CN107699494A - 基于微孔板的雨生红球藻筛选方法 - Google Patents

基于微孔板的雨生红球藻筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物的筛选方法，特别是指一种基于微孔板的雨生红球藻筛选方法。包括种子培养、发酵培养、促使虾青素积累、虾青素的提取、雨生红球藻的筛选等工艺步骤，各步骤中的微孔板选用透光材质制作。本发明有效解决了现有微孔板法高通量筛选雨生红球藻时存在培养困难、虾青素提取测定步骤繁琐且结果误差大、筛选结果不可靠的问题，具有与摇瓶筛选相比提高了培养效率、操作简单、有效减少乃至消除了微孔板培养雨生红球藻时因气体交换能力差造成孔板培养的边缘效应等优点。

Description

基于微孔板的雨生红球藻筛选方法
技术领域
本发明属于微生物的筛选方法，特别是指一种基于微孔板的雨生红球藻筛选方法。
背景技术
虾青素是一种红色的类胡萝卜素，化学名称为3，3’-二羟基-4，4’-二酮基-β，β’-胡萝卜素，具有极强抗氧化功能的生物活性成分，研究发现其抗氧化活性比其他类胡萝卜素高10倍，比维生素E高550倍。虾青素能够增强机体免疫力，预防癌症，防止皮肤衰老，维护眼睛及中枢神经系统的健康，具有防治心血管疾病的功能，虾青素还具有很强的着色功能。目前虾青素主要来源有化学合成和天然资源，与化学合成的虾青素相比天然虾青素更容易被人体吸收、安全性高，其在食品、保健品、制药业、化妆品等行业均有广泛应用。
天然虾青素的生物来源主要有四种：一是从甲壳类动物中直接提取获得；二是某些细菌(如乳酸分支杆菌、短杆菌等)合成的虾青素；三是利用某些真菌(如红法夫酵母)生产虾青素；四是利用微藻(如衣藻、小球藻和雨生红球藻等)生产虾青素。雨生红球藻细胞内积累的虾青素占类胡萝卜素总量的90％以上，含量可达到藻体干重的4％，被确认为自然界中虾青素含量最高、最可能实现工业化生产的物种。虽然雨生红球藻是公认的天然虾青素的最佳来源，但由于受到其生长速率慢，发酵周期长，虾青素含量和产率低，培养过程中易受细菌、杂藻及原生动物污染等不利因素的影响，制约了其工业化的生产。因而选育优良高产的雨生红球藻藻种对虾青素工业化生产具有重大意义。目前雨生红球藻的育种工作多采用自然筛选和诱变育种两种方法，以生长速率、生物量及虾青素含量等指标作为筛选依据进行优良藻株的选育。一般来说，菌种变异都是随机的，经过一次的诱变和筛选很难筛选到所需的藻株，需要经过多轮诱变，从成百上千甚至是上万的藻株中去挑选遗传稳定的高产藻株，巨大的工作量给筛选工作带来困难。
常规的筛选方法是将待筛选的藻种接种于摇瓶培养，定时取样测定生长状况，培养到一定时期后对藻种进行刺激促进虾青素的积累，虾青素积累完成后离心收集细胞，提取和测定虾青素。由于雨生红球藻的生长特性和细胞形态的特点，使得摇瓶筛选方式存在两个难点。一是因为雨生红球藻的培养分两个阶段，在第一阶段先将细胞培养至对数末期，第二阶段时再改变培养条件促进虾青素积累，所以在培养过程中需要不断取样测定细胞生长时期，而逐个摇瓶取样和测定使得操作非常繁琐，对于大批量的筛选费时费力很难完成；二是雨生红球藻生长到后期会形成厚壁孢子，导致虾青素提取和测定非常困难。因为较厚的细胞壁阻碍了溶剂渗透和虾青素的胞外扩散，所以虾青素提取过程中还需要逐个对样品进行破壁处理，导致整个筛选过程工作量大且耗时长。因此雨生红球藻的筛选工作需要一种高效的培养方法和虾青素提取测定方法。
