CN112107880B - 一种低共熔混合物及利用其萃取鲟鱼鱼籽蛋白质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物蛋白质提取技术领域，公开了一种低共熔混合物及利用其萃取鲟鱼鱼籽蛋白质的方法。该低共熔混合物，主要由以下原料组分制得：生物碱和有机酸；有机酸选自草酸、抗坏血酸或咖啡酸中的至少一种；生物碱和有机酸的摩尔比为(1‑10)：(2‑20)。该低共熔混合物萃取鲟鱼鱼籽蛋白质的方法为：(1)将低共熔混合物与水混合，然后调pH至5‑11，制得低共熔混合物的水溶液；(2)将鲟鱼鱼籽与低共熔混合物的水溶液混合，预冻和解冻，将解冻后的混合物匀质、离心，上清液过滤。该低共熔混合物对鲟鱼鱼籽蛋白质具有很好的萃取效果，萃取效率高，萃取所得的蛋白质生物活性好，稳定性好。

Description

一种低共熔混合物及利用其萃取鲟鱼鱼籽蛋白质的方法

技术领域

本发明属于动物蛋白质提取技术领域，特别涉及一种低共熔混合物及利用其萃取鲟鱼鱼籽蛋白质的方法。

背景技术

鲟鱼种类繁多，是可淡水养殖的鱼类。从鲟鱼中提取到的鲟鱼鱼籽蛋白质具有多种功能功。研究发现，鲟鱼鱼籽蛋白质具有多种生物学功能，例如抗氧化、降血压、抗菌以及医药方面均有良好的表现。但鲟鱼鱼籽蛋白质的萃取效率极大影响着蛋白质的利用与开发。

目前萃取鱼籽蛋白质的方法主要是通过水溶剂进行萃取，但该方法存在的问题有很多，诸如其萃取效率不高、萃取得到的蛋白质稳定性差，蛋白质易变性失活等。

因此，希望提供一种能高效萃取鲟鱼鱼籽蛋白质的方法，且萃取得到的蛋白质生物活性好及稳定性好，易于存储，是十分有必要的。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种低共熔混合物(即两种或两种以上物质形成的熔点最低的混合物)及利用其萃取鲟鱼鱼籽蛋白质的方法，利用本发明所述的低共熔混合物(简称DES)萃取鳕鱼鱼籽蛋白质具有萃取效率高，萃取所得的蛋白质生物活性好，稳定性好，易于存储。

本发明构思：因为不同的天然酸、碱具有不同的性质，天然酸与碱之间形成了特定的化合物(盐)，这些化合物(盐)具有提高蛋白萃取的独特性质(不同的盐作用效果不同，筛选这些酸、碱以及盐类是本领域的工作重点及难点)。另外，从不同的动物中萃取蛋白质，由于动物种类不同，萃取效果也存在差异。本发明选用特定的酸和碱以特定的比例混合，制得低共熔混合物，利用该低共熔混合物对鲟鱼鱼籽蛋白质具有很好的萃取效果，萃取效率高，萃取所得的蛋白质生物活性好，稳定性好，易于存储。

因此，本发明的第一方面提供一种低共熔混合物。

具体的，一种低共熔混合物，主要由以下原料组分制得：生物碱和有机酸；所述有机酸选自草酸、抗坏血酸或咖啡酸中的至少一种；所述生物碱和有机酸的摩尔比为(1-10)：(2-20)。

具体的，一种低共熔混合物的制备方法为：将生物碱与有机酸按照摩尔比为(1-10)：(2-20)的比例搅拌混合制得；所述有机酸选自草酸、抗坏血酸或咖啡酸中的至少一种。

优选的，所述生物碱选自甜菜碱、三乙醇胺、咪唑、咖啡碱、茶碱、可可碱、苦参碱或左旋肉碱中的至少一种。

优选的，所述生物碱与有机酸按照摩尔比为(2-4)：(3-8)的比例搅拌混合。

优选的，所述搅拌混合的过程中还包括旋转。旋转使得搅拌混合更为均匀。

发明所述低共熔混合物(简称DES)是一种既可以对水溶性成分又可以对脂溶性成分进行提取，它具有无毒、无害以及萃取后的混合物中不需要去除所述低共熔混合物的特性，可以直接应用于不同的方向，因此，利用DES对鱼籽中的多肽进行高效萃取，且萃取的蛋白质保持高的活性。

