JP2015230222A - 皮膚バリア機能促進剤のスクリーニング方法 - Google Patents
皮膚バリア機能促進剤のスクリーニング方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2015230222A JP2015230222A JP2014116066A JP2014116066A JP2015230222A JP 2015230222 A JP2015230222 A JP 2015230222A JP 2014116066 A JP2014116066 A JP 2014116066A JP 2014116066 A JP2014116066 A JP 2014116066A JP 2015230222 A JP2015230222 A JP 2015230222A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- pnpla1
- test substance
- gene
- skin
- ceramide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 230000008591 skin barrier function Effects 0.000 title claims abstract description 143
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 113
- 238000012216 screening Methods 0.000 title claims abstract description 36
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 235
- 229940106189 ceramide Drugs 0.000 claims abstract description 200
- YDNKGFDKKRUKPY-JHOUSYSJSA-N C16 ceramide Natural products CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)N[C@@H](CO)[C@H](O)C=CCCCCCCCCCCCCC YDNKGFDKKRUKPY-JHOUSYSJSA-N 0.000 claims abstract description 163
- ZVEQCJWYRWKARO-UHFFFAOYSA-N ceramide Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)C(=O)NC(CO)C(O)C=CCCC=C(C)CCCCCCCCC ZVEQCJWYRWKARO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 163
- VVGIYYKRAMHVLU-UHFFFAOYSA-N newbouldiamide Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)C(O)C(O)C(CO)NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC VVGIYYKRAMHVLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 163
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 128
- 101100244206 Homo sapiens PNPLA1 gene Proteins 0.000 claims abstract description 111
- 101001129191 Homo sapiens Omega-hydroxyceramide transacylase Proteins 0.000 claims abstract description 78
- 102100031247 Omega-hydroxyceramide transacylase Human genes 0.000 claims abstract description 75
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 claims abstract description 51
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 39
- -1 acyl ceramide Chemical compound 0.000 claims abstract description 37
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 27
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 14
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 198
- CRJGESKKUOMBCT-VQTJNVASSA-N N-acetylsphinganine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCC[C@@H](O)[C@H](CO)NC(C)=O CRJGESKKUOMBCT-VQTJNVASSA-N 0.000 claims description 143
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 112
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 claims description 81
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 68
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 52
- 235000020778 linoleic acid Nutrition 0.000 claims description 47
- OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N linoleic acid Natural products CCCCC\C=C/C\C=C\CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N 0.000 claims description 47
- OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N Linoleic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N 0.000 claims description 44
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims description 40
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 32
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 30
- 238000002493 microarray Methods 0.000 claims description 26
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 20
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims description 19
- 101150036692 Abhd5 gene Proteins 0.000 claims description 16
- 101150078190 Ugcg gene Proteins 0.000 claims description 16
- 101100383240 Xenopus laevis ugcg-a gene Proteins 0.000 claims description 16
- 101100383241 Xenopus laevis ugcg-b gene Proteins 0.000 claims description 16
- 206010012438 Dermatitis atopic Diseases 0.000 claims description 15
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 claims description 15
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 15
- 101150053849 ALOXE3 gene Proteins 0.000 claims description 14
- 101150076123 Alox12b gene Proteins 0.000 claims description 14
- 206010021198 ichthyosis Diseases 0.000 claims description 13
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 11
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims description 10
- 206010013786 Dry skin Diseases 0.000 claims description 9
- 230000037336 dry skin Effects 0.000 claims description 9
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 claims description 6
- 239000013068 control sample Substances 0.000 claims description 6
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 claims description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 5
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 claims description 4
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 claims description 4
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 claims description 3
- 208000001126 Keratosis Diseases 0.000 claims description 3
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 22
- 238000005070 sampling Methods 0.000 abstract 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 103
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 102
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 72
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 69
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 48
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 48
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 44
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 36
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 35
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 35
- 210000000434 stratum corneum Anatomy 0.000 description 35
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 150000001783 ceramides Chemical class 0.000 description 26
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 24
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 23
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 23
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 21
- 101100244207 Mus musculus Pnpla1 gene Proteins 0.000 description 20
- 101150081747 Pnpla1 gene Proteins 0.000 description 20
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 20
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 19
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 19
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 18
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 18
- 241000894007 species Species 0.000 description 18
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 17
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 17
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 17
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 17
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 16
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 15
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 15
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 14
- 210000005175 epidermal keratinocyte Anatomy 0.000 description 14
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 13
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 12
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 102100028314 Filaggrin Human genes 0.000 description 11
- 101710088660 Filaggrin Proteins 0.000 description 11
- 102100031784 Loricrin Human genes 0.000 description 11
- 108010079309 loricrin Proteins 0.000 description 11
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 11
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 11
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 10
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 10
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 10
- 230000005068 transpiration Effects 0.000 description 10
- MIUIRGGKIICMBP-NFOZDHADSA-N [27-oxo-27-[[(2s,3s,4r)-1,3,4-trihydroxyoctadecan-2-yl]amino]heptacosyl] octadecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)N[C@@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)CCCCCCCCCCCCCC MIUIRGGKIICMBP-NFOZDHADSA-N 0.000 description 9
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 9
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 9
- 230000006870 function Effects 0.000 description 9
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 8
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 8
- 229940048864 ceramide 1 Drugs 0.000 description 8
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 8
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 8
