PT89861B - Processo para a conjugacao de polimeros com factor estimulador de colonias-1 - Google Patents

Description

CETUS CORPORATION

PROCESSO PARA A CONJUGAÇÃO DE POLÍMEROS COM FACTOR ESTIMULADOR DE COLÓNIAS-1

-7.-

na não conjugada. 0 CSF-1 conjugado pode ser usado para es timular uma resposta imune ou para se obter mais células a serem estimuladas.

Este invento está relacionado com uma modificação química do factor 1 de estimulação de colónias (CSF-1) biologicamente activo que altera as propriedades químicas e/ou fisiológicas desta proteína. Mais específicamente, este invento está relacionado com a conjugação selectiva de CSF-1 e polímeros para aumentar a semi-vida de circulação da proteína em maiíferos.

O factor 1 de estimulação de colónias (CSF-1) (também conhecido como M-CSF) é uma das várias proteínas que são capazes de estimular a formação de colónias por células de medula óssea semeadas em meio de cultura semisólido. CSF-1 distingue-se de outros factores estimuladores de colónias pela sua capacidade para estimular predominantemente a formação de colónias de macrófagos. Outros CSF estimulam a produção de colónias que consistem em granulócitos neutrofílicos e macrófagos, exclusivamente granulócitos neutrofílicos ou granulócitos neutrófílicos e eosinofílicos e macrófagos. Uma revisão destes CSFs foi publicada por Dexter, T.M. Nature (1984) 309:746 e por Vadas , M.A. J.. Immunol.

(1983) 130:793. Normalmente não existe um ensaio de rotina in vivo conhecido como sendo específico para a actividade de CSF-1.

CSF-1 foi purificado a partir de fontes nativas (ver e.g., CSejtey et al., Biochem. Biophy. Res. Comm. (1986) 138:238 e Atm publicação PCT N2 W086/04587 publicado em 14 de Agosto, 1986 no gue respeita a cromatografia de afinidade de CSF-1 nativo para permitir determinações parciais de aminoácidos). CSF-1 foi também produzido a partir de DNA recombinante usando dois clones de cDNA aparentemente relacionados:(1) uma forma curta que codifica uma proteína monomérica de 224 aminoácidos precedido de uma sequência sinal de 32 aminoácidos (Kawasaki et al., Science (1985) 230:292-296) e (2) uma forma longa, codificadora de uma proteína monomérica de 522 aminoácidos, também precedida pela sequência sinal de 32 aminoácidos. A forma longa foi clonada e expressa por

dois grupos, conforme divulgado na Publicação de Patente europeia NQ 0272779 publicada em 29 de Junho, 1988 e Ladner et al. EMBO J. (1987) 6^:2693, cada uma delas aqui incluída cnno referência; e em Wong et al Science (1987) 235:1504-1509 , e PCT W087/06954 publicado em 19 de Novembro de 1987. (O DNA e as sequências de aminoácidos para estes dois clones estão apresentados nas Figuras 1 e 2, respectivamente). Ambas as formas longa e curta do CSF-1 estão descritas por Clark e Kamen Science (1987) 236 :1229-1237 . Também foi recentemente divulgada uma forma intermédia gue codifica uma proteína monomérica de 406 aminoácidos precedida por uma sequência sinal de 32 aminoácidos (Cerretti et al (1988) Mol. Immunol. 25:761-770) .

As formas longa e curta do DNA codificador de CSF-1 parecem derivar de uma junção de splicing variável na porção a montante do exão 6 do DNA genómico codificador de CSF-1. Quando CSF-1 é expresso em certas células eucarióticas a partir das formas longa ou curta de cDNA, ela é secretada como glicóproteína dimérica e parece ser váriavelmente processada no extremo C e/ou variávelmente glicosilada. Consequentemente, encontram-se proteínas CSF-1 de vários pesos moleculares quando a forma monomérica reduzida é sujeita a análise Western.

As sequências de aminoácidos das formas longa e curta, conforme previsto a partir da sequência de DNA dos clones isolados e pela sua relação com a sequência genómica, são idênticos nos primeiros 149 aminoácidos do extremo N após clivagem do peptídeo sinal e divergem a partir daí como resultado da inserção np clone maior, de um fragmento adicional de 894 pb (codificando 298 aminoácidos adicionais) antes do codão codificador do aminoácido 150. Assim, as formas curta e comprida do gene codificador regiões com sequências idênticas no extremo C assim como no extremo N. Recuperou-se proteína biologicamente activa quando cDNAs trancados codificado apenas os primeiros 145 ou 147 aminoácidos da forma

curta madura (Publicação de Patente Europeia NQ 0261592 publicado em 30 de Março, 1988; Cerreti et al supra ou os primeiros 190 ou 221 aminoácidos da forma longa madura, são expressos em células eucarióticas.

CSF-1 recombinante foi expresso em E. coli pela modificação de um clone pequeno de cDNA originalmente descrito por Kawasaki et al., Science (1985) 230:291 para codificar proteínas que contenham 1) o extremo N nativo e o extremo C no aminoácido 150 da proteína madura e 2) o extremo N trancado sem os dois primeiros aminoácidos e o extremo C no aminoácido 150 da proteína madura. Estas proteínas foram purificadas e reenroladas para formar homodímeros e encontrou-se terem pesos moleculares aparentes , em cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) de exclusão por tamanho, de aproximadamente 43000 e 40000 daltons, respectivamente. Tanbém foram preparadas proteínas CSF-1 modificadas de modo a que o extremo C da proteína expressa fosse o aminoácido 150 ou 158 e com eliminação até três aminoácidos do extremo N.

As proteínas pequenas (menos de 70 kd) muitas vezes têm uma semi-vida relativamente curta no sangue após injecção intravenosa. O desaparecimento rápido de drogas da circulação reduz muitas vezes a sua eficácia. É muitas vezes desejável aumentar a semi-vida de um polipeptídeo circulante de modo a que possam ser administradas menores quantidades do polipeptídeo ou injecções menos frequentes, mantendo ao mesmo tempo o efeito terapêutico pretendido. Serão desejáveis modificações da proteína CSF-1 que possam alterar a sua semi-vida in vivo, reduzir a sua imunogenicidade ou reduzir ou eliminar a agragação da proteína que possa ocorrer quando é introduzida in vivo. Tais modificações incluem a modificação de proteínas essêncialmente com polímeros de cadeia linear tais como polietilenoglicol (PEG), poliprppilenoglicol (PPG), dextrano ou álcool polivinilico.

Por exemplo, a Patente U.S. NQ

4.261.973 descreve a conjugação de moléculas de alergénio imunogénicas com polímeros solúveis em água não imunogénicos tais como PEG ou álcool polivinilico para reduzir a imunogenicidade do alergénio. Patente U.S. NQ 4.301.144 descreve a conjugação de hemoglobina a PEG, PPG, um copolímero de etilenoglicol com propilenoglicol ou éteres, ésteres ou produtos desidratados de tais polímeros para aumentar a capacidade transportadora de oxigénio da molécula de imunoglobulina. A Patente U.S. NQ 4.609.546 descreve que a conjugação de um polipeptídeo ou glicoproteína como seja um factor estimulador de colónias a um copolímero de polioxietileno-polioxipropileno pode aumentar a duração da sua actividade fisiológica. As únicas proteínas que foram testadas deste modo foram enzimas ou interferão nativo, que são fácilmente solúveis em água. PCT WO 86/04145 publicado em 17 de Julho de 1986 descreve a modificação de anticorpos com pEG para diminuir a ligação aos receptores de Fc. A Patente U.S. 4.179.337 descreve a conjugação de polipeptideos solúveis em água tais como enzimas e insulina a PEG ou PPG para reduzir a imunogenicidade dos polipeptídeos mantendo uma proporção subtâncial das suas actividades fisiológicas pretendidas. EP 154 316, publicada em 11 de Sei tembro, 1985 para a Takeda Chemical Industries, Lda., descreve e reivindica linfoquinas modificadas quimicamente tais como IL-2 contendo PEG ligado directamente a pelo menos um grupo amino primário da linfoquina. Em adição Katre et al. ,

Proc. Natl. Acad. Sei (1987) 84:1487 descreve modificações de IL-2 com PEG.

Muitas outras referências descrevem o conceito de derivatização de proteínas com PEG como sejam o inibidor de alfa-l-proteinase, asparaginase, uricase , superóxido-dismutase, estreptoquinase, activador do plasminogénio, IgG, albumina, lipase de lipoproteínas, peróxidase de rábano silvestre, catalase, arginase e asparaginase, assim como peptídeos. Tal derivatização através de lisinas assim como peptídeos. Tal derivatização através de lisinas foi descrita como aumentando a semi-vida, diminuindo a imunogenicidade, aumentando a solubilidade e em geral aumentando a eficácia (que permitiu uma dosagem menos frequente). Na maior parte dos casos, as proteínas requerem múltiplas modificações por molécula para se conseguir aumentar a actuação in vivo e a actividade in vitro foi substâncialmente diminuída por tal modificação.

A modificação de IL-2, IFN- e imunotoxinas com PEG através dos resíduos cisteina de um polipeptídeo está descrito emPCT WO87/00056 publicado em 15 de Janeiro de 1987.

Além destas patentes e publicações de patentes, vários artigos descrevem o conceito de utilização de PEG ou PPG activados como um agente de modificação para proteínas tais como enzimas, IgG e albumina. Por exemplo, Inada et al., Biochemand Biophys. Res. Comm. 122:845-850 (1984) descreve a modificação de lipase de lipoproteínas solúvel em água para torná-la solúvel em solventes orgânicos tais como benzeno usando cloreto de cianúrico para conjugar com PEG. Takahashi et al. , Biochem. and Biophys. Res. Comm. 121:261-265 (1984) descreve a modificação de peroxidase de rábano silvestre usando triazina de cloreto cianúrico com PEG para tornar a enzima solúvel em água activa e solúvel em benzeno .

As patentes e publicações de patentes que descrevem a utilização de álcool polivinílico (PVA) em reacções de conjugação de proteínas incluem as Patentes U.S. Nos. 4.296.097 e 4.430.260, relacionadas com a conjugação de benzilpenicilina e PVA, Patente U.S. NQ 4.496.689 (EP 147.761) relacionada com a conjugação do inibidor de alfa-1-proteinases com um polímero como seja a heparina, PVA ou PEG, EP 142.125, publicada em 22 de Maio, 1985, descreve a ligação não covalente de hemoglobina a PVA como veiculo, DE 2312615 (Exploaterings AB TBF) relacionada com PVA interligado insolúvel em água acoplado a uma proteína e DE 3.340.592 publicado em 23 de Maio, 1985, relacionada com conjugados de

PVA com hemoglobina A humana.

Os ar.tigos relacionados com conjugados de proteínas e PVA incluem Shbet et al.,Indian J. Chem.

Sec. A (1984) 23A(5) (descrevendo interacção de PVA e proteínas), Wei et al. , Immunol (1984) 51:687-696 (descrevendo trimetilitilo conjugado com PVA), Lee et al., J. Immunol (1981) 126:414-418 e Hulbard et al., J. Immunol (1981) 126:407-413 (ambas descrevendo DNP conjugado com PVA), Lee et al., Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. (1980) 63:1-13 (descrevendo antibenzilpeniciloil IgE conjugadocom PVA), Sehon, Prog. Allergy (1982) 32:161-202 (descrevendo um conjugado de alergénio e hapteno via (PVA), Holford-Strevens et al:, Int. Arch Allergy App. Immunol (1982) 67:109-116 (descrevendo a conjugação de PVA e um antigénio/hapteno) e Sehon e Lee Int. Arch. Allergy App. Immunol (1981) 66 (Supp.l), p. 39-42 (descrevendo um hapteno/alergénio conjugado com PVA).

As publicações PCT Nos. WO86/04607 e WO87/03204 e Ralph et al., Immunobiol (1986) 172:194 descrevem várias potências utilizações de CSF-1, incluindo a utilização como um agente anti-infecção, anti-tumor ou cicatrizante de feridas.

No entanto nenhuma destas referências descreve detalhes de como modificar CSF-1 com um polímero como seja PEG ou álcool poLivinilico de modo a manter a sua actividade biológica e aumentando ao mesmo tempo a sua semi-vida de circulação ou eficácia. Ainda, geralmente não é possível prever o grau de modificação da proteína ou a natureza das condições de reacção desejáveis porque algumas proteínas são muito mais susceptíveis à inactivação através da conjugação do que outras.

Assim, o presente invento proporciona modificações do factor 1 estimulador de colónias para aumentar a sua semi-vida in vivo, enquanto mantêm também a sua actividade biológica útil. O CSF-1 modificado pode ser usado

para estimular células in vivo numa dosagem mais reduzida e7ou menos frequente do que CSF-1 não modificado.

Como vantagens secundárias a modificação pode diminuir a imunogenicidade do CSF-1 (especialmente quando usado em espécies heterólogas, como seja a utilização de CSF-1 humano em gado) e/ou reduzir a agregação da proteína que possa ocorrer.

Mais especificamente, o presente invento é dirigido a uma composição biologicamente activa tendo semi-vida prolongada in vivo em mamíferos, compreendendo uma proteína que estimula essêncialmente a formação de colónias de macrófagos no ensaio in vitro para factor 1-estimulador de colónias, proteína essa que é conjugada covalentemente a um polímero solúvel em água seleccionado do grupo constituido por bromopolímeros de polietilenoglicol ou'polietilenoglicol, polióis polioxietilados e álcool polivinílico, em que o referido homopolímero não é substituido ou é substituido num e: tremo com um grupo alquilo. A proteína CSF-1 pode ser conjugada com o polímero via: (1) grupos amina livres, incluindo resíduos de lisina e o aminoácido N-terminal (de preferência 1 a 3 sítios), (2) grupo(s) açúcar de CSF-1 glicosilado expresso em eucariotas; ou (3) grupos sulfidrilo livres introduzidos em CSF-1.

De preferência o polímero é polietilenoglicol (PEG) não substituido, monometil-PEG (mPEG) ou glicerol polioxietilado (POG) que é acoplado a (1) resíduo(^s) lisina do CSF-1 via uma ligação amida ou uretano formada a partir de um éster activo (de preferência o éster de N-hidroxi-succinimida ou o éster paranitrofenilo) de um ácido carboxílico ou carbónico de PEG, mPEG ou POG; (2) grupo(s) açúcar do CSF-1 via uma ligação amina, hidrazina ou hidrazida; ou (3) resíduo(s) cisteína do CSF-1 via um grupo maleimido ou haloacetilo (onde halo é Br, Cl ou I).