本发明的第二方面提供一种利用上述低共熔混合物萃取鲟鱼鱼籽蛋白质的方法。

具体的，利用上述低共熔混合物萃取鲟鱼鱼籽蛋白质的方法，包括以下步骤：

(1)将上述低共熔混合物与水混合，然后调pH至5-11，制得低共熔混合物的水溶液，备用；

(2)将鲟鱼鱼籽与步骤(1)制得的低共熔混合物的水溶液混合，进行预冻和解冻，将解冻后的混合物进行匀质、离心，取上清液过滤，取滤液。

优选的，步骤(1)中，所述水为去离子水。

优选的，步骤(1)中，所述低共熔混合物的水溶液中，低共熔混合物的质量浓度为1-80％；进一步优选的，共熔混合物的质量浓度为10-50％。

优选的，步骤(1)中，调pH所用的酸或碱选自制备所述低共熔混合物用到的生物碱或有机酸。

优选的，步骤(2)中，鲟鱼鱼籽与步骤(1)制得的低共熔混合物的水溶液按照质量比为(2-40)：(9-120)的比例混合；进一步优选的，鲟鱼(1)制得的低共熔混合物的水溶液按照质量比为(5-30)：(15-100)的比例混合；更优选的，鲟鱼鱼籽与步骤(1)制得的低共熔混合物的水溶液按照质量比为(8-25)：(30-90)的比例混合。

优选的，步骤(2)中，所述预冻的温度为-20至-80℃；进一步优选的，所述预冻的温度为-25至-60℃。

优选的，步骤(2)中，所述解冻的温度为10至30℃；进一步优选的，所述解冻的温度为15至25℃。

优选的，步骤(2)中，所述预冻和解冻的过程重复进行1-20次；进一步优选的，所述预冻和解冻的过程重复进行3-15次。

优选的，步骤(2)中，所述匀质的条件为：在转速为1100-8000r/min的条件下匀质1-60min；进一步优选的，所述匀质的条件为在转速为2000-7000r/min的条件下匀质5-45min。

优选的，步骤(2)中，所述离心的条件为：在转速为7000-10000r/min的条件下离心1-40min；进一步优选的，所述离心的条件为在转速为8000-10000r/min的条件下离心1-30min。

步骤(2)所得滤液含有鱼籽蛋白质，需要在-20℃至4℃的条件下保存。

本发明的第三方面提供上述低共熔混合物在提取动物蛋白质领域中的应用。

相对于现有技术，本发明的有益效果如下：

(1)本发明选用特定的酸和碱以特定的比例混合，制得低共熔混合物，利用该低共熔混合物对鲟鱼鱼籽蛋白质具有很好的萃取效果，萃取效率高，萃取所得的蛋白质生物活性好，稳定性好，易于存储。

(2)本发明利用低共熔混合物萃取鲟鱼鱼籽蛋白质的过程简单，适合工业化量产，可充分利用现有养殖鲟鱼的鱼资源。

具体实施方式

为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。

以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。

实施例1：低共熔混合物的制备及利用其萃取鲟鱼鱼籽蛋白质的方法

一种低共熔混合物，主要由以下原料组分制得：将左旋肉碱与草酸按照摩尔比为2：1的比例搅拌、旋转混合制得。

利用上述低共熔混合物萃取鲟鱼鱼籽蛋白质的方法，包括以下步骤：

(1)将上述低共熔混合物与去离子水混合，然后调pH至7.0，制得低共熔混合物的水溶液，低共熔混合物的质量浓度为5％，备用；

(2)将1g鲟鱼鱼籽与49g步骤(1)制得的低共熔混合物的水溶液混合，进行预冻和解冻，预冻的温度为-20℃，解冻的温度为25℃，预冻和解冻的过程重复进行8次，将解冻后的混合物在转速为6000r/min的条件下匀质15min，然后在转速为10000r/min的条件下离心8min，取上清液过滤，取滤液，即可，所得滤液含有鲟鱼鱼籽蛋白质，在-20℃至4℃的条件下保存。

