WO1991012316A1 - Procede de preparation de derives sanguins et derives obtenus par ce procede - Google Patents

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    • C12N2501/82—Histamine

Definitions

  • the present invention relates to a process for the preparation of derivatives of blood cells in which monocytes or leukocytes are isolated from blood and in which these monocytes or leukocytes are treated in a culture medium.
  • the process according to the invention which is a process of the type described in the first paragraph of this specification, is a process in which the monocytes or leukocytes are treated in a medium containing at least 1 g / l of amino acid (s) ( s), at least 3 g / 1 of glucose and at least 10 mg / 1 of vitamins placed in a bag permeable to gaseous samples.
  • the medium contains more than 4 g / l of glucose and more than 2 g / l of amino acid (s).
  • An advantageous medium according to the invention is a medium containing, as amino acids, L-Cystine 2HC1, L-Glutamine, L-Isoleucine HC1 HO, L-Leucine, L- Lysine HC1, L-Threonine, L-Tyrosine and L-Valine.
  • the medium according to the invention also advantageously contains more than 5 g / l of alkali or alkaline earth metal salts.
  • the moncytes or leukocytes are treated in a medium containing at least 2%, preferably from 2 to 5% of decomplemented serum or plasma.
  • the treatment according to the invention of the cells is advantageously carried out at a temperature between 30 and 40 ° C, preferably around 37 ° C under an atmosphere consisting of an oxygenated medium containing from 2 to 10% and, preferably, 5% CO 2 , the concentration of monocytes or leukocytes in the medium to be treated being, preferably between
  • An oxygenated medium suitable for the process according to the invention is, for example, humid air containing 5% of CO-.
  • At least one growth factor is added to the culture medium, this factor preferably being chosen from the monocyte-macrophage colony stimulating factor (MCSF), the granulocyte-macrophage colony stimulating factor (G CSF) and insulin.
  • MCSF monocyte-macrophage colony stimulating factor
  • G CSF granulocyte-macrophage colony stimulating factor
  • At least one compound chosen from oxaloacetic acid, glutamine, pyruvic acid or amino acids is added to the culture medium.
  • At least one porous support is introduced into the culture medium on which the monocytes or macrophages are fixed, so as to produce extracellular mediators, the porous support preferably being porous glass beads.
  • the medium and the beads are advantageously removed from the pocket permeable to gas exchanges, after a stay of 2 to 24 hours of said medium and said beads in the permeable pocket and this medium and these balls are placed in a reactor under a controlled atmosphere in CO_ and
  • the monocytes or leukocytes are treated in the medium for at least 6 days.
  • These differentiated macrophages can be activated by adding recombinant human interferons and a cyclooxygenase inhibitor, in particular indomethacin, to the culture medium.
  • 100 to 500 units of interferons per ml of medium are added to the medium, so as to obtain anti-tumor macrophages after at least 6 hours.
  • Such macrophages are advantageously used in cancer therapy.
  • At least one compound chosen from murapeptide or a formyl peptide, an agent is added to the culture medium containing the differentiated leukocytes or macrophages.
  • oxidant polylysine amino 1-3 polyglucose
  • an immunomodulator extracted from bacterial membranes
  • phorbol myristate acetate phytohemagglutinin
  • an antibody an antireceptor or thrombin plus vitamin C
  • the medium is subjected to molecular filtration, while to extract cytokines and protease inhibitors of molecular weight greater than 50,000, the medium is respectively subjected to chromatography affinity followed by filtration and precipitation followed by molecular filtration.
  • the medium is subjected, on the one hand, to molecular filtration, so as to extract growth factors with a molecular weight of less than 20,000 and, on the other hand, to a chromatography of affinity, precipitation and molecular filtration, so as to extract cytokines and protease inhibitors of molecular weight greater than 50,000 from the medium,
  • the cells remaining fixed to the glass beads are treated with phospholipase C and a nonionic detergent, so as to dissolve in the protein-free medium of the membrane receptors which are purified by affinity chromatography.
  • the subject of the present invention is also:
  • composition of macrophages differentiated in culture and taken up in a glycerol medium such a composition being able to be frozen so as to allow the cryopreservation of the macrophages in said glycerol medium, the latter being more biocompatible and bactericidal;
  • compositions containing at least one new growth factor are given below by way of example only.
