CN105349521B - 一种基于稻壳固定化玉米赤霉烯酮降解酶的霉菌毒素脱毒剂的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于稻壳固定化玉米赤霉烯酮降解酶的霉菌毒素脱毒剂的制备方法及其应用，属于固定化酶技术领域。本发明采用稻壳上的羟基很容易被高碘酸钠氧化成醛基，而使其可以很好的与酶连接，稻壳载体即经济实惠，而且还具有高比表面积、表面存在孔隙、良好的生物相容性，未固定化酶提供了生物友好的微环境，有效的固定化酶的催化活性和稳定性。跟现有技术相比，本发明提供的方法工艺简单、成本少，而且具有稳定、高效脱除玉米赤霉烯酮真菌毒素等性质。

Description

一种基于稻壳固定化玉米赤霉烯酮降解酶的霉菌毒素脱毒剂 的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种基于稻壳固定化玉米赤霉烯酮降解酶的霉菌毒素脱毒剂的制备方法及其应用，属于固定化酶技术领域。
背景技术
玉米赤霉烯酮(ZEN)是一类污染范围广，具有类雌激素活性的镰刀菌属真菌毒素。ZEN在世界范围内能广泛污染玉米、谷物等粮食作，世界范围内能广泛污染玉米、谷物等粮食作，不仅给食品和饲料行业带来了巨大的经济损失，还可以通过食物链在动体或人中积累，进而引起动物或人体发生急性中毒和慢。因此，找到一种安全高效ZEN脱毒技术是尽快解决我国ZEN污染粮食安全的污染粮食安全的重要任务。
人们对稻壳的利用历史可以追溯到1000多年前，主要适用于燃烧，但是此过程给环境带来了很大的污染，所以急需找到更加环保的方法来利用稻壳，而将稻壳作为固定化载体就是很好解决这个问题的方法。因此本发明是非常有意义的。
酶的固定化可以增加酶在各种环境中的稳定性，还可以提高酶的重复利用率，是一种提高酶的使用价值的常见技术。然而，根据酶与固定化方法本身的特点及已有的酶固定化报道可知，酶的固定化可以分为吸附固定和化学键共价链接，吸附固定的酶不是很稳定，很容易掉落。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种新的固定化酶方法，是利用稻壳固定化玉米赤霉烯酮降解酶，采用高碘酸钠稻壳上的羟基，使其变成醛基，更容易与酶发生共价反应，使酶固定。本发明以稻壳作为固定化载体，稻壳的具有大量的孔洞结构，且稻壳中的二氧化硅与木质素、纤维素间存在着较强的共价键作用，表面羟基多，具有较强的过滤和净化能力，通过对稻壳进行表面改性可以增强稻壳对离子的吸收性能，而且还具有性质稳定，耐降解、传质好、比表面积大等优势。而且稻壳表面以及内部都存在大量的羟基，很容易被高碘酸钠氧化成醛基，与氨基发生酰胺反应，最终固定酶或者蛋白质。
本发明的目的在于提供一种固定化酶的方法，将稻壳用NaOH溶液和HCl溶液进行前处理，之后用NaIO4溶液将稻壳表面的羟基氧化为醛基，由于直接固定酶会限制酶的活性，所以再用尿素和戊二醛与氧化稻壳反应，得到带支臂的活化稻壳，清洗完毕将活化稻壳于游离酶液混合，冰浴中反应，离心收集沉淀、洗涤，风干之后就得到固定化的酶。
所述方法包括如下步骤：
(1)先将稻壳依次加入到碱溶液、酸溶液中进行前处理；
(2)将前处理后的稻壳加入到NaIO4溶液中，避光搅拌反应，反应完毕之后除去未反应的NaIO4、清洗、风干，得到氧化型稻壳，然后将氧化型稻壳加入尿素溶液中搅拌反应，再加入一定浓度的戊二醛搅拌反应，完毕之后用去离子水清洗，得到活化稻壳；
(3)将活化稻壳与游离酶液混合，冰浴搅拌，离心收集沉淀，并用缓冲液洗涤，冷冻干燥后，即可得固定化酶。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中碱溶液为0.5mol/L的NaOH，室温搅拌反应24h；所述酸溶液为0.1mol/L的HCl溶液，室温搅拌反应12h。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)是在2g/L的NaIO4溶液中室温反应3h，然后用0.5mol/L丙酮搅拌反应0.5h以去除未反应的NaIO4。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)的尿素溶液浓度为4mol/L，室温反应18h；所述戊二醛浓度为0.5mol/L，室温反应2h。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)中活化稻壳与游离酶液的配比为1000mg：100ml；所述冰浴下搅拌的时间为18h；所述缓冲液为20mmol/L、pH4.0的磷酸钠-柠檬酸缓冲液。