高通量筛选是一种用于菌种选育及新化合物开发等方面的新技术，它是在微孔板的基础上进行高密度、快速平行地测定大批量样本的方法。在菌种高通量筛选过程中，微孔板与连续加样器、排枪及酶标仪等仪器结合使用，可以大大地节约批量操作时间，提高效率。一些欧美国家应用先进的计算机技术和机器人，开发出了全自动高通量筛选工作站，但是这些设备价格相当昂贵。微孔板在菌种筛选中成功应用的例子很多，如CN105087390A利用深孔细胞培养板对产衣康酸的土霉菌种进行了高通量筛选；CN103725669A将诱变后的红曲霉菌悬液接种于深孔板，混合培养后，高通量检测出产量最高的混合体，进行平板分离纯化，摇瓶发酵检测，获得纯种的高产菌株；CN104232734A将产腺苷微生物菌种接种于深孔板中培养，培养结束后将深孔板离心，取上清液用酶标仪测腺苷含量，根据标准曲线和发酵液上清的稀释倍数计算腺苷产量。上述例子均是对异养型的微生物菌种进行筛选，并且所测目标产物均是胞外产物，不涉及细胞破壁处理。CN103074205B利用电动转盘结合微孔板培养的方法高通量筛选了耐受二氧化碳的生物质能藻种，它是以细胞生物量浓度为筛选指标确定最优藻种，未进行胞内物的提取。
雨生红球藻为光合藻类，其在生长过程中需要光照进行光合作用，吸收二氧化碳并放出氧气。由于受到微孔板空间及结构限制，与容积较大的摇瓶相比用较小容积的微孔板培养雨生红球藻时有很大困难。一是光合型雨生红球藻生长过程中会释放大量的氧气，由于微孔板单孔容积小且有盖板，与外部气体交换差，导致培养液中氧浓度升高，不同溶氧浓度下雨生红球藻的代谢方式不同，较低的氧浓度时以自养型的光合作用为主，高氧浓度下转为异养代谢，过高的氧浓度还可能会抑制藻细胞的生长。二是因为微孔板的孔小且密度高，孔板中央位置处的气体交换能力最差，边缘位置的气体交换能力强，这会导致中央至边缘形成氧浓度差，形成边缘效应。中央孔培养基中的溶解氧浓度高于边缘孔，这将造成不同孔的培养结果出现差异，从而不能真实反映不同孔中的细胞生长情况，筛选结果出现偏差，可能导致选出了性能差的藻种而漏掉优良藻种的后果。三是用机械研磨等常规方法提取虾青素时涉及细胞的收集、干燥、研磨破壁、虾青素提取和测定等步骤，操作非常繁琐，又因为用微孔板培养获得的培养液体积少，总生物量低，容易造成测定误差大的问题，所以用常规方法提取测定微孔板中雨生红球藻的虾青素含量不现实，因此利用微孔板直接提取虾青素是本领域科学研究中面临的技术难题。
总之，微孔板法高通量筛选雨生红球藻时存在培养困难、虾青素提取测定步骤繁琐且结果误差大、筛选结果不可靠的问题。针对雨生红球藻育种过程中存在的问题，开发一种经济、筛选高效、且筛选结果可靠的方法，对虾青素的产业化发展具有重大的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于微孔板的雨生红球藻筛选方法，解决了雨生红球藻育种中工作量大，筛选效率低的问题，具有简便、经济、高效、筛选结果可靠的优点。
本发明的整体技术构思是：
基于微孔板的雨生红球藻筛选方法，包括如下工艺步骤：
A、种子培养：将藻种接入微孔板内灭菌后的种子液培养基中，光照静置培养至藻种处于对数期获得种子液；
B、发酵培养：将步骤A中制备的种子液接入微孔板内灭菌后的发酵培养基中，光照静置培养至藻种处于对数末期获得发酵液；
C、促使虾青素积累：调整发酵液的培养条件促使虾青素积累；
D、虾青素的提取：虾青素积累完成后向微孔板内加入虾青素提取介质后混匀进行超声处理，超声处理的条件为：先在超声频率为25KHz-50KHz的条件下处理20-60分钟，再在超声频率为70KHz-200KHz条件下处理10-40分钟；
E、雨生红球藻的筛选：测定步骤D中产物的虾青素含量，依据虾青素含量测定结果筛选高产虾青素的雨生红球藻；
