CN101955514B - 一种槲皮素配基琼脂糖凝胶氢键吸附色谱介质的合成方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种以琼脂糖凝胶为基质、以槲皮素为配基的氢键吸附介质的合成方法。琼脂糖凝胶介质表面有大量可供反应的羟基，并存在大量极性基团，如醚键、半缩醛、伯醇、仲醇等，可以与多肽分子中的肽键(酰胺键)以及侧链中含有的醇羟基、酚羟基、巯基等反应形成氢键。本发明以短链环氧化试剂环氧氯丙烷和长链环氧化试剂1，4-双-(2，3-环氧丙氧基)-丁烷活化琼脂糖凝胶，连接配基槲皮素，制备用于缩宫素分离纯化的琼脂糖凝胶氢键吸附色谱介质，将此介质用于液相合成或固相合成缩宫素的分离纯化。

Description

一种槲皮素配基琼脂糖凝胶氢键吸附色谱介质的合成方法

技术领域

本发明涉及一种色谱介质的合成方法，具体地是涉及一种槲皮素配基琼脂糖凝胶氢键吸附色谱介质的合成方法。

本发明属于生物工程的生化分离领域。

背景技术

琼脂糖凝胶是天然多糖类色谱介质，发明于20世纪60年代，具有理想介质的许多特性：高孔度(90-96％)，即使在高浓度下也能保持高的孔度；具有连接纤维的开放的结构；高的连通性有效保证了分子内物质传递；大比表面积提供了很高的吸附能力易制备成不同琼脂糖浓度、不同尺寸的球形颗粒以满足不同领域的需求；在氢氧化钠中稳定可满足苛刻的在位清洗步骤；低的非特异性吸附使应用面较广；具有弹性及非脆性(较易实现柱子的再装填)又可通过足够的交联步骤使介质具有刚性(有较高的耐压性能)；可用不同的活化步骤进行共价交联而活化，可被大量配基取代而应用于多种吸附色谱技术，是迄今为止应用最广泛的一种色谱介质。由于琼脂糖上含有较多的可活化的羟基，可以在一定条件下接入不同的配基，可制备多种亲和色谱和离子交换色谱的介质，随着研究与应用的不断深入，琼脂糖凝胶不仅作为常压和低压色谱的介质，而且已能在中压下操作和实现快速高效色谱分离，分离对象涉及蛋白质、核酸、肽类、糖类等水溶性生化物质。琼脂糖凝胶除了作为分离介质外，还可以作为活细胞载体，一方面可以使细胞得到均匀分散，有利于营养物质和代谢产物的扩散，另一方面可以降低微球膜材的浓度，增加膜的通透性，有利于营养物质进入微球内供细胞生长。

氢键吸附色谱是离子交换、疏水相互作用和生物特异性相互作用色谱的补充，利用高浓度、高交联度琼脂糖凝胶，利用氢键吸附色谱原理分离纯化中药有机小分子的机理及应用研究已有报道。

缩宫素于1895年被发现，在临床上缩宫素被广泛用于引产，催产及预防因分娩后子宫乏力引起的大出血，也是美国FDA唯一认可用于临床引产的药物。因直接从动物组织中提取缩宫素，存在病毒灭活、过敏原、热原等安全性问题，我国自1969年第一次合成缩宫素以来，国内30余家缩宫素制剂生产厂家均采用九肽酰胺经钠-液氨法消除、缩合的办法合成缩宫素，最终产品的纯化过程较复杂，产品纯度低、收率低，这也是导致临床出现部分不良反应的因素之一。

琼脂糖凝胶介质表面有大量可供反应的羟基，并存在大量极性基团，如醚键、半缩醛、伯醇、仲醇等，可以与多肽分子中的肽键(酰胺键)以及侧链中含有的醇羟基、酚羟基、巯基等反应形成氢键。这是琼脂糖凝胶氢键吸附色谱法分离纯化多肽的理论基础。

发明内容

本发明的目的在于克服使用传统方法从合成溶液中纯化缩宫素存在的纯度低、收率低、过程复杂的问题，制备以琼脂糖凝胶为基质、以槲皮素为配基的氢键吸附介质，提供一种高选择性、高纯度、高收率的一步纯化缩宫素的色谱分离介质。