在本发明的一种实施方式中，所述酶为玉米赤霉烯酮降解酶。
在本发明的一种实施方式中，所述游离酶液的制备方法是：将产玉米赤霉烯酮降解酶的黑曲霉菌株活化培养后接种至发酵培养基培养，结束后离心得发酵上清液，即为游离酶液。
所述游离酶液是黑曲霉(Aspergillus niger)FS10所产的，该菌株保藏于江南大学食品与科学学院。
在本发明的一种实施方式中，所述游离酶液的制备方法是：黑曲霉孢子接种PDA培养基活化，然后刮取孢子于无菌生理盐水中，调整孢子浓度为106CFU/mL，将孢子悬浮液以6％的接种量接种到PDB培养基，30℃、150rpm回转式摇床培养24～48h得种子液，将将种子液按20％的接种量接种到发酵培养基中。
在本发明的一种实施方式中，所述PDA培养基的组成为：10g/L马铃薯浸出液，20g/L葡萄糖，2g/L琼脂。
在本发明的一种实施方式中，所述PDB培养基的组成为：8g/L马铃薯浸出液，20g/L葡萄糖。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的组成为：8g/L马铃薯浸出液，20g/L葡萄糖，2g/L磷酸氢二钾，2g/L尿素，0.3g/L硫酸镁，0.4g/L碳酸钙。
本发明还要求保护根据所述方法得到的固定化酶及其应用。
本发明的有益效果：
(1)本发明中，先发酵黑曲霉菌获得含有ZEN降解酶的发酵上清液，再通过高碘酸盐氧化纤维法制备活化的稻壳载体，并用尿素和戊二醛去延伸醛基，使稻壳更容易与酶结，最后利用活化的稻壳和ZEN降解酶非活性中心的氨基发生酰胺缩合反应而使ZEN得到固定化，且通过单因素变量法研宄固定化酶的热、酸碱的稳定性。本发明中活化稻壳表面粗糙且有部分孔状结构，与普通的稻壳相比，对酶的固定效果上更加有优势。
(2)本发明采用了一种改性稻壳固定ZEN降解酶的方法，采用该方法固定的ZEN降解酶在热稳定性、酸碱稳定性上与游离酶相比都有很大的优越性，与其他固定化酶相比，该固定化酶蛋白负载量和酶活力有很大的提高并且生产成本大大降低。
附图说明
图1为未处理、碱化、带支臂的稻壳的SEM表征图；
图2为未处理、碱化、带支臂的稻壳、固定化ZEN红外检测；
图3为游离酶和固定化酶的催化最适温度的测定；
图4为游离酶和固定化酶的热稳定性的比较；
图5为游离酶和固定化酶的催化最适pH的测定；
图6为游离酶和固定化酶的pH稳定性的比较；
图7为直接固定酶和间接固定酶的相对活性的比较。
具体实施方式
所制备的同定化ZEN降解酶的性质表征可采用以下方法：
酶活力的定量检测：将含有10ppm ZEN溶液，用碱调节pH为4.0。取1mL底物溶液与9mL发酵上清液或者10mg固定化酶混合，使溶液中ZEN最终浓度为1ppm，40℃反应12h，立即用0.5mol/L乙腈终止反应。酶活力单位(U)定义为在定温度、pH条件下，每分钟催化降解1ppbZEN所需的酶量。
最适反应温度的测定：将游离酶和固定化酶的反应体系分别在10、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90℃下反应12h，定量测定溶液中残余ZEN，比较在不同反应温度下的ZEN脱除率，分别得到游离酶和固定化酶的最佳催化温度。
稳定性的测定：将发酵上清液和固定化酶分别在10、20、30、40、50、60、70、80、90℃保温1h，然后再在40℃、pH4.0条件下检测溶液中残余ZEN脱除率，测定不同温度处理后游离酶和固定化酶的残留活力，比较热稳定性。
最适反应pH:配制pH为2.5、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0的底物溶液，测定在不同pH条件下游离酶和固定化酶的酶活力，分别得出游离酶和固定化酶催化最适催化pH。
