CN102277348B - 一种用高碘酸钠氧化法固定化磷脂酶a1的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是针对自然酶混溶在反应体系中不仅不易分离回收，而且酶的制取一般较困难，且成本高昂，难以反复或连续使用等问题，而提出的用高碘酸钠氧化法固定化磷脂酶A1的方法，包括高碘酸钠的氧化活化和磷脂酶A1的固定化步骤。本发明中，高碘酸钠具有将表面具有大量羟基的滤纸表面羟基氧化成醛基的作用，根据醛基含量越高，与酶的交联率越大的特性固定化磷脂酶A1，提高了酶在反应体系中的活性和稳定性，调节和控制酶的活性与选择性，从而有利于酶的回收，最终得到的固定化酶活为4.8U/cm2，所得到的固定化酶的活力较常规固定化方法有所提高。
Description
技术领域：
本发明涉及一种固定化磷脂酶A1的方法。
背景技术：
磷脂酶A1是一类可以水解磷脂Sn-1位酯键获得2-酰基-溶血磷脂和脂肪酸的酶，广泛存在于动植物和微生物中。磷脂酶A1不仅具有脂肪酶活性而且还同时具有磷脂酶活性，但是在一定的反应体系中，会优先表现出一种特定的酶活，价格低廉的磷脂酶A1在工业上具有巨大的应用价值。固定化酶技术是通过物理和/或化学作用将水溶性的游离酶分子束缚在一定的区间内(通常在非水溶性载体上)，用简单的分离方法(如离心沉降)即可回收并反复使用，这样改良的酶即称为固定化酶。固定化酶的制备、结构与性质及固定化酶反应器的研制、生产与各有关应用技术，是固定化酶体系的主要内容。固定化酶技术现在已经成为酶工程领域中最为活跃的研究方向之一，因此对固定化酶的研究也就越来越多。常用的固定化方法主要有四种即包埋法、交联法、吸附法和共价法。目前，国内外关于磷脂酶A1的固定化研究很少，且相关的应用研究主要集中在酶法脱胶方面。
近年来由于直接利用自然酶进行工业化生产一般是不可行的，自然酶混溶在反应体系中不仅不易分离回收，而且酶的制取一般较困难，且成本高昂，难以反复或连续使用，为了解决上述问题，固定化酶技术越来越受到人们的关注。
酶可以通过吸附法固定在膜上，但吸附法固定的酶不牢固，易流失。化学交联法是通过共价键达到载体与酶结合的目的，因而固定的酶比较牢固。由于纤维素滤纸表面含有大量的羟基，容易改性而与酶共价结合，而采用高碘酸钠进行氧化可使纤维素滤纸表面的羟基氧化成醛基，使固定化后的酶稳定性及重复使用性增强。因此，纤维素滤纸是固定化酶的良好载体，被广泛地应用于固定化酶和作为色谱支持物来分离和纯化敏感的生物活性物质。
发明内容：
本发明是针对自然酶混溶在反应体系中不仅不易分离回收，而且酶的制取一般较困难，且成本高昂，难以反复或连续使用等问题，而提出的用高碘酸钠氧化法来进行固定化磷脂酶A1的方法。
所述目的是通过如下方案实现的：
一种用高碘酸钠氧化法固定化磷脂酶A1的方法，取一张含有羟基的膜悬浮于0.01～0.3mol/L的高碘酸钠溶液中，室温下置于摇床中活化30～100min，取出立即用去离子水洗至中性，吸干水分；然后将含有羟基的膜置于平皿中，在5～35℃条件下，分别与0.01～0.09g/mL的酶液和pH为5.8的磷酸盐缓冲液，加入体积浓度0.05～0.6％戊二醛进行交联反应1～6h，交联反应结束后将所述含有羟基的膜悬浮于体积浓度为1％的氢硼化钠溶液中，4℃反应20～40min，然后用HAI溶液、KCl溶液和水分别洗涤三次，晾干剪碎即得固定化磷脂酶A1。
