CN102363776A - 一种用高碘酸钠氧化法固定化脂肪酶的方法 - Google Patents
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Abstract
一种用高碘酸钠氧化法固定化脂肪酶的方法。本发明提供一种以醋酸纤维素/聚丙烯复合膜为载体，采用氧化剂高碘酸钠氧化法和交联反应相结合的固定化方法，用该氧化后的醋酸纤维素/聚丙烯复合膜固定化脂肪酶。研究了高碘酸钠浓度、活化时间、酶液浓度、交联时间和交联剂浓度等不同固定化条件对脂肪酶固定化后酶活力的影响，通过响应面优化法，进一步优化了经高碘酸钠氧化后的醋酸纤维素/聚丙烯复合膜固定化脂肪酶的优势。采用先对醋酸纤维素/聚丙烯复合膜进行氧化活化，再进一步进行脂肪酶的固定化，使脂肪酶与载体结合的更稳定，不易溶脱，而利于固定化酶的回收利用。最终得到的固定化酶活为0.52U/cm2。
Description
技术领域：
本发明涉及一种固定化脂肪酶的方法。
背景技术：
脂肪酶是一种广泛分布于动物、植物和微生物中的酶，能够进行可逆的甘油酯键水解或合成。在一定的条件下，脂肪酶可以主要催化合成反应，即可以用来合成生物柴油。无论在小规模的实验还是工业规模的酯合成中，作为催化剂，脂肪酶已经得到成功应用。固定化酶技术，就是将酶结合在载体上，或将其限制在有限空间内的一类技术，酶仍能进行相应催化活性，并方便回收利用。一般将酶的固定化技术分为酶与载体的结合和包埋两大类。其中结合法包括物理吸附、离子吸附、共价键结合及交联法等。
固定化方法是否成功很大方面取决于选择合适的载体。固定化载体的选择主要考虑是否拥有固定化所需的最佳性能，如机械强度、稳定性、亲水疏水性、孔隙度、反应性、再生性及经济性等方面。常用的载体主要有微晶纤维素、硅藻土、硅胶等。而以膜为载体，不仅结合了膜的分离功能，还结合了载体功能和分隔功能，具有其他载体不可比拟的优点。
发明内容
本发明是针对自然酶混溶在反应体系中不仅不易分离回收，而且酶的制取一般较困难，且成本高昂，难以反复或连续使用等问题，而提出的用高碘酸钠氧化法来进行固定化脂肪酶的方法。用高碘酸钠氧化法来进行固定化脂肪酶的方法通过以下步骤实现：一、高碘酸钠的氧化活化。二、脂肪酶的固定化。三、酶活力的测定。四、固定化条件的优化。五、响应面法优化固定化条件。六、固定化酶酶学性质的讨论。
利用高碘酸钠氧化法固定化脂肪酶中，高碘酸钠具有将滤纸表面的羟基氧化成醛基的作用，根据醛基含量越高，与酶的交联率越大的特性固定化脂肪酶，提高了酶在反应体系中的活性和稳定性，调节和控制酶的活性与选择性，从而有利于酶的回收，最终得到的固定化酶活为0.52U/cm2，所得到的固定化酶的活力较常规固定化方法有所提高。
具体实施方式
具体实施方式一：用高碘酸钠氧化法固定化脂肪酶的方法通过以下步骤实现：一、高碘酸钠的氧化活化：取一张膜悬浮于10ml不同浓度的高碘酸钠溶液中，室温下置于摇床中摇动一定时间，取出立即用去离子水洗至中性，吸干水分；二、脂肪酶的固定化：取若干份1cm2的纤维素膜于平皿中，分别与一定量的酶液和pH为8.0的磷酸盐缓冲液，加入一定量戊二醛于28℃进行交联反应，交联反应结束后悬浮于10ml 1％氢硼化钠溶液中于4℃反应30min，然后用0.1mol的HAI溶液、2mol的Kcl溶液和水分别洗涤三次，取出测定酶活；三、酶活力的测定：橄榄油乳化法，测定固定化酶酶活时将已固定化酶的滤纸剪碎，平均分成两份，其中一份做空白；四、固定化条件的优化：分别在高碘酸钠浓度为0.05～0.30mol/L，活化时间10～100min，温度5～35℃，酶液浓度0.01～0.25g/10mL，交联时间1～6h，交联剂浓度0.05～0.6％的条件下，通过测定固定化酶活力得到最佳的固定化条件。