各步骤中的微孔板选用透光材质制作。
申请人需要说明的是，对于光合自养型的雨生红球藻而言，因为培养过程中有光照的需求，因此选用透光材质制作微孔板是显而易见的，更为优选的技术方案是，微孔板选用透明材质制作。
本发明的具体技术构思还有：
超声法可有效加速虾青素的提取速度，因超声波能量传播遇到器具表面会受到阻尼，造成器具内介质接受的超声波能量受损，影响了超声效果。而不同材质对超声波的阻尼效果不同，为了有效提取虾青素，优选的技术方案是，微孔板的材质选用聚苯乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯、聚氯乙烯中的一种。更为优选的技术方案是，微孔板的材质选用聚丙烯。
为了达到良好的培养效果，微孔板选用48孔板、24孔板、12孔板或6孔板中的一种。
微孔板的孔容积大小和装液量对液体蒸发、气体交换都有影响，进而影响雨生红球藻的培养情况。为了达到良好的培养效果，优选的技术方案是，步骤A、B中培养基的装量为微孔板中孔容积的1/4-2/3。
接种量是微生物培养中的重要技术因素，优选的技术方案是，步骤A中藻种的接种量为体积比＝8％-20％，步骤B中藻种的接种量为体积比＝8％-15％。
种子液培养对于菌种发酵非常关键，为了使发酵培养顺利进行，优选的技术方案是，步骤A中的种子培养的级数为至少一级。更为优选的技术方案是，步骤A中的种子培养的级数为两级。
低光照强度有利于细胞分裂和生长，高光照强度容易诱导绿细胞合成虾青素而转为红细胞。优选的技术方案是，由于本发明使用微孔板作为培养容器，气体交换能力差，具有边缘效应，过高的光照强度使得光合作用增强，氧气释放速率增加，边缘效应加剧，反而不利于各孔培养条件的一致性。对于光照供给时间本发明不做限制，可以是24小时的连续光照，也可以是12:12小时的光暗周期或其他频率的光暗变换，均适用于本发明。步骤A、B中光照静置培养条件为温度20℃-28℃，光照强度600lux-900lux。
由于微孔板体积较小而雨生红球藻的培养时间较长，培养液的体积过少容易导致水分过度蒸发而变干，水分减少会导致培养基养分的浓缩，养分浓度增加会影响藻种的培养和发酵。为了减小水分蒸发对雨生红球藻的生长影响，优选的技术方案是，步骤A、B中光照静置培养条件为湿度不低于96％。
种子液培养对于菌种发酵非常关键，为了使发酵培养顺利进行，优选的技术方案是，步骤A中的种子液培养基包括如下原料：
硝酸钠100mg/L-300mg/L；磷酸二氢钾50mg/L-250mg/L；磷酸氢二钾50mg/L-150mg/L；七水合硫酸镁50mg/L-150mg/L；二水合氯化钙10mg/L-80mg/L；乙二胺四乙酸二钠10mg/L-100mg/L；柠檬酸铁铵2mg/L-10mg/L及微量元素；微量元素包括含量均为0.05μM的钴盐、铜盐、钼盐、镍盐、碘盐，含量均为0.01μM的钒盐、钨盐、铬盐，含量为0.1μM的锌盐和1.0μM的锰盐；种子液培养基的pH＝6.8。
步骤B中的发酵培养基包括如下原料：
三水合醋酸钠1g/L-3g/L；硝酸钠0.4g/L-1.6g/L；谷氨酸钠0.1g/L-1g/L；六水合氯化镁0.05g/L-0.8g/L；柠檬酸铁铵2mg/L-10mg/L；二水合氯化钙0.01g/L-0.05g/L；碳酸钠0.1g/L-0.8g/L及微量元素；微量元素包括含量均为0.05μM的钴盐、铜盐、钼盐、镍盐、碘盐；含量均为0.01μM的钒盐、钨盐、铬盐；含量为0.1μM的锌盐和1.0μM的锰盐；发酵培养基的pH＝6.8。
