BR112019020954A2

BR112019020954A2 - secretoma bacteriano para uso no tratamento de lesões de pele

Info

Publication number: BR112019020954A2
Application number: BR112019020954A
Authority: BR
Inventors: Hernandez-Pigeon Hélène; Galliano Marie-Florence; Castex-Rizzi Nathalie
Original assignee: Fabre Pierre Dermo Cosmetique
Priority date: 2017-04-06
Filing date: 2018-04-06
Publication date: 2020-05-05
Also published as: SG11201909144VA; RU2019134658A; MX2019011951A; CN111630152B; JP7334119B2; TW201841647A; EP3607049A1; FR3065009B1; CA3059380A1; RU2019134658A3; US20200030387A1; JP2020513007A; WO2018185324A1; CN111630152A; AU2018248899A1; KR20190138640A; KR102585934B1; FR3065009A1; US11484555B2

Abstract

a presente invenção refere-se a um novo uso de um secretoma bacteriano no campo do tratamento de lesões de pele e mais particularmente cicatrização de feridas. a invenção também se refere a composições cosméticas ou dermatológicas compreendendo tal secretoma bacteriano como agente ativo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para SECRETOMA BACTERIANO PÁRA USO NO TRATAMENTO DE LESÕES DE PELE.

Campo da Invenção [001] A presente invenção refere-se a um novo uso de um secretoma bacteriano no campo do tratamento de lesões de pele e mais particularmente da cicatrização. A invenção tem também por objeto composições cosméticas ou dermatológicas compreendendo tal secretoma bacteriano como agente ativo.

Técnica Anterior [002] A cicatrização de feridas é um processo biológico complexo e dinâmico que envolve a interação de numerosos fatores locais e sistêmicos na reparação normal dos tecidos. A progressão da cicatrização comporta três fases interdependentes: hemostasia e inflamação, proliferação e remodelagem (General principles of wound healing. Witte MB, Barbul A. Surg Clin North Am. 1997 June; 77(3):509-28.). A proliferação envolve três processos nitidamente observáveis: granulação, contração e reepitelialização.

[003] Durante a granulação, observa-se a proliferação e a migração das células que intervém no resto do processo de reparação na direção do leito da ferida. Por exemplo, ali são encontrados macrófagos, fibroblastos e células endoteliais. Os macrófagos liberam constantemente fatores quimiotáticos e fatores de crescimento. Os fibroblastos constroem a nova matriz celular necessária para o crescimento de células na base da ferida. Esta construção de cadafalsos favorece a migração celular. Finalmente, as células endoteliais desencadeiam a formação de brotos vasculares que constituirão novos capilares, o que permitirá restabelecer a perfusão e garantir o fornecimento de oxigênio e de nutrientes essenciais para a atividade metabólica das células na ferida.

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2/27 [004] A contração da ferida é um mecanismo de redução do tamanho da ferida, e os fibroblastos desempenham um papel principal desta contração.

[005] A reepiteliaiização consiste na regeneração de uma epiderme que cobre uma ferida para formar uma barreira eficaz contra o ambiente externo, capaz de se pigmentar e recuperar suas funções sensoriais e imunes. Ela envolve, portanto, os processos celulares de migração e proliferação de queratinócitos, mas também a diferenciação deste neoepitélio e a restauração de uma membrana basal que reconecta a derme e a epiderme. Quando a migração de células basais em direção ao centro da ferida permite que as duas bordas da ferida se rejuntem, uma onda de mitose celular é produzida para preencher os espaços deixados pela migração e fornecer células para o tecido epitelial em regeneração tridimensional.

[006] As etapas de proliferação de células queratinócitas, fibroblastos ou células endotelials podem ser consideradas como um dos fenômenos funcionais que apresentam atividade cicatrizante de um ativo. Um aumento da proliferação de fibroblastos participaria na cicatrização de uma ferida profunda (dano na derme), ao passo que o aumento da proliferação e/ou da migração de queratinócitos participaria na reepiteliaiização.

[007] A cicatrização também apresenta problemas cosméticos a partir do momento em que os defeitos de cicatrização, ou uma má cicatrização, podem ser responsáveis por marcas visíveis incômodas e quase permanentes tais como cicatrizes grossas ou queloides.

[008] Todas as intervenções cirúrgicas, de medicina estética ou dermatológica, assim como as lesões traumáticas não médicas (arranhões, cortes, esfoladuras, queimaduras) ou patológicas levam a cicatrizes. Uma das principais habilidades dos cirurgiões plásticos é a de controlar a formação de cicatrizes.

[009] Pressão é, por exemplo, usada há muitos anos para as ci

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3/27 catrizes causadas por queimaduras e mais recentemente ela foi combinada com folhas de silicone aplicadas diretamente sobre a cicatriz.

[0010] Continua ainda sendo necessário propor novas composições para promover a cicatrização de peles danificadas bem como para melhorar a aparência estética de cicatrizes.

[0011] Pela primeira vez, e surpreendentemente, a requerente evidenciou propriedades benéficas na regeneração tecidual e na cicatrização de lesões de pele de um secretoma bacteriano proveniente de uma cepa bacteriana (ou bactéria), LMB64, isolada de um lençol freático.

[0012] Esta bactéria foi descrita pela Requerente no pedido de patente WO2012/085182. Mais particularmente, a bactéria foi descrita como tal por suas atividades anti-inflamatórias. Ainda mais particularmente, foram escritos e exemplificados os extratos denominados S0, E0 e ESO, respectivamente constituídos do sobrenadante de cultura separado da biomassa, da biomassa de células lisadas, e sobrenadante depois de incubação da cultura em pH básico por várias horas. Apenas as atividades farmacológicas dos extratos E0 e ESO foram testadas e foi mostrado que estes extratos E0 e ESO tinham capacidade de induzir citocinas e de maturar as células de Langerhans (para E0) assim como de ativar os receptores TLR2/TLR4/TLR5, antagonistas dos receptores PARs, e de induzir peptídios antimicrobianos (para ESO). Estes resultados permitiram considerar o uso de tais extratos no tratamento de doenças inflamatórias tais como prurido, psoríase, eczema ou ainda dermatite atópica.

[0013] Contra todas as expectativas, a Requerente mostra aqui que um secretoma não constituído dos mesmos elementos que os extratos ESO e E0 mencionados acima, mas constituídos principalmente das biomoléculas secretadas e externalizadas no sobrenadante de cultura pela referida bactéria LMB64, apresenta propriedades cicatrizantes surpreendentes.

