CN101456898A - 一种使用氢键吸附色谱分离纯化多肽的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种使用氢键吸附色谱分离纯化多肽的方法。此方法采用高浓度、高交联度的琼脂糖凝胶介质或聚酰胺介质，根据氢键吸附原理，从生物组织提取物、蛋白水解物或多肽合成混合物中分离纯化得到高纯度的多肽，具有选择性高、纯化工艺简单、样品载量高、介质重复利用度高等优点。克服传统方法步骤复杂，反相色谱介质重复利用度低、难于规模化、样品载量低、生物相容性差等缺点。获得的多肽馏分通过反相高效液相色谱确定纯度，通过质谱确定多肽序列和分子量。

Description

一种使用氢键吸附色谱分离纯化多肽的方法

技术领域

本发明涉及一种多肽分离纯化方法，具体的是涉及一种氢键吸附色谱分离纯化多肽的方法。

背景技术

自然界存在着数量庞大种类繁多的生物活性多肽，在各种生命活动中起着非常重要的调节作用，涉及各种毒素、激素、抗菌肽、信息素、细胞因子等，广泛参与分子识别、信号转导、酶活调节、免疫调节、细胞分化及个体发育调控等过程。生物活性多肽的开发与利用已经越来越受到医药、食品、化妆品等行业的重视，特别是医药行业，已经有大量生物活性多肽作为激素、抗生素、疫苗、诊断试剂、酶抑制剂、抗肿瘤药物等通过了临床试验，投放市场，如催产素、降钙素、血管紧张肽、内啡肽等等。

我国地域辽阔，动植物资源极其丰富，具有大量待开发的生物活性多肽，仅仅海洋生物活性多肽就有数万种之多。开发多肽类药物具有其特殊优势：1)多肽分子量小，结构简单，易于化学合成或生物合成，有利于规模化、商品化；2)功能特异，合成纯度高，不产生热原，使用安全；3)易于被机体吸收，给药途径多样化(如口服、喷雾、透皮吸收等)。多肽类药物的研究已经成为目前医药行业的热点。

生物活性多肽作为药物，与作为食品添加剂或化妆品添加剂相比，要求具有更高的纯度，杂质成分不但会降低药效，还可能产生毒副作用。通常所说的生物活性多肽一般分为两种：一种是天然活性多肽，即生物组织中天然存在的活性多肽，包括抗生素、激素、毒素等；另一种是酶解活性多肽，即通过特异性蛋白酶的水解作用，从大分子蛋白中释放出的活性肽段。无论是哪一种活性多肽，在对其进行毒理、药理研究，或者精确的结构解析之前，都需要首先将其从成分极其复杂的组织提取物或蛋白水解物中分离纯化出来。在结构和功能研究清楚之后，可以通过生物合成或化学合成实现规模化生产，以满足临床需要，这时同样需要高产并且能够保持多肽生物活性的分离纯化方法，从合成混合物中分离纯化目标多肽，最终形成产品。

生物活性多肽的生产工艺可以分为粗分离和纯化两部分。

多肽的粗分离方法主要包括液-液萃取、盐析、有机溶剂沉淀、超滤等，获得了粗提物之后，再进行进一步纯化。

多肽的纯化大多采用几种色谱技术相结合的方法，包括凝胶过滤色谱、离子交换色谱、毛细管区带电泳、亲和色谱、疏水相互作用色谱、反相高效液相色谱和逆流色谱等，每种方法都有其优势和局限。通常多肽的粗分离样品经过1～2步精分离，如离子交换色谱、凝胶过滤色谱或毛细管电泳，再经过1～3次不同表面基团(C₁₈、C₈、C₄等)的反相高效液相色谱，就能够得到很好的纯化。对于那些结构不稳定、易失活的多肽，要尽可能减少分离步骤，从而实现较高的活性回收。

凝胶过滤色谱(gel filtration chromatography)，也称为分子排阻色谱(size exclusionchromatography，SEC)，根据多肽分子的分子量和形状的差异，利用其在多孔凝胶介质中扩散速率的不同进行分离。选择合适的粒径、孔隙率和刚性的介质，对多肽单体和聚集态、线性肽和环肽以及在修饰程度具有微小差异的多肽都能实现很好的分辨率。但对于分子量相近甚至相同的多肽，单纯采用凝胶过滤的方法很难将其分开。

离子交换色谱(ion exchange chromatography，IEC)根据多肽分子带电状态的不同实现分离。离子交换介质种类较多，大孔树脂、均孔树脂、离子交换纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶都可以作为基础材料，表面键合了不同的阴、阳离子，可选择的范围广。IEC需在高盐浓度洗脱，易发生聚合而失活的多肽则不宜采用这一方法。