本发明的目的是通过如下的技术方案实现的。

本发明提供的使用以琼脂糖凝胶为基质、以槲皮素为配基的氢键吸附介质的合成方法，包括如下步骤：

1)12％浓度、30μm平均粒径的高交联度琼脂糖凝胶微球1升，用水洗后转入反应瓶或反应器；

2)加入100-200ml水，加5-15g硫酸钠，搅拌2-3h；

3)加入100-200ml水和50-60ml的20-50％的氢氧化钠，60rpm搅拌；

4)加入30-60ml环氧化试剂，包括环氧氯丙烷和1，4-双-(2，3-环氧丙氧基)-丁烷，20-30℃，60rpm搅拌，反应6-8h；

5)用盐酸调pH4-6；

6)加入4-10mg槲皮素和橙皮素，20-50％的氢氧化钠，20-30℃，60rpm搅拌，反应12-20h；

7)用盐酸调pH4-6，10倍体积水洗。

本发明提供的在高浓度、高交联度琼脂糖凝胶微球上，使用短链环氧化试剂环氧氯丙烷或长链环氧化试剂1，4-双-(2，3-环氧丙氧基)-丁烷连接槲皮素配基，制备用于缩宫素分离纯化的琼脂糖凝胶氢键吸附色谱介质的合成方法，步骤简便易行。

附图说明

图1为实施例1采用短链环氧化试剂环氧氯丙烷连接配基槲皮素所制备的琼脂糖凝胶氢键吸附色谱介质纯化缩宫素的色谱图(色谱峰3为缩宫素)。

图2为实施例2采用长链环氧化试剂1，4-双-(2，3-环氧丙氧基)-丁烷连接槲皮素所制备的琼脂糖凝胶氢键吸附色谱介质纯化缩宫素的色谱图。

具体实施方式

实施例1、采用短链环氧化试剂环氧氯丙烷连接配基槲皮素制备用于缩宫素纯化的琼脂糖凝胶氢键吸附色谱介质

1)12％浓度、30μm平均粒径的高交联度琼脂糖凝胶微球1升，用水洗后转入反应瓶或反应器；

2)加入200ml水，加10g硫酸钠，搅拌2h；

3)加入200ml水和50ml的30％的氢氧化钠，60rpm搅拌；

4)加入40ml环氧氯丙烷，25℃，60rpm搅拌，反应6h；

5)用盐酸调pH5；

6)加入6mg槲皮素和橙皮素，30％的氢氧化钠，25℃，60rpm搅拌，反应12h；

7)用盐酸调pH6，10倍体积水洗。

实施例2、采用长链环氧化试剂1，4-双-(2，3-环氧丙氧基)-丁烷连接槲皮素制备用于缩宫素纯化的琼脂糖凝胶氢键吸附色谱介质

1)12％浓度、30μm平均粒径的高交联度琼脂糖凝胶微球1升，用水洗后转入反应瓶或反应器；

2)加入200ml水，加15g硫酸钠，搅拌3h；

3)加入200ml水和50ml的50％的氢氧化钠，60rpm搅拌；

4)加入60ml的1，4-双-(2，3-环氧丙氧基)-丁烷，25℃，60rpm搅拌，反应8h；

5)用盐酸调pH6；

6)加入9mg槲皮素和橙皮素，30％的氢氧化钠，25℃，60rpm搅拌，反应15h；

7)用盐酸调pH6，10倍体积水洗。

Claims (1)

1.一种纯化缩宫素的琼脂糖氢键吸附色谱介质的合成方法，采用短链环氧化试剂环氧氯丙烷连接配基槲皮素，采用长链环氧化试剂1,4-双-(2,3-环氧丙氧基)-丁烷连接橙皮素；

包括如下的步骤：

1)12%浓度、30μm平均粒径的高交联度琼脂糖凝胶微球1升，用水洗后转入反应瓶或反应器；

2)加入100-200ml水，加5-15g硫酸钠，搅拌2-3h；

3)加入100-200ml水和50-60ml的20-50%的氢氧化钠，60rpm搅拌；

4)加入30-60ml环氧化试剂，包括环氧氯丙烷和1,4-双-(2,3-环氧丙氧基)-丁烷，20-30℃，60rpm搅拌，反应6-8h；

5)用盐酸调pH 4-6；

6)加入4-10mg槲皮素和橙皮素，20-50%的氢氧化钠，20-30℃，60rpm搅拌，反应12-20h；

7)用盐酸调pH 4-6，10倍体积水洗。

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