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Descrição Detalhada [0014] De acordo com uma primeira modalidade (1), a presente invenção tem por objeto um secretoma bacteriano de uma bactéria Gram-negativa não patogênica pertencente à classe das Betaproteobacteria, subfamília Neisseriaceae, contendo um rRNA 16S compreendendo a sequência SEQ ID NO: 1, ou qualquer sequência tendo pelo menos 80% de identidade com a sequência SEQ ID NO: 1, para uso no tratamento de lesões de pele, o referido secretoma sendo passível de ser obtido, ou obtido, por um processo compreendendo as etapas de:

- a) cultivar a referida bactéria em um meio de cultura e em condições adequadas para seu crescimento,

- b) separação iíquido/sólida e recuperação da fase líquida,

- c) obtenção do referido secretoma compreendendo as biomoléculas secretadas pelo referida bactéria na fase líquida.

[0015] De acordo com uma segunda modalidade da presente invenção, o secretoma bacteriano para uso no tratamento de lesões de pele de acordo com a invenção é caracterizado pelo fato de que um tampão básico é adicionado à fase líquida obtida na etapa b) e que a fase líquida tamponada é opcionalmente deixada em contato por 1 a 7 horas, de preferência a uma temperatura compreendida entre 1 e 6°C. [0016] A bactéria LMB64 foi caracterizada e definida como pertencente à classe das Betaproteobacteria, subfamília Neisseriaceae, e provavelmente de um novo gênero ainda não definido. A análise da sequência do gene codificando o RNA ribossômico (rRNA) 16S permitiu colocar esta bactéria próxima dos gêneros Chramobacteriurn, Paludimonas, Lutelia e Glubenkiana, com os quais ela compartilha 95% de similaridade de sequência.

[0017] Esta bactéria não patogênica é uma bactéria Gram-negativa que foi isolada a partir do lençol freático.

[0018] Mais particularmente, a bactéria LMB64 se apresenta na

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5/27 forma de um bastão com um comprimento de aproximadamente 2,3 pm (±0,3) e uma largura de aproximadamente 1,0 pm (±0,1). Uma particularidade desta bactéria é a presença de um flagelo polar.

[0019] O gene codificando o rRNA 16S foi quase que completamente sequenciado (1487 bp, correspondendo à sequência SEQ ID NO: 1). A bactéria L.MB64 possui um plasmídio circular de 10948 bp. Este plasmídio foi completamente sequenciado,e a sequência está representada na sequência SEQ ID NO: 2.

[0020] De acordo com uma outra modalidade, uma bactéria da qual o secretoma de acordo com a invenção é proveniente contém pelo menos um plasmídio compreendendo a sequência SEQ ID NO: 2, ou qualquer sequência tendo pelo menos 80% de identidade com a sequência SEQ ID NO: 2, vantajosamente pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ainda pelo menos 97% e mais preferivelmente ainda pelo menos 98% de identidade com a sequência SEQ ID NO: 2.

[0021] Além disso, uma bactéria da qual o secretoma é proveniente é uma bactéria não patogênica Gram-negativa pertencente à classe das Betaproteobacteria, subfamília Neisseriaceae, a referida bactéria contendo um rRNA 16S compreendendo a sequência SEQ ID NO: 1, ou qualquer sequência tendo pelo menos 80%, ainda pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% de identidade com a sequência SEQ ID NO: 1 e a referida bactéria contendo pelo menos um plasmídio compreendendo a sequência SEQ ID NO: 2, ou qualquer sequência tendo pelo menos 80% de identidade com a sequência SEQ ID NO: 2, vantajosamente pelo menos 85%, pelo menos 90%, apm 95%, ainda pelo menos 97% e mais preferivelmente ainda pelo menos 98% de identidade com a sequência SEQ ID NO: 2.

[0022] A título de exemplo, tal bactéria é representada pela cepa LMB64, que foi depositada no nome da Requerente no Collection Nati~ onaie de Cultures de Microorganismos (CNCM), Institut Pasteur, Paris, em 8 de abril de 2010 sob o número I-4290.

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6/27 [0023] De posse dessas informações genéticas, combinadas as características de crescimento em meio sem enxofre e da natureza não filamentosa dessa bactéria, um especialista na técnica não teria dificuldade em encontrar/identificar uma outra bactéria que permitisse obter um secretoma de acordo com a invenção. Tal identificação de uma outra bactéria naturalmente ligeiramente diferente fenotipicamente, porém reunindo os critérios fenotípicos da invenção em termos do secretoma, pode ser efetuada depois de um trabalho de seleção, que não é de forma alguma intransponível, e isto com base nas informações contidas no presente pedido assim como naquelas contidas no pedido WO2012/085182, combinadas com os conhecimentos gerais do especialista na técnica.

[0024] Por “percentagem de identidade” entre duas sequências de ácidos nucleicos no contexto da presente invenção, entende-se uma percentagem de nucleotídeos idênticos entre as duas sequências a serem comparadas, obtida após o melhor alinhamento (alinhamento ótimo), esta percentagem sendo puramente estatística e as diferenças entre as duas sequências sendo distribuídas aleatoriamente e em todo o comprimento das mesmas. As comparações de sequências entre duas sequências de ácidos nucleicos são tradicionalmente efetuadas comparando-se essas sequências depois de terem sido alinhadas de forma ótima, a referida comparação podendo ser efetuada por segmento ou por “janela de comparação”. O alinhamento ótimo das sequências para a comparação pode ser efetuado, além de manualmente, por meio do algoritmo de homologia de Smith and Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2:482], por meio do algoritmo de homologia local de Needleman and Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48:443], por meio do método de busca de similaridade de Pearson and Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444], ou por meio de programas de computador usando esses algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575

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Science Dr., Madison, Wl, ou ainda peios programas de comparação BLAST N ou BLAST P).

[0025] A percentagem de identidade entre duas sequências de ácidos nucleicos é determinada comparando-se essas duas sequências aiinhadas de forma ideal, onde a sequência de ácidos nucleicos a ser comparada pode compreender adições ou deleções em relação à sequência de referência para um alinhamento ótimo entre essas duas sequências. A percentagem de identidade é calculada determinandose o número de posições para as quais o nucleotídeo é idêntico entre as duas sequências, dividindo-se este número de posições idênticas pelo número total de posições na janela de comparação, e multiplicando-se o resultado obtido por 100 para obter a percentagem de identidade entre essas duas sequências.