培养雨生红球藻合成虾青素分为两个阶段，第一阶段为绿细胞培养期，细胞利用培养液中的养分进行分裂生长，细胞浓度不断增加，此阶段的细胞内含有叶绿素，通过光合作用释放大量氧气；第二阶段为红细胞培养期，细胞在环境和营养等胁迫条件下合成大量虾青素，并形成厚壁孢子。溶氧分压升高会使得不动细胞数目增加，低溶氧情况下雨生红球藻以光合自养代谢为主，高溶氧情况下以异养生长为主，代谢途径的不同导致代谢产物发生质和量的改变。空气的流通和交换有利于维持培养液表面的氧分压的平衡，避免因培养液中氧浓度不同而导致的代谢途径改变或者抑制作用。微孔板是上面带盖且由很多孔组成的矩阵平板，孔小且密度高，孔板中央位置处的气体交换能力最差，边缘位置的气体交换能力强，中央孔与边缘孔所培养的雨生红球藻会出现差异，形成边缘效应。为了减小乃至消除边缘效应，优选的技术方案是，步骤A、B中的种子液培养基及发酵培养基中含有如下原料：
异抗坏血酸钠0.1g/L-0.5g/L；半胱氨酸盐酸盐0.6g/L-1.6g/L；抗坏血酸钠0.2g/L-0.8g/L。
所述的步骤C中调整后发酵液的培养条件为温度22℃-26℃，湿度不低于96％。雨生红球藻培养后期，通过改变环境和营养条件有利于促进虾青素的积累，为达到提高虾青素含量的效果，优选的技术方案是，所述的步骤C中调整后发酵液的培养条件是采用在微孔板的孔内加入促进剂或进行光照培养中的一种或其结合的技术手段促使虾青素积累，促进剂选用终浓度为1.5g/L-6g/L的醋酸钠、0.3g/L-0.7g/L的七水合硫酸亚铁、5g/L-10g/L的氯化钠中的一种或其结合，光照强度为8000lux-10000lux，一般采用连续光照最佳，也可以采用光暗周期变换。
超声提取雨生红球藻细胞内虾青素的主动力是超声空化现象，此过程中产生的微小局部瞬时高温高压、自由基、冲击波、微射流、微气泡震动等空化效应，为有机溶剂渗透孢子细胞壁溶解虾青素的过程提供了极端条件，因此，超声辅助强化可以代替许多苛刻的强酸、强碱、高温高压或机械破壁等破壁条件。超声波能够引起质点振动，质点振动的加速度与超声频率的平方成正比。一般来说提高声强会增强空化，声强愈高,空化愈强烈。不同超声频率的空化阈和空化效应不同。低频超声空化强度高对雨生红球藻孢子壁破坏作用强，而高频超声更容易在细胞壁细微裂缝处形成空化效应，加强虾青素的溶出。高频超声的空化阈高，应提高声强来增加空化现象。为了提高超声提取虾青素的效果，本发明采取两阶段不同频率下的超声作用，为了达到更好的提取效果，更为优选的技术方案是，所述的步骤D中超声温度为30℃-60℃，超声功率为50W-1500W。
为便于对虾青素进行提取，进而有效测定其含量，优选的技术方案是，步骤D中虾青素积累完成后，采用高速离心后弃上清。
更为优选的技术方案是，步骤D中的高速离心的条件是转速为3000转/分钟，时间为3分钟。
虾青素提取介质的加入主要是为保证虾青素的充分提取，优选的技术方案是，步骤D中的虾青素提取介质选用二甲基亚砜，二甲基亚砜的加入量为培养液体积的1-3倍。
藻种生长时期的测定可以采用包括但不局限于多种现有方案，其中优选的技术方案是，所述的步骤A、B中藻种生长时期的测定是将培养液混匀后的微孔板放入酶标仪中测定培养液的OD600吸光度。
虾青素含量的测定可以采用包括但不局限于多种现有方案，其中优选的技术方案是，步骤E中虾青素含量的测定是将步骤D中的产物高速离心后，将上清转至另一微孔板中，采用酶标仪490nm波长进行。更进一步，步骤E中测定虾青素含量时虾青素浓度为12mg/L-160mg/L。更为优选的技术方案是，步骤E中的高速离心的条件是转速为5000转/分钟，时间为3分钟。
本发明所取得的实质性特点及显著的技术进步在于：