- 229940099417 ceramide 2 Drugs 0.000 description 7
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 7
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 7
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 7
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 6
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101000909110 Homo sapiens Ultra-long-chain fatty acid omega-hydroxylase Proteins 0.000 description 6
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 102100024915 Ultra-long-chain fatty acid omega-hydroxylase Human genes 0.000 description 6
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 6
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 6
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 6
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 6
- 150000002305 glucosylceramides Chemical class 0.000 description 6
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 6
- DLBFLQKQABVKGT-UHFFFAOYSA-L lucifer yellow dye Chemical compound [Li+].[Li+].[O-]S(=O)(=O)C1=CC(C(N(C(=O)NN)C2=O)=O)=C3C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC3=C1N DLBFLQKQABVKGT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 6
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WWUZIQQURGPMPG-KRWOKUGFSA-N sphingosine Chemical group CCCCCCCCCCCCC\C=C\[C@@H](O)[C@@H](N)CO WWUZIQQURGPMPG-KRWOKUGFSA-N 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 101150058971 KRT10 gene Proteins 0.000 description 5
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 210000000736 corneocyte Anatomy 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 5
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 5
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 5
- 108010051219 Cre recombinase Proteins 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101150037996 KRT5 gene Proteins 0.000 description 4
- 101150056422 Krt1 gene Proteins 0.000 description 4
- ATGQXSBKTQANOH-UWVGARPKSA-N N-oleoylphytosphingosine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)NC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC ATGQXSBKTQANOH-UWVGARPKSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 235000011054 acetic acid Nutrition 0.000 description 4
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 4
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 4
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N ether Substances CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 4
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- VOFUROIFQGPCGE-UHFFFAOYSA-N nile red Chemical compound C1=CC=C2C3=NC4=CC=C(N(CC)CC)C=C4OC3=CC(=O)C2=C1 VOFUROIFQGPCGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 4
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 4
- 229940033329 phytosphingosine Drugs 0.000 description 4
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 4
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 4
- 229950003937 tolonium Drugs 0.000 description 4
- HNONEKILPDHFOL-UHFFFAOYSA-M tolonium chloride Chemical compound [Cl-].C1=C(C)C(N)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 HNONEKILPDHFOL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- OYHQOLUKZRVURQ-NTGFUMLPSA-N (9Z,12Z)-9,10,12,13-tetratritiooctadeca-9,12-dienoic acid Chemical compound C(CCCCCCC\C(=C(/C\C(=C(/CCCCC)\[3H])\[3H])\[3H])\[3H])(=O)O OYHQOLUKZRVURQ-NTGFUMLPSA-N 0.000 description 3
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 3
- 206010012442 Dermatitis contact Diseases 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101150003028 Hprt1 gene Proteins 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101150040052 KRT14 gene Proteins 0.000 description 3
- 102100023970 Keratin, type I cytoskeletal 10 Human genes 0.000 description 3
- 102100022905 Keratin, type II cytoskeletal 1 Human genes 0.000 description 3
- 102100025756 Keratin, type II cytoskeletal 5 Human genes 0.000 description 3
- 108010070514 Keratin-1 Proteins 0.000 description 3
- 108010065038 Keratin-10 Proteins 0.000 description 3
- 108010070553 Keratin-5 Proteins 0.000 description 3
- KSVODRGOBYCXKF-HFBOQBPWSA-N N-(omega-hydroxytriacontanoyl)sphingosine Chemical compound CCCCCCCCCCCCC\C=C\[C@@H](O)[C@H](CO)NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCO KSVODRGOBYCXKF-HFBOQBPWSA-N 0.000 description 3
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010040844 Skin exfoliation Diseases 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 101150039702 TGM1 gene Proteins 0.000 description 3
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 3
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 3
- 239000011449 brick Substances 0.000 description 3
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 3
- 208000010247 contact dermatitis Diseases 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N dihydroxy(oxo)silane Chemical compound O[Si](O)=O IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 3
- 235000004626 essential fatty acids Nutrition 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 3
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 3
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 3
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 150000002430 hydrocarbons Chemical group 0.000 description 3
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 102000007236 involucrin Human genes 0.000 description 3
- 108010033564 involucrin Proteins 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 3
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 3
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 3
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 3
- 231100000245 skin permeability Toxicity 0.000 description 3
- OTKJDMGTUTTYMP-ZWKOTPCHSA-N sphinganine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCC[C@@H](O)[C@@H](N)CO OTKJDMGTUTTYMP-ZWKOTPCHSA-N 0.000 description 3
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 3
- 230000036572 transepidermal water loss Effects 0.000 description 3
- 150000004669 very long chain fatty acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 3
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trimethyl-N-[3-(trifluoromethyl)phenyl]benzenesulfonamide Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C)=C1S(=O)(=O)NC1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010003645 Atopy Diseases 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 239000004322 Butylated hydroxytoluene Substances 0.000 description 2
- NLZUEZXRPGMBCV-UHFFFAOYSA-N Butylhydroxytoluene Chemical compound CC1=CC(C(C)(C)C)=C(O)C(C(C)(C)C)=C1 NLZUEZXRPGMBCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 2
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 102100040445 Keratin, type I cytoskeletal 14 Human genes 0.000 description 2
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N Methanesulfonic acid Chemical compound CS(O)(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BBAFBDLICMHBNU-MFZOPHKMSA-N N-(2-hydroxyoctadecanoyl)-4-hydroxysphinganine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCC(O)C(=O)N[C@@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)CCCCCCCCCCCCCC BBAFBDLICMHBNU-MFZOPHKMSA-N 0.000 description 2
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 2
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 description 2
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101001010097 Shigella phage SfV Bactoprenol-linked glucose translocase Proteins 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 235000010724 Wisteria floribunda Nutrition 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 210000000593 adipose tissue white Anatomy 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N all-trans-retinol Chemical compound OC\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000002585 base Substances 0.000 description 2
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000000476 body water Anatomy 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 description 2
- 235000010354 butylated hydroxytoluene Nutrition 0.000 description 2
- 229940095259 butylated hydroxytoluene Drugs 0.000 description 2
- 229940044176 ceramide 3 Drugs 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 2
- 108010007093 dispase Proteins 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 238000004299 exfoliation Methods 0.000 description 2
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 2
- 230000008713 feedback mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 2
- 125000002519 galactosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 2
