PT1545428E - Processo para diminuir o nível da agregação de uma proteína peguilada - Google Patents
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Description
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DESCRIÇÃO "PROCESSO PARA DIMINUIR O NÍVEL DA AGREGAÇÃO DE UMA PROTEÍNA PEGILADA"
CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção tem por objecto, genericamente, métodos recombinantes para a preparação de um polipeptido peguilado pretendido. Estes métodos permitem obter um produto polipeptidico peguilado que contém níveis reduzidos de agregados e/ou de algumas suas isoformas que são impurezas. Em particular, a presente invenção também diz respeito a um método recombinante para a preparação de um antagonista da hormona do crescimento (v.g., pegvisomant e seu intermediário proteico) que fazem diminuir o nível de agregação e/ou das isoformas que são impurezas. Mais concretamente, as impurezas constituídas por isoformas, cujo nível diminui graças aos métodos da presente invenção, são as impurezas isoformas trissulfureto e des-phe do antagonista da hormona do crescimento (ou seu intermediário). Além disso, o agregado referido é o agregado indesejável de antagonista de hormona do crescimento peguilado.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 pegvisomant (Somavert®; Pharmacia Corp.) é um antagonista do receptor da hormona do crescimento humano. É um análogo da hormona do crescimento humano ("hGH") que foi estruturalmente alterado. A sequência de aminoácidos do 2 componente/intermediário proteico (B-2036) do pegvisomant difere da sequência de aminoácidos da hGH em nove posições. As substituições de aminoácidos especificas são as seguintes: H18D, H21N, G120K, R167N, K168A, D171S, K172R, B174S e I179T. Conforme se sabe perfeitamente bem na especialidade, a primeira letra (isto é, H18D) representa o aminoácido na sequência de hGH na posição numerada (isto é, 18a posição dos aminoácidos, conforme indicado por H18D) que é substituído com o aminoácido designado pela segunda letra (isto é, H18D). Assim sendo, H18D designa uma substituição do aminoácido his pelo aminoácido asp na 18a posição dos aminoácidos da sequência de aminoácidos da hGH de tipo selvagem. A figura IA ilustra, de forma esquemática, a estrutura da sequência de aminoácidos do componente/intermediário proteico (B-2036) do pegvisomant (PEG B-2036 ou B-2036 PEG), estando os asteriscos a indicar os locais potenciais de acoplamento do polímero polietileno-glicol (unidade de "PEG"). Além disso, o registo da sequência de aminoácidos do componente/intermediário proteico (B-2036 - sem o acoplamento da unidade de PEG) do pegvisomant é aqui identificado por SEQ. ID. NO. 1. Para efeitos de comparação, o registo da sequência de aminoácidos da hormona de crescimento humana é aqui identificado por SEQ. ID. NO. 2. São aqui apresentados os dois registos de sequências. Ver também Jorgensen et al., "Quantifying biosynthetic human growth hormone in Escherichia coli with electrophoresis under hydrophobic conditions," J. Chromatography A 817:205-214 (1998) para a sequência da hGH.
Estruturalmente, o pegvisomant é uma proteína (contendo 191 resíduos aminoácidos) à qual são predominantemente ligadas, de forma covalente, 4 a 6 unidades de PEG. O peso 3 molecular do componente/intermediário proteico (B-2036) de pegvisomant é de 21 998 Dalton. 0 peso molecular de cada unidade de PEG do pegvisomant é aproximadamente igual a 5000 Dalton. Assim sendo, os pesos moleculares predominantes do pegvisomant são aproximadamente iguais a 42 000 (4 unidades de PEG/molécula), 47 000 (5 unidades de PEG/molécula) e 52 000 (6 unidades de PEG/molécula) Dalton.
Aludindo ao antagonista, e sem se pretender impor qualquer limitação de natureza teórica, admite-se que a hGH endógena activa os seus receptores quando uma única molécula de hGH se liga a duas das suas moléculas receptoras adjacentes (e idênticas), induzindo a homodimerização do receptor mediada pela hormona. Ver as patentes de invenção norte-americanas n°s 5 849 535 e 6 057 292. A actividade da hGH depende da sua aptidão para se ligar a dois dos seus receptores adjacentes (e idênticos) através de dois locais de ligação independentes (local 1 e local 2) na mesma molécula de hGH. Estes locais de ligação da hGH, designados por local 1 e local 2, são numerados com 1 e 2, de modo a reflectir a ordem da sua ligação a dois receptores de hGH adjacentes (e idênticos) que actuam como mediadores na homodimerização dependente da hGH.
Além disso, sem se pretender impor qualquer limitação de natureza teórica, admite-se que o pegvisomant se liga selectivamente aos receptores da hormona do crescimento humana ("receptores GH") nas superfícies das células, onde bloqueiam a ligação da hormona de crescimento humana endógena, interferindo assim com a transdução do sinal da hormona de crescimento humana. As modificações estruturais feitas na parte proteica (também designada "componente" ou "intermediário") do pegvisomant (relativamente à hGH) 4 permitem que o pegvisomant bloqueie competitivamente a interacção entre uma molécula de hGH e um receptor de hGH. 0 pegvisomant liga-se ao receptor GH, bloqueando assim a ligação a GH, uma vez que o receptor está ocupado. As modificações estruturais impedem a dimerização do receptor e em consequência disso não ocorre a transdução do sinal. Bloqueando assim a interacção intima necessária entre uma molécula de hGH e um receptor de hGH, o pegvisomant bloqueia a homodimerização, mediada pela hGH, dos receptores de hGH, conferindo ao pegvisomant a sua actividade antagonista.
Este antagonista é utilizado para tratar patologias, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, a acromegalia em pacientes que não respondam convenientemente à cirurgia, na terapêutica por radiação e/ou noutras terapêuticas médicas convencionais, ou que por alguma outra razão não consigam tolerar estas terapêuticas. Além disso, as modificações estruturais feitas na parte proteica (B-2036) do pegvisomant fazem com que este manifeste uma afinidade de ligação para o receptor da prolactina que é inferior à da hGH, minimizando assim os efeitos secundários indesejáveis relacionados com a lactação, associados à utilização do pegvisomant. A parte proteica intermediária (B-2036) do pegvisomant é sintetizada por uma estirpe de bactérias Escherichia coli que foram geneticamente modificadas, mediante a adição de um plasmideo que transporta um gene para o antagonista do receptor da hormona do crescimento (B-2036). O B-2036 é depois recuperado a partir das células microbianas e purificado. O B-2036 purificado é depois peguilado para se obter o pegvisomant (PEG B-2036). As patentes de invenção 5 norte-americanas n°s 5 849 535 e 6 057 292 descrevem métodos para a produção de B-2036 e métodos para a conjugação de uma ou mais unidades de PEG com o B-2036, embora sem pormenores sobre a maneira de diminuir, reduzir, eliminar, inverter e/ou impedir a formação de níveis inaceitavelmente elevados das suas impurezas isoformas trissulfureto e des-phe.
Um dos problemas existentes, quando são utilizados métodos de fabrico recombinantes convencionais para se obter B-2036, é a formação das suas impurezas isoformas, tais como as suas isoformas des-phe e trissulfureto. Um outro dos problemas existentes, quando são utilizados métodos convencionais de fabrico e de purificação para se obter B-2036 PEG (isto é, B-2036 peguilado, tal como o pegvisomant) a partir de B-2036, é a formação de um "agregado" indesejável de B-2036 PEG, conforme adiante se explica melhor. A impureza isoforma des-phe é aquela em que à molécula de B-2036 lhe falta fenilalanina no seu terminal amino. Ver a figura IA que mostra o referido resíduo fenilalanina do terminal amino (isto é, indicado pela letra "F") adjacente à extremidade NH2 do B-2036. A impureza isoforma trissulfureto é aquela em que molécula B-2036 contém um átomo de enxofre suplementar que forma uma "ponte trissulfureto" dentro da molécula. Ver o rectângulo na figura 1B. Ver também Andersson et al., "Isolation and characterization of a trisulfide variant of recombinant human growth hormone formed during expression in Escherichia coli," Int. J. Peptide Protein Res. 47:311-321 (1996) e A. Jesperson et al., "Characterisation of a trisulphide derivative of biosynthetic human growth hormone produced in Escherichia coli," Eur. J. Biochem. 219:365-373 6 (1994) . Sem se pretender impor qualquer limitação de natureza teórica, presume-se que estas impurezas isoformas sejam geradas, tipicamente, durante o crescimento celular {v.g., fermentação) e durante a expressão (síntese e secreção) de B-2036 em células hospedeiras geneticamente modificadas, e/ou durante a extracção e purificação da proteína B-2036.
No que diz respeito ao problema do "agregado", a formação de tal "agregado" provoca uma diminuição do rendimento de produção da proteína desejada e um custo maior na sua produção. Além disso, se o nível de "agregado" for demasiadamente elevado, a proteína final pode ter uma pureza tão fraca que seja inadequada para fins terapêuticos.
No que diz respeito a determinadas impurezas, o pedido de patente de invenção internacional WO 94/24157 (publicado a 27 de Outubro de 1994) descreve um derivado hidrofóbico de hGH que possui um átomo de enxofre suplementar, comparativamente com a hGH nativa. Ver o documento WO 94/24157 na página 3, linhas 3-10. O átomo de enxofre suplementar do derivado hidrofóbico de hGH forma uma "ponte trissulfureto" que dá origem a uma variante trissulfureto de hGH. Ver o documento WO 94/24157 na página 7, linhas 11-16. O documento WO 94/24157 também esclarece que esta variante trissulfureto de hGH pode ser convertida outra vez na sua forma hGH nativa, tratando a variante trissulfureto de hGH com um composto mercapto, tal como cisteína, glutationa, 2-mercapto-etanol ou ditiotreitol. Ver o documento WO 94/24157 nas páginas 4 e 5. O pedido de patente de invenção internacional WO 96/02570 (publicado a 1 de Fevereiro de 1996) descreve um 7 outro método para converter a variante trissulfureto de hGH outra vez na sua forma nativa, utilizando quer sulfito de sódio, sulfito de potássio ou sulfito de amónio, quer um sulfito de um metal alcalino-terroso, tal como o sulfito de magnésio ou o sulfito de cálcio. Ver o documento WO 94/24157 na página 4, linhas 17-21. 0 pedido de patente de invenção internacional WO 00/02900 (publicado a 20 de Janeiro de 2000) com o titulo "Method for the production of recombinant peptides with a low amount of trisulfides" explica "um método para a redução da quantidade de trissulfuretos na produção de péptidos recombinantes, v.g., tanto proteínas como péptidos mais pequenos. A invenção baseia-se na nova e inesperada conclusão de que a quantidade de trissulfuretos na produção de péptidos recombinantes poderia ser reduzida mediante a adição de um sal de um metal, de preferência em excesso, quer durante quer após a fermentação, e não por conversão, conforme anteriormente sugerido, dos trissulfuretos formados da hormona de crescimento na sua forma nativa. Ver o documento WO 00/02900 na página 2, linhas 21-27. O documento com a referência WO 00/02900 esclarece ainda que "a proteína pode ser qualquer proteína recombinante, mas é, preferencialmente, a hormona de crescimento recombinante que pode ser de origem humana ou de origem animal, por exemplo, a hormona de crescimento humana (hGH) , a hormona de crescimento dos bovinos (bGH) e a hormona de crescimento dos porcinos (pGH)." Ver o documento WO 00/02900 na página 3, linhas 4-6. O pedido de patente de invenção internacional WO 02/057478 (publicado a 25 de Julho de 2002) com o título "Methods and Composition For Extracting Proteins From
Cells" tem por objecto um método de extracção de uma proteína a partir de uma célula hospedeira, fazendo contactar a célula hospedeira com um agente redutor e um detergente. Esta publicação esclarece que a finalidade do agente redutor é a de "facilitar a recuperação de proteínas nas suas conformações nativas". Ver o documento WO 02/057478 na página 2, linhas 16-18. Além disso, o documento WO 02/057478 descreve que "um ou mais agentes redutores são agentes... que reduzem as pontes dissulfureto e/ou conservam os resíduos sulfidrilo nas suas formas reduzidas. É possível utilizar qualquer desses agentes redutores. De acordo com uma variante preferencial, qualquer desses agentes redutores utilizados é seleccionado entre o conjunto constituído por ditiotreitol (DTT); ditioeritritol (DTB); cisteína (Cys) e Tris-2-carboxietilposfina (TCEP)". Ver o documento WO 02/057478 desde a página 3, linha 24 até à página 4, linha 4.
Como exemplos de outras referências que dizem respeito à purificação ver a patente de invenção norte-americana n° 6 265 542 BI (Fahmer et al. com o título "Purification of Molecules"); patente de invenção norte-americana n° 6 333 399 BI (Blank com o título "Protein Purification"); patente de invenção norte-americana n° 5 747 639 (Seely, com o título "Use of Hydrophobic Interaction Chromatography to Purify Polyethylene Glycols"); pedido de patente de invenção internacional n° PCT/US96/19459 (Ibrahim et al., com o título "Activated Linkers and Methods for Making and Purifying the Same"); e patente de invenção norte-americana n° 2002/002271 Al (Rinderknecht et al., com o título "Antibody Purification"). 9
No entanto, as referências supramencionadas nada dizem a respeito da prevenção, inversão, redução ou eliminação da formação de impurezas isoformas associadas a um antagonista da hormona do crescimento, tal como o pegvisomant ou a sua porção proteica B-2036, e/ou sobre a formação de agregados da proteína peguilada, v.g., o pegvisomant. Assim sendo, há a necessidade de se dispor de métodos aperfeiçoados para a produção de B-2036 que desengordurem, atenuem, evitem, minimizem, invertam e/ou eliminem a formação das suas impurezas isoformas (trissulfuretos e/ou des-phe) e/ou a formação de agregados da proteína peguilada. De igual modo, estas obras também nada dizem sobre a detecção, atenuação, minimização, inversão, redução ou eliminação da formação da impureza isoforma des-phe da hormona do crescimento e/ou da formação de agregados da proteína peguilada, v.g., a hormona de crescimento peguilada ou a hormona de crescimento humana peguilada.
DESCRIÇÃO ABREVIADA DOS DESENHOS A figura IA ilustra a sequência de aminoácidos de B-2036 que corresponde à SEQ. ID. NO. 1. Os asteriscos (*) na figura IA indicam nove (9) locais potenciais para o acoplamento covalente de unidades de PEG a cada molécula de B-2036. Faz-se observar que embora haja nove (9) locais possíveis identificados, nem todos esses 9 locais têm de ser ligados, de forma covalente, às unidades de PEG. De preferência há 4-6 unidades de PEG por cada molécula de B-2036. A figura 1B ilustra a estrutura da impureza isoforma trissulfureto de B-2036 (designada por "Trissulfureto (+32 10 u.m.a.")), comparativamente com a sua forma desejável (designada por "GHA nativa"). A figura 2 é um gráfico de comparação das percentagens de espécies B-2036 PEG-4 encontradas nas fracções 7 a 18 de 'Q-Sephatose FF', conforme determinado por electroforese capilar e HPLC de fase inversa. A figura 3 é um gráfico de comparação das percentagens de espécies B-2036 PEG-5 encontradas nas fracções 7 a 18 de 'Q-Sephatose FF', conforme determinado por electroforese capilar e HPLC de fase inversa. A figura 4 é um gráfico de comparação das percentagens de espécies B-2036 PEG-6 encontradas nas fracções 7 a 18 de 'Q-Sephatose FF', conforme determinado por electroforese capilar e HPLC de fase inversa.
DESCRIÇÃO ABREVIADA DA INVENÇÃO
Perante a necessidade anteriormente referida de se dispor de um processo aperfeiçoado para a produção de um polipeptido peguilado recombinante, antagonista da hormona do crescimento, e/ou um polipeptido peguilado recombinante, antagonista da hormona de crescimento humana, com níveis reduzidos de agregados indesejáveis e/ou da suas impurezas isoformas indesejadas, a presente invenção tem por objecto proporcionar processos aperfeiçoados para a produção de polipeptidos peguilados recombinantes antagonistas da hormona do crescimento (incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, os antagonistas da hormona de crescimento humana), com níveis reduzidos dos seus agregados e das suas impurezas isoformas des-phe e/ou trissulfuretos. 11
No que diz respeito ao antagonista da hormona de crescimento recombinante, (incluindo o antagonista da hormona de crescimento humana), o nível da sua impureza isoforma trissulfureto é reduzido por contacto suficiente entre a impureza isoforma trissulfureto e (1) um composto mercapto, (2) um agente quelante, (3) um sal de um metal, (4) um composto mercapto conjuntamente com um sal de um metal ou (5) um composto mercapto, após contacto com um agente quelante, mas na ausência do agente quelante.
No que diz respeito ao antagonista da hormona de crescimento recombinante (incluindo o antagonista da hormona de crescimento humana), reduz-se a formação da sua impureza isoforma des-phe por adição de (1) um agente quelante ou (2) um sal de um metal.
No que diz respeito a um antagonista da hormona de crescimento recombinante peguilado e/ou um antagonista da hormona de crescimento humana peguilado, mantém-se o nível de agregação num determinado valor desejado ou reduz-se para baixo de um determinado valor desejado, por cromatografia de permuta de aniões durante a separação das suas isoformas peguiladas.
DESCRIÇÃO MINUCIOSA DAS VARIANTES PREFERENCIAIS
Nesta memória descritiva são utilizadas as abreviaturas seguintes: AC cromatografia por afinidade AEX permuta de aniões IFA ingrediente farmacêutico activo BI lote intermediário; B-2036 peguilação) 12 B-2036 PEG B-2036 peguilada PEG B-2036 B-2036 peguilada CE electroforese capilar CEX permuta de catiões cm centímetro VC volume da coluna DEAE dietilaminoetilo HEPES ácido N-(2-hidroxietil)-piperazina-N-(2-etano)-sulfónico HIC cromatografia de interacção hidrofóbica IEX permuta de iões kDa quiloDalton L litros LPM litros por minuto mL ou ml mililitro mM milimolar mS miliSiemen PMC peso molecular critico ym micron N normalidade NaCl cloreto de sódio NaOH hidróxido de sódio NWP permeabilidade aquosa normalizada PEG molécula de polietileno-glicol ou sua variante PEG-1 uma molécula de B-2036 peguilada com 1 molécula de PEG ou sua variante PEG-2 uma molécula de B-2036 peguilada com 2 moléculas de PEG ou sua variante PEG-3 uma molécula de B-2036 peguilada com 3 moléculas de PEG ou sua variante 13
Peg uma molécula de B-2036 peguilada com 4 moléculas de PEG ou sua variante PEG-5 uma molécula de B-2036 peguilada com 5 moléculas de PEG ou sua variante PEG-6 uma molécula de B-2036 peguilada com 6 moléculas de PEG ou sua variante PEG-7 uma molécula de B-2036 peguilada com 7 moléculas de PEG ou sua variante PEG-8 uma molécula de B-2036 peguilada com 8 moléculas de PEG ou sua variante PEG-9 uma molécula de B-2036 peguilada com 9 moléculas de PEG ou sua variante RPHPLC cromatografia em liquido de alto rendimento, de fase inversa DP desvio padrão SDS-PAGE electroforese em gel de poliacrilamida com com dodecil-sulfato de sódio SEHPLC cromatografia em liquido de alto rendimento com exclusão dimensional RTM rendimento transmembranar TRIS tris-(2-hidroximetil)-aminometano UF/DF ultrafiltração/diafiltração UV ultravioleta API água para injecção 0 termo "proteína peguilada" designa uma hormona, hormona de crescimento, hormona de crescimento humana, antagonista da hormona de crescimento, antagonista da hormona de crescimento humana, um anticorpo (ou seus fragmentos) e B-2036 PEG. 0 termo "proteína peguilada" compreende também uma ou várias proteínas relevantes, peguiladas em um ou vários locais. 14
Salvo quando especificado de outro modo, o termo "agregado" refere-se a um amontoado, com o aspecto de esparguete, de uma ou várias proteínas relevantes, quer sejam peguiladas ou não. Um "agregado" é um conjunto de moléculas de proteínas que se agruparam umas com as outras por interacção espacial ou de qualquer outra forma. Como exemplos de "agregados" refere-se o emaranhamento entre (1) um conjunto de moléculas de proteínas peguiladas, (2) um conjunto de moléculas de proteínas não peguiladas e/ou (3) pelo menos uma molécula de uma proteína peguilada e pelo menos uma molécula de uma proteína não peguilada.
Salvo quando especificado de outro modo, uma "impureza proteica não peguilada" compreende as proteínas não peguiladas, isto é, proteínas às quais não esteja acoplada nenhuma molécula de PEG ou uma sua variante.
Salvo quando especificado de outro modo, o termo "razão estequiométrica em peso" designa o quociente entre a quantidade de moléculas de PEG livres e a quantidade de moléculas de proteínas não peguiladas relevantes.
Salvo quando especificado de outro modo, o termo "isoforma de proteína peguilada" designa uma proteína relevante à qual estejam acoplados um ou vários radicais de PEG, de preferência por meio de um acoplamento covalente. Por exemplo, o termo "PEG-1" refere-se a uma molécula de B-2036 à qual esteja acoplada uma molécula de PEG, de preferência numa posição como a de um resíduo aminoácido lisina e/ou no terminal amino. De igual modo, os termos PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9 designam o número de moléculas de PEG acopladas a uma molécula de B-2036. Assim, o termo PEG-2 refere-se a uma molécula de B-2036 à qual estão acopladas duas moléculas de 15 PEG e o termo PEG-3 refere-se a uma molécula de B-2036 à qual estão acopladas três moléculas de PEG, e assim por diante.
Salvo quando especificado de outro modo, o termo "volume de leito compactado" designa um volume de leito compactado respeitante a uma resina particular compactada em conformidade com as condições de trabalho sugeridas pelo fabricante.
Salvo quando especificado de outro modo, o termo "impureza isoforma" refere-se pelo menos a uma impureza isoforma trissulfureto, ou a uma impureza isoforma des-phe, aqui descritas. 0 termo "impureza isoforma" também pode compreender outras impurezas conhecidas na especialidade. 0 termo "condutividade da mistura para CE" refere-se à medição de condutividade da fracção de VC recolhida que irá ser submetida a CE.
Os termos "antagonista da hormona do crescimento" e "antagonista do receptor da hormona do crescimento" abrangem os polipeptidos peguilados e os polipeptidos que inibam ou que de qualquer outra forma antagonizem a ligação da hormona do crescimento ao correspondente receptor da hormona do crescimento, para bloquear os efeitos biológicos da hormona do crescimento. De preferência, o "antagonista da hormona do crescimento" peguilado ou o "antagonista do receptor da hormona do crescimento" peguilado é B-2036 peguilado, B-2036 ou uma sua variante. As "variantes" compreendem os homólogos (em particular os homólogos com adições, delecções ou substituições de aminoácidos conservadores relativamente à B-2036), seus análogos, fragmentos, etc. (correspondentemente) que possuam actividade antagonista do receptor da hormona do crescimento. 16
Os termos "agonista da hormona do crescimento" e "agonista do receptor da hormona do crescimento" designam polipeptidos peguilados e polipeptidos que se ligam ao receptor da hormona do crescimento e o activam. De preferência, o "agonista da hormona do crescimento" ou o "agonista do receptor da hormona do crescimento" é a hormona do crescimento humana peguilada, a hormona de crescimento humana ou uma sua variante. As "variantes" compreendem os homólogos (em particular os homólogos com adições, delecções ou substituições de aminoácidos conservadores relativamente à hormona do crescimento humana), análogos, fragmentos, pseudopéptidos, anticorpos, etc. (correspondentemente) que possuam actividade agonista do receptor da hormona do crescimento. 0 termo "e" pode significar "e" ou "ou", conforme conveniente ou necessário para descrever um processo para se obter a diminuição desejada do nivel das impurezas relevantes (v.g., impurezas isoformas trissulfureto ou des-phe e/ou agregados). 0 termo "ou" pode significar "e" ou "ou", conforme conveniente ou necessário para descrever um processo para se obter a diminuição desejada do nivel das impurezas relevantes (v.g., impurezas isoformas trissulfureto ou des-phe e/ou agregados).
Conforme aqui utilizado, salvo quando especificado de outro modo, o termo "diminuir" (ou suas variações lógicas) significa manter, eliminar, minimizar, reduzir, evitar, inverter e/ou atenuar a quantidade do nivel de "agregado" da proteína peguilada relevante e/ou da impureza isoforma relevante, quer seja a impureza isoforma trissulfureto quer seja a impureza isoforma des-phe. 17
Salvo quando especificado de outra forma, o termo "célula hospedeira" (ou as suas variações lógicas) refere-se a qualquer célula hospedeira em que possa ser formada a molécula B-2036 recombinante ou a hGH recombinante. Assim sendo, a célula hospedeira pode ser uma célula hospedeira de um mamífero, uma célula hospedeira vegetal ou uma célula hospedeira microbiana, por exemplo, células hospedeiras de E. coli ou mesmo de leveduras. É importante referir que a célula hospedeira pode ser uma célula que seja suficiente para nela se desenvolver o componente da proteína B-2036 recombinante ou a hGH recombinante. Assim sendo, não há nenhuma limitação sobre o tipo de célula hospedeira, com a excepção de ter de ser capaz de produzir recombinantemente o componente proteico B-2036 ou a hGH recombinante considerada relevante ou suas "variantes".
Além do mais, tal como aqui utilizado, salvo quando especificado de outra forma, o termo "crescimento" (ou suas variações lógicas, v.g., crescer) compreende os fenómenos de fermentação e de criação em cultura ou aqueles que façam, de alguma forma, com que as células hospedeiras proliferem suficientemente para produzirem as quantidades desejadas do componente proteico B-2036 recombinante ou de hGH recombinante.