1、本发明首次将微孔板应用于雨生红球藻培养，一个微孔板中可以培养多株藻种，与摇瓶筛选相比提高了培养效率，大大地减少了实验耗材的消耗。
2、采用超声波来提高虾青素分子的运动速度和穿透细胞壁的能力，增大虾青素溶出效率，无需进行藻细胞的破壁处理，操作简单，节省提取时间。
3、相比现有的酸法、碱法、机械破壁法、微孔板一步超声法提取虾青素而言，采用本发明的方法提取虾青素与国标的提取率吻合程度更高，但操作简化程度及操作周期均明显优于国标，因此有效保证了利用本发明方法对雨生红球藻进行筛选的效果准确性。
4、选用孔板材质和不同频率超声条件增加了超声提取效率，解决了在微孔板中提取虾青素困难且效率低的问题。
5、有效减少乃至消除了微孔板培养雨生红球藻时因气体交换能力差造成孔板培养的边缘效应，以及培养条件不一致使得筛选结果出现错误的问题，具有各孔培养条件均匀一致，培养结果可靠的优点。
6、本发明中藻种培养和虾青素提取均在微孔板中进行，可以充分利用酶标仪、排枪、连续加样器等仪器设备，大大减少育种人员的工作量并且筛选效率得到大大提高。
附图说明
图1是利用微孔板和摇瓶培养不同藻株的虾青素含量对比示意图。
图2是微孔板法与GB/T 31520法测定虾青素含量的浓度曲线拟合图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述，但不应理解为对本发明的限定，本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书所做出的等效技术手段替换，均不脱离本发明的保护范围。
实施例1
对24株自然筛选的雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)进行筛选。
种子液培养基包括如下含量的原料：
硝酸钠250mg/L；磷酸二氢钾200mg/L；磷酸氢二钾125mg/L；七水合硫酸镁125mg/L；二水合氯化钙60mg/L；乙二胺四乙酸二钠75mg/L；柠檬酸铁铵8mg/L及微量元素；微量元素包括含量均为0.05μM的钴盐、铜盐、钼盐、镍盐、碘盐；含量均为0.01μM的钒盐、钨盐、铬盐；0.1μM的锌盐和1.0μM的锰盐；调节pH值＝6.8。另外加入0.5g/L的异抗坏血酸钠，0.6g/L的半胱氨酸盐酸盐和0.2g/L的抗坏血酸钠。
发酵培养基包括如下含量的原料：
三水合醋酸钠2.5g/L；硝酸钠1.3g/L；谷氨酸钠0.8g/L；六水合氯化镁0.6g/L；柠檬酸铁铵8mg/L；二水合氯化钙0.04g/L；碳酸钠0.1g/L及微量元素；微量元素与种子液培养基相同，调节pH值＝6.8。另外加入0.1g/L的异抗坏血酸钠，1.6g/L的半胱氨酸盐酸盐和0.5g/L的抗坏血酸钠。
筛选步骤如下：
A、种子培养：按10％接种量将24株藻种分别接入微孔板内灭菌后的种子液培养基中，于温度为25℃、光照强度为800lux、湿度96％的条件下培养，每隔8小时在100转/分钟的条件下振荡2分钟或用移液器吸打混匀培养液，将混匀后的微孔板放入酶标仪中测定培养液的OD600吸光度，培养至藻种处于对数期获得种子液。
B、发酵培养：按10％接种量将步骤A中制备的种子液接种至微孔板内灭菌后的发酵培养基中，于温度为25℃、光照强度为850lux、湿度96％的条件下培养，每隔8小时在转速为100转/分钟的条件下振荡2分钟或用移液器吸打混匀培养液，将混匀后的微孔板放入酶标仪中测定培养液的OD600吸光度，培养至藻种处于对数末期。
C、促使虾青素积累：向每个孔中加入终浓度为4g/L的醋酸钠、0.7g/L的七水合硫酸亚铁和5g/L的氯化钠，置于温度为25℃，光照强度为10000lux条件下促使虾青素积累，10天后获得培养液。