[0026] Por exemplo, pode ser usado o programa BLAST, “BLAST 2 sequences” (Tatusova et al., “Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences,” FEMS Microbiol Lett. 174:247-250), disponível em http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/b12.html, os parâmetros usados sendo aqueles dados como default (em particular para os parâmetros “open gap penalty”: 5, e “extension gap penalty”: 2; a matriz escolhida sendo, por exemplo, a matriz “BLOSUM 62” proposta pelo programa). A percentagem de identidade entre as duas sequências a serem comparadas é calculada diretamente pelo programa. Também é possível usar outros programas tais como os softwares “ALIGN” ou “Megalign” (DNASTAR).

[0027] Uma bactéria de acordo com a invenção compreende a bactéria LMB64 que contém pelo menos um plasmídio compreendendo a sequência SEQ ID NO: 2, ou qualquer sequência tendo pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade com a referida sequência SEQ ID NO: 2. Outras características da referida LMB64 serão descritas em detalhes mais adiante exemplos.

[0028] Além disso, a bactéria LMB64 foi depositada em nome da

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Requerente no Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, Paris, em 8 de abril de 2010 sob o número I4290.

[0029] De acordo com uma outra modalidade, a presente invenção também se refere a um secretoma bacteriano para uso no tratamento de lesões de pele de acordo com a segunda modalidade, caracterizado pelo fato de que o tampão básico é selecionado dentre tampão Tris, tampão arginina e misturas dos mesmos.

[0030] Em uma outra modalidade, a invenção refere-se a um secretoma bacteriano para uso no tratamento de lesões de pele de acordo com uma das modalidades precedentes, caracterizado pelo fato de que a etapa b) de separação líquido/sólido é seguida por uma etapa b^!) de clarificação da fase líquida ou da fase líquida tamponada por filtração antes da etapa c).

[0031] Em uma outra modalidade, a invenção refere-se a um secretoma bacteriano para uso no tratamento de lesões de pele de acordo com a modalidade precedente, caracterizado pelo fato de que a filtração é realizada com um corte de 0,2 pm.

[0032] De acordo com uma outra modalidade, a invenção também se refere a um secretoma bacteriano para uso no tratamento de lesões de pele de acordo com uma das modalidades precedentes, caracterizado pelo fato de que as referidas biomoléculas consistem nos peptídios, proteínas e metabólitos secundários secretados pela referida bactéria.

[0033] Também é uma outra modalidade da presente invenção apresentar um secretoma bacteriano para uso no tratamento de lesões de pele de acordo com uma das modalidades precedentes, caracterizado pelo fato de que a bactéria contém pelo menos um plasmídio compreendendo a sequência SEQ ID NO: 2, ou qualquer sequência tendo pelo menos 80% de identidade com a sequência SEQ ID NO: 2.

[0034] De acordo com uma outra modalidade, a invenção também

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9/27 se refere a um secretoma bacteriano para uso no tratamento de tesões de pele de acordo com uma das modalidades precedentes, caracterizado pelo fato de que a bactéria é a bactéria depositada no CNCM em 8 de abril de 2010 sob o número I-4920.

[0035] Em geral, o termo “secretoma” é usado para descrever o conjunto de biomoléculas secretadas e excretadas no meio de cultura e solubilizadas neste meio, por uma célula, um tecido ou um organismo. No presente caso, secretoma deve ser entendido como o conjunto de biomoléculas secretadas e externalizadas pela bactéria LMB64, e isto sem modificação ou alteração ou lise da célula bacteriana. Mais particularmente, essas biomoléculas consistem principalmente nas proteínas, peptídios e metabolites secundários secretados e externalizados pela bactéria no meio de cultura.

[0036] As bactérias se multiplicam por fissão binária, isto é, cada bactéria cresce e depois se divide em duas células filhas separadas por um septo de divisão formado pela parede celular. Durante a divisão, o DNA se duplica bem como outros componentes. Diversos sistemas enzimáticos de síntese e de degradação participam na divisão celular.

[0037] O crescimento bacteriano é o aumento ordenado de todos os componentes da bactéria. Daí resulta o aumento no número de bactérias. Durante o crescimento, produz-se, de um lado, um empobredimento de nutrientes do meio de cultura e, de outro lado, um enriquecimento em biomoléculas secretadas e excretadas no meio de cultura pela bactéria e solubilizadas nesse meio, assim como em subprodutos do metabolismo.

[0038] Pela expressão “meio de cultura” ou “meio” entende-se qualquer meio compreendendo pelo menos os nutrientes necessários para o crescimento e a multiplicação de bactérias. As bactérias podem ser cultivadas meio líquido, sólido ou semi-líquido. De preferência, o meio de cultura é um meio líquido que permite a recuperação do soPetição 870190099701, de 04/10/2019, pág. 30/66

10/27 brenadante de cultura contendo o secretoma.

[0039] Um meio de cultura adequado contém nutrientes que favorecem o crescimento e a multiplicação de bactérias. Em geral, um meio de cultura adequado pode compreender água, uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio e sais. A título ilustrativo, um exemplo particular de meio de cultura está descrito mais adiante nos exemplos.

[0040] Por “metabolites secundários” entende-se as moléculas pequenas que uma bactéria de acordo com a invenção, em particular a bactéria LMB64, produz, secreta e excreta no meio de cultura. A título ilustrativo, tais metabólitos secundários podem ser moléculas solúveis como as bacteriocinas, peptídios não ribossômicos, sideróforos, lipopeptídios ou ainda policetídios ou moléculas como os terpenos, pirazinas, indóis ou ainda derivados sulfurados. As proteins presentes no secretoma apresentam tamanhos compreendidos entre 10 kDa e 100 kDa, preferivelmente entre 18 kDa e 98 kDa, e de preferência uma proteína majoritária cujo tamanho é de cerca de 38 kDa.

[0041] Na prática, o secretoma de uma bactéria de acordo com a invenção, por exemplo, e em particular a bactéria LMB64, pode ser obtido a partir de uma cultura em um meio de cultura que permite o crescimento, o desenvolvimento e a multiplicação da bactéria (como, por exemplo, aquele descrito abaixo) por simples recuperação do sobrenadante de cultura que contém as biomoléculas secretadas que constituem o secretoma de acordo com a invenção. Em termos concretos, devido ao fato de que essas biomoléculas são secretadas e externalizadas pela bactéria e solubilizadas no meio, não é necessário realizar uma etapa de tratamento das referidas bactérias (mecânico ou químico induzindo a lise total ou parcial das células ou ainda a liberação de proteínas ou componentes da parede ou da membrana ou ainda do espaço periplasmático). A recuperação dos componentes do sobrenadante de cultura (doravante o secretoma) dos componentes celulares sólidos não solúveis pode ser feita por qualquer meio de separação líqui

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11/27 do/sólido. Mais particularmente, é, portanto, possível, pelos especialistas na técnica, isolar a fração líquida contendo as biomoléculas solubilizadas da fração sólida contendo princípalmente células inteiras, detritos celulares compreendendo proteínas superficiais e/ou proteínas localizadas no espaço perlplasmático da bactéria.

