circulatório, digestório, linfático, locomotor, nervoso, respiratório, reprodutor, urinário e visual, bem como na semiologia da pele dos animais.
[00111] Não foi observada diferença estatística significativa (p<0,05) nos valores de frequência cardíaca e pressão arterial antes, durante e após cada uma das aplicações do secretoma de CTMs.
[00112] A partir dos valores obtidos nos exames clínicos e laboratoriais dos oito cães, foram realizadas médias aritméticas para cada parâmetro. Não foi observada diferença estatística (p<0,05) em nenhum dos parâmetros hematológicos e bioquímicos analisados.
[00113] A análise dos resultados, mostrou que tanto os valores hematológicos como os exames bioquímicos se encontram dentro dos padrões de referência para a espécie. Da mesma forma, não foram encontradas alterações na coloração de mucosas e nos valores de FC e PA, podendo-se afirmar que a aplicação endovenosa do Concentrado Proteico não levou a alterações significativas dos parâmetros avaliados pelo presente estudo.
[00114] Concluiu-se que a aplicação seriada de 6 mL de meio condicionado por CTMs pela via endovenosa mostrou ser um procedimento seguro que não leva a alterações sistêmicas deletérias. Este resultado indica a possibilidade da utilização deste composto para fins terapêuticos, desde que comprovada a sua eficácia.
[00115] Exemplo 3
[00116] SEGURANÇA CLÍNICA DO USO TÓPICO DE MC POR CTMS NA FORMA DE COLÍRIO
[00117] Objetivo
[00118] Avaliar a segurança clínica da invenção, administrado por via ocular tópica em cães, através deste estudo controlado.
[00119] Material e Métodos
[00120] Foram selecionados para o estudo 8 cães em bom estado nutricional, com idade entre 1 ano e 1 mês e 7 anos e 4 meses e peso corporal entre 10,3 e 36,4 quilogramas, sem histórico de doenças sistêmicas graves ou crônicas, e que não receberam qualquer tratamento medicamentoso nos últimos 15 dias que antecederam o início do estudo. Os cães selecionados foram submetidos a exames clínicos gerais e laboratoriais e exame do local de aplicação do produto, no dia que antecedeu a aplicação do produto.
[00121] Grupo tratado: os cães receberam, no olho direito, o produto veterinário investigacional na dose fixa de 2 gotas de CP-CTMs, administrado por via intra ocular tópica, 3 vezes ao dia durante 7 dias. Para tanto, o frasco do produto foi previamente homogeneizado golpeando-se gentilmente com os dedos, observando-se a total suspensão da solução; em seguida, foi retirado o lacre e o conteúdo foi pingado com conta-gotas próprio do frasco, observando-se o comportamento do cão (qualquer anormalidade seria relatada como evento adverso). O cão foi mantido em observação durante 15 minutos após o término da administração do produto, quando foram aferidas a frequência cardíaca, a pressão arterial, pressão intra-ocular (PIO) e realizado o teste de Schirmer. Os exames foram repetidos após 24hs, 72hs e 7 dias do início do tratamento. Os exames laboratoriais de hemograma e bioquímico do sangue foram colhidos logo antes do início do tratamento, após 24 horas e após 7 dias.
[00122] Controle: Os mesmos cães receberam, no olho esquerdo, o placebo (Solução fisiológica) na dose fixa de 2 gotas, administrado por via intra-ocular tópica, 3 vezes ao dia durante 7 dias. Foram realizados os mesmos exames antes do início do tratamento e nas datas subsequentes após este, de acordo com o calendário estabelecido para o grupo tratado.
[00123] Durante todo o período do estudo (desde a avaliação basal 1, até D7), os cães foram observados quanto ao estado geral de saúde. 4-Exame Oftalmologico
[00124] O exame oftálmico: teste de Schirmer (mm/min), pressão intra-ocular (PIO- mmHg), coloração do fluoresceína; presença e secreção, blefarospasmo, prurido, hiperemia, congestão, quemose, opacidade e fundoscopia, foram realizados nos momentos 0h, 24h, 96h e 7 dias após o início das aplicações.