五、通过响应面寻优得到最佳的固定化条件，在最佳的固定化条件下测得酶活力为最优0.5U/cm2六、固定化酶酶学性质的讨论：在温度15～55℃，PH4～10范围内，通过测定固定化酶和游离酶的活力，得出固定化酶的最适温度，最适PH值。并通过比较确定固定化酶较游离酶稳定性好。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点在于步骤四中将醋酸纤维素/聚丙烯复合膜在高碘酸钠浓度为0.01～0.25mol/L，活化时间10～100min的条件下进行脂肪酶的交联固定。其它步骤与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一的不同点在于步骤四中将醋酸纤维素/聚丙烯复合膜在高碘酸钠浓度为0.01～0.25mol/L，活化时间30～90min的条件下进行脂肪酶的交联固定。其它步骤与具体实施方式一相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一的不同点在于步骤四中将醋酸纤维素/聚丙烯复合膜在高碘酸钠浓度为0.01～0.25mol/L，活化时间30～90min，酶液在温度15～30℃的条件下，进行脂肪酶的交联固定，其它步骤与具体实施方式一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一的不同点在于步骤四中将醋酸纤维素/聚丙烯复合膜在高碘酸钠浓度为0.01～0.25mol/L，活化时间30～90min，酶液在温度15～30℃的条件下，添加浓度为0.01～0.2g/10mL的酶液。其它步骤与具体实施方式一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一的不同点在于步骤四中将醋酸纤维素/聚丙烯复合膜在高碘酸钠浓度为0.01～0.25mol/L，活化时间30～90min，酶液在温度15～30℃，添加浓度为0.01～0.2g/10mL的酶液，与戊二醛交联剂浓度0.1～0.5％的条件下交联固定，其它步骤与具体实施方式一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一的不同点在于步骤四中将醋酸纤维素/聚丙烯复合膜在高碘酸钠浓度为0.01～0.25mol/L，活化时间30～90min，酶液在温度15～30℃，添加浓度为0.01～0.2g/10mL的酶液，与戊二醛交联剂浓度0.1～0.5％的条件下交联固定2～5h。其它步骤与具体实施方式一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一的不同点在于步骤五中将由单因素确定的结果再进一步优化得到固定化条件，优化的固定化条件为交联时间2～4h，交联剂浓度0.2～0.4％，酶液浓度0.1～0.2g/10mL，在最优状态下酶活力最高0.52U/cm2。其它步骤与具体实施方式一相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一的不同点在于步骤六中将固定化酶与游离酶在温度25～45℃条件下，比较固定化酶与游离酶的最适温度。其它步骤与具体实施方式一相同。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一的不同点在于步骤六中将固定化酶与游离酶在PH7～9.5条件下，比较固定化酶与游离酶的最适PH值。其它步骤与具体实施方式一相同。
Claims (10)