Um outro aspecto deste invento reside num processo para a preparação da proteína conjugada descrita acima, compreendendo:

(a) obtenção de um polímero solúvel em água tendo pelo menos um grupo terminal reactivo onde o polímero é seleccionado do grupo constituído por homopolímeros de polietileno ou polipropilenoglicol e polióis polioxietilado e álcool polivinilico, em que o referido homopolímero não é substituido ou é substituido num extremo com um grupo alquilo;

(b) reacção da proteína com o grupo reactivo do referido polímero de modo a tornar a proteína biologicamente activa e selectivamente conjugada; e (c) purificação da proteína conjugaNum outro aspecto, o invento está relacionado com um método para o tratamento profilático ou terapêutico de doenças infecciosas ou cancro em mamíferos e com métodos eficazes para o tratamento de cancro, tratamento , cicatrização de feridas, redução do colesterol ou citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) em mamíferos compreendendo a administração ao mamífero de uma quantidade eficaz de uma preparação farmacêutica compreendendo a proteína CSF-1 conjuqada dissolvida num veículo aquoso farmacêutieamente aceitável.

A Figura 1 mostra o cDNA e a sequência de aminoácidos deduzida do pCSF-17 (sequências líder de 32 aminoácidos e aminoácidos 1-224).

A Figura 2 mostra o cDNA e a sequência de aminoácidos deduzida do CSF-4 (sequência de aminoácidos líder parcial e aminoácidos 1-522).

A Figura 3A mostra o cromatograma de HPLC de exclusão por tamanho de CSF-1 recombinante não derivatizado (rCSF-1) (SCSF/N.V2 CV150). A Figura 3B mostra o cromatograma de HPLC do mesmo rCSF-1 derivatizado com PEG-NHS de 7000 daltons de peso molecular médio.

A Figura 4 mostra um cromatograma de rCSF-1 (SCSF/C 9150) derivatizado com PEG-NHS de 11000 daltons de peso molecular médio.

A Figura 5 mostra um gráfico da concentrçaão de CSF-1 em plasma de sangue de rato versus tempo para E. eoli rCSF-1 ( SCSF/C Ç? 150 ) , o produto na forma de dímero derivou do rCSF-1 com a sequência na Figura 2 /sem a sequência líder e uma sequência C terminal, mas mantendo essêncialemnte toda a metionina N-terminal presente na construção de E. eoli 7, rCSF-1 expressa em células de mamífero (COS) que deriva de um precursor glicosilado de 522 aminoácidos (LCSF) e £. eoli rCSF-1 (SCSF/C57150) derivatizado com PEG 11000.

A Figura 6 mostra um cromatograma de HPLC de exclusão por tamanho de plasma do sangue de rato 120 minutos após injecção intravenosa de rCSF-1 (SCSF/CV150) derivatizado com PEG-11000. Estão representados o radioimunoensaio (RIA) e a absorvância a 280 mm.

A Figura 7 mostra um gráfico da concentrçaão de CSF-1 em plasmide sangue de rato versus tempo para JE. eoli rCSF-1 (SCSF/NXÍ3C Vl58) e para a mesma proteína derivatizada com PEG 11000.

A Figura 8 mostra a análise por SDS-PAGE de rCSF-1 derivatizado com PEG-11000 (SCSF/CV150). O gel (10%) corado para proteínas com azul Coomassie é da amostra usada na Figura 5 com ou sem redução das ligações dissulfureto.

Definições

Factor-1 estimulador de colónias refere-se a uma composição de proteína na forma de dímero ou de glicoproteína que tem a actividade biológica de CSF-1 no ensaio convencional de estimulação de colónias in vitro de Metcalf J. Cell Physiol (1970) 76:89 em que o polipeptideo estimula a formação essêncialmente de colónias de macrófagos. CSF-1 biologicamente activo significa uma composição de CSF-1 conjugado que possui essêncialmente a mesma actividade especifica em ensaios de formação de colónias de medula óssea de murganho que a forma não conjugada do mesmo CSF-1 ou pelo menos cerca de 10% da sua actividade específica. Um CSF-1 nativo é um CSF-1 não recombinante. CSF-1 de murganho está descrito na Publciação de Patente Europeia NQ 0272779, Rajavashisth et al . Proc. Natl. Acad. Sei USA (1987) 84: 1157 e em DeLamarter er al., Nucleic Acids Res. (1987) 15:2389.

CSF-1 clínicamente puro significa uma preparação de CSF-1 humano biologicamente activo produzido por via recombinante em bactérias que é pelo menos 95% de CSF-1 por RP-HPLC ou por análise de SDS-PAGE com ou sem redução e tem um teor de endotoxina inferior a cerca de 1,0 ng/mg de CSF-1.

Selectivamente conjugado refere-se a proteínas que são covalentemente ligadas via grupos amina livres da proteína (de preferência um ou dois grupos amina livres, para reter máxima actividade biológica), via grupos sulfidrilo livres (se os houver) ou via um grupo açúcar (se o houver) presente na proteína.

Quantidade eficaz e quantidade imunoterapêuticamente eficaz significa uma quantidade eficaz para efectuar a função especificada, como seja promover a redução de tumores ou evitar ou curar doenças infecciosas. A quantidade óptima exacta dependerá de muitos factores, incluin-

do a história clínica do paciente e a doença em questão, o esquema de tratamento, a via e a resposta do paciente.

Tratamento terapêutico indica tratamento após a doença ter sido contraída enquanto que tratamento profiláctico indica tratamento para evitar contrair a doença.

Mamíferos indica quaisquer espécies de mamíferos e inclui coelhos, murganhos, cães, gatos, gado, vacum, ovelhas, primatas e humanos, de preferência humanos .

Muteínas são proteínas obtidas por engenharia genética expressa a partir de uma sequência de ácido nucleico que foi alterada usando técnicas tais como mutagénese específica de sítio. Tais alternativas genéticas são projectadas para resultarem numa ou mais substituições, adições e/ou delecções da sequência de aminoácidos da proteína parental.

Farmacêuticamente aceitável refere-se a um veículo que não interfere com a eficácia da activida e biológica do(s) ingrediente(s) activo(s), é estável e não é tóxico para o hospedeiro a que é administrado.

Homodímero refere-se a úma proteína na forma de dímero essêncialmente idêntica nas suas duas subunidades excepto também incluir dímeros de proteínas com pequenas micro-hetérogeneidades que ocasionalmente surgem na produção ou processamento de proteínas recombinantes.

Heterodímero refere-se a uma proteína na forma de dímero tendo subunidades que diferem na sequência de aminoácidos, no número de aminoácidos ou em ambos. Por outras palavras os heterodímeros têm duas subunidades não idênticas.

Proteínas CSF-1

Conforme estabelecido na secção dos fundamentos, CSF-1 é biologicamente activo na sua forma de dímero. 0 CSF-1 aqui empregue pode ser o dímero nativo eu o dímero produzido por via recombinante. As espécies nativas de CSF-1 na forma de dímero têm sido obtidas a partir de urina humana, monócitos em cultura e sobrenadantes de cultura de algumas linhas celulares. Tem sido possível obter DNA recombinante codificador de mónomeros de CSF-1 constituido numa variedade de sequências de aminoácidos e comprimentos. As Figuras 1 e 2 mostram as sequências de DNA e sequências de aminoácidos previstos a partir das sequências de DNA para as formas de tamanho completo, curta e comprida não processadas, ambas contendo uma sequência sinal de 32 aminoácidos no seu extremo N. As sequências da proteína CSF-1 na forma de monómero são aqui consideradas por conveniência como sendo a forma de 224 aminoácidos sem a sequência líder (aqui designado como SCSF) e a forma longa de 522 aminoácidos sem a sequência líder (designada aqui como LCSF). Outros dímeros de CSF-1 produzidos a partir de sequências de DNA modificadas por mutações pontuais, inserções, delecções e/ou translocações espera-se que beneficiem também da modificação química deste invento se forem biologicamente activas.

CSF-1 recombinante, produzido por qualquer hospedeiro, eucariota ou procariota, pode ser conjugado com polímeros via grupos laterais de aminoácidos seleccionados, de preferência grupos amino livres. Preferêncialmente o DNA codificador de CSF-1 é expresso em bactérias e o CSF-1 resultante é um homodímero após purificação e reenrolamento. Se a conjugação fôr via um grupo açúcar, o hospe-d deiro deve ser eucariota ou a glicosilação tem de ser efectuada in vitro.

Por conveniência, a estmtra primária das subunidades da proteína codificadas pelas várias constru-15-

ções de cDNA descritas são designadas aqui isando uma notação tipo abreviatura como se segue: LCSF significa a sequência de 522 aminoácidos descrita para o clone CSF-4, divulgado na Publicação de Patente Europeia NQ 027779 referida atrás e mostrada na Figura 2, sem a sequência sinal completa. SCSF significa a sequência de 224 aminoácidos divulgada para o clone pCSF-17, mostrado na Figura 1, sem a sequência sinal, descrito no artigo de Kawasaki referido atrás, Science (1985) 230: 292-296, aqui incorporado como referência.

Será notada que um derivado particular d o clone pCSF-17 tem um resíduo de ácido aspártico na posição 59. O LSCF descrito também codifica Asp na posição 59. As muteínas correspondendo às substituições de aminoácidos dentro das sequências descritas nas Figuras 1 e 2 são correspondentemente designadas pela substituição subscrita com a posição.

Formas de muteínas de CSF-1 estão divulgadas na Publicação de Patente Europeia NQ 0272779 publicada em 29 de Junho de 1988, a divulgação da qual é aqui incluida como referência. Quando as construções codificadoras destas proteínas são expressas em bactérias os produtos finais podem também reter a metionina N-terminal em grau variável. Uma vez o grau de remoção de proteína N-terminal não pode ser previsto com confiança, esta possibilidade não está incluida na notação.

As formas truncadas C-terminais e N-terminais destas sequências básicas SCSF e LCSF serão designadas como C ou N V , respectivamente. As delecções C-terminais serão seguidas do número que representa o número de aminoácidos da estrutura nativa que permanecem; para as delecções N-terminais, N \7 será seguido do número de aminoácidos eliminados do extremo N. Assim, por exemplo, LSCF/ /C*Ç7 150 significa uma construção codificadora de uma proteína que contem os 150 primeiros resíduos de aminoácidos da se-16-

quência CSF longa; SCSF/C \T 158 significa uma construção codificadora de uma proteína que contem os primeiros 158 resíduos de aminoácidos da forma curta; SCSF/N V 2 significa uma construção codificadora da forma curta com dois aminoácidos N-terminais eliminados. (Conforme estabelecido atrás, LCSF e SCSF começam a divergir na posição 150 e reconvergem passados 298 aminoácidos no clone LCSF). LCSF/N \7 2C 150 significa uma forma que é a mesma de LCSF/C \715O exceptuando a eliminação dos dois resíduos de ácido glutâmico N-terminais.

Estão normalmente disponíveis os plasmídeos codificadores de uma variedade de formas de CSF-1 que pdoem ser expressos em sistemas bacterianos. Uma forma de plasmídeo codificador da forma longa de CSF-1 podeser expressa em células eucariotas, neste caso a célula eucariota processa o clone secretando uma proteína que é truncada no extremo C e tem a sequência líder removida do extremo N. Como alternativa o clone pode ser trancado para expressar formas específicas com delecções C-terminais em células procarióticas ou eucarióticas. Em adição os dois ou três primeiros codões N-terminais podem ser eliminados de modo a que a proteína resultante expressa em E. Coli é mais homogénea. Especificamente, a metionina N-terminal codifica imediatamente a montante da sequência nativa madura do extremo N nas construções de E. coli (que é retida na proteína como Met N-terminal a menos que removida por processamento pós-traducional) é mais fácilmente removida destas construções com delecção N-terminal. Ainda, encontra-se heterogeneidade significativa detectável usando HPLC de fase reversa RP-HPLC) quando o gene codificador da sequência N-terminal nativa (por exemplo, da forma curta, muteína SCSF/C 5J150) é expressa em E. coli e o produto purificado é caracterizado. Esta heterogeneidade é eliminada quando o correspondente gene CSF-1 sem os dois codões N-terminais (ácido glutâmico) é expresso. Correspondetemente, as formas truncadas N-terminais de outras construções curtas e longas do gene CSF-1 podem também ser empregues.

São preferidas as construções seleccionada do grupo construído por LCSF/C7 150 a CV 464, tir^g LCSF/CV150 a CV464; asp₅gSCSF/C V150 a CS7 166. São mais preferidas as proteínas CSF-1 consistindo essêncialmente numa sequência de aminoácidos seleccionada do grupo constituido por LCSF/C 7150; LCSF/C57190; LCSF/CV221; LCSF/CV223; LCSF/ /CV 236; LCSF/C\/238; LCSF/C V245; LCSF/CV258; LCSF/C V406; LCSF/C V411; LCSF/CV464; asp₅gSCSF/C Vl50; asp₅gSCSF/C 7153 ; e asp_5gSCSF/CV 158.

Construções particulares preferidas que resultam em proteínas CSF-1 para modificação incluem clones codificadores de LCSF/CV190, LCSF/C V 221, asp^gSCSF/ /CV158, asp₅gSCSF/C V150 e suas correspondentes formas N?2 e N 7 3 .

Os materiais de partida preferidos são os produtos dos clones codificadores de asp^gSCSF/CV150; aspç-gSCSF/C V 158 ; LCSF/C \/221 e as suas correspondentes formas N V 3 .

Como alternativa o CSF-1 pode estar na forma de um heterodímero preparado a partir de várias unidades monoméricas de CSF-1, particularmente se a conjugação fôr feita através de um resíduo císteina ra&oactivo do heterodímero CSF-1. O grande número de proteínas CSF-1 formadas por variações na sequência C-terminal devido a diferenças no processamento ou na construção do clone proporciona uma variedade de materiais de partida que podem ser utilizados na formação de heterodímeros. Assim, os novos materiais heterodímeros podem ser formados por reeenrolamento. Por exemplo, a forma monomérica de SCSF/C V150, juntamente com a forma monomérica de LCSF/C 7157, pode ser misturada e tratada de modo como método da Publicação PCT NS WO 88/08003 publicado em 20 de Outubro de 1988 , a divulgação do qual é aqui incluída como referência. O heterodímero pode então ser separado dos produtos secundários homodímericos e oligoméricos por vários mé-18-

todos cromatográficos e outros. O heterodímero (particularmente SCSF/C F7150 e LCSF/C \7157 ) pode ser feito de modo a terminar numa subunidade na posição 157, proporcionando um grupo sulfidrilo potêncialmente livre para reacção com o polímero de conjugação. Misturas semelhantes sujeitas ao método do invento podem conduzir a heterodímeros de componentes tendo substituição de aminoácidos--e . g. , glu^LGSF/C V221 e LCSF/C 190.

Os diferentes monómêros podem ser misturados in vitro ou produzidos na mesma célula. Se prodizidos na mesma célula, uma construção para a expressão de cada monómero é introduzido no mesmo hospedeiro; em tais realizações é preferido que cada construção seja portadora de uma marca diferente (como seja resistência à tetraciclina (Tc ) e resistência à ampicilina (Amp ) de modo a seleccionarem-se os hospedeiros cotransfectados. As células cotransformadas são então cultivadas e induzidas para se obter misturas das duas formas.