反相高效液相色谱(reversed phase high-performance liquid chromatography，RP-HPLC)是目前分辨率最高的多肽纯化方法，可以精确分辨一个氨基酸残基的差异，经常被用作最终的纯度验证步骤。尽管已经有商品化的制备级RP-HPLC色谱柱，但将RP-HPLC技术应用于规模化生产生物活性多肽，还是有困难的。第一，RP-HPLC样品载量较低，且不易放大；第二，介质的重复使用次数有限，对样品的要求较高；第三，硅胶基质结合C链基团的分离介质，用作临床用药的生产，其生物相容性与生物安全性没有葡聚糖、琼脂糖类的介质高。

鉴于以上常用的多肽分离方法都不能实现一步分离，操作步骤繁琐，而RP-HPLC的样品载量、重复使用次数和生物安全性也限制了其规模化生产，需要开发更加高效高产而且易于规模化的多肽分离方法。目前还没有将吸附色谱应用于多肽分离的报道。

这里所说的吸附色谱(adsorption chromatography)，是指广义的吸附，不仅包括通常所指的无化学键引入的物理作用，也包括疏水相互作用和氢键作用等。利用介质对提取物吸附强度的不同来实现分离。涉及的介质范围非常广泛，包括：硅胶、键合相硅胶、琼脂糖、葡聚糖、氧化铝、大孔吸附树脂、聚酰胺、活性碳、羟基磷灰石等。

氢键吸附色谱常用的介质为聚酰胺。又有研究表明，一些高浓度、高交联度的葡聚糖、琼脂糖介质对小分子物质，特别是含芳环的化合物也有吸附作用，早先把这种吸附作用归结为疏水相互作用，但近来的研究表明，在有些流动相条件下，除了疏水相互作用，更主要的还是氢键作用，也可以作为氢键吸附色谱介质使用。多肽所含有的肽键本身就可以和介质间形成氢键，有的氨基酸侧链中还含有醇羟基、酚羟基、巯基、氨基等，也可以形成氢键。因此，氢键吸附色谱在多肽分离领域很有应用前景。

发明内容

本发明的目的就是在于简化多肽分离的步骤，克服传统方法步骤复杂，反相色谱介质重复利用度低、难于规模化、样品载量低、生物相容性差等缺点。采用氢键吸附色谱纯化多肽，提高选择性，简化工艺，提高产品回收率、稳定性和生物安全性，提高样品载量和介质重复利用度。本方法适用于从生物组织提取物、蛋白水解物或多肽生物合成混合物、多肽化学合成混合物中分离纯化天然多肽及其活性同源物、变体、片段及人工修饰过的多肽等。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的。

本发明提供一种氢键吸附色谱分离纯化多肽的方法，具体步骤如下：

1)制备生物组织粗提物、蛋白水解物或多肽合成混合物；

2)选择氢键吸附介质：选择10-30μm粒径、6-12％浓度的高交联度琼脂糖凝胶介质；或100-400目的聚酰胺介质；

3)选择流动相：水，乙醇-水，乙醇-乙酸-水，乙醇-三氟乙酸-水，甲醇-水，甲醇-乙酸-水，甲醇-三氟乙酸-水，乙腈-水，乙腈-乙酸-水，乙腈-三氟乙酸-水等体系，采用不同溶剂配比；

4)洗脱方式：可采用等度洗脱，线性梯度洗脱或分步的等度洗脱分离多肽混和物；

5)将步骤2选定的氢键吸附介质进行适当的预处理：琼脂糖凝胶介质在20％乙醇保存液中装柱，平衡到初始流动相即可使用；聚酰胺介质中通常有两种杂质，一种是聚酰胺的聚合原料单体及其小分子聚合物，另一种是蜡质，这些杂质必须除去，否则原料单体及其小分子聚合物可与酚类物质形成复合物，常用的预处理方法是：取聚酰胺粉末，加入95％乙醇于室温110转/分钟振荡洗涤40-50分钟，倾出95％乙醇，用水洗至无醇味，再分别用5％氢氧化钠溶液及30％乙酸溶液按相同方法洗涤，最后用20％乙醇洗涤，装柱平衡至初始流动相即可使用；

6)将步骤3)选定并配制好的流动相超声脱气或真空脱气10-30min，室温静置0.5-1h；

7)使用步骤6)配制好的流动相平衡氢键吸附色谱柱两个柱体积，采用步骤4)的洗脱方式，线性流速20～100cm/h，紫外检测器210-280nm或采用示差检测器在线监测，自动收集馏分；