[00125] Avaliação da Segurança do Produto Veterinário Investigacional
[00126] A segurança do produto veterinário investigacional foi avaliada comparando- se as variações nos parâmetros avaliados nos exames clínicos gerais, laboratoriais e nos exames do local de aplicação, bem como na temperatura retal e monitoramento de frequência cardíaca, respiratória, pressão arterial diastólica e sistólica, tempo de perfusão capilar e temperatura cutânea, durante a administração do produto veterinário investigacional e placebo, entre o momento 0 (antes da aplicação e os momentos após a aplicação). Os resultados obtidos também foram comparados a valores de referência espécie-específicos, e adequados para a faixa etária dos cães.
[00127] RESULTADOS E DISCUSSÃO
[00128] Exames Clínicos Gerais
[00129] Não foram observadas, durante os exames clínicos gerais, anormalidades no comportamento, nos sistemas circulatório, digestório, linfático, locomotor, nervoso, respiratório, reprodutor e urinário, bem como na semiologia da pele.
[00130] A Tabela 4 a seguir indica a média (erro padrão) para variáveis aferidas ao longo de 3 momentos:
[00132] Não houve diferenças estatísticas entre os momentos para nenhuma das variáveis descritas na tabela 4.
[00133] Ao analisar os resultados, observou-se que os valores hematológicos e bioquímicos do sangue se encontram dentro dos padrões de referência para a espécie, bem como a coloração de mucosas e os valores de FC e PA, podendo-se afirmar que a aplicação endovenosa do Concentrado Proteico não levou a alterações significativas dos parâmetros avaliados pelo presente estudo.
[00134] Exame do Local de Aplicação
[00135] Nenhum cão apresentou, no local de aplicação do produto veterinário investigacional e placebo, dor, eritema, prurido, edema, nódulo, ferida, abscesso, descamação de pele, alopecia, bem como qualquer outro tipo de anormalidade, durante todo o período experimental. Ao quinto dia, após o tratamento, foi observada uma diminuição significativa da pressão intra-ocular nos olhos que receberam o tratamento, em relação ao momento inicial. No entanto esta diminuição da PIO foi transitória, pois os valores deixaram de ser significativos aos 7 dias de tratamento. Por outro lado, os resultados da avaliação do teste de Schirmer não diferiram entre os olhos tratados e não, nem tão pouco entre os momentos.
[00136] A Tabela 5 indica a média (erro padrão) de teste de Schirmer e pressão intra-ocular (PIO) para olhos sob tratamento e controle ao longo dos momentos. Na Tabela 5 letras diferentes (ab) indicam diferença estatística (p<0,05) entre os momentos dentro do mesmo tratamento.
[00137] Concluiu-se que o produto veterinário investigacional, composto por concentrado proteico produzido por células tronco mesenquimais é seguro quando administrado em cães adultos saudáveis, na dose de duas gotas, 3 vezes ao dia por 7 dias, pela via intraocular tópica, não sendo observadas anormalidades em parâmetros clínicos ou laboratoriais, bem como no local de aplicação.
[00139] USO DO CONCENTRADO DE PROTEINAS E PEPTÍDEOS PARA O TRATAMENTO DE FERIDAS CUTANEAS - RESULTADOS PRELIMINARES
[00140] Quatro cães com feridas crônicas refratárias aos tratamentos convencionais, foram submetidos à aplicação de concentrado de proteínas derivadas de CTMs. As aplicações foram feitas em pontos distribuídos pela borda das feridas pela via subcutânea, cada ponto recebeu 0,5ml de MC por CTM. Foram feitas uma aplicação por semana durante 1-3 semanas. Logo após a primeira aplicação foi observado diminuição significativa da inflamação caracterizada por diminuição do tumor, rubor e exsudação da região; e aumento do tecido de granulação das feridas.
[00141] Após aplicações subsequentes foi observado início da epitelização das bordas da ferida com diminuição da sua extensão, como observados na Figura 11.
