CN101830979B - 液-固萃取体系分离纯化血清白蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及液-固萃取体系分离纯化血清白蛋白的方法，按以下步骤进行：将长链二元脂肪酸聚乙二醇修饰物混合吐温80聚合物、无机盐形成液-固萃取体系，调pH；在液-固萃取体系中加入血样，置于电动震荡机上平置振荡，取下倒置，体系分成聚合物固相和盐水液相，血清白蛋白被萃入固相；再将固相加蒸馏水溶解后，调pH并加入无机盐，置于电动震荡机上平置振荡，取下倒置，体系重新分成聚合物固相和盐水液相，血清白蛋白被反萃入液相；再将萃入液相的血清白蛋白于透析袋中进行透析，将留在透析袋中的血清白蛋白冻干后得血清白蛋白干粉。用本发明纯化得到高纯度、结构未变、未聚合的血清白蛋白，并将通常需对血浆进行前处理、粗分离、细分离一步完成。

Description

液-固萃取体系分离纯化血清白蛋白的方法

技术领域

本发明涉及一种用液-固萃取体系从血液中分离纯化血清白蛋白的方法，更具体地说是涉及用液-固萃取体系从人血浆或牛血浆中纯化血清白蛋白的方法。更具体地说，是通过分子识别机理，用聚乙二醇(PEG)二元脂肪酸修饰物混合聚合物-盐-水液-固亲和萃取法从血液中提取血清白蛋白。

背景技术

血清白蛋白是一种水溶性很强的蛋白，结构稳定，能结合多种小分子，在医学临床及生物领域有着广泛的应用。蛋白质的分离纯化原理主要基于溶解度差异、电荷差异、分子大小、疏水作用、生物亲和差异来达到分离的。作为生物分子，蛋白质的分离纯化与其它化学产品的分离有很大的差异：通常完成一次产品的纯化需要好几种方法结合使用，一般分为：前处理、粗分离、细分离和结晶四个步骤。随着人类对蛋白质认识的深入，分离纯化方法也一直在改进，当今纯化研究的重点在提高纯度、回收率，降低成本、减少繁冗的操作时间和步骤。

目前，血清白蛋白的分离纯化方法有很多种，各自都具有一定的特点，归纳起来主要有以下方法：

1、利用溶解度差异分离纯化血清白蛋白

沉淀法是一种初级分离技术，但是，多步操作也可以获得高纯度的目标产品。

(1)盐沉淀法

蛋白质在不同浓度的中性盐溶液中溶解度有不同程度的降低，采用添加中性盐的方法使各种蛋白质依次分别沉淀出来的方法，叫盐析法，比如硫酸铵、利凡诺、辛酸盐沉淀法。但是盐析法可能产生蛋白质聚合体或蛋白质变性，影响药用效果，自动化程度低、生产周期长、成本高、纯化倍数低。因此，在目前的实际应用中受到一定的限制。

(2)有机溶剂沉淀法

向蛋白质溶液中加入乙醇等水溶性溶剂之后，水的活度降低，利用有机溶剂较低的介电常数来沉淀白蛋白。最常用的是冷乙醇沉淀法，即著名的Cohn法。虽然广泛应用于工业生产，但乙醇沉淀法也有一些不足：乙醇是一种非特异性沉淀剂，尽管对人血清白蛋白HSA生产效果显著，但产品纯度不是很高；作为有机溶剂的乙醇还可能使蛋白质发生聚集变性或者二级构象改变；生产不易实现自动化，生产周期长；在非封闭式的环境中有机溶剂对工作人员危害也较大，同时也有可能由于环境不洁造成产品污染。

(3)聚乙二醇(PEG)沉淀法

PEG沉淀的条件温和，可以避免蛋白质聚集或变性，而且沉淀完全，但大量PEG价格较贵，从白蛋白溶液中除去在工业生产上需较大成本。M.I.Jimenez等人将聚乙二醇和乙醇结合来纯化血清白蛋白，分离迅速，并达到了实验室中等分离规模。但又用到了有机溶剂乙醇。

2、利用电荷差异分离纯化血清白蛋白

(1)离子交换色谱

这是迄今利用较广泛的色谱技术，在纯化中占了75％。因为它具有分辨率高，交换容量大以及明确的作用机理等特点。在白蛋白的分离纯化上有很重要的作用。但色谱柱的再生、保存、使用步骤烦琐，以及容易出现柱阻塞等问题，限制了它的进一步使用。