pH稳定性测定：将发酵上清液和固定化酶分别放置在不同pH(2.5、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0)的磷酸钠-柠檬酸钠缓冲液中，冰浴下放置lh，然后将pH调到4.5，再在40℃下反应12h，定量测定残留酶活力，比较pH稳定性。
实施例1：
黑曲霉菌的活化：将FS10原始菌种的孢子用接种环接种到PDA平板培养基中培养3d，用灭菌接种环刮取平板边缘新生、活力高的孢子于无菌生理盐水中，调整孢子浓度为106CFU/mL；所述PDA培养基的组成为：10g/L马铃薯浸出液，20g/L葡萄糖，2g/L琼脂。
黑曲霉菌的培养：将孢子悬浮液以6％的接种量接种到装有500mLPDB培养基的1L锥形瓶中，30℃、150rpm回转式摇床培养24～48h；所述PDB培养基的组成为：8g/L马铃薯浸出液，20g/L葡萄糖。
上罐获得酶液：将种子液按20％的接种量接种到发酵培养基中，培养5d后停止培养，离心去菌体收集发酵上清液，获得游离酶液；所述发酵培养基的组成为：8g/L马铃薯浸出液，20g/L葡萄糖，2g/L磷酸氢二钾，2g/L尿素，0.3g/L硫酸镁，0.4g/L碳酸钙。
2)制备载体稻壳前处理，具体方法如下：
将稻壳加到0.5mol/L NaOH溶液中，在室温下，磁力搅拌器上，以200rmp转速搅拌24h，以除去稻壳表面的木质素，暴露出内部的纤维素，再用去离子水清洗3-6遍，用0.1mol/L HCl溶液,室温浸泡12h后，用去离子水清洗3-6遍，风干放入冰箱保存；
3)稻壳的活化
将前处理得到的稻壳加入到2g/L NaIO4液中，室温下，避光以200rpm搅拌3h，反应完毕之后用0.5mol/L丙酮除去未反应的NaIO4，反应完毕之后用去离子水清洗3-6遍，风干于冰箱中保存，得到氧化型稻壳，将氧化的稻壳加4mol/L尿素溶液中，以200rpm转速磁力搅拌18h，反应完毕之后加入0.5mol/L戊二醛，以200rpm转速磁力搅拌2h，反应完毕之后用去离子水清洗3-6遍，得到活化稻壳；
4)ZEN降解酶的固定
将活化稻壳与ZEN降解酶按照1000mg：100ml混合，再冰浴以200rpm转速搅拌18h，离心收集沉淀，并用磷酸钠-柠檬酸缓冲液洗涤3-6遍，冷冻干燥后，即可得固定化ZEN降解酶。
实施例2：未处理稻壳、碱化稻壳、活化稻壳的表征
图1给出的是未处理稻壳、碱化稻壳、未处理稻壳的SEM图，从图中(a)、(b)可以看出未处理稻壳的表面非常光滑，这是由于稻壳表面被木质素包裹，这不利于酶的固定，从图中(c)、(d)可以明显的看到碱化稻壳表面变得粗糙，表面积增大，这是由于稻壳表面的木质素酶碱液水解，将稻壳内部的纤维素暴露出来，利于高碘酸钠将羟基氧化为羧基，从图中(e)、(f)可以看出活化的稻壳表面更加的粗糙，非常有利于酶的固定。
实施例3：未处理稻壳、碱化稻壳、氧化稻壳和固定化酶的红外检测
为了定性检测稻壳是否改性成功以及酶是否被成功被固定化，对实验过程中的产物做了红外光谱检测。如图2，与未处理稻壳的图谱相比较，在碱化稻壳图谱中在1,125cm-1处木质素的特征吸收峰明显减弱，这说明稻壳表面的木质素被NaOH溶液水解；在氧化稻壳的图谱中，波数1,734cm-1处出现了明显的伸缩峰，该峰正是C＝O的特征吸收峰，说明稻壳表面的纤维素被高碘酸钠氧化成醛基；而在固定化酶图谱中，波数1,734cm-1处的伸缩峰消失了，而波数1,640cm-1处出现了一个明显的伸缩峰，此伸缩峰正是酰胺键的伸缩振动吸收峰，这初步说明发酵上清液中蛋白质成功的被固定化在活化的稻壳上。
实施例4：固定化酶与游离酶最适温度的比较
如图3，游离酶、固定化酶的最适催化温度都是在40℃，在最优反应温度下固定化酶与游离酶对ZEN的脱除率提高了20％，一方面是由于稻壳可以物理吸附一定的ZEN，另一方面是固定化的酶比游离酶稳定，而且40～90℃高温下的固定酶活力都高于游离酶，说明固定化酶与游离酶相比，具有较强的抗热能力。
实施例5：固定化酶和游离酶热稳定性的比较
将40℃下孵育的酶对ZEN脱除效率设置成100％。如4，可以看出，游离酶酶活从60℃开始迅速降低，而固定酶仍然还存在很好的活力，在90℃下，固定酶活力仍然可以达到70％以上，由此可见，该固定化酶在耐热能力上较游离酶存在明显的优势。
实施例6：固定和酶与游离酶最适催化pH的比较