8)将步骤7)收集的馏分冷冻干燥，检测纯度：采用反相高效液相色谱C18柱，以甲醇-水、甲醇-乙酸-水、甲醇-三氟乙酸-水或乙腈-水、乙腈-乙酸-水、乙腈-三氟乙酸-水为流动相，采用线性梯度洗脱，以B相溶解样品，紫外检测器280nm在线监测，计算多肽纯度和收率；

9)步骤8)获得的纯度95％以上的馏分，质谱检测确定分子量及氨基酸序列，并利用数据库进行比对；

10)具有特殊生物活性的多肽在分离前后测定其活性，计算多肽活性回收率。

本发明提供了一种使用氢键吸附色谱分离纯化多肽的方法，首次将基于琼脂糖凝胶介质和聚酰胺介质的氢键吸附色谱应用于多肽的分离纯化，是对现有多肽分离纯化方法的有益补充，与现有技术相比的优势在于：一步分离可获得较高纯度的多肽，回收率高；不需要高浓度盐溶液进行洗脱，多肽产生聚合变性的可能性小，不需透析避免耗费大量缓冲液；介质对粗样品耐受强，样品载量高，介质可重复利用数十次，易于规模放大，特别是琼脂糖介质的生物安全性非常好。

附图说明

图1 12％浓度的高交联度琼脂糖凝胶层析柱分离甘氨酸寡肽混合物

图2 12％浓度的高交联度琼脂糖凝胶层析柱分离纯化牛胰肽胰酶水解物

图3 100-200目聚酰胺层析柱分离纯化溶菌酶水解物

具体实施方式

实施例1、使用12％浓度高交联度琼脂糖凝胶层析柱分离甘氨酸寡肽混合物

1)配制甘氨酸寡肽混合物：称取标准品0.6mgGly-Gly、1.2mgGly-Gly-Gly和0.4mgGly-Gly-Gly-Gly-Gly，混合后溶解在5mL流动相中，超声助溶，0.45μm滤膜过滤；

2)配制流动相：配制乙腈-水(10:90)溶液，超声脱气30分钟，静置1小时；

3)Superose 12琼脂糖凝胶介质在20％乙醇保存液中湿法装柱，层析柱内径10mm，柱床体积24mL，介质耐压2.5MPa，初始流动相平衡层析柱2个柱床体积；

4)通过自动进样阀进样500μL配制好的甘氨酸寡肽混合样品；

5)等度洗脱，线性流速30cm/h，紫外检测器210nm监测，收集洗脱峰；

6)Superose 12层析柱分离甘氨酸寡肽混合物所得的谱图如图1所示，分别收集的1、2、3号洗脱峰，冻干，重新溶解，C18柱检测，根据保留时间判断1、2、3号洗脱峰分别为Gly-Gly、Gly-Gly-Gly和Gly-Gly-Gly-Gly-Gly，各馏分纯度>95％，回收率>85％。

实施例2、使用12％浓度高交联度琼脂糖凝胶层析柱分离纯化牛胰肽胰酶水解物

1)制备牛胰肽(Bovine Pancreatic Peptide，BPP)胰酶水解物：5mg BPP溶于1mL 20mM NH₄HCO₃缓冲液(pH8)，按照酶与蛋白1:50的比例加入胰酶(无糜蛋白酶活性)，混合均匀后，37℃孵育过夜，15h左右，添加250μL乙腈，终止消化，反应液在4℃下1500rpm离心10分钟，上清液45μm滤膜过滤备用；

2)配制流动相：配制乙腈-水(30:70)溶液，超声脱气30分钟，静置1小时；

3)Superose 12琼脂糖凝胶介质湿法装柱，层析柱内径10mm，柱床体积24ml，耐压2.5MPa，层析柱用初始流动相平衡2个柱床体积；

4)步骤1)制备好的牛胰肽水解物样品，通过自动进样阀进样500μl；

5)等度洗脱，线性流速在30cm/h，紫外检测器280nm在线监测，收集洗脱峰；

6)Superose 12层析柱分离牛胰肽水解物的谱图如图2所示，分别收集的1、2、3号洗脱峰，冻干，重新溶解，RP-HPLC(C18柱)检测各馏分纯度>95％，分别取3个馏分的冻干品，质谱检测；

7)根据质谱分析的结果，通过片段的分子量判断，1号洗脱峰对应的片段为Tyr，2号洗脱峰对应的片段为Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg，3号洗脱峰对应的片段为Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Glu-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-Tyr-Ala-Ala-Glu-Leu-Arg，而按照BPP的氨基酸序列(Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Glu-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-Tyr-Ala-Ala-Glu-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr)，推断还应该产生Arg和Pro-Arg片段，但由于吸附作用较强，而在该流动相条件下未被洗脱，在流动相中添加5％的乙酸，可以将二者一起洗脱。