(2)电泳法

电泳分离的原理和操作形式多样，经过几十年的发展，成为分离纯化，特别是鉴定蛋白质的有力工具，现在正向综合方向发展。尹开吉等利用压力驱动的毛细管等电聚焦分离牛血清白蛋白和血红蛋白，得到了理想的分离结果，且操作简单。K.A.Denton等用中性涂布的高效毛细管分离临床用HSA，得到了八种组分峰。但是电泳法分离纯化蛋白质的量很少，不属制备范畴，无法满足制备需求，且电泳过程中产生的热量可能导致蛋白质变性，并且成本也很高。

3、利用分子大小差异

(1)凝胶层析法

这是20世纪60年代初发展起来的一种简单有效的技术。利用凝胶分子筛对大小、形状不同的蛋白进行分离。分子大小相差25％的样品，通过单一的凝胶就可以完全分开。应用于提纯蛋白质、激素、核酸等。同时还可以进行脱盐、浓缩、脱色、去热原。具有分离效果好、操作简单方便、分离广泛及不影响生物活性的特点。但是分辨率不高，分离操作较慢，对于质量差异不大的样品难以达到很好的分离。此外，凝胶层析要求样品黏度不宜太高。凝胶颗粒有时还有非特异性的吸附现象。

(2)离心法

离心法具有可以迅速将沉淀和上清液分开、应用范围广，成本低等特点，但无法获得纯度很高的产品。并且受样品浓度影响，离心力过大常会导致样品颗粒变性、聚集而失活。

4、利用特殊选择性分离纯化血清白蛋白

杨利等用IDA型固定化镍离子金属螯合亲和膜色谱对HSA分离纯化，产品经毛细管电泳分析，纯度与Sigma公司的电泳纯HSA相当，回收率可达85％以上。

Sinan Akgol等用苯乙二醇二聚异丁烯酸和二羟乙基异丁烯在水分散介质里通过基团悬浮聚合得聚合物珠，从人血浆中吸附HSA量，为95.7mg.g-1，纯度为88％，珠可重复使用未见吸附容量显著减少。

随着材料科学的发展，纳米技术，膜技术等现代化的材料与蛋白质生物亲和性结合，正在成为未来分离纯化发展的一个新兴方向。

5、萃取法

利用溶质在互不相溶的两相之间分配系数的不同而使溶质得到纯化或浓缩的方法称为萃取。用于血清白蛋白萃取的方法主要有反胶团萃取法、双水相萃取法等。

(1)反胶团萃取法

比如Tianxi Zhang等用游离的Cibacron Blue 3GA组成的反胶团萃取BSA。Gordon C.Kresheck等加热含有乙酸二甲次膦酸氧化物和蛋白质的水溶液形成双水相并分离BSA。李详村等用CATB(十六烷基三甲基溴化铵)/异辛烷/正戊醇反胶团萃取法纯化BSA等，但此法始终处于基础研究阶段，工业运用还有很多问题，无制备级研究报道。

(2)双水相萃取法

从1955年Albertson发明双水相体系到1979年德国人kula等人将双水相萃取技术应用于生物产品分离，目前已经成功的应用于蛋白质、核酸、病毒等生物产品的分离纯化，双水相体系也成功的应用到生物转化以及生物分析中。近年来，双水相萃取技术的分离对象进一步扩大到抗生素、多肽、氨基酸、重金属和植物有效成分中的小分子物质。双水相技术应用于血清白蛋白分离纯化的报道较多，比如邓凡政等用四氟硼酸1-甲基-3-丁基咪唑([Bmim]BF₄)和KH₂PO₄形成的离子液体双水相体系萃取分离BSA。在最佳条件下离子液体双水相体系对BSA有较高的正向萃取率。童爱军等利用阴阳离子型表面活性剂双水相萃取色氨酸衍生物和牛血清白蛋白。Graham E.McCreath等人在乳剂亲和血清白蛋白分离上也取得了一定的成果。双水相萃取成为新兴生物技术产业研究的热点，主要是该技术对于生物物质的分离和纯化表现出特有的优点和独有的技术优势：双水相萃取体系萃取蛋白也存在明显的不足，选择性不高，只能作为蛋白质的粗分离和蛋白质的浓缩，成相盐(如聚乙二醇或葡聚糖)价格昂贵，成本较高，工业化困难。对于双水相萃取体系由于两相密度相近，相系粘度很大，导致相分离困难，需借助离心操作，另外，由于高聚物的性质，生物大分子在两相界面存在较强的吸附及乳化作用，导致蛋白质的两相滞留。

