CN110003323A

CN110003323A - 一种双水相体系分离纯化蛋白质的方法

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Publication number: CN110003323A
Application number: CN201910261050.8A
Authority: CN
Inventors: 肖玉秀; 王璇璇
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2019-04-02
Filing date: 2019-04-02
Publication date: 2019-07-12
Anticipated expiration: 2039-04-02
Also published as: CN110003323B

Abstract

本发明涉及天然产物的分离提纯技术领域，具体涉及一种双水相体系分离纯化蛋白质的方法，包括以下步骤：A、双水相体系萃取蛋白质：将低共熔溶剂和含有蛋白质的无机盐水溶液混合均匀，然后离心得到液‑液两相体系，收集下相萃取液；B、反萃取蛋白质：将步骤A中的下相萃取液用水稀释后离心得到液‑固两相体系；C、蛋白质纯品制备：将步骤B中的固相用水溶解，并进行超滤离心后冷冻干燥，即得蛋白质纯品；其中，所述步骤A中，低共熔溶剂由季铵盐和六氟异丙醇配制而成。本发明采用基于HFIP的DES‑盐双水相体系，DES相易于收集，对蛋白质的萃取率和反萃取率高，蛋白质纯度高，蛋白质结构和活性均得到保持；操作简便。

Description

一种双水相体系分离纯化蛋白质的方法

技术领域

本发明涉及天然产物的分离提纯技术领域，具体涉及一种双水相体系分离纯化蛋白质的方法。

背景技术

蛋白质是生命活动的物质基础，其分离和纯化已引起越来越多的关注。传统的蛋白质纯化方法包括硫酸铵沉淀，离子交换层析，亲和层析，凝胶过滤层析等，存在操作繁琐、耗时长、成本高等问题。因此，开发快速简单有效的蛋白质纯化技术至关重要。

双水相体系(ATPS)是一种或几种物质的水溶液在一定条件下自发形成的两个互不相溶、界面清晰的水相体系，基于分析物在两相中的选择性分配实现分离。由于操作简便且易于放大、分相条件温和、生物相容性好、分离效率高等特点，双水相体系在天然产物的分离纯化领域有着诸多应用。

低共熔溶剂(DES)是通过将氢键受体(HBA，如季铵盐)和氢键供体(HBD，如酰胺，羧酸和醇)以一定的摩尔比混合制备得到的均一液体。DES不仅具有良好的蛋白质溶解度，而且还有助于蛋白质在水溶液中的热稳定性，构象稳定性和生物活性。

DES-无机盐双水相体系是一种新型双水相体系，与传统的双水相体系相比，具有分相迅速、粘度低、萃取过程不易乳化等优点。但是DES-无机盐双水相体系应用于分离纯化蛋白质时存在一些问题：(1)萃取后难以从DES相中进一步分离纯化蛋白质，蛋白质的反萃取效率较低，尽管蛋白质和DES可通过透析分离，但速度慢，耗水量大；(2)DES分相能力较弱，需较高的盐浓度才能形成双水相体系；(3)离心后DES相位于上层，不方便收集。

发明内容

本发明的目的在于提供一种双水相体系分离纯化蛋白质的方法，利用水稀释低共熔溶剂萃取相进行蛋白质的反萃取，反萃取操作简单，获得了高纯度的蛋白质。

本发明实现以上目的采用的技术方案是：一种双水相体系分离纯化蛋白质的方法，包括以下步骤：

A、双水相体系萃取蛋白质：

A1、取待分离纯化蛋白质的样品，用无机盐水溶液溶解或稀释，混匀得到混合溶液；

A2、将低共熔溶剂和步骤A1中的混合溶液混合均匀，然后离心得到液-液两相体系，收集下相萃取液；

B、反萃取蛋白质：

B1、将步骤A2中的下相萃取液用水稀释，混合均匀后离心得到液-固两相体系；

C、蛋白质纯品制备：

C1、将步骤B1中的固相用水溶解，并进行超滤离心，除去残留的低共熔溶剂组分和无机盐，得到蛋白质溶液；

C2、将步骤C1中的蛋白质溶液冷冻干燥，即得蛋白质纯品；

其中，所述步骤A2中，低共熔溶剂由季铵盐和六氟异丙醇配制而成。

本发明利用基于HFIP(六氟异丙醇)的DES(低共熔溶剂)-无机盐双水相体系萃取蛋白质，并且首次利用水稀释DES相的方法进行蛋白质的反萃取。HFIP具有低沸点(59℃)、高密度(1.596g/mL)、强溶解能力、强氢键给体能力(1.96，异丙醇0.767)、强疏水性(logP＝1.57,异丙醇0.173)等独特性能。这些特性使得基于HFIP的DES-无机盐双水相体系较传统的DES-无机盐双水相体系具有以下优势：