Além disso, embora a presente invenção seja descrita tomando como referência a molécula B-2036 e a molécula B-2036 PEG recombinante, salvo quando especificado de outro modo, subentende-se que o conteúdo da invenção pode ser utilizado com qualquer antagonista da hormona do crescimento recombinante, quer seja um antagonista da hormona do crescimento de mamíferos, um antagonista da hormona do 18 crescimento humana ou um antagonista da hormona do crescimento de bovinos, etc.. 0 pegvisomant (ao qual aqui se lhe atribui as referências PEG B-2036 ou B-2036 PEG) é a forma peguilada da proteína recombinante (B-2036) produzida em células hospedeiras recombinantes (v.g., células hospedeiras de E. coli recombinantes, geneticamente modificadas). A proteína B-2036 é produzida durante o crescimento celular (v.g., por fermentação) e durante a expressão (síntese e secreção). Após a sua produção, isola-se a B-2036 (v.g., por homogeneização) seguindo-se a purificação (v.g., por extracção, centrifugação, cromatografia de fase inversa e cromatografia de permuta de aniões e por permuta de tampão). No entanto, conforme foi comprovado, durante a produção recombinante da proteína B-2036, formam-se impurezas isoformas indesejáveis de B-2036, as quais são as impurezas isoformas trissulfureto e des-phe da proteína B-2036.
Conforme indicado, a figura IA ilustra a sequência de aminoácidos da B-2036 com as abreviaturas convencionais de 1 letra, indicando quais são os aminoácidos que se encontram presentes em cada posição identificada por uma letra. Como referência, ver o Quadro 1 subsequente que indica a correspondência entre a letra e o aminoácido que lhe está associado.
Quadro 1
Polipeptido
Aminoácido
Ala (A) Glu (E) Gin (Q) 19
Asp (D)
Asn (N)
Leu (L)
Gly (G)
Lys (K)
Ser (S)
Vai (V) (continuação)
Polipeptido
Aminoácido
Arg (R) Thr (T) Pro (P) Ile (I) Met (M) Phe (F) Tyr (T) Cys (C) Trp (W) His (H)
Por outro lado, a sequência de aminoácidos da B-2036 é aqui apresentada como SEQ. ID. NO. 1 e a sequência de aminoácidos da hGH é aqui apresentada como SEQ. ID. NO. 2. 1. Antagonista da hormona de crescimento recombinante e sua impureza isoforma trissulfureto A figura 1B ilustra a estrutura da sequência de aminoácidos da impureza isoforma trissulfureto da B-2036. Em particular, a impureza isoforma trissulfureto contém um 20 átomo de enxofre suplementar na ponte entre as cisteínas nas posições 182 e 189 do componente proteico B-2036. a. Diminuição da impureza isoforma trissulfureto com compostos mercapto
Sem se pretender impor nenhuma limitação de natureza teórica, admite-se que o contacto entre os compostos mercapto seleccionados e a impureza isoforma trissulfureto do antagonista B-2036 da hormona do crescimento recombinante tem como resultado a conversão da ponte trissulfureto cisteína-S-S-S-cisteína, que volta a assumir a sua forma nativa cisteina-S-S-cisteina. Além disso, também sem se querer impor qualquer limitação de natureza teórica, é possível que a presença de compostos mercapto impeça a formação subsequente da própria ponte trissulfureto.
Tipicamente, os compostos mercapto são acrescentadas às células hospedeiras que sintetizam o componente da proteína B-2036 recombinante desejada, durante ou após (ou durante e após) o crescimento das células hospedeiras. Mais ainda, após o crescimento e depois de os passos de contacto terem sido realizados, é preferível purificar a proteína B-2036. Seguidamente, a proteína purificada é, preferencialmente, peguilada para se obter PEG B-2036 (pegvisomant). Para conhecer os procedimentos de peguilação ver a patente de invenção norte-americana n° 5 849 535 e a patente de invenção norte-americana n° 5 672 662. É possível utilizar qualquer composto mercapto no âmbito da presente invenção, o qual deve ser, ao estabelecer contacto (de preferência, com agitação adequada) com o componente 21 proteico B-2036, conjuntamente com a sua impureza isoforma trissulfureto, suficiente para reduzir o nível da impureza isoforma trissulfureto, de preferência sem degradar (ou sem praticamente degradar) o rendimento de produção de B-2036. Os compostos mercapto preferíveis e convenientes para utilização no âmbito da presente invenção são seleccionados entre sulfitos, glutationa, β-mercaptoetanol, ditiotreitol, mercaptoetilamina, ditioeritritol, cloridrato de tris (2-carboxietil)-fosfina, cisteína e cisteína em combinação com cistina.
Outros compostos mercapto adequados para utilização com a presente invenção são os indicados nas obras seguintes: (1) J. Houk e G.M. Whitesides, "Structure-Reactivity Relations for Thiol-Disulfide Interchange," J. M. Chem. Soc., 109:6825-6836 (1987); (2) Sigmund, M., The Chemistry & Biochemistry of the Sulfhydro Group in Amino Acids, Peptides and Proteins, Ia Ed. Pergamon, Nova Iorque (1973) . Em particular, ver o Quadro II da obra de Houk et al. identificada no item (1) anterior onde está indicada uma listagem de compostos mercapto exemplificativos e adequados para utilização com a presente invenção.
Entre os compostos mercapto adequados, os mais preferíveis são cisteína ou cisteína em combinação com cistina (cisteína dimerizada). A quantidade de cisteína ou da combinação de cisteína e cistina (cisteína dimerizada, se a houver) considerada adequada para utilização com a presente invenção é a quantidade suficiente para fazer diminuir a impureza isoforma trissulfureto, que se tenha formado, pelo menos cerca de 10% da sua concentração máxima de equilíbrio (ou da sua concentração média de equilíbrio mais elevada, em que é calculada a média de diversos 22 lotes) . De preferência, a diminuição da quantidade da impureza isoforma trissulfureto, que se tenha formado, é, pelo menos, cerca de 20%, 30%, 40% ou 50% da sua concentração de equilíbrio mais elevada (ou da sua concentração média de equilíbrio mais elevada). A concentração combinada inicial de cisteína e de cistina, adequada para utilização com a presente invenção, é, preferencialmente, pelo menos cerca de 0,1 mM, entre cerca de 0,1 mM e cerca de 10 mM ou entre cerca de 1 mM e cerca de 5 mM. É preferível fornecer o composto mercapto num tampão. De preferência, o tampão irá ser aquele considerado adequado para utilização com a presente invenção, isto é, não deve evitar a formação do componente proteico B-2036 nem deve degradá-lo quando se tiver formado. Os tampões adequados para utilização no âmbito da presente invenção compreendem, mas sem que isso constitua qualquer limitação, os seleccionados entre Tris, fosfato, HEPES, ácido cítrico, trietilamina e histidina. O tampão preferível é o Tris. A concentração inicial do tampão preferível está compreendida entre cerca de 1 mM e cerca de 200 mM, mais preferencialmente entre cerca de 5 mM e cerca de 100 mM, ainda mais preferencialmente entre cerca de 8 mM e cerca de 70 mM e ainda muito mais preferencialmente entre cerca de 10 mM e cerca de 50 mM. É possível utilizar outros tampões convenientes. De preferência, estes tampões são suficientes para manter o pH do meio de crescimento num valor qualquer compreendido entre cerca de 4 e cerca de 9, entre cerca de 7,5 e cerca de 8,5 ou entre cerca de 7,5 e cerca de 8,0. Em particular, se forem utilizadas concentrações mais elevadas do composto mercapto, são tolerados valores mais elevados de pH, por exemplo, 23 valores iguais a cerca de 9,5. Deste modo, por exemplo, no caso de se utilizar um grande excesso de cisteína para a B-2036, então o valor de pH do tampão pode ser elevado e próximo de 9,5.
Conforme se disse antes, é preferível fornecer o composto mercapto num tampão. Por outro lado, a quantidade de composto mercapto no tampão deve ser tal que a proporção molar entre o número de moles do composto mercapto e o número de moles da proteína B-2036 esteja compreendida entre cerca de 0,5 e cerca de 1 000. Isto é especialmente verdadeiro quando o composto mercapto que vai ser utilizado é uma combinação de cisteína e, facultativamente, cisteína combinada com cistina. Em alternativa, a razão molar entre o número de moles de composto mercapto e o número de moles de proteína B-2036 pode estar compreendida entre cerca de 1 e cerca de 1000, entre de 1 e cerca de 500 ou entre cerca de 1 e cerca de 10.
De uma forma típica, depois de estar completo um contacto suficiente (para diminuir o nível de impureza isoforma trissulfureto) entre o composto mercapto e o componente proteico B-2036 (dentro ou fora das células hospedeiras), o componente proteico B-2036 no tampão tem uma concentração compreendida entre cerca de 0,1 mg/mL e cerca de 30 mg/mL, entre cerca de 0,5 mg/mL e cerca de 20 mg/mL ou entre cerca de 1 mg/mL e cerca de 10 mg/mL.
Por outro lado, o intervalo de temperaturas do meio de crescimento conjuntamente com o tampão, os compostos mercapto e os outros componentes, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, a proteína B-2036, deve ser mantido, preferencialmente a valores entre cerca de 0°C e cerca de 25°C depois de o composto mercapto ter sido 24 acrescentado às células hospedeiras ou ao seu lisado que contenha o componente proteico B-2036. Além disso, temperatura das células hospedeiras e/ou do seu lisado que contém o componente B-2036 é mantida, de preferência, entre cerca de 1°C e cerca de 15°C, entre cerca de 2°C e cerca de 10°C ou entre cerca de 2°C e cerca de 8°C. É importante observar que a desnaturação da proteína B-2036 ocorre para valores de cerca de 40°C ou superiores. Assim sendo, é desejável manter a temperatura do homogenado (isto é, a mistura que contém as células hospedeiras, o meio de crescimento, o tampão, os compostos mercapto e B-2036, etc.) num valor inferior à temperatura de desnaturação da proteína B-2036.
Por outro lado, o tempo de contacto entre o componente B-2036 e o composto mercapto deve ter uma duração suficiente para fazer diminuir o nível da impureza isoforma trissulfureto. Como exemplos de tempos de contacto adequados para diminuir o nível da impureza isoforma trissulfureto refere-se períodos pelo menos iguais a cerca de 30 minutos, entre cerca de 1 hora e cerca de 24 horas ou entre cerca de 1 hora e cerca de 4 horas.
De uma forma típica, após um período de contacto suficiente entre os compostos mercapto e o componente B-2036, o tampão que contém este componente possui um volume compreendido entre cerca de 1 litro e cerca de 5 000 litros, entre cerca de 10 litros e cerca de 500 litros ou entre cerca de 100 litros e cerca de 300 litros. Outros exemplos de volumes adequados correspondem a valores entre cerca de 160 litros e cerca de 500 litros.
Outros parâmetros que podem ter interesse durante o contacto entre os compostos mercapto e o componente B-2036 25 compreendem coisas tais como a velocidade de mistura. A velocidade de mistura deve ser a suficiente para se obter uma mistura homogénea (das células hospedeiras, seus lisados, tampão, compostos mercapto, o componente B-2036 e quaisquer outros componentes existentes num meio de crescimento), permitindo minimizar simultaneamente a quantidade de espuma que possa vir a formar-se. Os especialistas na matéria conseguem determinar facilmente qual deve ser a velocidade de mistura suficiente. Como é evidente, a velocidade de mistura deve ser tal que a temperatura seja mantida nos intervalos supramencionados e de tal modo que seja minimizada a degradação do componente proteico B-2036. b. Diminuição da impureza isoforma trissulfureto com agentes quelantes
Sem se pretender estabelecer qualquer limitação de natureza teórica, admite-se que o contacto entre os agentes quelantes seleccionados e (1) a impureza isoforma trissulfureto, (2) o antagonista B-2036 da hormona de crescimento recombinante, (3) os componentes celulares das células hospedeiras (para a produção recombinante de antagonista) e (4) todas as combinações de (1) - (3) tenha como resultado a conversão da ponte trissulfureto cisteína-S-S-S-cisteína de modo a que retome outra vez a sua forma nativa cisteina-S-S-cisteina, ou a diminuição dos níveis da impureza. Além disso, também sem se pretender impor qualquer limitação de natureza teórica, é possível que a presença de agentes quelantes impeça a formação suplementar da própria ponte trissulfureto. 26
De uma forma típica, os agentes quelantes são acrescentados às células hospedeiras que sintetizam o componente proteico B-2036 recombinante desejado, durante ou após (ou durante e após) o crescimento das células hospedeiras. Por outro lado, após o crescimento e depois de terem sido realizados os passos de contacto, é preferível purificar a proteína B-2036. Depois, a proteína purificada é preferencialmente peguilada para se obter PEG B-2036 (pegvisomant). Para se conhecer os procedimentos de peguilação, ver a patente de invenção norte-americana n° 5 849 535. É possível utilizar qualquer agente quelante no âmbito da presente invenção, o qual deve ser um agente que, ao contactar (de preferência com agitação adequada) com o componente proteico B-2036 conjuntamente com a sua impureza isoforma trissulfureto, seja suficiente para diminuir o nível da impureza isoforma trissulfureto, de preferência sem degradar (ou praticamente sem degradar) o rendimento de produção de B-2036. Os agentes quelantes preferenciais, adequados para utilização com a presente invenção, compreendem, mas sem que isso constitua qualquer limitação, os seleccionados entre EDTA, EGTA e DTPA. Outros exemplos de agentes quelantes compreendem, mas sem que isso constitua qualquer limitação, os seleccionados entre Deferoxamina, Ditiocarb sódico, Edetato de cálcio dissódico, Edetato dissódico, Edetato sódico, Edetato trissódico, Penicilamina, Pentetato de cálcio trissódico, ácido pentético, 'Succimer' e Trientina. Note-se que o edetato sódico é o sal de EDTA.
Outros agentes quelantes adequados para utilização com a presente invenção estão enunciados nas obras seguintes: 27 (1) The Merck Index, 12a Edição, S. Budavari (Editor), Merck & Co., Inc., Therapeutic Category and Biological Activity Index, p. THER-19 (na rubrica "CHELATING AGENT"), Whitehouse Station, NJ (1996) e em cada uma das edições subsequentes até à presente data; (2) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a Ed., Arthur Osol (Editor), Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania (1980) e em cada uma das edições subsequentes até à presente data; (3) The United States Pharmacopeia, 21" Revisão (16a Edição), United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, Maryland (1985) e em cada uma das edições subsequentes até à presente data; (4) SIGMA, Biochemicals and Reagents for Life Science Research Catalogue, St. Louis, Missouri (2002-2003); e (5) Aldrich, Handbook of Fine Chemicals and Laboratory Equipment, Milwaukee, Wisconsin (2000-2001) e suas edições (2002-2003).
Entre os agentes quelantes adequados, o EDTA é o de maior preferência. A quantidade de agente quelante conveniente para utilização com a presente invenção deve ser a quantidade considerada suficiente para diminuir a impureza isoforma trissulfureto, que se formou pelo menos em cerca de 10% da sua concentração de equilíbrio máxima (ou da sua concentração média de equilíbrio mais elevada, em que é calculada a média de vários lotes). De preferência, a diminuição da quantidade da impureza isoforma trissulfureto que se formou é, pelo menos, cerca de 20%, 30%, 40% ou 50% da sua concentração de equilíbrio máxima (ou da sua concentração média de equilíbrio mais elevada) que se formou. A concentração inicial de EDTA adequada para utilização com a presente invenção é, preferencialmente, pelo menos cerca de 0,01 mM, entre cerca de 0,01 mM e cerca 28 de 100 mM, entre cerca de 0,1 mM e cerca de 20 mM, entre cerca de 2 mM e cerca de 10 mM ou entre cerca de 2 mM e cerca de 5 mM. É preferível fornecer o agente quelante num tampão. De preferência, o tampão é aquele que venha a ser considerado conveniente para utilização com a presente invenção, isto é, não impeça a formação do componente proteico B-2036 nem 0 degrade depois de formado. Os tampões adequados para utilização no âmbito da presente invenção compreendem os seleccionados entre Tris, fosfato, HEPES, ácido cítrico, trietilamina e histidina. O tampão preferível é o Tris. A concentração de tampão inicial, preferível, está compreendida entre cerca de 1 mM e cerca de 200 mM, mais preferencialmente entre cerca de 5 mM e cerca de 100 mM, ainda mais preferencialmente entre cerca de 8 mM e cerca de 70 mM e ainda muito mais preferencialmente entre cerca de 10 mM e cerca de 50 mM. É possível utilizar outros tampões adequados. De preferência, estes tampões são suficientes para manter o pH do meio de crescimento num valor qualquer no intervalo entre cerca de 6 e cerca de 9, entre cerca de 6,5 e cerca de 7,5 ou entre cerca de 7,2 e cerca de 7,5.
Conforme se disse antes, é preferível fornecer o agente quelante num tampão. Por outro lado, a quantidade do agente quelante no tampão deve ser tal que a razão molar entre o número de moles de agente quelante e o número de moles de proteína B-2036 esteja compreendida entre cerca de 1 e cerca de 1 000. Em alternativa, a razão molar entre o número de moles de agente quelante e o número de moles de proteína B-2036 deve estar compreendida entre cerca de 20 e cerca de 1 000, entre cerca de 50 e cerca de 250 ou entre cerca de 60 e cerca de 110. 29
De uma forma típica, depois de estar completo um contacto suficiente (para diminuir o nível da impureza isoforma trissulfureto) entre o agente quelante e o componente proteico B-2036 (dentro ou fora das células hospedeiras), o componente proteico B-2036 no tampão tem uma concentração compreendida entre cerca de 0,1 mg/mL e cerca de 20 mg/mL, entre cerca de 0,5 mg/mL e cerca de 5 mg/mL ou entre cerca de 1 mg/mL e cerca de 5 mg/mL.
Por outro lado, o intervalo de temperaturas do meio de crescimento conjuntamente com o tampão, os agentes quelantes e os outros componentes, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, a proteína B-2036, deve ser mantido, preferencialmente, entre cerca de 0°C e cerca de 35°C depois de o agente quelante ter sido acrescentado às células hospedeiras ou ao seu lisado que contenha o componente proteico B-2036. Além disso, a temperatura das células hospedeiras e/ou do seu lisado que contém o componente B-2036 é mantida, de preferência, entre cerca de 1°C e cerca de 15°C, entre cerca de 2°C e cerca de 10°C ou entre cerca de 2°C e cerca de 15°C. Note-se que, preferencialmente, após a adição do agente quelante (v.g., EDTA), cuja temperatura é de cerca de 4°C, a temperatura do homogenado que contém a proteína B-2036 sobe para cerca de 30°C após a homogeneização. É importante observar que a desnaturação da proteína B-2036 ocorre a valores de cerca de 40°C ou superiores. Assim sendo, é desejável manter a temperatura do homogenado (isto é, a mistura que contém as células hospedeiras, o meio de crescimento, o tampão, os agentes quelantes e B-2036, etc.) num valor inferior à temperatura de desnaturação da proteína B-2036. 30
Por outro lado, o tempo de contacto entre o componente B-2036 e o agente quelante deve ter uma duração suficiente para diminuir o nivel da impureza isoforma trissulfureto. Como exemplos de tempos de contacto adequados para diminuir o nivel da impureza isoforma trissulfureto refere-se períodos pelo menos iguais a cerca de 30 minutos, entre cerca de 1 hora e cerca de 48 horas ou entre cerca de 5 horas e cerca de 15 horas.
De uma forma típica, após um período de contacto suficiente entre os agentes quelantes e o componente B-2036, o tampão que contém este componente possui um volume compreendido entre cerca de 1 litro e cerca de 5 000 litros, entre cerca de 10 litros e cerca de 500 litros ou entre cerca de 100 litros e cerca de 300 litros. Outros exemplos de volumes adequados correspondem a valores entre cerca de 160 litros e cerca de 500 litros.
Outros parâmetros que podem ter interesse durante o contacto entre os agentes quelantes e o componente B-2036 compreendem coisas tais como a velocidade de mistura. A velocidade de mistura deve ser a suficiente para se obter uma mistura homogénea (das células hospedeiras, seus lisados, tampão, agentes quelantes, o componente B-2036 e quaisquer outros componentes existentes num meio de crescimento), permitindo minimizar simultaneamente a quantidade de espuma que possa vir a formar-se. Os especialistas na matéria conseguem determinar facilmente qual deve ser a velocidade de mistura suficiente. Como é evidente, a velocidade de mistura deve ser tal que a temperatura seja mantida nos intervalos supramencionados e de tal modo que seja minimizada a degradação do componente proteico B-2036. 31 c. Diminuição da isoforma trissulfureto com sais de metais
Sem se pretender estabelecer qualquer limitação de natureza teórica, admite-se que o contacto entre os sais de metais seleccionados e (1) a impureza isoforma trissulfureto, (2) o antaqonista B-2036 da hormona de crescimento recombinante, (3) os componentes celulares das células hospedeiras (para a produção recombinante de antagonista) e (4) todas as combinações de (1) - (3) tenham como resultado a conversão da ponte trissulfureto cisteína-S-S-S-cisteína de modo a que retome outra vez a sua forma nativa cisteína-S-S-cisteina, ou a diminuição dos níveis da impureza. Além disso, também sem se pretender impor qualquer limitação de natureza teórica, é possível que a presença de sais de metais impeça a formação suplementar da própria ponte trissulfureto.
De uma forma típica, os sais de metais são acrescentados às células hospedeiras que sintetizam o componente proteico B-2036 recombinante desejado, durante ou após (ou durante e após) o crescimento das células hospedeiras. Por outro lado, após o crescimento e depois de terem sido realizados os passos de contacto, é preferível purificar a proteína B-2036. Depois, a proteína purificada é preferencialmente peguilada para se obter PEG B-2036 (pegvisomant) . Para se conhecer os procedimentos de peguilação ver a patente de invenção norte-americana n° 5 849 535. É possível utilizar qualquer sal de um metal no âmbito da presente invenção, o qual, ao contactar (de preferência com agitação adequada) com o componente proteico B-2036 conjuntamente com a sua impureza isoforma trissulfureto, 32 seja suficiente para diminuir o nivel da impureza isoforma trissulfureto, de preferência sem degradar (ou praticamente sem degradar) o rendimento de produção de B-2036. Os sais de metais adequados para utilização com a presente invenção compreendem, mas sem que isso constitua qualquer limitação, os sais de metais alcalino-terrosos, os sais de metais alcalinos, os sais de metais de transição e suas combinações. Os sais de metais preferíveis, adequados para utilização com a presente invenção, compreendem, mas sem que isso constitua qualquer limitação, os seleccionados entre fosfato de potássio, acetato de potássio, fosfato de sódio, acetato de sódio, cloreto de zinco e suas combinações.
Outros sais de metais adequados para utilização com a presente invenção estão enunciados nas obras seguintes: (1) The Merck Index, 12a Edição, S. Budavari (Editor), Merck & Co., Inc., Therapeutic Category and Biological Activity índex, p. THER-19 (na rubrica "CHELATING AGENT"), Whitehouse Station, NJ (1996) e em cada uma das edições subsequentes até à presente data; (2) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a Ed., Arthur Osol (Editor), Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania (1980) e em cada uma das edições subsequentes até à presente data; (3) The United States Pharmacopeia, 21a Revisão (16a Edição), United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, Maryland (1985) e em cada uma das edições subsequentes até à presente data; (4) SIGMA, Biochemicals and Reagents for Life Science Research Catalogue, St. Louis, Missouri (2002-2003); e (5) Aldrich, Handbook of Fine Chemicals and Laboratory Equipment, Milwaukee, Wisconsin (2000-2001) e suas edições (2002-2003). 33
Entre os sais de metais utilizados com a presente invenção, são também preferíveis o fosfato de sódio, ZnCl2 e suas combinações. A quantidade de sais de metais, conveniente para utilização com a presente invenção deve ser a quantidade considerada suficiente para diminuir a impureza isoforma trissulfureto que se formou, pelo menos em cerca de 10% da sua concentração máxima (ou da sua concentração média de equilíbrio mais elevada, em que é calculada a média de vários lotes). De preferência, a diminuição da quantidade da impureza isoforma trissulfureto que se formou é, pelo menos, cerca de 20%, 30%, 40% ou 50% da sua concentração máxima (ou da sua concentração média mais elevada) . A concentração inicial do sal de um metal (v.g., fosfato de sódio), adequada para utilização com a presente invenção é, preferencialmente, pelo menos cerca de 0,1 mM, entre cerca de 1 mM e cerca de 500 mM, entre cerca de 1 mM e cerca de 200 mM, entre cerca de 5 mM e cerca de 175 mM, entre cerca de 10 mM e cerca de 150 mM ou entre cerca de 25 mM e cerca de 100 mM. É preferível fornecer o sal de um metal num tampão. No entanto, o fosfato de sódio pode actuar simultaneamente como tampão e como sal de metal adequado. No entanto, é possível acrescentar outros sais de metais adequados ao tampão sulfato de sódio. De preferência, o tampão é aquele que venha a ser considerado conveniente para utilização com a presente invenção, isto é, não impeça a formação do componente proteico B-2036 nem o degrade depois de formado. Os tampões adequados para utilização no âmbito da presente invenção compreendem os seleccionados entre Tris, fosfato, HEPES, ácido cítrico, trietilamina e histidina. A concentração de tampão inicial, preferível, está compreendida entre cerca de 34 1 irM e cerca de 200 mM, mais preferencialmente entre cerca de 5 mM e cerca de 100 mM, ainda mais preferencialmente entre cerca de 8 mM e cerca de 70 mM e ainda muito mais preferencialmente entre cerca de 10 mM e cerca de 50 mM. É possível utilizar outros tampões adequados. De preferência, estes tampões são suficientes para manter o pH do meio de crescimento num valor qualquer no intervalo entre cerca de 4 e cerca de 9, entre cerca de 4,5 e cerca de 7,5 ou entre cerca de 5,5 e cerca de 7,5.