人血清白蛋白(Human serum albumin HSA)是人血浆中最丰富的蛋白质，血浆中血清白蛋白含量约占总血浆蛋白质含量的60％，血清白蛋白在人体内具有重要的作用，是迄今为止用量最大的蛋白质药物，HSA的纯化非常关键。目前市场上销售的HAS或牛血清白蛋白(BSA)商品均由血浆纯化而得。由于生物分子的特殊柔性、安全要求以及对分离条件要求很高，使适用于化工领域的技术无法应用于血清白蛋白分离纯化。同时，由于生物制品的分离纯化成本大约占其总成本的60-90％，因此需要选择可靠、安全、低成本的人血清白蛋白分离纯化方法。近年许多实验室和公司已陆续尝试通过遗传工程方法获取HSA，但是也遇到了同样的分离纯化难题。作为药物制品的HSA，不论怎样制备，它自身的特点和用途都决定了纯化的复杂性。

发明内容

本发明目的在于提供一种液-固萃取体系分离纯化血清白蛋白的方法，用该方法纯化可得到高纯度、结构未变、未聚合的血清白蛋白，并将通常需进行的血浆前处理、粗分离、细分离一步完成。

本发明的技术方案为：

液-固萃取体系分离纯化血清白蛋白的方法，按以下步骤进行：(1)、液-固萃取体系形成：将长链二元脂肪酸聚乙二醇修饰物混合吐温80聚合物、无机盐形成液-固萃取体系，并且液-固萃取体系中无机盐的浓度为0.5-3.5mol·L^-1，聚合物吐温80的质量浓度为3～20％，长链二元脂肪酸聚乙二醇修饰物的浓度为0.2～3.0mg·mL^-1，调节pH 3.5-9.5；(2)、在上述液-固萃取体系中加入血样，置于电动震荡机上平置振荡2-10分钟，优选4-6分钟，取下倒置10-20分钟，优选12-16分钟，体系分成聚合物固相和盐水液相，血清白蛋白被萃入固相；(3)、将第(2)步的固相加蒸馏水溶解后，使体系酸度在pH 3-9范围内，并加入无机盐使体系的无机盐浓度达到0.5-3.5mol·L^-1，置于电动震荡机上平置振荡2-10分钟，优选4-6分钟，取下倒置10-20分钟，优选12-16分钟，体系重新分成聚合物固相和盐水液相，血清白蛋白被反萃入液相；(4)、将第(3)步的萃入液相的血清白蛋白于透析袋中进行透析，将留在透析袋中的大分子血清白蛋白冻干后得血清白蛋白干粉。

所述的长链二元脂肪酸聚乙二醇修饰物为碳十二长链二元脂肪酸聚乙二醇、碳十四长链二元脂肪酸聚乙二醇或碳十六长链二元脂肪酸聚乙二醇。

所述的无机盐为磷酸钾、磷酸钠、硫酸铵或柠檬酸钠。

本发明利用长链二元脂肪酸聚乙二醇修饰物混合吐温80聚合物-无机盐-水液-固萃取体系直接对牛血浆、人血浆中血清白蛋白进行选择性萃取，经过一次正萃，一次反萃和透析、冻干后即可得到纯度大于98％的血清白蛋白干粉。通过实验证明，采用该体系能够获得理想的固相收得率和反萃取率，而且操作简单，全血浆样品经过一次正萃，一次反萃，透析后即可获得较为满意的纯度，为血清白蛋白SA的分离纯化提供了一种简易、快速、成本低廉的方法。通过中科院查新检索查阅国内外相关文献，未见报道。

在此体系中，经过优化萃取条件，牛血清白蛋白、人血清白蛋白混合分配系数K(K＝固相中血清白蛋白浓度∶液相中血清白蛋白浓度)均可达到1000；一次正相萃取固相收得率R(R＝萃取分相后固相血清白蛋白的量：加入体系的血清白蛋白的总量)可达100％，一次反萃取率也可达到100％。经高效液相色谱、SDS-PAGE凝胶电泳法验证纯度不低于美国sigma公司所购试剂(98％)，并用荧光法检验蛋白构象与sigma公司产品一致，未发生变化。

本发明利用聚合物-盐-水液-固萃取体系克服了双水相技术和反胶团技术萃取蛋白的缺陷，相系清晰，界面无乳化。与传统有机溶剂液-液萃取体系比较，该体系不仅能萃取电中性物质，还能萃取带电荷的化合物，该体系不使用挥发性有机溶剂，无毒性，安全，成相容易，分相操作不需特殊技术处理，成相后直接倾倒出液相即可，无需双水相萃取中的离心等操作，成相聚合物及盐对生物活性物质有稳定和保护作用，且不存在似双水相萃取中被萃物质滞留于相界面的问题，现用分子识别机理萃取分离选择性好、消耗低，是易于规模放大的分离新技术。