D、虾青素的提取：将步骤C中的培养液在转速为3000转/分钟、时间为3分钟的条件下离心后弃上清，在微孔板中加入1倍培养液体积的二甲基亚砜，混匀，于温度为40℃、功率为500W、频率为35KHz的条件下超声40分钟，然后在温度为50℃、功率为800W、频率为100KHz的条件下超声20分钟。
E、雨生红球藻的筛选：将步骤D中的微孔板在转速为5000转/分钟的条件下离心3分钟，收集上清转移至另一微孔板中并稀释，于酶标仪中测定490nm处的吸光度值。
微孔板选用聚丙烯材质的24孔(每孔3ml)板，每孔中装入的培养液体积为单孔容积的3/5。
为验证本发明筛选结果的准确性，申请人采用摇瓶培养筛选藻种的方法进行对比。具体方法如下：
摇瓶培养：将前述24株藻种接种至装有100ml种子液培养基的250ml三角瓶中，于温度为25℃、光照强度为2600lux的条件下静置培养，每隔8小时混匀培养液，取样测定OD600吸光度，培养至藻种处于对数期获得种子液。按10％接种量将种子液接种于另一装有200ml发酵培养基的500ml三角瓶中，于温度为25℃、光照强度为3000lux的条件下静置培养至藻种处于对数末期。每瓶中加入终浓度为4g/L的醋酸钠、0.7g/L的七水合硫酸亚铁和5g/L的氯化钠，置于温度为25℃、光照强度为10000lux的条件下促使虾青素积累，10天后获得培养液。收集细胞沉淀，冷冻干燥，利用GB/T 31520法测定虾青素的含量。
由图1可见，不同藻株分别通过用摇瓶培养和微孔板培养进行筛选测定的虾青素含量变化趋势相同。
实施例2
微孔板法与GB/T 31520法测定虾青素含量的浓度曲线拟合
本实施例所用藻株为雨生红球藻(Haematococcus pluvialis UTEX 2505)。
种子液培养基包括如下含量的原料：
硝酸钠200mg/L；磷酸二氢钾150mg/L；磷酸氢二钾100mg/L；七水合硫酸镁100mg/L；二水合氯化钙40mg/L；乙二胺四乙酸二钠50mg/L；柠檬酸铁铵6mg/L及微量元素，微量元素及pH值与实施例1相同。
发酵培养基包括如下含量的原料：
三水合醋酸钠2.0g/L；硝酸钠1.0g/L；谷氨酸钠0.4g/L；六水合氯化镁0.3g/L；柠檬酸铁铵6mg/L；二水合氯化钙0.03g/L；碳酸钠0.1g/L及微量元素，微量元素及pH值同种子液培养基。
雨生红球藻的发酵培养：按18％的接种量将试管保藏的藻种接种于装有100ml种子液培养基的250ml三角瓶中，于温度为25℃、光照强度为1500lux的条件下培养，每隔8小时混匀一次培养液，取样测定不同时间点的发酵液吸光度OD600，培养至藻种处于对数期获得种子液。将种子液按10％的接种量转接于装有20L发酵培养基的发酵罐中，在温度为25℃、搅拌转速150转/分钟、通气量1vvm、光照强度2000lux条件下进行培养，光暗循环周期为12：12小时，培养至藻种处于对数末期，加入终浓度为3g/L的醋酸钠和8g/L的氯化钠，于光照强度为10000lux的条件下促使虾青素积累，每隔4-6小时取样获得雨生红球藻培养液。其中16-30号样品是将所取培养液浓缩4倍后制得。将取得的30个样品分别用GB/T 31520法和微孔板法提取测定虾青素含量。
微孔板法提取测定虾青素的步骤为：取1ml培养液于24孔聚丙烯材质的微孔板中(孔容积为3ml)，3000转/分钟转速下离心3分钟后弃掉上清，加入2ml二甲基亚砜，于温度为50℃、功率500W、频率为35KHz的条件下超声40分钟，然后在温度为50℃、功率800W，频率为100KHz的条件下超声20分钟，超声后将微孔板在5000转/分钟转速下离心3分钟，收集上清转移至另一微孔板中并稀释，于酶标仪中测定490nm处的吸光度值。