(1)分相能力更强

HFIP具有强氢键给体能力，可以和多种氢键受体合成DES，因此可供选择的DES种类更多。HFIP的高密度使得分相后DES相位于下层，方便收集。除盐析作用外，HFIP的强疏水性、HFIP分子间的强氢键作用在体系分相中也发挥了一定的作用。因此，基于HFIP的DES分相能力显著强于传统的DES。

(2)萃取效率高，反萃取操作简单，反萃取效率更高

HFIP具有优异的溶解能力，基于HFIP的DES具有良好的蛋白质溶解度。基于HFIP的DES-无机盐双水相体系可以为目标蛋白质提供多种作用力，包括氢键相互作用，疏水相互作用，盐析效应等，有利于提高萃取效率。

传统的DES-无机盐双水相体系，通过向DES相中加入无机盐水溶液，调节pH等方法进行反萃取，但是反萃取效率低，也不能实现蛋白质的纯化。水稀释DES相的方法，是因为大量水的加入破坏了DES相的结构，使蛋白质释放出来，通过简单的涡旋，离心操作即可完成反萃取过程，实现蛋白质的纯化，且反萃取效率较高。

(3)纯化效果好，蛋白质的结构和生物活性得到保持

DES有助于蛋白质在水溶液中的热稳定性，构象稳定性和蛋白质活性。大量水稀释DES相破坏DES结构后，蛋白质基本处于水环境，结构和活性均得到保持。再通过简单的超滤离心，冷冻干燥即可得到纯度更高的蛋白质。

本发明的方法采用基于HFIP的DES-盐双水相体系，DES相易于收集，DES相对蛋白质的萃取率高；所得的DES相只需通过简单的操作即可完成反萃取和纯化过程，反萃取效率高，可获得高纯度的蛋白质；蛋白质结构和活性均得到保持；分离纯化蛋白质的方法操作简便，成本低廉，适合工业化生产。

优选地，所述步骤A1中，待分离纯化蛋白质的样品为蛋白质标准品或含蛋白质的生物样品。

本发明中的蛋白质标准品一般为固体状，采用无机盐水溶液进行溶解，含蛋白质的生物样品一般为血清、蛋清等液体状，采用无机盐水溶液进行稀释。

优选地，所述步骤A1中，当待分离纯化蛋白质的样品为蛋白质标准品时，混合溶液中蛋白质的浓度为2.5-15mg/mL。

优选地，所述步骤A1中，当待分离纯化蛋白质的样品为含蛋白质的生物样品时，生物样品与无机盐水溶液的体积比范围为1:10-100。

优选地，所述步骤A中，无机盐为硫酸钠、磷酸氢二钾中的至少一种，无机盐水溶液的pH为7-10，所述步骤A2中，液-液两相体系中，无机盐的质量百分比为0.8％-6.04％。

无机盐的种类保证了本发明的方法中反萃取过程的成功完成，若选用其他无机盐，下相萃取液加水稀释不会有富含蛋白质的固体沉淀，反萃取过程不能顺利进行。无机盐水溶液的pH保证了在所采用的无机盐用量下本发明的液-液体系的成功形成。本发明通过控制无机盐的种类、浓度和pH保证了本发明的步骤A和步骤B的成功，使萃取和反萃取过程顺利完成。

优选地，所述步骤A2中，低共熔溶剂为季铵盐和六氟异丙醇按照摩尔比为1:1.5-2.5配制而成，液-液两相体系中，低共熔溶剂的质量百分比为19.53％-54.82％。-