[00142] A cicatrização por segunda intenção pode ser dividida em quatro fases que podem ser observadas macroscopicamente, sendo elas: 1) fase inflamatória; 2) formação de granulação; 3) contração das bordas/ epitelização e 4) remodelamento. Muito embora a reparação comece precocemente no processo inflamatório, pela presença de macrófagos que fagocitam e digerem restos celulares presentes no local, a real atividade reparativa é atingida através da formação da granulação. Feridas crônicas permanecem na fase inflamatória, não permitindo ou retardando a proliferação de fibroblastos e epitelização. Através de estudos prévios qualificamos as proteínas presentes no CTM-PC constatando a presença de IL-10, VEGF, entre outros fatores importantes para cicatrização com efeitos anti-inflamatório, de angiogênese e de proliferação celular.
[00143] Dessa forma, concluímos que os fatores presentes no CTM- PC contribuíram para a modulação da resposta inflamatória crônica permitindo a evolução para as fases finais de granulação e epitelização da ferida, validando o seu uso em casos de difícil cicatrização.
[00144] O método de obtenção de concentrado de proteínas e peptídeos derivado de células estronais mesenquimais, de acordo com a presente invenção compreende as seguintes etapas: (a) seleção de tecido adiposo subcutâneo ou visceral de animal ou humano; (b) digestão em solução enzimática do tecido e suspensão celular para formação de pellet; (c) cultivo primário de células ocorre com troca do meio de cultivo a cada 72 h; (d) atingidos 80% de confluência o meio de cultivo é descartado e as células são ressuspendidas por ação enzimática; (e) as CTMs (células mesenquimais estromais) são caracterizadas pela sua capacidade de aderência ao plástico, pela expressão dos marcadores de superfície e pelo seu potencial de diferenciação; (f) as CTMs são criopreservadas em criotubos contendo aproximadamente 1 a 5 milhões de células/ criotubo; (g) re-cultivo das células ocorre por forma estática ou em meio agitado ou em biorreatores; (h) no re-cultivo são plaqueadas 4 a 8 milhões de células/1000cm2. (i) após confluência celular o meio de cultivo é substituído completamente por meio livre de proteína e fica em repouso por 24 a 94 , preferencialmente 24 a 72h; (j) então o sobrenadante livre de debris celulares é separado e congelado, obtendo-se assim um concentrado de proteínas e peptídeos apresentando de 1.200 a 2.500 μg de proteína total/ml do meio condicionado (MC).
[00145] Ao final o método é ficaz para obter um concentrado de proteínas e peptídeos compreendendo: 10 a 30μg de proteínas relacionadas a modulação da resposta imunológica como o Biglican (BGN), Galectinas (LGAL), versican (VCAN), anexina 1 e 2 (ANXA1 e ANXA2), reguladores da cascata de complemento (CD55 e CD59) e as proteínas SPARC e LTBP; 20 a 60μg de proteínas e peptídeos relacionadas a proliferação celular, com efeito antiapoptótico, antioxidante e angiogênico como o TGF-beta, IGF, TLBP, Galectinas (LGAL), Alfa2HS (AHSG), IGFBPs, cistatina (CSTB), SOD, Tireodoxina (TXN), decorina (DCN), vasorina (VASN), ANGPTL, SERPINA e VEGF; e 15 a 40μg de proteínas de ação cicatrizante e antifibrótico como os colágenos I, II, III e V (COL1A1, COL1A2, COL3 e COL5), elastina, actina G (ACTG1), fibronectina (FNPC1), lumican (LUM), fetuina B (FETUB), profilina (PFN1), periostina (POSTN), SPARC, HSPG, proteínas de matriz extra-celular (ECM1), matrix metaloproteinase 2 (MMP2), bem como inibidores de metaloproteinases (TIMP).