  • the mononuclear cells were resuspended in physiological solution (PBS solution, saline solution containing 9 g / l of phosphate buffer and this suspension was subjected to centrifugation at 1700 rpm so as to obtain a concentrate.
  • physiological solution PBS solution, saline solution containing 9 g / l of phosphate buffer and this suspension was subjected to centrifugation at 1700 rpm so as to obtain a concentrate.
  • This concentrate was washed twice with said physiological solution and this concentrate was suspended in a medium containing more than 1 g / l of amino acids and more than 4 g / l of glucose.
  • the composition of the medium is given in table 1.
  • the cell suspension was placed in polypropylene conical tubes and this suspension was subjected at 4 ° C to a slow horizontal rotation for 30 to 45 minutes until flocculation " of monocytes or leukocytes was observed.
  • the tubes After placing the tubes vertically, they were placed in a basin containing ice for 15 minutes until the monocytes or leukocytes sedimented.
  • the supernatant was aspirated and 3 to 10 ml of the medium, the composition of which is given in table i, was added to the monocytes or leukocytes. This suspension of monocytes or leukocytes was deposited on 2 to 5 ml of decomplemented serum. The agglutinated monocytes or leukocytes were then allowed to sediment through the serum at ⁇ * f ° C. This sedimentation took 5 to 30 minutes.
  • the monocytes or leukocytes (1 to 10 million / ml) were suspended in the medium, the composition of which is given in table 1, this medium being supplemented with decomplemented human serum (5%), namely antibiotics penicillin and streptomycin and hollow glass beads.
  • This medium containing the monocytes as well as the hollow glass beads was placed in a tefion pocket whose walls allow a gas exchange under an atmosphere containing 5% CO 2 and at
  • the cells were differentiated into macrophages.
  • the cells being preferably fixed on the glass, it is possible by elimination of the culture medium to obtain a concentrate of macrophages fixed on the beads.
  • Macrophage activation can then be obtained according to the methods described below.
  • ⁇ interferon 100 ⁇ g / ml of indomethacin as a cyclooxy genase inhibitor and 10 ⁇ g / ml of cimetidine as an inhibitor of binding sites. type 2 histamine.
  • the anti-tumor macrophages were activated. These can be used for example by injection for the treatment of cancer and for the fight against infections.
  • polylysine from 20 to 200 ⁇ g / ml
  • poly F extracted from the membrane of Streptococcus mutans from 10 to 100 ⁇ g / ml
  • phorbol myristate acetate from 0.01 to 0.5 ⁇ g / ml
  • phytohemagglutinin from 1 to 10 ⁇ g / ml
  • fibronectin from 1 at 10 ⁇ g / ml
  • MCSF monocyte macrophage colony stimulating factor
  • GMCSF granulocyte macrophage colony stimulating factor
  • the preparation enriched with growth factors was subjected to molecular filtration, so as to obtain a concentrate containing essentially the following growth factors:
  • MGCSF granulocyte growth factor - macrophage CSF
  • NAF Neurotrophil activating factor
  • the concentrate was heated at 60 ° C for 10 hours to cause viral inactivation and said factors were purified by affinity chromatography on non-porous supports on which are coupled anti-receptor antibodies (anti-receptor antibodies for immunoglobulin, MEDAREX, USA).
  • the leukocyte concentrate or buffy coat is directly cultured in 1 to 5 times its volume of the medium described above in the presence of 1 to 5 U / ml of human or bovine thrombin and of vitamin C (10 to 200 ⁇ ).
  • the preparation is cultivated for 8 hours according to the above conditions.
  • the collected extracellular medium gives a composition rich in multiple growth factors in the form of a cocktail.
  • a virally inactivated concentrate was used.
  • growth factors with a molecular weight of less than 20,000 were recovered from said concentrate and after affinity chromatography and precipitation with ammonium sulfate, inhibitors were extracted from the medium by molecular filtration.
  • proteases with a molecular weight greater than 50,000 such as antiprotease, plasmin inhibitor, plasminogen activator inhibitor
  • cytokines such as antiprotease, plasmin inhibitor, plasminogen activator inhibitor
  • the remaining cells fixed on the beads were then treated with phospholipase C and with tween (a nonionic detergent), so as to dissolve in the extracellular medium membrane receptors.
  • the growth factors obtained by the process according to the invention differ from those obtained by genetic engineering in that they are in a glycosylated form. They are therefore better absorbed by the human body and are therefore more active.