实施例2：低共熔混合物的制备及利用其萃取鲟鱼鱼籽蛋白质的方法

一种低共熔混合物，主要由以下原料组分制得：将茶碱与抗坏血酸按照摩尔比为6：9的比例搅拌、旋转混合制得。

利用上述低共熔混合物萃取鲟鱼鱼籽蛋白质的方法，包括以下步骤：

(1)将上述低共熔混合物与去离子水混合，然后调pH至5.0，制得低共熔混合物的水溶液，低共熔混合物的质量浓度为30％，备用；

(2)将15g鲟鱼鱼籽与120g步骤(1)制得的低共熔混合物的水溶液混合，进行预冻和解冻，预冻的温度为-80℃，解冻的温度为25℃，预冻和解冻的过程重复进行8次，将解冻后的混合物在转速为5000r/min的条件下匀质10min，然后在转速为8000r/min的条件下离心25min，取上清液过滤，取滤液，即可，所得滤液含有鲟鱼鱼籽蛋白质，在-20℃至4℃的条件下保存。

实施例3：低共熔混合物的制备及利用其萃取鲟鱼鱼籽蛋白质的方法

一种低共熔混合物，主要由以下原料组分制得：将可可碱与咖啡酸按照摩尔比为11：1的比例搅拌、旋转混合制得。

利用上述低共熔混合物萃取鲟鱼鱼籽蛋白质的方法，包括以下步骤：

(1)将上述低共熔混合物与去离子水混合，然后调pH至10.0，制得低共熔混合物的水溶液，低共熔混合物的质量浓度为10％，备用；

(2)将30g鲟鱼鱼籽与110g步骤(1)制得的低共熔混合物的水溶液混合，进行预冻和解冻，预冻的温度为-15℃，解冻的温度为25℃，预冻和解冻的过程重复进行12次，将解冻后的混合物在转速为4000r/min的条件下匀质30min，然后在转速为10000r/min的条件下离心20min，取上清液过滤，取滤液，即可，所得滤液含有鲟鱼鱼籽蛋白质，在-20℃至4℃的条件下保存。

对比例1

与实施例1相比，对比例1中将实施例1中的草酸用苹果酸代替，其余组分和制备方法与实施例1相同，最终制得的含有鲟鱼鱼籽蛋白质的滤液。

对比例2

与实施例1相比，对比例2中的低共熔混合物的制备过程中还加入乙二醇，乙二醇与苦参碱的摩尔比为1:1，其余组分和制备方法与实施例1相同，最终无法制得含鲟鱼鱼籽蛋白质的滤液，因为，在加入乙二醇后，鲟鱼鱼籽蛋白质容易部分沉淀出来。

对比例3

与实施例1相比，对比例3中用去离子水来萃取鲟鱼鱼籽蛋白质，最终制得的含有鲟鱼鱼籽蛋白质的滤液(即对比例3中不使用低共熔混合物)。

产品效果测试

1.萃取效率测定

最终获得的滤液中的蛋白质浓度可用来衡量不同实施例和对比例对鲟鱼鱼籽蛋白质的萃取效率(蛋白质浓度越高，表明萃取效率越高)，用BCA试剂盒(市售的常见测定蛋白质的试剂盒)对实施例1-3和对比例1、对比例3制得的滤液(滤液用质量浓度为1％的氯化钠溶液稀释10倍)中的蛋白质含量进行测定，直接测定562nm的吸光值，根据标准曲线计算出滤液中蛋白质的含量，结果如表1所示。

表1：滤液中蛋白质含量

从表1可以看出，实施例1-3制得的滤液中蛋白质的含量明显高于对比例1和对比例3制得的滤液中蛋白质的含量，从实施例1和对比例3的结果可以看出，使用实施例1制得的低共熔混合物萃取鲟鱼鱼籽蛋白质的萃取效率相对于用去离子水萃取鲟鱼鱼籽蛋白质的效率高11倍，表明用本发明的低共熔混合物萃取鲟鱼鱼籽蛋白质的萃取效率高。

