CN102732500B - 氧化双醛纤维素固定化脲酶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种氧化双醛纤维素固定化脲酶的制备方法，经过如下两个步骤制成：一是氧化双醛纤维素的制备，其中包括纤维素的活化、水热合成制备氧化双醛纤维素两个子步骤。二是固定化脲酶的制备，其中包括分散相的制备、脲酶的固定化和洗涤干燥三个子步骤。本方法利用自然界广泛存在的纤维素为基质材料，通过水热合成制备得到氧化双醛纤维素载体，利用希夫碱(Schiff base)反应将脲酶固定在此载体上，得到氧化纤维素固定化的脲酶。本发明制备的氧化双醛纤维素醛基含量较高，为脲酶结合提供更多活性位点，固定化脲酶的方法简单易于操作，且载体材料来源广泛，具有广泛的应用前景和实用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种酶学技术，具体是以氧化双醛纤维素为载体固定化脲酶的制备方法。
背景技术
脲酶在污水处理、酿酒以及医疗领域都具有很高的潜在价值。但是由于脲酶价格昂贵，溶液中的脲酶容易变性失活，反应后的脲酶难以回收，无法重复利用，极大地限制了脲酶的应用。为了提高脲酶在溶液中的稳定性，重复使用性和贮存稳定性，采用适当的方法将脲酶与载体键联连接固定从而克服游离态脲酶的缺点，是一种可行的技术途径。
目前脲酶的固定化载体材料选择比较广泛，主要分为无机材料和有机材料，其中有机材料包括聚合物(如改性聚丙烯腈、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯醇)、藻朊酸盐和壳聚糖及其衍生物。纤维素、壳聚糖、淀粉等天然多糖类载体在自然界中大量存在，容易获得，价格便宜，载体性能比较稳定，被广泛应用于生活中的各个领域。但是由于此类载体缺少能与酶结合的功能基团，只能以吸附方法将酶固定在载体上，得到的固定化脲酶重复使用性能比较弱。
本发明以纤维素为原料，经化学改性，制备的氧化双醛纤维素具有良好的生物相容性、生物可降解性、环境友好和无毒等特点，并具有纤维素不具有的活性功能基团，反应活性更强，是一种优良的载体材料。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种氧化双醛纤维素固定化脲酶的制备方法。
解决上述技术问题所采用的技术方案是：
本氧化双醛纤维素固定化脲酶的制备方法是按如下步骤进行：
一、氧化双醛纤维素的制备：
(1)纤维素的活化：将微晶纤维素或棉纤维置于质量比为12％-20％的NaOH水溶液中润涨24h，用蒸馏水洗至中性，抽滤后将得到的固体置于30-40℃烘箱中干燥3h，研磨成粉末备用；
(2)纤维素的氧化：将活化后的微晶纤维素或棉纤维与1∶1-1∶4的重量比的高碘酸或高碘酸钠置于水热合成反应釜中，加入蒸馏水，填充系数为0.6-0.9，将此密闭的水热合成反应釜置于110-130℃烘箱中反应4-10h；反应结束后，滤纸过滤得到固体，并用蒸馏水反复冲洗该固体4-5次，抽滤后将固体置于30-40℃烘箱干燥3h后研磨成粉备用；将干燥得到的产物再进行一次相同方法的选择性氧化反应，即得氧化双醛纤维素，再将氧化双醛纤维素置于30-40℃烘箱中干燥3h后放入4℃冰箱中保存；
二、固定化脲酶的制备：
(1)分散相的制备：取步骤一(2)得到的氧化双醛纤维素载体，加入pH4-10的磷酸盐缓冲液制备分散相；控制氧化双醛纤维素在此分散相中的质量比为3％-5％；
(2)脲酶的固定：向分散相中加入脲酶溶液，其中脲酶溶液浓度为0.1-20mg/mL，控制反应温度2-8℃，磁力搅拌2-4h；
(3)洗涤干燥：用纱布过滤得到固体，将此固体用去离子水洗涤4-5次，除去未固定的游离脲酶，真空冷冻干燥得到固定化的脲酶。
本发明的有益效果是：本发明采用水热合成反应、利用密闭的压力容器，以水为溶剂，氧化反应更充分，比传统的方法获得的氧化纤维素，其醛基含量较高，能为脲酶与载体的连接提供更多的活性结合位点。本方法的载体性能稳定、酶固定化的条件温和，方法简便。
具体实施方式
本发明结合实施例作进一步详述：
脲酶是一种专一分解尿素的酶类，又名酰胺水解酶。在水存在的条件下，将尿素分解为氨和二氧化碳，是一般尿素分解反应(无脲酶催化)速度的1014倍。因此脲酶在污水处理、酿酒以及医疗领域都具有很高的潜在价值。但是由于脲酶价格昂贵，溶液中的脲酶容易变性失活，反应后的脲酶难以回收，无法重复利用，极大的限制了脲酶的应用。为了提高脲酶在溶液中的稳定性，重复使用性和贮存稳定性，可采用适当的方法将脲酶与合适的载体键联连接固定从而很好的克服游离脲酶的缺点。脲酶的固定化载体材料选择比较广泛，纤维素、壳聚糖、淀粉等天然多糖类载体；聚乙烯，聚丙烯腈等聚合物载体；以及蚕丝素蛋白、磁性微球等其他新型载体均可作为脲酶的固载材料。优良的固定化载体材料应有化学性质稳定、亲水性、具有一定刚性、机械稳定性、较大的表面积及抗微生物浸染等特点。