Em adição, podem ser introduzidos resíduos císteina individuais no CSF-1 numa localização não natural para criar uma construção de rCSF-l contendo um grupo sulfidrilo livre num resíduo císteina para reacção com PEG, desde que a molécula mantenha a bioactividade. As construções de heterodímeros contendo uma substituição de uma dada císteina em apenas uma das duas subunidades pode também ser útil na geração de sulfidrilos livres. Também podem ser colcoados grupos de açúcar na proteína CSF-1, quer por expressão em sistemas eucarióticos quer por glicosilação in vitrc com enzimas.

As proteínas recombinantes CSF-1 podem conservar ou não o comprimento exacto previsto no clone, devido ao processamento pelo hospedeiro. Portanto, apesar das proteínas do material de partida serem referidas pela mesma designação, deverá compreender-se que estãs designações, na

realidade, referem-se à construção do clone e o comprimento real do material de partida para o processo aqui descrito pode ser mais curto ou mais comprido (se tiver Met N-terminal) do que especificado pelo número do aminoácido C-terminal.

Conforme mencionado acima, o CSF-1, pode ser produzido em células eucarióticas, e.g. células de mamífero, insecto ou levedura. A produção em células de mamífero está descrita na Publicação de Patente PCT N° WO 86/ /04607. O CSF-1 pode ser produzido a partir de células de insecto usando um vector baculovírus como descrito por Luckow et al. , Biotechnol. (1988) .6:47, a divulgação do qual é aqui incluído por referência. Outras descrições deste tipo de produção de CSF-1 estão contidas em Weaver et al., Bio/technology (1988) 6j287. CSF-1 produzido em células de insecto (SCSF/ /C F7 150) é um dímero glicosilado que se encontrou possuir uma semi-vida in vivo muito curta. Os dois sinais de glicosilação ligada a N na sequência de aminoácidos do CSSF (Asn 122 a Asnl40) podem ser modificados no DNA usando mutagénese dirigido para gerar uma proteína CSF-1 produzida por células de insectos, bioactivos e não glicosilada, (Glul22, Glnl40). Esta proteína pode então reagir através dos seus resíduos lisina ou cisteina com um polímero como é feito com rCSF-1, expresso em procariotas para aumentar a sua semi-vida in vivo.

O polímero pode ser ligado covalentemente ao CSF-1 glicosilado no açúcar, por exemplo por reacção de PEG-amina, PEG-hidrazina ou PEG-hidrazida com a proteína CSF-1 que foi oxidada com periodato para converter dos dióis dos açúcares em aldeidos. A PEG-amina pode ser preparada pela conversão de PEG-OH em PEG-tosilato e em seguida em PEG-ftalimida e a ftalimida é clivada com hidrazina par a produzir PEG-Nl·^ numa síntese de Gabriel. PEG-hidrazina e PEG-hidrazida podem ser preparados por métodos conhecidos dos familiarizados com a matéria. O derivado do PEG acoplar-se-à nos locais de açúcar onde os dióis foram convertidos em aldeídos .

Se o CSF-1 fôr produzido intracelularmente em hospedeiros bacterianos deve ser reenrolado para formar dímeros activos com rendimento elevado, como descrito na Publicação PCT N° WO 88/08003 supra. Resumidamente, neste processo o monómero solubilizado, secretado ou produzido como proteína madura ou de fusão, é mantido num ambiente caotrópico em condições redutoras. Tal manutenção envolve o uso de um agente redutor adequado como seja -mercaptoetanol ou ditiotreitol (DTT). A proteína solubilizada é tipicamente mantida por exemplo em ureia 8M ou hidrocloreto de guanidinio 7M num pH de cerca de 7-8,6, na presença de composto tiol, aproximadamente 2-100 mM. Começando com esta forma solubilizada, o monómero pode ser reenrolado directamente ou putificado a partir das proteínas restantes por um processo de purificação adequado como seja cromatografia num gel adsorvente, cromatografado usando uma coluna de permuta iónica ou cromatografia de permeação em gel antes do reenrolamento. A cromatografia de permeação em gel é útil uma vez que permite uma separação fácil por tamanhos do comprimento de monómero pretendido, o qual é geralmente conhecido antecipadamente, de entre impurezas de diferentes pesos moleculares. A cromatografia de DEAE Sepharose em ureia é ainda mais útil uma vez que concentra e purifica e é mais fácilmente aumentada em escala. Prefere-se que a purificação seja efectuada em condições redutoras para evitar a írmação de agregados ligados por pontes dissulfureto.

Assim, independentemente do processo cromatográfico, inclui-se um agente redutor adequado nas soluções usadas para encher as colunas de cromatografia ou aplicar a amostra e nas soluções de eluição. Nalguns casos, o pH baixo pode substituit o agente redutor, uma vez que o pH baixo essêncialmente evitará a formação de ligações dissulfureto e é compatível com alguns sistemas de cromatografia. Em adição, a inclusão de uma concentração baixa de um agente quelator pode ajudar a preservar a forma reduzida da proteína.

O monómero parcialmente purificado é então sujeito a condições de reenrolamento para a formação do dímero. A concentração de proteína durante este passo é de considerável importância. Geralmente, os rendimentos finais por volume de reacção de reenrolamento de CSF-1 são aumentados se a concentração de proteína fôr inferior a cerca de 2 mg/ml de proteína CSF-1; prefere-se uma gama de concentrações de 0,03-1,0 mg/ml. As condições de reenrolamento i podem incluir a remoção gradual do ambiente caotrópico durante um período de tempo adequado, geralmente várias horas, ou diluição da amostra para a concentração de proteína pretendida e agente caotrópico. Também são possíveis métodos que proporcionem uma concentração de proteína constante, como seja diálise ou diafiltração em fibras ocas enquanto o agente caotrópico é lentamente removido. No fim do processo, quando o agente caotrópico foi removido, atinge-se um nível relativamente não desnaturante. Por exemplo, se se usar hidrocloreto de guanidina como agente caotrópico, atinge-se uma concentração final inferior a cerca de 2M e de preferência 0,1-lM e se se usar ureia como agente caotrópico atinge-se uma concentração final inferior a cerca de IM e de preferência 0,l-0,5M.

reenrolamento é efectuado de modo a permitir oxidação dos grupos sulfidrilo para dissulfitos que estabelece a configuração dimérica biologicamente activa que no caso de CSF-1 , requere a formação de pontes dissulfureto, uma ou mais das quais liga as duas cadeias. Também se formam uma ou mais pontes dissulfureto dentre da mesma cadeia. As condições de redox adequadas que encorajam esta formação de dímeros incluem combinações de reagentes sulfidrilo/dissulfito, como seja glutationa oxidada e reduzida. A proporção de glutationa reduzida para oxidada ou outra combinação sulfidrilo/dissulfito é tipicamente de aproximadamente 2 mM/0,1 mM a 0,5 mM/1,0 mM. Outros métodos de oxidação são igualmente aceitáveis. Em qualquer dos casos o pH da solução durante o processo de reenrolamento deverá ser mantido a cerca de 7,5 a 9,0 para favorecer a reacção. E claro que durante o proces-22-

so de reenrolamento as condições altamente redutoras em que a purificação inicial foi conduzida já não são mais empregues. Ã exclusão de concentrações significativas de sais como seja cloreto de sódio, durante o processo de reenrolamento permite o uso de uma cromatografia de permuta iónica como passo de concentração/purificação subsequente.

durante o processo cé reenrolamento podem ser formadas espécies oligoméricas mais altas de CSF-1. Este processo de agregação é minimizado através do controle da temperatura em que temperaturas baixas de cerca de 0-4QC são preferíveis a temperaturas mais latas de 25-37QC.

Os reagentes redox residuais presentes na preparação durante passos de purificação subsequentes. Mais dois processos preferidos para bloquear tais permutas dissulfureto indesejáveis incluem o abaixamento do pH para baixo de 7,0 ou diafiltEação para remover os reagentes redox.

Por exemplo, antes de posterior purificação dos dímeros de CSF-1 reenrolados, a remoção do material radox e concentração das proteínas reenroladas pode·? ser efectuado aplicando directamente o material reenrolado numa coluna de cromatografia de permuta iónica usando, por exemplo, DEAE Sepharose. Frequentemente, tais processos são efectuados a pHs à volta de 8; no entanto, baixando o pH para a gama de 5,5 a 7,0 reduziu a formação de oligómeros e aumentou o rendimento de CSF-1 dimérico.

Após reenrolamento, concentração e purificação o dímero é ainda purificado a partir do material redox residual e das outras proteínas usando processos semelhantes aos estabelecidos atrás para o monómero. Meios adequados incluem, em particular, filtração em gel, cromatografia de interacção hidrofóbica, cromatografia de permuta iónica e HPLC de fase reversa.

Um protocolo particularmente satisfatório para a remoção de impurezas indesejáveis tais como pirogénios ou outras coluna de fenil-TSK ou fenil-Sepharose.

A cromatografia é efectuada em condições e com reagentes essêncialmente livres de endotoxinas. O CSF-1 dimérico pretendido é solúvel e estável em sulfato de amónio aproximadamente 1,5M a pH neutro e é aplicado nestas colunas nestas condições a baixas temperaturas, i.e. entre cerca de 42C e cerca de 10°C e de preferência a cerca de 4SC. A remoção do precipitado que se forma qaando da adição de sulfato de amónio remove alguns agregados e formas instáveis do CSF-1 reenrolado. A proteína CSF-1 pode ser eluida usando um gradiente decrescente de sulfato de amónio (1,5 a 0 M) com etilenoglicol crescente (0 a 50%) em tampão neutro. O dímero CSF-lelui a aproximadamente 0,6M de sulfato de amónio 35% de etilenoglicol de uma coluna fenil-TSK. Pode-se usar propilenoglicol em vez de etilenoglicol, neste caso as condições de eluição serão algo diferentes. Também podem ser usados suportes alternatixos e de facto, fenil-Sepharose é o preferido para a produção em larga escala da proteína de CSF-1 purificada e na forma de dímero.

Conjugação

A proteína CSF-1 descrita atrás é conjugada com o polímero via (1) grupo(s) amina livre(s), de preferência apenas um ou dois para minimizar a perda de actividade biológica, (2) pelo menos um grupo açúcar na proteína ou (3) grupo(s) sulfidrilo livre(s) que é/são introduzidos no clone e são mantidos livres após reenrolamento.

número de moléculas de polímero que foram conjugadas com a proteína pódem ser determinadas por vários métodos, incluindo por exemplo degradação ou digestão ácida, seguido de análise de aminoácidos se as ligações foram maleimido ou bromoacetilo a ligações císteina e o grau de derivatização é alto (mais de 4 moles/mole). Como alternativa, a proteína conjugada pode ser digerida em pequenos fragmentos com uma enzima (e.g. tripsina) e separados por cromatografia em coluna. Serão comparados os mapas de peptídeos da proteína antes e depois da modificação e os fragmentos com tempos de eluição alterados serão sequênciados para determinar a(s) localização(ões) das ligações dos polímeros. Numa terceira alternativa o polímero pode ser marcado radioactivamente antes de ser acoplado para determinar quantos moles de polímero radioactivos são ligadas por mole de proteína CSF-1. Nos casos em que os polímeros de peso molecular relativamente uniforme são conjugados com CSF-1 de peso molecular uniforme, a medição do peso molecular do conjugado pode servir como estimativa do número de polímeros por molécula de CSF-1.

Os resíduo(s) a ser(em) conjugadoís) pode(m) ser: (1) quaisquer grupes amino livres (grupos amina nos resíduos de lisina ou um grupo amina livre, se houver, no extremo N), (2) grupos salfidrilo livres em resíduos de císteina que são introduzidos ou construídos em CSF-1 ou (3) grupo açúcar (discutido algures). Encontrou-se que se a proteína fôr moderadamente derivatizada nos grupos amina livres com PEG (i.e. contem cerca de um a três resíduos de aminoácidos modificados) ela mantém de 25 a 100% da bioactividade

da CSF-1 não derivatizada. Se, no entanto, fôr altamente derivatizada com PEG, a proteína conjugada tem significativamente menos bioactividade mensurável, dependendo do tipo de CSF— 1, comprimento do polímero PEG e do ligando e condições de reacção empregues.

polímero a que a proteína é ligada é um homopolímero de polietilenoglicol (PEG) ou de polipropilenoglicol (PPG), um poliol polioxietilado ou álcool polivinilico, desde que em todos os casos o polímero seja solúvel em água à temperatura ambiente. Exemplos de polióis polioxietilados incluem glicerolpolioxietilado, sorbitol polioxietilado, glucose polioxietilado e similares.

esqueleto de glicerol polioxietilado é o mesmo esqueleto natural que ocorre por exemplo em animais e humanos nos mono, di e triglicéridos. Portanto este composto não deverá necessáriamente ser visto como estranho pelo corpo.

polímero tem de preferência um peso molecular médio entre cerca de 1000 e 100 000 daltons, de preferência entre 4000 e 40 000 daltons, dependendo por exemplo do peso molecular do CSP-1 particular empregue. Uma vez que o objectivo da modificação é obter proteína conjugada que retenha a actividade biológica com uma maior semi-vida in vivo relativamente à proteína não conjugada e com imunogenicidade reduzida, o peso molecular do polímero será escolhido para optimizar estas condições, e.g. uma proteína CSF-1 na forma de dímero modificada com cerca de 80 kd de peso molecular aparente .

Uma vantagem adicional ganhada na derivatização de CSF-1 dimérico nativo (i.e. proteína não recombinante) é que o uso de um escasso CSF-1 que é dificil de purificar será maximizado por tal modificação.

De preferência o homopolímero de PEG s substituido num extremo com um grupo alquilo mas pode também não ser substituido. De preferência o grupo alquilo é um grupo alquilo C^-C^ e ainda mais preferível um grupo metilo. Ainda mais preferido o polímero é um homopolímero de PEG monometil-substituído e tem um peso molecular de cerca de 4000 a 40 000 daltons.

A reacção de modificação covalente pode ter ligar através de qualquer um dos métodos descritos atrás, de preferência a aproximadamente pH 5-9, mais preferivelmente 7-9 se o grupo reactivo na proteína fôr um grupo amina livre. Usando esta última abordagem, a proteína é conjugada via pelo menos um grupo reactivo terminal adicionado ao polímero. 0 polímero com o(s) grupo(s) reactivo(s) é aqui designado por polímero activado. O(s) grupo(s) reactivo(s) reage(m) selectivamente com uma arhina livre ou outro grupo reactivo da proteína. (Se existir mais do que um grupo reactivo as condições de conjugação devem ser cuidadosamente controladas para evitar a ligação cruzada; no entanto, são preferidas as espécies monovalentes) . A quantidade de polimero activado intacto empregue é geralmente cerca de 1 a 30 vezes de excesso molar do polímero activo em relação à proteína. A proporção molar exacta depende de uma série de variáveis incluindo o tipo de polímero usado, o pH, a concentração de proteína e a molécula de CSF-1 usada. Para os polímeros activados além do éster activo de PEG-cloroformato, o excesso molar do polímero activado em relação à proteína é de preferência não mais do que 11 moles por mole do dímero de CSF-1 para derivatização de grupos amina e de preferência é cerca de 1 a 8 moles por mole de CSF-1. 0 excesso molar do éster activo de PEG-cloroformato (PEG-PNP) relativamente à proteína é de preferência não mais do que aprcxlmadamente 5 moles por mole de dímero CSF-1 para a derivatização de grupos amino e de preferência é cerca de 1 a 2 moles por mole de CSF -1.

