BE1002141A5

BE1002141A5 - Procede de culture et d'activation de cellules humaines et conditionnement pour le traitement du cancer.

Info

Publication number: BE1002141A5
Application number: BE8800037A
Authority: BE
Original assignee: Bartholeyns Jacques; Poindron Philippe; Andreesens Reinhard
Priority date: 1988-01-13
Filing date: 1988-01-13
Publication date: 1990-07-31

Abstract

Un produit constitué de macrophages activés pour le traitement du cancer est préparé à partir de monocytes isolés à partir du sang d'un patient. On transforme ces monocytes en macrophages par culture et on active les macrophages en cellules cytotoxiques au moyen d'immunostimulants comprenant un activateur tel que de l'interféron humain recombinant alpha et un agent potentialisant l'activation, tel que du murapeptide. Un conditionnement pharmaceutique comprend, d'une part, un flacon souple contenant une culture de macrophages issus de monocytes humains et, d'autre part, un récipient, contenant des activateurs de macrophages, le contenu du récipient étant introduit dans le flacon souple dans les 12 à 24 heures précédant l'administration au patient.

Description

PROCEDE DE CULTURE ET D'ACTIVATION DE CELLULES HUMAINES
ET CONDITIONNEMENT POUR LE TRAITEMENT DU CANCER
La présente invention est relative à un pro- cédé de préparation de produits stimulant le système immunitaire contenant des macrophages humains activés'en cellules cytotoxiques pour les cibles tumorales.

L'invention concerne également des produits permettant la mise en oeuvre dudit procédé, notamment un conditionnement ou "kit" pour l'obtention de macrophages activés en cellules cytotoxiques.

Il est connu de traiter certains cancers par des lymphocytes isolés du sang humain, activés et multipliés en culture, en présence d'interleukine-2, de manière à obtenir des cellules tueuses (LAK) (S.A.

Rosenberg et al, N. Engl. J. MED., 1987, vol 316, pages 889-897).

Des tentatives cliniques de traitement du cancer ont aussi été effectuées récemment par H.C.

Stevenson et al, par injection de monocytes autologues activés à l'aide d'interféron humain y recombinant en monocytes cytotoxiques (H.C. STEVENSON et al, TRANSFUSION MEDECINE, édit. Alan R. Liss INC, 75-82,1986).

On a découvert à présent que les macrophages dérivés de monocytes humains différenciés et activés en culture, ont une activité antitumorale nettement supé- rieure à celles des lymphocytes tueurs (LAK) et des

monocytes cytotoxiques précités.'
De plus, on a constaté que l'on peut éviter la toxicité secondaire liée à l'interleukine-2 dans le cas des lymphocytes tueurs (LAK) et utiliser un nombre de cellules beaucoup moindre.

La présente invention est relative à un procédé de culture et d'activation de macrophages obtenus à partir de monocytes sanguins.

L'invention concerne, en particulier, un procédé de préparation de produits stimulant le système immunitaire contenant des macrophages humains, dans lequel on isole des monocytes à partir du sang d'un patient, ce procédé étant essentiellement caractérisé en ce qu'on transforme ces monocytes en macrophages dans un flacon souple perméable aux échanges gazeux et à surface interne hydrophobe non adhérente, par culture de ces mynocytes dans un milieu de culture contenant des fac- teurs de croissance et par différenciation, puis on active les macrophages en cellules cytotoxiques, en vue de l'administration de ces cellules cytotoxiques acti- vées, pour le traitement du cancer.

Selon une particularité du procédé suivant l'invention, on utilise les monocytes isolés dans un milieu de culture classique de type RPMI 1640 additionné d'au moins un antibiotique et d'un inhibi- teur de cyclooxygénase, ainsi que de facteurs de crois- sance.

Comme antibiotiques, on peut utiliser une pénicilline de type quelconque, de la streptomycine ou d'autres antibiotiques seuls ou en mélange.

Comme inhibiteurs de'la cyclooxygénase, on peut utiliser de l'indométhacine ou des dérivés de l'acide acétylsalicylique.