Depois de o sal de um metal ter sido fornecido num tampão (ou no caso de NaP, em que a solução de NaP actua simultaneamente como sal de metal e como tampão), a quantidade de sal de metal no tampão (ou de solução de NaP que actua também como tampão) deve ser tal que a razão molar entre o número de moles de sal do metal e o número de moles de proteína B-2036 esteja compreendida entre cerca de 1 cerca de 10 000. Em alternativa, a razão molar entre o número de moles de sal do metal e o número de moles de proteína B-2036 pode estar compreendida entre cerca de 300 e cerca de 10 000, entre cerca de 500 e cerca de 5 000 ou entre cerca de 500 e cerca de 2 500.
De uma forma típica, depois de estar completo um contacto suficiente (para diminuir o nível da impureza isoforma trissulfureto) entre os sais de metais e o componente proteico B-2036 (dentro ou fora das células hospedeiras), o componente de proteína B-2036 no tampão tem uma concentração compreendida entre cerca de 0,1 mg/mL e cerca de 20 mg/mL, entre cerca de 0,5 mg/mL e cerca de 5 mg/mL ou entre cerca de 1 mg/mL e cerca de 5 mg/mL.
Por outro lado, o intervalo de temperaturas do meio de crescimento conjuntamente com o tampão, os sais de metais e 35 os outros componentes, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, a proteína B-2036, deve ser mantido, preferencialmente, entre cerca de 0°C e cerca de 35°C depois de o sal do metal ter sido acrescentado às células hospedeiras ou ao seu lisado que contenha o componente proteico B-2036. Além disso, a temperatura das células hospedeiras e/ou do seu lisado que contém o componente B-2036 é mantida, de preferência, entre cerca de 1°C e cerca de 15°C, entre cerca de 2°C e cerca de 10°C ou entre cerca de 2°C e cerca de 15°C. Note-se que, após a homogeneização com um sal de um metal (v.g., NaP) , a temperatura de homogenado pode aumentar. É importante notar que a desnaturação da proteína B-2036 ocorre a valores de cerca de 40°C ou superiores. Assim sendo, é desejável manter a temperatura do homogenado (isto é, a mistura que contém as células hospedeiras, o meio de crescimento, o tampão, o sal de um metal, a B-2036 e facultativamente o composto mercapto, etc.) a uma temperatura inferior à temperatura de desnaturação da proteína B-2036.
Por outro lado, o tempo de contacto entre o componente B-2036 e o agente quelante deve ter uma duração suficiente para fazer diminuir o nível da impureza isoforma trissulfureto. Como exemplos de tempos de contactos adequados para diminuir o nível da impureza isoforma trissulfureto refere-se períodos pelo menos iguais a cerca de 30 minutos, entre cerca de 1 hora e cerca de 48 horas ou entre cerca de 5 horas e cerca de 15 horas.
De uma forma típica, após um período de contacto suficiente entre os sais de metais e o componente B-2036, o tampão que contém este componente possui um volume compreendido entre cerca de 1 litro e cerca de 5 000 36 litros, entre cerca de 100 litros e cerca de 2 000 litros ou entre cerca de 200 litros e cerca de 1 500 litros.
Outros parâmetros que podem ter interesse durante o contacto entre os sais de metais e o componente B-2036 compreendem coisas tais como a velocidade de mistura. A velocidade de mistura deve ser a suficiente para se obter uma mistura homogénea (das células hospedeiras, seus lisados, tampão, sais de metais, o componente B-2036 e quaisquer outros componentes existentes num meio de crescimento), permitindo minimizar simultaneamente a quantidade de espuma que possa vir a formar-se. Os especialistas na matéria conseguem determinar facilmente qual deve ser a velocidade de mistura suficiente. Como é evidente, a velocidade de mistura deve ser tal que a temperatura seja mantida nos intervalos supramencionados e de tal modo que seja minimizada a degradação do componente proteico B-2036. 2. Antagonista da hormona de crescimento recombinante e sua impureza isoforma des-phe a. Diminuição da impureza isoforma des-phe com um agente guelante
Sem se pretender impor qualquer limitação de natureza teórica, admite-se que a adição de agentes quelantes ao antagonista B-2036 da hormona de crescimento recombinante tem como resultado uma diminuição do nível da impureza isoforma des-phe, quer porque haja uma redução real do seu nível quer porque seja evitada mais formação de des-phe. 37
De uma forma típica, os agentes quelantes são acrescentados às células hospedeiras que sintetizam o componente proteico B-2036 recombinante desejado, durante ou após (ou durante e após) o crescimento das células hospedeiras. Por outro lado, após o crescimento e depois de terem sido realizados os passos de contacto, é preferível purificar a proteína B-2036. Depois, a proteína purificada é preferencialmente peguilada para se obter PEG B-2036 (pegvisomant). Para se conhecer os procedimentos de peguilação ver a patente de invenção norte-americana n° 5 849 535. É possível utilizar qualquer agente quelante no âmbito da presente invenção, o qual deve ser um agente que, ao contactar (de preferência com agitação adequada) com o componente proteico B-2036 conjuntamente com a sua impureza isoforma des-phe, seja suficiente para diminuir o nível da impureza isoforma des-phe, de preferência sem degradar (ou praticamente sem degradar) o rendimento de produção de B-2036. Os agentes quelantes preferenciais, adequados para utilização com a presente invenção, compreendem, mas sem que isso constitua qualquer limitação, os seleccionados entre EDTA, EGTA e DTPA. Outros exemplos de agentes quelantes compreendem, mas sem que isso constitua qualquer limitação, os seleccionados entre Deferoxamina, Ditiocarb sódico, Edetato de cálcio dissódico, Edetato dissódico, Edetato sódico, Edetato trissódico, Penicilamina, Pentetato de cálcio trissódico, ácido pentético, 'Succimer' e Trientina. Nota-se que o edetato sódico é o sal de EDTA.
Outros agentes quelantes adequados para utilização com a presente invenção estão enunciados nas obras seguintes: (1) The Merck Index, 12a Edição, S. Budavari (Editor), 38
Merck & Co., Inc., Therapeutic Category and Biological Activity Index, p. THER-19 (na rubrica "CHELATING AGENT"), Whitehouse Station, NJ (1996) e em cada uma das edições subsequentes até à presente data; (2) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a Ed., Arthur Osol (Editor), Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania (1980) e em cada uma das edições subsequentes até à presente data; (3) The United States Pharmacopeia, 21" Revisão (16a Edição), United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, Maryland (1985) e em cada uma das edições subsequentes até à presente data; (4) SIGMA, Biochemicals and Reagents for Life Science Research Catalogue, St. Louis, Missouri (2002-2003); e (5) Aldrich, Handbook of Fine Chemicals and Laboratory Equipment, Milwaukee, Wisconsin (2000-2001) e suas edições (2002-2003).
Entre os agentes quelantes adequados, o EDTA é o de maior preferência. A quantidade de agente quelante conveniente para utilização com a presente invenção deve ser a quantidade considerada suficiente para diminuir a impureza isoforma des-phe que se formou, pelo menos em cerca de 10% da sua concentração de equilíbrio máxima (ou da sua concentração média de equilíbrio mais elevada, em que é calculada a média de vários lotes) . De preferência, a diminuição da quantidade da impureza isoforma des-phe que se formou é, pelo menos, cerca de 20%, 30%, 40% ou 50% da sua concentração de equilíbrio máxima (ou da sua concentração média de equilíbrio mais elevada). A concentração inicial de EDTA adequada para utilização com a presente invenção é, preferencialmente, pelo menos cerca de 0,01 mM, entre cerca de 0,01 mM e cerca de 100 mM, entre 39 cerca de 0,1 mM e cerca de 20 mM, entre cerca de 2 mM e cerca de 10 mM ou entre cerca de 2 mM e cerca de 5 mM. É preferível fornecer o agente quelante num tampão. De preferência, o tampão é aquele que venha a ser considerado conveniente para utilização com a presente invenção, isto é, não impeça a formação do componente proteico B-2036 nem o degrade depois de formado. Os tampões adequados para utilização no âmbito da presente invenção compreendem os seleccionados entre Tris, fosfato, HEPES, ácido cítrico, trietilamina e histidina. O tampão preferível é o Tris. A concentração de tampão inicial, preferível, está compreendida entre cerca de 1 mM e cerca de 200 mM, mais preferencialmente entre cerca de 5 mM e cerca de 100 mM, ainda mais preferencialmente entre cerca de 8 mM e cerca de 70 mM e ainda muito mais preferencialmente entre cerca de 10 mM e cerca de 50 mM. É possível utilizar outros tampões adequados. De preferência, estes tampões são suficientes para manter o pH do meio de crescimento num valor qualquer no intervalo entre cerca de 6 e cerca de 9, entre cerca de 6,5 e cerca de 7,5 ou entre cerca de 7,2 e cerca de 7,5.
Conforme se disse antes, é preferível fornecer o agente quelante num tampão. Por outro lado, a quantidade do agente quelante no tampão deve ser tal que a razão molar entre o número de moles de agente quelante e o número de moles de proteína B-2036 esteja compreendida entre cerca de 1 e cerca de 1 000. Em alternativa, a razão molar entre o número de moles de agente quelante o número de moles de proteína B-2036 deve estar compreendida entre cerca de 20 e cerca de 1 000, entre cerca de 50 e cerca de 250 ou entre cerca de 60 e cerca de 110. 40
De uma forma típica, depois de estar completo um contacto suficiente (para diminuir o nível da impureza isoforma des-phe) entre o agente quelante e o componente proteico B-2036 (dentro ou fora das células hospedeiras), o componente proteico B-2036 no tampão tem uma concentração compreendida entre cerca de 0,1 mg/mL e cerca de 20 mg/mL, entre cerca de 0,5 mg/mL e cerca de 5 mg/mL ou entre cerca de 1 mg/mL e cerca de 5 mg/mL.
Por outro lado, o intervalo de temperaturas do meio de crescimento conjuntamente com o tampão, os agentes quelantes e os outros componentes, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, a proteína B-2036, deve ser mantido, preferencialmente, entre cerca de 0°C e cerca de 35°C depois de o agente quelante ter sido acrescentado às células hospedeiras ou ao seu lisado que contenha o componente proteico B-2036. Além disso, a temperatura das células hospedeiras e/ou do seu lisado que contém o componente B-2036 é mantida, de preferência, entre cerca de 1°C e cerca de 15°C, entre cerca de 2°C e cerca de 10°C ou entre cerca de 2°C e cerca de 15°C. Note-se que, preferencialmente, após a adição do agente quelante (v.g., EDTA), cuja temperatura é de cerca de 4°C, a temperatura do homogenado que contém a proteína B-2036 sobe para cerca de 30°C após a homogeneização. É importante observar que a desnaturação da proteína B-2036 ocorre a valores de cerca de 40°C ou superiores. Assim sendo, é desejável manter a temperatura do homogenado (isto é, a mistura que contém as células hospedeiras, o meio de crescimento, o tampão, os agentes quelantes e B-2036, etc.) num valor inferior à temperatura de desnaturação da proteína B-2036. 41
Por outro lado, o tempo de contacto entre o componente B-2036 e o agente quelante deve ter uma duração suficiente para diminuir o nivel da impureza isoforma des-phe. Como exemplos de tempos de contactos adequados para diminuir o nível da impureza isoforma des-phe refere-se períodos pelo menos iguais a cerca de 30 minutos, entre cerca de 1 hora e cerca de 48 horas ou entre cerca de 5 horas e cerca de 15 horas.
De uma forma típica, após um período de contacto suficiente entre os agentes quelantes e o componente B-2036, o tampão que contém este componente possui um volume compreendido entre cerca de 1 litro e cerca de 5 000 litros, entre cerca de 10 litros e cerca de 500 litros ou entre cerca de 100 litros e cerca de 300 litros. Outros exemplos de volumes adequados correspondem a valores entre cerca de 160 litros e cerca de 500 litros.
Outros parâmetros que podem ter interesse durante o contacto entre os agentes quelantes e o componente B-2036 compreendem coisas tais como a velocidade de mistura. A velocidade de mistura deve ser a suficiente para se obter uma mistura homogénea (das células hospedeiras, seus lisados, tampão, agentes quelantes, o componente B-2036 e quaisquer outros componentes existentes num meio de crescimento), permitindo minimizar simultaneamente a quantidade de espuma que possa vir a formar-se. Os especialistas na matéria conseguem determinar facilmente qual deve ser a velocidade de mistura suficiente. Como é evidente, a velocidade de mistura deve ser tal que a temperatura seja mantida nos intervalos supramencionados e de tal modo que seja minimizada a degradação do componente proteico B-2036. 42 b. Diminuição da impureza isoforma des-phe com sais de metais
Sem se pretender impor qualquer limitação de natureza teórica, admite-se que a adição de sais de metais ao antagonista B-2036 da hormona de crescimento recombinante tem como resultado uma diminuição do nível de impureza isoforma des-phe, quer porque haja uma redução real no seu nível quer porque seja evitada mais formação de des-phe.
De uma forma típica, os sais de metais são acrescentados às células hospedeiras que sintetizam o componente proteico B-2036 recombinante desejada, durante ou após (ou durante e após) o crescimento das células hospedeiras. Por outro lado, após o crescimento e depois de terem sido realizados os passos de contacto, é preferível purificar a proteína B-2036. Depois, a proteína purificada é preferencialmente peguilada para se obter PEG B-2036 (pegvisomant) . Para se conhecer os procedimentos de peguilação ver a patente de invenção norte-americana n° 5 849 535. É possível utilizar qualquer sal de um metal no âmbito da presente invenção, o qual, ao contactar (de preferência com agitação adequada) com o componente proteico B-2036 conjuntamente com a sua impureza isoforma des-phe, seja suficiente para diminuir o nível da impureza isoforma des-phe, de preferência sem degradar (ou praticamente sem degradar) o rendimento de produção de B-2036. Os sais de metais adequados para utilização com a presente invenção compreendem, mas sem que isso constitua qualquer limitação, os sais de metais alcalino-terrosos, os sais de metais alcalinos, os sais de metais de transição e suas combinações. Os sais de metais 43 preferíveis, adequados para utilização com a presente invenção, compreendem, mas sem que isso constitua qualquer limitação, os seleccionados entre fosfato de potássio, acetato de potássio, fosfato de sódio, acetato de sódio, cloreto de zinco e suas combinações.
Outros sais de metais adequados para utilização com a presente invenção estão enunciados nas obras seguintes: (1) The Merck Index, 12a Edição, S. Budavari (Editor), Merck & Co., Inc., Therapeutic Category and Biological Activity Index, p. THER-19 (na rubrica "CHELATING AGENT"), Whitehouse Station, NJ (1996) e em cada uma das edições subsequentes até à presente data; (2) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a Ed., Arthur Osol (Editor), Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania (1980) e em cada uma das edições subsequentes até à presente data; (3) The United States Pharmacopeia, 21a Revisão (16a Edição), United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, Maryland (1985) e em cada uma das edições subsequentes até à presente data; (4) SIGMA, Biochemicals and Reagents for Life Science Research Catalogue, St. Louis, Missouri (2002— 2003); e (5) Aldrich, Handbook of Fine Chemicals and Laboratory Equipment, Milwaukee, Wisconsin (2000-2001) e suas edições (2002-2003).
Entre os sais de metais utilizados com a presente invenção, são também preferíveis o fosfato de sódio, ZnCl2 e suas combinações. A quantidade de sais de metais conveniente para utilização com a presente invenção deve ser a quantidade considerada suficiente para diminuir a impureza isoforma des-phe que se formou, pelo menos em cerca de 10% da sua concentração máxima (ou da sua concentração média mais elevada, em que é calculada a média 44 de vários lotes). De preferência, a diminuição da quantidade da impureza isoforma des-phe que se formou é, pelo menos, cerca de 20%, 30%, 40% ou 50% da sua concentração máxima (ou da sua concentração média mais elevada). A concentração inicial do sal de um metal (v.g.r fosfato de sódio), adequada para utilização com a presente invenção é, preferencialmente, pelo menos cerca de 0,1 mM, entre cerca de 1 mM e cerca de 500 mM, entre cerca de 1 mM e cerca de 200 mM, entre cerca de 5 mM e cerca de 175 mM, entre cerca de 10 mM e cerca de 150 mM ou entre cerca de 25 mM e cerca de 100 mM. É preferível fornecer o sal de um metal num tampão. No entanto, o fosfato de sódio pode actuar simultaneamente como tampão e como sal de metal adequado. No entanto, é possível acrescentar outros sais de metais adequados ao tampão sulfato de sódio. De preferência, o tampão é aquele que venha a ser considerado conveniente para utilização com a presente invenção, isto é, não degrade a formação do componente proteico B-2036. Os tampões adequados para utilização no âmbito da presente invenção compreendem os seleccionados entre Tris, fosfato, HEPES, ácido cítrico, trietilamina e histidina. A concentração de tampão inicial, preferível, está compreendida entre cerca de 1 mM e cerca de 200 mM, mais preferencialmente entre cerca de 5 mM e cerca de 100 mM, ainda mais preferencialmente entre cerca de 8 mM e cerca de 70 mM e ainda muito mais preferencialmente entre cerca de 10 mM e cerca de 50 mM. É possível utilizar outros tampões adequados. De preferência, estes tampões são suficientes para manter o pH do meio de crescimento num valor qualquer no intervalo entre cerca de 45 4 e cerca de 9, entre cerca de 4,5 e cerca de 7,5 ou entre cerca de 5,5 e cerca de 7,5.
Depois de o sal de um metal ter sido fornecido num tampão (ou no caso de NaP, em que a solução de NaP actua simultaneamente como sal de metal e como tampão), a quantidade de sal de metal no tampão (ou de solução de NaP que actua também como tampão) deve ser tal que a razão molar entre o número de moles de sal do metal e o número de moles de proteína B-2036 esteja compreendida entre cerca de 1 cerca de 10 000. Em alternativa, a razão molar entre o número de moles de sal do metal e o número de moles de proteína B-2036 pode estar compreendida entre cerca de 300 e cerca de 10 000, entre cerca de 500 e cerca de 5 000 ou entre cerca de 500 e cerca de 2 500.
De uma forma típica, depois de estar completo um contacto suficiente (para diminuir o nível da impureza isoforma des-phe) entre os sais de metais e o componente proteico B-2036 (dentro ou fora das células hospedeiras), o componente de proteína B-2036 no tampão tem uma concentração compreendida entre cerca de 0,1 mg/mL e cerca de 20 mg/mL, entre cerca de 0,5 mg/mL e cerca de 5 mg/mL ou entre cerca de 1 mg/mL e cerca de 5 mg/mL.
Por outro lado, o intervalo de temperaturas do meio de crescimento conjuntamente com o tampão, os sais de metais e os outros componentes, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, a proteína B-2036, deve ser mantido, preferencialmente, entre cerca de 0°C e cerca de 35°C depois de o sal de um metal ter sido acrescentado às células hospedeiras ou ao seu lisado que contenha o componente proteico B-2036. Além disso, a temperatura das células hospedeiras e/ou do seu lisado que contém o 46 componente B-2036 é mantida, de preferência, entre cerca de 1°C e cerca de 15°C, entre cerca de 2°C e cerca de 10°C ou entre cerca de 2°C e cerca de 15°C. Note-se que, após a homogeneização com um sal de um metal (v.g., NaP), a temperatura de homogenado pode aumentar. É importante notar que a desnaturação da proteína B-2036 ocorre a valores de cerca de 40°C ou superiores. Assim sendo, é desejável manter a temperatura do homogenado (isto é, a mistura que contém as células hospedeiras, o meio de crescimento, o tampão, o sal de um metal, a B-2036 e facultativamente o composto mercapto, etc.) a uma temperatura inferior à temperatura de desnaturação da proteína B-2036.
Por outro lado, o tempo de contacto entre o componente B-2036 e o sal do metal deve ter uma duração suficiente para fazer diminuir o nível da impureza isoforma des-phe. Como exemplos de tempos de contactos adequados para diminuir o nível da impureza isoforma des-phe refere-se períodos pelo menos iguais a cerca de 30 minutos, entre cerca de 1 hora e cerca de 48 horas ou entre cerca de 5 horas e cerca de 15 horas.
De uma forma típica, após um período de contacto suficiente entre os sais de metais e o componente B-2036, o tampão que contém este componente possui um volume compreendido entre cerca de 1 litro e cerca de 3 000 litros, entre cerca de 100 litros e cerca de 2 000 litros ou entre cerca de 200 litros e cerca de 1 500 litros.
Outros parâmetros que podem ter interesse durante o contacto entre os sais de metais e o componente B-2036 compreendem coisas tais como a velocidade de mistura. A velocidade de mistura deve ser a suficiente para se obter uma mistura homogénea (das células hospedeiras, seus 47 lisados, tampão, sais de metais, o componente B-2036 e quaisquer outros componentes existentes num meio de crescimento), permitindo minimizar simultaneamente a quantidade de espuma que possa vir a formar-se. Os especialistas na matéria conseguem determinar facilmente qual deve ser a velocidade de mistura suficiente. Como é evidente, a velocidade de mistura deve ser tal que a temperatura seja mantida nos intervalos supramencionados e de tal modo que seja minimizada a degradação do componente proteico B-2036. 4. Polipeptido peguilado e seu agregado a. Diminuição de agregado com cromatoqrafia de permuta de aniões
No fabrico e na purificação de B-2036 PEG, prepara-se o lote intermediário ou molécula B-2036 conforme se disse anteriormente. Depois a molécula B-2036 é submetida a um processo de acordo com os seis passos a seguir indicados para se obter o IFA final que é a proteína B-2036 PEG com interesse. Estes seis passos são os seguintes: 1. peguilação para se obter a molécula B-2036 peguilada, 2. cromatografia HIC (passo facultativo) para se obter uma mistura ("pool") de HIC, 3. ultrafiltração / diafiltração (passo facultativo) para se obter uma mistura de diafiltração, 4. cromatografia AEX e mistura das fracções para se obter uma mistura de AEX, 48 5. diafiltração do lote de AEX para se obter uma mistura de diafiltração e 6. filtração do IFA (para efeitos de esterilização, de preferência através de um filtro de 0,22 ym para dentro de garrafas de recolha, para congelamento), para se obter um IFA final.
Os passos 1-6 supramencionados são exemplificativos e estão explicitados no fluxograma 1 e no Exemplo 1.
Tomando como referência o passo 1, o passo de peguilação concretiza o primeiro passo da invenção reivindicada, ao proporcionar as isoformas de proteínas peguiladas relevantes. Seguidamente, são executados, preferencialmente, o passo 2 da HIC e o subsequente passo 3 de diafiltração, ambos considerados facultativos, para se remover qualquer proteína não peguilada, moléculas de PEG livres e quaisquer outras impurezas que possam ser removidas durante o passo 2. Após o passo 3, a mistura de diafiltração do passo 3 é então submetida à cromatografia de permuta de aniões do passo 4 para se efectuar a separação das isoformas PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9 que são depois reunidas para enriquecerem, preferencialmente, o nível das isoformas PEG-4, PEG-5 e PEG-6, de modo a obter-se um produto final para processamento subsequente no passo 5 da diafiltração que irá ser seguido pelo passo 6 de filtração com esterilização para se obter um produto final que é o IFA.
Voltando agora, outra vez, ao passo 1 de peguilação, submete-se a molécula de B-2036 a condições suficientes para se efectuar a peguilação da própria molécula B-2036 para dar origem a B-2036 PEG, incluindo as isoformas PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9. Os 49 parâmetros de peguilação preferíveis estão indicados no fluxograma 1 e no Exemplo 1. À molécula B-2036 e a outras moléculas é possível acoplar moléculas de PEG, de preferência por acoplamento covalente, sendo essas moléculas de PEG seleccionadas entre o conjunto constituído por PEG-N-hidroxisuccinimida-5K, PEG-carbonato de succinimidilo-5K, PEG-propionato de succinimidilo-5K, PEG2-malemida-40K (2 x 20K), PEG2-N-hidroxisuccimida-40K (2 x 20K) e PEG2-aldeído-40K (2 x 20K). A quantidade da molécula de PEG acrescentada à molécula B-2036 para peguilação (ou a qualquer outra proteína relevante que necessite de ser peguilada) deve ser tal que a razão estequiométrica em peso entre a quantidade de moléculas de PEG livres (não ligadas) e a quantidade de moléculas de proteína não peguilada esteja compreendida entre cerca de 0,5 e cerca de 100, de preferência entre cerca de 1,5 e cerca de 2,5, mais preferencialmente entre cerca de 1,9 e cerca de 2 e muito mais preferencialmente entre cerca de 1,95 e cerca de 2,05. Durante a peguilação, a molécula B-2036 (ou qualquer outra proteína relevante que se pretenda PEGilar) é peguilada a valores de pH para a peguilação compreendidos entre cerca de 3 e cerca de 10, de preferência entre cerca de 7,2 e cerca de 7,8, mais preferencialmente entre cerca de 7,4 e cerca de 7,8 e muito mais preferencialmente entre cerca de 7,40 e cerca de 7,80. A temperatura a que é executado o passo de peguilação é designada por temperatura de peguilação. A temperatura de peguilação está compreendida entre cerca de 0°C e cerca de 40°C, de preferência entre cerca de 10 °C e cerca de 30 °C e mais preferencialmente entre cerca de 18°C e cerca de 25°C. 50
Aludindo agora ao passo 2 de HIC facultativo, os parâmetros preferíveis para a execução deste passo estão indicados no Exemplo 1 e no fluxograma 1. Durante o passo 2 de cromatografia HIC, facultativo, a proteína peguilada e qualquer proteína não peguilada são carregadas sobre a resina de HIC para uma carga de HIC ^ a cerca de 10 g de proteína por litro de volume de leito compactado de resina de HIC, de preferência < a cerca de 5 g de proteína por litro de volume de leito compactado de resina de HIC ou ^ a cerca de 4,1 g de proteína por litro de volume de leito compactado de resina de HIC. Por outro lado, a condutividade da carga de HIC está compreendida entre cerca de 30 e cerca de 60 mS/cm, de preferência entre cerca de 40 e cerca de 52 mS/cm ou mais preferencialmente entre cerca de 45 e cerca de 51 mS/cm. Mais ainda, o passo de HIC é efectuado a uma temperatura de HIC compreendida entre cerca de 10 e cerca de 40°C, de preferência entre cerca de 15 e cerca de 30°C e mais preferencialmente entre cerca de 18 e cerca de 25°C. O passo 2 de HIC, facultativo, remove pelo menos algum PEG livre, proteína não peguilada e proteína agregada, presentes na carga de HIC. A seguir ao passo 2 de HIC, obtém-se uma mistura de HIC. A mistura de HIC é depois submetida a um passo 3 de ultrafiltração/diafiltração que é facultativo, na medida em que no caso o passo 2 de HIC ser realizado, então o passo de ultrafiltração/diafiltração também é efectuado. No entanto, se o passo 2 de HIC não for realizado, então não há nenhuma necessidade de se realizar o passo 3 de ultrafiltração/diafiltração. Em alternativa, o passo 3 de ultrafiltração/diafiltração pode ser executado na ausência do passo 2 de HIC facultativo. As condições preferenciais 51 para a execução do passo 3 de ultrafiltração/diafiltração estão explicitadas no Exemplo 1 e no fluxograma 1. Aqui, este passo é designado por UF/DF #3. 0 passo UF/DF #3 é executado com uma membrana de UF/DF #3 que possui um peso molecular critico (PMC) compreendido entre cerca de 3 kDa e cerca de 20 kDa, de preferência entre cerca de 8 kDa e cerca de 15 kDa, mais preferencialmente entre cerca de 10 kDa e cerca de 12 kDa, sendo muito mais preferencialmente igual a cerca de 10 kDa.