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 2
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 2
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 2
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 2
- 210000004565 granule cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 150000002402 hexoses Chemical class 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 2
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000003020 moisturizing effect Effects 0.000 description 2
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 2
- 239000012120 mounting media Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 2
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 2
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 125000001805 pentosyl group Chemical group 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 2
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 230000004137 sphingolipid metabolism Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 2
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 2
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 2
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 2
- 239000006200 vaporizer Substances 0.000 description 2
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 2
- WWUZIQQURGPMPG-UHFFFAOYSA-N (-)-D-erythro-Sphingosine Natural products CCCCCCCCCCCCCC=CC(O)C(N)CO WWUZIQQURGPMPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N (2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-amino-4,5-dihydroxy-6-[(1r)-1-hydroxyethyl]oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]([C@@H](C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N 0.000 description 1
- BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N (S)-malic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- HBOQXIRUPVQLKX-BBWANDEASA-N 1,2,3-trilinoleoylglycerol Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCC\C=C/C\C=C/CCCCC)COC(=O)CCCCCCC\C=C/C\C=C/CCCCC HBOQXIRUPVQLKX-BBWANDEASA-N 0.000 description 1
- WRGQSWVCFNIUNZ-GDCKJWNLSA-N 1-oleoyl-sn-glycerol 3-phosphate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@@H](O)COP(O)(O)=O WRGQSWVCFNIUNZ-GDCKJWNLSA-N 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 13-cis retinol Natural products OCC=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 3-azaniumyl-2-hydroxypropanoate Chemical compound NCC(O)C(O)=O BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030560 Abnormality of the skin Diseases 0.000 description 1
- 102000006772 Acid Ceramidase Human genes 0.000 description 1
- 108020005296 Acid Ceramidase Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 229930091051 Arenine Natural products 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 description 1
- OTWWBVHZYCZNCB-LLVSGNJRSA-N C(CCCCCCCCCCCCCCCCC)(=O)OCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)C(O)[C@H](N)[C@H](O)[C@H](O)CCCCCCCCCCCCCC Chemical group C(CCCCCCCCCCCCCCCCC)(=O)OCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)C(O)[C@H](N)[C@H](O)[C@H](O)CCCCCCCCCCCCCC OTWWBVHZYCZNCB-LLVSGNJRSA-N 0.000 description 1
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 1
- 101100408437 Caenorhabditis elegans ipla-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- BHYOQNUELFTYRT-UHFFFAOYSA-N Cholesterol sulfate Natural products C1C=C2CC(OS(O)(=O)=O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)CCCC(C)C)C1(C)CC2 BHYOQNUELFTYRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000725101 Clea Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- AERBNCYCJBRYDG-UHFFFAOYSA-N D-ribo-phytosphingosine Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)C(O)C(N)CO AERBNCYCJBRYDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 206010058314 Dysplasia Diseases 0.000 description 1
- 206010014935 Enzyme abnormality Diseases 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 208000010201 Exanthema Diseases 0.000 description 1
- 239000004606 Fillers/Extenders Substances 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108010066321 Keratin-14 Proteins 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YDNKGFDKKRUKPY-TURZORIXSA-N N-hexadecanoylsphingosine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)N[C@@H](CO)[C@H](O)\C=C\CCCCCCCCCCCCC YDNKGFDKKRUKPY-TURZORIXSA-N 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 102000007399 Nuclear hormone receptor Human genes 0.000 description 1
- 108020005497 Nuclear hormone receptor Proteins 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 101710091688 Patatin Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 1
- 102000003728 Peroxisome Proliferator-Activated Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000029 Peroxisome Proliferator-Activated Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000011755 Phosphoglycerate Kinase Human genes 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Propanedioic acid Natural products OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 208000006981 Skin Abnormalities Diseases 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric acid Natural products [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 101001099217 Thermotoga maritima (strain ATCC 43589 / DSM 3109 / JCM 10099 / NBRC 100826 / MSB8) Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 206010048218 Xeroderma Diseases 0.000 description 1
- GCDXVKZXCQGDHC-BLCQCPAESA-N [30-oxo-30-[[(2s,3s,4r)-1,3,4-trihydroxyoctadecan-2-yl]amino]triacontyl] (9z,12z)-octadeca-9,12-dienoate Chemical class CCCCCCCCCCCCCC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCOC(=O)CCCCCCC\C=C/C\C=C/CCCCC GCDXVKZXCQGDHC-BLCQCPAESA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N alpha-glycerophosphate Natural products OCC(O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxysuccinic acid Natural products OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000013321 baculovirus-insect cell expression system Methods 0.000 description 1
- 210000000270 basal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003796 beauty Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- SRSXLGNVWSONIS-UHFFFAOYSA-N benzenesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 SRSXLGNVWSONIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940092714 benzenesulfonic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010233 benzoic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000012742 biochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 239000001055 blue pigment Substances 0.000 description 1
- 101710097260 cGAMP-activated phospholipase Proteins 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000004568 cement Substances 0.000 description 1
- BHYOQNUELFTYRT-DPAQBDIFSA-N cholesterol sulfate Chemical compound C1C=C2C[C@@H](OS(O)(=O)=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 BHYOQNUELFTYRT-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 235000015165 citric acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 1
- OTKJDMGTUTTYMP-UHFFFAOYSA-N dihydrosphingosine Natural products CCCCCCCCCCCCCCCC(O)C(N)CO OTKJDMGTUTTYMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 231100001129 embryonic lethality Toxicity 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SEACYXSIPDVVMV-UHFFFAOYSA-L eosin Y Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C([O-])=C(Br)C=C21 SEACYXSIPDVVMV-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000008556 epithelial cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000009786 epithelial differentiation Effects 0.000 description 1
- 201000005884 exanthem Diseases 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- SVWLIIFHXFGESG-UHFFFAOYSA-N formic acid;methanol Chemical compound OC.OC=O SVWLIIFHXFGESG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 239000001530 fumaric acid Substances 0.000 description 1
- 235000011087 fumaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 239000006451 grace's insect medium Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 235000013402 health food Nutrition 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 230000003780 keratinization Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- HBOQXIRUPVQLKX-UHFFFAOYSA-N linoleic acid triglyceride Natural products CCCCCC=CCC=CCCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCC=CCC=CCCCCC)COC(=O)CCCCCCCC=CCC=CCCCCC HBOQXIRUPVQLKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002669 linoleoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])/C([H])=C([H])\C([H])([H])/C([H])=C([H])\C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- YECLLIMZHNYFCK-RRNJGNTNSA-N linoleoyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CCCCCCC\C=C/C\C=C/CCCCC)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 YECLLIMZHNYFCK-RRNJGNTNSA-N 0.000 description 1