Em geral o processo envolve a prepa-27-

ração de um polímero activado e depois a reacção da proteína com o polímero activado. Tipicamente a reacção é efectuada num tampão a pH de cerca de 7-9, frequentemente em Hepes lOmM pH 7,5, 100 mM NaCl se fôr usado um reagente PEG-NHS sem ésteres internos ou em Naborato 50 mM pH 9 se se usar o reagente PEG-PNP, ambos descritos abaixo. A reacção é efectuada geralmente entre 0 e 25°C durante cerca de 20 minutos até aproximadamente 12 horas, de preferência 25-35 minutos a 20QC ou très horas a 4QC. Após conjugação o produto pretendido é recuperado e purificado por cromatografia em coluna ou de modo similar.

A reacção de modificação com PEG activo pode ser efectuada de muitas maneiras, descritas abaixo, usando um ou mais passos. Exemplos de agentes de modificação adequados que poderm ser usados para produzir o PEG activado numa reacção de um único passo incluem cloreto de ácido cianúrico (2,4,6-tricloro-S-triazina ) e fluoreto de ácido cianúrico.

Numa realização preferida a reacção de modificação dá-se em dois passos em que PEG-OH reage primeiro com um anidrido ácido como seja anidrido succínico ou glutárico para formar um ácido carboxílico e o ácido carboxálico reage então com um composto capaz de reagir com o ácido carboxílico para formar um PEG activado oom um grupo éster reactivo que é capaz de reagir com a proteína. Exemplos de tais compostos incluem N-hidroxissuccinimida, sulfo-N-hidroxissuccinimida, ácido 4-hidroxi-3-nitrobenzenossulfónico e similares. De preferência, usa-se N-hidroxissuccinimida.

Por eexemplo, PEG monometil-substituido pode reagir a temperaturas elevadas, de preferência a cerca de 100-110SC durante quatro horas com anidrido glutárico. O monometil-PEG-ácido glutárico assim produzido reage então com N-hidroxissuccinimida na presença de um reagente carbodiimida como seja diciclo-hexil ou diisopropilcarbodiimí-28-

da para produzir o polímero activado, metoxipolietilenoglicolil-rN-succinimidil-glut arato que pode então reagir com a proteína após purificação. Este método está descrito detalhadamente em Abuchowski et al., Câncer Biochem. Biophys: _7: 175-186 (1984).

Num outro exemplo, o PEG monometil-substituido pode reagir com anidrido glutárico seguido de reacção com ácido 4-hidroxi-3-nitrobenzenossulfónico (HNSA) na presença de diciclo-hexilcarbodiimida para produzir o polímero activado. HNSA está descrito em Bhatnagar et al., Peptides: Synthesus-Structur-Function, Proceedungs of the Seventh

American Péptide Symposium Rich et al (eds) (Pierre Chemical Co., Rockford IL, 1981), p. 97-100, em Nitecki et al., High-Technology Route to Virus Vaccines (American Society for Microbiology:1980 ) , páginas 43-46 (baseado na conferência de 8-10 de Novembro de 1984), entitulado Novel Agent for Compling Synthetic Peptides to Carriers and its Application e em Aldwin et al., Anal. Biochem. (1987) 164:494-501. Todas estas descrições são aqui incluídas como referência.

Uma vez que as ligações éster são química e fisiologicamente mais reactivas do que as ligações amida, pode ser preferível derivatizar a proteína com moléculas de poiietilenoglicol activado que não vão gerar ésteres no produto final.

Numa execução, o PEG pode ser activado para ligação à proteína usando PEG-amina ou PEG-OH como materiais de partida. 0 PEG-OH pode ser convertido em PEG-amina como descrito por V.N.R. Pillar et al., J. Organic Chem.. 45: 5364-5370 (1980), a divulgação do qual é aqui incluído como referência. Resumidamente, monometil-PEG-amina (mPEG) é preparado através da conversão de mPEG-OH em mPEG-tosilato e depois em mPEG-ftalimida e a ftalimida é clivada com hidrazina para produzir mPEG-NH2 numa síntese de Gabril. A mPEG-amina

reage então com anidrido glutáricó à temperatura ambiente durante cerca de 4 horas para produzir mPEG-NHCO()^COOH . Depois da reacção o produto é precipitado, purificado e reage com N-hidroxissuccinimida e diciclo-hexilcarbodiimida para produzir mPEGNHCO(CH₂)₃COOEste composto pode então reagir com o(s) grupo(s) amina livre adequado do polipeptídeo CSF-1.

Numa outra realização as formas de éster activo do ácido carboxílico de polietilenoglicol úteis para tal conjugação estão descritos em Nitecki et al., Peptide Chemistry 1987, Shiba & Sakakubara (Ed.). Protein Research Foundation, Osaka (1988). Resumidamente os ésteres activos têm a fórmula:

R’-(O-CH₂-CH₂)_n-O’(CHR2)-CO-OLG (I) ou R'-(O-CH₂-CH₂)n-l-O-CH₂-CO-OLG GD em que R' é um grupo alquilo inferior de 1-4 átomos de carbono, R é H ou um substituinte orgânico, n é cerca de 5-800,

LG é um grupo migrante seleccionado entre cianometilo, um grupo aromático seleccionado entre um grupo fenilo ou naftilo substituído com 1 a 5 substituintes que tornam o grupo aromático mais frágil e um grupo piridilo contendo facultativamente 1-4 destes substituintes. Estes ésteres podem ser produzidos, para o Composto I, por alquilação do polietilenoglicol com um ácido alfa-haloalcanóico ou um seu éster seguido de esterificação com HO-CH^-CN ou o grupo correspondente a LG ou para o Composto (II) por oxidação do PEG para dar o seu ácido,

seguido da esterificação com HO-CF^-CN ou o grupo correspondente a LG. De preferência prepara-se a Fórmula I e o agente de activação é para-nitrofenol ou ortonitrofenol. De preferência o polímero é conjugado com a proteína via uma ligação amida formada a partir do éster para-nitrofenilico do polímero. Por exemplo, o PEG-OH pode ser convertido em PEG-O- e faz-se reagir com BrCF^CC^CH-j, o éster metilico pode ser hidrolizado e o ácido pode reagir com £-nitrofenol na presença de diciclo-hexil-carbodiimida para produzir

PEG-O-CH₂COO-^NO2.

Este. po (s) polímero, após amina livre(s) purificação, reage por sua vez com grudisponivel(eis) do CSF-1.

Numa outra realização PEG-OH reage com cloroformato (também designado um clorocarbonato) para formar um éster activo de PEG também designado (PEG-PNP). Após formação do éster activo de PEG, este reage com CSF-1 para formar um conjugado de PEG/CSF-1. Ver também Veronese et al., 1985, Biochem. and Biotech. 11:141-152que é aqui incluído com orefer?encia na sua totalidade. Os cloroformatos podem ser adquiridos a companhias tais como a Aldrich. Eles podem também ser feitos como se mostra na equação (1).

Cl-íci + R-OH -> ClX

O-R + HC1

O cloroformato é feito através da reacção de fosgeno também conhecido como cloreto de carbonilo com um álcool (R-OH) que contem substituintes capturadores de electrões no carbono portador do-oH. O álcool é de preferência um álcool acídico, mais preferêncialmente um álcool acídico que contendo anéis arômáticos os qiais podem ter coeficientes de extinção altos. São exemplos de grupos R: N-hidroxi-31-

-succinimida, N-hidroxi-sulfossuccinimida, ésteres cianometilicos, todas as substituições nitro, cloro e ciano em benzeno naftaleno ou sistemas anelares aromáticos maiores os quais podem ou não conter hetero-átomos, tais como piridinas, para-nitrofenol (PNP), orto-nitrofenol (ONP), etc.. Os grupos R mais preferidos são PNP e ONP.

após formação de cloroformato este reage com PEG-OH para formar um éster activo de PEG como se mostra na equação (2).

PEG-OH + Cl-£

ÍL

O-R -> PEG-O-C-O-R + HC1

O cloroformato é reactivo em dois sítios; na ligação entre o cloro eo grupo carbonilo (mais reactivo) e na ligação entteeo carbonilo e o grupo 0-R (menos reactivo). 0 sítio mais reactivo é onde o cloroformato se liga ao PEG. PEG-OH e o cloroformato são de preferência adicionados em conjunto à teeperatura ambiente num solvente adequado, como seja CHCl^ ou

De preferência adiciona-se um catalisador de acilaçã entre 0 e 1 horas mais tarde, de preferência o catalisador é piridina ou dimetilpiridina. De preferência o cloroformato é adicionado até um excesso de 12M, mais preferivelmente até um excesso de 2M. A mistura é deixada misturar de preferência 4 horas, ainda mais preferido 16 horas. Nesta altura pode-se formar um precipitado. Ele é removido por filtração e rejeitado. São aceitáveis dispositivos de filtração tais como fil tros de fibra de vidro Whatman (GH/B). A solução resultante contem o éster activo de PEG assim como PEG que não reagiu e cloroformato em excesso. É precipitado pela adição um éster, de preferência o éter é éter dietílico. 0 precipitado contem o éster activo de PEG e pode ser lavado com solventes adequados tais como éter redissolvido e reprecipitado se necessário

Após formação do éster activo de PEG ele é conjugado com CSF-1 como se mostra na equação (3):

(3)

PEG ,-O-C-OR + NH₂-CSF-l-4 PEG-O-C-NH - CSF-1+ ROH grupo cloformato do éster activo de PEG ainda possui o sítio menos reactivo disponível. Neste sítio forma-se a ligação covalente entre o PEG e CSF-1. No produto final o grupo PEG é ligado a CSF-1 por uma ligação uretano, também designado carbonato, tendo a estrutura /1

-O-C-NH-. Esta ligação é relativamente estável e manterá o conjugado de PEG e CSF-1 com pouca ou nenhuma hidrólise nas condições fisiológicas.

Os homodímeros de CSF-1 recombinante derivados de E. coli não contêm números significativos de grupos sulfidrilo livres reactivos após o reenrolamento ter prosseguido correctamente até estar completo. No entanto, o clone poderá ser modificado genéticamente de modo a incluir um ou mais novos resíduos de císteina que possam manter grupos sulfidrilo após reenrolamento. A muteína de CSF-1 assim produzida deve ainda preservar actividade biológica significativa de modo a ser utilizável.

Como alternativa, os grupos sulfidrilo livres podem ser gerados, através da criação de heterodímeros seleccionados ou por reenrolamento parcial de homodímeros tais como certos grupos SH, como seja na cis_15g , e estarem disposníveis para modificação pro polímeros activados.

Se a proteína fôr conjugada através de um resíduo cisteina, um'modo preferido de conjugação é comosse segue: mPEG-Nl·^ como descrito atrás reage à temperatura

ambiente, de preferência durante 0,5-1,5 horas com o éster N-maleimido-6-aminocapróico do ácido 4-hidroxi-3-nitrobenzencssulfónico (mal-sac-HJSA) que está descrito por Nitecki et al. , High Technology Ronte to Virus Vaccines (Amer. Soc. for Microbiol. , 1985), pág. 43-46, referido atrás. Esta última reacção é de preferência efectuada com um excesso molar de aproximadamente 5 vezes de mal-sac HNSA relativamente a PEG-Nt^. Após remoção do mal-sac HNSA hidrolisado ou que nao reagiu (e.g., por diálise, diafiltração ou cromatografia de exclusão por tamanho), o reagente pode então reagir com a proteína à temperatura ambiente num tampão usando quantidades equimolares de reagente e de proteína. Outros reagentes tais como N-succinimidil-4-(N-maleimidometil)-ciclo-hexano-1-carboxilato (SMCC) ou éster de XCH₂CO-NH(CH₂)₅~HNSA em que X é Br, Cl ou I, podem desempenhar a mesma função do mal-sacHNSA numa variedade de condições de reacção conhecida dos familiarizados com a matéria.

Purificçaão de conjugados

Após a reacção de conjugação estão provavelmente presentes numa mistura de espécies, a identidade das quais dependerá das condições de reacção. Estas espécies que diferem no número de grupos PEG conjugados com CSF-1 podem ser separados por vários métodos incluindo cromatografia, electroforese e fraccionamento com sais. A cromatografia de interacção hidrofóbica (HIC) usando fenil-Sepharose mostrou-se particularmente útil. A separação por tamanhos pode ser conseguida usando SDS-PAGE não redutora ou cromatografia de filtração molecular. Em adição, a remoção do sal de CSF-1 assim como dos conjugados de outras proteínas tais como interleuquina-2 (IL-2) também se mostrou útil. Os sais normalmente usados são sulfato de amónio, (NH^^SO^; sulfato de sódio, Na₂SO^ ; sais de magnésio e fosfatos. As espécies mais altamente conjugadas precipitaram com concentrações salinas mais baixas do que as menos conjugadas e proteína não

-34conjugada. A rsiclagem das espécies parcialmente purificadas através de qualquer uma destas técnicas pode resultar numa espécie substâncialmente homogénea da proteína conjugada relativamente ac número de polímeros por molécula de proteína.

Formulações

A proteína assim modificada e facultativamente purificada até ao grau de conjugação é então formulada num veículo não tóxico, estável farmaceuticamente acei tável, de preferência a pH entre 3 e 8, de preferência 5-8.

A administração é por protocolos e regimes convencionais, de preferência sistémicos, incluindo administração intravenosa, para as aplicações in vitro, assim como para fins de diagnóstico, os modos de administração e formulação não são críticos Serão normalmente usadas formulações aquosas compatíveis com o meio de cultura ou de perfusão. Quando usada in vivo para terapia a composição pode incluir excipientes convencionais fis iológicanente aceitáveis, tais como água para injecção, tam pões e estabilizantes como são conhecidos. Facultativamente pode-se adicionar ao meio um veículo solúvel em água como seja manitol.

O CSF-1 modificado pode ser usado como único ingrediente activo ou em combinação com outras pro teínas ou compostos tendo actividade complementar. Tais outros compostos podem incluir agentes antitumorais tais como adriamicina de linfoquinas tais como IL-1, -2, -3, -4 , interferões (alfa, beta ou gama), GH-CSF; G-CSF e factor de necrose tumoral. O efeito do CSF-1 modificado pode ser aumentado pela presença de tais compostos adicionais. Um sumário de técnicas de formulação para composições farmacêuticas, incluin do proteína, encontra-se por exemplo em Remington's Pharmaceu tical Sciences, Mack Publishing co., Easton, PA, última edição .

nível de dosagem da proteína na formulação dependerá dos dados de eficácia in vivo obtidos após testes pré-clinicos e pode variar dependendo da aplicação clínica. O meio em que a proteína é dissolvida terá um pH farmaceuticamente aceitável quando a mistura fôr reconstituída .