  • the differentiated human macrophages are advantageously mixed with a solution containing at least 10% glycerol, so as to allow their freezing in liquid nitrogen and therefore their cryopreseryation.
  • a macrophage-glycerol solution composition can be used after rapid thawing for the treatment of the skin (topically), to fight infections, to induce debridement and wound healing.
  • the present invention also relates to a composition in the form of a hydrogel containing at least one, preferably a mixture of glycosylated growth factors.
  • a composition in the form of a hydrogel containing at least one, preferably a mixture of glycosylated growth factors.
  • Such a composition can be used to promote wound healing, cosmetic surgery, cosmetology, neovascularization, to combat cell aging, baldness, etc.
  • the growth factors according to the invention can be used for 1 Osteoporosis, bone repair, autoimmune diseases, arthritis, ulcers, ophthalmology, odontology, nerve and stem cell regeneration as well as for their absorption on various prostheses.

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Abstract

Procédé de préparation de dérivés de cellules sanguines dans lequel on isole des monocytes ou leucocytes à partir du sang et dans lequel on traite ces monocytes ou leucocytes dans un milieu de culture, caractérisé en ce qu'on traite les monocytes ou leucocytes dans un milieu contenant au moins 1 g/l d'acide(s) aminé(s), au moins 3 g/l de glucose et au moins 10 mg/l de vitamines placés dans une poche perméable aux échanges gazeux.

Description

PROCEDE DE PREPARATION DE DERIVES SANGUINS ET DERIVES OBTENU PAR CE PROCEDE
La présente invention est relative à un procédé de préparation de dérivés de cellules sanguines dans lequel on isole des monocytes ou leucocytes à partir du sang et dans lequel on traite ces monocytes ou leucocyte dans un milieu de culture.
On a remarqué qu'en sélectionnant le milieu de culture, il était possible d'obtenir avec d'excellents rendements des macrophages, des facteurs de croissance, des mono ines et des inhibiteurs de protéases.
Le procédé suivant l'invention, qui est un procédé du type décrit dans le premier paragraphe du présent mémoire, est un procédé dans lequel on traite les monocytes ou leucocytes dans un milieu contenant au moins 1g/l d'acide(s) aminé(s), au moins 3 g/1 de glucose et au moins 10 mg/1 de vitamines placés dans une poche perméable aux échanσeR gazeux.
De préférence, le milieu contient plus de 4 g/1 de glucose et plus de 2 g/1 d'acide(s) aminé(s).
Un milieu avantageux suivant l'invention est un milieu contenant, à titre d'acides aminés, de la L-Cystine 2HC1, de la L-Glutamine, de la L-Isoleucine HC1 H-O, de la L-Leucine, de la L-Lysine HC1, de la L-Thréonine, de la L-Tyrosine et de la L-Valine. Le milieu suivant l'invention contient également avantageusement plus de 5 g/1 de sels de métaux alcalins ou alcalino-terreux.
Selon une particularité du procédé suivant l'invention, on traite les moncytes ou leucocytes dans un milieu contenant au moins 2%, de préférence de 2 à 5 % de sérum ou plasma décomplémenté. Le traitement suivant l'invention des cellules est avantageusement réalisé à une température comprise entre 30 et 40°C, de préférence d'environ 37°C sous une atmosphère constituée d'un milieu oxygéné contenant de 2 à 10% et, de préférence, 5% de CO2, la concentration en monocytes ou leucocytes dans le milieu à traiter étant, de préférence comprise entre
1.106 et 3.106 cellules par ml.
Un milieu oxygéné convenant pour le procédé suivant l'invention est, par exemple, de l'air humide contenant 5 % de CO-.
Dans une variante du procédé suivant l'invention, on ajoute au milieu de culture au moins un facteur de croissance, ce facteur étant, de préférence, choisi parmi le monocyte-macrophage colony stimulating factor (MCSF) , le granulocyte-macrophage colony stimulating factor (G CSF) et l'insuline.
Dans une autre variante du procédé suivant l'invention, on ajoute au milieu de culture au moins un composé choisi parmi l'acide oxaloacétique, la glutamine, 1'acide pyruvique ou des acides aminés .