Selon une particularité importante de l'invention, on opère la culture des monocytes en l'absence de sérum sanguin pendant quelques jours, puis on achève la culture en présence de sérum sanguin autologue ou d'un groupe sanguin compatible, de manière à obtenir des macrophages.

Dans une forme de réalisation du procédé suivant l'invention, on active les macrophages en cellules cytotoxiques à l'aide d'immunostimulants, ces derniers comprenant un activateur des macrophages constitué par de l'interféron humain recombinant y ou par des endotoxines et par un agent potentialisant l'activation, choisi parmi le murapeptide éventuellement encapsulé dans des liposomes, le facteur nécrotisant des tumeurs (TNF a), d'autres immunomodula- teurs extraits de parois bactériennes et des agents oxydants tels que le peroxyde d'hydrogène ou le tetrachlorodecaoxygène (Oxochemie, RFA).

Selon une autre particularité de l'invention, on procède à l'activation des macrophages en cellules cytotoxiques dans les 12 à 24 heures précédant l'administration au patient.

La présente invention concerne également, à titre de produit thérapeutique nouveau, un conditionne- ment sous forme de "kit" comprenant, d'une part, un flacon souple perméable aux échanges gazeux et à sur- face interne hydrophobe, contenant une culture de macrophages issus de monocytes humains dans un milieu de

culture approprié et, d'autre part, un récipient conte- nant des activateurs de macrophages.

Dans ce conditionnement suivant l'invention, le flacon souple en matière plastique hydrophobe ou en teflon perméable aux échanges gazeux contient un milieu de culture classique de type RPMI 1640 additionné d'au moins un antibiotique et d'un inhibiteur de cyclooxygénase, ainsi que de facteurs de croissance.

Dans le conditionnement suivant la présente invention, le récipient précité contient au moins un immunostimulant de macrophages en cellules cytotoxiques, cet immunostimulant comprenant un activateur des ma- crophages constitué par de l'interféron humain recombi- nant y ou par des endotoxines et un agent potentialisant l'activation, choisi parmi le murapeptide éventuellement encapsulé dans des liposomes, le facteur nécrotisant des tumeurs (TNF a), d'autres immunomodulateurs extraits de parois bactériennes et des agents oxydants.

D'autres particularités et détails de l'invention res- sortiront de la description suivante d'un mode de réa- lisation illustratif du procédé selon l'invention.

Exemple 1. Séparation de leucocytes sanguins
On recueille stérilement des leucocytes d'un patient par passage d'environ 6 litres de sang en cytaphérèse.

On obtient ainsi environ 109 à 1010 leucocytes, c'est-à-dire un mélange de lymphocytes, de granulo- cytes et de monocytes, dénommé "buffy coat".

2. Enrichissement en monocytes
On ajoute 200 ml de sérum albumine humain en solution à 4 % en poids dans de l'eau distillée stérile aux leucocytes recueillis et on centrifuge le mélange, pendant 10 minutes, à 800 tours/min, pour éliminer les plaquettes sanguines.

On récupère le culot de la centrifugation et on le soumet à l'un ou l'autre des traitements suivants : a) séparation par centrifugation dans un élutriateur.

On centrifuge ledit culot repris dans une solution à 4 % de sérum albumine humain à
2500 tours/minute dans un élutriateur à contre-reflux (par exemple, l'élutriateur de la firme BECKMAN, U.S.A.). Les plaquettes sont ainsi séparées à une vitesse de 10 ml/minute, les lymphocytes à une vitesse de
15 ml/minute et les monocytes à une vitesse de 19 et 23 ml/minute.

(b) séparation par centrifugation au moyen de liquides de séparation.

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On centrifuge le culot précité repris dans
200 ml d'une solution à 4 % de sérum albumine humain . dans une poche de lavage circulaire souple en matière plastique à une vitesse de
1700 tours/minute, en introduisant successi- vement 200 ml de Ficoll-Hypaque (Pharmacia,

Suède), puis 150 ml de Nicodenz (Nyegaard,
Norvège) et enfin 200 ml des leucocytes pré- cités.