[0042] A título ilustrativo, a separação líquido/sólido pode ser feita por uma técnica selecionada dentre: centrifugação, sedimentação, filtração, ultrafiltração, decantação, drenagem, por exemplo.

[0043] De preferência, a separação líquido/sólido é feita por centrifugação da cultura bacteriana para separar, de um lado, a fase sólida, isto é, a pelota, contendo células e detritos celulares e, de outro lado, a fase líquida, isto é, o sobrenadante, compreendendo as moléculas solúveis, ou seja, o secretoma.

[0044] O sobrenadante, isto é, a fase líquida, pode ser usada como tal, ou depois de filtração simples para remover os detritos celulares eventualmente presentes e esterilizar o mesmo. Também se pode considerar concentrar o mesmo, por exemplo, por diafiltração. As proteínas que constituem o secretoma também podem ser recuperadas por precipitação com sulfato de amônio.

[0045] Como indicado acima, o processo de preparação de um secretoma bacteriano da invenção é caracterizado pelo fato de que um tampão básico é adicionado à fase líquida na etapa b) e que a fase líquida tamponada obtida é opcionalmente deixada em contato com tal tampão por 1 a 7 horas, em particular à baixa temperatura, de preferência a uma temperatura entre 1 e 6°C.

[0046] A adição de um tampão básico ao sobrenadante melhora a solubilidade e/ou a estabilidade de proteínas e peptídios em solução.

[0047] De preferência, este tampão básico é um tampão Tris ou um tampão arginina ou uma mistura de Tris-arginina mixtura. De preferência ele é um tampão Tris-arginina.

[0048] A quantidade de tampão básico, de preferência Tris

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12/27 arginina, adiciondo é tal que a fase líquida tamponada obtida tem uma concentração de arginina entre 100 mM e 500 mM e/ou uma concentração de Tris entre 10 mM e 90 mM.

[0049] O pH da fase líquida tamponada pode variar entre 8 e 12, e de preferência entre 9 e 11.

[0050] O emprego de um tampão básico (Tris, arginina ou Trisarginina) permite estabilizar as proteínas em solução e evitar sua agregação durante um longo período de armazenamento.

Um modo preferido de cultura da bactéria da invenção, em particular a cepa LMB64, pode compreender três etapas.

® Um primeiro inóculo pode ser preparado em um balão de Erlenmeyer em um meio adequado contendo substâncias minerais, proteicas e glicídicas apropriadas para esta pré-cultura.

® Uma segunda cultura de pré-fermentação em modo “batch” em um segundo meio de cultura similar ou idêntico ao primeiro meio (ou qualquer meio equivalente) é então preparada.

® Por fim, fermentação em modo “fed-batch” em meio idêntico ou similar ao segundo meio a fim de obter uma densidade celular alta.

[0051] Uma etapa de centrifugação permite em seguida a eliminação das células e detritos celulares e a recuperação do sobrenadante de cultura.

[0052] Este sobrenadante tamponado, ou fase líquida tamponada, pode em seguida ser clarificado por filtração.

[0053] Como indicado acima, a etapa b) de separação líquido/sólido é seguida por uma etapa b’) de clarificação da fase líquida ou da fase líquida tamponada, por exemplo, por filtração, antes da etapa c).

[0054] A filtração pode ser realizada por qualquer meio adequado que permita a clarificação da fase líquida, ou da fase líquida tampona

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13/27 da, conforme o caso. Tal clarificação por filtração permite a eliminação das partículas em suspensão que não foram eliminadas durante a etapa de separação líquido/sólido e visa obter um secretoma límpido.

[0055] A filtração pode ser efetuada por qualquer meio de filtração, ultrafiltração ou diafiltração.

[0056] Vantajosamente, a filtração é realizada por filtração através de um filtro ou cartucho de filtro com um corte de 0,4 pm, de preferência 0,2 pm. Neste caso, o secretoma bacteriano é caracterizado pelo fato de que os peptídios, as proteínas e os metabólitos secundários secretados têm um tamanho menor ou igual a 0,2 pm.

[0057] De preferência, filtros ou pré-filtros não carregados eletrostaticamente podem ser usados com a finalidade de evitar qualquer absorção das biomoléculas responsáveis por toda a atividade ou por parte delas.

[0058] A natureza exata dos meios e das diferentes etapas será descrita de forma mais detalhada nos exemplos. Deve ficar entendido que qualquer modificação do processo, dos meios, ou das sequências de etapas que pareça evidente para um especialista na técnica tendo vista a presente descrição deve ser considerada dentro do escopo do presente pedido de patente.

[0059] Como mencionado acima, a invenção também diz respeito, em uma outra modalidade, a um secretoma bacteriano para uso no tratamento de lesões de pele de acordo com uma das modalidades precedentes, caracterizado pelo fato de que as lesões de pele são selecionadas do grupo que consiste em escoriações, queimaduras, queimaduras de sol, arranhões, cortes, esfoladuras, suturas.

[0060] A invenção também se refere a um secretoma bacteriano para uso no tratamento de lesões de pele de acordo com uma das modalidades precedentes para uso na atenuação de defeitos de cicatrização.

[0061] A invenção também diz respeito, em uma outra modalidade,

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14/27 um secretoma bacteriano para uso no tratamento de tesões de pele de acordo com uma das modalidades precedentes, caracterizado pelo fato de que as lesões de pele pós-traumáticas, pós-cirúrgicas, posteriores a um procedimento dermatológico, ou posteriores a um procedimento estético.

[0062] Vantajosamente, a invenção também se refere a um secretoma bacteriano para uso no tratamento de tesões de pele de acordo com uma das modalidades precedentes, caracterizado pelo fato de que ele é combinado com um sal de cobre ou com um sal de zinco.

[0063] Em uma outra modalidade, a invenção também se refere a um secretoma bacteriano para uso no tratamento de lesões de pele de de acordo com uma das modalidades precedentes, caracterizado pelo fato de que o tratamento de tesões de pele consiste em melhorar a cicatrização e a restauração da pele.

[0064] A invenção refere-se ainda, em uma outra modalidade, a um método de tratamento cosmético para atenuação de defeitos de cicatrização da pele compreendendo a aplicação de uma quantidade eficaz de uma composição contendo uma quantidade eficaz de um secretoma bacteriano tal como definido nas modalidades precedentes em combinação com um excipiente cosmeticamente apropriado e formulado em uma forma adequada para aplicação tópica.