Claims (21)
1. Concentrado de proteínas e peptídeos derivados de células estronais mesenquimais caracterizado por ser obtido através de processo compreendendo as seguintes etapas: (a) seleção de tecido adiposo subcutâneo ou visceral de animal ou humano; (b) digestão em solução enzimática do tecido e suspensão celular para formação de pellet; (c) cultivo primário de células ocorre com troca do meio de cultivo a cada 72 h; (d) atingidos 80% de confluência o meio de cultivo é descartado e as células são ressuspendidas por ação enzimática; (e) as CTMs (células mesenquimais estromais) são caracterizadas pela sua capacidade de aderência ao plástico, pela expressão dos marcadores de superfície e pelo seu potencial de diferenciação; (f) as CTMs são criopreservadas em criotubos contendo aproximadamente 1 a 5 milhões de células/ criotubo; (g) re-cultivo das células ocorre por forma estática ou em meio agitado ou em biorreatores; (h) no re-cultivo são plaqueadas 4 a 8 milhões de células/1000cm2. (i) após confluência celular o meio de cultivo é substituído completamente por meio livre de proteína e fica em repouso por 24 a 96 h; (j) então o sobrenadante livre de debris celulares é separado e congelado, obtendo-se assim um concentrado de proteínas e peptídeos apresentando de 1.200 a 2.500 μg de proteína total/ml do meio condicionado (MC), sendo: (k) a 30μg de proteínas relacionadas a modulação da resposta imunológica como o Biglican (BGN), Galectinas (LGAL), versican (VCAN), anexina 1 e 2 (ANXA1 e ANXA2), reguladores da cascata de complemento (CD55 e CD59) e as proteínas SPARC e LTBP; (l) a 60μg de proteínas e peptídeos relacionadas a proliferação celular, com efeito antiapoptótico, antioxidante e angiogenico como o TGF-beta, IGF, TLBP, Galectinas (LGAL), Alfa2HS (AHSG), IGFBPs, cistatina (CSTB), SOD, Tireodoxina (TXN), decorina (DCN), vasorina (VASN), ANGPTL, SERPINA e VEGF; e (m) a 40μg de proteínas de ação cicatrizante e antifibrótico como os colágenos I, II, III e V (COL1A1, COL1A2, COL3 e COL5), elastina, actina G (ACTG1), fibronectina (FNPC1), lumican (LUM), fetuina B (FETUB), profilina (PFN1), periostina (POSTN), SPARC, HSPG, proteínas de matriz extra-celular (ECM1), matrix metaloproteinase 2 (MMP2), bem como inibidores de metaloproteinases (TIMP).
2. Concentrado de proteínas e peptídeos derivados de células estronais mesenquimais, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por as células para produção do concentrado serem de origem mesenquimal obtidas de diversos tecidos animais como o adiposo subcutâneo ou visceral, sangue de medula óssea e/ou do cordão umbilical e tecidos placentários entre outros, de espécies de mamíferos domésticos (cão, gato, cavalo, boi, ovelha, cabra, coelho, alpaca), bem como da espécie humana.
3. Concentrado de proteínas e peptídeos derivados de células estronais mesenquimais, de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por o sangue ser submetido a agente anticoagulante e separado por gradiente de densidade, as células serem digeridas em solução enzimática; e a suspensão celular submetida à centrifugação formando um pellet, o qual é ressuspendido no meio de cultivo.
4. Concentrado de proteínas e peptídeos derivados de células estronais mesenquimais, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por empregar colagenase a temperatura entre 30 e 44 oC.
5. Concentrado de proteínas e peptídeos derivados de células estronais mesenquimais, de acordo com a reivindicação 2 e 3, caracterizado por após confluência de 80 % ou etapa (d) as células serem ressuspendidas por ação enzimática da tripsina.
6. Concentrado de proteínas e peptídeos derivados de células estronais mesenquimais, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por após a produção do meio condicionado (MC), as células poderem ser reutilizadas, ou armazenadas em banco de células, para uso futuro.
7. Concentrado de proteínas e peptídeos derivados de células estronais mesenquimais, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por as células tripsinizadas serem acondicionadas em meio crioprotetor compreendendo SFB (serum fetal bovino) e dimetilsulfóxido para a formação do banco de células.
8. Concentrado de proteínas e peptídeos derivados de células estronais mesenquimais, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a etapa (e) ou recultivo celular ser realizado em sistemas bidimensionais multicamadas ou tridimensionais, em presença de substratos, podendo ser em sistema estático ou em cultivo agitado.
9. Concentrado de proteínas e peptídeos derivados de células estronais mesenquimais, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por as condições de cultivo utilizadas para produção do concentrado poderem ser modificadas para modular a produção das proteínas e peptídeos, as células podendo ser cultivadas com diferentes concentrações de nutrientes, em diferentes atmosferas, em monocamadas (cultivo em 2D) ou em cultivo tridimensional (3D) adicionado ou não de substratos e contendo um ou mais antimicrobianos ou moduladores do metabolismo celular.