Le Ficoll est un produit bien connu utilisé, de manière classique, pour séparer les monocytes des lymphocytes.

Le Nicodenz est un dérivé non ionique de l'acide triiodobenzoîque permettant de séparer les monocytes des lymphocytes.

Après environ 5 minutes, les types de cellules sont séparés l'un de l'autre. On élimine les 200 premiers ml de surnageant.

On recueille les 250 ml suivants contenant les monocytes. On élimine la dernière fraction contenant les lymphocytes et les granulocytes.

La fraction monocytaire est ensuite lavée, à deux reprises, par centrifugation,,pendant 10 minutes à 1400 tours/minute dans une solution à 4 % de sérum albumine humain.

On obtient les monocytes avec un rendement de
90 % et une pureté de 60 à 70 % (contamina- tion par de gros lymphocytes).

3. Mise en culture des monocytes
Les monocytes sont transférés dans des poches souples, telles que des poches hydrophobes en teflon, comme le Biofolia fabriqué par HERAUS, RFA, ou des poches hydrophobes en matière plastique

telles que les poches Lifecell (Fenwall Laboratories, division de Travenol LAB, U.S.A.).

On met dans chaque poche 2 à 5.10 8 monocytes par 200 ml d'un milieu de culture de composition suivante : - -RPMI 1640 ; - antibiotiques 100 u/ml de pénicilline G et
100 mcg/ml de streptomycine ; - indométhacine : 5.10'M ; - facteurs de croissance : - acide oxalacétique : 26 mg : - insuline : 1,6 mg ; - glutamine : 2 mM ; - acide pyruvique : 0,1 mg ; - acides aminés essentiels (concentré Gibco) : 2 ml.

La culture est initiée dans un milieu exempt de sérum sanguin pendant quelques jours, par exem- ple 4 à 8 jours, à une température de 37 C dans un incubateur humide air-CO2-
Le cas échéant, on peut ajouter du facteur de croissance des macrophages (CSF 1 recombinant) pour augmenter la population cellulaire.

Ensuite, on ajoute 5 à 10 % en volume de sérum autologue ou de sérum de groupe sanguin compatible (AB ) et on poursuit la culture pendant au moins 48 heures pour obtenir des macrophages différenciés. Ces macrophages peuvent être conservés en culture à 37 C dans une poche hydrophobe pendant de nombreuses semaines.

4. Activation des macrophages en cellules cytotoxiques
Les macrophages sont activés en cellules cytotoxiques par addition d'immunostimulants combi- nés, c'est-à-dire d'un agent activant les macro- phages constitué par de l'interféron humain recom- binant y ou par des endotoxines et d'un agent potentialisant l'activation, choisi parmi le murapeptide éventuellement encapsulé dans des liposomes, le facteur nécrotisant les tumeurs (TNF a), d'autres immunomodulateurs extraits de parois bactériennes et des agents oxydants.

En pratique, on utilise 100 à 1000 unités d'interféron humain recombinant y par ml de culture et 0,1 à 1 g/ l d'un murapeptide éventuellement encapsulé dans des liposomes.

Cette activation qui prend quelques heures doit être induite 12 à 24 heures avant l'utili- sation des macrophages activés.

5. Caractérisation des macrophages activés (a) Cytotoxicité -------------
La toxicité des macrophages activés vis-à-vis de cellules tumorales est vérifiée in vitro sur des cibles tumorales humaines, par exemple lignée leucémique U 937 ou carcinome de l'ovaire.

A cette fin, on met les macrophages activés et les cellules tumorales dans un rapport numérique 1/1 en contact pendant 48 heures à 37 C et on vérifie

l'incorporation de thymidine tritiée ou le rejet d'un marqueur vital, tel que le bleu trypan.

La cytotoxicité des macrophages activés de la manière décrite plus haut s'avère supérieure à 50 % des cellules tumorales cibles.

Des essais comparatifs ont révélé qu'avec des lymphocytes tueurs (LAK) ou des monocytes activés cytotoxiques, une telle cytotoxicité ne peut pas être obtenue. Ainsi, avec les lymphocytes tueurs, il faut un rapport cellules tueuses/cellules tumorales de 10 à 100/1 pour une cytotoxicité comparable.

