CN103146675B - 以赤石脂为载体的固定化脂肪酶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以赤石脂为载体的固定化脂肪酶的制备方法，首先对赤石脂分别进行羟基化和硅烷化处理，然后将处理好的赤石脂载体加入到肪酶溶液中，经摇床振荡吸附固定后，用海藻酸盐凝胶对吸附了脂肪酶的赤石脂进行包埋，最后冷冻干燥得到赤石脂固定化脂肪酶。本方法采用的赤石脂具有原料易得，价格低廉的特点，同时也具有很好的物理吸附性和表面化学活性，经过改性以及包埋处理后，能显著提升载体的稳定性，制得的固定化酶酶活力回收率高，稳定性好，而且本发明的工艺简单，操作成本低，有望推动酶法制备生物柴油的工业化进程。
Description
技术领域
本发明涉及固定化脂肪酶技术领域，特别涉及以赤石脂为载体的固定化脂肪酶的制备方法。
背景技术
脂肪酶（lipase，EC3.1.1.3）是一类特殊的酰基水解酶，能够在油-水界面上催化酯水解、酯合成、酯交换等化学反应及高聚物合成和立体异构拆分等有机合成反应，并且在强烈脱水和有机体系中能保持高活性、高稳定性和高区域、立体选择性，因此被广泛应用于油脂水解、 油脂改性、皮革加工、造纸工业、洗涤剂工业、制药工业、食品加工、生物能源等方面有着很大的应用潜力，是目前被广泛研究的一种酶催化剂。然而，在实际使用过程中，游离酶即使在最适反应条件下也存在易失活、催化反应不稳定、与产物分离困难或分离成本高等缺点。另外，脂肪酶酶制剂一般是通过微生物发酵产生，或者是从动物、植物体内提取的，分离纯化成本高，导致酶的生产价格较高，加上游离酶很难重复利用，导致酶制剂的使用成本提高，从而限制了游离酶在工业生产中大规模的应用。
固定化酶指经物理或化学方法处理后，使酶变成不易随水流失即运动受限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。与游离酶相比，固定化酶的优点有：可多次使用，且酶的稳定性提高；反应完成后，固定化酶易与底物和产物分离，而且酶活力降低较少，这样就降低了生产成本；反应条件易于控制，有利于自动化生产。固定化酶通常所用的载体有活性炭、硅藻土、高岭土、大孔树脂、层状硅酸盐、改性硅胶、氧化铝、壳聚糖、纤维素、聚乙烯醇、聚乙烯丙烯胶、卡拉胶、海藻酸纳、磁性淀粉微球、分子筛以及复合二氧化硅等。
酶的固定化方法常用的是：吸附法、共价结合法、交联法和包埋法。在此基础上还出现了上述方法的结合法等。吸附法制备的固定化酶，酶的活性中心不易被破坏而且酶高级结构变化较少，能较好的保持酶的催化活力，但酶与载体之间的结合力较弱，酶容易从载体上脱落下来，而包埋法采用的凝胶聚合物的网格可以阻止酶的泄漏，同时能让基质渗入和产物扩散出来，通过吸附-包埋法制备固定化酶不仅可以有效保持酶活力，还能提升酶的稳定性。
酶固定化研究中，良好的载体是固定化酶成功的关键。所以在酶固定化领域，作为固定化载体的筛选和制备就成为了主要研究方向。
赤石脂为硅酸盐类矿物多水高岭石族多水高岭石，主要成分为水化硅酸铝，尚含相当多的氧化铁等物质，其组成如下：硅42.93%、铝36.58%、氧化铁及锰4.85%、镁及钙0.94%、水分14.75%。赤石脂与高岭土极其相似，具有很强吸附能力。
由于目前赤石脂作为一种传统中药材，主要在中医中使用，而利用其作为固定化载体国内外还没人研究，所以利用赤石脂作为固定化载体固定脂肪酶具有较大的理论和实践意义；而本方法研究的目的是开发赤石脂的应用领域，并可以增强赤石脂在工业、医学、环境保护等领域的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种以赤石脂为载体的固定化脂肪酶的制备方法，该方法工艺简单，操作成本低、稳定性好，具有较高催化活力以及酶活回收率。