[0065] Vantajosamente, a invenção também se refere a um secretoma bacteriano para uso no tratamento de defeitos de cicatrização de acordo com uma das modalidades precedentes, caracterizado pelo fato de que ele é combinado com um sal cobre e/ou um sal de zinco.

[0066] Portanto, a invenção refere-se ainda, em uma outra modalidade, ao uso de um secretoma bacteriano tal como definido em uma das modalidades precedentes para o tratamento cosmético de atenuação de defeitos de cicatrização da pele. De acordo com uma modalidade particular, o secretoma da invenção é usado em combinação com um sal de cobre e/ou um sal de zinco.

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15/27 [0067] Em uma outra modalidade, a invenção refere-se a uma composição dermatológica contendo um secretoma bacteriano tal como definido em uma das modalidades 1 a 9 e um excipiente dermatológico adequado para aplicação tópica. Em uma modalidade vantajosa, a composição dermatológica compreende ainda um sal de zinco e/ou um sal de cobre.

[0068] Em uma outra modalidade, a invenção refere-se ainda a uma composição dermatológica de acordo com uma das modalidades precedentes para uso no tratamento de lesões de pele. Em uma modalidade vantajosa, a composição dermatológica compreende ainda um sal de zinco e/ou um sal de cobre.

[0069] Em uma outra modalidade, a invenção refere-se a uma composição cosmética contendo um secretoma bacteriano tal como definido em uma das modalidades precedentes e um excipiente cosmético adequado para aplicação tópica. Em uma modalidade vantajosa, a composição dermatológica compreende ainda um sal de zinco e/ou um sal de cobre.

[0070] Por fim, em uma outra modalidade, a presente invenção refere-se ao uso de uma composição cosmética de acordo com uma modalidade precedente para o tratamento cosmético de atenuação de defeitos de cicatrização da pele.

[0071] De acordo com uma modalidade, a invenção refere-se a um secretoma bacteriano tal como definido em uma das modalidades precedentes, para uso tópico destinado a favorecer a proliferação de fibroblastos.

[0072] De acordo com uma modalidade, a invenção refere-se a um secretoma bacteriano tal como definido em uma das modalidades precedentes, para uso tópico destinado a favorecer a proliferação e/ou migração de queratinócitos.

[0073] De acordo com uma modalidade, a invenção tem por objeto um secretoma bacteriano tal como definido em uma das modalidades

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16/27 precedentes, para uso tópico destinado ao tratamento de tesões de pele.

[0074] De acordo com uma modalidade, a invenção refere-se a um secretoma bacteriano tal como definido em uma das modalidades precedentes, para uso tópico destinado melhorar a cicaztrização e a recuperação da pele.

[0075] Um outro objeto da invenção diz respeito a uma composição destinada a acelerar a reparação da pele para restabelecer a integridade e a qualidade da pele, compreendendo como princípio ativo o secretoma definido em uma das modalidades precedentes. Mais vantajosamente, a composição ode compreender ainda um sal de cobre e/ou um sal de zinco.

[0076] De preferência, a concentração em uma composição de acordo com a invenção varia entre 0,05% e 10%. Mais preferivelmente, ela está compreendida entre 0,1% e 5%.

[0077] A composição de acordo com a invenção compreende ainda um ou mais excipientes dermatologicamente usuais e/ou cosmeticamente compatíveis conhecidos pelos especialistas na técnica para obter uma composição para aplicação tópica, tais como emulsificantes, espessantes, gelificantes, fixadores de água, agentes de espalhamento, estabilizantes, colorantes, perfumes e preservativos.

[0078] Na presente invenção, por “dermatologicamente ou cosmeticamente aceitável” entende-se aquilo que é útil na preparação de uma composição dermatológica ou cosmética, que geralmente é seguro, atóxico e não biologicamente ou de forma indesejável e que é aceitável para uso dermatológico ou cosmético, e em particular dermatológico ou dermocosmético, em particular por aplicação tópica.

[0079] As composições de acordo com a invenção são vantajosamente destinadas a uma aplicação tópica, em particular à pele.

[0080] A composição de acordo com a invenção pode ser preparada na forma de uma emulsão, de uma dispersão, ou de uma loção

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17/27 aquosa ou oleosa.

[0081] Em uma outra modalidade particular, a composição dermatológica ou cosmética de acordo com a invenção compreende pelo menos um outro princípio ativo, mais preferivelmente pelo menos um princípio ativo hidradante.

[0082] Este outro princípio ativo pode ser principalmente selecionado do grupo que consiste em:

« Agentes cicatrizantes ou reparadores bastante conhecidos: pantenol, madecassosídeode, alantoína, aloe vera, mel;

* Agentes anti-infecciosos: oligoelementos tipo cobrezinco, mel ® Agentes hidratantes e nutrientes: glicerina, manteiga de carité, ceras naturais, ácido hialurônico, ácidos graxos ® Agentes calmantes: alantoína, bisabolol, pantenol, enoxolone * Filtros UV.

[0083] De preferência, o segundo princípio ativo será um oligoelemento tipo cobre-zinco. Nesta modalidade preferida, a composição da invenção compreende, portanto, o secretoma e o oligoelemento tipo cobre-zinco.

[0084] Como mencionado, uma composição dermatológica ou cosmética de acordo com a invenção compreendendo o secretoma pode compreender um sal de cobre ou um sal de zinco. De preferência, o sal de cobre será sulfato de cobre. Vantajosamente, o sal de zinco será selecionado dentre óxido de zinco e sulfato de zinco.

[0085] A quantidade de sulfato de cobre em uma composição de acordo com a invenção pode variar entre 0,05 e 0,5% em peso da composição, preferivelmente entre 0,1 e 0,25% em peso da composição, mais preferivelmente ainda em torno de 0,2% em peso da composição.

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18/27 [0086] A quantidade de sulfato de zinco em uma composição de acordo com a invenção pode variar entre 0,05 e 0,5% em peso da composição, preferivelmente entre 0,1 e 0,4% em peso da composição, mais particularmente entre 0,1 e 0,2% em peso da composição.

[0087] A quantidade de óxido de zinco em uma composição da presente invenção pode variar entre 0,5 e 10% em peso da composição, preferivelmente entre 1 e 5% em peso da composição, mais particularmente em tomo de 2 a 4% em peso da composição.

[0088] De acordo com uma modalidade da invenção, é prevista uma composição de acordo com uma das modalidades precedentes caracterizada pelo fato de que ela compreende ainda pelo menos um outro princípio ativo selecionado dentre cicatrizantes, anti-infecciosos, agentes hidratantes, calmantes e misturas dos mesmos. De acordo com uma outra modalidade particular, pelo menos um outro princípio ativo será selecionado dentre agentes hidratantes, agentes cicatrizantes, agentes calmantes e misturas dos mesmos, de preferência agentes hidratantes. Tal princípio ativo será usado de preferência em composições dermatológicas.

[0089] A presente invenção também diz respeito a um método para o tratamento e a cicatrização de lesões de pele compreendendo a administração, de preferência tópica, de uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo como princípio ativo um secretoma de acordo com a invenção.

[0090] As composições de acordo com a invenção destinam-se em particular aos cuidados de peles que tenham sofrido lesões.

[0091] Lesões de pele podem aparecer depois de traumatismos ou procedimentos médicos ou cirúrgicos, invasivos ou não invasivos, curativos ou estéticos.

[0092] Como procedimentos médicos ou cirúrgicos invasivos podem ser citados: procedimentos cirúrgicos (excisão, “shaving” com ou sem sutura, crioterapia, ablação a laser, peelings moderados ou fortes,

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19/27 sutura, mesoterapia ou ainda curetagem, por exemplo.

[0093] Como lesões de pele pós-traumáticas, por exemplo, subsequente a uma leve alteração externa da pele, podem ser citadas cortes, arranhões, esfoladuras e queimaduras superficiais ou queimadura de sol, por exemplo.

[0094] Como procedimento médico não invasivo superficial que precisa de um produto cicatrizante que acelere a recuperação da pele e seja adequado para uso prolongado (até a reparação completa da pele) podem ser citados peelings leves, depilação a laser, e tratamentos vasculares superficiais (rosácea), por exemplo.

[0095] O tratamento de lesões de pele e de mucosa de acordo com a invenção pode compreender particularmente o tratamento de cortes, sutura, escoriações, esfoladuras, arranhões, cicatrizes póscirúrgicas ou após um procedimento dermatológico cosmético, queimaduras superficiais, queimaduras de sol.

[0096] A presente invenção refere-se ainda ao uso de uma composição cosmética de acordo com a invenção destinada a melhorar a cicatrização e a reparação da pele em particular para atenuar defeitos de cicatrização.

[0097] A invenção será mais bem compreendida com a leitura dos exemplos abaixo que ilustram a invenção sem limitar seu escopo.

[0098] Os exemplos referem-se às figuras abaixo.

[0099] FIGURA 1: Gel SDS-PAGE de proteínas do secretoma.

Faixa 1 (M, marcadores de peso molecular, Sea Blue).

Faixas 2 a 5: (See, secretoma antes da adição de tampão arginina) - depósitos de 10 pl, 15 μΙ, 20 μΙ e 30 pl, respectivamente.

Faixas 6 a 9: (Sec + Arg, secretoma depois da adição de tampão arginina) - depósitos de 10 pl, 15 μΙ, 20 μΙ e 30 μΙ, respectivamente.

[00100] FIGURA 2: % de estimulação (média ±SEM) de fibroblastos humanos normais tratados com os diferentes produtos em comparação

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20/27 com células de controle (n=3 pools de doadores).

[00101] FIGURA 3: % de estimulação (média ±SEM) de migração da linhagem de queratinócitos HaCaT tratados com os diferentes compostos em comparação com células de controle (n=2).

[00102] FIGURA 4: Reepitelialização (média ±SEM) da ferida depois de aplicação por 48 horas a explantes de orelhas de porco de diferentes produtos em comparação com um creme reparador de referência (n=10 doadores independentes).

Exemplo 1: Cultura da bactéria LMB64 [00103] A título de exemplo não limitative, meios de cultura preferidos contêm cloreto de amônio, sulfato de magnésio e extrato de levedura. Também deve ser observado que, como decorre do pedido WO2012/085182, entre outros, outros meios similares poderão ser usados e devem, portanto, ser considerados como formando uma parte integrante da presente descrição. Qualquer adaptação feita por um especialista na técnica também deve ser considerada como parte da invenção.

[00104] Um exemplo de um processo de cultura encontra-se descrito abaixo. Convém lembrar aqui que este exemplo tem apenas valor ilustrativo e não deve de forma alguma ser considerado como limitativo.

[00105] A cepa LMB64 é cultivada em três etapas, a saber, um primeiro inóculo, uma pré-cultura (ou pré-fermentação) em modo batelada e finalmente uma cultura, “fed-batch” (adição de glicose).

[00106] Inóculo: Um tubo de WCB LMB64 é usado para incolular um balão de Erlenmeyer contendo 1000 mL de meio estéril. O balão de Erlenmeyer é então colocado no agitador incubador e agitado. Quando a densidade celular do caldo é suficiente, a cultura é interrompida. As células são então resfriadas para serem transferidas para o préfermentador.

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21/27 [00107] Pré-cultura: O pré-fermentador é então preenchido com cerca de 16 L de meio de cultura e em seguida completamente esterilizado.

[00108] Dois balões satélites são conectados ao pré-fermentador após esterilização do tanque e então dos blocos de adição:

® um balão contendo de uma solução estéril de glicose a 50%. Esta solução (pré-cultura de glicose “fedbatch”)) é imediatamente transferida para o meio de cultura para atingir a concentração inicial de glicose de 20 g/L.

® o balão de Erlenmeyer contendo o inóculo descrito acima etapa Inóculo é inoculado no pré-fermentador.

[00109] A pré-cultura é lançada e em seguida regulada automaticamente. A título de exemplo, podem ser mencionados os seguintes parâmetros: temperatura, velocidade de agitação, pressão, taxa de fluxo de ar, ou ainda PO2.

[00110] O crescimento das células é monitorado por uma medida da densidade ótica a 620 nm. A pré-cultura é interrompida por resfriamento quando ela atinge uma densidade suficiente.

[00111] Cultura: O fermentador é então preenchido com 127 L de meio ajustado em pH 7,0 e então completamente esterilizados. Três balões satélites são usados:

* um balão contendo uma solução estéril de glicose. Esta solução é imediatamente transferida para 0 meio de cultura para atingir a concentração inicial de glicose de 20 g/L.

« um balão de antiespumante. Este antiespumante será adicionado automaticamente durante a cultura para controlar 0 nível de espuma no tanque.

® um balão de glicose “fedbatch”. Esta solução será acrescentada durante a cultura para promover 0 crescimento de células. [00112] A cultura é lançada e em seguida regulada automaticamen

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22/27 te. A título de exemplo, também podem ser mencionados os seguintes parâmetros: temperatura, pH, velocidade de agitação, pressão, taxa de fluxo de ar, PO2.

[00113] Após exaustão da glicose inicialmente presente no meio (aumento de PO2), a adição da solução de glicose “fedbatch” é iniciada e permite um crescimento de células de alta densidade. A fermentação é interrompida depois do consumo total da glicose. Neste estágio, 0 mosto de fermentação é resfriado automaticamente. Durante toda a cultura, 0 crescimento de células é monitado por uma medida da densidade ótica a 620 nm. A quantidade de biomassa seca (g/L) obtida no final da cultura é determinado com a ajuda de um método de pesagem. Exemplo 2: Extração do secretoma [00114] O exemplo abaixo é dado a título ilustrado de uma modalidade preferida, mas não deve ser considerado como limitativo.

[00115] O secretoma geralmente é obtido depois de centrifugação do resultado da etapa de cultura a fim de eliminar as células, as proteínas superficiais e as proteínas localizadas no espaço periplasmático da bactéria. Esta etapa de centrifugação é seguida por uma adição de um tampão básico Tris-arginina ao sobrenadante. Uma última etapa de filtração do sobrenadante também é possível. Qualquer adaptação feita por um especialista na técnica também deve considerada como parte da invenção.

[00116] Centrifugação: A linhagem de transferência do fermentador para a centrífuga é esterilizada. O mosto de fermentação é então separado por centrifugação contínua em uma centrífuga. A centrifugação é realizada a 150 L/h (±30 L/h) com velocidade de rotação da tigela de 10900±1000 rpm. O sobrenadante é recuperado em um recipiente equipado com uma bolsa descartável. O peso do sobrenadante é medido na plataforma de equilíbrio.

[00117] Adição de arginina: O tampão de extração Tris arginina é esterilizado e então transferido para a bolsa descartável contendo 0

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23/27 sobrenadante de cultura. O tempo de contato necessário varia entre 1 e 7 horas. A concentração alvo de Tris e arginina depois da adição à bolsa descartável varia em torno de 0,3 M de L-arginina e de 20 mM de Tris.

[00118] O volume total depois da adição do tampão de extração é de cerca de 240 L.

[00119] Filtração: Duas etapas de filtração são realizadas em linha, a fim de clarificar o sobrenadante e produzir um secretoma límpido, livre de germes. A filtração é controlada pelo sistema de filtração/distribuição. O cartucho de filtração profunda descartável é colocado em seu alojamento de filtração. Todo o produto filtrado é recuperado de forma estéril em um recipiente equipado com uma bolsa descartável. A bolsa de produto filtrado é pesada na plataforma de equilíbrio e então armazenada a +5°C até ser distribuída.

[00120] Eletroforese em gel das proteínas do secretoma: vide Figura 1 [00121] Gel SDS-PAGE (4 - 12%) Bis-Tris, em condições desnaturantes e reduzidas, detecção em azul de Coomassie de depósitos de diferentes volumes de sobrenadantes de cultura (10, 15, 20, 30 μΙ, respectivamente) antes e depois da adição de tampão arginina. Nos 2 casos, observa-se diferentes bandas de proteínas de tamanho entre 14 e 100 kDa, incluindo uma banda principal a cerca de 38 kDa.

Exemplo 3: Efeito do secretoma na proliferação de fibroblastos humanos normais [00122] A técnica usada é aquela da incorporação de um nucleotídeo, 5-bromo-2^!--desoxiuridina (BrdU), análogo da timidina, no DNA de células em fase S, a 37°C. Esta técnica permite a quantificação das células cuja progressão no ciclo celular é característica de uma célula proliferativa (fase S ou de síntese do DNA).

[00123] Os fibroblastos são semeados em uma placa de 96 poços e então incubados por 72 horas na presença dos compostos a serem

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24/27 testados, EGF como controle positivo e o secretoma a 0,4, 0,6 e 1%. A incorporação de BrdU é realizada durante as últimas 24 horas. A incorporação de BrdU é quantificada com a ajuda do kit ELISA BrdU (item n° 11647229001, Roche Diagnostics).

[00124] A % do controle é calculada de acordo com a fórmula:

(Valor / média do controle) x 100 [00125] A Estimulação % é calculada de acordo com a fórmula:

Estimulação média em % = (Média (Valor / média do controle) x 100)™ 100

SEM = desvio padrão / Wi [00126] As análises estatísticas são feitas com a ajuda do teste de Student. Os estudos foram realizados em 3 pools de doadores.

[00127] O controle positivo EGF, estimulou forte e significativamente e de forma reprodutível a proliferação de fibroblastos nos 3 pools de doadores (95% de estimulação). Isto valida os experimentos. Os resultados mostram que o secretoma testado a 0,4%, 0,6% e 1% estimulou significativamente a proliferação de fibroblastos humanos normais. A Tabela 1 abaixo resume os resultados da incorporação de BrdU (média ± SEM) pelos fibroblastos humanos normais (por ELISA) depois de 72 horas de incubação na presença dos compostos testados (n=3 pools de doadores). Os resultados estão mostrados na Figura 2.

Tabela 1

Composto	controle	EGF 10 ng/ml	Secretoma 0,4%	Secretoma 0,6%	Secretoma 1%
Média % controle	100	195	138	134	127
SEM	2	10	6	4	3
Média % estimulação	0	95	38	34	27
SEM	2	10	6	4	3
teste de Student	—

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Exemplo 4: Efeito do secretoma na migração da linhagem ceratinóclto HaCaT [00128] Os estudos foram realizados com a ajuda do kit de migração celular Oris Cell Migration Assay (Platypus Technologies) de acordo com o protocolo padrão recomendado pelo fabricante. Principalmente, as células da linhagem HaCaT (linhagem celular humana de queratinócitos) são semeadas em placas de 96 poços. As tampas Oris™ são retiradas e os compostos a serem avaliados são acrescentados ao meio de cultura. A incubação prossegue por 24 horas para permitir a migração de células. Um traçador fluorescente permeável às células, calceína, é então adicionado para permitir a visualização das células na zona delimitada pelas tampas.

[00129] A migração de células é avaliada com a ajuda de imagens feitas dos poços e medição da área superficial de migração em mm².

[00130] A % do controle é calculada de acordo com a fórmula:

(Valor / média do controle) x 100 [00131] A estimulação em % é calculada de acordo com a fórmula: Estimulação média em % (Média (Valor / médio do controle) x 100)- 100

SEM = desvio padrão / v [00132] As análises estatísticas são realizadas com a ajuda do teste de Student.