附图说明

图1标准HSA的XRD谱图。

图2提取蛋白的XRD谱图。

图3SDS-PAGE电泳图。

图4为标准HSA和萃取HSA的荧光发射光谱图。1-标准HSA，2-人血浆。

图5为SDS-PAGE凝胶电泳图。

图6为粗血浆、标准品、萃取蛋白的SDS-PAGE图。

图7为2mg.mL^-1标准品蛋白HPCE图。

图8为2mg.mL^-1粗蛋白HPCE图。

图9为2mg.mL^-1萃取蛋白HPCE图。

图10为标准白蛋白的HPLC图。

图11为萃取白蛋白的HPLC图。

图12为粗血浆的HPLC图。

图13为10％全牛血清经萃取分离后透析袋中溶液(254nm)的HPLC图。

图14为萃取分离前的血样：10％的全牛血清(254nm)的HPLC图。

图15为4mg/mL标准血清白蛋白(sigma分装)(280nm)的HPLC图。

图16为10％全牛血清经萃取分离后透析袋中溶液(280nm)的HPLC图。

图17为C₁₂PEG、C₁₄PEG、C₁₆PEG修饰物萃取率对比图。

具体实施方式

实施例一：碳十六长链二元脂肪酸聚乙二醇(C₁₆PEG)修饰物混合吐温80-磷酸钾-水液-固萃取体系分离纯化HSA

1.萃取方法

依次取2.0毫升HSA溶液、0.4克C₁₆PEG修饰物、0.8毫升吐温80储备液，6.3克磷酸钾溶液于比色管中，pH在6.5-9.5范围内，加水定容到10.0mL，在电动震荡机中振荡5分钟，混合均匀，静置后，体系分成聚合物固相和盐水相，将盐水相完全倾倒，用蒸馏水将聚合物固相定容至10.0mL刻度，使体系酸度在pH 3-6范围内，并加入6.0克磷酸钾，置于电动震荡机上平置振荡5分钟，取下倒置20分钟，体系重新分成聚合物固相和盐水液相，血清白蛋白被反萃入盐水相；再将萃入液相的血清白蛋白于透析袋中进行透析，将留在透析袋中的大分子血清白蛋白冻干后得血清白蛋白干粉38毫克。

2.纯度检测

1)XRD初步探究

通过XRD将上述制得的血清白蛋白冻干粉末进行初步探究，从图1，图2可以看出，提取得到的蛋白粉末与标准品的衍射峰个数一致，均为二个衍射峰，标准品[琼脂糖凝胶电泳法，98-99％(agarose gelelectrophoresis)，lyophilized powder(Sigma)]。

2)十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳检测

10％分离胶：二次水2mL，1.5M pH8.8Tris-HCl 1.25mL，30％双丙烯酰胺1.65mL，10％SDS(十二烷基硫酸钠)50μL，10％过硫酸铵40μL，TEMED(四甲基二乙胺)5μL 5％浓缩胶(二次水1.37mL，0.5MpH6.8Tris-HCl1.12mL，30％双丙烯酰胺0.5mL，10％SDS30μL，10％过硫酸铵20μL，TEMED2μL)。

步骤：1：将玻璃板、样品梳、电泳槽用洗涤剂洗净，用二次水冲洗数次，再用乙醇擦拭晾干2：将两块洗净的玻璃板之间加入Spacer，装好玻璃板3：按上述比例配制10％分离胶5mL，混匀；向玻璃板间灌制分离胶，立即加入二次水覆盖，大约20min后胶可聚合(视温度而定)4：按上述比例配制5％浓缩胶，混匀；5：将覆盖水用滤纸吸干，灌制浓缩胶，插入样品梳；6：待浓缩胶成胶后，拔掉梳子，点样；7：装好电泳系统，先将梳孔用电泳缓冲液加满，然后加入电泳缓冲液开始电泳。8：先从稳流开始，电流每五分钟调大5毫安，直到溴酚蓝前沿跑到分离胶与浓缩胶交界处，然后打到稳压100KV。溴酚蓝刚跑出分离胶时，停止电泳，约需2-3小时左右；9.卸下胶板，剥离胶放入考马斯亮蓝染色液中，室温染色10小时左右；加入脱色液脱色，每20min更换一次脱色液(冰乙酸∶乙醇∶蒸馏水为1∶4.5∶4.5)至完全脱净，得到图3。从左到右依次为人血浆样品、标准品、萃取HSA。人血浆样品浓度为2mg.mL^-1，标准品(sigma)1mg.mL^-1，萃取蛋白1.5mg.mL^-1，点样量均为10μL。