(b) Autres caractéristiques ----------------------- Les macrophages activés adhèrent aux matières plastiques et au verre.

Ces macrophages activés phagocytent des particules telles que levures ou billes de latex. Ils ne sécrètent pas de pyrogènes endogènes (interleukine 1 et TNF) à l'inverse des monocytes activés.

Les macrophages activés présentent, par ailleurs, une série d'antigènes de membrane spécifiques, tels que MAX 1, Fc' CD 16, CD 14, HLA DR, TNF et mannose.

Lesdits macrophages activés ont aussi une activité enzymatique de type estérase non spécifique et une phosphatase acide résistante au tartrate.

6. Essais in vivo
L'efficacité du traitement par transfert adoptif des macrophages activés suivant la présente invention a été vérifiée sur diverses tumeurs chez la souris.

1. Le transfert hebdomadaire de 106macrophages murins activés à des souris Balb/c porteuses de sarcome EMT 6 sous-cutané macroscopique permet une stabilisation de la tumeur et en combinaison avec un immunoadjuvant (tel que interféron y, TNF ou endotoxine) une régression complète.

2. Un transfert hebdomadaire de 106 macrophages murins à des souris C57Bl/6 porteuses de carcinome de Lewis macroscopique permet une régression de 30 % de la tumeur primaire et une inhibition d'au moins 80 % des métas- tases pulmonaires.

3. Le transfert de 106 macrophages humains activés à des souris nues (sans lymphocytes
T) porteuses de carcinome de l'ovaire humain sous-cutané permet une stabilisation complète du carcicome.

Ces essais in vivo permettent d'envisager une efficacité chez l'homme par thérapie locale, par 100 à 500 x 106 macrophages autologues activés administrés par injection en péri- phérie de tumeurs. L'utilisation serait envisagée pour le traitement de tumeurs so- lides, telles que, entre autres, le carcinome

de l'ovaire, les mélanomes, les carcinomes bronchiques et les glioblastomes cérébraux.

Les macrophages activés par le procédé suivant l'invention pourraient être également utiles pour combattre des infections chroniques bactériennes ou virales graves résistant aux anti- biotiques.

Des essais ont enfin montré que les macrophages activés par le procédé suivant l'invention favorisent des cicatrisations difficiles.

Les macrophages activés en question peuvent également être utilisés pour des modifications génétiques et des thérapies cellulaires.

L'invention couvre également un conditionnement ou "kit" comportant deux parties, à savoir : 1) une poche perméable aux échanges gazeux, par exemple en matière plastique hydrophobe ou teflon, cette poche contenant tous les éléments nécessaires pour la culture de monocytes sanguins et leur différenciation en macrophages, et 2) un récipient, tel qu'un flacon, contenant les agents d'activation en macrophages cytotoxiques.

Lors de l'utilisation du "kit" suivant l'invention, le contenu du récipient stérile est introduit dans la poche également stérile quelques heures avant l'administration thérapeutique des macrophages activés au patient.