微孔板法提取和测定虾青素含量按下式计算：
虾青素含量(mg/L)＝(4.5×OD490×Va)÷Vb×D
式中：OD490—虾青素提取液在490nm处的吸光值；
Va—虾青素提取液的体积(ml)；
Vb—藻液体积(ml)；
D—稀释倍数。
通过origin软件分析，将GB/T 31520法和微孔板法测得的30个样品中虾青素含量进行浓度曲线拟合，结果如图2所示。
由图2可以看出，利用微孔板提取和测定培养液样品中虾青素的浓度范围在12mg/L-160mg/L时，其与GB/T 31520法测定的结果线性相关度高，线性拟合公式为y＝0.9571x+1.0164(R2＝0.9998)。通过该拟合公式可以将微孔板法测定虾青素含量的结果准确计算出GB/T 31520法的测定结果。因此，当虾青素浓度范围为12mg/L-160mg/L时，微孔板法用于雨生红球藻中虾青素的提取测定结果准确可靠。
实施例3
本实施例所用藻株为雨生红球藻(Haematococcus pluvialis UTEX 2505)，发酵液培养基、种子液培养基及种子液培养过程同实施例2。按8％接种量将种子液接种于装有200ml发酵培养基、容量为500ml三角瓶中，于温度为28℃、光照强度为1800lux的条件下将藻种培养至对数末期，加入终浓度为4g/L的醋酸钠、0.4g/L的七水合硫酸亚铁和7g/L的氯化钠，于光照强度为9000lux光照条件下促使虾青素的积累，10天后获得培养液。取2ml培养液于12孔的聚丙烯材质的微孔板中(孔容积为6.9ml)，在3000转/分钟转速下离心3分钟后弃上清。向孔板中加入1倍培养液体积的二甲基亚砜(2ml)，混匀藻体，于温度为30℃、频率为50KHz、功率为1500W的条件下超声20分钟，再在频率为70KHz、功率为500W的条件下超声40分钟，超声完后将孔板在5000转/分钟转速下离心3分钟，将上清转至另一微孔板中并稀释，酶标仪中测定490nm处的吸光度值。按实施例2所述的公式计算得虾青素的含量为51.02±0.33mg/L，同时，按GB/T31520法测得虾青素含量为51.83±0.76mg/L，与GB/T 31520法相比，微孔板法提取率为98.44％。
实施例4
本实施例所用雨生红球藻(Haematococcus pluvialis UTEX 2505)培养同实施例3。取2ml培养液置于12孔聚丙烯材质的微孔板中(孔容积为6.9ml)，在3000转/分钟转速下离心3分钟后弃上清。向孔板中加入1.5倍培养液体积的二甲基亚砜(3ml)，混匀藻体，于温度为40℃、频率为45KHz、功率为1000W的条件下超声30分钟，再在频率为130KHz，功率为600W的条件下超声30分钟，超声完后将孔板在在5000转/分钟转速下离心3分钟，将上清转至另一微孔板中并稀释，酶标仪中测定490nm处的吸光度值。按实施例2所述的公式计算得虾青素的含量为49.98±0.28mg/L，同时，按GB/T 31520法测得虾青素含量为51.83±0.76mg/L，与GB/T 31520法相比，微孔板法提取率为96.43％。
实施例5