由图3可知萃取蛋白与标准品蛋白电泳带一致，与血浆比电泳条带明显减少，说明经过此方法能选择性地从人血浆中直接分离纯化HSA。

3)荧光法检测HSA蛋白活性

在激发波长222nm下，得到发射波长在260-420nm范围的标准HSA和本实施例一萃取HSA荧光光谱图4，白蛋白中色氨酸的残基是三个能自然发出荧光的芳香氨基酸之一。从图4可以看出，萃取HSA和标准HSA的最大荧光强度波长一致，没有明显的峰值移动，说明结构没有改变，相关文献报道如果结构改变，最大吸收波长会红移或者蓝移。

实施例二C₁₆PEG修饰物混合吐温80-柠檬酸钠-水液-固萃取体系分离纯化HSA

1.萃取方法

依次取2.0毫升HSA溶液、0.6克C₁₆PEG修饰物、0.75毫升吐温80储备液，2.8克柠檬酸钠溶液于比色管中，pH在4.1-6.2范围内，加水定容到10.0mL，在电动震荡机中振荡10分钟，混合均匀，静置10分钟后，体系分成聚合物固相和盐水相，将盐水相完全倾倒，用蒸馏水将聚合物固相定容至10.0mL，使体系酸度在pH 3.0-5.2范围内，并加入2.4克柠檬酸钠，置于电动震荡机上平置振荡10分钟，取下倒置10分钟，体系重新分成聚合物固相和盐水液相，血清白蛋白被反萃入；再将萃入液相的血清白蛋白于透析袋中进行透析，将留在透析袋中的大分子血清白蛋白冻干后得血清白蛋白干粉6.1毫克。

2.纯度检测

电泳实验条件同磷酸盐体系，从左到有分别为粗蛋白，标准品，萃取蛋白。由图5可知萃取蛋白与标准品蛋白电泳带一致，与血浆比电泳条带明显减少，说明经过此体系同样能选择性地从人血浆中直接分离纯化HSA。

实施例三C₁₂PEG修饰物混合吐80-碳酸钾盐-水液-固萃取体系分离纯化HSA

依次取2.0毫升HSA溶液、0.55克C₁₂PEG修饰物、0.9毫升吐温80储备液，1.7克碳酸钾盐溶液于比色管中，pH7.0-8.5，加水定容到10.0mL，在电动震荡机中振荡2分钟，混合均匀，静置15分钟后，体系分成聚合物固相和盐水相，将盐水相完全倾倒，用蒸馏水将聚合物固相定容至10.0mL刻度，使体系酸度在pH3-6范围内，并加入1.7克碳酸钾盐，置于电动震荡机上平置振荡2分钟，取下倒置15分钟，体系重新分成聚合物固相和盐水液相，血清白蛋白被反萃入盐水相；再将萃入液相的血清白蛋白于透析袋中进行透析，将留在透析袋中的大分子血清白蛋白冻干后得血清白蛋白干粉5.8毫克。

一次正萃固相收得率可达80％以上，一次反萃取率大于50％。实施例四C₁₂PEG修饰物混合吐温80-柠檬酸钠-水液-固萃取体系分离纯化HSA

依次取2.0毫升HSA溶液、0.4克C₁₂PEG修饰物、0.9毫升吐温80储备液，2.4克柠檬酸钠溶液于比色管中，pH4.0-6.0加水定容到10.0mL，在电动震荡机中振荡5分钟，混合均匀，静置15分钟后，体系分成聚合物固相和盐水相，将盐水相完全倾倒，用蒸馏水将聚合物固相定容至10.0mL刻度，使体系酸度在pH 3-6范围内，并加入2.2克柠檬酸钠，置于电动震荡机上平置振荡5分钟，取下倒置15分钟，体系重新分成聚合物固相和盐水液相，血清白蛋白被反萃入盐水相；再将萃入液相的血清白蛋白于透析袋中进行透析，将留在透析袋中的大分子血清白蛋白冻干后得血清白蛋白干粉6.2毫克。

