CN103045580A - 一种小麦胚芽脂肪酶的固定化方法 - Google Patents

Abstract

一种小麦胚芽脂肪酶的固定化方法，属于生物工程技术领域。本发明包括以下步骤：（1）用环氧氯丙烷活化载体，使载体带上环氧基；（2）用一种化合物将（1）中载体上的活化基团打开，载体带上连接基团；（3）将步骤（2）获得的载体通过连接物与小麦胚芽脂肪酶共价连接。本发明中固定化载体修饰和载体与酶共价结合条件温和，过程简单。通过该固定化方法大大提高了小麦胚芽脂肪酶的稳定性和重复利用次数，易于进行工业化生产。

Description

一种小麦胚芽脂肪酶的固定化方法

技术领域

本发明涉及一种小麦胚芽脂肪酶的固定化方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

    脂肪酶（EC 3.1.1.3）是一种重要的水解酶类，在食品、药品、化工等行业得到广泛应用。脂肪酶种类很多，其中绝大多数来自于微生物，少数来自于动物，而极少数来自于植物。小麦胚芽脂肪酶是一种存在于小麦中的脂肪酶，由于其热稳定性以及在小麦发芽中的重要性，为大家所关注。一般认为小麦胚芽当中富含多种酶类，有α-淀粉酶、脂肪酶、酯酶、脂肪氧化酶和蛋白酶等，其中主要是脂肪酶以及酯酶；尤其是在发芽后所显示的酶活主要是脂肪酶酶活。

小麦胚芽脂肪酶的存在对小麦胚芽的保藏是十分不利的，它能短时间内水解油脂，使其脂肪酸值大幅度升高，引起麦胚酸败变质；同时，微生物生长繁殖快，也会导致麦胚出现结块、霉变和发酵等变质现象。所以，目前对小麦胚芽脂肪酶的研究大多集中在该酶在小麦胚芽中的稳定性以及如何快速降低其水解活性，防止麦胚酸化变质。对小麦胚芽脂肪酶用于催化生物反应过程研究相对较少，主要集中在手性拆分和油脂工业方面。据报道，小麦胚芽脂肪酶在立体选择性方面并不符合Kazlauskas规则，呈现为反K氏规则，是现有唯一天然来源的反K氏规则的脂肪酶，这在手性拆分和脂肪酶催化分子机理解析方面具有重要的意义。在油脂催化方面，目前认为，小麦胚芽脂肪酶只对短链的甘油三酯具有催化作用，而对长链甘油三酯几乎没有作用。总体而言，相对于其它脂肪酶，小麦胚芽脂肪酶稳定性和活性都较低。通过某种手段改善小麦胚芽脂肪酶的不稳定性和低活性，是拓宽其应用范围的一大研究方向。

固定化酶技术是通过物理或化学的方法，将酶束缚在载体上，使其既保持酶的天然活性，又便于与反应液分离，可以重复使用。固定化酶与游离酶相比，主要有下列优点：(l)产物不易被酶污染，简化后续的分离提纯工艺；(2)在大多数情况下，酶在固定化后稳定性会得到提高并可重复使用，从而便于连续化生产，降低生产成本；(3)固定化酶具有一定的机械强度，可以采用搅拌或装柱的方式使用，便于生产过程实现管道化、连续化和自动化。酶固定化技术的显著优势使得该领域的研究一直受到广泛关注，工业化应用的例子也越来越多。

因此，通过酶固定化方法提高小麦胚芽脂肪酶的稳定性和重复利用次数是降低使用成本和简化分离纯化工序的一种有效手段。小麦胚芽脂肪酶经固定化之后载体对其具有保护和缓冲作用，在催化反应过程中大大降低了反应环境对其影响，如在有机溶剂反应中，可减轻有机溶剂对其的失活作用。此外，在固定化的过程中，可对酶分子进行一定的化学修饰作用，使脂肪酶分子α螺旋“盖子”处于开启状态，有助于底物分子进入袋型结构与酶分子催化三联体结合，提高酶与底物之间的传质作用，加快反应的进行。