固定化条件优选为：高碘酸钠浓度为0.01～0.09mol/L，活化时间31～49min，温度6～10℃，酶液浓度0.01～0.03g/mL，交联时间1～2h，交联剂戊二醛浓度0.05～0.15％。
固定化条件优选为：高碘酸钠浓度为0.1～0.19mol/L，活化时间50～69min，温度11～25℃，酶液浓度0.04～0.05g/mL，交联时间3～4h，交联剂戊二醛浓度0.16～0.28％。
固定化条件优选为：高碘酸钠浓度为0.2～0.29mol/L，活化时间70～99min，温度26～34℃，酶液浓度0.06～0.08g/mL，交联时间5～6h，交联剂戊二醛浓度0.29～0.58％。
固定化条件优选为：高碘酸钠浓度为0.15mol/L，活化80min，与浓度为0.05g/ml的酶液、pH为5.8的磷酸盐缓冲溶液于戊二醛体积浓度0.4％，温度4℃下，交联4h时。
利用高碘酸钠氧化法固定化磷脂酶A1中，高碘酸钠具有将表面具有大量羟基的滤纸表面羟基氧化成醛基的作用，根据醛基含量越高，与酶的交联率越大的特性固定化磷脂酶A1，提高了酶在反应体系中的活性和稳定性，调节和控制酶的活性与选择性，从而有利于酶的回收，最终得到的固定化酶活为4.8U/cm2，所得到的固定化酶的活力较常规固定化方法有所提高。本发明所述方法对自然酶混溶在反应体系中分离回收容易，酶的制取容易，成本低廉，可反复或连续使用。
附图说明：
图1是用本发明方法固定化磷脂酶A1与游离酶在不同温度下酶活力曲线图。
图2是用本发明方法固定化磷脂酶A1与游离酶在不同PH值下酶活力曲线图。
图3是重复使用次数对用本发明方法固定化磷脂酶A1相对酶活力的影响曲线图。
图4是高碘酸钠氧化后的纤维素滤纸膜的SEM图。
图5是用本发明方法，高碘酸钠氧化后的固定化酶酶表面结构的SEM图。
具体实施方式：
下面结合附图详细阐述本发明优选的实施方式。
实施例一：
一种用高碘酸钠氧化法固定化磷脂酶A1的方法，取一张纤维素滤纸膜悬浮于10ml浓度为0.01～0.3mol/L的高碘酸钠溶液中，室温下置于摇床中摇动30～100min，取出立即用去离子水洗至中性，吸干水分；然后取1cm2纤维素滤纸膜置于平皿中，在5～35℃条件下，分别与0.01～0.09g/mL的酶液和pH为5.8的磷酸盐缓冲液，加入体积浓度0.05～0.6％戊二醛进行交联反应1～6h，交联反应结束后将所述纤维素滤纸膜悬浮于10ml体积浓度为1％的氢硼化钠溶液中，4℃反应20～40min，然后用0.1mol的HAI溶液、2mol的KCl溶液和水分别洗涤三次，晾干剪碎即得固定化磷脂酶A1。
用所述方法得到的固定化磷脂酶A1与游离酶进行对比，分别在不同温度条件下测定酶活，如图1所示。由图1可知，固定化酶的最适反应温度为35℃，而自由酶的最适反应温度为35℃，与自由酶相比固定化酶膜的最适反应温度没有明显变化，并且它在50℃时所表现的酶活力还是比较稳定的，说明固定化酶最适温度范围变宽。因此，固定化酶酶活变化较游离酶小，固定化酶比游离酶稳定，不易失活。
选择不同的反应pH，用本发明所述方法进行固定化磷脂酶A1，测定固定化磷脂酶活力并与游离磷脂酶进行比较，如图2所示。由图2可知，游离磷脂酶的最适pH值为8.0，固定化磷脂酶的最适pH值为9.0，向碱性偏移1.0。固定化酶的最适pH为9.0，显示固定化酶比游离酶较耐碱，且固定化后的磷脂酶的pH变化范围不大。