Após o passo 3, o produto obtido nesta altura é designado por mistura de diafiltraçâo. Esta mistura de diafiltração é depois submetido ao passo 4 que é o passo de cromatografia de permuta de aniões e de colheita das diversas fracções. As condições preferíveis para a execução desta cromatografia AEX e para o passo de colheita das fracções estão indicadas no Exemplo 1 e no fluxograma 1. A mistura de diafiltração do passo anterior (isto é, do passo 3), ou a proteína peguilada (v.g., B-2036 PEG do passo 1, se os passos 2 e 3 não tiverem sido efectuados) é submetida ao passo 4. Na realidade, sem o processamento de HIC do passo 2, a mistura de diafiltração do passo 3 que contém B-2036 PEG ou B-2036 PEG do passo 1 é carregada numa resina de permuta de aniões conjuntamente com qualquer PEG livre, qualquer proteína peguilada, qualquer proteína não peguilada, qualquer proteína parcialmente peguilada e quaisquer impurezas (tais como a impureza trissulfureto ou a impureza des-phe) e todos os seus agregados.
De preferência, a resina utilizada é uma resina de permuta de aniões (AEX). As resinas AEX preferíveis compreendem, mas sem que isso constitua qualquer limitação, as seleccionadas entre ANX4, DEAE, Q-Sepharose, Q-Sepharose 52 FF, Q-Sepharose HP e Q-Sepharose XL. A resina AEX preferida é a resina Q-Sepharose FF.
De preferência, a resina AEX possui grupos funcionais seleccionados entre o conjunto constituído por aminas primárias, secundárias, terciárias e quaternárias e suas combinações. Além disso, a resina AEX possui grupos funcionais seleccionados entre o conjunto constituído por grupos funcionais dietilaminoetilo, dietilaminopropilo, dimetiletanolamina, trimetil-amónio-etilo, trimetilbenzil-amónio, dimetiletanol-benzilo e poliaminas. Por outro lado, a resina AEX compreende, preferencialmente, um material de suporte seleccionado entre o conjunto constituído por poliéteres hidrofílicos, divinil-benzeno-polistireno reticulado, agarose reticulada, polipropileno, acrilamidovinilo hidrofílico, metacrilato, hidrogel polimerizado com uma base de esférulas de cerâmica, material misto de sílica-dextrano, sílica enxertada com polímeros, divinil-benzeno-estireno, divinil-benzeno poliacrílico, celulose reticulada, metacrilato co-polimérico, polistireno, acrilato, gel hidrofílico G5000 e celulose. Além disso, também é preferível utilizar uma resina AEX que seja uma resina macroporosa ou uma resina em gel. De uma forma típica, o material de suporte tem um diâmetro compreendido entre cerca de 10 e cerca de 500 ym e, preferencialmente, é de cerca de 30 pm. O carregamento de AEX é efectuado a valores da condutividade do carregamento de AEX que é ^ a cerca de 10 mS/cm, de preferência < a cerca de 5 mS/cm e mais preferencialmente ê a cerca de 2,4 mS/cm. A resina de AEX é carregada a valores de pH de carregamento de AEX compreendidos entre cerca de 5 e cerca de 10, de preferência entre cerca de 6,6 e cerca de 9 e mais preferencialmente entre cerca de 6,9 e cerca de 7,1. 53 A carga da proteína peguilada, incluindo quaisquer impurezas, tais como a impureza trissulfureto ou a impureza des-phe ou os seus agregados, é tal que a carga de AEX é 1 10 g de proteína/L de volume de leito compactado de resina de AEX, de preferência ^ 5,5 g de proteína/L de volume de leito compactado de resina de AEX e mais preferencialmente < 4,1 g proteína/L de volume de leito compactado de resina de AEX.
De acordo com uma variante, a proteína peguilada que é carregada sobre a resina de AEX, ou que é fornecida no primeiro passo em que se faz o fornecimento de proteína peguilada, contém uma ou mais isoformas de proteína peguilada seleccionadas entre PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8, PEG-9 ou quaisquer agregados, sua impureza trissulfureto e sua impureza des-phe e quaisquer impurezas não peguiladas da proteína peguilada e quaisquer moléculas de PEG livres.
De acordo com uma outra variante, a proteína peguilada que é carregada sobre resina de AEX, ou que é fornecida no primeiro passo em que se faz o fornecimento de uma proteína peguilada, contém uma ou várias isoformas de proteína peguilada, seleccionadas entre PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 ou quaisquer agregados, sua impureza trissulfureto e sua impureza des-phe e quaisquer impurezas não peguiladas da proteína peguilada e quaisquer moléculas de PEG livres.
De acordo com uma outra variante, a proteína peguilada, que é carregada sobre a resina de AEX ou que é fornecida no primeiro passo em que se faz o fornecimento de uma proteína peguilada, contém uma ou várias isoformas de proteína peguilada, seleccionadas entre PEG-2, PEG-3, PEG- 54 4, PEG-5, PEG-β, PEG-7, PEG-8 ou quaisquer agregados, sua impureza trissulfureto e sua impureza des-phe e quaisquer impurezas não peguiladas da proteína peguilada e quaisquer moléculas de PEG livres.
De acordo com uma outra variante, a proteína peguilada, que é carregada sobre a resina de AEX ou que é fornecida no primeiro passo em que se faz o fornecimento de uma proteína peguilada, contém uma ou várias isoformas de proteína peguilada, seleccionadas entre PEG-3, PEG-4, PEG- 5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 ou quaisquer agregados, sua impureza trissulfureto e sua impureza des-phe e quaisquer impurezas não peguiladas da proteína peguilada e quaisquer moléculas de PEG livres.
De acordo com uma outra variante, a proteína peguilada, que é carregada sobre a resina de AEX ou que é fornecida no primeiro passo em que se faz o fornecimento de uma proteína peguilada, contém uma ou várias isoformas de proteína peguilada, seleccionadas entre PEG-4, PEG-5, PEG- 6, PEG-7, PEG-8 ou quaisquer agregados, sua impureza trissulfureto e sua impureza des-phe e quaisquer impurezas não peguiladas da proteína peguilada e quaisquer moléculas de PEG livres.
De acordo com uma outra variante, a proteína peguilada, que é carregada sobre a resina de AEX ou que é fornecida no primeiro passo em que se faz o fornecimento de uma proteína peguilada, contém uma ou várias isoformas de proteína peguilada, seleccionadas entre PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7 ou quaisquer agregados, sua impureza trissulfureto e sua impureza des-phe e quaisquer impurezas não peguiladas da proteína peguilada e quaisquer moléculas de PEG livres. 55
De acordo com uma outra variante, a proteína peguilada, que é carregada sobre a resina de AEX ou que é fornecida no primeiro passo em que se faz o fornecimento de uma proteína peguilada, contém uma ou várias isoformas de proteína peguilada, seleccionadas entre PEG-4, PEG-5, PEG-6 ou quaisquer agregados, sua impureza trissulfureto e sua impureza des-phe e quaisquer impurezas não peguiladas da proteína peguilada e quaisquer moléculas de PEG livres.
De acordo com uma outra variante, a proteína peguilada, que é carregada sobre a resina de AEX ou que é fornecida no primeiro passo em que se faz o fornecimento de uma proteína peguilada, contém uma ou várias isoformas de proteína peguilada, seleccionadas entre PEG-4, PEG-5, PEG-6 ou quaisquer agregados, sua impureza trissulfureto e sua impureza des-phe e quaisquer impurezas não peguiladas da proteína peguilada.
De acordo com uma outra variante, a proteína peguilada, que é carregada sobre a resina de AEX ou que é fornecida no primeiro passo em que se faz o fornecimento de uma proteína peguilada, contém uma ou várias isoformas de proteína peguilada, seleccionadas entre PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9 ou quaisquer agregados, sua impureza trissulfureto e sua impureza des-phe .
De acordo com uma outra variante, a proteína peguilada, que é carregada sobre a resina de AEX ou que é fornecida no primeiro passo em que se faz o fornecimento de uma proteína peguilada, contém uma ou várias isoformas de proteína peguilada, seleccionadas entre PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9 ou quaisquer agregados e sua impureza trissulfureto. 56
De acordo com uma outra variante, a proteína peguilada, que é carregada sobre a resina de AEX ou que é fornecida no primeiro passo em que se faz o fornecimento de uma proteína peguilada, contém uma ou várias isoformas de proteína peguilada, seleccionadas entre PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9 e quaisquer agregados. A proteína peguilada, conjuntamente com qualquer agregado, suas impurezas trissulfureto e/ou des-phe, quaisquer proteínas não peguiladas ou parcialmente peguiladas e quaisquer moléculas de PEG livres, é submetida, após carregamento sobre a resina de AEX, a um procedimento de eluição com uma solução de eluição durante um passo de eluição seguido pela recolha do eluente em fracções múltiplas. As fracções referidas são fracções em volume, relativamente ao volume da coluna. 0 passo de eluição pode ser efectuado quer em gradiente de pH quer em gradiente de potência iónica. Se a eluição for efectuada com um gradiente de potência iónica, então a eluição é feita com uma solução salina num tampão de eluição contendo um sal iónico com uma concentração salina suficiente para fazer a eluição da proteína peguilada carregada, a partir da resina de AEX. De preferência, o sal iónico é um sal cloreto. Mais preferencialmente, o sal iónico é seleccionado entre o conjunto constituído por NaCl, cloreto de lítio, fosfato de Na, sulfato de Na, cloreto de amónio, sulfato de amónio, fosfato de amónio, Kl e KC1. Há outros sais iónicos, adequados para utilização com as resinas de AEX, que são incorporados conforme aqui explicitado. De preferência, o sal iónico é o cloreto de sódio fornecido num tampão. Durante a eluição, com uma solução salina 57 fornecida num tampão de eluição, o gradiente de concentração salina {v.g., para uma solução de sal NaCl) está compreendido entre cerca de 2 e cerca de 50 mM por VC, de preferência entre cerca de 5 e cerca de 25 mM por VC e mais preferencialmente entre cerca de 10 e cerca de 20 mM por VC e muito mais preferencialmente entre cerca de 10 e cerca de 12,5 mM por VC. O tampão de eluição, em que a solução salina é fornecida, tem valores de pH compreendidos entre cerca de 5 e cerca de 10, de preferência entre cerca de 6,6 e cerca de 9 e mais preferencialmente entre cerca de 6,9 e cerca de 7,1. Por outro lado, o passo de eluição é efectuado a uma temperatura de eluição ^ a cerca de 50 °C, de preferência ^ a cerca de 35°C, mais preferencialmente entre cerca de 2 e cerca de 30°C, ainda mais preferencialmente entre cerca de 15 e cerca de 30°C e ainda muito mais preferencialmente entre cerca de 18 e cerca de 25°C. O tampão de eluição, contendo a solução salina, é introduzido na coluna com a resina de AEX e passa através da coluna com uma velocidade linear ^ 300 cm/hora, de preferência compreendida entre cerca de 10 e cerca de 150 cm/hora, mais preferencialmente entre 30 e cerca de 100 cm/hora, ainda mais preferencialmente entre cerca de 50 e cerca de 100 cm/hora, muito mais preferencialmente entre cerca de 50 e cerca de 70 cm/hora, ainda muito mais preferencialmente entre cerca de 60 e cerca de 65 cm/hora e muitíssimo mais preferencialmente a cerca de 60 cm/hora.
Ao recolher-se o eluente proveniente da resina de AEX, é preferível colhê-lo em fracções de volume múltiplas, compreendidas entre cerca de 0,1 e cerca de 5 volumes de coluna (VC), de preferência fracções compreendidas entre 58 cerca de 0,1 e cerca de 1 VC, mais preferencialmente fracções entre cerca de 0,1 e cerca de 0,5 VC e muito mais preferencialmente fracções entre cerca de 0,1 e cerca de 0,2 VC. Assim, por exemplo, é possível recolher 100 fracções independentes, podendo este número ser menor ou maior, dependendo isso da quantidade total de solução salina e de tampão eluente a passar através da resina de AEX para recolha das diversas fracções de VC. Faz-se observar que as fracções de VC são recolhidas sequencialmente, à medida que o eluente vai sendo recolhido na saída da coluna de AEX (tipicamente no fundo da coluna de AEX).
Cada uma das fracções de VC recolhidas irá conter, preferencialmente, uma determinada isoforma de proteína peguilada, por exemplo, PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9. As fracções de VC recolhidas são depois submetidas a uma operação de combinação de fracções para se determinar qual a fracção que contém uma determinada isoforma de proteína peguilada e para permitir depois que se faça uma combinação selectiva das isoformas de proteínas peguiladas desejadas que foram recolhidas. b. Combinação de fracções
Assim, as fracções de VC recolhidas a partir da resina de AEX são depois submetidas a um passo de combinação de fracções para se seleccionar quantidades discretas das isoformas de proteínas peguiladas, tais como PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9. É possível recorrer a diversas técnicas analíticas para combinar, selectivamente, as isoformas de proteínas 59 peguiladas desejadas. Estas técnicas compreendem, mas sem que isso constitua qualquer limitação, CE, SDS-PAGE, cromatografia de IEX, cromatografia de HIC, cromatografia de AEX, cromatografia de CEX, RPHPLC, SEHPLC, cromatografia por afinidade (AC) e suas combinações. Preferem-se quer a CE quer a RPHPLC em relação SDS-PAGE. Por outro lado, sem se pretender impor qualquer limitação de natureza teórica, admite-se que o reagente (v.g., dodecil-sulfato de sódio), utilizado no ensaio SDS-PAGE, deturpe a medição de qualquer agregado que se tenha formado. Admite-se que o dodecil-sulfato de sódio (SDS), utilizado no ensaio de SDS-PAGE, destrua o agregado, de tal modo que seja medida uma quantidade reduzida de agregado ou que até nem seja mesmo medida nenhuma quantidade de agregado. No entanto, o ensaio de SDS-PAGE pode ser utilizado com êxito para caracterizar (v.g., determinar a composição qualitativa e quantitativa de PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9 de uma fracção recolhida) as proteínas peguiladas individuais. Quando a análise por CE é efectuada para combinação de fracções, essa análise é realizada a uma temperatura de CE compreendida entre cerca de 5 e cerca de 50°C, de preferência entre cerca de 5 e cerca de 45°C, mais preferencialmente entre cerca de 20 e cerca de 40°C e muito mais preferencialmente entre cerca de 30 e cerca de 32°C.
Ainda no caso de se utilizar o procedimento de CE, então esse procedimento de CE é efectuado com uma condutividade da combinação de fracções por CE (trata-se da condutividade da fracção da amostra) compreendida entre cerca de 0 e cerca de 60 mS/cm e mais preferencialmente entre cerca de 5 e cerca de 10 mS/cm. A fracção da amostra, que possui uma condutividade contida no intervalo de 60 condutividade de combinação de fracções por CE anteriormente referido, é depois introduzida no capilar de CE para identificação da proteina peguilada. A curva caracteristica da isoforma de proteina peguilada assim obtida, respeitante à fracção de VC relevante, é comparada com um padrão de referência para se identificar a isoforma de proteina peguilada particular presente na amostra. O valor percentual da área, obtido para cada máximo caracteristico da curva de caracterização, é proporcional à percentagem (%) em peso da isoforma correspondente a esse máximo nessa fracção. Depois, a fracção assim identificada por CE, contendo a isoforma de proteina peguilada desejada, com a percentagem em peso desejada da isoforma, é misturada, facultativamente, com outras fracções escolhidas de modo semelhante, para se obter a mistura pretendida de isoformas. Esta operação de processamento proporciona a composição do IFA.
Ver, por exemplo, Swapan K. Chowdhury et al., "Fingerprinting Proteins Coupled with Polymers by Mass Spectrometry: Investigation of Polyethylene Glycol-Conjugated Superoxide Dismutase," American Society for Mass Spectrometry, Vol. 6, pp. 478-487, 1995.
Para se efectuar a análise de CE na fracção de VC recolhida, a concentração da proteina peguilada no tampão é pelo menos igual a cerca de 0,2 mg/ml, pelo menos cerca de 0,5 mg/ml, entre cerca de 0,1 e cerca de 100 mg/ml, entre cerca de 0,5 e cerca de 10 mg/1 ou entre cerca de 2 e cerca de 3 mg/ml. Utilizando a análise de CE ou quaisquer das técnicas de análise supramencionadas para a combinação de fracções, é possível combinar diversas isoformas de proteínas peguiladas para se obter uma mistura desejada da 61 proteína peguilada. Assim, por exemplo, uma mistura de proteína peguilada pode conter uma ou mais das isoformas PEG-1 até PEG-9, uma ou mais das isoformas PEG-2 até PEG-9, uma ou mais das isoformas PEG-3 até PEG-9, uma ou mais das isoformas PEG-3 até PEG-8, uma ou mais das isoformas PEG-3 até PEG-7, uma das isoformas PEG-3 até PEG-6, uma ou mais das isoformas PEG-4 até PEG-β, uma ou mais das isoformas PEG-4 e PEG-5, uma ou mais das isoformas PEG-5 e PEG-6 ou a isoforma PEG-5.
Entre as misturas referidas antes, são preferíveis diversas misturas de proteínas peguiladas. Por exemplo, no que diz respeito a uma mistura de PEG-4, PEG-5 e PEG-6, tal mistura de PEG-4, PEG-5 e PEG-6 deve conter pelo menos 70% em peso de PEG-4, PEG-5 e PEG-6 com base no peso total das isoformas de proteínas peguiladas existentes no lote particular. De preferência, a fracção de proteínas peguiladas de PEG-4, PEG-5 e PEG-6 constitui pelo menos por cerca de 75% em peso, com base no peso total das isoformas de proteínas peguiladas existentes na mistura. Mais preferencialmente, este valor é pelo menos igual a cerca de 80% em peso, pelo menos igual a cerca de 85% em peso, pelo menos igual a cerca de 90% em peso e pelo menos igual a cerca de 94% em peso, pelo menos igual a cerca de 95% em peso, pelo menos igual a cerca de 96% em peso, pelo menos igual a cerca de 97% em peso, pelo menos igual a cerca de 98% em peso, pelo menos igual a cerca de 99% em peso, pelo menos igual a cerca de 99,5% em peso e pelo menos igual a cerca de 99,9% em peso.
Para a preparação das misturas, o procedimento de preparação é efectuado com isoformas de proteínas peguiladas recolhidas nas fracções de VC em que as 62 isoformas de proteínas peguiladas são fornecidas num tampão. Esse tampão, no qual as isoformas de proteínas peguiladas são fornecidas, tem um pH compreendido entre cerca de 5 e cerca de 10, de preferência entre cerca de 6,6 e cerca de 9 e mais preferencialmente entre cerca de 6,9 e cerca de 7,1. Além disso, o tampão é seleccionado entre o conjunto constituído por Tris, fosfato, HEPES, ácido cítrico, trietilamina e histidina.
Nesta altura, as isoformas de proteínas peguiladas, reunidas nas misturas, de acordo com a metodologia supramencionada (também descrita nos Exemplos 1, 3 e 4, mais adiante) devem ser tais que o nível de agregação do produto combinado seja menor ou igual cerca de 10% em peso, com base no peso total das isoformas de proteínas peguiladas e de todos os seus agregados que tenham sido submetidos aos passos 1-5 anteriormente enunciados, sendo os passos 2 e 3 facultativos. De preferência, o nível de agregação é menor ou igual cerca de 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1,5%, 1%, 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6%, 0,5%, 0,4%, 0,3%, 0,2%, 0,1%, 0,05% e 0,01% em peso, com base no peso total supramencionado. A proteína peguilada, assim reunida, é constituída essencialmente por uma ou mais das isoformas PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9. A proteína peguilada, assim reunida, é constituída essencialmente por uma ou mais das isoformas PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9. A proteína peguilada, assim reunida, é constituída preferencial e essencialmente por uma ou mais das isoformas PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9. A proteína peguilada, assim reunida, é constituída preferencial e essencialmente 63 por uma ou mais das isoformas PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7 e PEG-8. A proteína peguilada, assim reunida, é constituída preferencial e essencialmente por uma ou mais das isoformas PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6 e PEG-7. A proteína peguilada, assim reunida, é constituída preferencial e essencialmente por uma ou mais das isoformas PEG-3, PEG-4, PEG-5 e PEG-6. A proteína peguilada, assim reunida, é constituída preferencial e essencialmente por uma ou mais das isoformas PEG-4, PEG-5 e PEG-6. A proteína peguilada, assim reunida, é constituída preferencial e essencialmente por uma ou mais das isoformas PEG-4 e PEG-5. A proteína peguilada, assim reunida, é constituída preferencial e essencialmente por uma ou mais das isoformas PEG-5 e PEG-6. A proteína peguilada, assim reunida, é constituída preferencial e essencialmente por uma ou várias das isoformas PEG-5. A metodologia de combinação das fracções supramencionada pode ser utilizada para preparar misturas de isoformas de proteínas peguiladas, independentemente de tais isoformas terem sido ou não submetidas a cromatografia de permuta de aniões.
No caso de a proteína peguilada ser um antagonista da hormona de crescimento peguilada, é preferível que o nível de agregação seja ^ a 6% em peso, com base no peso total das isoformas de antagonista peguilado da hormona de crescimento e quaisquer seus agregados existentes na mistura ou na fracção de VC recolhida. Mais preferencialmente, o nível de agregação é ^ a cerca de 5%, 4%, 3%, 2% e 1% em peso, com base no peso total supramencionado. Além disso, se a proteína peguilada for um antagonista peguilado da hormona de crescimento, com 64 diversas das suas isoformas, o "nível total" de uma soma de quaisquer impurezas trissulfureto, quaisquer impureza des-phe e de quaisquer seus agreqados é, preferencialmente, um nível < a cerca de 15% em peso, com base num peso total das isoformas do antagonista peguilado da hormona de crescimento, quaisquer impurezas trissulfureto, quaisquer impurezas des-phe e quaisquer seus agregados existentes na mistura ou na fracção de VC recolhida. De preferência, o nível total supramencionado (de uma soma de quaisquer impurezas trissulfureto, quaisquer impurezas des-phe e qualquer seu agregado) é < a cerca de 12%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% e 1% em peso, com base no peso total.
De preferência, no caso de o antagonista peguilado da hormona de crescimento ser a proteína B-2036 PEG, a sua estrutura polipeptídica é B-2036 de SEQ. ID NO. 1.
Após o passo de cromatografia AEX e de preparação das misturas, executa-se um passo 5 subsequente de ultrafiltração/ diafiltração. Os parâmetros preferíveis para a execução deste passo de UF/DF estão explicitados no Exemplo 1 e no fluxograma 1. No final do passo 5, recolhe-se uma mistura de diafiltração. Esta mistura de diafiltração é depois submetida ao passo 6 que consiste em remover o ingrediente farmacêutico activo assim obtido na mistura de diafiltração supramencionada e, preferencialmente, esterilizá-la, por filtração através de um filtro de 0,22 ym. Os parâmetros preferíveis para a execução do passo 6 de filtração do IFA estão explicitados no Exemplo 1 e no fluxograma 1.