发明内容

    本发明的目的是为了克服游离小麦胚芽脂肪酶稳定性和重复利用性差的缺点，提出一种化学法固定小麦胚芽脂肪酶的方法。该方法采用价格低廉的载体，经过简单的几步反应就达到了固定化目的。在固定化过程中，反应条件温和、所用试剂毒性均较低，对人体和环境危害小。酶经固定化之后结合牢固，不易从载体脱落，大大提高了重复利用次数。

    本发明的技术方案：为了实现上述目的，在本发明的第一方面，提供了一种小麦胚芽脂肪酶的固定化方法，包括以下步骤：

（1）用环氧氯丙烷活化载体，使载体带上环氧基；

（2）用一种带氨基的化合物将步骤（1）已活化载体上的环氧基团打开，使载体带上连接基团氨基；

（3）步骤（2）获得的载体通过连接物与小麦胚芽脂肪酶共价连接。

本发明中在步骤（1）环氧氯丙烷活化过程中引入一定体积的水溶性助溶剂，一方面有助于解决环氧氯丙烷在水中的溶解度有限，造成其在载体中扩散通量较低，活化反应时间延长的问题；另一方面，可抑制环氧基在碱性条件下发生水解反应，提高修饰密度。水溶性助溶剂的种类可以是二甲亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、二氧六环、乙腈、丙酮、正己烷中的一种或一种以上的混合物，其中二甲亚砜效果最佳。助溶剂加入量占总体系体积的5%-40%，较佳地选择10%-20%。

环氧化时间对最终环氧基密度影响很大。反应时间过短，载体上羟基未能全部被取代；反应时间过长，容易使载体环氧化之后，环氧基发生水解反应，降低环氧基密度。因此，在环氧化反应过程中，要严格控制好时间1-8h。较优地，将时间控制在2-4h。

环氧氯丙烷活化载体的温度为30-50℃，较优的，将温度控制在40℃。

本发明中，所用载体为带有羟基的天然或人工合成的聚合物。优先选择价格低廉，性能稳定的硅胶、琼脂糖、壳聚糖、葡聚糖、聚乙二醇中的一种或一种以上的混合物。载体在使用前需经浓盐酸浸泡后，用大量去离子水洗涤，抽滤干燥后待用。

步骤（2）中，化合物为带有氨基的化合物，加入氨基化合物的目的是使环氧基在碱性条件下发生水解，形成氨基。所述带有氨基的化合物选用：氨水、1,2-二氨基乙烷、3,3^’-二氨基二丙烷、乙二胺1,6-己二胺、6-氨基己酸中的一种；体系中氨基化合物浓度并不需严格控制，加入的氨基化合物能使体系中pH大于12即可。氨基化合物与环氧基摩尔比为1-100:1，氨基化温度为30-50℃，控制转速为100-200rpm，反应时间为12-24h。

 本发明步骤（3）中控制好温度和pH对提高酶吸附量十分关键。碳化二亚胺（EDC）对温度和pH较为敏感。所述连接物为碳化二亚胺EDC、碳化二亚胺EDC与N-羟基琥珀酰亚胺NHS混合物、碳化二亚胺EDC与N-羟基硫代琥珀酰亚胺Sulfo-NHS混合物中的一种；

连接物与小麦胚芽脂肪酶的摩尔比为1-100:1，交联温度为4-25℃，交联的pH为5.0-9.0，交联时间为2-24h。

较佳地，交联过程中控制温度选择4-10℃，pH控制在5-8。

在本发明的第二方面提供了一种固定化小麦胚芽脂肪酶，其特点是，由上述的小麦胚芽脂肪酶固定化方法制备而成。

本发明的有益效果在于：

1、本发明涉及的一种小麦胚芽脂肪酶的固定化方法通过用一种活化基团修饰载体；再用一种化合物将活化载体上的活化基团打开，载体带上连接基团；最后通过连接物与小麦胚芽脂肪酶共价连接，实现小麦胚芽脂肪酶的固定化。本发明使用廉价的固定化材料，利用简单的几步化学修饰，巧妙地将小麦胚芽脂肪酶与载体共价连接。整个固定化过程反应条件温和，使用的试剂价格低廉、安全低毒，适合大规模推广应用。