优选地，所述季铵盐为氯化胆碱和/或四甲基氯化铵。

优选地，所述步骤B1中，下相萃取液与水的体积比为1:7.5-12。

下相萃取液与水的体积比保证了本发明的方法中反萃取过程的成功和高效完成。稀释倍数较小时，下相萃取液加水稀释不会有富含蛋白质的固体沉淀，稀释倍数较大时，大量的水则会溶解部分蛋白质，导致反萃取率的降低。本发明通过控制下相萃取液与水的体积比为1:7.5-12，控制较高的蛋白质反萃取率。

优选地，所述步骤C1中，超滤离心截留分子量≥3KD的物质。

优选地，所述步骤A2中，采用振荡或者涡旋将低共熔溶剂和混合溶液混匀，其中，振荡速率为500-1500rpm，振荡时间为0-30min，振荡温度为15-55℃；涡旋功率为60W，涡旋时间为0-30min；离心转速为2000-6000rpm，离心时间为3-15min，所述步骤B1中，采用涡旋将下相萃取液和水混匀，其中，涡旋功率为60W，涡旋时间为1-15min；离心转速为2000-6000rpm，离心时间为3-15min。

本发明的有益效果为：

1.采用基于HFIP的DES-盐双水相体系，DES相易于收集，DES相对蛋白质的萃取率高，牛血清白蛋白萃取率为99.20％-100.00％；

2.采用基于HFIP的DES-盐双水相体系，所得的DES相只需通过简单的操作即可完成反萃取和纯化过程，反萃取效率高(牛血清白蛋白90.28％-97.77％)，可获得高纯度的蛋白质，牛血清白蛋白纯度为91.24％-95.16％；

3.蛋白质结构和活性均得到保持；

4.分离纯化蛋白质的方法操作简便，成本低廉，适合工业化生产。

附图说明

图1为本发明实施例3的蛋白质反萃取率图(n＝4)；

图2为本发明实施例3的ChCl-HFIP DES-K₂HPO₄双水相体系萃取牛血清白蛋白(BSA)的色谱图，其中：a-萃取后的盐相，b-反萃取后的离心上清液，c-空白DES相，d-0.2mg/mL BSA，e-稀释30倍的萃取后的DES相，f-反萃取后蛋白质溶液，峰1-BSA单体，2-BSA二聚体；

图3为本发明实施例4的ChCl-HFIP DES-K₂HPO₄双水相体系萃取溶菌酶(LYS)的色谱图，其中：a-萃取后的盐相，b-反萃取后的离心上清液，c-空白DES相，d-0.2mg/mL LYS，e-稀释30倍的萃取后的DES相，f-反萃取后蛋白质溶液，峰1-LYS；

图4为本发明实施例8所制备BSA的CD图谱，其中：a-制备产物，b-0.1mg/mL BSA；

图5为本发明实施例9的ChCl-HFIP DES-K₂HPO₄双水相体系萃取稀释10倍的小牛血清的色谱图，其中：a-萃取后的盐相，b-反萃取后的离心上清液，c-空白DES相，d-稀释30倍的萃取后的DES相，e-反萃取后蛋白质溶液，f-0.3mg/mL BSA，g-稀释10倍的小牛血清，峰1-BSA单体，2-BSA二聚体；

图6为本发明的双水相体系分离纯化蛋白质的方法的流程示意图。

具体实施方式

为更好的理解本发明，下面的实施例是对本发明的进一步说明，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

实施例1

低共熔溶剂种类和摩尔比对双水相体系萃取率的影响：

双水相萃取：称取DES1.6 g置于5mL离心管中，加入2mL含有10mg牛血清白蛋白(BSA)的0.03g/mL K₂HPO₄水溶液。25℃1000rpm振荡10min或60 W涡旋10min，3000rpm离心5min。此时，形成互不相容的液-液两相体系，其中下层为DES相，上层为盐相。记录两相的体积，收集DES相并用水稀释20倍进行UV测定，采取对照品比较法对BSA的含量进行定量分析，并计算萃取率。结果见表1。

由表1可知，ChCl-HFIP DES和四甲基氯化铵-HFIP DES均具有较高的蛋白质萃取率。不同摩尔比的ChCl-HFIP DES的萃取率相差不大，蛋白质的萃取率均能达到95％以上。