Se a formulação fôr liofilizada, a mistura liofilizada pode ser reconstituída por injecção para dentro do frasco de um solvente aquoso parentérico convencional, e.g. água destilada para injecção.

A formulação reconstituída preparada como descrito acima é adequada para administração parentérica a humanos ou outros mamíferos em quantidades terapêuticamente eficazes (i.e., quantidadesque eliminam ou reduzem o estado patológico do paciente sem mortalidade ou mortalidez inaceitável) para lhes fornecer terapia. A terapia com CSF-1 pode ser adequada a uma variedade de indicações tais como potenciação do sistema imune, estimulação da citotoxicidade de macrófagos, aumento da contagem de células brancas do sangue monociticas ou granulociticas, tratamento de doçuras infecciosas como seja infeeções por citomegalovírus e bacterianas (e.g. bactérias Gram-negativas), por administração terapêutica ou profiláctica a mamíferos, tratamento de tumores tais comosarcoma ou melanoma em mamíferos, tratamento de colesterolemia (como descrito para GM-CSF por Nimer et al (1988) JAMA 260: 3297-3300) e/ou cicatrização de feridas em mamíferos. Em adição, CSF-1 pode ser combinado com G-CSF para estimulação do sistema imune, como descrito na Publicação de Patente Europeia NQ 0273778 publicado em 6 de Julho de 1988, a divulgação do qual é aqui incluído como referência.

A dose e regime de dosagem do CSF-1 conjugado dependerá, por exemplo, da farmacocinética da droga, da natureza da doença ou estado, do tipo e comprimento do polímero, das características do CSF-1 particular, e.g. o seu

-36índice terapêutico, o seu espectro de actividade, o paciente e a história médica do paciente. Espera-se que as diferentes proteínas CSF-1 modificadas possuam diferentes propriedades farmacocinéticas e terapêuticas que são vantajosas para diferentes vias de administração. Uma droga de acção prolongada deverá ser administrada apenas de 3-4 dias em 3-4 dias , semanalmente ou quinzenalmente. A velocidade de desaparecimento pode ser variada para dar flexibilidade de adaptação à necessidade particular do paciente através da alteração, e.g.,do tipo de polímero, do tamanho do polímero ligado e da sequência de aminoácidos a que o polímero é ligado.

Nos exemplos que se seguem, os quais ilustram o invento, todas as partes e percentagens são por peso a menos que de outro modo seja estabelecido e todas as temperaturas são em graus Celsius.

EXEMPLO I

Preparação de CSF-1 PEGilado via método de ligação Um

A. Preparação de PEG-NHS activado

Um éster linear de monometil-PEG de peso molecular médio 7000 pode ser obtido fazendo reagir primeiro monometil-PEG 7000, que pode ser adquirido à Union Carbide, com anidrido glutárico entre 100 e 110QC durante quatro horas ou por um método semelhante ao de Abuchowski et al., Câncer Biochem.Biophys. /:175-186 (1984), a divulgação do qual é aqui incluída como referência. 0 PEG-glutarato resultante reagiu com N-hidroxissuccinimida na presença de diciclo-hexilcarbodiimida, como descrito detalhadamente por Abuchowski et al., supra na página 176. O produto resultante é glutarato de metoxipolietilenoglicolil-N-succinimidilo, daqui em diante designado PEG*_7000. A reacção de PEG-4800 (adquirido à Union

Carbide) pelo mesmo método resultou em PEG*-4800.

As espécies de PEG-11000 glutaramida NHS (PEG -11000) foram preparadas como se segue, de acordo com o processo de Rajasekharom Pillai et al., J. Org. Chem. 45: 5364-5370 (19080): Um monometil PEG linear de peso molecular médio 11000 daltons adquirido à Union Carbide (1,5 mmole) foi primeiro dissolvido em 10 ml de cloreto de metileno e depois adicionou-se 1,8 ml (22,2 mmoles) de piridina e 6,0 g (31,6 mmoles) de cloreto de p-tolueno-sulfonilo. O frasco foi gaseado com azoto e a mistura de reacção agitada à temperatura ambiente durante a noite. A mistura foi concentrada até cerca de 5 ml é o produto precipitado com 75 ml de éter etílico. O precipitado foi colhido e lavado com éter. O produto (mPEG_ -tosilato) foi recristalizado a partir de etanol.

O mPEG-tosilato (cerca de 1,5 mmoles) foi dissolvido em 20 ml de dimetilformamida e adicionou-se 2,5 g (17,0 mmoles) de potássio-ftalimida. A solução foi aque cida a refluxo em atmosfera de azoto durante quantro horas. O precipitado que se formou foi removido por filteação e o filtrado foi adicionado gota a gota a 300 ml de éter para precipitar o produto. O precipitado foi filtrado e lavado com éter O produto foi suspenso em 30 ml de cloreto de metileno e agitado durante 0,5 horas. As impurezas insolúveis foram removidas por filtração e o produto (mPEG-ftalimida) foi precipitado com éter. Em seguida, o mPEG-ftalimida (cerca de 1,1 mmole) foi dissolvido em 15 ml de etanol e adicionadou-se 2,0 ml (41,2 mmole) de hidrato de hidrazina. A mistura foi sujeita a refluxo durante a noite. A mistura de reacção foi arrefecida até à temperatura ambiente e o produto foi precipitado com éter.

O precipitado foi colhido por filtração e ressuspenso em 25 ml de cloreto de metileno. As impurezas insolúveis foram removidas por filtiaçãooe o produto precipitado com éter. Este precipitado, mPEG-11000-amina foi

suspenso em , filtrado e precipitado com éter mais duas vezes. A segunda vez ficou completamente solúvel em cloreto de metileno.

Um total de 0,5 g de mPEG-llOOO-amina foi dissolvido em 10 ml de dioxano a que se adicionou 0,25 g de anidrido glutáricó. A reacção foi efectuada durante quatro horas à temperatura ambiente. Após a reacção, o produto, mPEG-NHCO(CF^)3COOH foi precipitado com cerca de 100 ml de éter. A mistura foi filtrada e o produto foi redissolvido em CH2CI2, filtrado para éter, filtrado e seco. O rendimento do produto foi de 200 me.

mPEG-NHCO(CH2)^COOH reagiu então com N-hidroxissuccinimida na presença de diciclo-hexilcarbodiimida como descrito atrás para a preparação de PEG -7000 .

O produto resultante foi aqui designado como PEG-11000.

B. Purificação e reenrolamento de CSF-1

Uma estirpe de E. coli HW22, transformada com o plasmídeo pJN653 contendo o gene SCSF/NA 3C Δ158 (oplasmídeo sendo depositado na ATCC N° 67.561 em 12 de Novembro de 1987) foi cultivado num fermentador de 10 litros em meio basal contendo (NH.)„SO. 96 mM, KH~PO. 28 mM, Na-,citrato.

2 4 '24 '3 .2H₂O 4 mM, 1,7 ml/1 de TK9 (30 mM ZnSC>₄ , 30 mM MgSO₄ , 1 mM CuSO₄), com adições emcondições de esterilidade de 6,5 g/1 de glucose, 2,2mM MgSC>₄.7H2O, 95 juM FeSO₄.7H2O e 26 mg/1 de tiamina.HCl a 30QC até se atingir uma OD_rn„ de 10. Os casaminoácidos foram então adicionados para 2% p/v. A expressão de CSF-1 foi induzida mudando a temperatura da cultura para 37QC. Após quatro horas a absorvância a 680 nm atingiu 79.

As células foram colhidas por concentração 5 vezes e diafiltradãs contra dez volumes de 5 mM EDTA, pH 8,5 usando filtração microporosa de fluxo tangencial Dorr-39-Oliver. As células foram rebentadas por três passagens a 7500 psi num homogeneizador de células mecânica de alta pressão Manton-Gaulin. Adicionou-se 1-octanol para 0,1% (v/v) e o homogenato foi mantido durante a noite a 4SC.

O homogenato foi ajustado a 25% de sacarose pela adição de uma solução de sacarose a 63% p/v. A fracção de proteína insolúvel (corpos refractários) foi separada dos detritos celulares por centrifugação de fluxo contínuo (Westphalia SB7) a 9000 xg, 1 litro/minuto e 4-62C. O sedimento molhado foi misturado 50:50 (p/v) com água desionizada e guardado a -20°C dividido em pequenas quantidades.

Vinte e cinco gramas da suspensão de corpos refractáveis (aproximadamente 390 mg de proteína) foram solubilizados em 250 ml de ureia 8M contendo 25 mM Tris, mM tampão fosfato de sódio (pH 8,4), 1 mM ácido etilenodiamina a tetracético (EDTA) e 4 mM ditiotreitol (DTT). Após duas horas à temperatura ambiente a solução foi clarificada por centrifugação a 15000 xg durante 15 minutos. 150 ml do CSF-1 solubilizado foi então aplicado numa coluna de 5x8 cm de DEAE-Sepharose (Pharmacia) equilibrada em ureia 6M contendo 25 mM Tris, 10 mM tampão fosfato de sódio (pH 7,0). A coluna foi lavada com 1 volume de leite da solução acima, a qual foi modificada de modo a conter 1 mM DTT e 1 mM EDTA e oCSF-1 foi então eluido com um gradiente salino de 1,4 litro de cloreto de sódio 0-06 M em tampão de lavagem. O pico de CSF-1 eluiu a aproximadamente 0,06M de cloreto de sódio.

Os restantes 90 ml dos corpos refractáveis solubilizados foram então purificados em coluna de DEAE -Sepharose de modo semelhante. Os conjuntos de CSF-1 combinados (165 ml) continham aproximadamente 250 mg de proteína com uma pureza de aproximadamente 50%.

CSF-1 foi então reenrolado através da diluição do conjunto de DEAE em tampão de reenrolamento

contendo 50 mM Tris (pH 8,5), 5 mM EDTA, 2 mM glutationa reduzida, 1 mM glutationa oxidada, pré-arrefecida a 4SC. O CSF-1 foi deixado reenrolar durante 30 horas a 42C. O pH do CSF-1 reenrolado foi então ajustado a 6,8 usando solução de ácido fosfórico a 8,5%. A solução foi então clarificada por centrifugação durante 10 minutos a 15000xg e aplicada numa coluna de 5x4 cm de DEAE-Sepharose pré-equilibrada, em 10 mM fosfato de sódio, 25 mM Tris (pH 6,8). A coluna foi lavada com 300 ml deste tampão e depois eluida com um gradiente de 900 ml de cloreto de sódio 0-0,6M no mesmo sistema tampão. O CSF-1 elui a aproximadamente cloreto de sódio 120 mM. Adicionou-se então sulfato de amónio (stock 4M, pH 7,0) ao conjunto de fracções de DEAE totalizando 95 ml para uma concentração final de 1 M. O CSF-1 foi então filtrado através de um filtro Nalgene de 0,45 microns e aplicado (a 42C) numa coluna TSK Phenyl-5-Pw Bio-Rad de 21,5x150 mm equilibrada em sulfato de amónio 1,5M despirogenado, fosfato de sódio 0,1 M (pH 7,0). A coluna foi lavada com dois volumes de leite deste tampão de aplicação e depois eluida em fosfato de sódio 0,1 M (pH 7,0) usando um gradiente de 45 minutos em que a concentração de sulfato de amónio decresceu de 1,5 M para OM e a concentração de etilenoglicol aumentou de 0-60% (v/v). Todas as operações foram efectuadas a 42C em condições essêncialmente livres de pirogénios. O CSF-1 eluiu a aproximadamente 0,6M sulfato de amónio em 30% de etilenoglicol. O CSF-1 foi então extensivamente dialisado contra tampão 10 mM Hepes (pH 7,5) contendo 150 mM cloreto de sódio e subsequentemente esterilizado por filtração através de um filtro Millex de 0,45 microns.

Obteve-se aproximadamente 50 mg de CSF-1 SCSF/N Δ3C Δ158 purificado. Mais de 90% do produto CSF-1 final migrou como uma espécie isolada analisado por RP-HPLC em acetonitrilo/TFA. A actividade específica foi de cerca de g

1,5-1,7x10 unidades/mg (unidades determinadas como equivalentes de unidades formadoras de colónias usando uma linha celular dependente de CSF-1 e a concentração de proteína determinada usando A„_on e um coeficiente de extinção de 0,6, cal280 nm ' '

culado a partir de determinações da composição em aminoácidos). Esta actividade específica é pelo menos equivalente senão superior à do CSF-1 Mia PaCa nativo purificado. 0 teor em endotoxinas do produto CSF-1 purificado reenrolado, determinado por ensaio LAL foi de 0,5-1 ng/ml de CSF-1.

De modo semelhante, a proteína de E. coli produzida sob controle do promotor P_r a partir do DNA — £j codificador de SCSF/N &2C &150 conforme descrito na Publicação da Patente Europeia NS 0272779 foi reentolado e purificada de modo semelhante. 0 vector usado para transformar E. coli foi preparado por substituição do fragmento sintético adeuado pelo DNA HindiII/BstXI excisado do vector CSF-17 adequado para codificar o CSF/NV2, sem glu-glu terminal.

C. Conjugação de PEG*-7000 com CSF-1

A proteína CSF-1 (SCSF/NV2C 7150) na secção B foi dialisada (1 mg de proteína/ml) num meio de tampão 10 mM Hepes , pH 7,2 contendo 100 mM NaCl. O PEG*-7000 foi dissolvido rápidamente num pequeno volume, de água e imediatamente adicionado à solução de proteína que foi continuamente agitada ao longo da reacção. Empregou-se um excesso molar de 3 vezes a 30 vezes de PEG*-7000 relativamente ao dímero CSF-1. A reacção ficou completa em cerca de 30 minutos a -20QC e em cerca de três horas a 4°C.

As amostras foram analisadas pDE HPLC de exclusão por tamanho. A Figura 3A mostra o cromatograma da amostra de rCSF-1 não derivatizado (SCSF/NV 2CV150) antes da experiência. A figura 3B mostra o cromatograma de 100 jjg da mesma amostra de CSF-1 após derivatização com um excesso molar de 5 vezes de PEG*-7000 durante 30 minutos a 202C. O radioimunoensaio, efectuado de acordo com o método de Stanley, R. e Guilbert, J. Imm. Methods 42:253-284 (1981) confirmou que os três primeiros principais picos de absorvância observados na Figura 3B continham rCSF-1. Ver Tabela I.

As fracções 30, 32, 34, 36, 37, 38, 39, 41 e 42 foram também analisadas quanto à actividade biológica usando o J, Immunol (1983) 131: 2397 e por Prystowsky et al., Am, J. Pathol. (1984) 114: 149, as divulgações daque las referências são aqui incluídas por referência. A Tabela I apresenta os resultados.

TABELA I

Derivatização com PEG *-7000 Clone: SCSF/NV2CV150

Bioactividade

'racção	Medula Óssea	RIAl	Proporção^
30	0 «	215,000	0
32	51,900	288,000	0.18
34	175,100	576,000	0.30
36	210,700	454,000	0.46
37	522,000	886,000	0.59
38	809,300	445,000	1.82
39	660,000	348,000	1.90
41	1,281,000	800,000	1.60
42	1,048,000	>1,000,000	ND
fraeções	foram testadas após	diluição	de cerca

de 1000 RIA U/ml.