为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决：
（1）赤石脂载体的羟基化处理：按每克赤石脂加入6-8ml盐酸的比例，将赤石脂浸渍于盐酸溶液中，并于35-40℃振荡反应过夜，然后用去离子水洗涤至中性，烘干；
（2）赤石脂载体的硅烷化处理：按每克羟基化处理的赤石脂添加2-4ml石油醚和0.02-0.04 mL硅烷化试剂的比例，在羟基化处理的赤石脂中加入石油醚和硅烷化试剂，充分混匀后，常温下放置于摇床中反应3-5 h，待反应结束后，过滤，滤渣分别用石油醚和无水乙醇洗涤3-5次，烘干；
（3）脂肪酶的固定化：按给酶量为40-90mg/g的比例（即每克赤石脂给酶量为40-90mg）向脂肪酶溶液中加入硅烷化赤石脂，密封，在20-40℃下振荡固定1-5h后，抽滤，滤渣用缓冲液洗涤直至没有蛋白洗脱下来，冷冻干燥后备用；
（4）赤石脂固定化酶的包埋：按每克赤石脂固定化酶加入10-20ml海藻酸盐溶液的比例，向其中加入质量百分比浓度为1-3%的海藻酸盐溶液，充分搅拌均匀。用5号针头的注射器将溶液逐滴打入到质量百分比浓度为1-2%的氯化钙溶液中， 并在4℃下固化1-3h，抽滤，充分洗涤，然后冷冻干燥，即得到固定化脂肪酶。
本发明步骤（1）中盐酸浓度为1-3mol/L。
本发明步骤（2）中硅烷化试剂为甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷、3-氨丙基三乙氧基硅烷、N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基三乙氧基硅烷中的一种。
本发明步骤（3）中脂肪酶溶液为脂肪酶和pH值为3-8的缓冲液混合制得的溶液，其中缓冲液是浓度为0.02-0.05mol/L的磷酸盐缓冲溶液或醋酸盐缓冲溶液。缓冲液按常规方法配制，磷酸盐缓冲溶液由磷酸氢二钠溶液和磷酸二氢钠溶液配制而成，醋酸盐缓冲溶液由醋酸溶液和醋酸钠溶液配制而成。
本发明步骤（4）中所述海藻酸盐溶液为海藻酸钠或者海藻酸钙溶液。
本发明中固定化脂肪酶的评价方法如下：
1、脂肪酶活力测定采用橄榄油乳化法。向锥形瓶中加入4ml橄榄油乳化液和5ml磷酸缓冲液，40℃水浴中预热5min，并设立空白组。加入固定化脂肪酶，混匀，40℃水浴震荡15min。反应结束后，各锥形瓶中加入15ml的95％乙醇终止反应。待测样品加入酚酞指示剂后，用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液准确滴定至粉红色。由滴定消耗氢氧化钠的量计算出游离酶及固定化酶的酶活。
以在pH为7的缓冲液、温度为40℃的条件下，1min水解产生1μmol脂肪酸所需的酶量定义为一个活力单位(U)，酶活力的计算公式如下：
式中：c--标准NaOH溶液浓度(mol/L)；
?V--样品和空白样样品消耗标准NaOH溶液的体积差(mL)；
t--反应时间(h)；
m--酶的用量(g)。
2、固定化酶酶活回收率计算公式如下：
本发明具有的优点和技术效果：
（1）脂肪酶催化活力高
赤石脂具有发达的孔状结构和较大的比表面积，能使脂肪酶分子很好的吸附在载体上，赤石脂经过改性剂修饰后形成的疏水性表面有利于脂肪酶蛋白活性中心构想的正确折叠，而且改性赤石脂表面丰富的活性基团通过疏水作用力、氢键以及范德华力等作用力与酶蛋白分子充分固定，显著增强酶活性中心的刚性，减少了反应过程中酶蛋白构象的变化，疏水性载体表面也有利于疏水性酯类底物与酶活性中心的充分接触和富集，减少了反应过程中的传质阻力，从而使酶催化活力得到显著增强；
（2）脂肪酶稳定性好
通过海藻酸钠包裹吸附了脂肪酶的赤石脂，能有效改善吸附过程中酶与载体结合力较弱，酶容易脱落的情况，而且形成的凝胶聚合物网格具有较好的机械强度，可防止酶体的机械损伤，有效的提升了固定化酶的稳定性；