一次正萃固相收得率可达60％以上，一次反萃取率可达55％。

以下是对牛血清白蛋白的萃取实施例

实施例五C₁₆PEG修饰物混合吐温80-磷酸钠-水液-固萃取体系分离纯化BSA

1.萃取方法

依次取2.0毫升BSA溶液、0.64克C₁₆PEG修饰物、1.1毫升吐温80储备液，4.4克磷酸钠溶液于比色管中，pH4.8-8.1，加水定容到10.0mL，在电动震荡机中振荡5分钟，混合均匀，静置15分钟后，体系分成聚合物固相和盐水相，将盐水相完全倾倒，用蒸馏水将聚合物固相定容至10.0mL刻度，使体系酸度在pH 3-6范围内，并加入4.0克磷酸钠，置于电动震荡机上平置振荡5分钟，取下倒置15分钟，体系重新分成聚合物固相和盐水液相，血清白蛋白被反萃入盐水相；再将萃入液相的血清白蛋白于透析袋中进行透析，将留在透析袋中的大分子血清白蛋白冻干后得血清白蛋白干粉28毫克。

在最佳条件下，一次正相萃取率可达100％；一次反萃取率可达70％。

2.纯度检测

1)SDS-PAGE的检测

电泳条件同前，粗牛血浆浓度为5mg.mL^-1，BSA标准品浓度为1mg.mL^-1，萃取蛋白浓度为1.5mg.mL^-1，点样量均为8μL，从左到有分别为粗蛋白，标准品，萃取蛋白。

由图6可知萃取蛋白与标准品蛋白电泳带一致，与血浆比电泳条带明显减少，说明经过此体系也能选择性地从牛血浆中直接分离纯化BSA。

2)高效毛细管电泳HPCE的检测

配制BSA标准品2mg.mL^-1，新生牛血浆2mg.mL^-1，萃取所得的BSA2mg.mL^-1，利用毛细管电泳进行蛋白纯度检测，进样前样品用0.22um微孔滤膜过滤。毛细管有效长度50mm×75um，采用压力进样，先用0.1mol·L^{- 1}NaOH溶液冲洗3min，再依次用二次蒸馏水，20mmol·L^-1，pH＝9.1的硼酸钠缓冲溶液，二次蒸馏水各冲洗5min.2次实验间隔中用0.1mol·L^-1NaOH溶液冲洗3min。

分别用20mmol·L^-1，30mmol·L^-1，40mmol·L^-1的硼酸钠(pH＝9.1)做背景缓冲液，用毛细管电泳对5mg·ml^-1新生牛血浆白蛋白检测，进样压力为2psi，进样时间为20sec，20℃下用5kV的分离电压，检测波长为191nm。研究表明20mmol·L^-1硼酸钠缓冲液对蛋白具有较好的分离，因此选择20mmol·L^-1硼酸钠缓冲溶液做背景缓冲液。

分别试验分离电压15KV，10KV，5KV，背景缓冲液，20mmol·L^-1，pH＝9.1进样压力为2psi，进样时间为20sec，20℃下检测波长为191nm。当分离电压为5、10、15KV时，萃取蛋白与标样蛋白均比血浆所得电泳峰少，初步说明血浆经过萃取得到了提纯的蛋白，电压越大，样品出峰时间越早，但分离效果较差，故选用5KV

进样压力为1psi，进样时间为10sec。背景缓冲液，20mmol·L^-1，pH＝9.1硼砂缓冲液，20℃下检测波长为191nm，分离电压5KV。得图5-8，5-9，5-10。

从图7、图8、图9可以看出通过HPCE检测，粗蛋白和萃取蛋白、标准品有明显的差异，经过提取的蛋白得到了纯化。因sigma公司制品是结晶后产品，单位体积浓度比我们的冻干粉略大，这一点从电泳图的响应上也可看出。

实施例六C₁₆PEG修饰物混合吐温80-硫酸铵盐-水液-固萃取体系分离纯化BSA

1.萃取方法

依次取2.0毫升BSA溶液、0.4克C₁₆PEG修饰物、1.2毫升吐温80储备液，2.2克硫酸铵溶液于比色管中，pH 3.3-5.8，加水定容到10.0mL，在电动震荡机中振荡8分钟，混合均匀，静置12分钟后，体系分成聚合物固相和盐水相，将盐水相完全倾倒，用蒸馏水将聚合物固相定容至10.0mL刻度，使体系酸度在pH2.5-4.5范围内，并加入2.0克硫酸铵，置于电动震荡机上平置振荡8分钟，取下倒置12分钟，体系重新分成聚合物固相和盐水液相，血清白蛋白被反萃入；再将萃入液相的血清白蛋白于透析袋中进行透析，将留在透析袋中的大分子血清白蛋白冻干后得血清白蛋白干粉12毫克。