由图5可知，游离酶、固定化酶的最优催化pH分别是4.0和5.0，固定化酶在pH为6.0-10.0的环境中的相对酶活力都高于游离酶，这说明此固定化酶较游离酶具有更强的酸碱耐受范围。
实施例7：固定化酶和游离酶pH稳定性的比较
将游离酶和固定化酶分别置于不同的pH的磷酸钠-柠檬酸钠缓冲溶液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲缓冲溶液中冰浴1h，配置pH为4.0的底物溶液，再将两种状态的酶在各自的最适温度下催化反应，测定酶活，将没有用酸碱处理过的酶的活性力定义成100％。如图6，从曲线中可以看出，固定化酶在pH为4.0的缓冲溶液中的相对酶活力相对最高，而游离酶则在pH为5.0的缓冲溶液中相对较高。从曲线的变化趋势可以分析出，无论是在过酸性环境还是在过碱性环境中，固定化酶的相对活力都高于游离酶的相对活力，这说明该固定化酶的有良好的抗酸抗碱的能力。
用活化过的稻壳来固定ZEN降解酶的优势，在于共价交联的固定化方式使固定化酶在催化过程中不易从载体上脱落，增强其重复利用的能力。同时，载体本身的结构能够更好地保护酶在催化过程中耐热、耐酸碱的能力而不易失活。固定化酶制备的过程中，材料的制备与改性尤为重要，固定化酶性质的探究对其日后在工业上的应用也相当重要。
实施例8：不同固定化酶方法对固定酶效果的影响
不带“间隔臂”氧化稻壳直接固定酶与带“间隔臂”稻壳间接固定酶(即本发明的方法)的效果比较：
以实施例3得到的氧化型稻壳(不带“间隔臂”)直接进行固定化，其他步骤与实施例3一致。
由图7可以看出，在最适pH和温度下，直接固定酶的活性明显低于间接固定酶的活性，这是由不带“间隔壁”的氧化稻壳比间接固定酶时链接的蛋白量少，其次，小分子高碘酸钠可以进入纤维内部进行氧化，而大分子的酶不能进入纤维内部。相反，带有“间隔臂”的氧化稻壳可以将氧化得到的醛基延伸出来与没反应而增加的酶固定的含量。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (5)

1.一种固定化酶的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)先将稻壳依次加入到碱溶液、酸溶液中进行前处理，所述碱溶液为0.5mol/L的NaOH，室温搅拌反应24h；所述酸溶液为0.1mol/L的HCl溶液，室温搅拌反应12h；(2)将前处理后的稻壳加入到NaIO4溶液中，避光搅拌反应，反应完毕之后除去未反应的NaIO4、清洗、风干，得到氧化型稻壳，然后将氧化型稻壳加入尿素溶液中搅拌反应，再加入一定浓度的戊二醛搅拌反应，完毕之后用去离子水清洗，得到活化稻壳；(3)将活化稻壳与游离酶液混合，冰浴搅拌，离心收集沉淀，并用缓冲液洗涤，冷冻干燥后，即可得固定化酶；
所述酶为玉米赤霉烯酮降解酶；
所述步骤(2)是在2g/L的NaIO4溶液中室温反应3h，然后用0.5mol/L丙酮搅拌反应0.5h以去除未反应的NaIO4；
所述步骤(2)的尿素溶液浓度为4mol/L，室温反应18h；所述戊二醛浓度为0.5mol/L，室温反应2h。
2.根据权利要求 1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中活化稻壳与游离酶液的配比为1000mg：100ml；所述冰浴搅拌的时间为18h；所述缓冲液为20mmol/L、pH4.0的磷酸钠-柠檬酸缓冲液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述游离酶液的制备方法是：将产玉米赤霉烯酮降解酶的黑曲霉菌株活化培养后接种至发酵培养基培养，结束后离心得发酵上清液，即为游离酶液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述游离酶液的制备方法具体是：黑曲霉孢子接种PDA培养基活化，然后刮取孢子于无菌生理盐水中，调整孢子浓度为106CFU/mL，将孢子悬浮液以6％的接种量接种到PDB培养基，30℃、150rpm回转式摇床培养24～48h得种子液，将种子液按20％的接种量接种到发酵培养基中。
5.根据权利要求1所述方法得到的固定化酶。
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