实施例3、使用聚酰胺层析柱分离纯化溶菌酶水解物

1)制备溶菌酶(Lysozyme)胰酶水解物：5mg BPP溶于1mL 20mM NH₄HCO₃缓冲液(pH8)，加入250μl 10mM的二硫苏糖醇(DTT)，50℃孵育30分钟，冷却至室温，加入250μl 30mM的碘乙酰胺，避光孵育60分钟，按照酶与蛋白1:50的比例加入胰酶(无糜蛋白酶活性)溶液500μl，混合均匀后，37℃孵育过夜，15h左右，添加250μl乙腈，终止消化，反应液在4℃下1500rpm离心10分钟，上清液经过45μm滤膜过滤备用；

2)配制流动相：配制乙腈-水(30:70)溶液，超声脱气30分钟，静置1小时；

3)100～200目聚酰胺介质湿法装柱，层析柱内径16mm，柱床体积30ml，接入岛津HPLC系统，压力限2.5MPa，层析柱用流动相平衡2个柱床体积；

4)步骤1)制备好的溶菌酶水解物样品，通过自动进样阀进样1ml；

5)等度洗脱，一般线性流速在40cm/h，紫外检测器280nm监测，收集洗脱峰；

6)聚酰胺层析柱分离溶菌酶水解物的谱图如图4所示，分别收集的1～8号洗脱峰，冻干，重新溶解，经RP-HPLC(C18柱)检测，其中2、4、5、8号峰的纯度在95％以上；

7)取2、4、5、8号峰的冻干样品，重新溶解，进行质谱检测；

8)根据质谱分析的结果，2号洗脱峰对应的片段为GTDVQAWIR，4号洗脱峰对应的片段为IVSDGNGMNAWVAWR，5号洗脱峰对应的片段为NTDGSTDYGILQINSR，8号洗脱峰对应的片段为NLCNIPCSALLSSDITASVNCAK，而按照溶菌酶的氨基酸序列(KVFGRCELAAAMKRHGLDNYRGYSLGNWVCAAKFESNFNTQATNRNTDGSTYGILQINSRWWCNDGRTPGSRNLCNIPCSALLSSDITASVNCAKKIVSDGNGMNAWVAWRNRCKGTDVQAWIRGCRL)，推断由胰酶水解应产生18个片段，一些单个氨基酸如Arg和Lys可能由于吸附太强而未被洗脱，其它小片段在这一流动相条件下未被分离开，可以进一步调整流动相的配比，实现其余片段的分离。

Claims (2)

1、一种使用氢键吸附色谱分离纯化多肽的方法，利用高浓度、高交联度的琼脂糖凝胶介质和聚酰胺介质与目标多肽之间产生的强度不同的氢键吸附作用，从生物组织提取物、蛋白水解物或多肽合成混合物中分离纯化多肽。

2、如权利要求1所述的使用氢键吸附色谱分离纯化多肽的方法，包括如下的步骤：

1)制备生物组织粗提物、蛋白水解物或多肽合成混合物；

2)氢键吸附介质包括10-30μm粒径、6-12％浓度的高交联度琼脂糖凝胶介质或100-400目的聚酰胺介质；

3)流动相包括不同比例的如下溶剂：水，乙醇-水，乙醇-乙酸-水，乙醇-三氟乙酸-水，甲醇-水，甲醇-乙酸-水，甲醇-三氟乙酸-水，乙腈-水，乙腈-乙酸-水，乙腈-三氟乙酸-水；

4)洗脱方式：等度洗脱，线性梯度洗脱或分步的等度洗脱；

5)氢键吸附介质的预处理：取聚酰胺粉末，加入95％乙醇于室温110r/min振荡洗涤40-50min，倾出95％乙醇，再分别用5％氢氧化钠溶液及30％乙酸溶液按相同方法洗涤，最后用20％乙醇洗涤装柱；

6)配制好的流动相超声脱气或真空脱气10-30min，室温静置0.5-1h；

7)配制好的初始流动相平衡氢键吸附色谱柱两个柱体积，采用步骤4)的洗脱方式，线性流速20～100cm/h，紫外检测器210-280nm或采用示差检测器在线监测，自动收集馏分；

8)将步骤7)收集的馏分冷冻干燥，采用反相高效液相色谱C18柱检测纯度，以甲醇-水、甲醇-乙酸-水、甲醇-三氟乙酸-水或乙腈-水、乙腈-乙酸-水、乙腈-三氟乙酸-水为流动相，采用线性梯度洗脱，以B相溶解样品，紫外检测器210-280nm在线监测，计算多肽收率；

9)质谱检测确定分子量并利用数据库确定氨基酸序列；

10)具有特殊生活活性的多肽在分离前后测定其活性，计算活性多肽回收率。

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