10. Concentrado de proteínas e peptídeos derivados de células estronais mesenquimais, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por na etapa (e) o cultivo em meio agitado ocorrer em presença de microcarregadores, sendo as células plaqueadas em meio contendo os ditos microcarregadores.
11. Concentrado de proteínas e peptídeos derivados de células estronais mesenquimais, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por os microcarregadores serem de gelatina de origem natural ou sintética, e de formato esférico podendo ser porosos ou sólidos.
12. Concentrado de proteínas e peptídeos derivados de células estronais mesenquimais, de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado por durante a etapa (e) a agitação inicial ser intermitente por período de 4 a 10 horas, sendo que após esse período o volume de meio é dobrado e após 24 horas completa-se para o volume final.
13. Concentrado de proteínas e peptídeos derivados de células estronais mesenquimais, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser obtido através de processo compreendendo as seguintes etapas: (a) seleção de tecido adiposo subcutâneo ou visceral de animal ou humano; (b) digestão em solução enzimática do tecido e suspensão celular para formação de pellet; (c) cultivo primário de células ocorre com troca do meio de cultivo a cada 72 h; (d) atingidos 80% de confluência o meio de cultivo é descartado e as células são ressuspendidas por ação enzimática de tripsina; (e) as CTMs (células mesenquimais estromais) são caracterizadas pela sua capacidade de aderência ao plástico, pela expressão dos marcadores de superfície e pelo seu potencial de diferenciação; (f) as CTMs são criopreservadas em criotubos contendo aproximadamente 1 a 5 milhões de células/ criotubo; (g) as células são criopreservadas em meio compreendendo SFB (sérum bovino fetal) e DMSO (dimetilsufóxido); (h) re-cultivo das células ocorre por forma estática ou em meio agitado ou em biorreatores; (i) no re-cultivo são plaqueadas 4 a 8 milhões de células/1000cm2, (j) após confluência celular o meio de cultivo é substituído completamente por meio livre de proteína e fica em cultivo por 24 a 72 h; (k) então o sobrenadante livre de debris celulares é separado e congelado, obtendo-se assim um concentrado de proteínas e peptídeos apresentando de 1.200 a 2.500 μg de proteína total/ml do meio condicionado (MC), sendo: 10 a 30μg de proteínas relacionadas a modulação da resposta imunológica como o Biglican (BGN), Galectinas (LGAL), versican (VCAN), anexina 1 e 2 (ANXA1 e ANXA2), reguladores da cascata de complemento (CD55 e CD59) e as proteínas SPARC e LTBP; 20 a 60μg de proteínas e peptídeos relacionadas a proliferação celular, com efeito antiapoptótico, antioxidante e angiogenico como o TGF-beta, IGF, TLBP, Galectinas (LGAL), Alfa2HS (AHSG), IGFBPs, cistatina (CSTB), SOD, Tireodoxina (TXN), decorina (DCN), vasorina (VASN), ANGPTL, SERPINA e VEGF; e 15 a 40μg de proteínas de ação cicatrizante e antifibrótico como os colágenos I, II, III e V (COL1A1, COL1A2, COL3 e COL5), elastina, actina G (ACTG1), fibronectina (FNPC1), lumican (LUM), fetuina B (FETUB), profilina (PFN1), periostina (POSTN), SPARC, HSPG, proteínas de matriz extra-celular (ECM1), matrix metaloproteinase 2 (MMP2), bem como inibidores de metaloproteinases (TIMP).
14. Concentrado de proteínas e peptídeos derivados de células estronais mesenquimais, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o concentrado de proteínas e peptídeos obtido poder se apresentar no estado congelado, ou resfriada, ou liofilizado, ou desidratado, ou líquido, ou sólido, para uso tópico ou oral, ou ainda se apresentar na forma de cápsulas, ou comprimidos, ou injetáveis.
15. Concentrado de proteínas e peptídeos derivados de células estronais mesenquimais, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por apresentar aplicação humana ou veterinária.