在最佳条件下，一次正萃取率可达100％；一次反萃取率可达70％。

2.纯度检测

HPLC纯度检测

色谱条件：流动相A：pH＝5.0，0.2M的磷酸二氢钠缓冲液；流动相B：40％乙腈水溶液。检测波长：280nm；柱温：30℃；流速1ml·min^-1；HatichiDL7000高效液相色谱仪，单泵四流路，二极管阵列紫外检测器。反相C18柱，25cm*4.6mm。洗脱方式：0min100％pH＝5.0，0.2M的磷酸二氢钠缓冲液(A)线形梯度-10min100％40％乙腈水溶液(B)洗脱，维持2min，从100％B线形梯度-10min再回到100％A。(缓冲液经过0.45μm的纤维微孔滤膜过滤脱气)HSA标准品，萃取HSA，牛血浆样品配置成一定浓度的溶液，经过0.22μm的微孔滤膜过滤后进样。标准白蛋白，萃取白蛋白，血浆浓度均为4mg.mL^-1进样量为10μL。

从图10、图11、图12可看出，同浓度的萃取蛋白和标准蛋白响应基本是粗血浆中的一倍，说明此体系也能纯化BSA。通过HPLC对萃取BSA进行了初步的纯度检测，确知经过萃取BSA与标准品成分基本一致，与粗蛋白相比，主要成分响应也明显提高。在实际应用中，选择合适的盐对高效分离蛋白，节约成本有重要的意义。

实施例七C₁₂PEG修饰物混合吐温80-硫酸铵盐-水液-固萃取体系分离纯化BSA

1.萃取方法

依次取2.0毫升BSA溶液、0.3克C12PEG修饰物、1.1毫升吐温80储备液，2.5克硫酸铵溶液于比色管中，加水定容到10.0mL，pH 3.1-6.2，在电动震荡机中振荡10分钟，混合均匀，静置10分钟后，体系分成聚合物固相和盐水相，将盐水相完全倾倒，用蒸馏水将聚合物固相定容至10.0mL刻度，使体系酸度在pH3-6范围内，并加入2.2克硫酸铵，置于电动震荡机上平置振荡10分钟，取下倒置10分钟，体系重新分成聚合物固相和盐水液相，血清白蛋白被反萃入；再将萃入液相的血清白蛋白于透析袋中进行透析，将留在透析袋中的大分子血清白蛋白冻干后得血清白蛋白干粉9.7毫克。

在最佳条件下，一次正相萃取率可达70％；一次反萃取率可达91.69％。

2.纯度检测

HPLC纯度检测

利用硫酸铵萃取体系最佳条件对牛血清样品进行一次正萃，一次反萃，将反萃后液相透析，透析液进行HPLC分析。由中国农科院油料作物研究所张闻老师测试的HPLC结果如图13、图14所示。

从图13、图14两图的对比中不难看出，在同样测定条件下萃取分离前血样谱图中吸收峰很多，且分离效能很低，萃取分离后透析袋中的血样吸收峰明显减少，保留时间为5.076的组分峰高(46mAU)比血样中相应保留时间组分(5.134)峰高(6mAU)高出约7-8倍，可是反萃后液相血清浓度大约比图15的10％血清低20倍，不考虑透析过程中的稀释，可明显看出有组分被提纯。

这说明，通过本课题所选用的C₁₂PEG修饰物混合吐温80-硫酸铵-水液-固萃取体系一次正萃，一次反萃，透析后能够使血样纯化。

从图15、图16两图可以看出，萃取分离后的透析袋中血样谱图与标准BSA(98％，sigimaCo.)的谱图在同样测定条件下，所出峰的个数相近，白蛋白是一类结构和功能相近的蛋白组，标准BSA谱图中保留时间为2.531，3.786，5.503，10.069四种主成分的总量应占到98％的大部分，而透析袋中血样的谱峰，除溶剂峰1.769外，大部分也是由保留时间为2.519，3.809，5.471，10.154的四种主成分所代表，由此可以初步知道通过本课题所选用的C₁₂PEG修饰物混合吐温80-硫酸铵-水液-固萃取体系一次正萃，一次反萃，透析后能够使全血清样的纯度达到与sigima公司标准品相当的纯度。

[色谱条件：Aginent 1100液相色谱仪，反向C18柱，t_c＝30℃，流速1.0ml/min；流动相A：pH5.0磷酸盐(0.2mol/L磷酸二氢钠)缓冲液；流动相B：40％乙腈水溶液；梯度洗脱方式：0min100％A线性梯度-10min到100％B洗脱，维持2min再回到100％A。二极管列阵检测器；标准牛血清白蛋白(98％)浓度4mg/mL，进样量是10uL；血样：10％的全牛血清，进样量10uL；10％全牛血清经萃取分离后透析袋中溶液，进样量是10uL。]