1.一种用高碘酸钠氧化法固定化脂肪酶的方法，其特征在于用高碘酸钠氧化法固定化脂肪酶的方法通过以下步骤实现：一、高碘酸钠的氧化活化：取一张膜悬浮于10ml不同浓度的高碘酸钠溶液中，室温下置于摇床中摇动一定时间，取出立即用去离子水洗至中性，吸干水分；二、脂肪酶的固定化：取若干份1cm2的纤维素膜于平皿中，分别与一定量的酶液和pH为5.8的磷酸盐缓冲液，加入一定量戊二醛于28℃进行交联反应，交联反应结束后悬浮于10ml 1％氢硼化钠溶液中于4℃反应30min，然后用0.1mol的HAI溶液、2mol的Kcl溶液和水分别洗涤三次，取出测定酶活；三、酶活力的测定：测定固定化酶酶活时将已固定化酶的滤纸剪碎，平均分成两份，其中一份做空白；四、固定化条件的优化：分别在高碘酸钠浓度为0.01～0.3mol/L，活化时间30～100min，温度5～35℃，酶液浓度0.01～0.2g/10mL，交联时间1～6h，交联剂浓度0.05～0.6％的条件下，通过测定固定化酶活力得到最佳的固定化条件。五、通过响应面寻优得到最佳的固定化条件，在最佳的固定化条件下测得酶活力为最优0.5U/cm2。六、固定化酶酶学性质的讨论：在温度15～55℃，PH5.5～9.5范围内，通过测定固定化酶和游离酶的活力，得出固定化酶的最适温度，最适PH值。并通过比较确定固定化酶较游离酶稳定性好。
2.根据权利要求1所述的用高碘酸钠氧化法固定化脂肪酶，其特征在于步骤四中将醋酸纤维素/聚丙烯复合膜与酶液在高碘酸钠浓度为0.02～0.3mol/L，活化时间30～100min的条件下进行脂肪酶的固定。
3.根据权利要求1所述的用高碘酸钠氧化法固定化脂肪酶，其特征在于步骤四中将醋酸纤维素/聚丙烯复合膜与酶液在高碘酸钠浓度为0.01～0.3mol/L，活化时间50～90min的条件下，进行脂肪酶的固定。
4.根据权利要求1所述的用高碘酸钠氧化法固定化脂肪酶，其特征在于步 骤四中将醋酸纤维素/聚丙烯复合膜与酶液在高碘酸钠浓度为0.01～0.3mol/L，活化时间30～100min，温度为20～30℃的条件下，进行脂肪酶的固定。
5.根据权利要求1所述的用高碘酸钠氧化法固定化脂肪酶，其特征在于步骤四中将醋酸纤维素/聚丙烯复合膜与酶液在高碘酸钠浓度为0.01～0.3mol/L，活化时间30～100min，温度为5～35℃，添加酶液浓度0.03～0.2g/10mL的条件下，进行脂肪酶的固定。
6.根据权利要求1所述的用高碘酸钠氧化法固定化脂肪酶，其特征在于步骤四中将醋酸纤维素/聚丙烯复合膜与酶液在高碘酸钠浓度为0.01～0.3mol/L，活化时间30～100min，温度为5～35℃，酶液浓度0.03～0.2g/10mL与交联剂浓度为0.2～0.5％的条件下，进行脂肪酶的固定。
7.根据权利要求1所述的用高碘酸钠氧化法固定化脂肪酶，其特征在于步骤四中将醋酸纤维素/聚丙烯复合膜与酶液在高碘酸钠浓度为0.01～0.3mol/L，活化时间30～100min，温度为5～35℃，酶液浓度0.03～0.2g/10mL与交联剂浓度为0.2～0.5％的条件下交联2～5h，进行脂肪酶的固定。
8.根据权利要求1所述的用高碘酸钠氧化法固定化脂肪酶，其特征在于步骤五中将固定化条件进行进一步优化，优化结果为交联时间2～4h，交联剂浓度0.2～0.4％，酶液浓度0.1～0.2g/10mL，用优化结果进行脂肪酶的固定。
9.根据权利要求1所述的用高碘酸钠氧化法固定化脂肪酶，其特征在于步骤六中将固定化酶与游离酶在温度25～45℃条件下，比较固定化酶与游离酶的最适温度。
10.根据权利要求1所述的用高碘酸钠氧化法固定化脂肪酶，其特征在于步骤六中固定化酶与游离酶在PH7～9.5条件下，比较固定化酶与游离酶的最适PH值。
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