Finalmente, no Exemplo 1 subsequente, é apresentado um processo preferencial da invenção reivindicada em que estão explicitados os pormenores de cada um dos passos 1-6 65 supramencionados, utilizando um passo de cromatografia em resina de permuta de aniões. Para efeitos de comparação, é apresentado o exemplo 2 de comparação em que o passo de cromatografia de permuta de aniões é substituído por um passo de cromatografia de permuta de catiões conjuntamente com o passo de permuta por um tampão conveniente, que lhe está associado. Os resultados do processo do Exemplo 2 estão transpostos para o Quadro 2 em que os níveis de agregação variam entre valores compreendidos entre proporções elevadas de cerca de 60% e proporções diminutas de cerca de 6% de agregado, relativamente ao peso. O Exemplo 3 descreve uma metodologia de preparação de misturas que é aplicável quer ao exemplo 1 e ao processo do fluxograma 1, quer ao exemplo 2 e ao processo do fluxograma 2, em que se recorre a RPHPLC como técnica analítica que é comparada com a técnica analítica de CE. As figuras 2, 3 e 4 comprovam que a RPHPLC é equivalente à CE. O Exemplo 4 descreve processos preferenciais para a técnica analítica de CE.
VARIANTES DA INVENÇÃO 1. Um processo para diminuir o nível de agregação de um antagonista peguilado da hormona de crescimento e das suas isoformas, em que o referido processo compreende os passos seguintes: (a) arranjar o referido antagonista peguilado da hormona de crescimento e suas isoformas; (b) com o referido antagonista peguilado da hormona de crescimento e suas isoformas, incluindo quaisquer impurezas e quaisquer seus agregados, carregar uma resina de permuta 66 de aniões (AEX), em que o carregamento é efectuado para uma condutividade inferior ou igual a cerca de 10 mS/cm, para valores de pH compreendidos entre cerca de 5 e cerca de 10, e com uma concentração da proteína inferior ou igual a cerca de 10 g de proteína /L de volume de leito compactado de resina AEX; e (c) separar o referido antagonista peguilado da hormona de crescimento e suas isoformas por cromatografia AEX. 2. O processo da variante 1, em que a referida resina AEX é seleccionada entre o conjunto constituído por ANX4™, DEAE™, Q-Sepharose™, Q-Sepharose FF™, Q-Sepharose HP™ e Q-Sepharose XL™. 3. O processo da variante 1 ou da variante 2, em que, no passo (b) , o carregamento é efectuado para uma condutividade inferior ou igual a cerca de 5 mS/cm. 4. O processo da variante 1 ou da variante 2, em que, no passo (b) , o carregamento é efectuado para uma condutividade inferior ou igual a cerca de 2,4 mS/cm. 5. O processo de acordo com uma qualquer das variantes 1 a 4, em que o passo (b) é efectuado a valores de pH do carregamento de AEX compreendidos entre cerca de 6,6 e cerca de 9. 6. O processo de acordo com uma qualquer das variantes 1 a 4, em que o passo (b) é efectuado a valores de pH do carregamento de AEX compreendidos entre cerca de 6,9 e cerca de 7,1. 7. O processo da variante 1, em que o referido antagonista peguilado da hormona de crescimento compreende uma ou várias das referidas isoformas do antagonista 67 peguilado da hormona de crescimento, seleccionado entre o conjunto constituído por: PEG-1 (uma molécula de antagonista da hormona do crescimento com uma molécula de ; PEG ou uma sua variante) - PEG-2 (uma molécula de antagonista da hormona do crescimento com duas moléculas de PEG ou uma sua variante), PEG-3 (uma molécula de antagonista da hormona do crescimento com três moléculas de PEG ou uma sua variante), PEG-4 (uma molécula de antagonista da hormona do crescimento com quatro moléculas de PEG ou uma sua variante), PEG-5 (uma molécula de antagonista da hormona do crescimento com cinco moléculas de PEG ou uma sua variante), PEG-6 (uma molécula de antagonista da hormona do crescimento com seis moléculas de PEG ou uma sua variante), PEG-7 (uma molécula de antagonista da hormona do crescimento com sete moléculas de PEG ou uma sua variante), PEG-8 (uma molécula de antagonista da hormona do crescimento /~N com oito moléculas de PEG ou uma sua variante), PEG-9 (uma molécula de antagonista da hormona do crescimento com nove moléculas de PEG ou uma sua variante), e quaisquer seus agregados, impurezas trissulfureto e impurezas des-phe e também quaisquer impurezas não peguiladas do referido antagonista da hormona do crescimento e quaisquer moléculas de PEG livres. 8. 0 processo da variante 1, o qual compreende também um passo (d) de mistura de fracções, em que são preparadas quantidades discretas de misturas de isoformas do antagonista peguilado da hormona de crescimento, para se 68 obter uma mistura de antagonista peguilado da hormona de crescimento por meio de uma técnica seleccionada entre o conjunto constituído por: electroforese capilar (CE), electroforese em gel de poliacrilamida com dodecil-sulfato de sódio (SDS-PAGE), cromatografia de permuta de iões (IEX), cromatografia de interacção hidrofóbica (HIC), cromatografia de permuta de aniões (AEX), cromatografia de permuta de catiões (CEX), cromatografia em líquido de alto rendimento de fase inversa (RPHPLC), cromatografia em líquido de elevado rendimento de exclusão dimensional (SEHPLC), cromatografia por afinidade (AC) e suas combinações. 9. 0 processo da variante 8, em que o referido antagonista peguilado da hormona de crescimento combinado compreende uma ou várias das isoformas PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9. 10. 0 processo da variante 9, em que um antagonista peguilado da hormona de crescimento combinado ou uma fracção de antagonista peguilado da hormona de crescimento, contendo PEG-4, PEG-5 e PEG-6 constitui pelo menos cerca de 70% em peso, com base num peso total das referidas isoformas do antagonista peguilado da hormona de crescimento PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9 e de quaisquer seus agregados. 11. O processo da variante 1, em que o referido nível reduzido do referido agregado é inferior ou igual a cerca de 10% em peso, com base num peso total das referidas isoformas e do referido agregado.
Estão adiante explicitadas algumas outras variantes que são enumeradas com a finalidade de permitir uma compreensão geral da invenção reivindicada. 69 1. Um processo para diminuir o nivel de agregação de isoformas de proteínas peguiladas, compreendendo o referido processo os passos seguintes: (a) arranjar as referidas isoformas de proteínas peguiladas; e (c) separar as referidas isoformas de proteínas peguiladas por cromatografia de permuta de aniões, utilizando uma resina de permuta de aniões em condições suficientes para diminuir o referido nível da referida agregação. 2. 0 processo da variante 1, em que o referido passo (a) compreende o passo (al) de PEGilar uma forma não peguilada ou parcialmente peguilada da referida proteína, ou em PEGilar ambas. 3. 0 processo da variante 2, em que o referido passo (al) consiste em PEGilar com PEG livre, seleccionado entre o conjunto constituído por PEG-N-hidroxisuccinimida-5K, PEG-carbonato de succinimidilo-5K, PEG-propionato de succinimidilo-5K, PEG2-malemida-40K (2 x 20K), PEG2-N-hidroxisuccimida-40K (2 x 20K) e PEG2-aldeído-40K (2 x 20K) . 4. 0 processo da variante 3, em que a razão estequiométrica em peso entre a referida PEG livre e a referida proteína não peguilada está compreendida entre cerca de 0,5 e cerca de 100. 5. O processo da variante 4, em que a referida razão estequiométrica em peso está compreendida entre cerca de 1,5 e cerca de 2,5. 6. O processo da variante 5, em que a referida razão estequiométrica em peso está compreendida entre cerca de 1,9 e cerca de 2. 70 7. O processo da variante 6, em que a referida razão estequiométrica em peso está compreendida entre cerca de 1,95 e cerca de 2,05. 8. O processo da variante 2, em que o referido passo de peguilação (al) é efectuado a valores de pH de peguilação compreendidos entre cerca de 3 e cerca de 10. 9. O processo da variante 8, em que o referido valor de pH da peguilação está compreendido entre cerca de 7,2 e cerca de 7,8. 10. O processo da variante 9, em que o referido valor de pH da peguilação está compreendido entre cerca de 7,4 e cerca de 7,8. 11. 0 processo da variante 10, em que o referido valor de pH da peguilação está compreendido entre cerca de 7,40 e cerca de 7,80. 12. O processo da variante 2, em que o referido passo de peguilação (al) é efectuado a uma temperatura de peguilação compreendida entre cerca de 0 e cerca de 40°C. 13. O processo da variante 12, em que a referida temperatura de peguilação está compreendida entre cerca de 10 e cerca de 30°C. 14. O processo da variante 13, em que a referida temperatura de peguilação está compreendida entre cerca de 18 e cerca de 25°C. 15. O processo da variante 1, o qual compreende também um passo (a2) de HIC facultativo, que consiste em seleccionar a referida proteína peguilada por cromatografia de interacção hidrofóbica (HIC), utilizando uma resina de HIC. 16. O processo da variante 2, o qual compreende também um passo (a2) de HIC facultativo, que consiste em 71 seleccionar a referida proteína peguilada por cromatografia de interacção hidrofóbica (HIC), utilizando uma resina de HIC. 17. 0 processo da variante 16, em que o referido passo (a2) de HIC consiste em carregar a referida proteína peguilada e quaisquer proteínas não peguiladas sobre a referida resina de HIC, para uma carga de HIC inferior ou igual a cerca de 10 g de proteína/L de volume de leito compactado de resina de HIC. 18. O processo da variante 17, em que a referida carga de HIC é inferior ou igual a cerca de 5 g de proteína/L de volume de leito compactado de resina de HIC. 19. 0 processo da variante 18, em que a referida carga de HIC é inferior ou igual a cerca de 4,1 g de proteína/L de volume de leito compactado de resina de HIC. 20. O processo da variante 17, em que o carregamento, no referido passo (a2) de HIC, é efectuado para uma condutividade de carregamento de HIC compreendida entre cerca de 30 e cerca de 60 mS/cm. 21. O processo da variante 20, em que a referida condutividade de carregamento de HIC está compreendida entre cerca de 40 e cerca de 52 mS/cm. 22. O processo da variante 21, em que a referida condutividade de carregamento de HIC está compreendida entre cerca de 45 e cerca de 51 mS/cm. 23. O processo da variante 17, em que o referido passo (a2) de HIC é efectuado a uma temperatura de HIC compreendida entre cerca de 10 e cerca de 40°C. 24. O processo da variante 23, em que a referida temperatura de HIC está compreendida entre cerca de 15 e cerca de 30°C. 72 25. 0 processo da variante 24, em que a referida temperatura de HIC está compreendida entre cerca de 18 e cerca de 25°C. 26. 0 processo da variante 16, o qual compreende também um passo (a3) de UF/DF#3 de ultrafiltração/ diafiltração (UF/DF#3) de um eluente proveniente do referido passo (a2) de HIC. 27. 0 processo da variante 26, em que o referido passo (a3) de UF/DF#3 é efectuado com uma membrana de UF/DF#3 em que essa membrana de UF/DF#3 possui um peso molecular critico (PMC) compreendido entre cerca de 3 kDa e cerca de 20 kDa. 28. O processo da variante 27, em que o referido PMC da membrana de UF/DF#3 está compreendido entre cerca de 8 kDa e cerca de 15 kDa. 29. O processo da variante 28, em que o referido PMC da membrana de UF/DF#3 está compreendido entre cerca de 10 kDa e cerca de 12 kDa. 30. 0 processo da variante 29, em que o referido PMC da membrana de UF/DF#3 é igual a cerca de 10 kDa. 31. O processo da variante 1, em que o referido passo (b) compreende também um passo (bl) que consiste em carregar a referida proteína peguilada, incluindo quaisquer suas impurezas e quaisquer seus agregados, sobre a referida resina de permuta de aniões (AEX) para proporcionar a proteína peguilada carregada. 32. O processo da variante 31, em que a referida resina AEX é seleccionada entre o conjunto constituído por ANX4, DEAE, Q-Sepharose, Q-Sepharose FF, Q-Sepharose HP e Q-Sepharose XL. 73 33. 0 processo da variante 32, em que a referida resina AEX é Q-Sepharose FF. 34. 0 processo da variante 31, em que o referido passo (bl) é efectuado para valores de condutividade de carregamento de AEX inferiores ou iguais a cerca de 10 mS/cm. 35. O processo da variante 34, em que a referida condutividade de carregamento de AEX é inferior ou igual a cerca de 5 mS/cm. 36. O processo da variante 35, em que a referida condutividade de carregamento de AEX é inferior ou igual a cerca de 2,4 mS/cm. 37. O processo da variante 31, em que o referido passo (bl) é efectuado a valores de pH de carregamento de AEX compreendidos entre cerca de 5 e cerca de 10. 38. O processo da variante 37, em que os referidos valores de pH de carregamento de AEX estão compreendidos entre cerca de 6,6 e cerca de 9. 39. O processo da variante 38, em que os referidos valores de pH de carregamento de AEX estão compreendidos entre cerca de 6,9 e cerca de 7,1. 40. O processo da variante 31, em que o referido passo (bl) é efectuado com uma carga de AEX com proteína peguilada, incluindo quaisquer suas impurezas ou quaisquer dos seus referidos agregados, inferior ou igual a cerca de 10 g de proteína/L de volume de leito compactado de resina de AEX. 41. O processo da variante 40, em que a referida carga de AEX é inferior ou igual a cerca de 5,5 g de proteína/L de volume de leito compactado de resina de AEX. 74 42. 0 processo da variante 40, em que a referida carga de AEX é inferior ou igual a cerca de 4,1 g de proteina/L de volume de leito compactado de resina de AEX. 43. O processo da variante 1, em que a referida proteina peguilada compreende uma ou várias das referidas isoformas de proteínas peguiladas PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG- 4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9 e quaisquer seus agregados, impurezas trissulfureto e impurezas des-phe e quaisquer impurezas não peguiladas da referida proteína e quaisquer moléculas de PEG livres. 44. O processo da variante 1, em que a referida proteína peguilada compreende uma ou várias das referidas isoformas de proteínas peguiladas PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG- 5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9 e quaisquer seus agregados, impurezas trissulfureto e impurezas des-phe e quaisquer impurezas não peguiladas da referida proteína e quaisquer moléculas de PEG livres. 45. O processo da variante 1, em que a referida proteína peguilada compreende uma ou várias das referidas isoformas de proteínas peguiladas PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG- 5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e quaisquer seus agregados, impurezas trissulfureto e impurezas des-phe e quaisquer impurezas não peguiladas da referida proteína e quaisquer moléculas de PEG livres. 46. O processo da variante 1, em que a referida proteína peguilada compreende uma ou várias das referidas isoformas de proteínas peguiladas PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG- 6, PEG-7, PEG-8 e quaisquer seus agregados, impurezas trissulfureto e impurezas des-phe e quaisquer impurezas não peguiladas da referida proteína e quaisquer moléculas de PEG livres. 75 47. 0 processo da variante 1, em que a referida proteína peguilada compreende uma ou várias das referidas isoformas de proteínas peguiladas PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e quaisquer seus agregados, impurezas trissulfureto e impurezas des-phe e quaisquer impurezas não peguiladas da referida proteína e quaisquer moléculas de PEG livres. 48. 0 processo da variante 1, em que a referida proteína peguilada compreende uma ou várias das referidas isoformas de proteínas peguiladas PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7 e quaisquer seus agregados, impurezas trissulfureto e impurezas des-phe e quaisquer impurezas não peguiladas da referida proteína e quaisquer moléculas de PEG livres. 49. 0 processo da variante 1, em que a referida proteína peguilada compreende uma ou várias das referidas isoformas de proteínas peguiladas PEG-4, PEG-5, PEG-6 e quaisquer seus agregados, impurezas trissulfureto e impurezas des-phe e quaisquer impurezas não peguiladas da referida proteína e quaisquer moléculas de PEG livres. 50. O processo da variante 1, em que a referida proteína peguilada compreende uma ou várias das referidas isoformas de proteínas peguiladas PEG-4, PEG-5, PEG-6 e quaisquer seus agregados, impurezas trissulfureto e impurezas des-phe e quaisquer impurezas não peguiladas da referida proteína. 51. O processo da variante 1, em que a referida proteína peguilada compreende uma ou várias das referidas isoformas de proteínas peguiladas PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9 e quaisquer seus agregados, impurezas trissulfureto e impurezas des-phe. 52. O processo da variante 1, em que a referida proteína peguilada compreende uma ou várias das referidas 76 isoformas de proteínas peguiladas PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9 e quaisquer seus agregados e impurezas trissulfureto. 53. 0 processo da variante 1, em que a referida proteína peguilada compreende uma ou várias das referidas isoformas de proteínas peguiladas PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9 e quaisquer seus agregados. 54. 0 processo da variante 1, o qual compreende também um passo (c) de preparação de misturas em que são reunidas quantidades discretas das referidas isoformas de proteínas peguiladas para se obter uma mistura de proteína peguilada por meio de uma técnica seleccionada entre o conjunto constituído por electroforese capilar (CE), electroforese em gel de poliacrilamida com dodecil-sulfato de sódio (SDS-PAGE), cromatografia de permuta de iões (IEX) cromatografia de interacção hidrofóbica (HIC), cromatografia de permuta de aniões (AEX), cromatografia de permuta de catiões (CEX), cromatografia em líquido de alto rendimento de fase inversa (RPHPLC), cromatografia em líquido de elevado rendimento de exclusão dimensional (SEHPLC), cromatografia por afinidade (AC) e suas combinações. 55. 0 processo da variante 42, o qual compreende também um passo (c) de preparação de misturas em que são reunidas quantidades discretas das referidas isoformas de proteínas peguiladas para se obter uma mistura de proteína peguilada por meio de uma técnica seleccionada entre o conjunto constituído por electroforese capilar (CE), electroforese em gel de poliacrilamida com dodecil-sulfato de sódio (SDS-PAGE), cromatografia de permuta de iões (IEX) cromatografia de interacção hidrofóbica (HIC), cromatografia de permuta de 77 aniões (AEX), cromatografia de permuta de catiões (CEX), cromatografia em líquido de alto rendimento de fase inversa (RPHPLC), cromatografia em líquido de elevado rendimento de exclusão dimensional (SEHPLC), cromatografia por afinidade (AC) e suas combinações. 56. 0 processo da variante 54, em que o referido passo (c) de preparação de misturas é efectuado pela referida CE a uma temperatura de CE compreendida entre cerca de 5 e cerca de 50°C. 57. O processo da variante 55, em que o referido passo (c) de preparação de misturas é efectuado pela referida CE a uma temperatura de CE compreendida entre cerca de 5 e cerca de 50°C. 58. 0 processo da variante 56, em que a referida temperatura de CE está compreendida entre cerca de 5 e cerca de 45°C. 59. 0 processo da variante 58, em que a referida temperatura de CE está compreendida entre cerca de 20 e cerca de 40°C. 60. 0 processo da variante 59, em que a referida temperatura de CE está compreendida entre cerca de 30 e cerca de 32°C. 61. O processo da variante 56, em que o referido passo (c) de preparação de misturas é efectuado pela referida CE para valores de condutividade de preparação de misturas por CE compreendidos entre cerca de 0 e cerca de 60 mS/cm. 62. O processo da variante 61, em que a referida condutividade de preparação de misturas por CE está compreendida entre cerca de 5 e cerca de 10 mS/cm. 63. O processo da variante 54, em que o referido passo (c) de preparação de misturas é efectuado com as referidas 78 isoformas de proteínas peguiladas fornecidas num tampão para valores de concentração das proteínas pelo menos iguais a cerca de 0,2 mg/mL. 64. O processo da variante 56, em que o referido passo (c) de preparação de misturas é efectuado com as referidas isoformas de proteínas peguiladas fornecidas num tampão para valores de concentração das proteínas pelo menos iguais a cerca de 0,5 mg/mL. 65. O processo da variante 54, em que o referido passo (c) de preparação de misturas é efectuado com as referidas isoformas de proteínas peguiladas fornecidas num tampão para valores de concentração das proteínas entre cerca de 0,1 to e cerca de 100 mg/mL. 66. O processo da variante 65, em que os referidos valores de concentração das proteínas estão compreendidos entre cerca de 0,5 e cerca de 10 mg/mL. 67. O processo da variante 66, em que os referidos valores de concentração das proteínas estão compreendidos entre cerca de 2 e cerca de 3 mg/mL. 68. O processo da variante 56, em que o referido passo (c) de preparação de misturas é efectuado com as referidas isoformas de proteínas peguiladas fornecidas num tampão para valores e concentração das proteínas entre cerca de 0,1 e cerca de 100 mg/mL. 69. O processo da variante 67, em que os referidos valores de concentração das proteínas estão compreendidos entre cerca de 0,5 e cerca de 10 mg/mL. 70. O processo da variante 68, em que os referidos valores de concentração das proteínas estão compreendidos entre cerca de 2 e cerca de 3 mg/mL. 79 71. 0 processo da variante 63, em que as referidas misturas de proteína peguilada contêm uma ou várias proteínas seleccionadas entre PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9. 72. 0 processo da variante 63, em que as referidas misturas de proteína peguilada contêm uma ou várias proteínas seleccionadas entre PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9. 73. 0 processo da variante 63, em que as referidas misturas de proteína peguilada contêm uma ou várias proteínas seleccionadas entre PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9. 74 . 0 processo da variante 63, em que as referidas misturas de proteína peguilada contêm uma ou várias proteínas seleccionadas entre PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7 e PEG-8. 75. 0 processo da variante 63, em que as referidas misturas de proteína peguilada contêm uma ou várias proteínas seleccionadas entre PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6 e PEG-7. 76. 0 processo da variante 63, em que as referidas misturas de proteína peguilada contêm uma ou várias proteínas seleccionadas entre PEG-3, PEG-4, PEG-5 e PEG-6. 77 . 0 processo da variante 63, em que as referidas misturas de proteína peguilada contêm uma ou várias proteínas seleccionadas entre PEG-4, PEG-5 e PEG-6. OO 0 processo da variante 63, em que as referidas misturas de proteína peguilada contêm uma ou várias proteínas seleccionadas entre PEG-4 e PEG-5. 80 79. O processo da variante 63, em que as referidas misturas de proteína peguilada contêm uma ou várias proteínas seleccionadas entre PEG-5 e PEG-6. 80. O processo da variante 63, em que a referida mistura de proteína peguilada contém PEG-5. 81. 0 processo da variante 71, em que uma fracção das proteínas peguiladas PEG-4, PEG-5 e PEG-6 combinada constitui pelo menos cerca de 70% em peso, relativamente ao peso total das referidas isoformas de proteínas peguiladas PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9 e seus agregados. 82. O processo da variante 71, em que uma fracção das proteínas peguiladas PEG-4, PEG-5 e PEG-6 combinada constitui pelo menos cerca de 75% em peso, relativamente ao peso total das referidas isoformas de proteínas peguiladas PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9 e seus agregados. 83. 0 processo da variante 71, em que uma fracção das proteínas peguiladas PEG-4, PEG-5 e PEG-6 combinada constitui pelo menos cerca de 80% em peso, relativamente ao peso total das referidas isoformas de proteínas peguiladas PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9 e seus agregados. 84. 0 processo da variante 71, em que uma fracção das proteínas peguiladas PEG-4, PEG-5 e PEG-6 combinada constitui pelo menos cerca de 90% em peso, relativamente ao peso total das referidas isoformas de proteínas peguiladas PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9 e seus agregados. 85. O processo da variante 71, em que uma fracção das proteínas peguiladas PEG-4, PEG-5 e PEG-6 combinada 81 constitui pelo menos cerca de 94% em peso, relativamente ao peso total das referidas isoformas de proteínas peguiladas PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9 e seus agregados. 86. 0 processo da variante 64, em que o referido tampão em que é fornecida a referida proteína peguilada possui um valor de pH compreendido entre cerca de 5 e cerca de 10. 87. O processo da variante 86, em que o referido tampão tem um valor de pH entre cerca de 6,6 e cerca de 9. 88. O processo da variante 87, em que o referido tampão tem um valor de pH entre cerca de 6,9 e cerca de 7,1. 89. O processo da variante 64, em que o referido tampão em que é fornecida a referida proteína peguilada é seleccionado entre o conjunto constituído por Tris, fosfato, HEPES, ácido cítrico, trietilamina e histidina. 90. O processo da variante 1, em que o referido nível de agregados é inferior ou igual a cerca de 10% em peso, relativamente a um peso total das referidas isoformas e dos referidos agregados. 91. O processo da variante 90, em que o referido nível dos referidos agregados é inferior ou igual a cerca de 9% em peso, relativamente ao referido peso total. 92. O processo da variante 91, em que o referido nível dos referidos agregados é inferior ou igual a cerca de 8% em peso, relativamente ao referido peso total. 93. 0 processo da variante 92, em que o referido nível dos referidos agregados é inferior ou igual a cerca de 7% em peso, relativamente ao referido peso total. 82 94. 0 processo da variante 93, em que o referido nivel dos referidos agregados é inferior ou igual a cerca de 6% em peso, relativamente ao referido peso total. 95. 0 processo da variante 94, em que o referido nivel dos referidos agregados é inferior ou igual a cerca de 5% em peso, relativamente ao referido peso total. 96. 0 processo da variante 95, em que o referido nivel dos referidos agregados é inferior ou igual a cerca de 4% em peso, relativamente ao referido peso total. 97. 0 processo da variante 96, em que o referido nivel dos referidos agregados é inferior ou igual a cerca de 3% em peso, relativamente ao referido peso total. 98. 0 processo da variante 97, em que o referido nivel dos referidos agregados é inferior ou igual a cerca de 2% em peso, relativamente ao referido peso total. 99. 0 processo da variante 98, em que o referido nivel dos referidos agregados é inferior ou igual a cerca de 1,5% em peso, relativamente ao referido peso total. 100. O processo da variante 99, em que o referido nivel dos referidos agregados é inferior ou igual a cerca de 1% em peso, relativamente ao referido peso total. 101. O processo da variante 100, em que o referido nivel dos referidos agregados é inferior ou igual a cerca de 0,9% em peso, relativamente ao referido peso total. 102. 0 processo da variante 101, em que o referido nivel dos referidos agregados é inferior ou igual a cerca de 0,8% em peso, relativamente ao referido peso total. 103. O processo da variante 102, em que o referido nivel dos referidos agregados é inferior ou igual a cerca de 0,7% em peso, relativamente ao referido peso total. 83 104. O processo da variante 103, em que o referido nivel dos referidos agregados é inferior ou igual a cerca de 0,6% em peso, relativamente ao referido peso total. 105. 0 processo da variante 104, em que o referido nivel dos referidos agregados é inferior ou igual a cerca de 0,5% em peso, relativamente ao referido peso total. 106. 0 processo da variante 105, em que o referido nivel dos referidos agregados é inferior ou igual a cerca de 0,4% em peso, relativamente ao referido peso total. 