（3）本发明采用的固定化酶制备方法，制备方法简单、条件温和，不需要特殊的设备，后处理工艺简单，适合于工业上大规模生产。
附图说明
图1为本发明中赤石脂固定化脂肪酶与游离脂肪酶的热稳定性比较图；
图2为本发明中赤石脂固定化脂肪酶的操作稳定性结果示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明，但本发明保护范围并不局限于此。
实施例1：以赤石脂为载体的固定化脂肪酶的制备方法，方法如下：
（1）赤石脂载体的羟基化处理：取10g赤石脂，将其浸渍于70ml 1mol/L的盐酸溶液中，并于35℃振荡反应过夜，然后用去离子水洗涤至中性，110℃烘干；
（2）赤石脂载体的硅烷化处理：取10g羟基化处理的赤石脂，向其中加入20ml石油醚和0.2ml甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷，充分混匀后，常温下放置于摇床中反应4h，反应结束后，过滤，滤渣分别用石油醚和无水乙醇洗涤3次，110℃烘干；
（3）脂肪酶的固定化：将800mg脂肪酶溶于200ml pH值为5、离子浓度为0.02mol/L的醋酸盐缓冲液中，然后向脂肪酶溶液中加入硅烷化赤石脂10g，密封，在30℃下振荡固定2h后，抽滤，滤渣用醋酸盐缓冲液洗涤直至没有蛋白洗脱下来，冷冻干燥后备用；
（4）赤石脂固定化酶的包埋：取10g赤石脂固定化酶，向其中加入150ml 质量百分比浓度为1%的海藻酸钠溶液，充分搅拌均匀，用5号针头的注射器将溶液逐滴打入到质量百分比浓度为1%的氯化钙溶液中， 并在4℃下固化2h，抽滤，充分洗涤，然后冷冻干燥，即得到固定化脂肪酶。
采用橄榄油乳化法测定酶活力为2808U/g，制得的固定化酶的酶活回收率为78%。
本实施例制得的固定化脂肪酶与游离脂肪酶的热稳定性比较实验如下：
分别取1g的游离脂肪酶和固定化脂肪酶，分别放在10℃，20℃，30℃，40℃，50℃，60℃保存1h，测定酶活的变化；结果如图1所示，固定化酶和游离酶对不同温度具有不同的耐受性，经过改性赤石脂吸附-海藻酸钠包埋固定化后，固定化脂肪酶显示出比游离脂肪酶更好的热稳定性，脂肪酶的活性中心被更好的保护，不容易被破坏，提高了酶的热稳定性。
本实施例制得的固定化脂肪酶的使用稳定性实验如下：
将赤石脂固定化脂肪酶重复用于橄榄油乳化液的水解反应，观察其相对酶活力随重复使用次数的变化；结果如图2所示，赤石脂固定化脂肪酶的操作稳定性良好，经10个批次的重复使用，其相对酶活仍可达初始值的60％以上。
实施例2：以赤石脂为载体的固定化脂肪酶的制备方法，方法如下：
（1）赤石脂载体的羟基化处理：取10g赤石脂，将其浸渍于80ml 1mol/L的盐酸溶液中，并于35℃振荡反应过夜，然后用去离子水洗涤至中性，110℃烘干；
（2）赤石脂载体的硅烷化处理：取10g羟基化处理的赤石脂，向其中加入20ml石油醚和0.4ml 3-氨丙基三乙氧基硅烷，充分混匀后，常温下放置于摇床中反应4h，反应结束后，过滤，滤渣分别用石油醚和无水乙醇洗涤4次，110℃烘干；
（3）脂肪酶的固定化：将300mg脂肪酶溶于200ml pH值为3、离子浓度为0.03mol/L的醋酸盐缓冲液中，然后向酶液中加入硅烷化赤石脂5g，密封，在30℃下振荡固定3h后，抽滤，滤渣用醋酸盐缓冲液洗涤直至没有蛋白洗脱下来，冷冻干燥后备用；
（4）赤石脂固定化酶的包埋：取5g赤石脂固定化酶，向其中加入75ml 质量百分比浓度为1%的海藻酸钙溶液，充分搅拌均匀，用5号针头的注射器将溶液逐滴打入到质量百分比浓度为1%的氯化钙溶液中， 并在4℃下固化3h，抽滤，充分洗涤，然后冷冻干燥，即得到固定化脂肪酶。