2、本发明中使用的小麦胚芽脂肪酶可以从废弃的麦麸中提取获得，不但酶的来源广泛，而且实现了废物的回收再利用，变废为宝。将提取得到的酶液固定在载体上，大大提高了酶的稳定性和重复利用次数，易于实现工业化操作。

附图说明

图1  硅胶对小麦胚芽脂肪酶最大静态吸附量图。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明，其目的仅在于更好理解本发明的内容而非限制本发明的保护范围。

实施例1

称取40目大孔硅胶48g，用去离子水清洗2遍，真空抽干。在1000mL的蓝盖瓶中，加入经清洗干净的硅胶、78mL环氧氯丙烷（与硅胶的摩尔比为2:1）、125mL二氧六环和300mL、1.0M的氢化化钠溶液，密闭后，在30℃，200rpm摇床中振荡反应2.0h。反应结束后，硅胶用去离子水不断冲洗，直至砂芯漏斗下方流出水的pH为中性。将活化后的载体真空抽干5min，随后称取0.5g硅胶于50mL磨口三角瓶中，加入5mL、1.3mol/L的硫代硫酸钠和50μL中性红指示剂。30℃、160rpm下振荡反应1h，反应结束为的溶液用0.1M、HCl标准溶液滴定。直至溶液颜色由亮橙色变为红色为止。根据消耗的盐酸标准溶液的体积，测定出环氧基密度。经以上步骤可获得带有环氧基的硅胶。

实施例2

称取聚乙二醇2000（国药化学试剂有限公司）40g，加入环氧氯丙烷32mL、75mL丙酮和143mL、1.0M氢氧化钠溶液，密闭后，在50℃、200rpm摇床中振荡反应6.0h。反应结束后，测定环氧基密度，测定方法同实施例1。

实施例3

称取实施例1中环氧氯丙烷活化后硅胶36g，加入36%-38%氨水100mL，再加入去离子水150mL。调节pH为12，在30℃、160rpm反应过夜。反应结束后，用去离子水冲洗，使砂芯漏斗流出液体pH为中性为止。准确称量氨基化后的硅胶1g于50mL磨口三角瓶中，加入5mL去离子水和50μL甲基红指示剂，用0.1M盐酸标准溶液滴定其氨基密度。

实施例4

    称取实施例2中经环氧基活化的聚乙二醇2000  30g，加入50mL乙二胺，再加入75mL去离子水，调节pH为13，于30℃、160rpm反应12h。反应结束后测定其氨基密度，测定方法同实施例3。

实施例5

称取实施例3中经氨基化的硅胶20g于50mL离心管中，加入小麦胚芽脂肪酶粗酶粉5g(含酶质量1.32g，摩尔量为3.14×10^-5mol)，再加入20mL pH为5.0的磷酸缓冲液和456mg EDC（摩尔量为2.38×10^-3 mol，EDC与酶的摩尔比为76:1），混合均匀后，取0.1mL上清测定吸附前蛋白浓度C₁，然后于旋转混合培养器中旋转吸附，转速为30rpm，吸附温度为4℃，吸附时间为8h。吸附结束后，取0.1mL上清，测定其蛋白浓度C₂，然后倒去上清，用0.1M pH为7.0的磷酸缓冲液清洗载体表面未吸附的酶，然后真空抽滤得到干燥的固定于硅胶上的小麦胚芽脂肪酶（固定化WGL1）。准确称取固定化WGL1 50mg测定其水解酶活。

酶活通过酶对三乙酸甘油酯的水解能力来表征。测定方法为：称取34.15g三乙酸甘油酯，加入500mL pH为7.4的25mM磷酸缓冲液，用高速匀浆机10000rpm混匀成微乳液，向50mL具塞三角瓶中加入5mL微乳液，7.5mL缓冲液，预热10min，后加入50mg固定化WGL1，于37℃、200rpm下反应1h后，用95%乙醇终止反应，然后用0.05M NaOH滴定产生的酸量。酶活大小定义为每克固定化酶1h内产生乙酸的μmol数。