107. 0 processo da variante 106, em que o referido nivel dos referidos agregados é inferior ou igual a cerca de 0,3% em peso, relativamente ao referido peso total. 108. 0 processo da variante 107, em que o referido nível dos referidos agregados é inferior ou igual a cerca de 0,2% em peso, relativamente ao referido peso total. 109. 0 processo da variante 108, em que o referido nível dos referidos agregados é inferior ou igual a cerca de 0,1% em peso, relativamente ao referido peso total. 110. O processo da variante 109, em que o referido nível dos referidos agregados é inferior ou igual a cerca de 0,05% em peso, relativamente ao referido peso total. 111. O processo da variante 110, em que o referido nível dos referidos agregados é inferior ou igual a cerca de 0,01% em peso, relativamente ao referido peso total. 112. O processo da variante 31, em que o referido passo (b) compreende também um passo (b2) que consiste em lavar a referida proteína peguilada carregada, seguindo-se um passo (b3) de eluição da referida proteína peguilada carregada, com uma solução de eluição em gradiente de pH ou em gradiente de potência iónica, e um passo (b4) de recolha do eluente em fracções múltiplas de volume. 84 113. 0 processo da variante 31, em que em que o referido passo (b) compreende também um passo (b2) que consiste em lavar a referida proteína peguilada carregada, seguindo-se um passo (b3) de eluição da referida proteína peguilada carregada, com uma solução salina num tampão de eluição contendo um sal iónico com um gradiente de concentração salina suficiente para a eluição da referida proteína peguilada carregada, a partir da referida resina de AEX. 114. 0 processo da variante 113, que o referido sal iónico é um sal cloreto. 115. 0 processo da variante 114, que o referido sal iónico é NaCl. 116. 0 processo da variante 115, em que o referido passo (b) é efectuado numa coluna que possui um volume de coluna (VC) e em que o referido gradiente de concentração salina está compreendido entre cerca de 2 e cerca de 50 mM por VC. 117. O processo da variante 116, em que o referido gradiente de concentração salina está compreendido entre cerca de 5 e cerca de 25 mM por VC. 118. O processo da variante 117, em que o referido gradiente de concentração salina está compreendido entre cerca de 10 e cerca de 20 mM por VC. 119. O processo da variante 113, em que o referido tampão de eluição tem um valor de pH compreendido entre cerca de 5 e cerca de 10. 120. O processo da variante 119, em que o referido tampão de eluição tem um valor de pH compreendido entre cerca de 6,6 e cerca de 9. 85 121. 0 processo da variante 120, em que o referido tampão de eluição tem um valor de pH compreendido entre cerca de 6,9 e cerca de 7,1. 122. O processo da variante 113, em que o referido passo (b3) de eluição é efectuado a uma temperatura de eluição inferior ou igual a 50°C. 123. O processo da variante 122, em que a referida temperatura de eluição é inferior ou igual a cerca de 35°C. 124. O processo da variante 123, em que a referida temperatura de eluição está compreendida entre cerca de 2 e cerca de 30°C. 125. O processo da variante 123, em que a referida temperatura de eluição está compreendida entre cerca de 15 e cerca de 30°C. 126. O processo da variante 123, em que a referida temperatura de eluição está compreendida entre cerca de 18 e cerca de 25°C. 127. O processo da variante 113, em que o referido passo (b) é efectuado numa coluna e em que o referido tampão de eluição flui com uma velocidade linear, através da referida coluna, que é inferir ou igual a cerca de 300 cm/hora. 128. O processo da variante 127, em que a referida velocidade linear está compreendida entre cerca de 10 e cerca de 150 cm/hora. 129. O processo da variante 127, em que a referida velocidade linear está compreendida entre cerca de 30 e cerca de 150 cm/hora. 130. O processo da variante 127, em que a referida velocidade linear está compreendida entre cerca de 50 e cerca de 100 cm/hora. 86 131. 0 processo da variante 127, em que a referida velocidade linear está compreendida entre cerca de 50 e cerca de 70 cm/hora. 132. 0 processo da variante 127, em que a referida velocidade linear está compreendida entre cerca de 60 e cerca de 65 cm/hora. 133. 0 processo da variante 127, em que a referida velocidade linear é cerca de 60 cm/hora. 134. 0 processo da variante 1, em que a referida proteína peguilada é seleccionada entre 0 conjunto constituído por hormonas, hormona do crescimento, hormona do crescimento humano, antagonistas da hormona do crescimento, antagonistas da hormona do crescimento humano, um anticorpo e B-2036 PEG. 135. 0 processo da variante 1, que e a referida resina de permuta de aniões (AEX) compreende grupos funcionais seleccionados entre o conjunto constituído por aminas primárias, secundárias, terciárias e quaternárias e suas combinações. 136. 0 processo da variante 1, em que a referida resina de permuta de aniões (AEX) compreende grupos funcionais seleccionados entre o conjunto constituído por dietilaminoetilo, dietilaminopropilo, dimetiletanolamina, trimetil-amónio-etil, trimetil-benzil-amónio, dimetil-etanol-benzilo e poliaminas. 137. 0 processo da variante 1, em que a referida resina de permuta de aniões (AEX) compreende um material de suporte seleccionado entre o conjunto constituído por poliéteres hidrofílicos, divinil-benzeno-polistireno reticulado, agarose reticulada, polipropileno, acrilamidovinilo hidrofílico, metacrilato, hidrogel polimerizado com uma base de esférulas 87 de cerâmica, material misto de silica-dextrano, silica enxertada com polímeros, divinil-benzeno-estireno, divinil-benzeno poliacrílico, celulose reticulada, metacrilato co-polimérico, polistireno, acrilato, gel hidrofílico G5000 e celulose. 138. 0 processo da variante 1, em que a referida resina de permuta de aniões (AEX) é uma resina macroporosa. 139. 0 processo da variante 1, em que a referida resina de permuta de aniões (AEX) é uma resina em gel. 140. O processo da variante 63, em que a referida mistura de proteína peguilada é constituída essencialmente por uma ou várias proteínas PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG- 5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9. 141. O processo da variante 63, em que a referida mistura de proteína peguilada é constituída essencialmente por uma ou várias proteínas PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG- 6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9. 142. O processo da variante 63, em que a referida mistura de proteína peguilada é constituída essencialmente por uma ou várias proteínas PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG- 7, PEG-8 e PEG-9. 143. O processo da variante 63, em que a referida mistura de proteína peguilada é constituída essencialmente por uma ou várias proteínas PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7 e PEG-8. 144. O processo da variante 63, em que a referida mistura de proteína peguilada é constituída essencialmente por uma ou várias proteínas PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6 e PEG-7. 88 145. 0 processo da variante 63, em que a referida mistura de proteína peguilada é constituída essencialmente por uma ou várias proteínas PEG-3, PEG-4, PEG-5 e PEG-6. 146. 0 processo da variante 63, em que a referida mistura de proteína peguilada é constituída essencialmente por uma ou várias proteínas PEG-4, PEG-5 e PEG-6. 147. 0 processo da variante 63, em que a referida mistura de proteína peguilada é constituída essencialmente por uma ou várias proteínas PEG-4 e PEG-5. 148. 0 processo da variante 63, em que a referida mistura de proteína peguilada é constituída essencialmente por uma ou várias proteínas PEG-5 e PEG-6. 14 9. 0 processo da variante 63, em que a referida mistura de proteína peguilada é constituída essencialmente por PEG-5. 150. O processo da variante 31, em que o referido passo (b) é efectuado numa coluna que possui um volume de coluna (VC) e em que o referido passo (b) compreende também um passo (b2) que consiste em lavar a referida proteína peguilada carregada, seguindo-se um passo (b3) de eluição da referida proteína peguilada carregada, com uma solução de eluição em gradiente de pH ou num gradiente de potência iónica, e um passo (b4) de recolha de um eluente de fracções múltiplas de volume compreendidas entre cerca de 0,1 e cerca de 5 vezes o referido volume da coluna (VC). 151. O processo da variante 31, em que o referido passo (b) é efectuado numa coluna que possui um volume de coluna (VC) e em que o referido passo (b) compreende também um passo (b2) que consiste em lavar a referida proteína peguilada carregada, seguindo-se um passo (b3) de eluição da referida proteína peguilada carregada, com uma solução 89 de eluição em gradiente de pH ou num gradiente de potência iónica, e um passo (b4) de recolha de um eluente de fracções múltiplas de volume compreendidas entre cerca de 0,1 e cerca de 1 vezes o referido volume da coluna (VC). 152. O processo da variante 31, em que o referido passo (b) é efectuado numa coluna que possui um volume de coluna (VC) e em que o referido passo (b) compreende também um passo (b2) que consiste em lavar a referida proteína peguilada carregada, seguindo-se um passo (b3) de eluição da referida proteína peguilada carregada, com uma solução de eluição em gradiente de pH ou num gradiente de potência iónica, e um passo (b4) de recolha de um eluente de fracções múltiplas de volume compreendidas entre cerca de 0,1 e cerca de 0,5 vezes o referido volume da coluna (VC) . 153. 0 processo da variante 31, em que o referido passo (b) é efectuado numa coluna que possui um volume de coluna (VC) e em que o referido passo (b) compreende também um passo (b2) que consiste em lavar a referida proteína peguilada carregada, seguindo-se um passo (b3) de eluição da referida proteína peguilada carregada, com uma solução de eluição em gradiente de pH ou num gradiente de potência iónica, e um passo (b4) de recolha de um eluente de fracções múltiplas de volume compreendidas entre cerca de 0,1 e cerca de 0,2 vezes o referido volume da coluna (VC). 154. O processo da variante 113, em que o referido sal iónico é seleccionado entre o conjunto constituído por NaCl, cloreto de lítio, fosfato de Na, sulfato de NA, cloreto de amónio, sulfato de amónio, fosfato de amónio, Kl e KC1. 155. O processo da variante 118, em que o referido gradiente de concentração salina está compreendido entre cerca de 10 e cerca de 12,5 mM por VC. 90 156. Um processo para preparar misturas de isoformas de proteínas peguiladas, compreendendo o referido processo os passos seguintes: (a) separar e recolher as referidas isoformas de proteínas peguiladas por meio de uma técnica seleccionada entre o conjunto constituído por electroforese capilar (CE), electroforese em gel de poliacrilamida com dodecil-sulfato de sódio (SDS-PAGE), cromatografia de permuta de iões (IEX) cromatografia de interacção hidrofóbica (HIC), cromatografia de permuta de aniões (AEX), cromatografia de permuta de catiões (CEX), cromatografia em líquido de alto rendimento de fase inversa (RPHPLC), cromatografia em líquido de elevado rendimento de exclusão dimensional (SEHPLC), cromatografia por afinidade e suas combinações. 157. O processo da variante 140, em que a referida técnica é RPHPLC ou CE. 158. Um processo para fazer diminuir um nível de agregados de isoformas de antagonistas peguilados da hormona do crescimento, com um peso total das referidas isoformas e dos referidos agregados, compreendendo o referido processo os passos seguintes: (a) arranjar as referidas isoformas dos antagonistas peguilados da hormona do crescimento; e (b) separar as referidas isoformas de antagonistas peguilados da hormona do crescimento sobre uma resina de permuta de aniões (AEX) por cromatografia de permuta de aniões, em condições suficientes para diminuir o referido nível dos referidos agregados para valores inferiores ou iguais a cerca de 6% em peso, tomando por base o referido peso total. 91 159. 0 processo da variante 158, em que as referidas condições são suficientes para diminuir o referido nível do referido agregado para valores inferiores ou iguais a cerca de 5% em peso, tomando por base o referido peso total. 160. O processo da variante 158, em que as referidas condições são suficientes para diminuir o referido nível do referido agregado para valores inferiores ou iguais a cerca de 4% em peso, tomando por base o referido peso total. 161. O processo da variante 158, em que as referidas condições são suficientes para diminuir o referido nível do referido agregado para valores inferiores ou iguais a cerca de 3% em peso, tomando por base o referido peso total. 162. O processo da variante 158, em que as referidas condições são suficientes para diminuir o referido nível do referido agregado para valores inferiores ou iguais a cerca de 2% em peso, tomando por base o referido peso total. 163. O processo da variante 158, em que as referidas condições são suficientes para diminuir o referido nível do referido agregado para valores inferiores ou iguais a cerca de 1% em peso, tomando por base o referido peso total. 164. Um processo para diminuir um nível total de uma soma de quaisquer impurezas trissulfureto, quaisquer impurezas des-phe e quaisquer agregados de isoformas de antagonistas peguilados da hormona do crescimento, em que as referidas isoformas, as referidas impurezas e o referido agregado possuem um peso total, compreendendo o referido processo os passos seguintes: (a) arranjar as referidas isoformas dos antagonistas peguilados da hormona do crescimento; e (b) separar as referidas isoformas de antagonistas peguilados da hormona do crescimento sobre uma resina de 92 permuta de aniões (AEX) por cromatografia de permuta de aniões, em condições suficientes para diminuir o referido nivel total de todas as impurezas trissulfureto referidas, de todas as impurezas des-phe referidas e de todos os agregados referidos, para valores inferiores ou iguais a cerca de 15% em peso, tomando por base o peso total referido. 165. 0 processo da variante 164, em que as condições são suficientes para diminuir o referido nivel total de todas as impurezas trissulfureto referidas, de todas as impurezas des-phe referidas e de todos os agregados referidos, para valores inferiores ou iguais a cerca de 12% em peso, tomando por base o referido peso total. 166. 0 processo da variante 164, em que as condições são suficientes para diminuir o referido nivel total de todas as impurezas trissulfureto referidas, de todas as impurezas des-phe referidas e de todos os agregados referidos, para valores inferiores ou iguais a cerca de 10% em peso, tomando por base o referido peso total. 167. O processo da variante 164, em que as condições são suficientes para diminuir o referido nível total de todas as impurezas trissulfureto referidas, de todas as impurezas des-phe referidas e de todos os agregados referidos, para valores inferiores ou iguais a cerca de 9% em peso, tomando por base o referido peso total. 168. O processo da variante 164, em que as condições são suficientes para diminuir o referido nivel total de todas as impurezas trissulfureto referidas, de todas as impurezas des-phe referidas e de todos os agregados referidos, para valores inferiores ou iguais a cerca de 8% em peso, tomando por base o referido peso total. 93 169. 0 processo da variante 164, em que as condições são suficientes para diminuir o referido nível total de todas as impurezas trissulfureto referidas, de todas as impurezas des-phe referidas e de todos os agregados referidos, para valores inferiores ou iguais a cerca de 7% em peso, tomando por base o referido peso total. 170. O processo da variante 164, em que as condições são suficientes para diminuir o referido nível total de todas as impurezas trissulfureto referidas, de todas as impurezas des-phe referidas e de todos os agregados referidos, para valores inferiores ou iguais a cerca de 6% em peso, tomando por base o referido peso total. 171. O processo da variante 164, em que as condições são suficientes para diminuir o referido nível total de todas as impurezas trissulfureto referidas, de todas as impurezas des-phe referidas e de todos os agregados referidos, para valores inferiores ou iguais a cerca de 5% em peso, tomando por base o referido peso total. 172. O processo da variante 164, em que as condições são suficientes para diminuir o referido nível total de todas as impurezas trissulfureto referidas, de todas as impurezas des-phe referidas e de todos os agregados referidos, para valores inferiores ou iguais a cerca de 4% em peso, tomando por base o referido peso total. 173. O processo da variante 164, em que as condições são suficientes para diminuir o referido nível total de todas as impurezas trissulfureto referidas, de todas as impurezas des-phe referidas e de todos os agregados referidos, para valores inferiores ou iguais a cerca de 3% em peso, tomando por base o referido peso total. 94 174. 0 processo da variante 164, em que as condições são suficientes para diminuir o referido nivel total de todas as impurezas trissulfureto referidas, de todas as impurezas des-phe referidas e de todos os agregados referidos, para valores inferiores ou iguais a cerca de 2% em peso, tomando por base o referido peso total. 175. 0 processo da variante 164, em que as condições são suficientes para diminuir o referido nivel total de todas as impurezas trissulfureto referidas, de todas as impurezas des-phe referidas e de todos os agregados referidos, para valores inferiores ou iguais a cerca de 1% em peso, tomando por base o referido peso total. 176. 0 processo da variante 134, em que o referido antagonista da hormona do crescimento é B-2036 PEG em que a referida B-2036 PEG compreende uma estrutura polipeptidica de B-2036 de [SEQ. ID NO. 1] antagonista da hormona do crescimento. 177. 0 processo da variante 134, em que a referida hormona do crescimento é uma forma peguilada de um polipeptido de [SEQ. ID NO. 2]. 178. 0 processo da variante 137, em que o referido material de suporte tem um diâmetro compreendido entre cerca de 10 e cerca de 500 ym. 179. O processo da variante 178, em que o referido diâmetro tem um valor médio igual a 90 ym. 180. Um processo para preparar misturas de isoformas de proteínas peguiladas, compreendendo o referido processo os passos seguintes: (a) separar as referidas isoformas de proteínas peguiladas para se obter isoformas seleccionadas; e 95 (b) combinar as referidas isoformas seleccionadas para se obter uma mistura enriquecida nas referidas isoformas seleccionadas. 181. 0 processo da variante 180, em que as referidas isoformas seleccionadas são PEG-4, PEG-5 e PEG-6 com uma proporção em peso na mistura calculada pela expressão ( (um primeiro peso de PEG-4 + PEG-5 + PEG-6)/(um segundo peso de todas as PEG-1 + PEG-2 + PEG-3 + PEG-4 + PEG-5 + PEG-6 + PEG-7 + PEG-8 + PEG-9 presentes na referida mistura enriquecida) ) que é superior ou igual a cerca de 70% em peso. referida cerca de referida cerca de referida cerca de referida cerca de referida cerca de referida cerca de em que a ou igual a em que a ou igual a em que a ou igual a em que a ou igual a em que a ou igual a em que a ou igual a 182. O processo da variante 181, proporção em peso na mistura é superior 75% em peso. 183. O processo da variante 181, proporção em peso na mistura é superior 80% em peso. 184. O processo da variante 181, proporção em peso na mistura é superior 85% em peso. 185. O processo da variante 181, proporção em peso na mistura é superior 90% em peso. 186. O processo da variante 181, proporção em peso na mistura é superior 94% em peso. 187. O processo da variante 181, proporção em peso na mistura é superior 95% em peso. 96 188. 0 processo da variante 181, em que a referida proporção em peso na mistura é superior ou igual a cerca de 96% em peso. 189. 0 processo da variante 181, em que a referida proporção em peso na mistura é superior ou igual a cerca de 97% em peso. 190. 0 processo da variante 181, em que a referida proporção em peso na mistura é superior ou igual a cerca de 98% em peso. 191. 0 processo da variante 181, em que a referida proporção em peso na mistura é superior ou igual a cerca de 99% em peso. 192. 0 processo da variante 181, em que a referida proporção em peso na mistura é superior ou igual a cerca de 99,5% em peso. 193. 0 processo da variante 181, em que a referida proporção em peso na mistura é superior ou igual a cerca de 99,9% em peso. 194 . 0 processo da variante 180, em i que as referidas isoformas seleccionadas são uma ou várias das isoformas PEG-1, PEG-2 , PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG- 7, PEG-8 e PEG-9. 195. 0 processo da variante 180, em ( que as referidas isoformas seleccionadas são uma ou várias das isoformas PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9. 196. 0 processo da variante 180, em que as referidas isoformas seleccionadas são uma ou várias das isoformas PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9. 197. O processo da variante 180, em que as referidas isoformas seleccionadas são uma ou várias das isoformas PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9. 97 198. 0 processo da variante 180, em que as referidas isoformas seleccionadas são uma ou várias das isoformas PEG-4, PEG -5, PEG-6, PEG- -7 e PEG-8 • 199. 0 processo da variante 180, em que as referidas isoformas seleccionadas são uma ou várias das isoformas PEG-4, PEG -5, PEG-6 e PEG-7. 200. 0 processo da variante 180, em que as referidas isoformas seleccionadas são uma ou várias das isoformas PEG-4, PEG -5 e PEG-6. 201. 0 processo da variante 180, em que as referidas isoformas seleccionadas são uma ou várias das isoformas PEG-4 e PEG-5. 202. 0 processo da variante 180, em que as referidas isoformas seleccionadas são uma ou várias das isoformas PEG-5 e PEG-6. 203. 0 processo da variante 180, em que as referidas isoformas seleccionadas são uma ou várias das isoformas PEG-4 e PEG-6. 204. Um processo para obter uma isoforma de uma proteína peguilada seleccionada a partir de uma mistura que contenha pelo menos duas isoformas de proteínas peguiladas, compreendendo o referido processo o passo seguinte: (a) separar a referida isoforma da proteína peguilada seleccionada, retirando-a da mistura. 205. Um processo para a preparação de uma composição enriquecida, a partir de uma composição inicial, em que a referida composição inicial contém a molécula B-2036 não peguilada e uma ou várias isoformas peguiladas de B-2036 seleccionadas entre o conjunto constituído por PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-β, PEG-7, PEG-8 e PEG-9, e em que o referido processo compreende os passos seguintes: 98 (a) separar a referida composição inicial para se obter um conjunto de fracções, em que uma primeira proporção em peso entre fracções das isoformas PEG-4, PEG-5 e PEG-6 e o total de isoformas de B-2036 não peguiladas e de B-2036 peguiladas, pelo menos numa fracção, difere de uma segunda proporção em peso entre fracções de isoformas de PEG-4, PEG-5 e PEG-6 e o total de isoformas de B-2036 não peguiladas e de B-2036 peguiladas, pelo menos numa outra fracção, (b) determinar uma proporção em peso entre as isoformas de PEG-4, PEG-5 e PEG-6 e o total de isoformas de B-2036 não peguiladas e de B-2036 peguiladas de um resto de cada fracção ou numa amostragem de fracções e (c) combinar selectivamente menos do que a totalidade das referidas fracções para se obter a referida composição enriquecida, em que uma proporção em peso entre fracções enriquecidas de isoformas de PEG-4, PEG-5 e PEG-6 e o total de isoformas de B-2036 não peguiladas e de B-2036 peguiladas é maior na referida composição enriquecida do que na referida composição inicial.
Todos os valores numéricos e moléculas identificadas neste pedido de patente de invenção são exemplificativos e não tem por objectivo impor limitações ao que é reivindicado. 0 texto subsequente é apresentado a titulo de exemplo e não deve ser considerado como uma limitação ao âmbito da invenção.
EXEMPLOS
Exemplo 1 99
Manter ou diminuir o nível de agregação do antagonista peguilado da hormona do crescimento (B-2036-PEG) por cromatografia de permuta de aniões A operação de manter (abaixo de um nível desejado, v.g., ^ 6% em peso, relativamente ao peso total) ou diminuir os níveis de agregados de B-2036 PEG, utilizando como material de partida BI (o lote intermédio de B-2036), preparado conforme indicado no pedido de patente de invenção norte-americana, não provisório, com o número de série intercalar P-107 891, com o título 'Method for the Production Of Growth Hormone And Antagonist Thereof Having lower Leveis Of Isoform Impurities Thereof', depositado a 25 de Agosto de 2003, no Instituto Norte-Americano de Marcas e Patentes de Invenção. A fermentação (para se obter B-2036) num sistema de expressão recombinante em E. coli decorreu conforme descrito por Cunningham et al. na patente de invenção norte-americana n° 5 849 535. A purificação de B-2036 de BI foi efectuada conforme descrito no pedido de patente de invenção norte-americana, não provisório, acima identificado (P-107 891). Este material foi depois tratado em conformidade com os passos iniciais de peguilação e de cromatografia por interacção hidrofóbica, conforme ilustrado no fluxograma 1 subsequente, para se obter B-2036 PEG. A seguir à cromatografia de interacção hidrofóbica (passo 2) submeteu-se a B-2036 PEG às operações de UF/DF em tampão TRIS a pH 7,25 (em vez de tampão de acetato de sódio a pH 4, tal como no processo do exemplo 2, passo 3, fluxograma 2) . O retentato foi depois submetido a cromatografia de permuta de aniões forte em coluna de 'Q Sepharose FF' . Este passo separa, diferencialmente, as 100 espécies peguiladas em fracções para a preparação de lotes para se obter a distribuição de espécies peguiladas necessárias para libertar o IFA. Esta coluna faz o enriquecimento da BI peguilada (B-2036 PEG) em produtos PEG-4, PEG-5 e PEG-6. A eluição do produto é feita com 20 VC em gradiente linear entre 0-250 mM de NaCl em Tris 25 mM a pH 7,0, seguindo-se os passos de equilíbrio e uma lavagem com 2 VC de Tris 25 mM a pH 7,0. A análise das fracções foi feita utilizando CE em vez de SDS-PAGE, conforme explicitado no Exemplo 2, fluxograma 2. Ver o texto anterior sobre o mesmo tema. O pegvisomant (Somavert®; Pharmacia) é recolhido a partir do perfil de cromatografia, sob a forma de uma mistura de fracções analisadas por CE com um critério para a preparação da mistura em que haja >75% PEG4+5+6 (primeira fracção) e >94% PEG4+5+6 (última fracção) e >0,5 mg/mL. 0 produto resultante é submetido depois à parte restante do processo de purificação de B-2036 PEG, conforme indicado no fluxograma 1. Após a selecção e a preparação de mistura de fracções, a análise das misturas de material e do IFA final por SEHPLC revelou que não havia agregados detectáveis. Ver o Quadro 1 subsequente que indica o mesmo. FLUXOGRAMA 1 Exemplo 1 (Processo com resina de permuta de aniões)
101 OPERAÇÃO UNITÁRIA
DESCRIÇÃO E CONTROLO DO PROCESSO
PARÂMETROS DO PROCESSO A molécula B-2036 do processo de purificação de 1 1 1 IFA Espec. Demonstrado BI é PEGilada comum excesso de reagente de 1 1 Passo de prod. Aceitável PEGilação igual a 2g/L, éster N-hidroxi- 1 Intervalos succinimidílico do ácido metoxi(propileno- glicol)-propiónico, com um peso molécula igual a 1 1 PEGilação 5000 (m-SPA-5000) em HEPES 100 mM a pH 7,65. A 1. PEGilação reacção do produto PEGilado tem lugar num ______1 1 temperaturas 18-25 C 15-28,9 C reservatório de ácido inoxidável, mediante a 2. Intervalo de adição de PEG no estado sólido, com agitação 1 1 PH 7,40 -7,80 7,20-8,00 durante 60-90 minutos. 1 3. Concentração de BI 9,3 g/L 9-10 g/L pH = 7,65 em tampão de UF&DF #2 para B-2036 1 1 1 B-2036 PEGilada
Toyopearl Phenyl IFA Passo Intervalos
OPERAÇÃO UNITÁRIA
DESCRIÇÃO E CONTROLO DO PROCESSO 650M Espec. de prod.