表1不同低共熔溶剂种类和摩尔比下的萃取率

实施例2

不同萃取条件对双水相体系萃取率的影响：

双水相萃取：称取一定质量摩尔比1:2的ChCl-HFIP DES置于5mL离心管中，加入2mL含有一定质量BSA的一定浓度的K₂HPO₄水溶液。一定温度下1000rpm振荡一定时间，3000rpm离心5min。此时，形成互不相容的液-液两相体系，其中下层为DES相，上层为盐相。记录两相的体积，收集DES相并用水稀释15-200倍进行UV测定，采取对照品比较法对BSA的含量进行定量分析，并计算萃取率。结果见表2。

表2不同萃取条件下的萃取率

由表2可知，序号1中，萃取率仅为52.81±3.14％，主要原因是DES的加入量较小，为0.5g，导致其萃取的蛋白质有限，萃取率较低；序号10中，萃取率为87.74±2.06％，主要原因是较高的盐浓度使盐相倾向于捕获更多的水分子，导致DES相中的水含量降低，不利于维持蛋白质表面的水化层，对蛋白质的萃取产生不利影响；序号14和序号15，萃取率仅为88.56±2.64％和87.79±2.28％，主要原因是DES相的容量有限，限制了蛋白质的萃取量，当DES相萃取蛋白质达到饱和后，继续增加蛋白质的加入量，萃取率反而降低；序号25和序号26，萃取率仅为79.02±2.53％和82.83±3.72％，主要原因是pH7和8时部分K2HPO4转化为KH2PO4，削弱了盐的分相能力，导致DES相体积和萃取蛋白质的量明显减少，萃取率降低。而在其他不同的萃取条件下均能维持较高的蛋白质萃取率，有利于蛋白质的纯化。

实施例3

不同反萃取条件对反萃取率的影响：

1.双水相萃取：

称取摩尔比1:2的ChCl-HFIP DES1.33g置于5mL离心管中，加入2mL含有5mg BSA的0.022g/mL K₂HPO₄水溶液。25℃1000rpm振荡5min，3000rpm离心5min。此时，形成互不相容的液-液两相体系，其中下层为DES相，上层为盐相。记录两相的体积，收集DES相并用水稀释20倍进行UV测定，采取对照品比较法对BSA的含量进行定量分析。萃取率为99.20％-100.00％，几乎所有的BSA都被萃取至DES相中。

2.反萃取蛋白质：

取萃取蛋白质后的DES相置于5mL离心管中，分别加入一级水稀释7.5、8、9、10、11、12倍，60 W涡旋1min，3000rpm离心10min。此时，蛋白质在离心管底部沉淀。收集上清液，旋蒸以回收HFIP，将蛋白质溶解在3mL一级水中，进行UV测定，采取对照品比较法对BSA的含量进行定量分析，并计算反萃取率。

图1为实施例3的分析结果，从图中可以看出，反萃取率呈现出先增加到达平台后减小的趋势。这是因为，稀释倍数较小时，仍有蛋白质与DES紧密结合并保留在混合物中未沉淀。当稀释倍数太大时，大量的水则会溶解一些蛋白质，导致反萃取率的降低，当稀释倍率为7.5-12倍时，蛋白质的萃取率最低为60％左右，优选地，稀释倍率为8-10时，蛋白质的萃取率为90.28％-97.77％。

选取稀释倍数为9倍时，分别取盐相和DES相，反萃取后的离心上清液和蛋白质溶液，进行HPLC-UV分析。从图2中可以看出，DES相和反萃取后的蛋白质溶液中检测出BSA的色谱峰，盐相和反萃取后的离心上清液中未检测出BSA的色谱峰，表明HPLC-UV分析结果与UV基本一致，证明了萃取和反萃取的有效性。