采用橄榄油乳化法测定酶活力为1809U/g，制得的固定化酶的酶活回收率为67%。
实施例3：以赤石脂为载体的固定化脂肪酶的制备方法，方法如下：
（1）赤石脂载体的羟基化处理：取10g赤石脂，将其浸渍于70ml 3mol/L的盐酸溶液中，并于40℃振荡反应过夜，然后用去离子水洗涤至中性，110℃烘干；
（2）赤石脂载体的硅烷化处理：取10g羟基化处理的赤石脂，向其中加入40ml石油醚和0.2ml甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷，充分混匀后，常温下放置于摇床中反应4h，反应结束后，过滤，滤渣分别用石油醚和无水乙醇洗涤3次，110℃烘干；
（3）脂肪酶的固定化：将800mg脂肪酶溶于200ml pH值为7、离子浓度为0.04mol/L的磷酸盐缓冲液中，然后向酶液中加入硅烷化赤石脂10g，密封，在40℃下振荡固定1h后，抽滤，滤渣用磷酸缓冲液洗涤直至没有蛋白洗脱下来，冷冻干燥后备用；
（4）赤石脂固定化酶的包埋：取10g赤石脂固定化酶，向其中加入100ml 质量百分比浓度为1%的海藻酸钠溶液，充分搅拌均匀，用5号针头的注射器将溶液逐滴打入到质量百分比浓度为2%的氯化钙溶液中， 并在4℃下固化1h，抽滤，充分洗涤，然后冷冻干燥，即得到固定化脂肪酶。
采用橄榄油乳化法测定酶活力为2232U/g，制得的固定化酶的酶活力回收率为62%。
实施例4：以赤石脂为载体的固定化脂肪酶的制备方法，方法如下：
（1）赤石脂载体的羟基化处理：取10g赤石脂，将其浸渍于60ml 2mol/L的盐酸溶液中，并于35℃振荡反应过夜，然后用去离子水洗涤至中性，110℃烘干；
（2）赤石脂载体的硅烷化处理：取10g羟基化处理的赤石脂，向其中加入30ml石油醚和0.3ml N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基三乙氧基硅烷，充分混匀后，常温下放置于摇床中反应4h，反应结束后，过滤，滤渣分别用石油醚和无水乙醇洗涤5次，110℃烘干；
（3）脂肪酶的固定化：将450mg脂肪酶溶于200ml pH值为8、离子浓度为0.05mol/L的磷酸盐缓冲液中，然后向脂肪酶溶液中加入硅烷化赤石脂5g，密封，在20℃下振荡固定5h后，抽滤，滤渣用磷酸缓冲液洗涤直至没有蛋白洗脱下来，冷冻干燥后备用；
（4）赤石脂固定化酶的包埋：取5g赤石脂固定化酶，向其中加入100ml 质量百分比浓度为3%的海藻酸钙溶液，充分搅拌均匀，用5号针头的注射器将溶液逐滴打入到质量百分比浓度为2%的氯化钙溶液中， 并在4℃下固化2h，抽滤，充分洗涤，然后冷冻干燥，即得到固定化脂肪酶。
采用橄榄油乳化法测定酶活力为2835U/g，制得的固定化酶的酶活力回收率为70%。
实施例5：以赤石脂为载体的固定化脂肪酶的制备方法，方法如下：
（1）赤石脂载体的羟基化处理：取10g赤石脂，将其浸渍于80ml 1mol/L的盐酸溶液中，并于40℃振荡反应过夜，然后用去离子水洗涤至中性，110℃烘干；
（2）赤石脂载体的硅烷化处理：取10g羟基化处理的赤石脂，向其中加入25ml石油醚和0.35ml 3-氨丙基三乙氧基硅烷，充分混匀后，常温下放置于摇床中反应5h，反应结束后，过滤，滤渣分别用石油醚和无水乙醇洗涤3次，110℃烘干；
（3）脂肪酶的固定化：将900mg脂肪酶溶于200ml pH值为5、离子浓度为0.04mol/L的醋酸盐缓冲液中，然后向酶液中加入硅烷化赤石脂15g，密封，在40℃下振荡固定2h后，抽滤，滤渣用醋酸盐缓冲液洗涤直至没有蛋白洗脱下来，冷冻干燥后备用；