- 125000005645 linoleyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003473 lipid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000037356 lipid metabolism Effects 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 150000004668 long chain fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 210000004880 lymph fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 1
- 239000011976 maleic acid Substances 0.000 description 1
- 239000001630 malic acid Substances 0.000 description 1
- 235000011090 malic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 230000007721 medicinal effect Effects 0.000 description 1
- 229940098779 methanesulfonic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- IFSXZLJQEKGQAF-UHFFFAOYSA-M nuclear fast red Chemical compound [Na+].O=C1C2=CC=CC=C2C(=O)C2=C1C(O)=C(S([O-])(=O)=O)C(O)=C2N IFSXZLJQEKGQAF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108020004017 nuclear receptors Proteins 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 229950000964 pepstatin Drugs 0.000 description 1
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 1
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000000206 photolithography Methods 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- AERBNCYCJBRYDG-KSZLIROESA-N phytosphingosine group Chemical group OC[C@H](N)[C@H](O)[C@H](O)CCCCCCCCCCCCCC AERBNCYCJBRYDG-KSZLIROESA-N 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 239000000419 plant extract Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Substances [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 206010037844 rash Diseases 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 229960003471 retinol Drugs 0.000 description 1
- 235000020944 retinol Nutrition 0.000 description 1
- 239000011607 retinol Substances 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 150000003408 sphingolipids Chemical class 0.000 description 1
- 150000003410 sphingosines Chemical class 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 239000012128 staining reagent Substances 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 239000010902 straw Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 description 1
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000006276 transfer reaction Methods 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- 229940081852 trilinolein Drugs 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 1
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 230000037330 wrinkle prevention Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【解決手段】
PNPLA1遺伝子を有する細胞または非ヒト動物に被検物質を投与し、当該被検物質投与後に皮膚バリア機能の促進効果、アシルセラミドの増加もしくはPNPLA1遺伝子の発現の増加が得られたときは、当該被検物質を皮膚バリア機能促進剤または皮膚疾患治療薬として選択する工程を含む、皮膚バリア機能促進剤または皮膚疾患治療薬のスクリーニング方法。ω-ヒドロキシセラミドにPNPLA1を作用させた後、アシルセラミドを採取することを特徴とするアシルセラミドの製造方法。
【選択図】なし
Description
角質細胞間に分泌されたアシルセラミドは、ω位で加水分解されてリノール酸が外れた後、周辺帯を構成するタンパク質のグルタミン酸残基やグルタミン残基とエステル結合するω-ヒドロキシセラミドとなる。さらに酸性セラミダーゼにより加水分解されてスフィンゴシン骨格が遊離すると、ω位でエステル結合したω-ヒドロキシ極超長鎖脂肪酸となる。これらの周辺帯とエステル結合で共有結合したω-OHセラミドとω-OH脂肪酸は角化細胞表面でCLEを構成し、角化細胞と角質細胞間脂質を強固に結合する。
J Invest Dermatol. 96:523-526, 1991(非特許文献4)、Arch Dermatol Res. 283:219-223,1991(非特許文献5)は、「アトピー性皮膚炎や老人性乾皮症におけるセラミド量の減少」について、J Dermatol Sci. 1:79-83, 1990(非特許文献6)、Acta Derm Venereol. 74:337-340, 1994(非特許文献7)は、「セラミド量の減少と脂質代謝酵素異常」について、Contact Dermatitis. 45:280-285, 2001(非特許文献8)、J Eur Acad Dermatol Venereol. 16:587-594, 2002(非特許文献9)は、「セラミドによるバリア機能の回復」について開示している。
現在、化粧料や皮膚外用剤の配合に使用されているセラミドの多くはセラミド2(NSまたは単にセラミドとも呼ぶ)である。セラミド2はω-OHセラミド(ω-ヒドロキシセラミド)の前駆体であり、上述のように、皮膚バリア機能の回復や増強にはアシルセラミドの存在が不可欠であるため、単にセラミド類を投与するだけでは不十分で、投与されたセラミド2がω-OHセラミドを経て、角質細胞間脂質やCLEの最重要成分であるアシルセラミドに効率的に代謝されることが必要である。
Ca2+非依存性ホスホリパーゼA2/PNPLA (Patatin-like phospholipaseまたはPatain-like phospholipase domain containing)ファミリーに属するPNPLA1の遺伝子変異によって、ヒトとイヌにおいて魚鱗癬を発症することが報告されたが(非特許文献3)、この分子の生理機能や変異による魚鱗癬発症のメカニズムは不明であった。PNPLAファミリーには9種の分子種が存在し、patatinドメインと呼ばれる触媒ドメインを共通に持つことが特徴である(図2、非特許文献13)。このファミリーに属する分子は、様々な脂質の代謝、例えばリン脂質、リゾリン脂質、トリグリセリド、レチノイドエステルの加水分解や、レチノール、リゾホスファチジン酸への脂肪酸転移反応に関与することが報告されている。
(1)PNPLA1遺伝子が欠損した非ヒト動物に被検物質を投与し、当該被検物質投与後の前記非ヒト動物において皮膚バリア機能の促進効果が得られたときは、当該被検物質を皮膚バリア機能促進剤として選択する工程を含む、皮膚バリア機能促進剤のスクリーニング方法。
(2)PNPLA1遺伝子を有する非ヒト動物に被検物質を投与し、当該被検物質投与後の前記非ヒト動物においてPNPLA1の発現量、又はω位にリノール酸がエステル結合したアシルセラミドの量が増加したときは、当該被検物質を皮膚バリア機能促進剤として選択する工程を含む、皮膚バリア機能促進剤のスクリーニング方法。
(3)PNPLA1遺伝子を有する細胞、又はPNPLA1遺伝子を有する非ヒト動物から採取された生体材料に被検物質を接触させた後、ω位にリノール酸がエステル結合したアシルセラミドを検出し、得られる検出結果を指標として皮膚バリア機能の促進物質を選択する工程を含む、皮膚バリア機能促進剤のスクリーニング方法。
(4) ω位にリノール酸がエステル結合したアシルセラミドが、被検物質を接触させない対照の細胞又は生体材料と比較して増加したときは、当該被検物質を皮膚バリア機能促進剤として選択する、(3)に記載の方法。
(5)PNPLA1遺伝子を有する細胞、又はPNPLA1遺伝子を有する非ヒト動物から採取された生体材料に被検物質を接触させた後にPNPLA1の発現量、又はセラミド代謝関連遺伝子の発現量を測定し、得られる測定結果を指標として皮膚バリア機能の促進物質を選択する工程を含む、皮膚バリア機能促進剤のスクリーニング方法。
(6)PNPLA1の発現量が、被検物質を接触させない対照の細胞又は生体材料と比較して増加したときは、当該被検物質を皮膚バリア機能促進剤として選択する、(5)に記載の方法。
(7)セラミド代謝関連遺伝子が、Elovl4、Lass3、Cyp4f39、Ugcg、Abca12、Gba、Abhd5、Aloxe3及びAlox12bからなる群から選ばれる少なくとも1つである(5)に記載の方法。
(8)セラミド代謝関連遺伝子の発現量が、被検物質を接触させない対照の細胞又は生体材料と比較して増加したときは、当該被検物質を皮膚バリア機能促進剤として選択する、(7)に記載の方法。
(9)PNPLA1及びω-ヒドロキシセラミドを含む試料に被検物質を接触させた後にアシルセラミドを検出し、得られる検出結果を指標として皮膚バリア機能の促進物質を選択する工程を含む、皮膚バリア機能促進剤のスクリーニング方法。
(10)アシルセラミドが、被検物質を接触させない対照の試料と比較して増加したときは、当該被検物質を皮膚バリア機能促進剤として選択する、(9)に記載の方法。
(11)PNPLA1遺伝子及び/又はセラミド代謝関連遺伝子を搭載したマイクロアレイに被検物質を接触させた後にPNPLA1遺伝子及び/又はセラミド代謝関連遺伝子の発現を検出し、得られる検出結果を指標として皮膚バリア機能の促進物質を選択する工程を含む、皮膚バリア機能促進剤のスクリーニング方法。
(12)PNPLA1遺伝子の発現量が、被検物質を接触させない対照のマイクロアレイに搭載されたPNPLA1遺伝子と比較して増加したときは、当該被検物質を皮膚バリア機能促進剤として選択する、(11)に記載の方法。
(13)セラミド代謝関連遺伝子が、Elovl4、Lass3、Cyp4f39、Ugcg、Abca12、Gba、Abhd5、Aloxe3及びAlox12bからなる群から選ばれる少なくとも1つである(11)に記載の方法。
(14)セラミド代謝関連遺伝子の発現量が、被検物質を接触させない対照のマイクロアレイに搭載されたセラミド代謝関連遺伝子と比較して増加したときは、当該被検物質を皮膚バリア機能促進剤として選択する、(13)に記載の方法。
(15)PNPLA1遺伝子が欠損した非ヒト動物に被検物質を投与し、当該被検物質投与後の前記非ヒト動物において皮膚バリア機能の促進効果が得られたときは、当該被検物質を皮膚疾患治療薬として選択する工程を含む、皮膚疾患治療薬のスクリーニング方法。
(16)PNPLA1遺伝子を有する非ヒト動物に被検物質を投与し、当該被検物質投与後の前記非ヒト動物においてPNPLA1の発現量、又はω位にリノール酸がエステル結合したアシルセラミドの量が増加したときは、当該被検物質を皮膚疾患治療薬として選択する工程を含む、皮膚疾患治療薬のスクリーニング方法。
(17)PNPLA1遺伝子を有する細胞、又はPNPLA1遺伝子を有する非ヒト動物から採取された生体材料に被検物質を接触させた後、ω位にリノール酸がエステル結合したアシルセラミドを検出し、得られる検出結果を指標として皮膚疾患治療物質を選択する工程を含む、皮膚疾患治療薬のスクリーニング方法。
(18)ω位にリノール酸がエステル結合したアシルセラミドが、被検物質を接触させない対照の細胞又は生体材料と比較して増加したときは、当該被検物質を皮膚疾患治療薬として選択する、(17)に記載の方法。
(19)PNPLA1遺伝子を有する細胞、又はPNPLA1遺伝子を有する非ヒト動物から採取された生体材料に被検物質を接触させた後にPNPLA1の発現量、又はセラミド代謝関連遺伝子の発現量を測定し、得られる測定結果を指標として皮膚疾患治療物質を選択する工程を含む、皮膚疾患治療薬のスクリーニング方法。
(20)PNPLA1の発現量が、被検物質を接触させない対照の試料と比較して増加したときは、当該被検物質を皮膚疾患治療薬として選択する、(19)に記載の方法。
(21)セラミド代謝関連遺伝子が、Elovl4、Lass3、Cyp4f39、Ugcg、Abca12、Gba、Abhd5、Aloxe3及びAlox12bからなる群から選ばれる少なくとも1つである(19)に記載の方法。
(22)セラミド代謝関連遺伝子の発現量が、被検物質を接触させない対照の細胞又は生体材料と比較して増加したときは、当該被検物質を皮膚バリア機能促進剤として選択する、(21)に記載の方法。
(23)PNPLA1及びω-ヒドロキシセラミドを含む試料に被検物質を接触させた後にω位にリノール酸がエステル結合したアシルセラミドを検出し、得られる検出結果を指標として皮膚疾患治療物質を選択する工程を含む、皮膚疾患治療薬のスクリーニング方法。
(24)ω位にリノール酸がエステル結合したアシルセラミドが、被検物質を接触させない対照の試料と比較して増加したときは、当該被検物質を皮膚疾患治療薬として選択する、(23)に記載の方法。
(25)PNPLA1遺伝子及び/又はセラミド代謝関連遺伝子を搭載したマイクロアレイに被検物質を接触させた後にPNPLA1遺伝子及び/又はセラミド代謝関連遺伝子の発現を検出し、得られる検出結果を指標として皮膚疾患治療物質を選択する工程を含む、皮膚疾患治療薬のスクリーニング方法。
(26)PNPLA1遺伝子の発現量が、被検物質を接触させない対照のマイクロアレイに搭載されたPNPLA1遺伝子と比較して増加したときは、当該被検物質を皮膚疾患治療薬として選択する、(25)に記載の方法。
(27)セラミド代謝関連遺伝子が、Elovl4、Lass3、Cyp4f39、Ugcg、Abca12、Gba、Abhd5、Aloxe3及びAlox12bからなる群から選ばれる少なくとも1つである(25)に記載の方法。
(28)セラミド代謝関連遺伝子の発現量が、被検物質を接触させない対照のマイクロアレイに搭載されたセラミド代謝関連遺伝子と比較して増加したときは、当該被検物質を皮膚バリア機能促進剤として選択する、(27)に記載の方法。
(29)皮膚疾患が魚鱗癬、アトピー性皮膚炎、乾癬、荒れ肌、乾皮症、角化症、乾燥肌、湿疹及び乾燥性皮膚炎からなる群から選ばれる少なくとも1つである(15)〜(28)のいずれか1項に記載の方法。
(30)ω-ヒドロキシセラミドにPNPLA1を作用させた後、アシルセラミドを採取することを特徴とするアシルセラミドの製造方法。
(31)PNPLA1遺伝子若しくはセラミド代謝関連遺伝子を有する細胞、又はPNPLA1遺伝子若しくはセラミド代謝関連遺伝子を有する非ヒト動物から採取された生体材料に被検物質を接触させた後にPNPLA1遺伝子及び/又はセラミド代謝関連遺伝子の発現量を測定し、得られる測定結果を指標として被検物質の性質を評価することを特徴とする、被検物質の検査方法。
(33)PNPLA1遺伝子若しくはセラミド代謝関連遺伝子を有する細胞、又はPNPLA1遺伝子若しくはセラミド代謝関連遺伝子を有する非ヒト動物から採取された生体材料に被検物質を接触させた後、ω位にリノール酸がエステル結合したアシルセラミドを検出し、得られる検出結果を指標として被検物質の性質を評価することを特徴とする、被検物質の検査方法。
(34)PNPLA1遺伝子の発現量が、被検物質を接触させない対照の細胞又は生体材料と比較して低下したときは、当該被検物質は皮膚バリア機能を低下させる物質であると判定する、(31)に記載の方法。
(35)セラミド代謝関連遺伝子が、Elovl4、Lass3、Cyp4f39、Ugcg、Abca12、Gba、Abhd5、Aloxe3及びAlox12bからなる群から選ばれる少なくとも1つである(31)〜(33)のいずれか1項に記載の方法。
(36)セラミド代謝関連遺伝子の発現量が、被検物質を接触させない対照のマイクロアレイに搭載されたセラミド代謝関連遺伝子と比較して低下したときは、当該被検物質は皮膚バリア機能を低下させる物質であると判定する、(35)に記載の方法。
(37)ω位にリノール酸がエステル結合したアシルセラミドが、被検物質を接触させない対照の細胞又は生体材料と比較して低下したときは、当該被検物質は皮膚バリア機能を低下させる物質であると判定する、(33)に記載の方法。
1.概要