[00133] Os estudos são realizados em 6 réplicas técnicas e em n-2 experimentos independentes.

[00134] Os controles positivos, TGF-b e soro de bezerro fetal (FCS), estimularam fortemente e significativamente a migração de células e de forma reprodutível (51% e 176% de estimulação, respectivamente). Isto valida os experimentos. Os resultados mostram que o secretoma testado a 0,4%, 0,6% e 1% estimularam significativamente a migração de queratinócitos HaCaT. A Tabela 2 abaixo resume os resultados da migração de células HaCaT depois de 24 horas de incu

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26/27 bação com os vários compostos (n=2). Os resultados estão mostrados na Figura 3.

Tabela 2

composto	controle	FCS 10%	TGF-b 10 ng/ml	Secretoma 0,4%	Secretoma 0,6%	Secretoma 1%
Média % controle	100	276	151	267	266	272
SEM	5	9	7	8	10	9
Média % estimulação	0	176	51	167	166	172
SEM	5	9	7	8	10	9
teste de Stu- dent	—		*··			***

Exemplo 5: Efeito do secretoma no fechamento da ferida em um modelo de cicatrização ex vivo [00135] Explantes de pele de orelhas de porco são mantidas em condições de sobrevivência. São produzidas biópsias de seis milímetros no centro das quais é formada uma ferida circular de 3 mm. A ferida altera toda a epiderme e a derme superior. Os produtos a serem avaliados são aplicados topicamente. Quarenta e oito horas depois, as biópsias são congeladas e uma coloração com haematoxilina-eosina é efetuada em seções. A cinética da reepitelialização é avaliada de acordo com o seguinte processo:

1) Atribuição de um escore definido de 0 a 3 de acordo com protocolo desenvolvido por J. Brandner (Pollok et al., 2010, J Cell Mol Med).

Medida exata em pm da extensão da zona reepitelializada da borda da ferida. Um teste t de Student é realizado para determinação da significância.

2) O aspecto morfológico da borda da ferida também é avaliado e permite determinar a qualidade da preservação do tecido. [00136] Preparações dos produtos a serem aplicados: o secretoma

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27/27 foi incorporado a 0,4, 0,6 e 1 % em peso à mesma base de formulação que aquela de um creme reparador de referência (Cicalfate® creme) testado paralelamente. A reepitelialização é avaliada por comparação com este creme de referência.

[00137] Os resultados mostram um efeito da dose com o secretoma na evolução da reepitelialização da ferida. A formulação contendo secretoma a 1% acelera significativamente a evolução do fechamento da ferida em comparação com o creme restaurador de referência (p-0,043). Além disso, a análise morfológica dos tecidos mostra uma tolerância excelente das formulações contendo o secretoma. Os resultados estão mostrados na Figura 4.

* *

Exemplo de composição: emulsão óleo em água
Secretoma de acordo com o Exemplo 2:	0,1-5%
Glicerina:	1-30%
Hexileno glicol:	0,1 -7%
Cetearil glucosídeo:	0,1 - 1%
Álcool cetearílico:	0,9 - 4%
Ácido esteárico:	0,5-4%
Gliceril estearato:	0,1-4%
Óleo vegetal:	0,1-10%
Água	qs 100%

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Secretoma bacteriano de uma bactéria Gram-negativa não patogênica pertencente à classe das Betaproteobacteria, subfamília Neisseriaceae, contendo um rRNA 16S compreendendo a sequência SEQ ID NO: 1, ou qualquer sequência tendo pelo menos 80% de identidade com a sequência SEQ ID NO: 1, para uso no tratamento de lesões de pele, o referido secretoma sendo obtido por um processo caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

- a) cultivo da referida bactéria em um meio de cultura e em condições adequadas para seu crescimento,

- b) separação líquido/sólido e recuperação da fase líquida,

- c) obtenção do referido secretoma compreendendo as biomoléculas secretadas pela referida bactéria na fase líquida.
2. Secretoma bacteriano para uso no tratamento de lesões de pele, caracterizado pelo fato de que um tampão básico é adicionado à fase líquida obtida na etapa b) e que a fase líquida tamponada é opcionalmente deixada em contato por 1 a 7 horas, de preferência a uma temperatura entre 1 e 6°C.
3. Secretoma bacteriano para uso no tratamento de lesões de pele, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o tampão básico é selecionado dentre tampão Tris, tampão arginina e misturas dos mesmos.
4. Secretoma bacteriano para uso no tratamento de lesões de pele, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a etapa b) de separação líquido/sólido é acompanhada por uma etapa b’) de clarificação da fase líquida ou da fase líquida tamponada por filtração antes da etapa c).
5. Secretoma bacteriano para uso no tratamento de lesões de pele, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a filtração é efetuada com um corte de 0.2 pm.
6. Secretoma bacteriano para uso no tratamento de lesões

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2/3 de pele, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que as referidas biomoléculas consistem nos peptídios, proteínas e metabólitos secundários secretados pela referida bactéria.
7. Secretoma bacteriano para uso no tratamento de lesões de pele, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a bactéria contém pelo menos um plasmídio compreendendo a sequência SEQ ID NO: 2, ou qualquer sequência tendo pelo menos 80% de identidade com a sequência SEQ ID NO: 2.
8. Secretoma bacteriano para uso no tratamento de lesões de pele, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a bactéria é a bactéria depositada no CNCM em 8 de abril de 2010 sob o número I-4920.
9. Secretoma bacteriano para uso no tratamento de lesões de pele, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que as lesões de pele são selecionadas do grupo que consiste em escoriações, queimaduras, queimaduras de sol, arranhões, cortes, esfoladuras, suturas.
10. Secretoma bacteriano para uso no tratamento de lesões de pele de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que as lesões de pele são lesões pós-traumáticas, pós-cirúrgicas, posteriores a um procedimento dermatológico, ou posteriores a um procedimento estético.
11. Secretoma bacteriano para uso no tratamento de lesões de pele, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o tratamento de lesões de pele consiste em melhorar a cicatrização e a restauração da pele.
12. Secretoma bacteriano para uso no tratamento de lesões de pele, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que ele é combinado com um sal de cobre e/ou com um sal de zinco.

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13. Composição dermatológica caracterizada por compreender um secretoma bacteriano, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8 e um excipiente dermatológico adequado para aplicação tópica, para uso no tratamento de lesões de pele.
14. Composição dermatológica, caracterizada por compreender um secretoma bacteriano, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, um sal de cobre e/ou um sal de zinco e um excipiente dermatológico adequado.
15. Composição dermatológica, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada por ser para uso no tratamento de lesões de pele.