实施例八C₁₂PEG修饰物混合吐温80-磷酸钾-水液-固萃取体系分离纯化BSA

1.萃取方法

依次取2.0毫升BSA溶液、0.6克C12PEG修饰物、0.9毫升吐温80储备液，5.3克磷酸钾溶液于25.0mL比色管中，pH6.3-9.0，加水定容到10.0mL，在电动震荡机中振荡10分钟，混合均匀，静置10分钟后，体系分成聚合物固相和盐水相，将盐水相完全倾倒，用蒸馏水将聚合物固相定容至10.0mL刻度，使体系酸度在pH3-6范围内，并加入5.0克磷酸钾，置于电动震荡机上平置振荡10分钟，取下倒置10分钟，体系重新分成聚合物固相和盐水液相，血清白蛋白被反萃入盐水相；再将萃入液相的血清白蛋白于透析袋中进行透析，将留在透析袋中的大分子血清白蛋白冻干后得血清白蛋白干粉7.9毫克。

在最佳条件下，一次正萃取率可达90％，一次反萃取率可达70％。

2.C₁₂PEG、C₁₄PEG、C₁₆PEG修饰物固相收得率对比

C₁₂PEG、C₁₄PEG、C₁₆PEG修饰物对血清白蛋白的亲和力依次增大，本课题所采用的长链二元脂肪酸聚乙二醇修饰物混合吐温80-盐-水液-固萃取体系中，以柠檬酸盐体系为例，在相同条件下，各自的固相收得率和分配系数如图17所示，体系：柠檬酸：0.9mol·L^-1；吐温80：6％(v/v)长链二元脂肪酸修饰物：2.4％(w/v)；pH5.00，温度：20℃a.(R)％，b.LgK。

从图17可以看出，20℃时，在本课题所采用的长链二元脂肪酸聚乙二醇修饰物混合吐温80-盐-水液-固萃取体系中，在同样萃取条件下，C₁₂PEG、C₁₄PEG、C₁₆PEG修饰物对HSA的亲和力依次增大。一次萃取固相收得率R％从40％→70％→90％，1gK从1.6→1.85→3.0，在条件实验中选用萃取效果好的可达到明显优越的结果。

Claims (6)

1.液-固萃取体系分离纯化血清白蛋白的方法，其特征在于按以下步骤进行：(1)、液-固萃取体系形成：将长链二元脂肪酸聚乙二醇修饰物混合吐温80聚合物、无机盐形成液-固萃取体系，并且液-固萃取体系中无机盐的浓度为0.5-3.5mol·L^-1，聚合物吐温80的质量浓度为3～20％，长链二元脂肪酸聚乙二醇修饰物的浓度为0.2～3.0mg·mL^-1，调节pH 3.5-9.5；(2)、在上述液-固萃取体系中加入血样，置于电动震荡机上平置振荡2-10分钟，取下倒置10-20分钟，体系分成聚合物固相和盐水液相，血清白蛋白被萃入固相；(3)、将第(2)步的固相加蒸馏水溶解后，使体系酸度在pH3-9范围内，并加入无机盐使体系的无机盐浓度达到0.5-3.5mol·L^-1，置于电动震荡机上平置振荡2-10分钟，取下倒置10-20分钟，体系重新分成聚合物固相和盐水液相，血清白蛋白被反萃入液相；(4)、将第(3)步的萃入液相的血清白蛋白于透析袋中进行透析，将留在透析袋中的大分子血清白蛋白冻干后得血清白蛋白干粉。

2.根据权利要求1所述的液-固萃取体系分离纯化血清白蛋白的方法，其特征在于：所述的长链二元脂肪酸聚乙二醇修饰物为碳十二长链二元脂肪酸聚乙二醇、碳十四长链二元脂肪酸聚乙二醇或碳十六长链二元脂肪酸聚乙二醇。

3.根据权利要求1所述的液-固萃取体系分离纯化血清白蛋白的方法，其特征在于：所述的无机盐为磷酸钾、磷酸钠、硫酸铵或柠檬酸钠。

4.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的液-固萃取体系分离纯化血清白蛋白的方法，其特征在于：置于电动震荡机上平置振荡4-6分钟。

5.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的液-固萃取体系分离纯化血清白蛋白的方法，其特征在于：取下倒置12-16分钟。

6.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的液-固萃取体系分离纯化血清白蛋白的方法，其特征在于：正萃、反萃后需透析冻干。

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