PNPLA1(patatin-like phospholipase domain containing 1)は、表皮ケラチノサイトの分化に伴って発現する脂質代謝酵素である。本発明者は、Pnpla1遺伝子の欠損マウスを作製して表現型解析を行った結果、このマウスは、重篤な皮膚バリア機能の低下により激しい経皮水分喪失と体重低下が起こり、出生後まもなく死亡することを見出した。表皮の脂質分析により、PNPLA1はセラミドからアシルセラミドを生合成する反応に必須であることが明らかとなり、この過程が正常に進行しないと角質間細胞脂質層の形成不全が生じるばかりでなく、角層構成タンパク質のフィラグリンやロリクリンの発現減少を引き起こし、皮膚バリア機能が低下することが分かった。
EOS: N-(ω-OH-acyl)acyl-sphingosine、
EOP: N-(ω-OH-acyl)acyl-phytosphingosine
EOH: N-(ω-OH-acyl)acyl-6-OH-sphingosine
NdS: N-acyl-dihydrosphingosine
NS: N-acyl-sphingosine
NP: N-acyl-phytosphingosine
NH: N-acyl-6-OH-sphingosine
AdS: N-(α-OH-acyl)-dihydrosphingosine
AS: N-(α-OH-acyl)-sphingosine
AP: N-(α-OH-acyl)-phytosphingosine
AH: N-(α-OH-acyl)-6-OH-sphingosine
(1) Pnpla1 mRNAはケラチノサイトの分化に伴って発現誘導する
C57BL/6マウスの各臓器におけるPnpla1 mRNAの発現量を定量的PCRで解析すると、皮膚に特異的に発現し(図3A)、in situ hybridizationの結果から表皮に分布していることが明らかになった(図3B)。さらに、マウス表皮ケラチノサイト前駆細胞であるMPEK細胞を1 mM CaCl2存在下で培養して分化誘導すると、Pnpla1 mRNAの発現はKrt10やLorと同様に分化誘導2日目から誘導された(図3C)。したがって、PNPLA1の発現はケラチノサイトの分化と密接に関連することが分かった。
(2)Pnpla1欠損マウスにおける皮膚バリア機能の破綻
Pnpla1遺伝子のエクソン2の上流にFRT-LacZ-loxP-Neo-FRT-loxP配列、エクソン3の下流にloxP配列を挿入した構造のターゲティングベクターをC57BL/6由来ES細胞のRENKA株に導入し、相同組換えES細胞の選択を行った(図4A)。キメラマウス、F1マウスを作製した後、Flippase過剰発現マウス、Cre recombinase過剰発現マウスの順に交配してエクソン2および3を欠失したマウスを作製後、ヘテロ欠損マウス同士を交配した。Pnpla1ホモ欠損マウスはメンデルの法則にしたがって生まれたが(図4B、C)、皮膚の乾燥と硬化、低体重が観察され(図4D、E)、生後1日以内に死亡した。胎生18.5日目に帝王切開を行うとホモ欠損マウスの体重は野生型マウスと同等だったが、時間の経過とともに減少し(図5A)、皮膚の乾燥と硬化が進行していった。この時の皮膚バリア機能を経皮水分蒸散量(transepidermal water loss, TEWL)とトルイジンブルー染色液を用いた皮膚透過性試験により評価すると、激しい経皮水分喪失と染色液の浸透が見られた(図5B、C)。さらに皮膚切片のHE染色を行うと、セラミドやコレステロールからなる角質細胞間脂質の著しい減少が認められた(図5D)。
(3)Pnpla1欠損マウスにおけるアシルセラミドの生合成異常
ケラチノサイトは顆粒層でセラミド等の脂質を豊富に含有する層板小体を産生し、さらに分化が進んで角質層に達すると層板小体は細胞外に分泌され、皮膚バリア機能に重要な角質細胞間脂質を形成する(図1A)。皮膚の凍結切片をNile Red染色すると、野生型マウスでは角質細胞間脂質が規則正しくシート状に染色されたが、Pnpla1ホモ欠損マウスでは顆粒状の構造物が角質層に多数観察されたことから(図5E)、層板小体の分泌異常が疑われた。さらに新生仔マウス表皮より抽出した脂質を薄層クロマトグラフィー(TLC)で展開して脂質組成分析を行うと、ホスファチジルコリン(PC)やホスファチジルエタノールアミン(PE)などのリン脂質には大きな変化は見られなかったのに対し、Pnpla1ホモ欠損マウスではアシルセラミド(EOS)やアシルグルコシルセラミド(ω-O-AcylGlcCer)が激減しており、代謝経路のすぐ上流に位置するω-ヒドロキシセラミド(ω-OH-Cer)や、セラミド(NS)から派生するグルコシルセラミド(GlcCer)及び1-O-アシルセラミド(1-O-AcylCer)が増加していた(図6B)。この結果は、PNPLA1が存在しないとω-OH-CerからアシルセラミドEOSを生合成する反応(およびω-ヒドロキシグルコシドセラミド(ω-OH-GlcCer)からアシルグルコシルセラミド(ω-O-AcylGlcCe)が生合成する反応)が進行しないことを意味しており、その代わりに他の経路に流れた代謝物が増加すると考えられた(図6A)。
(4)Pnpla1欠損マウスではセラミド合成経路や角質構造タンパク質の発現が変化する
DNAマイクロアレイ解析により新生仔マウス表皮の遺伝子発現変化を検討したところ、これまでに知られている皮膚特有の超極長鎖脂肪酸を持つセラミド合成経路に関連する酵素群やトランスポーターの遺伝子発現の多くが Pnpla1欠損マウスで2倍以上に増加していることが判明した。定量的PCRにより、Elovl4、Lass3、Cyp4f39、Ugcg、Abca12、Abhd5、Tgm1などの発現が数倍に増加していることが確認された(図10)。これらの遺伝子群は、Pnpla1欠損マウスでアシルセラミドの合成が止まっているために、アシルセラミド合成に必要な原料の供給を増やすフィードバック機構が働いて発現が上昇するものと考えられる。また、このことは、たとえアシルセラミド合成よりも上流の代謝経路が促進されても、Pnpla1がないとアシルセラミドの合成や皮膚バリア機能の強化には繋がらないことを意味する。
(5)皮膚特異的Pnpla1欠損マウスにおける皮膚バリア機能低下とアシルセラミド合成異常
Pnpla1遺伝子のエクソン2の上流とエクソン3の下流にloxP配列を持つPnpla1f/+マウスと、皮膚特異的にCreリコンビナーゼを発現するK14-Creマウスをもとに交配を繰り返し、皮膚特異的Pnpla1欠損マウス(Pnpla1f/fK14-Creマウス)を作製した(図12A)。このマウスの皮膚におけるPnpla1の発現は完全には消失していなかったものの、著しく低下していた(図12B)。生後0日から2日までは外見上の異常は認められなかったが(図13A)、生後3日目頃より体重増加の停止(図12C)や皮膚剥離(図12D)を示す個体が観察され、生後6日目までに死亡した(図12E)。この皮膚特異的Pnpla1欠損マウスの経皮水分蒸散量は、皮膚の非剥離部位では正常値を示したが、剥離部位では著しく高い値を示した(図13B)。したがって、皮膚特異的なPnpla1欠損では、全身性Pnpla1欠損よりもやや生存期間が延長するものの、皮膚バリア機能の著しい低下に起因する水分喪失が起きていると考えられた。
(6)三次元培養皮膚モデルの皮膚バリア形成におけるPnpla1の役割
野生型マウスから調製したケラチノサイトは、2週間の3次元培養によりbasket wave appearanceを伴う角質層を形成したが、Pnpla1ホモ欠損マウス由来のケラチノサイトでは3次元培養しても角質細胞間脂質を伴う角質層が形成されなかった(図15A)。さらには、蛍光色素Lucifer Yellowの組織内への透過性試験から、野生型ケラチノサイトでは皮膚バリア機能を獲得していたが、Pnpla1ホモ欠損マウス由来ケラチノサイトでは蛍光色素が組織内へ浸透しており(図15B)、in vitroの皮膚モデルにおける皮膚バリア機能の獲得にもPnpla1が必要であることが明らかとなった。
(7)リコンビナントPNPLA1タンパク質を用いたアシルセラミドの合成
Pnpla1欠損マウスの表皮では、皮膚バリア機能に必要なアシルセラミド類が激減しており、ω-OHセラミドやその上流から分岐した反応経路で生じる代謝物が増加していたことから、PNPLA1がこれまで発見されてこなかったアシルセラミド合成酵素である可能性が
想定される。そこで、タンパク質の大量生産に適したバキュロウィルス-昆虫細胞発現系を用いてリコンビナントPNPLA1タンパク質を調製し、ω-ヒドロキシセラミドを基質としてアシルセラミド合成活性を検討した。放射性同位体14Cで標識したリノレイルCoAをリノール酸供給源として反応系に加えることで、ω位にリノール酸が結合したアシルセラミド(EOS)の合成が促進された(図16)。
(8)Discussion
本発明により、PNPLA1は表皮ケラチノサイトにおけるアシルセラミドの生合成に必要な酵素であることが示された。アシルセラミドは複雑で特殊な構造を持ち、皮膚バリアの形成に重要な角質細胞間脂質の主要成分であるが、代謝酵素が同定されていなかった。細胞レベルでω-ヒドロキシセラミドまでは合成できることから、PNPLA1を利用することで、これまで工業的に大量生産を行うことができなかったアシルセラミドを生化学的に合成することが可能となる。また、皮膚のPNPLA1発現量を増加させる薬物は、内因性アシルセラミドの合成能力を増加させることで皮膚バリア異常を伴う魚鱗癬、アトピー性皮膚炎などの皮膚疾患に薬効を示す可能性がある。
2.スクリーニング方法
本発明により、PNPLA1は表皮ケラチノサイトにおけるアシルセラミドの生合成に必要な酵素であることが示されたことから、PNPLA1の発現又はアシルセラミド(ω位にリノール酸がエステル結合したアシルセラミド)の合成を指標として、皮膚バリア機能促進剤又は皮膚疾患治療薬をスクリーニングすることができる。
被検物質が皮膚バリア機能を促進したかどうかを評価するための項目としては、例えば、PNPLA1の発現量、セラミド代謝関連遺伝子の発現量、アシルセラミドの量、角質細胞の剥離現象が認められる乾燥状態の皮膚の有無、表皮組織の縮小の有無又は度合い、表皮細胞分化増殖マーカー、経皮水分蒸散量、フィラグリンの発現量等が挙げられる。これらの評価は、動物の外見観察、組織学的解析、遺伝子工学的分析、生化学的分析等の手法を用いて行うことができる。そして、皮膚バリア機能促進効果について、皮膚疾患の発症抑制、皮膚疾患の縮小、アシルセラミド量の増加、PNPLA1の発現量の増加、及び表皮細胞分化増殖マーカーの出現又は消滅などの効果の少なくとも1つが観察されたときは、皮膚バリア機能の再生、修復、増強又は低下の予防効果が得られたと判断し、被検物質を、皮膚バリア機能促進作用を有する物質(皮膚バリア機能促進剤)として選択する。また、セラミド代謝関連遺伝子としては、Elovl4、Lass3、Cyp4f39、Ugcg、Abca12、Gba、Abhd5、Aloxe3及びAlox12bからなる群から選ばれる少なくとも1つが挙げられる。なお、Cyp4f39は、ヒトではCYP4F22となる。PNPLA1遺伝子ノックアウトマウスではこれらのセラミド代謝関連遺伝子の発現が増加するが、これはアシルセラミドの不足を補うためのフィードバック機構が働き、アシルセラミドの原料を供給する上流のセラミド代謝経路が促進されていると考えられる。従って、上記セラミド代謝関連遺伝子の発現量が対照と比較して増加したときは、被検物質を皮膚バリア機能促進剤として選択する。言い換えると、セラミド代謝関連遺伝子の発現量が対照と比較して変化したときは、被検物質を皮膚バリア機能修飾剤として選択する。
本発明において使用されるPNPLA1遺伝子が欠損した非ヒト動物は、PNPLA1遺伝子がホモノックアウトされた動物でもヘテロノックアウトされた動物でもよいが、全身性ホモノックアウト動物は、前述のように出生後極めて早期に死亡することから、皮膚特異的ホモノックアウト動物またはヘテロノックアウト動物を使用することが好ましい。
さらに、本発明においては、PNPLA1遺伝子が欠損若しくは変異した非ヒト動物、又はPNPLA1遺伝子が欠損若しくは変異した非ヒト動物から得られた生体材料を用いるときは、比較対照としてPNPLA1遺伝子がノックアウト又は変異されていない野生型非ヒト動物、あるいはPNPLA1遺伝子がノックアウト又は変異されていない細胞などを用いることが好ましい。例えば、ω位にリノール酸がエステル結合したアシルセラミドが、被検物質を接触させない対照の細胞又は生体材料と比較して増加したときは、当該被検物質を皮膚バリア機能促進剤として選択する。
非ヒト動物から採取された生体材料としては、例えば非ヒト動物由来の皮膚切片(皮膚組織)、細胞、体液、血液、リンパ液などが挙げられる。「PNPLA1遺伝子を含む細胞」とは、非ヒト動物から採取された生体材料以外の細胞を意味し、その種類は不問である。例えば樹立された培養細胞、遺伝子工学的にPNPLA1遺伝子が導入された形質転換細胞(形質転換された大腸菌、酵母、植物細胞等を含む)などが挙げられる。
3.被検物質の安全性評価方法
本発明において、PNPLA1遺伝子の発現を低下させるような物質は皮膚バリア機能を低下させると考えられる。
4.PNPLA1を用いたアシルセラミドの生合成
本発明は、ω-ヒドロキシセラミドにPNPLA1を作用させることを特徴とするアシルセラミドの製造方法を提供する。
<ω-ヒドロキシセラミドやアシルセラミドの構造・定義>
ω-ヒドロキシセラミド及びアシルセラミドの構造式は以下の通りである。
アシルセラミド合成酵素PNPLA1は、Pnpla1遺伝子を発現させた細胞や微生物のホモジネートに含有されたものを使用できる。あるいは、Pnpla1のアミノ酸配列及びDNA塩基配列の情報を基に、遺伝子工学的手法を用いてPnpla1に変異を入れた組み換えタンパク質を調製することもできる。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
マウス組織におけるPnpla1遺伝子発現量の解析:
8週齢の雄マウスをイソフルランで麻酔後、背部皮膚やその他の組織を採取し、液体窒素で急速凍結後に-80℃で保存した。凍結したマウス組織20 mgに対してRNA調製用のTRIZOL (Invitrogen社)を1 mL加え、ポリトロンPT10-35 GT (KINEMATICA社)を用いて破砕した。この溶液にクロロホルムを1/5容量加えて激しく撹拌した後、15,000 rpm、室温で10分間遠心して上清を分取した。上清に同容量の2-プロパノールを加えて転倒混和し、15分間静置した後、5,000 rpm、4℃で15分間遠心してRNAを沈殿させた。上清を除いて70% (v/v) エタノールを加え、15,000 rpm、4℃で5分間遠心してRNAを洗浄した。上清を除いた沈殿に滅菌水を適量加えて再溶解させ、260 nmにおける吸光度の測定により、得られたRNAを定量した。1 μgのRNAを鋳型としてReverTraAce (東洋紡)を用いて逆転写反応を行い、cDNAを作製した。RNA発現量の評価は蛍光標識プローブを用いた定量的PCR(TaqMan法qPCR)によって行った。ThunderBird qPCR Master Mix (東洋紡)を用いて、cDNA試料1 μLに2 x qPCR Master Mix 10 μL、リファレンス遺伝子Hprt1及び検出する該当遺伝子のプライマー (Pnpla1)、蛍光標識UPLプローブ (ロッシュ社)を加え、滅菌水で全量を20 μLに調製した。qPCR反応には96穴プレート(LightCycler(登録商標) 480 Multiwell Plate 96、04729692001;ロッシュ社)を用い、LightCycler(登録商標)480 Instrument II(ロッシュ社)を使用して50℃、2 min → 95℃、10 min → (95℃、15 sec → 60℃、1 min ) x 40サイクルの条件で反応させ、蛍光強度の変化曲線から比較CT法(DDCT法)を用いて目的とする遺伝子発現量を計算した。
Pnpla1: TGCGGGATTGAGATGGAG(配列番号3), CGCATCATCTGTACCATCTTG(配列番号4),UPL#94
In situ hybridization:
ジェノスタッフ社に委託し、胎生17.5日(E17.5)の胎仔マウスをイソフルランで麻酔後、4%パラホルムアルデヒド-リン酸緩衝液(pH7.4)で浸漬固定し、約4 μmに薄切した切片を使用した。検出プローブはPnpla1 mRNAに対するアンチセンスRNAを用い、コントロールとしてこの配列と相補的なセンスRNAを用いた。下に示すPnpla1の部分配列をコードしたプラスミドからin vitro transcription法によりジゴキシゲニン標識(DIG RNA Labeling Mix;ロッシュ社)したプローブを作製した。検出にはアルカリフォスファターゼ標識‐抗ジコキシゲニン抗体(ロッシュ社)と発色基質NBT/BCIP(シグマ社)を用い、対比染色はKernechtrot染色液(武藤化学)にて行った。
TTCCGAGTACCGATCCAAGGAAGAGCTCATCGAGGCCCTGTATTGCAGCTGCTTTGTTCCTGTTTACTGTGGCTTCATCCCCCCAACGTATCGGGGAGAGAGATACATCGACGGTGGCTTCACAAGCATGCAGCCCTGTTCCTTCTGGACAGACTCCATCACCATCTCCACCTTCAGCAGCCAGCAGGACATCTGTCCGAGAGACTGCCCCACCATCTTCCATGACTTCCGAATGTTCAACTTCTCCTTCCAGTTCTCCCTGGAGAATATCACCCGCATGACACATGCGCTGTTTCCCCCGGACCTGGTGATTCTGCAGGAATATTACTATCGGGGATACAATGATGCTGTCTCATACCTGCGGAGACTGAATGCAGCGTACCTTGACTCTCCCAGCAAGAGAGTGATTTTCCCGAGGGTTGAAGTATACTGCCAGATAGAGGTCGCCCTTGGCCATGAGCCCCCACCTCCGAGTCTGCAGAACCTGCCAGCCCTGAGGAGAAGCCCAGCAGACTCCTCACAAACCCATGCACAGGGGTCTCCCAAAAAGGACAGAAAGGACAGCCATTCCTCAGCCGCCCCCTCAGTGCAGACACCTGAATCTGGGTGCAAGGAGTCTGTGGAATCACCCGTGTCACTACGGGTCTCTATATCCAAGCAACCATCTGTATCGCCATTATCCCCAGCCCAGCCGGTCCCAGTAATGAGGCCCACTGGCCCCAGGGACAGTTGCCCAATAAATGTTCAAACTCCAAACCCGGAGCGAGGAGTGAAGGGTGCCCTGGACTCTGCCACAGAACGAGGAATGAAGGATGCTCTGGC
表皮前駆細胞の分化誘導に伴う遺伝子発現解析:
MPEK-BL6細胞 (Mouse Epidermal Keratinocyte Progenitors Cell, C57BL/6; CELnTEC社)を3.8×105 cells/ wellの細胞密度で12穴プレートに蒔き、表皮細胞用培地CnT-07(CELnTEC社)で37℃、5%CO2の条件で培養した。3日後に1 mM CaCl2を添加した表皮細胞培養液CnT-02(CELnTEC社)に培地交換することで、細胞の分化誘導を開始した。分化誘導後0、2、4、6、8日目にTRIZOL溶液を用いて細胞溶解液を回収した。上記と同様の方法で調製したRNAからcDNAを合成し、qPCRによってKeratin10(Krt10), Loricrin(Lor), Pnpla1の発現量を定量した。リファレンス遺伝子としてHprt1を用いた。