纤维素是多羟基天然高聚物，部分羟基在纤维素分子内和分子间形成牢固的氢键，使其在自然界中几乎找不到单组分溶剂，故纤维素材料具有稳定性好的特点；同时纤维素分子结构上还剩余的羟基容易与任何活性物质上的极性官能基团形成氢键，使纤维素具有亲水性和对极性物质有强的吸附能力。又因其原料丰富，价格便宜，无毒性，易被生物降解，对环境无污染等优点使其具有潜在的广泛用途。近年来用纤维素作为基质材料制备各种固定化酶多有报道。然而纤维素作为一种天然高分子化合物，在性能上存在某些缺点，如不耐化学腐蚀，强度有限，溶解性差，缺乏活性强的官能团等等。
氧化纤维素具有良好的生物相容性、生物可降解性、环境友好和无毒等特点，并具有纤维素不具有的活性功能团，是一种优良的载体材料。传统方法制备氧化纤维素，由于反应是在异相中进行，反应条件较温和，所制得的氧化纤维素醛基含量较低。本研究中采用的水热合成反应利用密闭压力容器，以水为溶剂，在高温高压的条件下氧化反应能更好地进行，与传统方法得到的氧化纤维素相比，醛基含量有明显提高。
本氧化纤维素固定化脲酶的制备方法是按如下步骤进行：
一、氧化双醛纤维素的制备：
(1)纤维素的活化：将微晶纤维素或棉纤维置于质量比为12％-20％的NaOH水溶液中润涨24h，用蒸馏水洗至中性，抽滤后将得到的固体置于30-40℃烘箱中干燥3h，研磨成粉末备用；
(2)纤维素的氧化：将活化后的微晶纤维素或棉纤维与1∶1-1∶4的重量比的高碘酸或高碘酸钠置于水热合成反应釜中，加入蒸馏水，填充系数为0.6-0.9，将此密闭的水热合成反应釜置于110-130℃烘箱中保存4-10h；反应结束后，滤纸过滤得到固体，并用蒸馏水反复冲洗该固体4-5次，抽滤后将固体置于30-40℃烘箱干燥3h后研磨成粉备用；将干燥得到的产物再进行一次相同方法的选择性氧化反应，即得氧化双醛纤维素，再将氧化双醛纤维素置于30-40℃烘箱中干燥3h后放入4℃冰箱中保存；
二、固定化脲酶的制备：
(1)分散相的制备：取步骤一(2)得到的氧化双醛纤维素载体，加入pH4-10的磷酸盐缓冲液制备分散相；控制氧化双醛纤维素在此分散相中的质量比为3％-5％；
(2)脲酶的固定：向分散相中加入脲酶溶液，其中脲酶溶液浓度为0.1-20mg/mL，控制反应温度2-8℃，磁力搅拌2-4h；
(3)洗涤干燥：用纱布过滤得到固体，将此固体用去离子水洗涤4-5次，除去未固定的游离脲酶，真空冷冻干燥得到固定化的脲酶。
本发明提供一种利用水热合成反应来制备聚合度低，醛基含量为86％的氧化双醛纤维素，并以此氧化纤维素为载体，以希夫碱(Schiff base)反应为基础，将脲酶氨基酸残基上的氨基与氧化双醛纤维素上的醛基通过化学键连接起来，得到氧化双醛纤维素固定化的脲酶。该固定化脲酶的最适温度为56℃，最适pH为7.0，贮存半衰期为68天。与游离脲酶相比，该固定化脲酶的稳定性大大提高。在温度20℃-90℃，pH 4-10范围内通过测定固定化酶和游离酶的活力，得出固定化酶的最适温度，最适pH值，并通过比较确定固定化脲酶较游离脲酶的温度耐受性和酸性条件下的pH耐受性均有所提高。
Claims (1)
1.一种氧化双醛纤维素固定化脲酶的制备方法，其特征是按如下步骤进行的：
一、氧化双醛纤维素的制备：
(1)纤维素的活化：将微晶纤维素或棉纤维置于质量比为12％-20％的NaOH水溶液中润涨24h，用蒸馏水洗至中性，抽滤后将得到的固体置于30-40℃烘箱中干燥3h，研磨成粉末备用；
(2)纤维素的氧化：将活化后的微晶纤维素或棉纤维与高碘酸或高碘酸钠置于水热合成反应釜中，所述的微晶纤维素或棉纤维与高碘酸或高碘酸钠的重量比为1∶1-1∶4，加入蒸馏水，填充系数为0.6-0.9，将此密闭的水热合成反应釜置于110-130℃烘箱中反应4-10h；反应结束后，滤纸过滤得到固体，并用蒸馏水反复冲洗该固体4-5次，抽滤后将固体置于30-40℃烘箱干燥3h后研磨成粉备用；将干燥得到的产物再进行一次相同方法的选择性氧化反应，即得氧化双醛纤维素，再将氧化双醛纤维素置于30-40℃烘箱中干燥3h后放入4℃冰箱中保存；
二、固定化脲酶的制备：
(1)分散相的制备：取步骤一(2)得到的氧化双醛纤维素载体，加入pH4-10的磷酸盐缓冲液制备分散相；控制氧化双醛纤维素在此分散相中的质量比为3％-5％；
(2)脲酶的固定：向分散相中加入脲酶溶液，其中脲酶溶液浓度为0.1-20mg/mL，控制反应温度2-8℃，磁力搅拌2-4h；
(3)洗涤干燥：用纱布过滤得到固体，将此固体用去离子水洗涤4-5次，除去未固定的游离脲酶，真空冷冻干燥得到固定化的脲酶。
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