实施例6

称取实施例4中经乙二胺活化后的聚乙二醇20g，加入小麦胚芽脂肪酶粗酶粉15g（含酶3.96g，摩尔量为9.42×10^-5mol），并加入20mL 磷酸缓冲溶液和22.80mg EDC（摩尔量为1.19×10^-4 mol，EDC与酶的摩尔比为1.3:1）和20.44mg NHS（摩尔量为9.42×10^-5mol，与酶的摩尔比为1:1），然后于旋转混合培养器中旋转吸附，转速为30rpm，吸附温度为25℃，吸附时间为24h。。吸附结束后，测定其蛋白吸附量和固定于聚乙二醇上小麦胚芽脂肪酶（固定化WGL2）的水解酶活，测定方法同实施例5。

上述实施例中测得到的硅胶对小麦胚芽脂肪酶的最大静态吸附量、以及固定化载体和固定化酶的参数分别如图1、表1和表2所示。

表1 固定化载体相关参数

载体	环氧基密度（μmol/g载体）	氨基密度（μmol/g载体）
			硅胶	100	95
聚乙二醇	80	70

表2 固定化酶相关参数

固定化酶	蛋白吸附量（mg/g载体）	水解酶活（U/g固定化酶）
			WGL固定于硅胶	121	1005
WGL固定于聚乙二醇	94	875

综上，本发明使用廉价的固定化材料，利用简单的几步化学修饰，巧妙地将小麦胚芽脂肪酶与载体共价连接。整个固定化过程反应条件温和，使用的试剂价格低廉、安全低毒，得到的固定化酶酶活较高，适合大规模推广应用。

在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以做出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。

Claims (4)

1.一种小麦胚芽脂肪酶的固定化方法，其特征在于步骤为：

（1）用环氧氯丙烷活化载体，活化时添加水溶性助溶剂，使载体带上环氧基；

所述载体为硅胶、琼脂糖、壳聚糖、葡聚糖、聚乙二醇中的一种或几种的混合物；载体在使用前需经浓盐酸浸泡后，用大量去离子水洗涤，抽滤干燥后待用；

所述水溶性助溶剂选用：二甲亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、二氧六环、乙腈、丙酮、正己烷中的一种或几种的混合物；环氧氯丙烷与载体的摩尔比为1-20:1；助溶剂加入量占总体系体积的5%-40%，环氧氯丙烷活化载体的温度为30-50℃，活化时间为1-8h； 

载体与小麦胚芽脂肪酶的质量比为1-100:1；

（2）用一种带有氨基的化合物将步骤（1）已活化载体上的环氧基打开，使载体带上连接基团，即使环氧基在碱性条件下发生水解，形成氨基；

所述带有氨基的化合物选用：氨水、1,2-二氨基乙烷、3,3^’-二氨基二丙烷、1,6-己二胺、6-氨基己酸中的一种；

氨基化合物与环氧基摩尔比为1-100:1，氨基化温度为30-50℃，控制反应pH为12-14，控制转速为100-200rpm；

（3）步骤（2）获得的载体通过连接物与小麦胚芽脂肪酶共价连接；

所述连接物为碳化二亚胺EDC、碳化二亚胺EDC与N-羟基琥珀酰亚胺NHS混合物、碳化二亚胺EDC与N-羟基硫代琥珀酰亚胺（Sulfo-NHS）混合物中的一种；

连接物与小麦胚芽脂肪酶的摩尔比为1-100:1，交联温度为4-25℃，交联的pH为5.0-9.0，交联时间为2-24h。

2.根据权利要求1所述的小麦胚芽脂肪酶的固定化方法，其特征在于步骤（1）中，选用的助溶剂为二甲亚砜，其效果最佳，助溶剂加入量占总体系体积的10%-15%；环氧氯丙烷活化载体温度为40℃；活化时间控制在2-4h。

3.根据权利要求1所述的小麦胚芽脂肪酶的固定化方法，其特征在于步骤（3）中，连接物与小麦胚芽脂肪酶的交联温度控制在4-10℃，pH控制在5-8。

4.一种固定化小麦胚芽脂肪酶，其特征在于，由权利要求1、2或3之一所述的小麦胚芽脂肪酶固定化方法制备而成。

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