实施例4

溶菌酶的萃取和反萃取：

1.双水相萃取：

除蛋白质改变为溶菌酶(LYS)，其他重复实施例3的步骤1进行萃取。萃取率为88.86％-92.55％。

2.反萃取蛋白质：

除蛋白质改变为溶菌酶(LYS)，选择稀释倍数为9倍，其他重复实施例3的步骤2进行反萃取。反萃取率为89.08％-92.03％。

分别取盐相和DES相，反萃取后的离心上清液和蛋白质溶液，进行HPLC-UV分析。从图3中可以看出，DES相和反萃取后的蛋白质溶液中检测出LYS的色谱峰，盐相和反萃取后的离心上清液中未检测出LYS的色谱峰，表明HPLC-UV分析结果与UV基本一致，证明了萃取和反萃取的有效性。

实施例5

牛血红蛋白的萃取和反萃取：

1.双水相萃取：

除蛋白质改变为牛血红蛋白(Bhb)，其他重复实施例3的步骤1进行萃取。萃取率为82.44％-85.92％。

2.反萃取蛋白质：

除蛋白质改变为牛血红蛋白(Bhb)，选择稀释倍数为9倍，其他重复实施例3的步骤2进行反萃取。反萃取率为58.79％-61.33％。

实施例6

卵清蛋白的萃取和反萃取：

1.双水相萃取：

除蛋白质改变为卵清蛋白(OVA)，其他重复实施例3的步骤1进行萃取。萃取率为97.78％-100.00％。

2.反萃取蛋白质：

除蛋白质改变为卵清蛋白(OVA)，选择稀释倍数为9倍，其他重复实施例3的步骤2进行反萃取。反萃取率为90.02％-98.28％。

实施例7

蛋白质纯品制备：

1.双水相萃取：

重复实施例3的步骤1进行萃取。

2.反萃取蛋白质：

选择稀释倍数为9倍，重复实施例3的步骤2进行反萃取。

3.蛋白质纯品制备：

反萃取后，尽可能多地收集上清液，旋蒸以回收HFIP，将沉淀的蛋白质置于离心管中进行冷冻干燥。将干燥后的蛋白质精密称重，溶解在一定体积的水中，进行UV测定，采取对照品比较法对BSA的含量进行定量分析。此时制备的BSA纯度为75.88％-81.32％，表明制备的BSA中含有残留的DES组分及无机盐。

将上述所得的蛋白质溶液置于具有15mL离心外管的超滤离心管中，多次超滤离心，除去残留的DES组分及无机盐。收集并合并超滤内管中的液体，冷冻干燥。此时制备的BSA纯度为91.24％-95.16％，纯度较高。

实施例8

分离纯化过程中蛋白质结构与活性的变化：

1.蛋白质结构的变化：

以BSA为代表，图4为BSA的圆二色谱(CD)图，可以反映蛋白质的二级结构。从图中可以看出，制备的BSA与BSA标准品的CD图谱基本一致，表明BSA的二级结构没有变化。

2.蛋白质活性的变化：

以LYS为代表，利用比浊法测定LYS活性，即测量底物微球菌(MicrococcusLysodeikticus)的降解速率来表征LYS活性。制备的LYS的活性为22995-26077U/mg，而缓冲液(pH＝6.2)中的LYS活性为21778-25333 U/mg，两组数据的t检验结果显示p值为0.791(>0.05)，证明两组数据之间没有显著性差异，表明LYS的活性得到保持。

实施例9

从小牛血清中分离纯化牛血清白蛋白：

1.双水相萃取：

小牛血清经0.45μm微孔有机滤膜过滤，用0.022g/mL K₂HPO₄稀释10倍。称取摩尔比1:2的ChCl-HFIP DES1.33g置于5mL离心管中，加入2mL稀释的小牛血清。25℃1000rpm振荡5min，3000rpm离心5min。此时，形成互不相容的液-液两相体系，其中下层为DES相，上层为盐相。

2.反萃取蛋白质：

取萃取蛋白质后的DES相置于5mL离心管中，加入一级水稀释9倍，60 W涡旋1min，3000rpm离心10min。此时，蛋白质在离心管底部沉淀。收集上清液，旋蒸以回收HFIP，将蛋白质溶解在3mL一级水中。

分别取盐相和DES相，反萃取后的离心上清液和蛋白质溶液，进行HPLC-UV分析。DES相用水稀释30倍时，出现大量白色不溶物质，因此在3000rpm离心5min后测试离心上清液。反萃取沉淀的蛋白质溶解时出现同上问题，也同上操作。