Lor: GGTTGCAACGGAGACAACA(配列番号7), CATGAGAAAGTTAAGCCCATCG(配列番号8), UPL#11
図4
Pnpla1遺伝子欠損マウスの作製:
BACPAC Resources(Children’s Hospital Oakland Research Institute、米国カリフォルニア州オークランド)からマウスPnpla1遺伝子のターゲティングベクター(Clone name HTGRS6008_A_A04)を得た。このターゲティングベクターは、図4Aにその一部の模式図を示すように、マウスPnpla1のゲノムDNAのエクソン2から6を有し、エクソン2の上流側に2つのFRT配列に挟まれた自律性プロモーター/ネオマイシン耐性遺伝子カセット(hBactP-neo)とloxP配列、エクソン3とエクソン4の間にloxP配列、エクソン6の下流にホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター/ジフテリア毒素Aフラグメント遺伝子(PGK−DTA)を有する。このターゲッティングベクターを制限酵素Sal Iで切断して直鎖化し、エレクトロポレーションによって、RENKA株(新潟大学脳研究所 崎村建司教授より入手)に遺伝子導入した。遺伝子導入されたES細胞を抗生物質G418 (100 μg/mL) を含む17.5% KSR(knockout serum replacement;Lifetechnologies) -DMEM培地において37℃で培養し、相同組み換えクローンをサザンブロッティングにより選択した。適切に相同組み換えが生じたマウス胚幹細胞をICR 8細胞期胚(アーク・リソース社)と共培養してaggregation chimera胚を作製し、偽妊娠ICRマウス(日本チャールスリバー社)の子宮に移植し、ヘテロ型Pnpla1遺伝子改変のキメラマウスを発生させた。選別した雄個体を雌C57BL/6(日本クレア社)と交配し、得られた産仔の尾先端から抽出したゲノムDNAを鋳型としてGoTaqポリメラーゼ(プロメガ)とトランスジーンを検出するプライマーを使用したPCRジェノタイピングを行い、トランスジーンが子孫に伝わることを確認した。この状態ではPnpla1遺伝子はまだ活性型であり、Cre-loxPシステムにより2つのloxP配列に挟まれたエクソン2および3を除くことによりPnpla1遺伝子をノックアウトすることができる。
図5
帝王切開して得た胎仔の体重測定:
ヘテロPnpla1欠損マウス同士を交配して妊娠 18.5日目となった雌マウスをイソフルランで麻酔後、開腹して子宮内から胎仔を取り出した。このE18.5胎仔にマジックマーカーで目印をつけ、1時間毎に16時間まで電子天秤ScoutPro(OHAUS社、ニュージャージー州、米国)を使用して体重の経時変化を測定した。測定終了後、尻尾の先端を切断し、抽出したゲノムDNAを用いたPCRにより、遺伝子型を決定した。
皮膚バリア機能の評価
経表皮水分蒸散量の測定:
Tewameter(登録商標)TM300 (Courage+Khazaka社、ドイツ)のプローブ先端の開放型チャンバー部を新生仔マウスの皮膚に押し当て、経表皮水分蒸散量を測定した。
トルイジンブルー染色による皮膚透過性試験:
出生直後の生直後の新生児を100%メタノールにて脱水後、0.1%トルイジンブルー溶液に全身を5分間浸した。体内への青色色素の侵入度合いにより、皮膚バリア機能を判定した。
ヘマトキシリン・エオシン染色(HE染色):
出生当日(PO)の新生仔マウスをイソフルランにて麻酔し、背部皮膚を採取した。10% (w/v) 中性ホルマリン緩衝溶液(和光純薬)で一晩固定した組織を適当な大きさに成形し、包埋カセット(ユニカセット;サクラファインテック社)に入れて70% エタノール中に1時間浸漬させた。真空自動固定包埋装置(サクラバキュームロータリーVRX-23;サクラファインテック社)を用いて以下のように組織中のエタノール濃度を上げた後パラフィンに置換し、包埋した(70% エタノール → 80% エタノール → 90% エタノール → 100% エタノール(5回) → 100% キシレン(3回) → 100% キシレン (4回))(Tissue Enbedding Medium;Mc Cormick Sientific社) → 100% パラフィン (60℃) → 100% パラフィン (60℃) → 100%パラフィン (60℃)、各3時間ずつ浸漬)。包埋したパラフィンブロックを滑走ミクロトーム(REM710;大和光機工業)にて皮膚面と垂直方向に厚さ約5 μm毎に切削した。得られた切片を42℃水浴上に浮かべて扁平にし、スライドグラス(プラチナプロホワイトPRO-01;松浪硝子)に貼り付けた後、42℃のティッシュー・テック パラフィン伸展器(PS-53;サクラファインテック社)で一晩乾燥させた。パラフィン包埋された切片のスライドを染色バスケットに入れ、以下のように順に各液に浸して脱パラフィンした(キシレン 5 分 (4回) → 99% エタノール 30 秒 →95% エタノール 30 秒→ 90% エタノール 30 秒→ 80%エタノール 30 秒→ 70% エタノール 30 秒→ 50% エタノール 30 秒)。マイヤー・ヘマトキシリン溶液(和光純薬)に約1分間浸漬し、水道水で3分間洗浄した。その後エオジン (0.5% Eosin Y ethanol solution; 和光純薬) に約1分浸漬し、再度水道水で3分間洗浄した。脱水および透徹を行った後、ソフトマウント (和光純薬) を用いて、カバーガラス(NEO MICRO COVER GLASS; 松浪硝子) により封入した。作製した組織切片は顕微鏡 (BX61; オリンパス) および画像解析ソフトウェア (DP2-BSW、オリンパス) を用いて観察した。
Nile Red染色:
出生当日(P0)のマウスをイソフルランにて麻酔し、背部の皮膚を採取し、中性ホルマリン緩衝溶液を用いて一晩固定した。これを10%ショ糖/PBS溶液に4℃で一晩浸漬後、さらに30%ショ糖/PBS溶液に置換してさらに半日静置した。凍結用包埋剤(Tissue-Tek(登録商標) O.C.T compound、サクラファインテック)/30%ショ糖=3:1 を用いて包埋し、皮膚標本を凍結させたブロックを作製した。クリオスタット(Leica CM3050)を用いて厚さ5 μmの切片を薄切し、スライドガラス(スーパーフロストホワイトS9441、松浪硝子)に貼り付け、送風乾燥させた。得られた皮膚切片にNile Red染色液(5 mg/ml in 75%グリセロール、和光純薬)を適量滴下し、カバーガラスにより封入した。共焦点レーザー顕微鏡(LSM710;Carl Zeiss社)を用い、励起波長 557 nm、蛍光波長 572 nmで観察した。
薄層クロマトグラフィー(TLC)による皮膚脂質の分析:
皮膚検体を1.5 mg/ml ディスパーゼ(Invitrogen社)/PBS溶液に4℃、1晩浸し、ピンセットを用いて表皮層を剥がして採取した。凍結乾燥した後、乾燥重量を秤量し、メタノール1 mlを加えてポリトロンPT10-35 GT(KINEMATICA社)を用いて破砕した。Folch法(FOLCH J, LEES M, SLOANE STANLEY GH. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol Chem 226:497-509, 1957)に準じて脂質を抽出し、窒素ガスを吹きかけて有機溶媒を蒸発させた後、表皮乾燥重量1 mg当たり1 μLになるようクロロホルムを加えて脂質サンプルを溶解した。シリカゲル60 TLCガラスプレート(1.05721.0001 、20 cm× 20 cm;Merck社)に5 μLの脂質サンプルをスポットし、クロロホルム/メタノール/水(40: 10: 1)で2 cm、クロロホルム/メタノール/水(40: 10: 1)で5 cm、クロロホルム/メタノール/酢酸(47: 2: 0.5)で8.5 cm、ヘキサン/ジエチルエーテル/酢酸(65: 35: 1)で18 cmの順で展開した。ヨウ素蒸気で発色させてTLCで分離したバンドを可視化し、LAS4000(GEヘルスケア)を用いて画像を取得した。
図7〜図9
質量分析による皮膚セラミド分子種の分析:
マウスの表皮から脂質を3回繰り返し抽出し、脂質の酸化を抑制するためにブチル化ヒドロキシトルエン(BHT)を50 μg/mLとなるように添加した。共有結合した脂質は2 mLの1M NaOH, 90%メタノール溶液中で60分間処理した後、3M塩酸を用いてpH 6に調整し、2.5 mLのクロロホルムを加えた。3,000×gで15分間遠心して得られた有機層を回収し、さらに液層を1mLのクロロホルムと混合し、3,000×gで10分間遠心した。得られた有機層を先の有機層と一緒にし、滅菌水で2回洗浄した後、窒素ガスを吹き付けて有機溶媒を蒸発させ、乾燥重量1 mg当たり1 μlのクロロホルムに溶解した。遊離スフィンゴ脂質の分離には逆相HPLCを用いた。5 μLの脂質抽出物をHPLCカラム(Phnomenex Luna C18, 100 mm×3 mm、2.6 μm粒子サイズ、100Åポアサイズ:Phenomenex社、カリフォルニア州、米国)に注入し、移動層Aには、メタノール:水(95:5)、移動層Bには100%酢酸エチルを使用した。14.15分まで650μL/minの流速にセットし、移動層Bを0%まで2分間維持し、そこから10.5分までに移動層Bの割合を55%まで直線的に増加させ、さらに14.15分まで100%に増加させた。その後、4分間100%で維持し、全ての脂質をカラムから溶出させた。共有結合した脂質の分離は、5 μlのサンプルを順相TLC Advantage Silicaカラム(250 mm×4.6 mm、5 μm粒子サイズ、150Åポアサイズ:Thomson Instrument社、カリフォルニア州、米国)に注入し、1 mL/minの流速でヘキサン/イノプロパノール/酢酸(90:10:0.1)で溶出した。
逆相HPLCで分離した遊離セラミド分子種の質量分析計による検出には、ThemoFinniganDSQ instrumentをAPCIイオンソースのポジティブイオンモードで使用した。キャピラリ温度 200℃、イオン移動電圧 2000 V、vaporizer温度450℃、電子エネルギー 70 eV。共有結合脂質の検出には、キャピラリ温度 275℃、イオン移動電圧 2000 V、vaporizer温度450℃、電子エネルギー 70 eVの条件を用いた。どちらの場合も400から1400 amu (±0.4 amu)でスキャンした。検出した脂質分子種の相対的な定量を行うためには、イオンクロマトグラムのピーク面積を計算し、それぞれの表皮脂質サンプルの乾燥重量で補正することで、サンプル間の比較を行った。
図10
セラミド代謝関連遺伝子群の発現量解析:
出生当日(P0)の新生仔マウスをイソフルランで麻酔後、背部皮膚を採取し、液体窒素で急速凍結後に-80℃で保存した。凍結したマウス皮膚片にRNA調製用のTRIZOL (Invitrogen社)を1 mL加え、ポリトロンPT10-35 GT (KINEMATICA社)を用いて破砕した。上述と同様の方法で調製したRNAからcDNAを合成し、qPCRによってElovl4, Lass3, Cyp4f39, Ugcg, Abca12, Abhd5, Aloxe3, Alox12b, Tgm1の発現量を定量した。
用いたプライマーとUPLプローブ番号の組み合わせを以下に示す。
Elovl4: GCGGCCAGTCTGCTACAC(配列番号9),CTTTGGTCCTGATGGCAAC(配列番号10),UPL#85
Lass3: CATGATATATCTGACATTTGGCTAGAG(配列番号11), GTGAAGATGAAGAACAGGGTGTTA(配列番号12), UPL#38
Cyp4f39: AAAGAAGAAAGCCAAGAGAATTGA(配列番号13),TGCAACAGGTAGTCGGTGAG(配列番号14), UPL#89
Ugcg: AGTTTCAATCCAGAATGATCAGG(配列番号15),CATTCTGAAATTGGCTCACAAAT(配列番号16), UPL#4
Abca12: CCTGCTAAACCAGACGATCC (配列番号17), ACTTGCACAAAGGGGTTCC (配列番号18),UPL#50
Abhd5: ATCTTTGGAGCCCGATCCT(配列番号19),CTTCTGGCTGATCTGCATACAC(配列番号20),UPL#89
Aloxe3: GGCCTCACTGATCTTCAACG(配列番号21),GTCCAGGAGACCTCGAATCTT(配列番号22),UPL#4
Alox12b: CTTTGGTCCTGATGGCAAC(配列番号23), GACAATCAGGCCCAGGAGT(配列番号24),UPL#105
Tgm1: CAGAAAGGACCGATCTCCAG(配列番号25),TCCGGTGACGGTGTTGTAG(配列番号26),UPL#51
図11
表皮ケラチノサイトの分化マーカー遺伝子群の発現解析:上述の出生当日(P0)の新生仔マウス皮膚から調製したcDNAを鋳型として、qPCRによりFilaggrin(Flg), Loricrin (Lor), Involucrin (Inv), Keratin 1(Krt1), Keratin 10(Krt10), Keratin 5(Krt5), Keratin 14(Krt14), S100a9の発現量を定量した。
用いたプライマーとUPLプローブ番号の組み合わせを以下に示す(既に記載したものは省略する)。
Krt1: TTTGCCTCCTTCATCGACA(配列番号27),GTTTTGGGTCCGGGTTGT(配列番号28),UPL#62
Krt5: CAGAGCTGAGGAACATGCAG(配列番号29),CATTCTCAGCCGTGGTACG(配列番号30),UPL#22
Krt14: ATCGAGGACCTGAAGAGCAA(配列番号31),TCGATCTGCAGGAGGACATT(配列番号32),UPL#83
Inv: AGCAGCTGCAGGTGAAAAAG (配列番号33),TCTCCAGATGCAGTTCCTGTT (配列番号34),UPL#18
Flg: GGAGGAAGAAACACTGAGCAA(配列番号35),CGATGTCTTGGTCATCTGGA(配列番号36),UPL#96
S100a9: GACACCCTGACACCCTGAG(配列番号37),TGAGGGCTTCATTTCTCTTCTC(配列番号38), UPL#31
免疫組織染色によるケラチノサイト分化マーカーの発現検出:HE染色と同様の方法で、スライドグラスに貼付けた切片を作製した。脱パラフィン操作を行った後、リン酸緩衝液(PBS)で2回(各3分間)洗浄し、ブロックエース(大日本製薬)を用いて室温で30分間処理して非特異的タンパク質に対するブロッキングを行った。その後、PBSで1回(3分)、T-PBS(0.05% Tween 20含有PBS)で1回(各3分間)洗浄し、一次抗体としてウサギ抗Keratin 5抗体(1,000倍希釈;Covance社)、抗Keratin 1抗体(1,000倍希釈;Covance社)、抗Loricrin抗体(1,000倍希釈;Covance社)、抗Filaggrin抗体(1,000倍希釈;Covance社)を用いて4℃一晩反応させた。PBSで2回(各3分)、T-PBSで1回(3分間)洗浄し、二次抗体としてAlexa546標識抗ウサギIgG抗体(1,000倍希釈;Invitrogen社)を用いて常温で1時間反応させた。PBSで2回(各3分間)洗浄した後、VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI (Vector laboratories社)とカバーグラスで封入し、共焦点レーザー顕微鏡(LSM710; Carl Zeiss社)で蛍光シグナルを観察した
実施例1で得られた結果を図3〜図11に示す。
8週齢マウスではPnpla1は皮膚に発現していたが、肝臓、白色脂肪組織(WAT)、骨格筋ではほとんど検出されなかった。(パネルB)E17.5マウス胎仔皮膚の切片を用いてin situ hybridizationを行った結果、Pnpla1発現が表皮に限局して発現していた。(パネルC)培養ケラチノサイト前駆細胞であるMPEK細胞を1 mM CaCl2の添加により分化誘導させると、Pnpla1のmRNA発現量が増加した。ケラチノサイト分化マーカー遺伝子であるKeratin10やLoricrinのmRNA発現も、この分化誘導条件で増加することを確認した。
図4において、パネルAは実施例で用いたマウスゲノムのPnpla1遺伝子部位の模式図を示し、パネルBは遺伝子型に対応してP0新生仔の背部皮膚においてPnpla1 mRNAの発現量が異なることを示す。パネルCに示すように、野生型(Pnpla1+/+)、Pnpla1ヘテロ欠損 (Pnpla1+/-)、Pnpla1ホモ欠損 (Pnpla1-/-) の新生仔はほぼ1:2:1の比率で得られたことから、Pnpla1ホモ欠損は胎生致死を示さないと言える。
C57BL/6マウス(野生型)の新生仔マウスと比較した時の、ヘテロ型Pnpla1遺伝子欠損マウスとホモ型Pnpla1遺伝子欠損マウスの特徴は、次のようにまとめられる。
ヘテロ型Pnpla1遺伝子欠損マウスは、外見、体重、寿命、皮膚構造の光学的顕微鏡病理所見は野生型と比べて差異がなかった。
ホモ型Pnpla1遺伝子欠損マウスは、出生後24時間以内に全ての個体が死亡した。皮膚は硬くて柔軟性がなく、尾の先端で壊死を生じたホモ型Pnpla1遺伝子欠損マウスも認められた(図4D)。体重は野生型の平均が1.4 g程度であるのに対して、ホモ欠損マウスは平均1.0 g程度であった(図4E)。図5Aに示すように、胎生18.5 日で妊娠マウスを帝王切開することで得たPnpla1-/-マウスの体重変化は、取り出した直後は野生型と体重が同等であったにも関わらず、時間経過とともに体重が急激に低下したことから、体重低下の原因は成長不良ではなく、皮膚からの水分蒸発に起因する体内水分喪失と考えられた(図5A)。実際、出生直後の新生仔(P0)の経皮水分蒸散量(TEWL)を測定すると、野生型マウスは1.22±0.08 g/h/m2 (19匹)、ヘテロ欠損マウスは1.56±0.11 g/h/m2(45匹)であったのに対し、Pnpla1欠損マウスのそれは6.34±0.29 g/h/m2 (19匹)と、野生型に比べて約5倍高かった(図5B)。また、トルイジンブルー染色液を用いた皮膚透過性試験を行うと、ホモ欠損マウスでは色素が体内へ浸透して青く染まった(図5C)。したがって、Pnpla1が発現しないと、深刻な皮膚バリア機能の低下が生じる。