2.滤液中蛋白质活性测定

将实施例1制得的滤液用质量浓度为1％的氯化钠溶液稀释20倍，然后测试稀释后的滤液对DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)和ABTS(2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)的清除率，以及对TYR(酪氨酸酶)和HA(透明质酸酶)活性的抑制率进行了测定，结果如表2所示。

表2：滤液中蛋白质活性测定结果

从表2可以看出，实施例1制得的滤液稀释20倍后对DPPH和ABTS的清除率分别为58％和56％，对酪氨酸酶活性的抑制率为47％，对透明质酸酶活性的抑制率为44％。10μg/mL的维生素C对DPPH和ABTS的清除率分别为52％和53％，280μg/mL的熊果苷对酪氨酸酶活性的抑制率为48％，31mg/mL的甘草酸二钾水合物对透明质酸酶活性的抑制率为49％。由此可知，本发明实施例1制得的滤液对DPPH和ABTS的清除率高，对酪氨酸酶活性和透明质酸酶活性的抑制率也十分可观，表明实施例1制得的滤液中蛋白质的活性良好。

另外，将实施例1制得的滤液用质量浓度为1％的氯化钠溶液稀释10倍，然后测试稀释后的滤液对超氧阴离子自由基的清除率，以浓度为10μg/mL的维生素C对超氧阴离子自由基的清除率作为对照，发现实施例1稀释10倍后的滤液对超氧阴离子自由基的清除率是浓度为10μg/mL的维生素C对超氧阴离子自由基的清除率的1.126倍。

3.滤液中蛋白质稳定性测试

以实施例1制得的滤液对超氧阴离子自由基、DPPH和ABTS的清除率，以及对TYR和HA活性的抑制率为基准，然后将实施例1制得的滤液分别在-20℃下储存14天，在4℃下储存14天，再测试其对DPPH和ABTS的清除率，以及对TYR和HA活性的抑制率，结果如表3所示(表3中的负数表示相对于未保存前对超氧阴离子自由基、DPPH和ABTS的清除率的降低值，对TYR和HA活性的抑制率的降低值)。

表3：稳定性测试结果

从表3可以看出，实施例1制得的滤液在-20℃下储存14天后，其活性均比在4℃储存的活性要好。实施例1制得的滤液在-20℃下储存14天后，其对超氧阴离子自由基、DPPH和ABTS的清除率分别下降了4.7％、4％和3％，对TYR和HA活性抑制率分别下降了2％和3％；而实施例1制得的滤液在4℃下储存14天后，其对超氧阴离子自由基、DPPH和ABTS的清除率分别下降了8.6％、9％和6％，对TYR和HA活性抑制率分别下降了8％和10％。总体而言，实施例1制得的滤液稳定性好，易于保存。另外，对比例3制得的滤液在4℃的环境下保存1个月后出现浑浊沉淀现象，实施例1制得的滤液在4℃的环境下保存1个月后依然澄清透明。

Claims (5)

1.一种萃取鲟鱼鱼籽蛋白质的方法，其特征在于，使用低共熔混合物，所述低共熔混合物，主要由以下原料组分制得：生物碱和有机酸；

所述生物碱选自茶碱、可可碱、左旋肉碱中的至少一种；

所述有机酸选自草酸、抗坏血酸或咖啡酸中的至少一种；

所述生物碱与有机酸按照摩尔比为（2-4）：（3-8）的比例搅拌混合；

并具体包括以下步骤：

（1）将所述低共熔混合物与水混合，然后调pH至5-11，制得低共熔混合物的水溶液，备用；

（2）将鲟鱼鱼籽与步骤（1）制得的低共熔混合物的水溶液混合，进行预冻和解冻，将解冻后的混合物进行匀质、离心，上清液过滤；

步骤（2）中，所述预冻的温度为-20至-80℃；所述解冻的温度为10至30℃；所述预冻和解冻的过程重复进行8-20次。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述低共熔混合物的水溶液中，低共熔混合物的质量浓度为1-80%。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，鲟鱼鱼籽与步骤（1）制得的低共熔混合物的水溶液按照质量比为（2-40）：（9-120）的比例混合。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述匀质的条件为：在转速为1100-8000r/min的条件下匀质1-60min。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述离心的条件为：在转速为7000-10000r/min的条件下离心1-40min。