Demonstrado Aceitável 1 .Capacidade de carga </= 4,1 g/L resina £5 g/L 2. Declive de gradiente 4+/-0,06 VC 3,88-4,12 3. Condutividade fraca 45-51 mS/cm 40-51 mS/cm
Condutividade final da coluna em equilíbrio 40-51 mS/cm
PARÂMETROS DO PROCESSO
Cromatografia de interacção hidrofóbica (continuação do passo facultativo) A eluição do produto é feita com 20 VC em gradiente linear, de NaCl entre 0-250 mM em Tris 25 mM a pH 7,0, seguindo-se os passos de equilíbrio e uma lavagem com 2 VC de Tris 25 mM a pH 7,0. Recolhe-se o pegvisomant a partir do perfil de cromatografia, sob a forma de um lote obtido a partir das fracções analisadas por CE com um critério de preparação dos lotes a que correspondem os valores >75% PEG4+5+6 (primeira fracção) e £94% PEG4+5+6 (última fracção) e £0,5 mg/mL. Tipo de resina: Resina de Q Sepharose FF Caudal: 60 cm/hr. Carregamento, lavagem e eluição Pré-equilíbrio: £3 VC Tris 1,0 M, pH 7,0 Equilíbrio: £4 VC Tris 25 mM, pH 7,0 Gradiente: 20 VC em gradiente linear pH final da coluna em equilíbrio 6,7-8,0 Valor final da condutividade em equilíbrio <2,4 mS/cm Condutividade da solução da carga <2,4 mS/cm UV da eluição no início da colheita 1,0% IFA Espec. Demonstrado Passo de prod. Aceitável Intervalos Electroforese capilar (fracções) £ 75% PEG4+5+6 (primeira fracção) PEG4+5+6 UV (fracções)
(última fracção) > 0,5 g/L B-2036 PEGilada 1 A finalidade deste passo consiste em concentrar o lote de produto proveniente da coluna de ’Q 1 IFA Espec. Demonstrado Sepharose FF' até ao valor de 10 mg/L e em trocar 1 Passo de prod. Aceitável o tampão, utilizando membranas Ί0Κ MWCO Biomax’ por outro constituído por manitol na concentração 1 (troca de de 18 g/L, glicma na concentração de 0,68 g/L e 1 1 1.Concentração final tampão para o fosfato de sódio 5 mM a pH 7,4 durante uma diálise 1 das proteínas 9,5-10,5 g/L </= 15 tampão final total de 9 diavolumes. 0 material é depois -----4 2.PTM 20-25 psi 15-27,5 do IFA) congelado como IFA l 1 3.Caudal de transferência do retentato 15-25 LPM >/= 19 Volumes totais Valor final de condutividade De diafíltração: 9 Da infiltração dos enxaguamentos 1 com API <0, 5 mS/cirí 1 1 1 Rendimento do passo £ 80%
102 OPERAÇÃO UNITÁRIA
DESCRIÇÃO E CONTROLO DO PROCESSO
PARÂMETROS DO PROCESSO
Lote da diafiltração
Os Exemplo dados seguintes 1 descrito antes.
Quadro 1
Esterilidade IFA Passo Intervalos 1. Concentração das proteínas 2. Rendimento: 3. Análise de esterilidade:
Espec. Demonstrado de prod. Aceitável 5 g/L ou 7,5 g/L ou 10 g/L >90% foram obtidos pelo processo do
Parâmetros de cromatografia de permuta de e rendimento com dados de agregação aniões pH. Gradiente Altura do ledte: Carga Processe interno Resina Equilibrai Carregar Ejluir Tampão Tampão A : o Declive. {VC} :0:,,6 CRI: col. (eml (mg/niL resinai Analitico Rendimento (%> % de agregados médio de EEQ ANXÍFF 8-, 0· 8 ,.G Ç,.7 i t1 ]F dl, % if dl, |H * , 15 20: 5,1 preparado por 5DS-PHGE 50 0 Ν/Λ MX41T Ç40 ml VC·):; ,&,0 8,0 &,.? í í I Η r mi , 4,11 i WqCi I I I |S 1 15 20: .5,.1, preparado por 5D5-MGE Ur? .0· W/.A Q Seth-aircse FF :8V 0· 8,8· ε,.7 r inlI Ttx í?,g ! 15 mb ! MaCl ! )!,(! ! 'rnM, pH 28 2fl· 3-,.ε pL&p=tt =idc Feu£- 1-utiiízaçao la i i, 6.5,8 8: 5,7' -Q Sepharode FF· Θ/.0 •'retc..... JC de Tn3 UI, pH v p=r o de ]Ί — 'equilíbrio 8> o- Tris -2> r 11, i 25 mH, i J 1 50 roM, pE 6/7 20 20' y,i pL<-pSLiJu PAbE. r-nfiiiraça·^ i|m i. ji.: 5.4,:4 Ό 5,1 5 Sepharcse .FF .evo· ·: -s-:csr- . 3 .c Je Tu ' lM, pH-8,-0) pat- i de ]m— eGuilibcio 8 0 8.,,0 Tris 25 iTiM, pK .3, 0 Tris •2 5-mH, NaCl. 90 raM,· pH 8,0 20, 20. w- pLtpaLadu por SDS-1AÕE, 'a utiliraçãu de CE :4'8..,:S 0 5,:0 q Sépbarasé FF' 7,0:' at.::cant: Vt 1la Til 1M, \n 8p' passn de pi--aquilibnc 8, 7,.0 T.ris 2.5 ITiM, p.K 3, 0 Tris •25 raM·,. Kaci mPí,. pH Ί,.ΰ 20 20. 3..,:58. prepara 1c ΕΑ'-Ε, Js urílização tj* - E 6|pV 0. 4,.a 103 :pH Gradiente Altura :dO· leito Carga. Processo . interno Resina Equilibrar carregar Eluir Tempão ft Tairpão B □eclive ÍVC) 9,'6 cnt ÇOl (cm) (mg/mL: resina) Analítico Rendimento (*) % de agregados s* mSdio de PB3 "Q Sêpbarôse w· i n1 l>- itiital l Jm Til 1M, JE ' :: .l·:- equililii- 9y,C Svp Tris- 25 HiM, .'pH' 8,0 Tris-25· iriM, KaCl 250 pH 9 ,Q 20 20 3·, 53 preparado· 'ÉjÓr:‘ sm-' utilização ' dé·: GE 5 irl •fi éf.o. Q sep.hairos.s 'FF 1M, pE ^.u' passo i- i ·.►-equilíbrio 7,0 7;y.O Tris 25 IfiM., pH 7,0 Tris 2 5 tnM, KàC.l 250 mM, pH 7:,0 20 2'8 4,0 ' ligado, cot: 'SÍÍS-PAGE,' preparado Pilo#· critérios da CE,· avaliado «;. 10% de .PEG-- e <_:% dc-ME-3 5.8y6 ;d: 5,0. Q sepharose FF 7.,.0- (ácppspen.tar 3 ;:ve ;de íris ,1M, -píí 7,0) :passp de pré-equíllbric 7 ,:0· 7,0 Tris' 25 ΙΠΜ, 'pH· 7>0 Tris. 2;5;··ηΜ, NaCl 2.50 mM', píí ?>:o 20 2'Ô 4,0 preparado· pelos: critério? de :ce. - 90%. 'PEG-4'- ' :5-6: 52.,-0- :C 5,0' e sep-harose TF...... 7.,,0: (.acrescentar 3'"TC 'de Tris 1M> pE7,J>.) [.j‘50 de pré-equilibric 7 ,.£)· 7.,.0 Tris 25 idm, píl 70' Tris· IS .rriM,: K-aCl· ,2:50 mM, píí 7>:o 10 28 6,.0.- p-reparadO·'· .pelçp critérios'' de .GE·' -SC* PE3-4-' 5-c :52,:3 0. •4,9: ΰ Stp-har- ^ :FT .. :: ..i: III, pF Τ,ιΐι i-U Jí pi··. M.]i.ilihix 7,.0- 7.,..0 TriS: :25 mM,. pji' •7>0 Tris· idómM,: WaCl ,250 mM) píí '7' :,.0 1.0 39 4,0- preparação' teórica potf' CE = ' 0.0% pé :72/P •Q 5,.C. e Sephe FF : [ le Τη-ili, pF Τ,Γπ c: :i- ^-Ihilibix 7,.0. 7.,P :TriS: :25 mM,. -pfi: ' -r, o Tris :25:;mM,: N-aCl 2:50, fflMr pS '7,0 10 39: 4,0·· CE do lote preparação náo completa NA/' »/A· N/A * = cal-ulaJq ba:* na análise 'por GE1
Exemplo 2
Processo em pequena escala para a avaliação do efeito de aditivos sobre a agregação de B-2036 PEG sobre 'S-Sepharose FF' (resina de cromatografia de permuta de catiões) A um tubo de centrifugação de 15 mL acrescentou-se 1,5 mL de resina de 'S-Sepharose FF' (volume de leito determinado). Preparou-se a resina para ligação das proteínas, enxaguando-a duas vezes com 10 mL de uma solução a 1% do aditivo, que se pretendia avaliar, em acetato de sódio 25 mM a pH 4. Após cada enxaguamento, recolheu-se o sobrenadante (por centrifugação), decantou-se e deitou-se fora. À massa de resina enxaguada acrescentou-se 2,5 mL da solução a 1% do aditivo, que se pretendia avaliar, em 104 acetato de sódio 25 mM a pH 4 e acrescentou-se uma quantidade de retentato de UF/DF que continha aproximadamente 5 mg de B-2036 PEG obtida no passo 3 (preparada pelo método do fluxograma 2, passos 1 a 3) . Depois, preparou-se nova suspensão com a resina na solução e manteve-se a incubar, com agitação suave, durante 2 a 24 horas. Após a incubação, centrifugou-se a solução e decantou-se o sobrenadante e deitou-se fora. Seguidamente fez-se a eluição da B-2036 PEG a partir da resina, acrescentando à massa de resina 2,5 mL de uma solução a 1% do aditivo, que se pretendia avaliar, em acetato de sódio 25 mM a pH 4 e 0,25 mL de cloreto de sódio 2,5 M. Com a resina da solução resultante preparou-se nova suspensão e manteve-se a incubar, com agitação suave, durante 20 minutos. Após a incubação, retém-se o sobrenadante por centrifugação e decanta-se para análise por cromatografia de exclusão dimensional (v.g., SEHPLC (HPLC de exclusão dimensional)). Depois deita-se fora a massa de resina utilizada. Repetiu-se o processo anterior para cada aditivo que se pretendia avaliar, utilizando resina de cromatografia de permuta de catiões para se determinar se a formação de agregados poderia ser eliminada ou suficientemente reduzida. Utilizando este processo anteriormente descrito, foram obtidos os resultados do Quadro 2 subsequente. Conforme reflectido no Quadro 2, nenhum aditivo testado, utilizando uma resina catiónica, teve tanto êxito como o que se obteve ao fazer a troca pela resina aniónica, em termos de diminuição do nivel de agregados formados. 105 FLUXOGRAMA 2 Exemplo 2 (Processo de comparação utilizando resina de permuta de catiões)
DESCRIÇÃO E CONTROLO DO PROCESSO
PARÂMETROS DO PROCESSO A molécula B-2036 do processo de purificação de BI é PEGilada comum excesso de reagente de PEGilaçâo igual a 2g/L, éster N-hidroxi-succinimidílico do ácido metoxi (propileno-glicol)-propiónico, com um peso molécula igual a 5000 (m-SPA-5000) em HEPES 100 mM a pH 7,65. A reacção do produto PEGilado tem lugar num reservatório de ácido inoxidável, mediante a adição de PEG no estado sólido, com agitação durante 60-90 minutos. pH = 7,65 em tampão de UFSDF #2 para B-2036
IFA Espec. Demonstrado Passo de prod. Aceitável Intervalos PEGilaçâo 1. Intervalo de temperaturas : 18-25 C 15-28,9 C 2. Intervalo de pH 7,40-7,80 7,20-8,00 3. Concentração de BI 9,3 g/L 9-10 g/L
Cromatografia de interacção hidrofóbica (passo facultativo) A mistura de reacção de PEGilaçâo é condicionada para cromatografia por interacção hidrofóbica por diluição (1:1) com citrato de sódio 800 mM, Tris 50 mM a pH 7,6. 0 produto é carregado na coluna de 'Phenyl', lavado com citrato de sódio 400 mM, Tris 50 mM a pH 7,5 e depois o produto é recolhido por gradiente salino inverso a partir de citrato de sódio 400 mM, Tris 50 mM a pH 7,5 até Tris 50 mM a pH 7,7, sendo as fracções recolhidas quando a proteína é detectada por espectroscopia de UV {v.g., aumentos de UV durante a eluição). Tipo de resina: TosoHaas Toyopearl Phenyl 650 M Carga de 'Phenyl': Lote de PEGilaçâo com tampão a 1:1 Caudal: 60 cm/hr.
Toyopearl Phenyl 650M IFA Passo Intervalos
Espec. de prod.
Demonstrado Aceitável 1.Capacidade de carga 2 . Declive de gradiente 3. Condutividade fraca 45-51 mS/cm </= 4,1 g/L resina <5 g/L 4+/-0,06 VC 3,88-4,12 40-51 mS/cm
Condutividade final da coluna em equilíbrio 40-51 mS/cm Condutividade final da carga 40-51 mS/cm I_ní ci c_ d_a__cc_hci ^ ç_dcs_^_i ccs__________^_UV%____
OPERAÇÃO UNITÁRIA
DESCRIÇÃO E CONTROLO DO PROCESSO
FARAMETROS DO PROCESSO
Ψ Lote da HIC Ψ
UF/DF #3 IFA Passo Intervalos Ψ Lote de diafíltraçãoΨ
Espec. de prod.
Demonstrado Aceitável 1. Concentração final das proteínas 5,4-6,6 g/L 2. PTM 20-25 psi 3. Caudal de transferência do retentato 20-25 LPM Valor final de condutividade dos enxagguamentos com API % de PAN original Total g. de B-2036 (rendimento do passo) </= 7,2 15-27,5 <0,5 mS/cm > 60%
106 OPERAÇÃO UNITÁRIA
DESCRIÇÃO E CONTROLO DO PROCESSO
PARÂMETROS DO PROCESSO
Cromatografia de permuta de catiões
Efectua-se a cromatografia em coluna utilizando uma resina de permuta de catiões forte 'Q Sepharose FF', utilizando o retentato final UF/DF #3. Este passo separa diferencialmente as espécies PEGiladas dando origem a fracções para a preparação de lotes para se conseguir a distribuição de espécies PEGiladas necessária para a libertação do IFA. Esta coluna faz o enriquecimento da BI PEGilada (B-2036-PEG). 0 produto é eluído com um gradiente linear de NaCl entre 0-25 mM em acetato de sódio 25 mM a pH 4,0 seguindo-se os passos de equilíbrio e uma lavagem com 2 VC com acetato de sódio 25 mM a pH 4,0. Recolhe-se o pegvisomant a partir do perfil de cromatografia, sob a forma de um lote obtido a partir das fracções analisadas por SDS-PAGE com um critério de preparação dos lotes essencialmente com as espécies PEG-4 e PEG-5 Tipo de resina: Resina de S Sepharose FF Caudal: 60 cm/hr. Carregamento, lavagem e eluição Equilíbrio: acetato de sódio 25 mM a pH 4,0
Gradiente: 20 VC em gradiente linear Q-Sepharose FF IFA Espec. Demonstrado Passo de prod. Aceitável Intervalos 1. pH de carga/eluição 3,90-4,10 2. Condutividade da carga </=2,0mS/cm 3. Capacidade de carga </=4,0 g/L pH final da coluna em equilíbrio 4,0 Valor final da condutividade em equilíbrio <2,0mS/cm UV da eluição no início da colheita 2,5% Preparação dos lotes: fracções constituídas essencialmente por espécies PEG-4 e PEG-4
T
Lote da CEX A finalidade deste passo consiste em concentrar o r 1 lote de produto proveniente da coluna de ’Q 1 1 IFA Espec. Sepharose FF' até ao valor de 10 mg/L e em trocar 1 Passo de prod. Aceitável o tampão, utilizando membranas Ί0Κ MWCO Biomax’ por outro constituído por manitol na concentração 1 (troca de de 18 g/L, glicina na concentração de 0,68 g/L e 1 1. Concentração f inal tampão para o fosfato de sódio 5 mM a pH 7,4 durante uma diálise 1 das proteínas 9,5-10,5 g/L </= 15 tampão final 1 1 2 . PTM 20-25 psi 15-27,5 do IFA) 1 3. Pressão da 1 alimentação 1 1 1 1 1 1 de UF/DF 20-35 psig
OPERAÇÃO UNITÁRIA
DESCRIÇÃO E CONTROLO DO PROCESSO
PARÂMETROS DO PROCESSO diavolumes. 0 material é depois congelado como IFA Valor final de condutividade dos enxaguamentos com API ^0,5 mS/cm ! (Continuação) % de PAN original 2 60% | De diafíltração: 9 Total g. de B-2036 (rendimento do passo) 2 85% [ 1 Encher com IFA A finalidade deste passo consiste em ajustar a concentração de todo o volume da solução proteínica, se necessário, e em fazer o enchimento estéril, utilizando filtros de 2 pm em frascos de Teflon para congelamento. Esterilidade IFA Passo Intervalos 1. Concentração Espec. de prod. Demonstrado | Aceitável i das proteínas 5 g/L ou 7,5 g/L ou 10 g/L ! Filtros: Cápsula de Sartobran P de 0,45/0,2 pm 2. Rendimento: 3. Análise de >90% esterilidade: estéril IFA final 107
Quadro 2 (Resultados obtidos utilizando resina de permuta de catiões). Processo em pequena escala do Exemplo 2 Método Resina carregada à razão de 3,3 g/L 1,5 mL de resina por experiência Resina equilibrada com aditivo antes do carregamento com proteína Eluição por adição de NaCl/acetato 2,5 M a pH 4; 1:10 v/v Incubação durante 24 horas com tudo a 1% com as excepções indicadas Aditivo/estado % de Agregado Controlo 21,5 ureia 6M 6,0 CHAPS 18, 7 Sarcosilo 9,3 PEG 3350 20,3 Isopropanol 19, 3 n-propanol 24,7 n-butanol 27,1 pH 7,7 TRIS 50 mM 30,3 controlo estabilizado a 32,2 de um dia para o outro ureia 7,5 M 10, 7 ureia 6 M 8,1 ureia 3 M 32,3 ureia 1,5 M 35,0 Tween 20 19,3 metanol 33,7 etanol 33,5 sacarose a 5% 31, 6 manitol 30,8 108 (Resultados obtidos utilizando resina de permuta de catiões). Processo em pequena escala do Exemplo 2 Método Resina carregada à razão de 3,3 g/L 1,5 mL de resina por experiência Resina equilibrada com aditivo antes do carregamento com proteína Eluição por adição de NaCl/acetato 2,5 M a pH 4; 1:10 v/v Incubação durante 24 horas com tudo a 1% com as excepções indicadas Aditivo/estado % de Agreqado polifosfato a 1% 61,2 polifosfato a 0,1% 42,5 polifosfato a 0,01% 33, 6 fosfato 25 mm, pH 2,2 19, 7 fosfato 25 mm, pH 3 22,3 fosfato 25 mm, pH 5,5 63,1 fosfato 25 mm, pH 6,5 42, 9 formiato 25 mm, pH 4 29,0 controlo 1 31,8 controlo 2 31,1
Exemplo 3
Técnica analítica por RPHPLC
Utiliza-se agora a RPHPLC para monitorizar e quantificar as percentagens de espécies peguiladas (v.g., PEG-4, PEG-5 e PEG-6) existentes nas fracções da coluna de 'Q-Sepharose' que contêm o pegvisomant obtido por purificação de permuta de aniões. 109
Aplica-se 25 pL de cada fracção de 'Q-Sepharose' (passo de permuta de aniões, ver o Exemplo 1 anterior) (concentrações das proteínas variando entre 0,5 e 1,3 mg/mL) a uma coluna 'Zorbax 300SB-CN' (4,6 mm x 150 mm; 3,5 pm; número de inventário 863973-905; número de série USMJ001205). A fase móvel A é ácido trifluoroacético a 0,1%, ao passo que a fase móvel B é constituída por ácido trifluoroacético a 0,085% em acetonitrilo. Utiliza-se um gradiente linear de tampão B, variando entre 40 e 50% ao longo de 20 minutos, com um caudal de 1,0 mL/minuto à temperatura ambiente, para separar as diferentes formas peguiladas de Pegvisomant. Monitorizou-se a absorvência a 214 nm.
Os resultados obtidos por RPHPLC são semelhantes aos obtidos por electroforese capilar (CE), conforme indicado nas figuras 2-4 subsequentes. Ver também o Exemplo 4 subsequente que diz respeito a um processo exemplificativo da técnica analítica de CE. 110
Quadro 3
Análise das fracções de 'Q-Sepharose' contendo pegvisomant, por electroforese capilar, com a finalidade de se determinar as percentagens de cada espécie peguilada (as fracções 7 a 18 também foram analisadas por RPHPLC - ver o Quadro 4) fracção concentração inicial (mg/mL) 0 0 PEG-2 0 0 PEG-3 0. 0 PEG-4 0. 0 PEG-5 0 0 PEG-6 0 0 PEG-7 0 0 PEG-8 2 0,59 0,0 0,0 2,8 26,3 39, 6 25,3 6,0 3 0,88 0,0 0,0 4,6 28,6 44,8 18,8 3,2 4 1,04 0,0 0,0 5,8 28,1 48,6 15,9 1,7 5 1,16 0,0 0,0 6,2 28,3 49,8 14,1 1,6 6 1,23 0,0 0,0 5,4 29,9 54,5 10,2 0,0 1,27 , ^ r - . ssiPr.0:.·.·.· 54,1 0,0 8 1,2? , '5,S·.··· l|9,0.... 50, b ...0,-8..... 0,0 9......... 1,27 49,9 41,8 3,8 ::M: Illlllll.......... ........ 1,24 ;;;;;;;; !"(M...... ......Ô>0..... |v5>1...... δ-9-rO··· IPrl..... .....2>0..... 0,0 - 11 1,21 ::::::0:,0:::::: c,2 :05,,9:::: 116,:4:::: 2,5 0,0- 1,17 ::::::Qj::Q::::: ::04:,:4:::: li?:,::?::::: :::::0111:: o, o..... , 0,0 ......Ο.,.δ...... ...:15,.3.... l.\h li,.2.... 0,0 0,0 Í|l,09 -1: 0,0 101.,.01 17007.1 lll,0ii 0,1 0,0 15 ........111·,-05.............. ......0.,011 ιιθ·,·0ΐι 107,01 107,011 illllii .0,011 0,0··· 16 1,01 0,0 0,0 ....:48,2 •140,01 llll0.il .011::: 0,0- 17 0,97 0,0 0,0 ·' * , ' 0 9 M > 0,01 18 ........Il&r5|||......... 0,0 2,1 31,8 3,0 0,0 0,0 19 0,84 0,0 0,0 80,8 19,2 0,0 0,0 0,0 20 0,77 0,0 1,2 78,2 20,7 0,0 0,0 0,0 21 0,71 0,0 6,8 77,3 15,9 0,0 0,0 0,0 22 0,65 0,0 12,3 75, 9 11,9 0,0 0,0 0,0 23 0,61 0,0 18,9 70,3 10,8 0,0 0,0 0,0 24 0,56 0,0 21,5 69,5 9,0 0,0 0,0 0,0
A região sombreada (isto é, as fracções 7 a 18) representa as fracções que também foram analisadas por RPHPLC 111
Quadro 4
Distribuição de diferentes formas peguiladas de pegvisomant através das fracções de 'Q-Sepharose', conforme determinado
por CE e por RPHPLC % PEG-4 %PEG-5 %PEG-6 % PEG-7 fracção CE ::I|!!|LÇ:: CE RPHPLC. CE CE ::ΐ =7=1 7 5,2 5,8 33,0 54,1 7,7 8,3 8 5, 3 39, 3 50,6 4,8 5,5 C ^ - 9 4,5 5,5 49, 9 52, 6 41,8 3 , 3 3,8 .......4, 6 10 5,1 59, 5 33,1 2,3 3,1 S r - ............ 11 6,2 8,5 65, 9 m· 71,6 25,4 2,5 2, 3 12 7,9 11,4 74,4 72,7 17,7 * ** i ^ 0,0 13 15,3 1 ,7 72, 6 -- - 12,2 1Ϊ (6 0,0 ο, η 14 21,4 28,4 70, 7 63,7 8,0 7,9 0,0 η,η 15 37,3 4/, - 57,3 ~ , c 5,4 5, ' 0,0 ·,<» 16 48,2 54,0 47,0 41,8 4,8 4,1 0,0 0,0 17 55,8 84,: 40,2 32; 5 SSSÍ^^ 3,9 , 0,0 18 62,4 71,5 31,8 mmmmém 3,6 3,1 0,0 ο,.ο
Nas figuras 2, 3 e 4 estão apresentados resultados comparativos obtidos por CE vs. RPHPLC para B-2036 PEG-4, B-2036 PEG-5 e B-2036 PEG-6. 112
Comparação dos métodos de RP-HPLC e de CE para quantificar a percentagem de espécies PEG-4 em fracçôes de permuta de aniões
7 a 9 10 11 12 13 14 15 í§ 17 13 Fracçôes de Q-Sepharose
Figura 2. Comparação gráfica das percentagens de espécies B-2036 PEG-4 encontradas nas fracçôes 7 a 18 de 'Q-Sepharose', conforme determinado por electroforese capilar e por HPLC de fase inversa.