Unidades/ml ^Proporção de bioactividade - bioensaio dividido por RIA ND= Não determinado

Os resultados na Tabela I e os abaixo descritos mostram que o rCSF-1 que não reagiu e o pico de peso molecular mais baixo do rCSF-1 derivatizado mantiveram aproximadamente toda a actividade biológica (dentro do erro experimental). As espécies maiores mantiveram muito menos bioactividade residual. A reacção com PEG -7000 aprarentemente não afectou de modo significativo a reactividade do radioimunoensaio (RIA) de CSF-1, uma vez que o rCSF-1 derivatizado não fraccionado menteve aproximadamente toda a imunoreactvidade de RIA por mg de proteína.

D. Conjugação de PEG-11000 com CSF-1

A proteína biologicamente activa foi purificada e reenrolada após expressão de uma construção codificadora de SCSF/CV150 em E. coli sob o controle do promotor P^ num vector construido conforme descrito na Publicação de Patente Europeia NQ 0272779 publicado em 29 de Junho de 1988. A estirpe usada foi uma E. coli lisogénica para F , DG116, transformada com o plasmideo O/E pP^ CSF-17 asp₃g/CV150 (ATCC NQ 67.389). A proteína foi produzida intracelularmente numa forma monomérica insolúvel e purificada e reenrolada como descrito na Publicação PCT NQ WO 88/08003 supra.

Um total de 2 mg deste CSF-1 purificado a 1 mg/ml de proteína foi dialisado contra tampão Hepes a pH 7,2 contendo 100 mM NaCl. O PEG“-11000 foi rapidamente dissolvido num pequeno colume de água e imediatamente adicionado à solução de proteína, que foi continuamente agitada ao longo da reacção. Usou-se um excesso molar de 8 vezes de PEG-11000 relativamente ao dímero CSF-1. A reacção ficou completa em 30 minutos a 20QC. Este CSF-1 reagiu com o PEG-11000 de modo muito semelhante à reacção de SCSF/NV2CV150 com o PEG*-7000. Como mostrou a Tabela II, uma PEGilação suave (1-2 por dímero) teve novamente um efeito máximo sobre a bioactividade enquanto que a fracção altamente modificada teve uma actividade significativamente reduzida.

TABELA II

Comparação da derivatização de rCSF-1 com PEG-11000 e PEG*-7000

Grau de PEGilação^	PEG* 7000 % Bioactivo (Comparado com SCSF/NV 2C150 Não derivatizado)	PEG-11000 % Bioactivo (Comparado com SCSF/C V150 não derivatizado)
Múltiplo	0-20	8-11
1 a 2 por dímero de CSF-1	100	90-100

Calculado a partir do peso molecular nativo aparente conforme medido por SEC-HPLC e SDS-PAGE.

A Figura 4 mostra um cromatograma de HPLC de exclusão por tamanho de 8 mg de rCSF-1(SCSF/C \715O) derivatizado com PEG-11000. A fracção moderadamente derivatizada, reunida como se msotra na figura, verificou-se reter toda a actividade biológica e miéjrar com um peso molecular aparente de 80.000 daltons por exclusão e 45.000 daltons em SDS-PAGE não redutor (Figura 8). Esta fracção foi recuperada com um rendimento global de aproximadamente 20%.

A diferença de tamanhos de PEG-CSF calculado por estas duas técnicas é consistente com as observações feitas por outros. O PEG pode alterar a capacidade de proteÍB para se ligar ao SDS, afectando a mobilidade em SDS-PAGE; e pode também afectar as estimativas por exclusão de tamanho, e.g. por interacção hidrofóbica com a matrix da coluna .

nível de endotoxina desta amostra,

conforme testado pelo ensaio do lisado de amoebócitos Limulus (LAL), verificou-se ser inferior a 1 ng/unidade de absorvância a 280 nm de proteína (unidade ^A289^* ^ensai° 6AL está descrito num folheto do produto (1982) da marca Pyrotell para LAL que se pode adquirir à Associates of Cape Cod, Inc.,Woods Hole, MA; está também descrito por Watron et al (eds.). Endotoxins and Their Detection Wuth the Limulus Amebocyte Lysate Test , Procedings of an International Conference on Endotoxin Standards and Limulus Amebocyte Lysate Use with Parenteral

Grugs. Alan R. Liss , Inc., New York (1982); e por Levin et al (1964) Buli. Jonms Hopkins Hosp., 115: 265).

E. Conjugação de PEG*-4800 com CSF-1

As mesmas condições usadas para PEG-11000 foram usadas para reagir rCSF-1 do clone SCSF/CÇ7 150 com PEG*-4800 . O CSF-1 foi derivatizado com êxito e a fracção por derivatização (num ou em dois sítios) man-t teve essencialmente toda a actividade biológica.

F. Farmacocinética de CSF-1 PEGilado e de CSF-1 não modificado em ratos .

Três ratos macho CD (Charles River Breeding Labs, Wilmington, MA) de peso médio 161 g foram injectados na veia ca dauda com 1 mg/kg da fracção pouco derivatizada de CSF-1 derivatizado com PEG-11000 derivado do clone SCSF/C 150 descrito atrás e mostrado na Figura 8. As amostras de plsma do sangue foram colhidas através de um catetero interior e o título de CSF-1 foi determinado por RIA Colheram-se amostras de urina ao fim de 0,30 e 120 minutos e testaram-se. Resultados adicionais foram também colhidos usan do o rCSF-1 não derivatizado e rCSF-1 expresso em células de mamífero (COS) que surge de um precursor glicosilado de 522 aminoácidos (LCSF). Cfe ratos nas experiências com CSF-1 não modificado tinham um peso médio de 178 g e foram injectados com 125 ug/kg de CSF-1 não modificado. Todas as outras condições foram as mesmas.

A Figura 5 compara a cinética de desaparecimento no sangue da proteína CSF-1 modificada e não mo dificada. 0 desaparecimento sistémico é calculado dividindo a dose pela área sob a curva do plasma sanguíneo. Os dados mostram que o desaparecimento sistémico do rCSF-1 derivatizado n osangue é 0,302 ml/min/kg versus 3,84 ml/min/kg para o rCSF-1 não derivatizado. Isto representa um prolongamento do tempo de residência de 12,7 vezes do derivatizado relativamen te à proteína não derivatizada.

A Figura 6 mostra o HPLC de exclusão por tamanho do plasma sanguíneo de rato 120 minutos após injecção do CSF-1 derivatizado (SCSF/C (7 150). Esta figura mos tra que o sinal de rCSF-1 detectável por RIA no plasma sanguí neo foi de 43-80 kd de tamanho aparente duas horas após a injecção intravenosa. Esta observação sugere que o sinal de RIA que foi medido na experiência de farmacocinética (aos 120 min.) representa PEG-rCSF-1 intacto e rCSF-1. A transferência Western pela técnica de Burnette, 0981), Anal. Biochem

112: 195-203 (desenvolvida com um anti-soro contra CSF-1 recombiannte capaz de detectar fragmentos de CSF-1, seguido de 125

I-proteína A) de um çpL de SDS-PAGE não reduzido da urina e plasma verificou que o antigénio rCSF-1 detectado por trans ferência Western estava aparentemente intacto, na forma de dímero e do mesmo tamanho do material que foi injectado.

EXEMPLO II

Preparação de CSF-1 PEGilado activado via um segundo método de ligação

A. Preparação do PEG-éster

1. Preparou-se o derivado carboximetilado de mPEG-5000:

Preparou-se sódio-naftaleno pela adição de 0,15 g de Na a uma solução de 0,64 g de naftaleno em cerca de 20 ml de tetra-hidrofurano (THF) destilado de fresco a partir de sódio-benzofenona. Monometilpoli(etilenoglicol) de peso molecular médio de 5000 (mPEG 5000) foi seco durante a noite num excicador sob vácuo com ^Ρ2θ2 & solução de

Na-naftaleno foi adicionada gota a gota a uma solução de 2,5 g de mPEG 5000 em »50 ml de THF seco (destilado de fresco). Quan do a côr verde persiste na solução para indicar excesso, cessou a adição da base e adicionou-se gota a gota 1,2 ml de BrCH2COOCHg. O verde desapareceu e a mistura tornou-se leitosa. A mistura foi agitada durante a noite à temperatura ambiente. A mistura leitosa foi vertida para um frasco contendo cerca de 70 ml de éter frio. O precipitado foi colhido por filtração sob vácuo e lavado com éter. 0 sólido seco foi dissolvido em 75 ml de NaOH IM e agitado à temperatura ambiente durante 2,5 horas para hidrólisar o éster de metilo. O pH foi ajustado a cerca de 3 pela adição de HC1 e a solução concentrada num evaporador rotativo. O resíduo foi suspenso em CH2CI2 e agitado durante cerca de uma hora. 0 material insolúvel foi removido por filtração e a solução vertida sobre éter. O sólido foi colhido por filtração sob vácuo, lavado com éter e seco num excicador sob vácuo sobre ^Ρ2θ5· Isto deu o ácido pretendido carboximetil mPEG-5000. O ácido foi titulado para demonstrar que houve conversão completa. A preparação de carboximetil mPEG-5000 foi repetida numa escala maior O precipitado foi colhido e seco dando 8,5 g. A titulação deu cerca de 102% de ácido. A referência desta experiência é Bu-49-

ckmann et al., Makromol. Chem. 182: 1397 (1981).

2. Preparou-se o éster para-nitrofenilico de carboximetil mPEG 5000:

Um total de 1 g de ácido mPEG-5000 (2x10 moles) foi dissolvido em 3 ml de CHCl... A esta solu~ -4 çao adicionou-se 0,28 g de p-nitrofenol (2x10 moles). A solução tornou-se amarelo clara. Em seguida 0,041 g de diciclo-hexilcarbodiimida (DCC) (2x10 moles) foi dissolvido numa pequena quantidade de CHCl^ e adicionado gota a gota à solução de PEG-ácido à temperatura ambiente. Após cerca de 10 minutos de agitação adicionou-se 2 ^al da mistura de CHCl^ a 1,0 ml de tampão fosfato, pH 7,0. A absorvância a 400 nm do anião jo-nitrofenol foi de 0,2443. Adicionou-se NaOH 5N, aumentando a ^A4qq para 0,5847 (% éster é 58,2% conforme calculado pela fórmula abaixo:

% éster ₌ ^A400^aP°^sNaOH-^fl400^{antesNaOHxl00) A}400^aP°^sNaOH

Após cerca de três horas de reacção adicionou-se 1 jal da mistura de CHCl^ a 1,0 ml de 0,01 fosfato, pH 7,0. A Α^θθ foi de 0,2238. Quando se adicionou 50 jil de 5N NaOH, a Α^θθ foi de 1,154, rendimento 80,6% de éster.

Apareceu um precipitado, diciclo-hexilureia, que foi removido através de um filtro de fibra de vidro e lavado com CHCl^. o éster foi precipitado pela adição de cerca de 300 ml de éter etilico anidro. A mistura foi deixada precipitar durante cerca de três horas, e foi depois filtrada através de um filtro de vidro. O precipitado foi então redissolvido em CHC1₃, reprecipitado com cerca de 100 ml de éter etílico e filtrado através de um filtro de vidro médio. Uma pegena quantidade de sólido húmido foi dissolvido em tampão fosfato 0,01M, pH 7,0. A Α₄θθ f_oi ^e 0,0240; quando se adicionou 50 ul de NaOH 5N a Α^θθ aumentou para

3,330 (% éster foi de 99,3).

precipitado principal foi seco num excicador sob vácuo durante a noite. O frasco em que estava contido foi lavado com água e os resíduos foram liofilizados. Um total de 4 mg do precipitado foi então dissolvido em 2 ml de 0,01M fosfato a pH 7,0 (Α^θθ = 0,0276). Quando se adiciona 50 jil de NaOH 5N, a Α^θθ era de 3,50 (fora da escala) Um total de 200 ^il da solução doi diluido para 800 pl de fosfato 0,01M, pH 7,0. A Α^θθ foi de 0,7985. % de éster calculada = 99,3.

Um total de 1,5 mg de resíduos liofilizados foi dissolvido em 1,0 ml de 0,01M fosfato, pH 7,0.

A absorvância foi de 0,0680 . Adicionou-se um total de 50 ^il de NaOH e a Α^θθ foi de 1,106 (% de éster = 93,9). Os resíduos no filtro derivados do precipitado principal foram lavados com água e liofilizados durante um fim de semana. O peso foi de 131 mg de pó branco fófo. Uma pequena quantidade foi dissolvida em fosfato 0,01M, pH 7 e a Α^θθ foi de 0,0859.

Ao adicionar-se 50 pl de 5N NaOH a Α^θθ foi de 0,6794 (87,4% de éster) .

Estrutura do éster:

PEG-O-CH2ChípNP)

B. PEGilação de CSF-1 (asp_5;?SCSF/C V150) éster para-nitrofenilo acabado de descrever foi acoplado à proteína asp^g SCSF/CXJ150 reenrolada descrita no Exemplo I como se segue:

rCSF-1 (20 jjg a 1 mg/ml) foi dialisado contra tampão Hepes 20 mM, pH 7,2, contendo 100 mM NaCl. Um total de 0,8 mg do éster para-nitrofenilico foi dissolvido nu m pequeno volume de água e 259 ^ag desta solução foi imediatamente adicionado à SCSF/CV150. A conjugação foi efectuada a 20SC durante quatro horas e as amostras foram analisadas pro HPLC de exclusão por tamanho. O rCSF-1 pouco derivatizado (correspondendo a cerca de 1 a 2 moléculas de PEG por CSF-1) manteve essencialmente toda a actividade biológica conforme testado em medula óssea de murganho.

Se as reacções foram efectuadas em cuvetes num espectofotómero Hewllett Packard de deuplo feixe, a libertação do anião para-nitrofenol pode ser controlada permitindo que a reacção de acoplamento seja parada de modo reprodutivo após uma determinada quantidade de libertação ter morrido.

EXEMPLO III

Preparação de CSF-1 PEGilado via um terceiro método de lgiação

A. Preparação do éster de PEG activado (PEG-PNP) gramas (2,5 mmoles) de monometil-PEG de peso molecular médio de 10.000 (m-PEG 10000; Union Carbide) contendo apenas baixas concentrações de diol foi dissolvido em 250 ml de CH2CI2 num frasco de 50 ml de fundo redondo com 3 tubuladuras. Adicionou-se 5 gramas (25 mmoles)

de p-nitrofenil-cloroformato (PNP-cloroformato) e 3 gramas (25 mmoles) de dimetilaminoridina (DMAP). A mistura foi agitada durante a noite em atmosfera de azoto à temperatura ambiente. A mistura de reacção foi filtrada para remover DMAP-HC1 e concentrada para 100 ml. A solução concentrada foi adicionada a 1 litro de éter com agitação. Colheu-se o precipitado num filtro de vidro. O precipitado foi então agitado com cerca de 400 ml de cloreto de metileno durante aproximadamente 1 hora e depois filtrado e concentrado até cerca de 100 ml. 0 éster de PEG foi novamente precipitado pela adiçõao da solução a 1 litro de éter. O precipitado foi colhido usando um filtro de vidro e seco num exciacador sob vácuo. O rendimento foi de 17,5 gramas.