皮膚組織切片を用いて組織学的解析を行った結果を図5Dに示す。HE染色すると野生型マウスでは、角質層に矢印で示すような角質細胞間脂質に相当するbasket weave appearanceがはっきりと観察されたが、ホモ欠損マウスではこの構造が消失しており(角質細胞間脂質の消失)、加えて表皮の肥厚が見られた。皮膚の凍結切片をNile Redによって脂質部分を染色すると、野生型マウスでは角質層が規則正しく層状に染色されたが、ホモPnpla1欠損マウスでは矢印で示すように顆粒状の構造物が角質層に多数観察され、ラメラボティが分泌されて層状に広がる過程が正常に進行していないことが示唆された(図5E)。
図6は、セラミド代謝経路(パネルA)と表皮の主要な脂質成分のTLC分析(パネルB)を示す。新生仔マウスの表皮から抽出した脂質を薄層クロマトグラフィー(TLC)で展開すると、ホモ欠損マウスでは、青字で示すEOS、アシルグルコシルセラミド(ω-O-AcylGlcCer)がほぼ消失し、赤字で示すω-OH-Ceramide、グルコシルセラミド(GlcCer)、1-O-AcylCerが著しく増加していた。この結果は、Pnpla1ホモ欠損マウスではω-OH-CeramideからAcylCer(EOS)を産生する反応がほぼ完全に阻害されていることを示す。またアシルセラミドの産生経路が機能しないためにすぐ上流の代謝物であるω-OH-Ceramideが蓄積し、さらにその一つ上流のCermide(NS)から他の代謝経路を介して他の種類のセラミド代謝物の産生が増加していることが示唆される。
図7および図8
図7は新生仔表皮から調製した脂質試料を液体クロマトグラフで分離し、質量分析装置でイオン化して検出することで、表皮セラミド分子種の網羅的解析を行った結果である。横軸にHPLCカラムによる保持時間、縦軸に質量数/電荷(m/z)をプロットした多段マスクロマトグラムであり、プロットの濃淡が該当物質のイオン強度を示す。丸で囲った位置にそれぞれのセラミド分子種クラスが検出され、青丸で囲んだEOH、EOP、EOS、Glc-EOH、Glc-EOSがPnpla1-/-マウスで減少していた。これらの分子はいずれも、ω位にリノール酸がエステル結合するセラミド分子種である。一方、赤点線の丸で囲んだNS、NdS、AP、NPなどのセラミド類はPnpla1+/+マウスよりもPnpla1-/-マウスにおいて増加傾向が見られた。
図8では図7の方法で得られたデータに対して、Pnpla1+/+マウス、Pnpla1+/-マウスPnpla1-/-マウスで比較定量したグラフを示す。加えて、アルカリ処理によって遊離させた角化細胞に共有結合する極超超鎖脂肪酸の定量結果も示す。これらの結果は、Pnpla1ホモ欠損マウスでは、極超長鎖のω位にリノール酸がエステル結合した多様なアシルセラミド分子種(EOH、EOP、EOS、EOdSなど)、アシルグルコシドセラミド、および角化細胞にω位で共有結合した極超長鎖脂肪酸が顕著に減少することを表すものである。
図9
皮膚のセラミド生合成経路と、多様なそれぞれのセラミド分子種のPnpla1-/-マウスにおける存在量の変化をまとめた図を示す。図7、図8からも分かるようにω位がリノール酸でエステル化されたアシルセラミド類が減少し、そのすぐ上流に位置するnon-esterified ceramide分子種が増加することが分かる。したがって、PNPLA1は、EOSだけでなく、他の種類のアシルセラミドの生合成にも必要であることを示している。
図10は、表皮特有のセラミド代謝に関わる代謝酵素やトランスポーターの遺伝子の多くが、Pnpla1ホモ欠損マウスで発現増加することを示す。パネルAはパネルBに示す各遺伝子がセラミド代謝経路のどの過程で働くかを表したものである。皮膚セラミドの代謝経路に関するこれら既知の遺伝子が発現低下すると、ω-ヒドロキシセラミド等の供給が減少し、その結果、アシルセラミド類の合成が不足する可能性がある。しかしながら、Pnpla1遺伝子欠損マウスの表皮における公知のセラミド代謝関連遺伝子の発現をqPCRによって解析したところ、Elovol4、Lass3、Cypf39、Ugcg、Abc12、Abhd5などの発現量が野生型に比べて2倍以上に増加していた。したがって、Pnpla1欠損マウスにおけるアシルセラミド量の低下は、上流の代謝経路の遺伝子発現低下や下流の代謝経路の活性化によるものではなく、欠損したPnpla1が機能しないことによる直接的な結果であることを支持する。また、アシルセラミド合成よりも上流のセラミド代謝経路が促進されても、Pnpla1がなければアシルセラミドが合成されず、皮膚バリア機能の低下を補うことができないことを意味する。
図11
Pnpla1ホモ欠損マウスでは、基底層マーカーのKrt5、Krt14や有棘層マーカーのKrt1、Krt10の発現は野生型と同等であったが、顆粒層マーカーのLorと角質層マーカーのFlgの発現がmRNAレベルおよびタンパク質レベルで低下していた。両者は角層構成タンパク質として重要であり、Pnpla1欠損によってアシルセラミド量が低下するのみならず、表皮ケラチノサイトの顆粒層以降の遺伝子発現が影響を受けることが示された。さらにS100a9はアトピー性皮膚炎や乾癬に罹患している患者の表皮で発現増加する炎症マーカーであり、Pnpla1ホモ欠損マウスの表皮におけるS100a9の発現増加は、皮膚バリア機能の破綻によって炎症応答が起きていることを示唆する。
皮膚特異的Pnpla1欠損マウスの作製:
Pnpla1f/+マウス同士を交配してPnpla1f/fマウスを得た。また一方で、Pnpla1f/+マウスと皮膚特異的にCreリコンビナーゼを発現するK14-Creマウスと交配し、Pnpla1f/+K14-Creマウスを得た。得られたPnpla1f/fマウスとPnpla1f/+ K14-Creマウスをさらに交配することにより、Pnpla1f/fマウス、Pnpla1f/f K14-Creマウス、 Pnpla1f/+マウス、Pnpla1f/+ K14-Creマウスの4通りの仔が得られるが、Pnpla1f/f K14-Creマウスが皮膚特異的Pnpla1欠損マウスであり、同腹のPnpla1f/fマウスをPnpla1発現が正常なコントロールとして使用した。
実施例1と同様に各組織におけるPnpla1 mRNAの発現量をqPCRにより定量すると、皮膚特異的Pnpla1欠損マウスであるPnpla1f/f K14-Creマウスでは、皮膚におけるPnpla1の発現が著しく低下していた(図12B)。しかしながら、生後0日から2日までは外見上の異常は認められず(図13A)、体重の低下(図12C)、経皮水分蒸散量の増加(図13C)は見られなかった。Pnpla1f/f K14-Creマウスは、生後3日目より体重増加の停止(図12C)や脚部や背部の皮膚剥離(図12D、図13A)を示す個体が観察されるようになり、生後6日までに全個体が死亡した(図12E)。コントロールのPnpla1f/fマウスの経皮水分蒸散量は1.43±0.10 g/h/m2 (10匹)であった。これに対し、Pnpla1f/f K14-Creマウスの経皮水分蒸散量は、皮膚の非剥離部位では1.46±0.04 g/h/m2 (19匹)と正常値を示したが、剥離部位では12.48±0.79 g/h/m2 (19匹)と著しく高い値を示した。
生後5日(P5)のマウス背部から実施例1と同様に脂質を抽出し、シリカゲル60 TLCによる脂質分析を行った。その結果、実施例1と同様に、青字で示すEOS、アシルグルコシルセラミド(ω-O-AcylGlcCer)がほぼ消失し、赤字で示すω-OH-Ceramide、グルコシルセラミド(GlcCer)、1-O-AcylCerが著しく増加していた(図13E)。実施例2の結果から、皮膚に発現するPnpla1がアシルセラミドの産生に必要不可欠であることが示された。
初代培養表皮細胞の3次元培養を用いた蛍光色素透過性試験:
出生当日(PO)のマウスを氷上に30分放置して活動を抑制させ、背部皮膚を採取し、遺伝子型の決定には同じマウスの尻尾先端部を用いた。皮膚を5 mg/mlディスパーゼ(Invitrogen社)溶液/表皮細胞培養溶液(CnT-57;CELnTEC社)で4℃、一晩処理を行った。
野生型(Pnpla1+/+)の3次元培養組織片でbasket wave appearance(角質細胞間脂質に相当)を伴う角質層を形成し、蛍光色素Lucifer Yellowの組織内への侵入がほとんど見られなかった。これに対し、Pnpla1ホモ欠損 (Pnpla1-/-)の3次元培養組織片では角質細胞間脂質を伴う角質層が十分形成されず、組織内部がLucifer Yellowで染色された。したがって、3次元培養によるin vitroの皮膚モデルにおいても、Pnpla1が皮膚バリア機能に必要であることが示唆された。
マウスPnpla1 cDNAを挿入したpFastBac1ベクターをMax Efficiency DH10BAC competent cells(10361-012 Invitrogen社)にトランスフォームし、10 μg/ml Tetracycline、100 μg/ml X-Gal、7 μg/ml Gentamycin、40 μg/ml IPTGを加えたLBプレートに撒いた。組換えが生じた青色コロニーを選択して増幅し、Bacmid DNAを精製した。CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG(配列番号39) とAGCGGATAACAATTTCACACAGG(配列番号40)の配列を持つプライマーセットを使用し、GoTaqポリメラーゼ(M5005;Promega社)を用いて、93℃、45秒→(94℃、45秒→55℃、45秒→72℃、5分)×30サイクル→72℃、3分のPCR反応を行い、部位特異的トランスポジションが起きたことを確認した。
1×106cells/well の細胞密度で6穴プレートにSf9細胞を播き、10%FBS、100 Unit/ml Penicillin、100 Unit/ml Streptomycin、1% CD Lipid Concentrate (Invitorgen社)を含むGrace's Insect medium(11605-102; Invitorgen社)で27℃、30分間培養した。細胞の接着を確認後、Cellfectin (Invitrogen社)を用いてBacmid DNA 2 μgを遺伝子導入した。27℃で5日間培養後、培地を回収し、2,000 rpmで10分間遠心し、上清を回収しバキュロウイルス懸濁液を得た。
Sf9細胞を5×105 cells/wellの細胞密度で12穴プレートに細胞を播き、PNPLA1をコードするバキュロウイルス懸濁液を1 μlずつ添加し、27℃の条件下で3日間培養した。細胞をセルスクレイパーではがして回収し、100 μlのlysis buffer(20 mL Tris、pH 7.4、50 mM NaCl、1 mM DTT、100 μg/mL leupeptin、10μg/mL pepstatin)を加え、音波処理した。1,000 x gで5分間遠心し、上清を酵素源とした。また、コントロールとしてウイルスを感染させていないSf9細胞から同様の方法でタンパク質溶液を調製した。
図16
アシルセラミドの合成:
反応基質としてLinoleoyl Coenzyme A, [linoleoyl 1-14C](終濃度20 μM、ARV1195;American Radiolabeled Chemicals社)、N-ω-Hydroxytriacontanoyl-D-erythro-sphingosine (終濃度266 μM 、MATREYA社)をガラス製試験管中で100 μlの反応液(100 mM Tris、pH7.0、100 mM NaCl、0.1%BSA、0.03% TritonX-100)に溶解し、Sf9から調製したタンパク質溶液1 μg分を酵素源として加え、37℃で30分間撹拌しながら反応させた。脂肪酸エステルの形成を確認するためのアルカリ処理は、酵素反応直後にアルカリ処理溶液 (クロロホルム/メタノール/10 M NaOH =2: 7: 1)を1 mL加え、37℃で60分間行った。得られた反応液を、クロロホルム2 ml、メタノール2 ml、酢酸バッファー 1.6 ml を加え、撹拌後3,000 rpmで10分間遠心後、下層を回収した。窒素ガスを吹きかけて有機溶媒を蒸発させた後、5 μlクロロホルムを加えて脂質サンプルを溶解した。全量をシリカゲル60 TLCプレートにスポットし、上記のTLCによる脂質分析と同様の方法で展開した。イメージングプレート(BAS IP MS2040;富士フィルム)を用いて放射線を検出し、イメージングアナライザー(BAS-2500;富士フィルム)を用いて可視化した。
酵素源としてPNPLA1を加えた試料で、アシルセラミド(EOS)の位置にアイソトープ標識されたバンドが見られ、このバンドはアルカリ処理によって消失することから、14C標識されたリノール酸とエステル結合していることが示された。この結果は、PNPLA1がリノール酸をω-OHセラミドのω位に転移し、皮膚バリア機能に必須であるアシルセラミドを合成する活性を持つことを示している。したがって、PNPLA1を利用することでアシルセラミドの大量生産系を構築できることを示唆する。
Claims (37)
- PNPLA1遺伝子が欠損した非ヒト動物に被検物質を投与し、当該被検物質投与後の前記非ヒト動物において皮膚バリア機能の促進効果が得られたときは、当該被検物質を皮膚バリア機能促進剤として選択する工程を含む、皮膚バリア機能促進剤のスクリーニング方法。
- PNPLA1遺伝子を有する非ヒト動物に被検物質を投与し、当該被検物質投与後の前記非ヒト動物においてPNPLA1の発現量、又はω位にリノール酸がエステル結合したアシルセラミドの量が増加したときは、当該被検物質を皮膚バリア機能促進剤として選択する工程を含む、皮膚バリア機能促進剤のスクリーニング方法。
- PNPLA1遺伝子を有する細胞、又はPNPLA1遺伝子を有する非ヒト動物から採取された生体材料に被検物質を接触させた後、ω位にリノール酸がエステル結合したアシルセラミドを検出し、得られる検出結果を指標として皮膚バリア機能の促進物質を選択する工程を含む、皮膚バリア機能促進剤のスクリーニング方法。
- ω位にリノール酸がエステル結合したアシルセラミドが、被検物質を接触させない対照の細胞又は生体材料と比較して増加したときは、当該被検物質を皮膚バリア機能促進剤として選択する、請求項3に記載の方法。
- PNPLA1遺伝子を有する細胞、又はPNPLA1遺伝子を有する非ヒト動物から採取された生体材料に被検物質を接触させた後にPNPLA1の発現量、又はセラミド代謝関連遺伝子の発現量を測定し、得られる測定結果を指標として皮膚バリア機能の促進物質を選択する工程を含む、皮膚バリア機能促進剤のスクリーニング方法。
- PNPLA1の発現量が、被検物質を接触させない対照の細胞又は生体材料と比較して増加したときは、当該被検物質を皮膚バリア機能促進剤として選択する、請求項5に記載の方法。
- セラミド代謝関連遺伝子が、Elovl4、Lass3、Cyp4f39、Ugcg、Abca12、Gba、Abhd5、Aloxe3及びAlox12bからなる群から選ばれる少なくとも1つである請求項5に記載の方法。
- セラミド代謝関連遺伝子の発現量が、被検物質を接触させない対照の細胞又は生体材料と比較して増加したときは、当該被検物質を皮膚バリア機能促進剤として選択する、請求項7に記載の方法。
- PNPLA1及びω-ヒドロキシセラミドを含む試料に被検物質を接触させた後にアシルセラミドを検出し、得られる検出結果を指標として皮膚バリア機能の促進物質を選択する工程を含む、皮膚バリア機能促進剤のスクリーニング方法。
- アシルセラミドが、被検物質を接触させない対照の試料と比較して増加したときは、当該被検物質を皮膚バリア機能促進剤として選択する、請求項9に記載の方法。
- PNPLA1遺伝子及び/又はセラミド代謝関連遺伝子を搭載したマイクロアレイに被検物質を接触させた後にPNPLA1遺伝子及び/又はセラミド代謝関連遺伝子の発現を検出し、得られる検出結果を指標として皮膚バリア機能の促進物質を選択する工程を含む、皮膚バリア機能促進剤のスクリーニング方法。
- PNPLA1遺伝子の発現量が、被検物質を接触させない対照のマイクロアレイに搭載されたPNPLA1遺伝子と比較して増加したときは、当該被検物質を皮膚バリア機能促進剤として選択する、請求項11に記載の方法。
- セラミド代謝関連遺伝子が、Elovl4、Lass3、Cyp4f39、Ugcg、Abca12、Gba、Abhd5、Aloxe3及びAlox12bからなる群から選ばれる少なくとも1つである請求項11に記載の方法。
- セラミド代謝関連遺伝子の発現量が、被検物質を接触させない対照のマイクロアレイに搭載されたセラミド代謝関連遺伝子と比較して増加したときは、当該被検物質を皮膚バリア機能促進剤として選択する、請求項13に記載の方法。
- PNPLA1遺伝子が欠損した非ヒト動物に被検物質を投与し、当該被検物質投与後の前記非ヒト動物において皮膚バリア機能の促進効果が得られたときは、当該被検物質を皮膚疾患治療薬として選択する工程を含む、皮膚疾患治療薬のスクリーニング方法。
- PNPLA1遺伝子を有する非ヒト動物に被検物質を投与し、当該被検物質投与後の前記非ヒト動物においてPNPLA1の発現量、又はω位にリノール酸がエステル結合したアシルセラミドの量が増加したときは、当該被検物質を皮膚疾患治療薬として選択する工程を含む、皮膚疾患治療薬のスクリーニング方法。
- PNPLA1遺伝子を有する細胞、又はPNPLA1遺伝子を有する非ヒト動物から採取された生体材料に被検物質を接触させた後、ω位にリノール酸がエステル結合したアシルセラミドを検出し、得られる検出結果を指標として皮膚疾患治療物質を選択する工程を含む、皮膚疾患治療薬のスクリーニング方法。
- ω位にリノール酸がエステル結合したアシルセラミドが、被検物質を接触させない対照の細胞又は生体材料と比較して増加したときは、当該被検物質を皮膚疾患治療薬として選択する、請求項17に記載の方法。
- PNPLA1遺伝子を有する細胞、又はPNPLA1遺伝子を有する非ヒト動物から採取された生体材料に被検物質を接触させた後にPNPLA1の発現量、又はセラミド代謝関連遺伝子の発現量を測定し、得られる測定結果を指標として皮膚疾患治療物質を選択する工程を含む、皮膚疾患治療薬のスクリーニング方法。
- PNPLA1の発現量が、被検物質を接触させない対照の試料と比較して増加したときは、当該被検物質を皮膚疾患治療薬として選択する、請求項19に記載の方法。
- セラミド代謝関連遺伝子が、Elovl4、Lass3、Cyp4f39、Ugcg、Abca12、Gba、Abhd5、Aloxe3及びAlox12bからなる群から選ばれる少なくとも1つである請求項19に記載の方法。
- セラミド代謝関連遺伝子の発現量が、被検物質を接触させない対照の細胞又は生体材料と比較して増加したときは、当該被検物質を皮膚バリア機能促進剤として選択する、請求項21に記載の方法。
- PNPLA1及びω-ヒドロキシセラミドを含む試料に被検物質を接触させた後にω位にリノール酸がエステル結合したアシルセラミドを検出し、得られる検出結果を指標として皮膚疾患治療物質を選択する工程を含む、皮膚疾患治療薬のスクリーニング方法。
- ω位にリノール酸がエステル結合したアシルセラミドが、被検物質を接触させない対照の試料と比較して増加したときは、当該被検物質を皮膚疾患治療薬として選択する、請求項23に記載の方法。
- PNPLA1遺伝子及び/又はセラミド代謝関連遺伝子を搭載したマイクロアレイに被検物質を接触させた後にPNPLA1遺伝子及び/又はセラミド代謝関連遺伝子の発現を検出し、得られる検出結果を指標として皮膚疾患治療物質を選択する工程を含む、皮膚疾患治療薬のスクリーニング方法。