Selon une particularité avantageuse, on introduit dans le milieu de culture au moins un support poreux sur lequel les monocytes ou macrophages se fixent, de manière a produire des médiateurs extracellulaires , le support poreux étant, de préférence, des billes en verre poreux. Dans le cas où un support poreux est introduit dans le milieu, on retire, de façon avantageuse, le milieu et les billes de la poche perméable aux échanges gazeux, après un séjour de 2 à 24 heures dudit milieu et desdites billes dans la poche perméable et on place ce milieu et ces billes dans un réacteur sous atmosphère contrôlée en CO_ et
°2*
Pour obtenir des macrophages différenciés, on traite les monocytes ou leucocytes dans le milieu pendant au moins 6 jours. Ces macrophages différenciés peuvent être activés en ajoutant au milieu de culture des interférons recombinants humains et un inhibiteur de cyclooxygénase, en particulier l'indométhacine.
De façon avantageuse, on ajoute au milieu de 100 à 500 unités d'interférons par ml de milieu, de manière à obtenir après au moins 6 heures des macrophages antitumoraux. De tels macrophages sont avantageusement utilisés en thérapie cancéreuse.
Pour libérer dans le milieu extracellulaire des facteurs de croissance, des monokines et/ou des inhibiteurs de protéases, on ajoute au milieu de culture contenant les leucocytes ou les macrophages différenciés au moins un composé choisi parmi le murapeptide ou un formyl-peptide, un agent oxydant, la polylysine amino 1-3 polyglucose, un immunomodula- teur extrait de membranes bactériennes, du phorbol myristate acétate, de la phytohémagglutinine, un anticorps, un antirécepteur ou de la thrombine plus vitamine C, de manière à libérer dans le milieu extracellulaire des facteurs de croissance, des monokines et/ou des inhibiteurs de protéases . Pour extraire dudit milieu des facteurs de croissance de poids moléculaire inférieur à 20.000, on soumet le milieu à une filtration moléculaire, tandis que pour extraire les cytokines et les inhibiteurs de protéases de poids moléculaire supérieur à 50.000, on soumet le milieu respectivement à une chromatographie d'affinité suivie d'une filtration et à une précipitation suivie d'une filtration moléculaire.
Dans une forme de réalisation du procédé, on soumet le milieu, d'une part, à une filtration molécu¬ laire, de manière à extraire des facteurs de croissance de poids moléculaire inférieur à 20.000 et, d'autre part, à une chromatographie d'affinité, à une précipi¬ tation et à une filtration moléculaire, de manière à extraire du milieu des cytokines et des inhibiteurs de protéases de poids moléculaire supérieur à 50.000, On traite les cellules restant fixées aux billes de verre dans le milieu par de la phospholipase C et un détergent non ionique, de manière à solubiliser dans le milieu dépourvu de protéines des récepteurs membra- naires que l'on purifie par chromatographie d'affinité.
La présente invention a également pour objet :
* une composition de macrophages différenciés en cultu¬ re et repris dans un milieu glycérol, une telle compo¬ sition pouvant être congelée de manière à permettre la cryopréservation des macrophages dans ledit milieu glycérol, ce dernier étant de plus biocompatible et bactéricide ;
* des nouveaux facteurs de croissance, ces derniers se trouvant sous une forme glycosylée ;
* des compositions contenant au moins un nouveau facteur de croissance. Un procédé suivant l'invention sera donné ci-après a titre d'exemple uniquement.
On a collecté 300 ml de sang que l'on a centrifugé selon des techniques connues, de manière à en extraire un concentré leucocytaire ou buff coat.
On a soumis ce concentré à une centrifugation
_ , (Lymphoprep) de manière à le purifier en cellules mononucléées.
On a remis en suspension les cellules mononucléées dans une solution physiologique (solution PBS, solution saline contenant 9 g/1 de tampon phosphate et on a soumis cette suspension à une centrifugation à 1700 tours/minute de manière a obtenir un concentré.
On a lavé deux fois ce concentré au moyen de ladite solution physiologique et on a mis ce concentré en suspension dans un milieu contenant plus de 1 g/1 d'acides aminés et plus de 4 g/1 de glucose. La compo¬ sition du milieu est donnée dans le tableau 1.
TABLEAU 1
Figure imgf000008_0001
TABLEAU 1 (suite)
Figure imgf000009_0001
On a également ajouté au milieu 30 μ molaire de mercaptoéthanol et 10 % de sérum ou plasma humain AB~ décomplémenté.
On a placé la suspension cellulaire dans des tubes coniques en polypropylène et on a soumis cette suspension à 4'C à une lente rotation horizontale pendant 30 à 45 minutes jusqu'à ce qu'on observe une floculation" de monocytes ou leucocytes.