Θ presente foi testado relativamente no teor em carbonato de p-nitrofenilo. 10,3 mg (1,,03χ10~θ moles) foi dissolvido em 10 ml de fosfato de sódio 0,lM, pH 8. As impurezas de p-nitrofenilo (PNP) livre ou gue não reagiu foram determinadas por absorvância a 400 nm. A Α^θθ inicial foi de 0,37. A adição de 50 microlitros e 5N NaOH a 1,0 ml de PEG-PNP hidrolizou todo o éster presente e Α^θθ foi de 2,06. Se todo o produto pesado (10,3 mg) tivesse sido PEG-PNP.

(i.e. sem estar presente PNPilivre) teria sido libertado -4

1,03x10 mole /litro tendo um Α^θθ = 1,85 que é referido como o ^A4qq máximo teórico.

Portanto 2,06-0,39 x 100 = 91% do 1,85 material pesado era de facto PEG-PNP. Uma vez que a absorvância inicial (0,37) era muito lta, aparentemente estava presente PNP livre. O produto foi ainda purificado por dissolução em cerca de 75 ml de e reprecipitação pela adição a 1,2 litros de éter. Colheu-se o precipitado, secou-se (15,8 gramas) e testou-se de novo.

Α4οο^άΡθ^δΝάθ^Η ~ ^400^anteS NaOH χ 100

400 máximo teórico

1,78 - 0,157 x 100 = 89%

1,82

B. Preparação de CSF-1(SCSF/N y158)PEGilado

CSF-1 foi produzido essêncialmente como descrito no Exemplo I. CSF-1 foi concentrado para cerca de 10 mg/ml em Na borato 0,05M pH 9,0. Adicionou-se 5 mg de PEG-PNP obtido na forma sólida no Exemplo III PArte A por ml de CSF-1 (proporção molar de aproximadamente 1:1). A reacção continuou durante 2 horas à temperatura ambiente.

Adiciounou-se NaCl à mistura de reacção para uma concentração final de aproximadamente 5M (saturação) e a mistura com concentração salina alta foi aplicada numa coluna de fenil-Sepharose (Pharmacia Fast Flow High Substitution). Aproximadamente 1 ml de fenil-Sepharose é apropriado para a aplicação de 10 mg de proteína. CSF-1 foi eluido da coluna com um gradiente de sulfato de amónio de 1,2-OM em 0,lM Tris, Ph 8,5. As fracções foram analisadas por coloração com azul Coomassie de SDS-PAGE não redutor e determinada a bioactividade no bioensaio NFS60. Os resultados estão apresentados na Tabela III. Os pulsos mostram quantidades relativas dos diferentes conjugados de CSF-1 nas amostras. Os resultados da bioactividade são a média de três ensaios.

TABELA III

Fracção Conjugados de CSF-1 presentes #PEGs/CSF-l 0 1_2 3 Bioactividade (U/mg)

1	+++++	1.4 X IO»
2	+++	++			1.4 X 108
3	++	+++			8.1 X 107
4	+	++4-+			5.7 X 107
5	+	++++			6.1 X 107
6		++++	+		7.3 X 107
7		+++	+	+	8.3 X 107
8		++	++	+	9.3 X 107
9		+	++	++	6.4 X 107

EXEMPLO IV

A. Preparação de CSF-1 (SCSF/N V 3C Ç715 8 ) PEGilado

O crescimento e colheita de _E. coli estirpe HW22 transformada com pJN653 contendo o gene SCSF/N V3C V158 foi como descrito no Exemplo I.

A suspensão de corpos refractários foi então solubilizada, reenrolada e purificada também como descrito no Exemplo I. A actividade específica final foi de cerca de 1,5x10 unidades/mg num bioensaio de CSF-1 efectuado numa linha celular dependente de CSF-1.

Numa concentração de 2,6 mg/ml em tampão 10 mM Hepes, pH 7,5 e 100 mM NaCl, 40 mg de CSF-1 reenrolado foi incubado com agitação a 20°C, PEG-11000 foi dissolvido em 200 ^ul de água destilada e adicionado imediatamente à solução de CSF-1 num excesso molar de 11 vezes de PEG-11000 relativamente ao dímero de CSF-1 (o pEG-11000 estava aproximadamente 55% não hidrolizado e activo). Após 30 minutos de incubação, a reacção foi parada pela adição de 2 moles de -aminocaproato por mole de PEG-11000, a partir de uma solução stock IM. A amostra foi concentrada para 6 ml por centrifugação em Amicon Centricon-30 e purificada por HPLC de exclusão por tamanho em três separações idênticas com aplicação de 2 ml. A coluna usada foi Bio-Sil® TSK-250,600 x21,5 mm (Bio Rad) equilibrada em tampão 0,2M Na2HPO^/NaH2PO^ pH 7,0

Os picos de ^A280 proteína fracamente PEGilado nas três corridas foram reunidos (conjunto 1, SEC) e concentrada para um volume final de 2 ml que foi reinjectado na mesma coluna. As fracções PEGiladas activas foram reunidas e concentradas.

conjunto final (conjunto 2, SEC) representando 15% do material de partida consistiu em 6 mg

-56de CSF-1 que tinha aproximadamente 100% da bioactividade inicial da CSF-1 não modificada e continha uma espécie principal de PEG-CSF-1 não modificada e continha uma espécie principal de PEG-CSF-1 que migrou com um M aparente de aproximadamente 45K em SDS-PAGE. Pequenas quantidades (cerca de 10%) de CSF-1 não modificado e de CSF-1 altamente modificado permaneceu no produto reunido. A caracterização dos conjuntos da cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) está apresentado nas Tabelas IV e V abaixo:

TABELA IV

Amostra Unidades ^A280 ^^en8iniento %) Endotoxina - - - ( LAL como descrito acima) (ng/mg proteina

rCSF-1	40.0	100	0,14
não modificado
Conjunto 1, SEC	12.2	30	ND
Conjunto 2,SEC	6.2	15	0,43

* Não realizado

TABELA V

Amostra

RIA (como descrito atrás) (unidades/ unidade Α₂θθ)

Bioensaio(usan do uma linha ce lular CSF-l-dependente)unidades unidade Α₂θθ)

Bioensaio usando uma linha celular CSF-l-dependente (unidades/mg) rCSF-1 não θ modificado 1 χ 10

Conjunto 2, SEC 2,7 χ 10⁸ χ 10⁸ 1,1χ10⁸

1.5 χ 10⁸

1.6 χ 10⁸

Β. Farmacocinética de CSF-1 (SCSF/N 3C 158)PEGilado

As condições descritas no Exemplo I foram usadas para calcular a velocidade média de eliminação intravenosa em três ratos para CSF-1 e PEG-CSF-1 descrito na Secção A deste exemplo, excepto as doses serem de 6 mg/kg para CSF-1 PEGilado e nãoPEGilado.

A Figura 7 mostra a curva da concentração relativa de CSF-1 do sangue de três ratos versus tempo após injecção intravenosa. Encontrou-se uma velocidade de elimiançaõcde cerca de 0,63 ml/min/kg para CSF-1 PEGilado e 7,50 ml/min/kg para CSF-1 não PEGilado (três horas em oposição a cinco minutos). Isto representa um aumento de cerca de 12 vezes do tempo de resistência média no sangue para a molécula PEGilada.

:EXEMPLO V

Fraccionamento com sulfato de amónio dos conjugados de PEG-CSF-1

A. Pequena escala ml da mistura de reacção contendo OPEG-CSF-1 (CSF-1 não conjugado), 1PEG-CSF-1 (1 mole PEG/ /mole CSF-1), 2PEG-CSF-1 (2 moles PEG/mole CSF-1), 3PEG-CSF-1 (3 moles PEG/mole CSF-1) e 4PEG-CSF-1 (4 moles PEG/mole CSF-1) tinha aproximadamente 1 mg/ml de proteína. Adicionou-se (NH^^SO^ sólido para cerca de 1,3 M. Formou-se um precipitado que foi removido por centrifugação a 10000 rpm durante 10 min. Guardou-se o sedimento e adicionou-se (NH^^SO^ do sobrenadante até este ficar turvo a cerca de 1,4M. O precipitado foi removido por centrifugação. Este processo prosseguiu fazendo cortes adicionais de (NH₄)₂SO₄ a cerca de 1,5, 1,6 e 1,7M. Os precipitados foram ressuspensos em 0,lM Tris

ρΗ 8,6. Α análise por SDS-PAGE dos precipitados mostrou enriquecimento do CSF-1 não conjugado no precipitado de (NH^J^SO^ 1,7M e da espécie 1PEG-CSF-1 nos precipitados de 1,5M e 1,6M. O 2PEG-CSF-1 foi a espécie predominante nos pre cipitados de 1,4M apesar de também estarem presentes 3PEG-CSF-1. A Tabela VI mostra as quantidades relativas de vários conjugados de CSF-1 em sedimento de concentração crescerte de (NH^^SO^ conforme analisado por SDS-PAGE não redutora corada com Goomassie. O fraccionamento repetido com (NH ^SO das fracções contendo mais do que uma espécie de conjugado CSF-1 resultou essencialmente em CSF-1 não conjugado puro e 1PEG-CSF-1. Esta iqpetição também pode ser usada para produzir 2PEG-CSF-1 ou 3PEG-CSF-1 substancialmente puro.

TABELA VI

Fraccionamento com sulfato de amónio dos conjugados PEG CSF 1

Fracção	Coniuqado	CSF-1	Presente	(^PEGs/DÍmero CSF-1)
0	1	2	3 4
5 1.3M	+	+	+	+ +
1.4M	+	+	++	+
1.5M	+	++++
1.6M	+	++++
1.7M	+++++

Β. Larga escala

Aproximadamente 1 g de CSF-1 (SCSF/ /N V3C V158) foi conjugado de acordo com o Exemplo III. Após fraccionamento por (NB^^SO^ como descrito na Parte A, purificou-se aproximadamente 600 mg de CSF-1 tendo o peso molecular do dímero de CSF-1 conjugado com um PEG. Este conjugado tem uma actividade especifica de aproximadamente 6,2x10 Ú/rng. Cerca de 80 mg de uma mistura de conjugados de CSF-1 tendo 1, 2 ou 3 PEG ligados foi também recuperado e tinha uma activida de especifica de cerca de 3,2xlO^U/mg.

EXEMPLO VI

Fraccionamento com sulfato de amónio dos conjugados de PEG-IL-2

A. Conjugados de PEG-IL-2 tendo uma ligaçao amida

Aproximadamente 12 mg de IL-2 que foi produzido e purificado essêncialmente como descrito na Publicação de Patente PCT N9 WO 88/08849 publicado em 17 de Novembro, 1988 e PEGilado essêncialmente como descrito na Patente U.S. N9 4.766.106 foi ressuspenso em 1 ml de l,0M Tris pH 8,0. Adicionou-se (NH^SO^ sólido até a solução ficar tur va. A amostra foi centrifugada a 12000 rpm durante 12 min.

O sedimento foi ressuspenso em 0,lM Tris pH 8,6. O fraccionamento com (NH)₂SO₄ continuou conforme descrito no Exemplo V e a análise por SDS-PAGE dos sedimentos ressuspensos indicou que a IL-2 não conjugada podia ser separada da IL-2 conju gada. Ainda, de modo semelhante aos resultados descritos no Exemplo V para CSF-1, obtiveram-se fracções enriquecidas em IL-2 conjugada com 1PEG. Espera-se que a reciclagem das fracções enriquecidas num conjugado particular resulte num conjugado substâncialmente puro.

B. Conjugados de PEG-IL-2 tendo uma ligação uretano

Obteve-se PEG-IL-2 pelos processos descritos na patente U.S. pendente em comum NS de Série 299.235 entregue em 20 de Janeiro de 1989. O grupo PEG foi ligado à IL-2 via ligação uretano aqui descrita. A precipita ção com (NH^SO^ essêncialmente como descrito no Exemplo VI Parte A e no Exemplo V resultou em fraccionamento dos vários conjugados de PEG-IL-2.

EXEMPLO VII

Eficácia in vivo de CSF-1CESF/N 3C 158)PEGilado: modelo infecção bactariana

Grupos de cinco murganhos foram injectados intraperitonealmente (ip) no dia 1 (um dia antes da injecção com uma dose letal de E^. coli SM18) com o

SCSF/N 57 3C57 15 8 PEGilado preparado como descrito no Exemplo

III ou soro fisiológico (grupo testemunha). Usaram-se dois grupos de dosagem de CSF-1 (10 pg/mutganho e 50 ^ig/murganho) .

No dia 0 todos os murganhos foram injectados im com uma dose 7 letal (5x10 células) de EU coli SM18. O número de murganhos sobrevivente foi seguido durante cinco dias. Os resultados estão apresentados na tabela abaixo.

TABELA VII

Testemunha (soro fisiológico injectado) ug 50 ug

CSF-1 PEGilado 10 ug 50 ug

12245Ú

200000

322222 3 3 3 3 3 3

2 1111 5 4 3 3 3 3

Os resultados mostrava que existe um efeito dose-dependente de rCSF-1 na sobrevivência. A ligeira diferença entre o CSF-1 modificado e não modificado nestaúnica experiência não é estatisticamente significativa. A PEGilação de CSF-1 não reduziu a eficácia detectada por este protocolo nem aumentou a toxicidade relacionada com a droga observável nesta experiência.

EXEMPLO VIII

Teste in vivo de CSF-1 conjugado para a eficácia anti-tumoral

A. Modelo Sarcoma Meth A

CSF-1 PEGilado é injectado intraperitonealmente, subcutâneamente ou intravenosamente (ip, sc, iv) até 50 |ig/dose por murganho (10 murganhos por grupo) implatado subcutêamente com um tumor sarcoma Meth A 7 dias mais cedo. Os protocolos de dosagem dependem da preparação de CSF-1 PEGilado particular usada. Seguiu-se o volume do tumor durante 14 dias^capós o começo do tratamento de CSF-1. Os resultados são avaliados por comparação da alteração média do volume do tumor ao longo do tempo nos murganhos tratados com CSF-1 e testemunha. (ΔTV= Razão entre o volume médio do tumor no dia indicado e o volume médio do tumor no dia 0 dentro de um único grupo de murganho).

B. Modelo Mestastases B16

Um segundo modelo de tumor in vivo usando CSF-1 P gilado para evitar metastases na linha celular de melanoma B16 de murganho também é útil.