以无油磷脂为溶质，以缓冲液溶解聚乙烯醇为溶剂。无油磷脂占磷酸盐缓冲液溶解聚乙烯醇的比重为5％。以所述粉末磷脂为底物，对用本发明所述方法固定化磷脂酶A1进行酶解反应，分别在相同条件下连续进行7批次操作，测定其酶活力，以第一批次酶活力作为100％计算相对活力，结果如图3示。由图3可知，固定化酶具有良好的操作稳定性，在连续使用7个批次后其相对活力仍保持65％以上。
采用本发明所述固定化条件将磷脂酶A1固定在纤维素滤纸膜上，用SEM对固定化后的磷脂酶A1进行扫描，如图4和图5所示。由图像对比可知：图4中经氧化后纤维素滤纸膜松散的呈纤维状，因此有较大的空间来负载酶。图5是将磷脂酶A1固定在纤维素滤纸膜表面制成的固定化酶膜，从图中可看出用纤维素滤纸膜来固定磷脂酶，膜表面负载了部分酶，但由于氧化后的纤维素滤纸膜的羟基被氧化成醛基，所以酶被很好的固定在膜上。因此，进一步验证了将酶固定在膜上更利于酶稳定性。
实施例二：
本实施例与实施例一的区别在于，固定化条件为：高碘酸钠浓度为0.01～0.09mol/L，活化时间31～49min，温度6～10℃，酶液浓度0.01～0.03g/mL，交联时间1～2h，交联剂戊二醛浓度0.05～0.15％。
实施例三：
本实施例与实施例一的区别在于，固定化条件为：高碘酸钠浓度为0.1～0.19mol/L，活化时间50～69min，温度11～25℃，酶液浓度0.04～0.05g/mL，交联时间3～4h，交联剂戊二醛浓度0.16～0.28％。
实施例四：
本实施例与实施例一的区别在于，固定化条件为：高碘酸钠浓度为0.2～0.29mol/L，活化时间70～99min，温度26～34℃，酶液浓度0.06～0.08g/mL，交联时间5～6h，交联剂戊二醛浓度0.29～0.58％。
实施例五：
本实施例与实施例一的区别在于，固定化条件为，纤维素滤纸膜在高碘酸钠浓度为0.15mol/L，活化80min，与浓度为0.05g/ml的酶的pH为5.8的磷酸盐缓冲溶液于戊二醛浓度0.4％，温度4℃下，交联4h时，获得的固定化磷脂酶A1酶活最高为4.8U/cm2。
含有羟基的膜除了本发明所述纤维素滤纸膜之外，醋酸纤维素聚丙烯复合膜同样可以实现本发明所述目的。但本发明不限于所列举的含有羟基的膜，其它现有技术中含有羟基的膜，只要采本发明所述方法能够实现所述目的，都在本专利的保护范围之内。
上述实施方式只是对本专利的示例性说明而并不限定它的保护范围，本领域人员还可以对其进行局部改变，只要没有超出本专利的精神实质，都视为对本专利的等同替换，都在本专利的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种用高碘酸钠氧化法固定化磷脂酶A1的方法，其特征在于：
取一张含有羟基的膜悬浮于0.15mol/L的高碘酸钠溶液中，室温下置于摇床中活化80min，取出立即用去离子水洗至中性，吸干水分；然后将含有羟基的膜置于平皿中，与浓度为0.05g/ml的酶液、pH为5.8的磷酸盐缓冲溶液于戊二醛体积浓度0.4%，温度4℃下，交联4h，交联反应结束后将所述含有羟基的膜悬浮于体积浓度为1%的氢硼化钠溶液中，4℃反应20～40 min，然后用HAI溶液、KCl溶液和水分别洗涤三次，晾干剪碎即得固定化磷脂酶A1。
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