Claims

REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation de produits stimulant le système immunitaire contenant des macrophages humains, dans lequel on isole des monocytes à partir du sang d'un patient et dans lequel on traite ces monocytes dans un milieu de culture, caractérisé en ce qu'on traite, par culture et différenciation, ces monocytes dans un flacon souple perméable aux échanges gazeux et à surface interne hydrophobe non adhérente contenant le milieu de culture et des facteurs de croissance de manière à transformer les monocytes en macrophages et en ce qu'on active les macrophages en cellules cytotoxiques, en vue de l'administration de ces cellules cytotoxiques activées, pour le traitement du cancer.
2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on traite par culture et différenciation lesdits monocytes dans au moins un milieu contenant du sérum sanguin autologue ou d'un groupe sanguin compatible de manière à obtenir lesdits macrophages.
3. Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce qu'on opère la culture des monocytes dans un milieu de culture exempt de sérum sanguin pendant quelques jours et en ce qu'on achève la culture en présence de sérum sanguin compatible.
4. Procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on traite les monocytes isolés dans un milieu de culture classique du type RPMI 1640 additionné d'au moins un <Desc/Clms Page number 13> antibiotique et d'un inhibiteur de cyclooxygénase, ainsi que des facteurs de croissance.
5. Procédé suivant la revendication 4, caractérisé en ce qu'on utilise une pénicilline et/ou de la streptomycine comme antibiotique et de l'indométhacine comme inhibiteur de la cyclooxygénase.
6. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 4 et 5, caractérisé en ce qu'on utilise comme facteur de croissance de l'acide oxalacétique, de l'insuline, de la glutamine et de l'acide pyruvique.
7. Procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on active les macrophages en cellules cytotoxiques à l'aide d'immunostimulants.
8. Procédé suivant la revendication 7, caractérisé en ce qu'on utilise comme immunostimulants, (1) un activateur des macrophages constitué par de l'interféron humain recombinant y ou par des endotoxines et (2) un agent potentialisant l'activation, choisi parmi le murapeptide éventuellement encapsulé dans des liposomes, le facteur nécrotisant les tumeurs (TNF a), d'autres immunomodulateurs extraits de parois bactériennes et des agents oxydants.
9. Procédé suivant la revendication 8, caractérisé en ce qu'on utilise, comme activateur, de l'interféron humain recombinant y et comme agent potentialisant l'activation du murapeptide. <Desc/Clms Page number 14>
10. Procédé suivant la revendication 8, caractérisé en ce qu'on utilise le tétrachlorodecaoxygène (TCDO) ou le peroxyde d'hydrogène comme agent oxydant.
11. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisé en ce qu'on utilise environ 100 à 1000 unités d'interféron humain recombinant y par millilitre de culture de macrophages.
12. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 7 à 9 et 11, caractérisé en ce qu'on utilise environ 0,1 à 1 pg de murapeptide par millilitre de culture de macrophages.
13. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisé en ce qu'on procède à l'activation des macrophages en cellules cytotoxiques dans les 12 à 24 heures précédant l'administration au patient.
14. Conditionnement sous forme de "kit" utilisable pour le traitement du cancer, caractérisé en ce qu'il comprend, d'une part, un flacon souple perméable aux échanges gazeux et à surface interne hydrophobe, contenant une culture de macrophages issus de monocytes humains dans un milieu de culture approprié et, d'autre part, un récipient contenant des activateurs de macrophages.
15. Conditionnement suivant la revendication 14, caractérisé en ce que le flacon souple précité contient un milieu de culture classique du type RPMI 1640 additionné d'au moins un antibiotique et d'un inhibiteur de cyclooxygénase, ainsi que de facteurs de croissance. <Desc/Clms Page number 15>
16. Conditionnement suivant la revendication 15, caractérisé en ce que l'antibiotique est choisi parmi les pénicillines et/ou la streptomycine.
17. Conditionnement suivant la revendication 15, caractérisé en ce que l'inhibiteur de la cyclooxygénase est de l'indométhacine.
18. Conditionnement suivant l'une quelconque des revendications 14 à 17, caractérisé en ce que le récipient précité contient au moins un immunostimulant de macrophages en cellules cytotoxiques.
19. Conditionnement suivant la revendication 18, caractérisé en ce que l'immunostimulant comprend un activateur des macrophages constitué par de l'interféron humain recombinant y ou par des endotoxines et un agent potentialisant l'activation, choisi parmi le murapeptide éventuellement encapsulé dans des liposomes, le facteur nécrotisant les tumeurs (TNF a), d'autres immunomodulateurs extraits de parois bactériennes et des agents oxydants.
20. Conditionnement suivant la revendication 19, caractérisé en ce que l'activateur est de l'interféron humain recombinant y et l'agent potentialisant l'activation est du murapeptide.
21. Conditionnement suivant la revendication 14, caractérisé en ce que le flacon souple est réalisé en une matière plastique hydrophobe ou en téflon.