- PNPLA1遺伝子の発現量が、被検物質を接触させない対照のマイクロアレイに搭載されたPNPLA1遺伝子と比較して増加したときは、当該被検物質を皮膚疾患治療薬として選択する、請求項25に記載の方法。
- セラミド代謝関連遺伝子が、Elovl4、Lass3、Cyp4f39、Ugcg、Abca12、Gba、Abhd5、Aloxe3及びAlox12bからなる群から選ばれる少なくとも1つである請求項25に記載の方法。
- セラミド代謝関連遺伝子の発現量が、被検物質を接触させない対照のマイクロアレイに搭載されたセラミド代謝関連遺伝子と比較して増加したときは、当該被検物質を皮膚バリア機能促進剤として選択する、請求項27に記載の方法。
- 皮膚疾患が魚鱗癬、アトピー性皮膚炎、乾癬、荒れ肌、乾皮症、角化症、乾燥肌、湿疹及び乾燥性皮膚炎からなる群から選ばれる少なくとも1つである請求項15〜28のいずれか1項に記載の方法。
- ω-ヒドロキシセラミドにPNPLA1を作用させた後、アシルセラミドを採取することを特徴とするアシルセラミドの製造方法。
- PNPLA1遺伝子若しくはセラミド代謝関連遺伝子を有する細胞、又はPNPLA1遺伝子若しくはセラミド代謝関連遺伝子を有する非ヒト動物から採取された生体材料に被検物質を接触させた後にPNPLA1遺伝子及び/又はセラミド代謝関連遺伝子の発現量を測定し、得られる測定結果を指標として被検物質の性質を評価することを特徴とする、被検物質の検査方法。
- PNPLA1遺伝子及び/又はセラミド代謝関連遺伝子を搭載したマイクロアレイに被検物質を接触させた後にPNPLA1遺伝子及び/又はセラミド代謝関連遺伝子の発現量を測定し、得られる測定結果を指標として被検物質の性質を評価することを特徴とする、被検物質の検査方法。
- PNPLA1遺伝子若しくはセラミド代謝関連遺伝子を有する細胞、又はPNPLA1遺伝子若しくはセラミド代謝関連遺伝子を有する非ヒト動物から採取された生体材料に被検物質を接触させた後、ω位にリノール酸がエステル結合したアシルセラミドを検出し、得られる検出結果を指標として被検物質の性質を評価することを特徴とする、被検物質の検査方法。
- PNPLA1遺伝子の発現量が、被検物質を接触させない対照の細胞又は生体材料と比較して低下したときは、当該被検物質は皮膚バリア機能を低下させる物質であると判定する、請求項31に記載の方法。
- セラミド代謝関連遺伝子が、Elovl4、Lass3、Cyp4f39、Ugcg、Abca12、Gba、Abhd5、Aloxe3及びAlox12bからなる群から選ばれる少なくとも1つである請求項31〜33のいずれか1項に記載の方法。
- セラミド代謝関連遺伝子の発現量が、被検物質を接触させない対照のマイクロアレイに搭載されたセラミド代謝関連遺伝子と比較して低下したときは、当該被検物質は皮膚バリア機能を低下させる物質であると判定する、請求項35に記載の方法。
- ω位にリノール酸がエステル結合したアシルセラミドが、被検物質を接触させない対照の細胞又は生体材料と比較して低下したときは、当該被検物質は皮膚バリア機能を低下させる物質であると判定する、請求項33に記載の方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2014116066A JP6460646B2 (ja) | 2014-06-04 | 2014-06-04 | 皮膚バリア機能促進剤のスクリーニング方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2014116066A JP6460646B2 (ja) | 2014-06-04 | 2014-06-04 | 皮膚バリア機能促進剤のスクリーニング方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2015230222A true JP2015230222A (ja) | 2015-12-21 |
JP6460646B2 JP6460646B2 (ja) | 2019-01-30 |
Family
ID=54887066
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2014116066A Active JP6460646B2 (ja) | 2014-06-04 | 2014-06-04 | 皮膚バリア機能促進剤のスクリーニング方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP6460646B2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111432799A (zh) * | 2017-11-24 | 2020-07-17 | 韩国外泌体生技有限公司 | 包含干细胞来源外排体作为有效成分的组合物在使皮肤屏障增强和使其功能改善中的用途 |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002322187A (ja) * | 2001-04-26 | 2002-11-08 | Kanebo Ltd | 新規スフィンゴミエリン及び皮膚外用剤 |
JP2002370998A (ja) * | 1998-09-30 | 2002-12-24 | Kao Corp | セラミド産生促進剤 |
JP2008261754A (ja) * | 2007-04-12 | 2008-10-30 | Kao Corp | 被験物質の評価又はスクリーニング方法 |
US20120034613A1 (en) * | 2010-08-03 | 2012-02-09 | Nse Products, Inc. | Apparatus and Method for Testing Relationships Between Gene Expression and Physical Appearance of Skin |
JP2012183061A (ja) * | 2011-02-14 | 2012-09-27 | Kose Corp | 表皮バリア機能調整剤のスクリーニング又は評価方法 |
US20130065775A1 (en) * | 2009-11-17 | 2013-03-14 | Catherine Andre | Methods for diagnosing skin diseases |
-
2014
- 2014-06-04 JP JP2014116066A patent/JP6460646B2/ja active Active
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002370998A (ja) * | 1998-09-30 | 2002-12-24 | Kao Corp | セラミド産生促進剤 |
JP2002322187A (ja) * | 2001-04-26 | 2002-11-08 | Kanebo Ltd | 新規スフィンゴミエリン及び皮膚外用剤 |
JP2008261754A (ja) * | 2007-04-12 | 2008-10-30 | Kao Corp | 被験物質の評価又はスクリーニング方法 |
US20130065775A1 (en) * | 2009-11-17 | 2013-03-14 | Catherine Andre | Methods for diagnosing skin diseases |
US20120034613A1 (en) * | 2010-08-03 | 2012-02-09 | Nse Products, Inc. | Apparatus and Method for Testing Relationships Between Gene Expression and Physical Appearance of Skin |
JP2012183061A (ja) * | 2011-02-14 | 2012-09-27 | Kose Corp | 表皮バリア機能調整剤のスクリーニング又は評価方法 |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111432799A (zh) * | 2017-11-24 | 2020-07-17 | 韩国外泌体生技有限公司 | 包含干细胞来源外排体作为有效成分的组合物在使皮肤屏障增强和使其功能改善中的用途 |
JP2021504366A (ja) * | 2017-11-24 | 2021-02-15 | エクソコバイオ インコーポレイテッド | 幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含む組成物の皮膚バリアの強化ないし機能改善の用途 |
JP7102021B2 (ja) | 2017-11-24 | 2022-07-19 | エクソコバイオ インコーポレイテッド | 幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含む組成物の皮膚バリアの強化ないし機能改善の用途 |
US11529370B2 (en) | 2017-11-24 | 2022-12-20 | Exocobio Inc. | Use of composition comprising stem cell-derived exosome as effective ingredient in strengthening skin barrier and improving skin barrier function |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP6460646B2 (ja) | 2019-01-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Grond et al. | PNPLA1 deficiency in mice and humans leads to a defect in the synthesis of omega-O-acylceramides | |
Binczek et al. | Obesity resistance of the stearoyl-CoA desaturase-deficient (scd1-/-) mouse results from disruption of the epidermal lipid barrier and adaptive thermoregulation | |
Sassa et al. | Impaired epidermal permeability barrier in mice lacking elovl1, the gene responsible for very-long-chain fatty acid production | |
Gosejacob et al. | Ceramide synthase 5 is essential to maintain C16: 0-ceramide pools and contributes to the development of diet-induced obesity | |
Mirza et al. | DHCR24 gene knockout mice demonstrate lethal dermopathy with differentiation and maturation defects in the epidermis | |
Arimura et al. | Mouse model carrying H222P-Lmna mutation develops muscular dystrophy and dilated cardiomyopathy similar to human striated muscle laminopathies | |
Eckl et al. | Impaired epidermal ceramide synthesis causes autosomal recessive congenital ichthyosis and reveals the importance of ceramide acyl chain length | |
Doege et al. | Targeted deletion of FATP5 reveals multiple functions in liver metabolism: alterations in hepatic lipid homeostasis | |
Gareus et al. | Normal epidermal differentiation but impaired skin-barrier formation upon keratinocyte-restricted IKK1 ablation | |
Chen et al. | Phosphatidylinositol 3-kinase signaling determines kidney size | |
Tsoutsikos et al. | Evidence that unsaturated fatty acids are potent inhibitors of renal UDP-glucuronosyltransferases (UGT): kinetic studies using human kidney cortical microsomes and recombinant UGT1A9 and UGT2B7 | |
Honda et al. | Decreased skin barrier lipid acylceramide and differentiation-dependent gene expression in ichthyosis gene Nipal4-knockout mice | |
Smyth et al. | A mouse model of harlequin ichthyosis delineates a key role for Abca12 in lipid homeostasis | |
Grond et al. | Skin barrier development depends on CGI-58 protein expression during late-stage keratinocyte differentiation | |
Naganuma et al. | Disruption of the Sjögren-Larsson syndrome gene Aldh3a2 in mice increases keratinocyte growth and retards skin barrier recovery | |
Mason et al. | Keratinocyte growth factor and the transcription factors C/EBPα, C/EBPδ, and SREBP-1c regulate fatty acid synthesis in alveolar type II cells | |
Kanetake et al. | Neural symptoms in a gene knockout mouse model of Sjögren‐Larsson syndrome are associated with a decrease in 2‐hydroxygalactosylceramide | |
Mezzar et al. | Phytol-induced pathology in 2-hydroxyacyl-CoA lyase (HACL1) deficient mice. Evidence for a second non-HACL1-related lyase | |
Lin et al. | Fatty acid transport protein 1 can compensate for fatty acid transport protein 4 in the developing mouse epidermis | |
Berendse et al. | Liver disease predominates in a mouse model for mild human Zellweger spectrum disorder | |
Robert-Cooperman et al. | PANDER transgenic mice display fasting hyperglycemia and hepatic insulin resistance | |
Ota et al. | Bifunctional DEGS2 has higher hydroxylase activity toward substrates with very-long-chain fatty acids in the production of phytosphingosine ceramides | |
JP6460646B2 (ja) | 皮膚バリア機能促進剤のスクリーニング方法 | |
Huybrechts et al. | Identification of a novel PEX14 mutation in Zellweger syndrome | |
Yang et al. | The defects in development and apoptosis of cardiomyocytes in mice lacking the transcriptional factor Pax-8 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20170525 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20180126 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20180206 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20180405 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180606 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20180703 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20181002 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20181105 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20181211 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20181225 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6460646 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |