KR20190060651A

KR20190060651A - 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물의 피부장벽 강화 내지 기능 개선 용도

Info

Publication number: KR20190060651A
Application number: KR1020180093873A
Authority: KR
Inventors: 이용원; 조병성
Original assignee: 주식회사 엑소코바이오
Priority date: 2017-11-24
Filing date: 2018-08-10
Publication date: 2019-06-03
Also published as: KR102127527B1; JP2021504366A; US20200276233A1; CN111432799A; US11529370B2; EP3695830A1; KR20190123709A; JP7102021B2; EP3695830A4; KR20190060646A

Abstract

본 발명의 조성물은 피부 장벽 보호, 강화 내지 기능 개선과 관련된 객관적 지표들을 개선시킨다. 본 발명의 조성물은 예를 들어, TEWL(경피수분손실)과 같은 피부 각질층의 수분 감소 지표를 개선시키고, 피부수분 함유량(skin hydration)을 증가시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 세라마이드, 디히드로세라마이드 및 스핑고 염기의 함량 증가, 이들의 합성에 관여하는 효소 활성 증가, 및 이들의 분해에 관여하는 효소 활성 감소의 효능을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 조성물은 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 약학 조성물, 피부외용제 및 화장료 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물의 피부장벽 강화 내지 기능 개선 용도 {A composition comprising an exosome derived from stem cell as an active ingredient and its application for reinforcing or improving skin barrier}

본 발명은 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물의 피부장벽 강화 내지 기능 개선 용도에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 약학 조성물, 피부외용제 및 화장료 조성물에 관한 것이다.

추가로, 본 발명은 피부장벽 강화 내지 기능 개선에 있어서 임상적 적용이 가능한 고순도이면서 입자크기 분포가 균일한 줄기세포 유래의 엑소좀을 대량으로 수득할 수 있고, 이와 같이 수득된 기능적 활성이 우수한 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 조성물을 저가로 대량으로 제공할 수 있는 임상 및 상업적으로 뛰어난 기술에 관한 것이다.

피부는 표피, 진피, 피하지방조직의 3개 층으로 크게 구성된다. 표피(epidermis)는 바깥쪽에서 안쪽으로 각질층, 투명층, 과립층, 기저층으로 나뉜다. 표피의 최외곽 층인 피부 각질층(stratum corneum)은 피부장벽 기능의 가장 중요한 구조로서, 무핵의 편평한 각질세포(corneocytes)와, 각질세포간 지질(SC intercellular lipid)로 이루어져 있다. 피부 각질층의 각질세포 간에는 스핑고지질(sphingolipids), 인지질(phospholipids), 콜레스테롤 황산염(cholesterol sulfate), 중성지질(neutral lipids) 등 다양한 종류의 지질이 존재하고, 이러한 지질들은 각질세포 사이에 존재하여 피부 수분의 증발을 방지하고, 외부 자극이나 오염으로부터 피부를 보호하는 피부장벽의 기능을 한다.

특히, 각질세포가 합성하는 세라마이드, 콜레스테롤, 및 지방산과 같은 세포간 지질로 형성된 다층 라멜라 지질층(multi lamella lipid layer) 또는 다층 라멜라 구조(multi lamella structure)는 피부 수분의 과도한 유실을 방지하고, 외부의 알레르겐이나 유해 물질이 피부로 침투하는 것을 방지하는 피부장벽 역할을 한다. 세라마이드는 N-아실레이티드 스핑고이드(N-acylated sphingoid) 화합물로서, 스핑고신, 피토스핑고신, 스핑가닌이라는 스핑고 염기(sphingoid base)에 지방산이 아미드 결합된 물질이다. 또한, 각질세포 외피는 인볼루크린(involucrin), 로리크린(loricrin), 필라그린(filaggrin) 등의 단백질 막으로 구성되며, 세라마이드 중 히드록시 세라마이드(hydroxyceramide)는 이들 단백질에 강력하게 결합하여 피부장벽의 구조를 견고하게 하는 것이 알려져 있다. 따라서, 세라마이드와 히드록시 세라마이드는 다층 라멜라 지질층의 피부장벽을 형성하고 단백질 피부장벽 구조 강화에 기여하므로, 세라마이드, 히드록시 세라마이드 및/또는 스핑고 염기의 생성량 증가, 이들의 합성에 관여하는 효소 활성 증가, 및 이들의 분해에 관여하는 효소 활성 감소는 피부 장벽 강화에 기여한다고 할 수 있다.

한편, 각종 스트레스나 환경 오염으로 인한 피부 스트레스, 잦은 세안 및 자연적인 피부 노화, 필라그린 유전자(FLG) 기능소실 돌연변이 등의 여러 가지 원인으로 인하여 피부장벽이 손상될 수 있다. 피부장벽이 손상되면 화학물질과 미생물들이 피부 속으로 쉽게 침투하여 피부염, 피부 건조증 등을 유발할 수 있다.

따라서, 피부장벽의 손상이 오기 전에 피부장벽을 선제적으로 보호, 강화 내지는 개선하기 위해 피부 장벽 강화 또는 피부 보습을 위한 조성물이나 기능성 화장품이 최근 주목을 받고 있다. 피부장벽 강화 내지 기능 개선을 위해 예를 들어, 수분을 흡수하는 성질이 있는 휴멕턴트(humectant)나, 수분 증발을 방지하는 폐쇄 보습제(occlusive moisturizer)가 사용되고 있다. 피부장벽이 일단 손상되면, 보습제를 바르더라도 피부장벽이 잘 회복되지 않아 스테로이드 치료제를 처방하지만, 스테로이드 치료제를 장기간 사용하게 되면 피부가 위축되거나 모세혈관이 확장될 수 있고, 오히려 피부장벽 기능의 약화를 초래할 수 있다. 따라서, 피부장벽이 손상되기 전에 피부장벽의 보호, 강화 내지는 기능 개선을 하는 것이 중요하다.

이러한 문제점을 감안하여 천연물을 이용한 피부장벽 강화 내지 기능 개선에 대한 연구가 활발하다. 이러한 천연물을 원료로 하는 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 조성물의 경우, 천연 추출물 내의 유효성분 함량이 적은 관계로 피부장벽 강화 내지 기능 개선 효과를 얻기 위해서는 많은 양의 사용이 필요하고, 이들 중 대부분은 천연물 소재라는 점을 마케팅에 활용하고 있을 뿐 피부장벽 강화 내지 기능 개선의 실질적 효능에 대해서는 과학적 연구가 좀더 필요한 상황이다.

한편, 줄기세포를 이용하여 피부 상태나 질환을 개선 또는 치료하고자 하는 방법이 제안되고 있다. 배아줄기세포 또는 태아조직 유래 줄기세포는 분화능력 및 재생치료능력이 우수하고 거부반응이 적지만, 윤리적 문제로 임상에 적용될 수 없고 종양을 형성할 수 있는 위험성이 존재한다. 이에 대한 대안으로서 성체줄기세포를 이용하여 피부 상태나 질환을 개선 또는 치료하고자 하는 방법이 제안되었다. 그러나, 환자 자신의 성체줄기세포가 이닌 타인의 성체줄기세포를 사용한 경우 이식편대숙주병(graft-versus-host disease)을 일으킬 위험이 있고, 자가 성체줄기세포를 이용하여 치료를 하기 위해서는 환자로부터 성체줄기세포를 채취한 후 이를 배양하는 과정이 필요하여 복잡하고 비용이 많이 드는 문제가 있다.

최근에는 전술한 바와 같은 줄기세포의 문제점을 감안하여 성체줄기세포를 배양하여 얻은 배양액을 이용하여 피부 상태나 질환을 개선 또는 치료하고자 하는 시도가 있다. 그러나, 성체줄기세포 배양액에는 성체줄기세포가 분비하는 다양한 단백질, 사이토카인, 성장인자 등이 함유되어 있는 반면, 세포가 성장하면서 분비한 노폐물, 오염방지를 위해 첨가된 항생제, 동물유래 혈청 등의 성분도 포함되어 있기 때문에 피부에 사용할 경우 각종 위험에 노출될 가능성이 높다.

최근 세포 분비물(secretome)에 세포의 행동(behavior)을 조절하는 다양한 생체활성인자가 포함되어 있다는 연구가 보고되고 있으며, 특히 세포 분비물 내에는 세포 간 신호전달 기능을 갖는 '엑소좀(exosome)'이 포함되어 있어 그 성분과 기능에 대한 연구가 활발히 진행 중에 있다.

세포는 세포외 환경에 다양한 막(membrane) 유형의 소포체를 방출하는데, 통상 이러한 방출 소포체들을 세포외 소포체(Extracellular vesicles, EV)라고 부르고 있다. 세포외 소포체는 세포막 유래 소포체, 엑토좀(ectosomes), 쉐딩 소포체(shedding vesicles), 마이크로파티클(microparticles), 엑소좀 등으로 불려지기도 하며, 경우에 따라서는 엑소좀과는 구별되어 사용되기도 한다.

엑소좀은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터 크기의 소포체로서 내부에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다. 엑소좀은 유래된 세포의 성질 및 상태에 따라 특이적인 유전물질과 생체활성 인자들이 포함되어 있다. 증식하는 줄기세포 유래 엑소좀의 경우 세포의 이동, 증식 및 분화와 같은 세포 행동을 조절하고, 조직 재생과 관련된 줄기세포의 특성이 반영되어 있다(Nature Review Immunology 2002 (2) 569-579).

그러나, 엑소좀을 이용한 일부 질환의 치료에 대한 가능성 제시 등 다양한 연구가 이루어지고 있음에도 불구하고, 보다 면밀한 임상 및 비임상 연구가 필요하며, 특히 엑소좀이 작용하는 다양한 표적을 과학적으로 규명하여 엑소좀을 다양한 질환 치료에 응용할 수 있는 기술의 개발이 필요한 실정이다.

본 발명자들은 피부장벽 강화 내지 기능 개선과 관련하여 종래 알려진 보습제나 스테로이드 치료제에 비하여 피부장벽 강화 내지는 기능 개선 효과가 뛰어나고 안전한 새로운 소재를 개발하고자 노력하였다. 이에 본 발명자들은 줄기세포로부터 유래된 엑소좀의 새로운 용도에 대해 예의 연구를 거듭하던 중, 줄기세포 배양액으로부터 분리된 엑소좀이 전술한 바와 같은 줄기세포 자체나 줄기세포 배양액의 안전성 문제를 해결할 수 있고, 피부장벽 강화 내지 기능 개선에 효과적임을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

한편, 상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 본 발명의 "선행 기술"로서 이용될 수 있다는 승인으로서 인용한 것은 아님을 이해하여야 한다.

대한민국 등록특허공보 제10-1780111호 (2017.09.19) 대한민국 등록특허공보 제10-1784160호 (2017.11.06) 대한민국 등록특허공보 제10-1663912호 (2016.10.10) 대한민국 공개특허공보 제10-2017-0099743호 (2017.09.01) 대한민국 공개특허공보 제10-2016-0116802호 (2016.10.10)

Man MQ et al., Characterization of a hapten-induced, murine model with multiple features of atopic dermatitis: structural, immunologic, and biochemical changes following single versus multiple oxazolone challenges, Journal of Investigative Dermatology (2008) 128(1), 79-86 (2007.08.02) Pin Li et al., Progress in Exosome Isolation Techniques, Theranostics, 2017, 7(3): 789-804 (2017.01.26) Coumans et al., Methodological Guidelines to Study Extracellular Vesicles, Circulation Research, 2017, 120:1632-1648 (2017.05.12)

본 발명의 목적은 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물의 피부장벽 강화 내지 기능 개선 용도를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는, 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 약학 조성물, 피부외용제 및 화장료 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 고순도이면서 입자크기 분포가 균일한 줄기세포 유래의 엑소좀을 대량으로 수득할 수 있고, 이와 같이 수득된 기능적 활성이 우수한 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 이용하여, 치료용을 제외한 피부장벽 강화 내지 기능 개선을 통해 포유동물 피부의 상태를 조절하는 미용방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 이용하여, 피부장벽 기능 손상으로 인한 피부질환의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는 방법을 제공하는데 있다.

그러나, 전술한 바와 같은 본 발명의 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 피부장벽 강화 내지 기능 개선에 있어서 임상적 적용이 가능한 고순도이면서 입자크기 분포가 균일한 줄기세포 유래의 엑소좀을 대량으로 수득할 수 있고, 이와 같이 수득된 기능적 활성이 우수한 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 조성물을 저가로 대량으로 제공할 수 있는 임상 및 상업적으로 뛰어난 신규한 기술을 제공한다.

본 명세서에서 용어, "엑소좀(exosomes)"은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터(바람직하게는 대략 30~200 nm) 크기의 소포체를 의미한다(단, 분리 대상이 되는 세포 종류, 분리방법 및 측정방법에 따라 엑소좀의 입자 크기는 가변될 수 있음)(Vasiliy S. Chernyshev et al., "Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes", Anal Bioanal Chem, (2015) DOI 10.1007/s00216-015-8535-3). 엑소좀에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "피부장벽 강화 내지 기능 개선"이라 함은 피부 각질층(stratum corneum)의 피부장벽 기능을 보호, 강화 내지는 개선하는 것을 의미하고, 진피나 피하지방조직의 재생이나 기능 개선을 의미하지 않는다. 예를 들어, "피부장벽 강화 내지 기능 개선"은 피부 각질층의 수분 감소 방지, 예를 들어 TEWL(경피수분손실)과 같은 피부 각질층의 수분감소 지표의 개선, 피부수분 함유량(skin hydration)의 증가, 세라마이드, 디히드로세라마이드 및/또는 스핑고 염기의 생성량 증가 등과 같은 피부장벽지표 개선을 통해 진정한 의미의 피부 각질층의 피부장벽의 보호, 강화 및 기능 개선을 가져오는 것을 의미한다.

한편, 줄기세포 유래의 엑소좀을 이용한, 제한적인 주름개선 및 피부재생 효과가 보고된 바가 있다. 그러나, 상기 종래기술에 있어서의 엑조좀을 이용한 피부재생은 피부각질층의 피부장벽의 보호, 강화 또는 기능 개선에 관한 것이 아니고, 피하지방조직의 재생을 통해 주름을 개선하거나 피부 탄력을 회복시키는 것에 관한 것이었다. 그리고 줄기세포, 줄기세포 배양액 등을 이용하여 피부 중 진피층을 재생하여 창상을 치료하고, 피하지방조직을 재생하여 피부 탄력을 개선하고자 한 시도는 있으나, 현재까지 줄기세포 배양액으로부터 분리 정제된 엑소좀을 사용할 때 전술한 바와 같이 정의된 "피부장벽 강화 내지 기능 개선" 효과가 있다는 것에 대해서는 공지된 바가 없었다.

현재까지 대량 배양이 가능한 줄기세포를 배양한 후, 줄기세포 배양액으로부터 대량으로 경제적으로 분리 정제된 엑소좀을 피부장벽 강화 내지 기능 개선에 임상적으로 적용가능하게 구현한 치료제는 개발된 바가 없다. 예를 들어, 지방에서 유래한 지방줄기세포(adipose-derived stem cells)는 지방 흡입술과 같은 간단한 시술에 의해 대량으로 입수가 가능하고 골수, 제대 또는 제대혈 등에 비해 약 40배 정도의 줄기세포가 있어 상업적으로는 가장 원가가 저렴하고 생산량이 많지만, 지방 내에 세포 잔해물, 노폐물, 단백질 및 거대입자와 같은 불순물이 많아 지방 유래 줄기세포 배양액으로부터 고순도이면서 입자크기 분포가 균일한 엑소좀을 경제적으로 대량으로 분리하는 것이 어렵다. 따라서, 경제성 측면에서 줄기세포 배양액으로부터 고순도의 입자크기 분포가 균일한 엑소좀을 대량으로 분리하는 것에는 기술적 장벽이 있다고 할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학 조성물, 피부외용제 또는 화장료 조성물로 적용될 때, 유효성분으로 함유된 줄기세포 유래의 엑소좀이 피부장벽 강화 내지 기능 개선에 유의적인 효과를 나타내며, 줄기세포 자체나 줄기세포 배양액의 안전성 문제를 해결할 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물에 포함된 줄기세포 유래의 엑소좀은 종래에 알려진 제한적인 주름개선 및 피부재생과는 전혀 다른 메카니즘으로 피부장벽의 강화 내지 기능 개선효능을 나타내며 이러한 효능은 종래기술로부터 전혀 예측할 수 없는 것임을 명백히 밝혀 둔다.

본 발명의 일 구체예의 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 조성물은, 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함한다.

또한, 본 발명의 일 구체예의 조성물에 있어서, 상기 엑소좀은 하기의 단계들을 수행하여 수득될 수 있다: (a) 줄기세포 배양액에 트레할로오스를 첨가하는 단계, (b) 상기 트레할로오스가 첨가된 줄기세포 배양액을 여과하는 단계, (c) 상기 여과된 줄기세포 배양액으로부터, TFF(Tangential Flow Filtration)를 이용하여 엑소좀을 분리하는 단계, 및 (d) 탈염과 버퍼교환(diafiltration)에 사용되는 완충용액에 트레할로오스를 첨가하고, 상기 트레할로오스가 첨가된 완충용액을 이용한 TFF(Tangential Flow Filtration)를 이용하여, 상기 분리된 엑소좀에 대한 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 수행하는 단계.

본 발명의 일 구체예의 조성물에 있어서, 상기 (d) 단계에서 탈염과 버퍼교환(diafiltration)에 사용되는 완충용액에 트레할로오스를 첨가하면, 입자크기 분포가 균일하고 순도가 높은 엑소좀을 효과적으로 수득할 수 있다(도 6 참조). 본 발명에서는 TFF에 의한 엑소좀 분리 전의 사전 여과 과정((b) 단계)과 엑소좀 분리 후 TFF에 의한 탈염 및 버퍼교환 과정((d) 단계)에서 트레할로우스를 사용하는 것에 의해 고순도의 입자크기 분포가 균일한 엑소좀을 높은 수율로 수득할 수 있다.

한편, 본 발명에 있어서 트레할로오스는 세포 잔해물, 노폐물, 단백질 및 거대 입자와 같은 불순물에 대해 엑소좀을 효율적으로 분별할 수 있는 기능을 부여한다.

본 발명의 일 구체예의 조성물에 있어서, 상기 탈염과 버퍼교환은 연속적으로 수행하거나 단속적으로 수행할 수 있다. 시작 부피(starting volume)에 대하여 적어도 4배, 바람직하게는 6배 내지는 10배 이상, 보다 바람직하게는 12배 이상의 부피를 갖는 완충용액을 이용하여 탈염과 버퍼교환을 수행할 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 조성물에 있어서, TFF를 위해 MWCO(molecular weight cutoff) 100,000 Da(Dalton), 300,000 Da, 500,000 Da 또는 750,000 Da의 TFF 필터, 또는 0.05 ㎛ TFF 필터를 사용할 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 조성물에 있어서, 상기 (c) 단계는 TFF(Tangential Flow Filtration)를 이용하여 1/100 내지 1/25의 부피까지 농축하는 과정을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 조성물에 있어서, 상기 엑소좀은, TEWL(transepidermal water loss)을 감소시키고 피부수분 함유량(skin hydration)을 증가시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 구체예의 조성물에 있어서, 상기 엑소좀은 세라마이드, 디히드로세라마이드 또는 스핑고 염기 중 적어도 1종의 생성량을 증가시키는 것을 특징으로 한다.

구체적으로, 상기 엑소좀은 C16 세라마이드, C18 세라마이드, C20 세라마이드, C22 세라마이드, 또는 C24 세라마이드, C24:1 세라마이드 중 적어도 1종의 생성량 및 총 세라마이드의 생성량을 증가시킬 수 있다. 또한, 상기 엑소좀은 C16 디히드로세라마이드, C18 디히드로세라마이드, C22 디히드로세라마이드, C24 디히드로세라마이드, 또는 C24:1 디히드로세라마이드 중 적어도 1종의 생성량 및 총 디히드로세라마이드의 생성량을 증가시킬 수 있다. 추가로, 상기 엑소좀은 S1P(Sphingosine-1-phosphate) 또는 스핑고신 중 적어도 1종의 생성량을 증가시킬 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 조성물에 있어서, 상기 엑소좀은 스핑고신 키나아제(Sphingosine kinase)인 Sphk1의 활성을 증가시키고 스핑고 염기인 S1P(Sphingosine 1-phosphate)를 분해하는 효소인 S1P 리아제(S1P lyase)의 활성을 감소시킬 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 조성물에서 상기 줄기세포의 종류는 제한되지 않으나, 바람직하게는 중간엽 줄기세포, 예를 들어 지방, 골수, 제대 또는 제대혈 유래 줄기세포일 수 있으며, 보다 바람직하게는 지방 유래 줄기세포일 수 있다. 상기 지방 유래 줄기세포의 종류는 병원체에 의한 감염의 위험이 없고 면역 거부 반응을 일으키지 않는 것이라면 제한되지 않으나, 바람직하게는 인간지방 유래 줄기세포일 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 조성물은 다양한 원인에 기인한 피부장벽 기능 손상의 예방, 억제, 완화 또는 개선에 효과적으로 이용될 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 조성물은 약학 조성물로 제조될 수 있다. 본 발명의 일 구체예의 조성물이 약학 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 일 구체예에 따른 약학 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제 등을 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 트레할로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 카보네이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스(microcrystalline cellulose), 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 미네랄 오일 등을 들 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 환제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 과립제, 엘릭시르제(elixirs), 에어로졸 등의 경구투여용 제제, 외용제, 좌제, 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 투여는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 약학 조성물의 투여경로는 약물이 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여로는 경피 투여, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 동맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 국소 투여, 직장 내 투여 등을 거론할 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것이 아니며 당업계에 알려진 다양한 투여 방법을 배제하지 않는다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물은 활성 물질이 표적 조직 또는 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 유효량은 치료 효과를 기대하기 위하여 투여에 요구되는 양을 의미한다.

본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 비경구 투여용 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 또는 좌제일 수 있다. 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 비경구 투여용 제제는 주사제로도 제조될 수 있다. 본 발명의 일 구체예의 주사제는 수성 주사제, 비수성 주사제, 수성 현탁 주사제, 비수성 현탁 주사제, 또는 용해 또는 현탁하여 사용하는 고형 주사제 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 구체예의 주사제는 그 종류에 따라 주사용 증류수, 식물유(예를 들어, 낙화생유, 참기름, 동백기름 등), 모노글리세리드, 디글리세리드, 프로필렌글리콜, 캄퍼, 벤조산에스트라디올, 차살리실산비스무트, 아르세노벤졸나트륨, 또는 황산스트렙토마이신 중 적어도 1종을 포함할 수 있고, 선택적으로 안정제나 방부제를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 배합비율은 전술한 바와 같은 추가 성분들의 종류나 양, 형태 등에 따라서 적당하게 선택할 수 있다. 예를 들어, 주사제 전량에 대해, 본 발명의 약학 조성물은 약 0.1 내지 99 중량%, 바람직하게는 약 10 내지 90 중량% 정도 포함될 수 있다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 적합한 투여량은 환자의 질환 종류, 질환의 경중, 제형의 종류, 제제화 방법, 환자의 연령, 성별, 체중, 건강 상태, 식이, 배설률, 투여 시간 및 투여 방법에 따라 조절될 수 있다. 예를 들어, 성인에게 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물을 투여하는 경우, 하루에 0.001 mg/kg ~ 100 mg/kg의 용량으로 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.

한편, 본 발명의 일 구체예의 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 조성물이 피부외용제 및/또는 화장료 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 효과를 손상하지 않는 범위내에서 통상 화장품이나 피부외용제에 이용되는 성분, 예를 들면 보습제, 산화방지제, 유성성분, 자외선 흡수제, 유화제, 계면활성제, 증점제, 알콜류, 분말성분, 색재, 수성성분, 물, 각종 피부영양제 등을 필요에 따라 적절히 배합할 수 있다.

또한, 본 발명의 일 구체예의 피부외용제 및/또는 화장료 조성물은 줄기세포 유래의 엑소좀 이외에, 그 작용(피부장벽 강화 내지 기능 개선 등)을 손상시키지 않는 한도에서 종래부터 사용된 피부장벽 강화 내지 기능 개선제 및/또는 보습제를 함께 혼합하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 엑소좀은 하이드로겔, 히알루론산, 히알루론산 염(예를 들어 히알루론산 나트륨 등), 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종에 담지되거나 혼합될 수 있다. 본 발명의 일 구체예의 피부외용제 및/또는 화장료 조성물에서, 상기 하이드로겔의 종류는 제한되지 않으나, 바람직하게는 겔화 고분자를 다가 알코올에 분산시켜 얻은 하이드로겔일 수 있다. 상기 겔화 고분자는 플루로닉, 정제한천, 아가로오스, 젤란검, 알긴산, 카라기난, 카시아검, 잔탄검, 갈락토만난, 글루코만난, 펙틴, 셀룰로오스, 구아검 및 로커스트빈검으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종일 수 있고, 상기 다가 알코올은 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 이소부틸렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 소르비톨, 자일리톨 및 글리세린으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종일 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 피부외용제 및/또는 화장료 조성물은 예를 들면, 패취, 마스크팩, 마스크시트, 크림, 토닉, 연고, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 로션, 젤, 오일, 팩, 스프레이, 에어졸, 미스트, 파운데이션, 파우더, 기름 종이 등의 다양한 형태에 적용할 수 있다. 예를 들어, 상기 피부외용제 및/또는 화장료 조성물은 패취, 마스크팩 또는 마스크시트의 적어도 일면(一面)에 도포되거나 침적될 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 피부외용제가 화장료 조성물로 제조되는 경우, 피부장벽 강화, 기능 개선 및/또는 피부 보습을 목적으로 사용되며, 화장품 제형은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 예를 들어 패취, 마스크팩, 마스크시트, 유연화장수, 영양화장수, 수렴화장수, 영양크림, 마사지크림, 아이크림, 클렌징크림, 에센스, 아이에센스, 클렌징로션, 클렌징폼, 클렌징워터, 선스크린, 립스틱, 비누, 샴푸, 계면활성제-함유 클렌징, 입욕제, 바디로션, 바디크림, 바디오일, 바디에센스, 바디세정제, 염모제, 헤어토닉 등으로 제형화할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예의 피부외용제 및/또는 화장료 조성물은 피부외용제 및/또는 화장품에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 그리고 담체를 포함할 수 있다. 또한, 피부외용제 및/또는 화장료 조성물에 대한 각각의 제형에 있어서, 다른 성분들은 피부외용제 및/또는 화장료 조성물의 종류 또는 사용목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.

본 발명의 다른 구체예는 상기 조성물을 이용하여, 치료용을 제외한 피부장벽 강화 내지 기능 개선을 통해 포유동물 피부의 상태를 조절하는 미용방법을 제공한다. 본 발명의 미용방법에 있어서, 피부의 상태 조절이란 피부의 상태를 개선시키고/시키거나 피부의 상태를 예방적으로 조절하는 것을 의미하고, 피부의 상태 개선이란 피부 조직의 외관 및 느낌의 시각적 및/또는 촉각적으로 지각할 수 있는 긍정적인 변화를 의미한다. 예를 들어, 피부의 상태 개선이란 피부 보습 향상, 피부 매끄러움 향상, 피부의 붉은기 감소 등일 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 미용방법은, (a) 상기 조성물을 포유동물의 피부에 직접 도포하는 것, (b) 상기 조성물이 도포되거나 침적된 패취, 마스크팩 또는 마스크시트를 포유동물의 피부에 접촉 또는 부착하는 것, 또는 상기 (a) 및 (b)를 순차적으로 진행하는 것을 포함한다.

본 발명의 또 다른 구체예는 상기 약학 조성물의 치료학적으로 유효한 양을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 피부장벽 기능 손상으로 인한 피부질환을 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는 방법을 제공한다. 상기 포유동물은 인간, 개, 고양이, 설치류, 말, 소, 원숭이, 또는 돼지일 수 있다.

본 발명의 조성물은 피부 장벽 보호, 강화 내지 기능 개선과 관련된 객관적 지표들을 개선시킨다. 본 발명의 조성물은 예를 들어, TEWL(경피수분손실)과 같은 피부 각질층의 수분 감소 지표를 개선시키고, 피부수분 함유량(skin hydration)을 증가시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 세라마이드, 디히드로세라마이드 및/또는 스핑고 염기의 함량 증가, 이들의 합성에 관여하는 효소 활성 증가, 및 이들의 분해에 관여하는 효소 활성 감소의 효능을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 조성물은 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 약학 조성물, 피부외용제 및 화장료 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 고순도이면서 입자크기 분포가 균일한 줄기세포 유래의 엑소좀을 저가로 대량으로 수득할 수 있다. 따라서, 본 발명은 기능적 활성이 우수한 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 조성물을 저가로 대량으로 제공할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 스케일-업(scale-up)이 가능하고 GMP(Good Manufacturing Practice)에도 적합하다.

한편, 전술한 바와 같은 효과들에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

도 1은 본 발명의 일 구체예에 따라 줄기세포 배양액으로부터 엑소좀을 제조하는 방법에 있어서 엑소좀을 분리 및 정제하는 과정을 설명하는 플로우챠트이다.
도 2는 본 발명의 일 구체예에 따라 줄기세포 배양액으로부터 엑소좀을 제조하는 단계(step)별로 용액 내에 포함되어 있는 단백질의 총량 비율(Relative amount of protein)을 측정한 결과를 나타낸다. 각 단계별 단백질 총량의 비율은 줄기세포 배양액 전체에 대한 단백질 총량의 상대적 비율로 나타내었다. 실험 결과는 2개의 서로 다른 배치에서 얻어진 결과를 각각 도시하였다.
도 3은 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀의 생산성(productivity)과 순도(purity)를 측정한 결과를 도시한 것이다. 엑소좀의 생산성은 "줄기세포 배양액(CM) 단위 mL 당 얻어진 엑소좀의 입자수"로 계산하였고, 엑소좀의 순도는 "최종 분획물에 포함되어 있는 단백질 단위 μg 당 엑소좀의 입자수"로 계산하였다. 실험 결과는 5개의 서로 다른 배치(batch)에서 얻어진 결과를 도시하였다.
도 4는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀의 물리적 특성 분석 결과를 도시한 것이다. "도 4A"는 TRPS(tunable resistive pulse sensing) 분석에 의한 입자 크기 분포와 입자수를 나타낸다. "도 4B"는 NTA(nanoparticle tracking analysis) 분석에 의한 입자 크기 분포와 입자수를 나타낸다. "도 4C"는 TEM(transmitted electron microscopy) 분석에 의한 입자 이미지를 배율에 따라 도시하였다. "도 4D"는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀의 웨스턴 블랏 결과를 나타낸다. "도 4E"는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀에 대한 마커 분석에 있어서 CD63 및 CD81에 대한 유세포분석 결과를 나타낸다.
도 5는 트레할로오스 첨가에 따라 입자크기 분포가 균일하고 순도가 높은 엑소좀이 수득되는 것을 보여주는 입자 크기 분포에 관한 NTA 분석 결과를 도시한다. 첨가된 트레할로오스의 양이 증가함에 따라 단일한 피크를 갖는 입자 크기 분포 결과를 얻을 수 있다.
도 6은 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀의 제조과정에서 트레할로오스 첨가 여부에 따른 입자 크기 분포를 나타내는 NTA 분석 결과를 도시한다. "도 6A"는 제조 과정 전과정에서 트레할로오스를 첨가한 경우, "도 6B"는 세포 배양액을 동결 보관하였다가 해동한 후 트레할로오스를 첨가한 경우, "도 6C"는 트레할로오스를 첨가하지 않고 제조한 결과를 나타낸다. "도 6D"에는 도 6A 내지 도 6C 방법에 의하여 분리한 엑소좀의 상대적인 생산성(Relative productivity)과 상대 농도(Relative concentration)를 비교한 결과를 도시하였다. "도 6E"에는 도 6A 내지 도 6C 방법에 의하여 분리한 엑소좀의 평균 입자크기(Mean size)를 도시하였다.
도 7은 인체 피부섬유아세포인 HS68 세포에 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀을 처리한 후 세포 독성이 없음을 확인한 결과를 도시한다.
도 8은 RAW 264.7 세포에 대해 LPS와 함께 본 발명의 엑소좀을 처리한 경우 LPS에 의해 유도되는 TNF-α, IL-6, IL-1β 및 iNOS mRNA의 발현량이 감소한 것을 확인한 리얼타임 PCR 결과를 도시한 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀에 의한, 염증 반응의 일종인 NO 형성의 감소 효과를 확인한 실험 결과를 도시한다. 도 9에서 PBS는 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline), DEX는 덱사메타손(dexamethasone), EXO는 엑소좀, CM은 지방줄기세포 배양액(conditioned media), CM-EXO는 엑소좀이 제거된 지방줄기세포 배양액(exosome-depeleted conditioned media)을 나타낸다.
도 10은 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀에 의한, 염증성 사이토카인인 TNF-α 형성의 감소 효과를 확인한 실험 결과를 도시한다. 도 10에서, PBS는 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline), DEX는 덱사메타손(dexamethasone), 각 숫자는 엑소좀 처리량(μg/mL)을 나타낸다.
도 11은 본 발명의 일 구체예에 따라 분리된 엑소좀에 의한 NO 형성 감소 효과와, 종래의 침전법(PPT)에 의해 분리된 엑소좀에 의한 NO 형성 감소 효과를 비교한 실험 결과를 도시한다. 도 11A는 종래의 침전법에 의해 분리된 엑소좀의 NTA 분석 결과이고, 도 11B는 본 발명의 일 구체예에 따른 방법에 의해 분리 정제된 엑소좀의 NTA 분석 결과이며, 도 11C는 NO 형성 감소 효과를 비교 도시한 그래프이다. NO 형성의 감소 정도는 양성대조군인 덱사메타손(Dex)에 의한 NO 형성 감소 정도에 대한 상대 비율(%)로 표시하였다.
도 12는 피부장벽 손상이 유발된 마우스에 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀을 처리한 결과, 엑소좀의 용량 의존적으로 TEWL(transepidermal water loss)이 감소하는 것을 나타내는 그래프이다.
도 13은 피부장벽 손상이 유발된 마우스에 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀을 처리한 결과, 엑소좀의 용량 의존적으로 피부수분 함유량(skin hydration)이 증가하는 것을 나타내는 그래프이다.
도 14는 피부장벽 손상이 유발된 마우스의 체중을 측정한 결과, 덱사메타손 처리군에서는 부작용으로 체중이 감소한 반면에, 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀을 처리한 실험군에서는 체중이 거의 감소하지 않은 것을 나타내는 그래프이다.
도 15는 피부장벽 손상이 유발된 마우스에 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀을 처리한 결과, 세라마이드의 함량이 증가한 것을 나타내는 그래프이다.
도 16은 피부장벽 손상이 유발된 마우스에 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀을 처리한 결과, 디히드로세라마이드의 함량이 증가한 것을 나타내는 그래프이다.
도 17은 피부장벽 손상이 유발된 마우스에 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀을 처리한 결과, 스핑고 염기인 S1P(Sphingosine-1-phosphate) 및 스핑고신의 함량이 증가한 것을 나타내는 그래프이다.
도 18은 피부장벽 손상이 유발된 마우스에 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀을 처리한 결과, Sphk1의 활성을 증가시키고 S1P 리아제(S1P lyase)의 활성을 감소시킨 것을 나타내는 그래프이다.
도 19는 각 실험군 별로 귀 피부 조직을 H&E로 염색한 후 촬영한 조직 절편(section) 사진과 귀 표피 두께를 비교한 그래프이다.
도 20은 각 실험군 별로 마우스의 지라 크기를 비교한 사진이다.

이하 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌들은 본 발명에 참고로서 통합된다.

명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

실시예

실시예 1: 세포의 배양

마우스 대식세포주인 RAW 264.7은 한국세포주은행에서 구입하여 배양하였다. 세포 배양을 위해 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum: ThermoFisher Scientific에서 구입) 및 1% 항생제-항진균제 (antibiotics-antimycotics: ThermoFisher Scientific에서 구입)가 함유된 DMEM (ThermoFisher Scientific에서 구입) 배지에 5% CO₂, 37℃ 조건에서 계대 배양하였다.

인체 피부 섬유아세포(human dermal fibroblast)인 HS68 세포는 ATCC에서 구입하여, 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum: ThermoFisher Scientific에서 구입) 및 1% 항생제-항진균제 (antibiotics-antimycotics: ThermoFisher Scientific에서 구입)가 함유된 DMEM (ThermoFisher Scientific에서 구입) 배지에 5% CO₂, 37℃ 조건에서 계대 배양하였다.

당해 발명이 속하는 기술분야에 알려진 세포배양 방법에 따라 5% CO₂, 37℃ 조건에서 지방 유래 줄기세포를 배양하였다. 그 다음, 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline)(ThermoFisher Scientific에서 구입)으로 세척 후, 무혈청, 무페놀레드 배지로 교체하여 1일 내지 10일간 배양하고 그 상층액(이하, 배양액)을 회수하였다.

엑소좀의 분리 과정에서 입자크기 분포가 균일하고 순도가 높은 엑소좀을 수득하기 위하여 배양액에 트레할로오스를 2 중량% 첨가하였다. 트레할로오스를 첨가한 후 배양액을 0.22 μm 필터로 여과하여 세포 잔해물, 노폐물 및 거대 입자 등의 불순물을 제거해 주었다. 여과된 배양액은 즉시 분리 과정을 통해 엑소좀을 분리하였다. 또한, 여과된 배양액은 냉장고(영상 10℃ 이하)에서 보관한 후 엑소좀 분리에 사용하였다. 또한, 여과된 배양액은 -60℃ 이하의 초저온 냉동고에서 동결 보관하였다가 해동시킨 후 엑소좀 분리를 수행하였다. 이후, 배양액으로부터 접선흐름여과장치(Tangential Flow Filtration; TFF)를 이용하여 엑소좀을 분리하였다.

실시예 2: TFF 방법에 의한 엑소좀의 분리 및 정제

실시예 1에서 0.22 μm 필터로 여과된 배양액으로부터 엑소좀을 분리, 농축, 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 위해 TFF(Tangential Flow Filtration) 방법을 사용하였다. TFF 방법을 위한 필터로는 카트리지 필터(cartridge filter, 일명 hollow fiber filter; GE Healthcare에서 구입) 또는 카세트 필터(cassette filter; Pall 또는 Sartorius 또는 Merck Millipore에서 구입)를 사용하였다. TFF 필터는 다양한 분자량 차단(molecular weight cutoff; MWCO)에 의해 선택될 수 있다. 선택된 MWCO에 의해 선별적으로 엑소좀을 분리, 농축하였고, MWCO보다 작은 입자나 단백질, 지질, 핵산, 저분자 화합물 등은 제거하였다.

엑소좀을 분리, 농축하기 위하여 MWCO 100,000 Da(Dalton), 300,000 Da, 또는 500,000 Da의 TFF 필터를 사용하였다. 배양액을 TFF 방법을 이용하여 1/100 내지 1/25 정도의 부피가 될 때까지 농축하면서, MWCO보다 작은 물질들은 제거하여 엑소좀을 분리하였다.

분리, 농축된 엑소좀 용액은 TFF 방법을 이용하여 추가로 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 수행하였다. 이때, 탈염과 버퍼교환은 연속적으로 수행(continuous diafiltration)하거나 단속적으로 수행(discontinuous diafiltration)하였으며, 시작 부피(starting volume)에 대하여 적어도 4배, 바람직하게는 6배 내지는 10배 이상, 보다 바람직하게는 12배 이상의 부피를 갖는 완충용액을 이용하여 수행하였다. 완충용액에는 입자크기 분포가 균일하고 순도가 높은 엑소좀을 수득하기 위하여 PBS에 녹인 2 중량%의 트레할로오스를 첨가하였다. 트레할로오스 처리에 따라 고순도이면서 입자크기 분포가 균일한 엑소좀을 높은 수율로 수득할 수 있는 효과를 확인한 결과는 도 6에 도시하였다.

실시예 3: 분리된 엑소좀의 특성 분석

분리된 엑소좀, 배양액, 및 TFF 분리과정의 분획물에서 단백질의 양은 BCA 발색법(ThermoFisher Scientific에서 구입) 또는 플루오로프로파일(FluoroProfile) 형광법(Sigma에서 구입)을 이용하여 측정하였다. 본 발명의 일 구체예의 TFF 방법에 의해 엑소좀이 분리, 농축되고 단백질, 지질, 핵산, 저분자 화합물 등이 제거되는 정도는 단백질 정량법에 의하여 모니터링하여 그 결과를 도 2에 도시하였다. 그 결과 본 발명의 일 구체예의 TFF 방법에 의하여 매우 효과적으로 배양액에 존재하는 단백질이 제거됨을 알 수 있었다.

본 발명의 일 구체예의 TFF 방법에 의해 엑소좀을 분리하는 경우 생산성과 순도를 독립적인 다섯 배치에서 비교한 결과를 도 3에 도시하였다. 독립적인 다섯 배치로부터 얻어진 결과를 분석한 결과, 본 발명의 일 구체예의 TFF 방법에 의하여 매우 안정적으로 엑소좀을 분리할 수 있음을 확인하였다.

분리된 엑소좀은 나노입자 트랙킹 분석(nanoparticle tracking analysis:　NTA; Malvern에서 구입) 또는 가변 저항펄스 감지(tunable resistive pulse sensing: TRPS; Izon Science에서 구입)에 의해 입자의 크기와 농도를 측정하였다. 분리된 엑소좀의 균일도와 크기는 투과전자현미경(transmitted electron microscopy: TEM)을 이용하여 분석하였다. 본 발명의 일 구체예에 따라 분리된 엑소좀의 TRPS, NTA, TEM 분석 결과는 도 4A 내지 도 4C에 도시하였다.

TFF 방법으로 엑소좀을 분리한 후, 트레할로오스의 첨가 여부에 따른 엑소좀의 크기 분포를 NTA 분석한 결과를 도 5에 도시하였다. 트레할로오스 농도를 0 중량%, 1 중량% 및 2 중량%로 증가시켰고(도 5의 위에서부터 아래), 3회 반복하여 실험하였다. 트레할로오스가 존재하지 않은 경우 300 nm 이상의 크기를 갖는 입자가 확인되는 반면, 트레할로오스의 첨가량을 늘려주면 300 nm 이상의 크기를 갖는 입자가 줄어들고 엑소좀의 크기 분포가 균일해지는 것을 확인하였다.

TFF 방법으로 엑소좀을 분리하는 과정에 트레할로오스의 첨가에 따른 효과를 추가로 조사하였다. 도 6에서 보는 바와 같이 엑소좀의 제조과정 전과정에 PBS에 녹인 2 중량%의 트레할로오스를 첨가한 경우, 균일한 크기 분포를 갖는 엑소좀을 얻을 수 있었다(도 6A). 반면 트레할로오스를 첨가하지 않고 동결 보관하였던 배양액을 사용하되, 탈염과 버퍼교환 과정에서만 트레할로오스를 첨가하여 TFF 과정을 진행한 경우나, 트레할로오스를 전혀 첨가하지 않고 TFF 과정을 진행한 경우, 크기가 큰 입자가 많이 포함된 불균일한 엑소좀을 얻었다(도 6B 및 도 6C).

분리된 엑소좀의 상대적인 생산성과 농도를 비교한 결과, 엑소좀의 제조과정 전과정에 트레할로오스를 첨가한 경우 매우 높은 생산성으로 엑소좀을 얻을 수 있었으며, 얻어진 엑소좀의 농도도 5배 이상 높았다(도 6D). NTA 분석 결과에서 나타난 바와 같이, 분리된 엑소좀의 평균 크기도 엑소좀의 제조과정 전과정에 트레할로오스를 첨가한 경우 200 nm로 균일하게 확인되었다(도 6E).

도 4D는 본 발명의 일 구체예의 방법에 따라 분리된 엑소좀에 대해 웨스턴 블랏을 수행한 결과로서, CD9, CD63, CD81 및 TSG101 마커의 존재를 확인하였다. 각 마커에 대한 항체로는 각각 항-CD9 (Abcam에서 구입), 항-CD63 (System Biosciences에서 구입), 항-CD81 (System Biosciences에서 구입), 및 항-TSG101 (Abcam에서 구입)을 사용하였다.

도 4E는 본 발명의 일 구체예의 방법에 따라 분리된 엑소좀에 대해 유세포분석기를 이용하여 분석한 결과로서 CD63 및 CD81 마커의 존재를 확인하였다. CD63에 대해 양성(positive)인 엑소좀을 분리하기 위하여 엑소좀-휴먼 CD63 분리/검출 키트(ThermoFisher Scientific에서 구입)를 제조사의 방법에 따라 사용하였고, PE-마우스 항-인간 CD63 (PE-Mouse anti-human CD63)(BD에서 구입) 및 PE-마우스 항-인간 CD81 (PE-mouse anti-human CD81)(BD에서 구입)을 사용하여 마커를 염색한 후, 유세포분석기 (ACEA Biosciences)를 이용하여 분석하였다.

상기 결과들을 종합하면, 본 발명은 접선흐름여과를 이용한 제조과정에서 트레할로오스를 첨가하여 고순도이면서 입자크기 분포가 균일한 엑소좀을 높은 수율로 경제적이면서 효율적으로 분리 및 정제할 수 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 분리방법의 공정들은 스케일-업이 가능하고 GMP에도 적합함을 알 수 있었다.

실시예 4: 엑소좀 처리에 따른 세포 독성 측정

인체 피부 섬유아세포인 HS68 세포에서 본 발명의 일 구체예의 분리 방법에 따라 수득된 엑소좀의 독성을 평가하기 위해 세포에 농도별로 엑소좀을 처리하고 세포의 증식률을 확인하였다. HS68 세포를 10% FBS를 포함한 DMEM에 현탁시킨 후 80 내지 90%의 밀집도(confluency)를 갖도록 분주하고 37℃, 5% CO₂인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 24시간 후, 배양액을 제거하고 실시예 2에서 준비된 엑소좀을 농도 별로 처리하여 24 내지 72시간 동안 배양하면서 세포 생존율을 평가하였다. 세포 생존율을 WST-1 시약(WST-1 reagent)(Takara에서 구입), MTT 시약(Sigma에서 구입), 셀타이터-글로 시약(CellTiter-Glo reagent)(Promega에서 구입), 또는 아라마르 블루 시약(alamarBlue reagent)(ThermoFisher Scientific에서 구입)과 마이크로플레이트 리더(microplate reader)(Molecular Devices에서 구입)를 이용하여 측정하였다.

비교군은 엑소좀이 처리되지 않은 일반 세포배양배지에서 배양된 세포수를 기준으로 하였고, 시험된 농도 범위 내에서 본 발명의 엑소좀에 의한 세포 독성이 나타나지 않음을 확인하였다(도 7).

실시예 5: 마크로파지 세포주를 이용한 염증 반응 측정

RAW 264.7 세포를 10% FBS를 포함한 DMEM 배지에 현탁시키고 이를 멀티웰 플레이트(multiwell plate)의 각 웰에 80 내지 90%의 밀집도(confluency)를 갖도록 분주하였다. 다음 날 LPS가 포함된 새로운 무혈청 배지에 희석한 본 발명의 엑소좀 (실시예 2에서 준비된 엑소좀)을 적정 농도로 1~24시간 동안 처리하여 배양하였다. 배양이 끝난 배양상층액을 취하고 배양액 내에 존재하는 NO 및 염증성 사이토카인을 측정하여 염증 반응을 확인하였다. 배양액 내의 염증 반응은 NO 검출키트(detection kit)(인트론바이오 혹은 프로메가에서 구입)를 이용하여 측정하였다. ELISA 키트 (R&D system에서 구입) 제조사의 매뉴얼대로 수행하여 LPS만을 처리한 군과 본 발명의 엑소좀이 함께 처리된 군의 염증성 사이토카인 TNF-α 양을 확인하였다. 양성대조군으로 덱사메타손(dexamethasone) (Sigma에서 구입)을 처리하였다. 또한, 위와 같이 처리된 RAW 264.7 세포로부터 얻은 총 RNA로부터 cDNA를 제조하였고 리얼타임 PCR 방법을 이용하여 iNOS, TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 mRNA 변화량을 측정하였다. 상기 유전자들을 정량하기 위한 표준 유전자로서 GAPDH 유전자를 사용하였다. 리얼타임 PCR에 사용한 프라이머의 종류와 서열은 하기의 표 1과 같다.

리얼타임 PCR에 사용된 프라이머 종류 및 염기서열

유전자	서열
유전자	정방향 프라이머 (5' → 3')	역방향 프라이머 (5' → 3')
TNF-α	TCT CAT CAG TTC TAT GGC CCA GAC (서열번호 1)	GGC ACC ACT AGT TGG TTG TCT TTG (서열번호 2)
iNOS	GCT ACC ACA TTG AAG AAG CTG GTG (서열번호 3)	CCA TAG GAA AAG ACT GCA CCG AAG (서열번호 4)
GAPDH	GAC ATC AAG AAG GTG GTG AAG CAG (서열번호 5)	CCC TGT TGC TGT AGC CGT ATT CAT (서열번호 6)
IL-6	GCC AGA GTC CTT CAG AGA GAT ACA (서열번호 7)	ATT GGA TGG TCT TGG TCC TTA GCC (서열번호 8)
IL-1β	GCA ACG ACA AAA TAC CTG TGG CCT (서열번호 9)	AGT TGG GGA ACT CTG CAG ACT CAA (서열번호 10)

우선, 도 8에 도시된 바와 같이, 생쥐의 대식세포인 RAW 264.7 세포에 대해 LPS와 함께 본 발명의 엑소좀을 처리한 경우 LPS에 의해 유도되는 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 mRNA의 발현량이 감소하였고, NO 생성효소인 iNOS의 mRNA의 발현량이 감소하였다. 다음으로, 도 9에 도시된 바와 같이, 생쥐의 대식세포인 RAW 264.7 세포에 LPS 존재 하에서 본 발명의 엑소좀을 처리한 결과 LPS에 의해 유도되는 염증 반응인 NO 생성을 농도의존적으로 감소시킴을 확인하였다. 또한, 도 10에 도시된 바와 같이, 생쥐의 대식세포인 RAW 264.7 세포에 LPS 존재 하에서 본 발명의 엑소좀을 처리한 결과 LPS에 의해 유도되는 염증성 사이토카인인 TNF-α 생성을 감소시킴을 확인하였다. 이러한 결과들은 본 발명의 엑소좀이 염증 반응에 기인한 피부장벽 기능의 손상을 예방, 억제, 완화 또는 회복시킬 수 있음을 시사하며, 이를 통해 본 발명의 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 조성물은 피부장벽 보호, 강화 또는 기능 개선에 유용할 것으로 기대된다.

실시예 6: 분리 방법에 따른 NO 형성 감소 효과의 비교

분리 방법에 따른 엑소좀의 NO 형성 감소 효과를 비교하기 위하여 본 발명의 일 구체예의 TFF 분리 정제에 의해 얻어진 엑소좀 이외에 종래의 침전법에 의해 분리된 엑소좀을 준비하였다. 침전법은 제조사(System Biosciences)의 프로토콜에 따라 시행하였다. 종래의 침전법에 의해 분리된 엑소좀(도 10A 참조)은 본 발명의 일 구체예의 TFF 방법에 의해 분리 정제된 엑소좀(도 10B 참조)과 비교하여 입자크기 분포의 균일도가 낮고 다양한 크기를 갖는 것을 확인하였다. 또한, 도 10C에 도시한 바와 같이 본 발명의 일 구체예의 TFF 방법에 의해 분리 정제된 엑소좀은 종래의 침전법에 의해 얻어진 엑소좀에 비해 훨씬 높은 수준으로 NO 형성을 억제함을 확인하였다. 이러한 결과들은 본 발명의 일 구체예에 따라 분리 정제된 엑소좀이 종래 방법에 따라 분리된 세포외 소포체에 비해 입자크기 분포의 균일도와 NO 형성 억제 측면에서 우수하다는 것을 보여주고 있다.

따라서, 본 발명의 일 구체예의 분리 방법에 따라 수득된 엑소좀은 종래의 분리 방법에 따라 수득된 세포외 소포체와 비교하여 성능 또는 기능적 활성(예를 들어, 입자크기 분포의 균일성, NO 생성 억제, 염증 반응 감소 등)이 훨씬 우수하고, 이와 같이 기능적 활성이 우수한 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 본 발명의 조성물은 염증 반응에 기인한 피부장벽 기능의 손상을 예방, 억제, 완화 또는 회복시키는 효과 면에서 종래기술 보다 훨씬 우수하다고 할 수 있다.

실시예 7: 피부장벽 손상이 유발된 동물 모델

피부장벽 강화 내지 기능 개선을 확인하기 위한 동물 모델을 확립하기 위해 옥사졸론(oxazolone)을 사용한다. 옥사졸론은 피부에 도포 시 피부장벽 기능 손상을 가져오는데, TEWL(transepidermal water loss) 증가로 나타나는 피부 각질층의 수분 감소, 피부장벽의 구조단백질인 로리크린, 인볼루크틴, 필라그린의 발현 감소, 피부 각질층의 pH 증가를 유발하여 피부 장벽 기능이 손상된 동물 모델을 제공할 수 있다(Journal of Investigative Dermatology (2008) 128(1), 79-86 참조).

암컷 SKH-1 생쥐(5주령; 중앙실험동물에서 구입)를 구매하여 7일 동안의 적응기를 통해 본 실험에 사용하였다. 적응기를 거친 생쥐는 피부장벽 손상을 유발 한 후 아래와 같이 각각 6군으로 분류하였다.

(1) Normal: 정상 대조군 (도 12에서 "N"으로 표기);

(2) Control (피부장벽 손상 유발군): 옥사졸론으로 피부장벽 손상을 유발한 음성 대조군 (도 12에서 "C"로 표기);

(3) 엑소좀 저용량: 옥사졸론으로 피부장벽 손상을 유발한 후 실시예 2에서 준비된 엑소좀을 개체 당 1 μg의 용량으로 주 3회씩 4주간 피하 투여(SC: subcutaneous injection)한 실험군 (도 12에서 "L"로 표기);

(4) 엑소좀 중용량: 옥사졸론으로 피부장벽 손상을 유발한 후 실시예 2에서 준비된 엑소좀을 개체 당 3 μg의 용량으로 주 3회씩 4주간 피하 투여한 실험군 (도 12에서 "M"으로 표기);

(5) 엑소좀 고용량: 옥사졸론으로 피부장벽 손상을 유발한 후 실시예 2에서 준비된 엑소좀을 개체 당 10 μg의 용량으로 주 3회씩 4주간 피하 투여한 실험군 (도 12에서 "H"로 표기);

(6) 덱사메타손: 옥사졸론으로 피부장벽 손상을 유발한 후 에탄올에 용해시킨 0.03% 덱사메타손(Sigma에서 구입)을 개체 당 100 μL의 용량으로 주 3회씩 4주간 피하 투여한 실험군 (양성대조군) (도 12에서 "D"로 표기).

(2)~(6)의 각 실험군의 생쥐 등피부(back skin)에 2% 옥사졸론(Sigma에서 구입) 200 μL를 도포하여 감작하였고, 감작 후 5~7일간 피부장벽 회복 기간을 거친 다음 약 15일동안 격일로 (2)~(6)의 각 실험군의 생쥐 등피부에 0.025%~0.05% 옥사졸론 100 μL를 도포하여 피부장벽 손상을 유발하였다. 또한, 피부장벽 손상 유지를 위해 엑소좀 처리 기간 동안 격일로 (2)~(6)의 각 실험군의 생쥐 등피부에 0.025%~0.05% 옥사졸론 100 μL를 도포하여 처리하였다.

본 발명의 엑소좀이 처리되기 전후에, TEWL 측정 장비를 이용하여 피부의 평균 수분 증발량을 측정하였고, 수분측정기(Corneometer CM825)(Courage-Khazaka eletronic GmbH, Germany)를 이용하여 피부수분 함유량을 측정하였다. 측정된 생쥐 마리수는 각 실험군 마다 12 마리였다(n=12).

그 결과, 질환 대조군(피부장벽 손상 유발군)에 비해 본 발명의 일 구체예의 엑소좀이 처리된 (3)~(5)의 실험군에서 엑소좀의 용량 의존적으로 TEWL(transepidermal water loss)이 감소하는 것, 즉 각질층의 수분 증발량 감소를 확인하였다(도 12). 또한, 질환 대조군에 비해 본 발명의 일 구체예의 엑소좀이 처리된 (3)~(5)의 실험군에서 엑소좀의 용량 의존적으로 피부수분 함유량(skin hydration)의 증가를 확인하였다(도 13). 따라서, 본 발명의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물은 각질층의 수분증발을 감소시키고 피부 보습을 향상시킴으로써 피부장벽을 보호 및 강화시킬 수 있다.

한편, 각 실험군의 체중을 측정한 결과(n=12), 덱사메타손을 처리한 (6)의 실험군에서는 부작용으로 체중이 감소하였으나, 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀을 처리한 (3)~(5)의 실험군에서는 정상 대조군에 비해 체중이 거의 감소하지 않았다(도 14). 즉, 피부장벽 손상의 회복 내지는 완화를 위해 일반적으로 사용되는 덱사메타손이 체중 감소와 같은 부작용을 나타내는 반면에, 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물은 피부장벽을 보호 및 강화시키면서도 체중 감소와 같은 부작용을 줄일 수 있는 장점이 있다.

실시예 8: 피부장벽 지표들의 개선 확인

실시예 7의 생쥐들을 희생시키고 피부 샘플을 채취한 후, 각 실험군 별로 세라마이드, 디히드로세라마이드, 스핑고신 및 스핑고신-1-인산(S1P)의 함량, 스핑고신 키나아제(Sphingosine kinase)인 Sphk1의 활성, 및 S1P(Sphingosine 1-phosphate)를 분해하는 효소인 S1P 리아제(S1P lyase)의 활성을 측정하였다. 측정에 사용된 생쥐의 마리수는 각 실험군 별로 8 마리였다(n=8).

카본길이별 세라마이드, 총 세라마이드, 스핑고신, 및 스핑고신-1-인산(S1P) 함량을 LC-MS/MS(API 3200 Triple quadruple mass, AB/SCIEX)를 이용하여 다음과 같이 분석하였다. 전체 지질은 당업계에 알려진 문헌에 따라 추출하였다(J Invest Dermatol. 2010 Oct;130(10):2472-80). 세라마이드, 스핑고신, 및 스핑고신-1-인산을 OPA(o-phthalaldehyde) 시약으로 유도체화하고 형광검출기가 장착된 LC-MS/MS 시스템을 이용하여 정량하였다(J Invest Dermatol. 2010 Oct;130(10):2472-80; Arch Pharm Res. 2009 Dec;32(12):1795-801; Proc Natl Acad Sci USA. 2016 Mar 8; 113(10): E1334-E1342). 스핑고지질의 함량은 "pmol/mg 단백질"로 표현하였고, 단백질 정량은 통상적인 BCA 방법에 따라 수행하였다.

도 15A 내지 도 15G에 도시된 바와 같이, 질환 대조군에 비해 본 발명의 일 구체예의 엑소좀이 처리된 (3)~(5)의 실험군에서, C16 세라마이드, C18 세라마이드, C20 세라마이드, C22 세라마이드, C24 세라마이드, C24:1 세라마이드 및 총 세라마이드의 함량이 증가된 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 16A 내지 도 16F에 도시된 바와 같이, 질환 대조군에 비해 본 발명의 일 구체예의 엑소좀이 처리된 (3)~(5)의 실험군에서, C16 디히드로세라마이드, C18 디히드로세라마이드, C22 디히드로세라마이드, C24 디히드로세라마이드, C24:1 디히드로세라마이드 및 총 디히드로세라마이드의 함량이 증가된 것을 확인할 수 있었다. 뿐만 아니라, 도 17A 및 도 17B에 도시된 바와 같이, 질환 대조군에 비해 본 발명의 일 구체예의 엑소좀이 처리된 (3)~(5)의 실험군에서, 스핑고신-1-인산(S1P) 및 스핑고신 함량 역시 증가된 것을 확인할 수 있었다.

한편, 스핑고신 키나아제(Sphingosine kinase)인 Sphk1의 활성을 LC-MS/MS을 이용하여 다음과 같이 분석하였다. 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 3 mM β-머캅토에탄올, 5% 글리세롤, 프로테아제 저해제(Sigma-Aldrich) 및 포스파타아제 저해제(Roche)를 함유하는 20 mM 트리스 버퍼(pH7.4) 내의 피부 조직 파쇄물을 10μL의 200 μM C17-스핑고신(SPHK 기질)(Avanti Polar Lipids)과 함께 인큐베이션 하였다. SPHK 활성의 평가를 위해, 어세이 버퍼에 0.5% 트리톤 X-100(Triton X-100)을 첨가하였고, 37℃에서 30 동안 인큐베이션 하였다. 효소 반응은 CHCl₃: MeOH: HCl (8:4:3, v/v/v)의 첨가에 의해 종료시켰다. C17-스핀가닌-1-포스페이트(100 pmol; Avanti Polar Lipids)를 내부 표준자(internal standard)로서 첨가하였다. CHCl₃ 첨가에 의해 분리된 유기상(organic phage)을 진공 하에서 건조하였고, 건조물을 메탄올에 재용해시킨 후 LC-ESI-MS/MS (API 3200 Triple quadruple mass, AB/SCIEX)로 분석하였다. SPHK 활성은 "C17-S1P pmol/mg 단백질/min"으로 표현하였고, 단백질 정량은 통상적인 BCA 방법에 따라 수행하였다.

또한, S1P 리아제의 활성을 LC-MS/MS을 이용하여 다음과 같이 분석하였다. 피부 조직 파쇄물을 10 nmol의 S1P (Avanti Polar Lipids)와 함께 20분 동안 인큐베이션 하였다. 100 pmol의 (2E)-d5-헥사데세날(hexadecenal)(Avanti Polar Lipids)을 내부 표준자로서 첨가하였고, 지질 추출에 의해 반응을 중지시켰다. 5% 포름산을 함유하는 메탄올 내의 5-mM 세미카르바지드 하이드로클로라이드(semicarbazide hydrochloride)(Avanti Polar Lipids)로 전체 지질 추출물을 40℃에서 2시간 동안 유도체화하고, LC-ESI-MS/MS로 분석하였다. S1P 리아제 활성은 "펜타데칸알 pmol/mg 단백질/min"으로 표현하였고, 단백질 정량은 통상적인 BCA 방법에 따라 수행하였다.

도 18A 및 도 18B에 도시된 바와 같이, 질환 대조군에 비해 본 발명의 일 구체예의 엑소좀이 처리된 (3)~(5)의 실험군에서, Sphk1의 활성 증가와 S1P 리아제(S1P lyase)의 활성 감소를 확인할 수 있었다. Sphk1는 피부장벽을 구성하는 스핑고지질의 합성에 관여하는 효소이므로 이의 활성 증가는 세라마이드 합성 증가 및 피부 장벽 강화를 의미한다. 또한, S1P 리아제는 스핑고신-1-인산을 분해하여 스핑고지질의 합성을 방해하는 효소이므로 이의 활성 감소는 세라마이드 합성 방해 감소 및 피부장벽 강화를 의미한다.

상기와 같은 결과들로부터 본 발명의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물은 피부 장벽 보호, 강화 내지 기능 개선과 관련된 객관적 지표들을 개선시키는 것, 예를 들어 세라마이드, 디히드로세라마이드 및 스핑고 염기의 생성량 증가, 이들의 합성에 관여하는 효소 활성 증가, 및 이들의 분해에 관여하는 효소 활성 감소를 나타내는 것을 알 수 있어, 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 약학 조성물, 피부외용제 및 화장료 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.

실시예 9: 동물 모델의 귀 두께 및 지라 크기 비교

실시예 7의 생쥐들을 희생시키고, 각 실험군 별로 당업계에 알려진 H&E 염색법에 의해 피부 조직 염색 후 표피 두께를 플랜 휠(Plan wheel SA2)(Scalex)을 이용하여 측정하였다. 또한, 각 실험군 별로 지라 크기를 측정하였다. 측정에 사용된 생쥐의 마리수는 각 실험군 별로 8 마리였다(n=8).

도 19A는 생쥐의 귀 피부 조직을 H&E로 염색한 후 촬영한 절편 사진이고, 도 19B는 (2)~(6)의 각 실험군에서 측정된 귀 표피 두께를 (1)의 정상군과 비교하여 도시한 그래프이다. 질환 대조군에 비해 본 발명의 일 구체예의 엑소좀이 처리된 (3)~(5)의 실험군에서 귀 표피 두께가 엑소좀의 용량의존적으로 감소한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 질환 대조군에 비해 본 발명의 일 구체예의 엑소좀이 처리된 (3)~(5)의 실험군에서 지라의 크기가 엑소좀의 용량 의존적으로 감소한 것을 확인할 수 있었다(도 20).

이러한 결과들은 염증 반응으로 인해 귀 표피 두께가 두꺼지고 지라 크기가 증가하는 것을 본 발명의 엑소좀이 억제 내지 완화시켜 주는 것을 보여주며, 이로부터 본 발명의 엑소좀을 포함하는 조성물은 염증 반응 및 이에 기인한 피부장벽 기능의 손상을 예방, 억제, 완화 또는 회복시킬 수 있음을 시사한다. 따라서, 상기 결과를 보더라도 본 발명의 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 조성물은 피부장벽 보호, 강화 또는 기능 개선에 유용할 것으로 기대된다.

실시예 10: 본 발명의 엑소좀을 포함하는 화장료 조성물의 제조

상기 실시예 2에서 준비된 1704 μg/mL 농도의 엑소좀을 하기 표 2에 기재된 성분들과 혼합하여 현탁한 후 화장료 조성물(로션)을 제조하였다. 각 성분의 함량은 하기 표 2와 같다.

본 발명의 엑소좀을 포함하는 로션의 성분 및 함량

성분	함량 (중량%)
실시예 2에서 준비된 엑소좀	1
글리세린	7.375
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드	6
세틸 에틸헥사노에이트	5
프로판디올	5
페닐 트리메티콘	3.5
스테아르산	3
1,2-헥산디올	2
판테놀	2
세테아릴 올리베이트	1.8
소르비탄 올리베이트	1.2
디이소스테아릴 말레이트	1
프룩탄	1
암모늄 아크릴로일디메틸타우레이트/VP 코폴리머	0.3
아라키딜 알코올	0.25
베헤닐 알코올	0.15
아라키딜 글루코사이드	0.1
하이드로제네이티드 레시틴	0.1
시어버터	0.09
잔탄검	0.05
라벤더 오일	0.02
베르가모트 오일	0.02
세라마이드 NP	0.02
오렌지껍질 오일	0.02
피토스핑고신	0.015
팔미토일 테트라펩타이드-7	0.01
팔미토일 트리펩타이드-1	0.01
정제수	잔량

이상, 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.

<110> ExoCoBio Inc. <120> A composition comprising an exosome derived from stem cell as an active ingredient and its application for reinforcing or improving skin barrier <130> P17-0030KR <150> KR 10-2017-0158950 <151> 2017-11-24 <150> KR 10-2018-0071805 <151> 2018-06-22 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha forward primer <400> 1 tctcatcagt tctatggccc agac 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha reverse primer <400> 2 ggcaccacta gttggttgtc tttg 24 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iNOS forward primer <400> 3 gctaccacat tgaagaagct ggtg 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iNOS reverse primer <400> 4 ccataggaaa agactgcacc gaag 24 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer <400> 5 gacatcaaga aggtggtgaa gcag 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse primer <400> 6 ccctgttgct gtagccgtat tcat 24 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 forward primer <400> 7 gccagagtcc ttcagagaga taca 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 reverse primer <400> 8 attggatggt cttggtcctt agcc 24 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1beta forward primer <400> 9 gcaacgacaa aatacctgtg gcct 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1beta reverse primer <400> 10 agttggggaa ctctgcagac tcaa 24

Claims

줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 엑소좀은 TEWL(transepidermal water loss)을 감소시키고 피부수분 함유량을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 엑소좀은 세라마이드, 디히드로세라마이드 또는 스핑고 염기 중 적어도 1종의 생성량을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 조성물.
제3항에 있어서,
상기 엑소좀은 C16 세라마이드, C18 세라마이드, C20 세라마이드, C22 세라마이드, 또는 C24 세라마이드, C24:1 세라마이드 중 적어도 1종의 생성량 및 총 세라마이드의 생성량을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 조성물.
제3항에 있어서,
상기 엑소좀은 C16 디히드로세라마이드, C18 디히드로세라마이드, C22 디히드로세라마이드, C24 디히드로세라마이드, 또는 C24:1 디히드로세라마이드 중 적어도 1종의 생성량 및 총 디히드로세라마이드의 생성량을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 조성물.
제3항에 있어서,
상기 엑소좀은 S1P(Sphingosine-1-phosphate) 또는 스핑고신 중 적어도 1종의 생성량을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 엑소좀은 스핑고신 키나아제(Sphingosine kinase)인 Sphk1의 활성을 증가시키고 S1P(Sphingosine 1-phosphate)를 분해하는 효소인 S1P 리아제(S1P lyase)의 활성을 감소시키는 것을 특징으로 하는, 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 엑소좀은 하기의 단계들을 수행하여 수득되는, 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 조성물:
(a) 줄기세포 배양액에 트레할로오스를 첨가하는 단계, (b) 상기 트레할로오스가 첨가된 줄기세포 배양액을 여과하는 단계, (c) 상기 여과된 줄기세포 배양액으로부터, TFF(Tangential Flow Filtration)를 이용하여 엑소좀을 분리하는 단계, 및 (d) 탈염과 버퍼교환(diafiltration)에 사용되는 완충용액에 트레할로오스를 첨가하고, 상기 트레할로오스가 첨가된 완충용액을 이용한 TFF(Tangential Flow Filtration)를 이용하여, 상기 분리된 엑소좀에 대한 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 수행하는 단계.
제8항에 있어서,
상기 탈염과 버퍼교환은 연속적으로 수행하거나 단속적으로 수행하는 것을 특징으로 하는, 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 조성물.
제8항에 있어서,
시작 부피(starting volume)에 대하여 적어도 4배의 부피를 갖는 완충용액을 이용하여 탈염과 버퍼교환을 수행하는 것을 특징으로 하는, 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 조성물.
제8항에 있어서,
TFF(Tangential Flow Filtration)를 위해 MWCO(molecular weight cutoff) 100,000 Da, 300,000 Da, 500,000 Da 또는 750,000 Da의 TFF 필터, 또는 0.05 ㎛ TFF 필터를 사용하는 것을 특징으로 하는, 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 조성물.
제8항에 있어서,
상기 (c) 단계는 TFF(Tangential Flow Filtration)를 이용하여 1/100 내지 1/25의 부피까지 농축하는 과정을 더 포함하는, 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
약제학적 조성물인, 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 조성물.
제13항에 있어서,
주사제인 것을 특징으로 하는, 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
피부 외용제 또는 화장료 조성물인, 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 조성물.
제15항에 있어서,
패취, 마스크팩, 마스크시트, 크림, 토닉, 연고, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 로션, 젤, 오일, 팩, 스프레이, 에어졸, 미스트, 파운데이션, 파우더 및 기름 종이로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종의 형태에 적용하는 것을 특징으로 하는, 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 조성물.
제16항에 있어서,
패취, 마스크팩 또는 마스크시트의 적어도 일면(一面)에 도포되거나 침적되는 것을 특징으로 하는, 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 조성물.
(a) 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 조성물을 포유동물의 피부에 직접 도포하는 것, (b) 상기 조성물이 도포되거나 침적된 패취, 마스크팩 또는 마스크시트를 포유동물의 피부에 접촉 또는 부착하는 것, 또는 상기 (a) 및 (b)를 순차적으로 진행하는 것을 포함하는, 치료용을 제외한 피부장벽 강화 내지 기능 개선을 통해 포유동물 피부의 상태를 조절하는 미용방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 조성물의 치료학적으로 유효한 양을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 피부장벽 기능 손상으로 인한 피부질환을 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는 방법.
제19항에 있어서,
상기 포유동물은 인간, 개, 고양이, 설치류, 말, 소, 원숭이, 또는 돼지인, 피부장벽 기능 손상으로 인한 피부질환을 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는 방법.