16. Método de obtenção de concentrado de proteínas e peptídeos derivados de células estronais mesenquimais, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por compreender as seguintes etapas: (a) seleção de tecido adiposo subcutâneo ou visceral de animal ou humano; (b) digestão em solução enzimática do tecido e suspensão celular para formação de pellet; (c) cultivo primário de células ocorre com troca do meio de cultivo a cada 72 h; (d) atingidos 80% de confluência o meio de cultivo é descartado e as células são ressuspendidas por ação enzimática; (e) as CTMs (células mesenquimais estromais) são caracterizadas pela sua capacidade de aderência ao plástico, pela expressão dos marcadores de superfície e pelo seu potencial de diferenciação; (f) as CTMs são criopreservadas em criotubos contendo aproximadamente 1 a 5 milhões de células/ criotubo; (g) re-cultivo das células ocorre por forma estática ou em meio agitado ou em biorreatores; (h) no re-cultivo são plaqueadas 4 a 8 milhões de células/1000cm2. (i) após confluência celular o meio de cultivo é substituído completamente por meio livre de proteína e fica em repouso por 24 a 96 h; (j) então o sobrenadante livre de debris celulares é separado e congelado, obtendo-se assim um concentrado de proteínas e peptídeos apresentando de 1.200 a 2.500 μg de proteína total/ml do meio condicionado (MC).
17. Método de obtenção de concentrado de proteínas e peptídeos derivados de células estronais mesenquimais, de acordo a reivindicação 16, caracterizado por obter ao final um concentrado de proteínas e peptídeos compreendendo: 10 a 30μg de proteínas relacionadas a modulação da resposta imunológica como o Biglican (BGN), Galectinas (LGAL), versican (VCAN), anexina 1 e 2 (ANXA1 e ANXA2), reguladores da cascata de complemento (CD55 e CD59) e as proteínas SPARC e LTBP; 20 a 60μg de proteínas e peptídeos relacionadas a proliferação celular, com efeito antiapoptótico, antioxidante e angiogênico como o TGF-beta, IGF, TLBP, Galectinas (LGAL), Alfa2HS (AHSG), IGFBPs, cistatina (CSTB), SOD, Tireodoxina (TXN), decorina (DCN), vasorina (VASN), ANGPTL, SERPINA e VEGF; e 15 a 40μg de proteínas de ação cicatrizante e antifibrótico como os colágenos I, II, III e V (COL1A1, COL1A2, COL3 e COL5), elastina, actina G (ACTG1), fibronectina (FNPC1), lumican (LUM), fetuina B (FETUB), profilina (PFN1), periostina (POSTN), SPARC, HSPG, proteínas de matriz extra-celular (ECM1), matrix metaloproteinase 2 (MMP2), bem como inibidores de metaloproteinases (TIMP).
18. Uso de concentrado de proteínas e peptídeos derivados de células estronais mesenquimais, obtido de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por destinar-se aos animais ou humanos em tratamento de doenças neurológicas, osteoarticulares, dermatológicas, oftálmicas, do sistema imune, do sistema urinário, do sistema digestivo e do aparelho reprodutor.
19. Uso de concentrado de proteínas e peptídeos derivados de células estronais mesenquimais, obtido de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por ser utilizado ainda para tratamento cosmético, crescimento capilar e associado a colas cirúrgicas, biopolímeros ou biogéis, podendo ocorrer através de aplicações endovenosas, subcutânea, intra-articulares, oculares, intra-testiculares, intra- ovariana, intra-uterina e intra-mamária, injetável, tópica ou oral, em sua forma pura ou microcapsulada.
20. Uso de concentrado de proteínas e peptídeos derivados de células estronais mesenquimais, obtido de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por ser utilizado na concentração de 2 a 100%, associado à um ou mais agente antimicrobiano, regulador do metabolismo celular e/ou substância que aumente a absorção celular.
21. Uso de concentrado de proteínas e peptídeos derivados de células estronais mesenquimais, obtido de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o dito concentrado poder ser utilizado como meio de cultivo celular, bem como de criopreservação de células, associado a crioprotetores, açúcares e macromoléculas inertes.
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