Figura 3. Comparação gráfica das percentagens de espécies B-2036 PEG-5 encontradas nas fracçôes 7 a 18 de 'Q-Sepharose', conforme determinado por electroforese capilar e por HPLC de fase inversa. 113 113Comparação dos métodos de RP-HPLC e de CE para quantificar a percentagem de espécies PEGJ3 em fracções de permuta de anides
Fracções tle Q-Sephaross
Figura 4. Comparação gráfica das percentagens de espécies B-2036 PEG-6 encontradas nas fracções 7 a 18 de 'Q-Sepharose', conforme determinado por electroforese capilar e por HPLC de fase inversa.
Exemplo 4
Técnica Analítica de CE
As fracções de 'Q-Sepharose' foram analisadas por electroforese capilar, conforme a seguir se descreve. Preparou-se o capilar, com um diâmetro interno de 50 ym e com um comprimento eficaz de 37 cm, enxaguando-o com uma solução de NaOH 1,0 N durante 10 minutos a uma pressão de 20 psi, seguindo-se um período de enxaguamento de 20 minutos com o tampão da experiência. O tampão da experiência, constituído por ácido fosfórico 40 mM contendo 0'0-bis(2-aminopropil)-polietileno-glicol na concentração de 4 mg/mL e óxido de polietileno na concentração de 0,1 114 mg/mL, a pH entre 1,9-2,0, foi preparado a partir de uma solução original 10X, tendo sido filtrado através de um filtro de 0,22 ym com a finalidade de se lhe remover as partículas diminutas que pudessem entupir o capilar.
Aqueceu-se as amostras à temperatura ambiente com a finalidade de se evitar a formação de agregados ao entrarem em contacto com o tampão de diluição dessas amostras (ácido fosfórico 40 mM, contendo 0'0-bis(2-aminopropil)-polietileno-glicol na concentração de 4 mg/mL a pH entre 1,9-2,2) ou tampão da experiência. As amostras que tinham uma concentração inferior a 0,5 mg/mL não foram analisadas. As amostras com concentrações h 0,5 mg/mL fora injectadas tal qual, ao passo que as amostras com uma concentração superior a 2,0 mg/mL foram diluídas para 2,0 mg/mL, utilizando o tampão de diluição das amostras. As amostras foram injectadas dentro do capilar, aplicando uma pressão de 0,5 psi durante 10-60 segundos. A seguir à injecção das amostras, injectou-se o tampão da experiência durante 3 segundos a uma pressão de 0,5 psi, com a finalidade de se concentrar a amostra. As amostras foram separadas durante 25 minutos a 30 kV e a uma temperatura mínima de 30°C, tendo sido detectadas a 214 nm. Antes da injecção subsequente de cada amostra lavou-se o capilar com uma solução de NaOH 0,1N, pelo menos durante um minuto a 20 psi e com tampão da experiência durante 2 minutos, com a finalidade de se remover das paredes do capilar qualquer amostra retida. O armazenamento das amostras foi feito a 25-30°C.
Os electroferogramas resultantes foram integrados dividindo os picos no ponto mais baixo entre máximos adjacentes, tendo sido calculado o valor percentual da área corrigida. 115
Utilizando o processo supramencionado, conjuntamente com os preceitos do passo 4, fluxograma 1, exemplo 1, obtém-se por CE os resultados que estão indicados nas figuras 2-4 anteriores.
Exemplo 5
Primeiro Exemplo de Preparação de Misturas de Fracções
As fracções de 'Q-Sepharose' foram analisadas por CE conforme a seguir se descreve. Preparou-se o capilar, com um diâmetro interno de 50 pm e com um comprimento eficaz de 37 cm, enxaguando-o com uma solução de NaOH 1,0 N durante 10 minutos a uma pressão de 20 psi, seguindo-se um período de enxaguamento de 20 minutos com o tampão da experiência. O tampão da experiência, constituído por ácido fosfórico 40 mM contendo O'O-bis(2-aminopropil)-polietileno-glicol na concentração de 4 mg/mL e óxido de polietileno na concentração de 0,1 mg/mL, a pH entre 1,9-2,0, foi preparado a partir de uma solução original 10X, tendo sido filtrado através de um filtro de 0,22 pm com a finalidade de se lhe remover as partículas diminutas que pudessem entupir o capilar.
Aqueceu-se as amostras à temperatura ambiente com a finalidade de se evitar a formação de agregados ao entrarem em contacto com o tampão de diluição dessas amostras (ácido fosfórico 40 mM, contendo O'O-bis(2-aminopropil)-polietileno-glicol na concentração de 4 mg/mL a pH entre 1,9-2,2) ou tampão da experiência. As amostras que tinham uma concentração inferior a 0,5 mg/mL não foram analisadas. As amostras com concentrações h 0,5 mg/mL fora injectadas tal 116 qual, ao passo que as amostras com uma concentração superior a 2,0 mg/mL foram diluídas para 2,0 mg/mL, utilizando o tampão de diluição das amostras. As amostras foram injectadas dentro do capilar, aplicando uma pressão de 0,5 psi durante 10-60 segundos. A seguir à injecção das amostras, injectou-se o tampão da experiência durante 3 segundos a uma pressão de 0,5 psi, com a finalidade de se concentrar a amostra. As amostras foram separadas durante 25 minutos a 30 kV e a uma temperatura mínima de 30°C, tendo sido detectadas a 214 nm. Antes da injecção subsequente de cada amostra lavou-se o capilar com uma solução de NaOH 0,1N, pelo menos durante um minuto a 20 psi e com tampão da experiência durante 2 minutos, com a finalidade de se remover das paredes do capilar qualquer amostra retida. O armazenamento das amostras foi feito a 25-30°C.
Os electroferogramas resultantes foram integrados dividindo os picos no ponto mais baixo entre máximos adjacentes, tendo sido calculado o valor percentual da área corrigida.
Utilizando o processo supramencionado, conjuntamente com os preceitos do passo 4, fluxograma 1, exemplo 1, obtém-se por CE os resultados que estão indicados no Quadro 5a subsequente. Preparou-se uma mistura de isoformas peguiladas e enriquecidas, utilizando o critério de aceitação de fracções para misturas, todas as fracções analisadas por CE com uma composição ^ 74% de PEG4 + 5+6 (primeira fracção) e ^94% de PEG4+5+6 (última fracção) e ^0,5 mg/mL. Foram seleccionadas as fracções 6 a 25 (Quadro 5a subsequente), tendo sido combinadas numa mistura utilizando estes critérios. O material de partida de UF/DF#3 e as fracções combinadas em mistura foram submetidas a análise por CE, conforme se disse 117 anteriormente. Após a selecção e a preparação de misturas das fracções, a análise da mistura de material revela o enriquecimento em isoformas PEG-4, PEG-5 e PEG-6. Ver o Quadro 5b subsequente que indica o mesmo.
Quadro 5a
Fracção # Concentração das proteínas (mg/rrC) PEG-2 PEG-3 PEG-4 PEG-5 PEG-6 PEG-7 PEG- -8 PEG (4+5+6) 1 0,23 2 0, 65 0 3 0, 91 2 18 40 32 9 60 4 1,06 3 19 41 31 6 63 5 1,15 4 22 43 27 5 69 6 1,21 4 26 44 23 3 74 7 1,27 3 28 49 20 80 8 1,28 3 25 55 17 83 9 1,28 3 25 60 12 88 10 1,27 4 30 58 8 92 11 1,25 4 47 43 6 94 12 1,23 4 52 39 5 95 13 1,20 3 62 31 4 96 14 1,15 5 70 23 3 98 15 1,11 6 69 24 1 99 16 1,06 10 76 15 101 17 1,02 23 70 7 100 18 0, 98 31 63 6 100 19 0, 94 44 50 5 99 20 0, 90 54 41 5 100 21 0,84 60 35 5 100 22 0,78 66 29 5 100 23 0,71 77 21 2 100 24 0, 64 82 16 2 100 25 0, 58 2 83 13 2 98 118 26 0,54 9 74 17 3 94 27 0,50 18 68 14 0 82
Quadro 5b
Fracção # Concentração das proteínas (mg/mL) PEG-2 PEG-3 PEG-4 PEG-5 PEG-6 PEG-7 PEG-8 PEG (4+5+6) Mistura de UF/DF#3 5,86 5 21 33 30 9 1 84 Fracções da mistura 1,04 25 38 30 7 93
Exemplo 6
Segundo Exemplo de preparação de misturas de fracções
As fracções de ' Q-Sepharose' foram analisadas por CE conforme a seguir se descreve. Preparou-se o capilar, com um diâmetro interno de 50 ym e com um comprimento eficaz de 37 cm, enxaguando-o com uma solução de NaOH 1,0 N durante 10 minutos a uma pressão de 20 psi, seguindo-se um período de enxaguamento de 20 minutos com o tampão da experiência. O tampão da experiência, constituído por ácido fosfórico 40 mM contendo O'O-bis(2-aminopropil)-polietileno-glicol na concentração de 4 mg/mL e óxido de polietileno na concentração de 0,1 mg/mL, a pH entre 1,9-2,0, foi preparado a partir de uma solução original 10X, tendo sido filtrado através de um filtro de 0,22 ym com a finalidade de se lhe remover as partículas diminutas que pudessem entupir o capilar.
Aqueceu-se as amostras à temperatura ambiente com a finalidade de se evitar a formação de agregados ao entrarem 119 em contacto com o tampão de diluição dessas amostras (ácido fosfórico 40 mM, contendo 0'0-bis(2-aminopropil)-polietileno-glicol na concentração de 4 mg/mL a pH entre 1,9-2,2) ou tampão da experiência. As amostras que tinham uma concentração inferior a 0,5 mg/mL não foram analisadas. As amostras com concentrações A 0,5 mg/mL fora injectadas tal qual, ao passo que as amostras com uma concentração superior a 2,0 mg/mL foram diluídas para 2,0 mg/mL, utilizando o tampão de diluição das amostras. As amostras foram injectadas dentro do capilar, aplicando uma pressão de 0,5 psi durante 10-60 segundos. A seguir à injecçâo das amostras, injectou-se o tampão da experiência durante 3 segundos a uma pressão de 0,5 psi, com a finalidade de se concentrar a amostra. As amostras foram separadas durante 25 minutos a 30 kV e a uma temperatura mínima de 30°C, tendo sido detectadas a 214 nm. Antes da injecçâo subsequente de cada amostra lavou-se o capilar com uma solução de NaOH 0,1N, pelo menos durante um minuto a 20 psi e com tampão da experiência durante 2 minutos, com a finalidade de se remover das paredes do capilar qualquer amostra retida. O armazenamento das amostras foi feito a 25-30°C.
Os electroferogramas resultantes foram integrados dividindo os picos no ponto mais baixo entre máximos adjacentes, tendo sido calculado o valor percentual da área corrigida.
Utilizando o processo supramencionado, conjuntamente com os preceitos do passo 4, fluxograma 1, exemplo 1, obtém-se por CE os resultados que estão indicados no Quadro 5a subsequente. Preparou-se uma mistura de isoformas peguiladas e enriquecidas, utilizando o critério de aceitação de fracções para misturas, todas as fracções analisadas por CE com uma composição h 74% de PEG4+5+6 120 (primeira fracção) e ^94% de PEG4+5+6 (última fracção) e ^0,5 mg/mL. Foram seleccionadas as fracções 3 a 20 (Quadro 6a subsequente), tendo sido combinadas numa mistura utilizando estes critérios. O material de partida de UF/DF n°3 (medido no lote de HIC) e as fracções combinadas em mistura foram submetidas a análise por CE, conforme se disse anteriormente. Após a selecção e a preparação de misturas das fracções, a análise da mistura de material revela o enriquecimento em isoformas PEG-4, PEG-5 e PEG-6.
Ver o Quadro 6b subsequente que indica o Quadro 6a mesmo Fracção # Concentração das proteínas (mg/mL) PEG-2 PEG-3 PEG-4 PEG-5 PEG-6 PEG-7 PEG-8 PEG (4+5+6) 1 0,17 2 0,59 3 26 40 25 5 69 3 0,88 5 29 45 19 3 78 4 1,04 6 28 49 16 2 83 5 1,6 6 28 50 14 98 6 1,24 5 30 55 10 100 7 1,27 5 33 54 8 100 8 1,27 5 39 51 5 100 9 1,27 5 50 42 4 100 10 1,24 5 60 33 2 100 11 1,21 6 66 25 3 100 12 1,17 8 74 18 100 13 1,13 15 73 12 100 14 1,09 21 71 8 100 15 1,05 37 57 5 100 16 1,01 48 47 5 100 17 0,97 56 40 4 100 18 0,91 2 62 32 4 98 121 19 0,84 0 81 19 100 20 0,77 1 78 21 99 21 0,71 7 77 16 93 22 0,66 12 76 12 88 23 0,61 19 70 11 81 24 0,57 22 70 9 79
Quadro 6b
Fracção # Concentração das proteínas (mg/itíL) PEG-2 PEG-3 PEG-4 PEG-5 PEG-6 PEG-7 PEG-8 PEG (4+5+6) Mistura de UF/DF#3* 3,51 9 27 37 22 4 86 Fracções da mistura 1,08 22 46 28 5 96
* medido no lote de HIC
Embora o texto anterior diga respeito à B-2036 recombinante e à B-2036 PEG recombinante, salvo quando indicado de outro modo, subentende-se que o conteúdo da presente invenção pode ser utilizado com qualquer antagonista peguilado da hormona do crescimento recombinante, quer seja um antagonista da hormona de crescimento dos mamíferos, um antagonista peguilado da hormona de crescimento humano ou um antagonista peguilado da hormona de crescimento dos bovinos, etc.. 122 LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS <110> Boyle et al. <120> Processo para diminuir os níveis de agregação de proteínas peguiladas <130> 161765.00521 <150> US 60/412,227 <151> 2002-09-20 <160> 2 <170> FastSEQ para Windows Versão 4.0
<210> 1 <211> 191 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 1 123
Phe Pro Thr He Pro Leu Ser Arg Leu Pi 3 1 Asn Ala Met Leu Arg 1 5 10 15 Ala Asp Arg Leu Asn Gin Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gin Glu Phe Glu 20 25 30 Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gin Lys Tyr ser Phe Leu Gin Asn Pro 35 40 45 Gin Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg 50 55 60 Glu Glu Thr Gin Gin Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu 65 70 . 75 80 Leu Leu He Gin Ser Trp Leu Glu Pro Vai Gin Phe Leu Arg Ser Vai 85 90 95 Phe Ala Asn Ser Leu Vai Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Vai Tyr Asp 100 105 110 Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Lys Ile Gin Thr Leu Met Gly Arg Leu 115 120 125 Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gin Ile Phe Lys Gin Thr Tyr Ser 130 135 140 Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp 'Ala Leu Leu Lys Asn Tyr 145 150 155 160 Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Asn Ala Asp Met Ser Arg Vai Ser Thr Phe 165 170 175 Leu Arg Thr Vai Gin Cys Arg Ser Vai Glu Gly Ser Cys Gly Phe 180 185 190
<210> 2 <211> 191 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 124
Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg 1 5 10 15 Ala His Arg Leu His Gin Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gin Glu Phe Glu 20 25 30 Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gin Lys Tyr Ser Phe Leu Gin Asn Pro 35 40 45 Gin Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg 50 55 60 Glu Glu Thr Gin Gin Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu 65 70 75 80 Leu Leu He Gin Ser Trp Leu Glu Pro Vai Gin Phe Leu Arg Ser Vai 85 90 95 Phe Ala Asn Ser Leu Vai Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Vai Tyr Asp 100 105 110 Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gin Thr Leu Met Gly Arg Leu 115 120 125 Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gin Ile Phe Lys Gin Thr Tyr Ser 130 135 • 140 Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr 145 150 155 160 Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Vai Glu Thr Phe 165 170 175 Leu Arg Ile Vai Gin Cys Arg Ser Vai Glu Gly Ser Cys Gly Phe 180 185 190 125
REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO A presente listagem de referências citadas pela requerente é apresentada meramente por razões de conveniência para o leitor. Não faz parte do documento de patente de invenção europeia. Embora se tenha tomado todo o cuidado durante a compilação das referências, não é possível excluir a existência de erros ou omissões, pelos quais o IEP não assume nenhuma responsabilidade.
Documentos de patentes citados na descrição • US 5849535 A [0005] [0008] [0044] [0056] [0068] [0080] [0092] [0145] US 6057292 A [0005] [0008] wo 9424157 A [0012] [0013] wo 9602570 A [0013] wo 0002900 A [0014] wo 02057478 A [0015] US 6265542 Bl [0016] US 6333399 Bl [0016] US 5747639 A [0016] US 9619459 W [0016] US 2002002271 Al, Rinderknecht [0016] US 5672662 A [0044] US P107891 A [0145] US 60412227 B [0164]
Literatura citada na descrição, para além das patentes de invenção • Jorgensen et al. Quantifying biosynthetic humangrowth hormone in Escherichia coli with electrophoresis under 126 hydrophobic conditions. J. Chromatography, 1998, vol. A 817, 205-214 [0003] • Andersson et al. Isolation and characterization of a trisulfide variant of recombinant human growth hormone formed during expression in Escherichia coli. Int. J. Peptide Protein Res., 1996, vol. 47, 311-321 [0010] • A. Jesperson et al. Characterisation of a trisulphide derivative of biosynthetic human growth hormone produced in Escherichia coli. Eur. J. Biochem., 1994, vol. 219, 365-373 [0010] • J. Houk; G.M. Whitesides. Structure-Reactivity Relations for Thiol-Disulfide Interchange. J. M. Chem. Soc., 1987, vol. 109, 6825-6836 [0046] • The Chemistry & Biochemistry of the Sulfhydro Group in Amino Acids. Sigmund, M. Peptides and Proteins. Pergamon, 1973 [0046] • The Merck Index. Therapeutic Category and Biological Activity Index. Merck & Co., Inc, 1996, THER-19 [0058] [0070] [0094] • Remington's Pharmaceutical Sciences. Mack Publishing Co, 1980 [0058] [0070] [0082] [0094] • The United States Pharmacopeia. United States Pharmacopeial Convention, Inc, 1985 [0058] [0070] [0082] [0094] • SIGMA, Biochemicals and Reagents for Life Science
Research Catalogue, 2002 [0058] [0070] [0082] [0094] • Aldrich. Handbook of Fine Chemicals and Laboratory Equipment. 2000 [0058] [0070] [0082] [0094] • The Merck Index. Therapeutic Category and Biological Activity Index. Merck & Co., Inc, 1996 [0082] 127 • Swapan K. Chowdhury et al. Fingerprinting Proteins Coupled with Polymers by Mass Spectrometry: Investigation of Polyethylene Glycol-Conjugated Superoxide Dismutase. American Society for Mass Spectrometry, 1995, vol. 6, 478-487 [0131]
Lisboa, 18/02/2010
Claims (12)
1 REIVINDICAÇÕES 1. Processo para diminuir o nível de agregação de um antagonista peguilado da hormona do crescimento (GH) e suas isoformas, compreendendo o referido processo os passos seguintes: (a) arranjar o referido antagonista peguilado da hormona de crescimento (GH) e suas isoformas; (b) com o referido antagonista peguilado da hormona de crescimento (GH) e suas isoformas, incluindo quaisquer impurezas e quaisquer seus agregados, carregar uma resina de permuta de aniões (AEX), em que o carregamento é efectuado a uma condutividade inferior ou igual a cerca de 10 mS/cm, a valores de pH compreendidos entre cerca de 5 e cerca de 10, e com uma concentração da proteína inferior ou igual a cerca de 10 g de proteína/L de volume de leito compactado de resina de permuta aniónica (AEX); e (c) separar o referido antagonista peguilado da hormona de crescimento (GH) e suas isoformas por cromatografia de AEX.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a referida resina de AEX é seleccionada entre o conjunto constituído por ANX4™, DEAE™, Q-Sepharose™, Q-Sepharose FF™, Q-Sepharose HP™ e Q-Sepharose XL™.
3. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 ou 2, em que, no passo (b) , o carregamento é efectuado a valores de condutividade inferiores ou iguais a cerca de 5 mS/cm. 2
4. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 ou 2, em que, no passo (b) o carregamento é efectuado a valores de condutividade inferiores ou iguais a cerca de 2,4 mS/cm.
5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o referido passo (b) é efectuado a valores de pH do carregamento de AEX compreendidos entre cerca de 6,6 e cerca de 9.
6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o referido passo (b) é efectuado a valores de pH do carregamento de AEX compreendidos entre cerca de 6,9 e cerca de 7,1.
7. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o referido antagonista peguilado da hormona de crescimento (GH) e suas isoformas compreendem o antagonista da hormona do crescimento (GH) e suas isoformas peguiladas em um ou vários locais.
8. Processo de acordo com a reivindicação 7, em que o referido antagonista peguilado da hormona de crescimento (GH) e suas isoformas compreendem uma ou várias isoformas do antagonista peguilado da hormona de crescimento (GH), seleccionadas entre o conjunto constituído por: PEG-1 (uma molécula de B-2036 (SEQ ID NO: 1) com uma molécula de PEG ou uma sua variante), PEG-2 (uma molécula de B-2036 (SEQ ID NO: 1) com duas moléculas de PEG ou uma sua variante), 3 PEG-3 (uma molécula de B-2036 (SEQ ID NO: 1) com três moléculas de PEG ou uma sua variante), PEG-4 (uma molécula de B-2036 (SEQ ID NO: 1) com quatro moléculas de PEG ou uma sua variante), PEG-5 (uma molécula de B-2036 (SEQ ID NO: 1) com cinco moléculas de PEG ou uma sua variante), PEG-6 (uma molécula de B-2036 (SEQ ID NO: 1) com seis moléculas de PEG ou uma sua variante), PEG-7 (uma molécula de B-2036 (SEQ ID NO: 1) com sete moléculas de PEG ou uma sua variante), PEG-8 (uma molécula de B-2036 (SEQ ID NO: 1) com oito moléculas de PEG ou uma sua variante) e PEG-9 (uma molécula de B-2036 (SEQ ID NO: 1) com nove moléculas de PEG ou uma sua variante), e qualquer agregado, impureza trissulfureto (molécula de antagonista da hormona do crescimento (GH) contendo um átomo de enxofre suplementar que forma uma "ponte trissulfureto" com a molécula), suas impureza des-phe (molécula de antagonista da hormona de crescimento (GH) à qual falta fenilalanina no seu terminal amino) , qualquer impureza não peguiladas do referido antagonista da hormona de crescimento (GH) e quaisquer moléculas de PEG livres.
9. Processo de acordo com a reivindicação 1, o qual compreende também um passo (d) que consiste na combinação de quantidades discretas de isoformas do antagonista peguilado da hormona de crescimento (GH) para se obter um antagonista peguilado de hormona de crescimento (GH) combinado por meio de uma técnica seleccionada entre o conjunto seguinte: 4 electroforese capilar (CE), electroforese em gel de poliacrilamida com dodecil-sulfato de sódio (SDS-PAGE), cromatografia de permuta de iões (IEX) cromatografia de interacção hidrofóbica (HIC), cromatografia de permuta de aniões (AEX), cromatografia de permuta de catiões (CEX), cromatografia liquida de alto rendimento de fase inversa (RPHPLC), cromatografia liquida de elevado rendimento de exclusão molecular (SEHPLC), cromatografia por afinidade (AC) e suas combinações.
10. Processo de acordo com a reivindicação 9, em que o referido antagonista peguilado da hormona do crescimento (GH) combinado compreende uma ou várias das espécies PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9.
11. Processo de acordo com a reivindicação 10, em que uma fracção de PEG-4, PEG-5 e PEG-6 do antagonista peguilado da hormona de crescimento (GH) combinado compreende pelo menos cerca de 70% em peso, com base num peso total das referidas isoformas PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9 do antagonista peguilado da hormona de crescimento (GH) e de quaisquer seus agregados.
12. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o referido nivel reduzido do referido agregado é inferior ou igual a cerca de 10% em peso, tomando por base um peso total das referidas isoformas e dos referidos agregados. Lisboa, 18/02/2010
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