从图5中可以看出，小牛血清中有三个主要的蛋白质的色谱峰，盐相中未检测出蛋白质的色谱峰，反萃取后的离心上清液中检测出极小的BSA的色谱峰，稀释的DES相和反萃取后蛋白质溶液中主要检测出BSA的色谱峰。这是因为，双水相体系同时萃取了三种蛋白质，但可以通过简单稀释除去另外两种水溶性差的蛋白质。峰面积归一化法计算实际样品中制备的BSA纯度为91.61％-98.58％，纯BSA单体可以通过收集流出物和冷冻干燥来制备。

综上所述，实施例1-3研究了不同条件对蛋白质萃取率和反萃取率的影响，在特定条件下萃取率几乎接近100％，反萃取率达到97％以上；实施例4-6表明了该体系对其他蛋白质(溶菌酶、牛血红蛋白、卵清蛋白)的萃取和反萃取效果，证明了该体系对其他蛋白质仍然有有效的萃取和反萃取；实施例7制备了蛋白质纯品，纯度在90％以上；实施例8表明本发明提供的分离纯化方法能够保持蛋白质的结构和活性；实施例9将该方法应用到含蛋白质的生物样品中，制备的蛋白质纯度同样在90％以上。总而言之，本发明提供的分离纯化方法操作简单，成本低廉，产品纯度高，蛋白质的结构和活性均得到保持，是一种快速简单有效的分离纯化方法。

以上所述是本发明的优选实施方式而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和变动，这些改进和变动也视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种双水相体系分离纯化蛋白质的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、双水相体系萃取蛋白质：

B、反萃取蛋白质：

C、蛋白质纯品制备：

C2、将步骤C1中的蛋白质溶液冷冻干燥，即得蛋白质纯品；

2.根据权利要求1所述的双水相体系分离纯化蛋白质的方法，其特征在于：所述步骤A1中，待分离纯化蛋白质的样品为蛋白质标准品或含蛋白质的生物样品。

3.根据权利要求2所述的双水相体系分离纯化蛋白质的方法，其特征在于：所述步骤A1中，当待分离纯化蛋白质的样品为蛋白质标准品时，混合溶液中蛋白质的浓度为2.5-15mg/mL。

4.根据权利要求2所述的双水相体系分离纯化蛋白质的方法，其特征在于：所述步骤A1中，当待分离纯化蛋白质的样品为含蛋白质的生物样品时，生物样品与无机盐水溶液的体积比范围为1:10-100。

5.根据权利要求1所述的双水相体系分离纯化蛋白质的方法，其特征在于：所述步骤A中，无机盐为硫酸钠、磷酸氢二钾中的至少一种，无机盐水溶液的pH为7-10，所述步骤A2中，液-液两相体系中，无机盐的质量百分比为0.8％-6.04％。

6.根据权利要求1所述的双水相体系分离纯化蛋白质的方法，其特征在于：所述步骤A2中，低共熔溶剂为季铵盐和六氟异丙醇按照摩尔比为1:1.5-2.5配制而成，液-液两相体系中，低共熔溶剂的-质量百分比为19.53％-54.82％。

7.根据权利要求6所述的双水相体系分离纯化蛋白质的方法，其特征在于：所述季铵盐为氯化胆碱和/或四甲基氯化铵。

8.根据权利要求1所述的双水相体系分离纯化蛋白质的方法，其特征在于：所述步骤B1中，下相萃取液与水的体积比为1:7.5-12。

9.根据权利要求1所述的双水相体系分离纯化蛋白质的方法，其特征在于：所述步骤C1中，超滤离心截留分子量≥3KD的物质。

10.根据权利要求1所述的双水相体系分离纯化蛋白质的方法，其特征在于：所述步骤A2中，采用振荡或者涡旋将低共熔溶剂和混合溶液混匀，其中，振荡速率为500-1500rpm，振荡时间为0-30min，振荡温度为15-55℃；涡旋功率为60 W，涡旋时间为0-30min；离心转速为2000-6000rpm，离心时间为3-15min，所述步骤B1中，采用涡旋将下相萃取液和水混匀，其中，涡旋功率为60 W，涡旋时间为1-15min；离心转速为2000-6000rpm，离心时间为3-15min。