Après avoir placé les tubes verticalement, on les a déposés dans un bassin contenant de la glace pendant 15 minutes jusqu'à ce que les monocytes ou leucocytes sédimentent.
On a aspiré le surnageant et on a ajouté aux monocytes ou leucocytes 3 à 10 ml du milieu dont la composition est donnée dans le tableau i. On a déposé cette suspension de monocytes ou leucocytes sur 2 à 5 ml de sérum décomplémenté. On a laissé ensuite les monocytes ou leucocytes agglutinés sédimenter à travers le sérum à <*f°C. Cette sédimentation prenait de 5 à 30 minutes.
On a aspiré ensuite le sérum et le milieu. 5
On a mis en suspension les monocytes ou les leucocytes (1 à 10 millions/ml) dans le milieu dont la composition est donnée dans le 0 tableau 1, ce milieu étant additionné de sérum humain décomplémenté (5%), d'antibiotiques à savoir de la pénicilline et de la streptomycine et de billes en verre creux. On a placé ce milieu contenant les monocytes ainsi que les billes en verre creux dans une poche en téfion dont les parois permettent un échange gazeux sous atmosphère à 5% de CO_ et à
35 37°C. Après 7 jours de culture, les cellules étaient différenciées en macrophages.
Les cellules étant de préférence fixées sur le verre, on parvient par élimination du milieu de culture à obtenir un concentré de macrophages fixés sur les billes .
L'activâtion des macrophages peut alors être obtenue selon les procédés décrits ci-après .
Activâtion en macrophages antitumoraux
On a ajouté au concentré de macrophages 200 unités/ml d'interféron γ recombinant, 100 μg/ml d'indométhacine en tant qu*inhibiteur de la cyclooxy- génase et 10 ug/ml de cimétidine en tant qu'inhibiteur des sites de fixation du type 2 de l'histamine. Après 24 heures , les macrophages antitumoraux étaient activés Ces derniers peuvent être utilisés par exemple par injection pour le traitement du cancer et pour la lutte contre des infections .
Activâtion des macrophages pour la production de facteurs de croissance et dérivés ainsi obtenus
On a ajouté au concentré de macrophages différen¬ ciés 1 mg/ml de murapeptide, 5 μg/ml d*immunomodulateur extrait de membranes bactériennes LPS, lipopolysaccha- ride extrait de bactéries GRAM .
Ceci permet la libération .de facteurs de crois¬ sance dans le milieu extracellulaire. On aurait également pu ajouter au concentré de macrophages différenciés , de manière à libérer dans le milieu extracellulaire des facteurs de croissance., des monokines et/ou des inhibiteurs de protéases, un ou plusieurs des composés suivants : polylysine (de 20 à 200 μg/ml) poly F extrait de la membrane de Streptococcus mutans (de 10 à 100 μg/ml) phorbol myristate acétate (de 0,01 à 0,5 μg/ml) phytohémagglutinine (de 1 à 10 μg/ml) fibronectine (de 1 à 10 μg/ml)
Zymosan (de 10 à 100 μg/ml) extrait de la membrane de Nocardia Opaca (de 10 à 100 μg/ml)
On peut également ajouter au milieu de 10 à
200 μg/ml de facteurs de croissance, en particulier de
MCSF (monocyte macrophage colony stimulating factor) et de GMCSF (granulocyte macrophage colony stimulating factor) .
Après 24 heures , on a soumis la préparation enrichie de facteurs de croissance à une filtration moléculaire, de manière à obtenir un concentré conte¬ nant essentiellement les facteurs de croissance suivants :
- PDGF (Platelet derived growth factor - facteur de croissance dérivé de plaquettes) ;
- IGF. (Insulin like growth factor - -facteur de croissance type insuline) ;
- MDGF (Macrophage derived growth factor - facteur de croissance dérivé de macrophage) ;
- MGCSF (facteur de croissance de granulocyte - macrophage CSF) - - NAF (Neutrophil activating factor - facteur de croissance d'activation neutrophile) ;
- FGF (Fibroblast growth factor - facteur de croissance fibroblaste ) .
On a chauffé le concentré à 60°C pendant 10 heures pour provoquer une inactivation virale et on a purifié lesdits facteurs par chromatographie d'affinité sur des supports non poreux sur lesquels sont couplés des anticorps antirécepteurs (anticorps antirécepteurs pour 1'immunoglobbuline, MEDAREX, U.S.A. ).