,

1-10 X 10 células tumorais, suspensas em 0,2 ml de Ca⁺ e Mg sem HBSS, são inoculadas em murganhos anestesiados na veia lateral da cauda. Entre 14 e 21 dias após a inoculação das células tumorais, os murganhos são usados e autopsiados. Durante a autópsia os pulmões e o sangue são removidos, lavados em água e pesados. Os pulmões são então fixados em solução de Bovin e o número de nódulos tumorais na supafície por par de pulmões é determinado com a ajuda de um microscópio de dissecação.

Usou-se CSF-1 recombinante humano

PEGilado preparado de acordo com o Exemplo III e tendo uma .

potência de 1-25x10 U/mg e níveis de endotoxina farmacológicamente aceitáveis.

O CSF-1 é obtido de fresco antes de cada experiência a partir de stoks congelados e diluido ime diatamente antes da injecção em soro-fisiológico USP. CSF-1 PEGilado é libertado iv., ip ou sc em protocolos que são dependentes da preparação particular de CSF-1 PEGilado ou CSF-1 usado. Os níveis de dosagem usados variam até 5 mg/kg. Como testemunha nagativa usou-se proteína não específica e não terapêutica, albumina do soro humano (HSA) USP ou CSF-1 PEGilado fervida. CSF-1 PEGilado é fervido durante 30 min para inactivar a actividade de CSF-1.

Os resultados de eficácia demonstram que CSF-1 PEGilado produziu uma redução significativa no número médio de metástase pulmonares.

EXEMPLO IX

Tratamento in vivo da infecção por CMV com CSF-1

PEGilado

M rganhos CD-I alogeneicos foram tra tados ip, iv ou sc. com CSF-1 PEGilado em doses até 400 p.q/ /Kg, começando dois dias antes da infecção com uma dose suble tal de citomugalovírus (CMV). Os protocolos de dosagem foram dependentes da preparação de CSF-1 PEGilado particular usado. Os murganhos foram mortos a o tercáro dia após injecção e o grau de replciação virai nos orgáos alvo tais como baço é ava liado por ensaio de placas. Os resultados mostram que os murganhos tratados com CSF-1 PEGilado têm títulos de vírus nos orgãos significativamente inferiores comparado com murganhos testemunha tratados com soro fisiológico, indicando que a injecção por CMV é menos grave em murganhos tratados com

soro fisiológico.

Assim, CSF-1 PEGilado pode ser usado sozinho ou em combinação com um outro linfoquina no tratamento de infecçoes virais em geral, e em particular, pode ser benéfico em infecçoes virais imunossupressoras tais como síndroma da imunodeficiência adquirida (AIDS).

EXEMPLO X

Estimulação in vivo da contagem de células brancas do sangue

Administrou-se CSF-1 recombinante humano PEGilado purificado como descrito no Exemplo III a murganhos CD-l alogeneicos, em quantidade até aproximadamente 2 mg/kg por dose em vários protocolos de dosagem que estão dependentes d preparação de CSF-1 PEGilado usada. As contagens totais de células brancas do sangue, neutrófilos, monócitos e linfócitos foram determinadas. Aumentos em qualquer um destes pa âmetros podem ser úteis em medicina clínica ou veterinária como estímulo da produção de granulócitos ou monócitos e como estimulador da contagem da série branca do sangue .

EXEMPLO XI

CSF-1 PEGilado na cicatrização de feridas

CSF-1 PEGilado foi testado relativamente à cicatrização de feridas usando modelos animais e protocolos como seja o modelo de cicatrização de feridas Goretex de Goodson e Hunt, 1982, J. Surg. Res., 33:394, em que tubos Goretex implantados cheios com macrófacjos invasores, fibroblas

tos e outras células do tecido conjuntivo e deposição de colagénio e fibrina. A cicatrização é testada examinando ao microscópio o conteúdo do tubo. Um segundo modelo é o modelo de cicatrização de feridas do tipo incisão, de Eisenger, et al. , 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:1937, em que as feridas são observadas visualmente e biopsias tipo punção são feitas para controlar a cicatrização, densidade das células e número de camadas de células epidérmicas que surgem dos folículos do cabelo. Também no fim da experiência determina-se a força de rotura da ferida. Um terceiro modelo é um modelo serosal como seja a serosa testicular danificada pelo calor de Fotev, et al., 1987, J. Pathol., 151:209 em que a cicatrização é testada em secções fixadas através do grau de formação mesotelial do sítio danificado. Os ensinamentos de cada um destes modelos são aqui incluidos com a referência.

Geralrnente, CSF-1 PEGilado é aplicado no sítio da ferida embebendo uma compressa cirúrgica não adesiva em quantidades até lOOOOOOU/ml de CSF-1 PEGilado em soro fisiológico em condições estáveis como descrito no modelo de cicatrização de feridas incisional usando factor derivado de células epidérmicas (EDF) para feridas tópicas. Como alternativa, quantidades resultantes de CSF-1 PEGilado são introduzidas em tubos Gorete na altura da implantação como descrito em Goodson e Hunt, ibid ou o CSF-1 PEGilado pode também ser incorporado numa matrix de libertação controlada eaplicado no local da ferida (em tubos Goretex,embebido ou sob compressas, ou por injecção na cavidade serosal) ou CSF-1 PEGilado é administrado sistémicamente (iv, ip ou sc) em doses até 1000 ^g/kg/dia.

A velocidade de cicatrização de cada modelo é medida e a reparação de tecidos avaliada na presença e na ausência de CSF-1 PEGilado.

CSF-1 PEGilado pode também ser usado em combinação com outros factores de crescimento para promo-6Ί-

ver a cicatrização de feridas tais comoEDF, factor de crescimento epidérmico (EGF), factor de crescimento fibroblástico (PGF básico e ácido), factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) ou factores de crescimento transformantes (TGF alfa e beta), IL-1 e outras substâncias tais como somatomedina C e vitamina C.

EXEMPLO XII

Preparação de LCSF PEGilado

A . Conjugação

Preparou-se PEG-11.000 como descrito no Exemplo IA. Preparou-se CSF-1 (LCSF/N V3C V221) de acordo com os processos de fermentação purificação e reenrolamento descritos na Publicação PCT N2 WO 88/08003 publicado em 20 de Outubro, 1988. 5 mg de LCSF foi dialisado contra tampão Hepes 20 mM, pH 7,5 contendo NaCl 50 mM. Adicionou-se PEG-11.000 num excesso molar de 6 vezes relativamente ao dímero de LCSF. O PEG activado seco foi adicionado à solução de 2 mg/ml de LCSF com agitação a 20°C. Amostras da mistura de reacção foram analisadas de 10 em 10 min. por HPLC de exclusão por tamanho (SEC) em GF250 Zorbax (Dupont). A reacção foi parada pela adição de um excesso de 10 vezes de 6--aminocaproato relativamente ao PEG. A Tabela VIII mostra os dados de bioensaio NFS 60 das misturas de reacção de PEG-LCSF.

As amostras contendo 2 mg/ml de M-CSF foram diluidas com PBS contendo 12 mg/ml de BSA e testadas no ensaio NFS60. Os valores representados a média de determinações em duplicado efectuadas em diluições seriadas de cada uma das amostras.

TABELA VII

Bioensaio NFS de PEG-LCSF/NV3221

Amostra Actividade de CSF-1

Material de partida 3.65 x 10⁷ min +PEG 2.51 χ 10⁷ min + PEG 3.30 χ 10⁷ min + PEG 1.68 χ 10⁷

A análise de exclusão por tamanho da reacção de PEGilação mostrou duas espécies principais de PEG-CSF após 30 min de reacção. Os seus tamanhos foram consistentes com uma derivati ação aproximada de 1 e 2 moles de PEG por mole de dímero CSF-1. O perfil SEC após 45 min. indicou que a reacção estava completa ao fim de aproximadamente 30 min.

B. Separação de PEG-LCSF do LCSF não modificado

A amostra foi ajustada a ph 8,3 com IM Tris-HCl, diafiltrada para reduzir a concentração de sal para 30 mM e aplicada numa coluna de HPLC 76x7,5 mm TSK-DEAR-S-PW. A coluna foi equilibrada em 30 mM Tris-HCl, pH 8,5 e foi eluida~com um gradiente de 40 min de 0 a 0,6M NaCl. Todos os tampões foram preparados com água despirogenada e o sistema de HPLC foi pré-lavado com 0,lM NaOH e com etanol a 50% para remover endotoxinas. As fraeções eluidas da coluna foram ana lisadas por SDS-PAGE. As espécies PEGilado eluiram da coluna mais cedo do que CSF-1 não'modificado. Algum PEG-CSF também apareceu no volume de exclusão e este material não se ligou

quando reaplicado na coluna. A fracção não ligada também continha anião NHS libertada.

Outras realizações

A reacçao aqui descrita pode também ser efectuada usando álcool polivinilico ou um poliol polioxietilado. Um POG-CSF-1 activo pode ser preparado como segue .

Glicerol polioxietilado (POG) de peso molecular 5000 pode ser adquirido à Polysciences. A 10 mg dePOG pode ser adicionado 2,28 g de anidrido glutárico (um excesso de 10 vezes relativamente a POG). A mistura pode ser agitada durante duas horas a 110°C e arrefecida. Isto pode ser dissolvido em 20 ml de CHCl^ e vertido lentamente sobre 500 ml de éter com agitação vigorosa. O roduto pode ser colhido e lavado com éter para dar cerca de 90% do produto POG-glutarato. Este produto pode reagir com N-hidroxissuccinimida como descrito no Exemplo IA para dar o éster activo POG-glutarol N-hidroxissuccinimida (POG*). Em seguida uma das proteínas CSF-1 descrita atrás pode reagir com POG*.

O álcool polivinilico substituido com nitrilo pode também ser usado para preparar um álcool polivinilico activado para conjugação com o CSF-1.

Depósitos

As culturas que se seguem descritas mais detalhadamente na Publicação PCT NS WO 86/04607 e na Publicação de Patente Europeia NS 0272779, foram depositadas na Cetus Master Culture Collection (CMCC), 1400 Fifty-Third Street, Emeryville, CA 94608 USA e na American Type Culture Collec tion (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 USA.

Os números de acesso CMCC e ATCC e as datas de depósito na ATCC para as amostras depositadas são:

Designação de Cultura CMCC No.	ATCC No.	ATCC Qata de depósito
Pago pH CSF-1 E coli DG98		40,177	2	de Abril, 1985
pHCSF-1 λ Charon 4A	2312	40,185	21	de Maio 1985
CSF-17 in E. coli MM294	2347	53,149	14	de Junho 1985
pCSF-aspsç	2705	67,139	19	de Junho 1985
pCSF-gln52	2708	67,140	19	de Junho 1986
pCSF-pro52	2709	67,141	19	de Junho 1986
pCSF-Bam	2710	67,142	19	de Junho 1986
pCSF-BamBcl	2712	67,144	19	de Junho 1986
pCSF-Glyl50	2762	67,145	19	de Junho 1986
pcDBCSF4 ,ou pcDBhuCSF-4)	2894	67,250	24	de Outubro 1986
pPhoA-LCSF/CV221 em MM294	3084	67,391	14	de Abril 1987
O/E pPLLCSF/NV3CV221 em DG 116	3095	67,390	14	de Abril 1987

O/E pP_LCSF-17 asp₅₉/CVl50

em DG116	3044	67,389	14 de Abril 1987
pPLCSF-17asp59/CVl50
em DG116	2946	67,383	7 de Abril 1987
pJN653	3204	67,561	12 de Novembro 1!

(SCSF/NV3CV158) em HW22

Os depósitos atrás foram feitos de acordo com um contracto entre a ATCC e o cessionário deste pedido de patente, Cetus Corporation. O contracto com a ATCC proporciona disponibilidade permanente da progénie destes pias mídeos e da linha celular ao público quando da publicação da patente U.S. que descreve e identifica o depósito ou as publicações ou quando da colcoação aberta ao público, de qualquer pedido de patente dos U.S.A. ou estrangeiro, qualquer que seja que venha em primeiro lugar e disponibilidade da progénie destes piasmídeos e da linha celular a alguém determinado pelo U.S. Commissioner of Patents and Trademarks a ser autorizado para tal de acordo com 35 USC§ 122 e as regras do Commissioner de acordo com ele (incluindo 37CFR§ 1.14 com referência particular a 886 OG 638). 0 cessionário do presente pedido concordar que se os piasmídeos e a linha celular depositados morrerem ou forem destruídos quando cultivados em condições adequadas, eles serão rapidamente substituídos, quando da notificação, por uma cultura viável dos mesmos piasmídeos e linha celular.

Resumido, o presente invento pretende proporcionar várias moléculas de CSF-1 recombinante selectivamente derivatizadas com polímeros solúveis em água dediferentes tamanhos usando diferentes agentes de ligação química. A derivatização do CSF-1 aumenta o peso molecular aparente do CSF-1 e aumenta a sua semi-vida in vivo no plasma de ratos. A derivatização pode também aumentar a solubilidade do CSF-1 em meio aquoso a pH fisiológico e pode diminuir a sua imunogenicidade decrescendo ou eliminando a agregação ou protegendo os seus determinados antigénios.

A especificação atrás descrita é considerada suficiente para permitir a prática do invento por alguém conhecedor da matéria. O presente invento não deverá ser limitado pelas culturas depositadas uma vez que os depósitos pretendem ser simples ilustração de um aspecto do invento e quaisquer culturas que sejam funcionalmente equivalentes

estão dentro do âmbito deste invento. 0 depósito de materiais não constitui uma admissão de que a descrição escrita aqui contida seja inadequada para permitir a prática de qualquer aspecto do invento, incluindo o melhor modo de o realizar, nem deve ser pensado como limitante do âmbito das reivindicações às ilustrações específicas que eles representam. De facto pretende-se incluir no âmbito das reivindicações que se seguem várias modificações dos modos atrás descritos para a realização do invento que são óbvios para os que estão dentro do campo da formulação farmacêutica ou campos relacionados.

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES lâ. - Processo para a preparação deuma composição biologicamente activa, caracterizado por se incluir na referida composição uma proteína que estimula a formação de colónias de macrófagos no ensaio in vitro do factor estimulador de colónias-1(CSF-1, proteína essa que está conjugada covalentemente com um polímero solúvel em água seleccionado do grupo constituido por homopolímeros de polietileno ou polipropilenoglicol, poliois polioxietilados e álcool polivinilico em que o referido homopolímero é substituído num extremo com um grupo alquilo ou não é substituído.

   2â . - Processo de acordo com a rei- vindicação 1. caracterizado por a proteína ser um CSF-1 huma- no nativo. 3â . - Processo de acordo com a rei- vindicação 1, caracterizado por a proteína ser um CSF-1 huma- no recombinante . 4â . - Processo de acordo com a rei- vindicação 3, caracterizado por a proteína ser expressa por

   via recombinante em bactérias a ser um homodímero com sequência de aminoácidos prevista seleccionada do grupo constituido por LCSF/CV150 a CV464;tyr_5gLCSF/CV150 a CV464;SCSF/CV150 a CV166; asp^gSCSF/CV150 a CV166; e a muteina gln^ θ as suas muteínas NV2 a NV3, em que LCSF é codificado pela sequência mostrada como sendo os aminoácidos 1-522 da Figura 2