（4）赤石脂固定化酶的包埋：取15g赤石脂固定化酶，向其中加入300ml 质量百分比浓度1.5%的海藻酸钠溶液，充分搅拌均匀，用5号针头的注射器将溶液逐滴打入到质量百分比浓度为1.5%的氯化钙溶液中， 并在4℃下固化3h，抽滤，充分洗涤，然后冷冻干燥，即得到固定化脂肪酶。
采用橄榄油乳化法测定酶活力为2025U/g，制得的固定化酶的酶活力回收率为75%。
实施例6：以赤石脂为载体的固定化脂肪酶的制备方法，方法如下：
（1）赤石脂载体的羟基化处理：取10g赤石脂，将其浸渍于65ml 2.5mol/L的盐酸溶液中，并于38℃振荡反应过夜，然后用去离子水洗涤至中性，110℃烘干；
（2）赤石脂载体的硅烷化处理：取10g羟基化处理的赤石脂，向其中加入35ml石油醚和0.25ml甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷，充分混匀后，常温下放置于摇床中反应3h，反应结束后，过滤，滤渣分别用石油醚和无水乙醇洗涤3次，110℃烘干；
（3）脂肪酶的固定化：将400mg脂肪酶溶于200ml pH值为6、离子浓度为0.03mol/L的磷酸盐缓冲液中，然后向酶液中加入硅烷化赤石脂10g，密封，在35℃下振荡固定4h后，抽滤，滤渣用磷酸缓冲液洗涤直至没有蛋白洗脱下来，冷冻干燥后备用；
（4）赤石脂固定化酶的包埋：取10g赤石脂固定化酶，向其中加入180ml 质量百分比浓度2%的海藻酸钠溶液，充分搅拌均匀，用5号针头的注射器将溶液逐滴打入到质量百分比浓度为2%的氯化钙溶液中， 并在4℃下固化2.5h，抽滤，充分洗涤，然后冷冻干燥，即得到固定化脂肪酶。
采用橄榄油乳化法测定酶活力为1296U/g，制得的固定化酶的酶活力回收率为72%。
Claims (2)
1.一种以赤石脂为载体的固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）赤石脂载体的羟基化处理：按每克赤石脂加入6-8ml盐酸的比例，将赤石脂浸渍于盐酸溶液中，并于35-40℃振荡反应过夜，然后用去离子水洗涤至中性，烘干；
（2）赤石脂载体的硅烷化处理：按每克羟基化处理的赤石脂添加2-4ml石油醚和0.02-0.04 mL硅烷化试剂的比例，在羟基化处理的赤石脂中加入石油醚和硅烷化试剂，充分混匀后，常温下放置于摇床中反应3-5h，待反应结束后，过滤，滤渣分别用石油醚和无水乙醇洗涤3-5次，烘干；
（3）脂肪酶的固定化：按给酶量为40-90mg/g的比例向脂肪酶溶液中加入硅烷化赤石脂，密封，在20-40℃下振荡固定1-5h后，抽滤，滤渣用缓冲液洗涤直至没有蛋白洗脱下来，冷冻干燥后备用；
（4）赤石脂固定化酶的包埋：按每克赤石脂固定化酶添加10-20ml海藻酸盐溶液的比例，在赤石脂固定化酶中加入质量百分比浓度为1-3%的海藻酸盐溶液，充分搅拌均匀，用5号针头的注射器将溶液逐滴打入到质量百分比浓度为1-2%的氯化钙溶液中， 并在4℃下固化1-3h，抽滤，充分洗涤，然后冷冻干燥，即得到固定化脂肪酶；
其中所述盐酸浓度为1-3mol/L；
所述硅烷化试剂为甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷、3-氨丙基三乙氧基硅烷、N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基三乙氧基硅烷中的一种；
所述海藻酸盐溶液为海藻酸钠溶液。
2.根据权利要求1所述以赤石脂为载体的固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于：脂肪酶溶液为脂肪酶和pH值为3-8的缓冲液混合制得的溶液，其中缓冲液是浓度为0.02-0.05mol/L的磷酸盐缓冲溶液或醋酸盐缓冲溶液。
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