Selon une procédure simplifiée le concentré leucocytaire ou buffy coat, est directement mis en culture dans 1 à 5 fois son volume du milieu décrit ci-avant en présence de 1 à 5 U/ml de thrombine humaine ou bovine et de vitamine C (10 à 200 μ ).
La préparation est cultivée pendant 8 heures selon les conditions précitées. Le milieu extracellulaire récolté donne une composition riche en facteurs de croissance multiples sous forme de cocktail.
Un schéma de purification et de préparation d'autres dérivés du sang.est donné, à titre d'exemple, ci-après :
On a utilisé un concentré inactivé viralement. Par filtration moléculaire, on a récupéré dudit concentré des facteurs de croissance d'un poids moléculaire inférieur à 20.000 et après une chromatographie d'affinité et une précipitation au sulfate d'ammonium, on a extrait du milieu, par filtration moléculaire, des inhibiteurs de protéases d'un poids moléculaire supérieur à 50.000 (tels, que l antiprotéase, inhibi¬ teur de la plasmine, inhibiteur de l'activateur du plasminogène) et des cytokines. Les cellules restantes fixées sur les billes ont ensuite été traitées par de la phospholipase C et par du tween (un détergent non ionique), de manière à solu¬ biliser dans le milieu extracellulaire des récepteurs membranaires.
Les facteurs de croissance obtenus par le procédé suivant l'invention se différencient de ceux obtenus par génie génétique par le fait qu'ils se trouvent sous une forme glycosylée. Ils sont dès lors mieux absorbés par le corps humain et sont dès lors plus actifs.
Les macrophages humains différenciés sont avanta¬ geusement mélangés à une solution contenant au moins 10 % de glycérol, de manière à permettre leur congélation dans de l'azote liquide et donc leur cryopréseryation. Une telle composition macrophage- solution glycérol peut être utilisée après décongéla¬ tion rapide pour le traitement de la peau (par voie topique) , pour combattre des infections, pour induire le débridement et la cicatrisation des plaies.
La présente invention a également pour objet une composition sous forme d'hydrogel contenant au moins un, de préférence un mélange de facteurs de croissance glycosylés . Une telle composition peut être utilisée pour favoriser la cicatrisation de plaies , la chirurgie esthétique, la cosmétologie, la néovascularisation, pour combattre le vieillissement cellulaire, la calvitie, etc.
Les facteurs de croissance suivant l ' invention peuvent être utilisés pour 1 Ostéoporose , la réparation osseuse , les maladies autoimmunes , l 'arthrite , les ulcères , l 'ophtalmologie , l 'odontologie , la régénéra¬ tion nerveuse et des cellules souches ainsi que pour leurs absorptions sur des prothèses diverses .

Claims

R E V E N D I C A T I O N S
1. Procédé de préparation de dérivés de cellules sanguines dans lequel on isole des monocytes ou leucocytes dans un milieu de culture, caractérisé en ce qu'on traite les monocytes ou leucocytes dans un milieu contenant au moins 1 g/1 d'acide(s) aminé(s), au moins 3 g/i de glucose et au moins 10 mg/1 de vitamines placés dans une poche perméable aux échanges gazeux.
2. Procédé suivant la revendication 1, caracté¬ risé en ce qu'on traite les monocytes ou leucocytes d?ns un milieu contenant au muin*. 2%, de préférence de 2 à 5% de s4rι.m ou Dlasma décomplémenté.
3. Procédé suivant la revendication 2, caracté¬ risé en ce qu'on traite les monocytes ou leucocytes à une température de 30 à 40°C, de préférence d'environ 37° sous une atmosphère constituéed'un milieu oxygène contenan
2 à 10%, de préférence environ 5% de CO .
4. Procédé suivant l'une quelconque des reven¬ dications précédentes, caractérisé en ce qu'on traite de 1.10 6 à 3.106 cellules par ml de milieu.
5. Procédé suivant l'une quelconque des reven¬ dications précédentes, caractérisé en ce qu'on ajoute au milieu de culture au moins un facteur de croissance, ce facteur étant, de préférence, choisi parmi le monocyte macrophage colony stimulating factor (MCSF), le granulocyte macrophage colony stimulating factor (GMCSF) et l'insuline.
6. Procédé suivant l'une quelconque des reven¬ dications précédentes, caractérisé en ce qu'on ajoute au milieu de culture au moins un composé choisi parmi l'acide oxaloacétique, la glutamine, l'acide pyruvique ou des acides aminés .
7. Procédé suivant l'une quelconque des reven¬ dications précédentes, caractérisé en ce qu'on introduit dans le milieu de culture au moins un support poreux sur lequel les monocytes ou macrophages se fixent de manière à produire des médiateurs extracellulaires.
8. Procédé suivant la revendication 7, caracté¬ risé en ce que le support poreux est une bille en verre poreu .
9. Procédé suivant l'une quelconque des reven- dications précédentes, caractérisé en ce qu'on traite les monocytes ou leucocytes dans le milieu pendant au moins 6 jours, de sorte que les monocytes soient différenciés en macrophages.
ιo. Procédé suivant les revendications 7 et 9, caractérisé en ce qu'on traite les monocytes DU leucocytes dans le milieu contenant au moins un support poreux dans une poche perméable aux échanges gazeux pendant une période de t comprise entre 2 et 24 heures et en ce qu'on place ensuite le
Figure imgf000016_0001
lieu ainsi que le ou les supports poreux dans un réacteur à atmosphère contrôlée en CO_ et Oo.
11. Procédé suivant la revendication 9 ou 10, caractérisé en ce qu'on active les macrophages en ajoutant au milieu de culture des interférons γ recom- binants humains et un inhibiteur de cyclooxygénase, en particulier 1*indométhacine.
12. Procédé suivant la revendication 11, caracté¬
5 risé en ce qu'on ajoute au milieu de 100 à 500 unités d'interférons par ml de milieu de manière à obtenir après au moins 6 heures des macrophages antitumoraux.
10 13. Procédé suivant la revendication 11 ou 12, caractérisé en ce qu'on ajoute au milieu un inhibiteur des sites de fixation de type 2 de l'histamine, de préférence la cimétidine.
j5
14. Procédé suivant l'une quelconque des reven¬ dications 1 à 10, caractérisé en ce qu'on ajoute au milieu de culture contenant les macrophages différenciés au moins un composé choisi parmi le murapeptide ou un formylpeptide, un agent oxydant, la
20 polylysine amino 1-3 polyglucose, un immunomodulateur extrait de membranes bactériennes, du phorbol myristate acétate, de la phytohémagglutinine, un anticorps , un antirécepteur, de manière à libérer dans le milieu extracellulaire des facteurs de croissance, des
25 monokines et/ou des inhibiteurs de protéases.
15. Procédé suivant la revendication 14, caracté¬ risé en ce qu'on extrait par filtration moléculaire des facteurs de croissance de poids moléculaire inférieur à
30 20.000.
16. Procédé suivant la revendication 14, caracté¬ risé en ce qu'on extrait par chromatographie d'affinité et filtration des cytokines .
35
17. Procédé suivant la revendication 14, caracté¬ risé en ce qu'on extrait par filtration moléculaire et par précipitation des inhibiteurs de protéases de poids moléculaire supérieur à 50.000.
18. Procédé suivant la revendication 14, caracté¬ risé en ce qu'on extrait du milieu par filtration moléculaire des facteurs de croissance de poids moléculaire inférieur à 20.000 et par chromatographie d'affinité et précipitation des cytokines et des inhibiteurs de protéases de poids moléculaire supérieur à 50.000, en ce qu'on traite les cellules restant dans le milieu par de la phospholipase C et un détergent non ionique de manière à solubiliser dans le milieu des récepteurs membranaires et en ce qu'on extrait ces récepteurs membranaires solubilisés dans ledit milieu.
19. Composition de macrophages différenciés en culture dans un milieu glycérol.
20. Composition suivant la revendication 19, caractérisée en ce que le milieu contient au moins 10 % de glycérol.
21. Facteur de croissance de poids moléculaire inférieur à 20.000, ledit facteur étant glycosylé.
22. Composition pour la cicatrisation, la chirur¬ gie esthétique, la cosmétologie, la néovascularisation ou pour combattre le vieillissement cellulaire sous forme d'hydrogel contenant au moins un facteur de croissance suivant la revendication 21.
23. Composition pour la cicatrisation contenant des macrophages différenciés et du glycérol.
24. Composition pour le traitement du cancer ou pour la lutte antiinfectieuse contenant des macro¬ phages obtenus selon le procédé suivant l'une quelconque des revendications 11 à 14.
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