本实施例所用雨生红球藻(Haematococcus pluvialis UTEX 2505)培养同实施例3。取2ml培养液至置于12孔聚丙烯材质的微孔板中(孔容积为6.9ml)，在3000转/分钟转速下离心3分钟后弃上清。向孔板中加入2倍培养液体积的二甲基亚砜(4ml)，混匀藻体，于温度为45℃、频率为40KHz、功率为500W的条件下超声40分钟，再在频率为150KHz，功率为500W下超声25分钟，超声完后将孔板在5000转/分钟转速下离心3分钟，将上清转至另一微孔板中并稀释，酶标仪中测定490nm处的吸光度值。按实施例2所述的公式计算得虾青素的含量为50.74±0.78mg/L，同时，按GB/T 31520法测得虾青素含量为51.83±0.76mg/L，与GB/T31520法相比，微孔板法提取率为97.9％。
实施例6
本实施例所用雨生红球藻(Haematococcus pluvialis UTEX 2505)培养同实施例3。取2ml培养液置于12孔聚丙烯材质的微孔板中(孔容积为6.9ml)，在3000转/分钟转速下离心3分钟后弃上清。向孔板中加入2.5倍培养液体积的二甲基亚砜(6ml)，混匀藻体，于温度为50℃、频率为35KHz、功率为100W的条件下超声50分钟，再在频率为180KHz，功率为1000W下超声20分钟，超声完后将孔板在在5000转/分钟转速下离心3分钟，将上清转至另一微孔板中并稀释，酶标仪中测定490nm处的吸光度值。按实施例2所述的公式计算得虾青素的含量为51.71±0.29mg/L，同时按GB/T 31520法测得虾青素含量为51.83±0.76mg/L，与GB/T 31520法相比，微孔板法提取率为99.77％。
实施例7
本实施例所用雨生红球藻(Haematococcus pluvialis UTEX 2505)培养同实施例3。取2ml培养液置于12孔聚丙烯材质的微孔板中(孔容积为6.9ml)，在3000转/分钟转速下离心3分钟后弃上清。向孔板中加入2.5倍培养液体积的二甲基亚砜(5ml)，混匀藻体，于温度为60℃、频率为25KHz、功率为50W下超声60分钟，再在频率为200KHz，功率为1500W下超声10分钟，超声完后将孔板在在5000转/分钟转速下离心3分钟，将上清转至另一微孔板中并稀释，酶标仪中测定490nm处的吸光度值。按实施例一所述的公式计算得虾青素的含量为48.46±0.67mg/L，同时，按GB/T 31520法测得虾青素含量为51.83±0.76mg/L，与GB/T31520法相比，微孔板法提取率为93.5％。
实施例8
本实施例所用藻株为雨生红球藻(Haematococcus pluvialis UTEX 2505)，发酵液培养基、种子液培养基及种子液培养过程同实施例2。按12％接种量将种子液接种于装有200ml发酵培养基、容量为500ml三角瓶中，于温度为25℃、光照强度为2500lux的条件下培养至藻种处于对数末期，加入终浓度为3g/L的醋酸钠、0.3g/L的七水合硫酸亚铁和6g/L的氯化钠，于光照强度为10000lux光照条件下促使虾青素积累，12天后获得培养液。取2ml培养液于12孔的包含聚苯乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯、聚氯乙烯材质的微孔板中(孔容积为6.9ml)，在3000转/分钟转速下离心3分钟后弃上清。向孔板中加入2倍培养液体积的二甲基亚砜(4ml)，混匀藻体，于温度为50℃、频率为28KHz、功率为500W的条件下超声30分钟，再在频率为130KHz，功率为1000W的条件下超声10分钟，超声完后将孔板在5000转/分钟转速下离心3分钟，将上清转至另一微孔板中并稀释，酶标仪中测定490nm处的吸光度值。
按实施例2所述的公式计算得虾青素的含量，同时，按GB/T 31520法测得虾青素含量为58.14±0.52mg/L。不同材质微孔板所提取测定虾青素的含量以及与GB/T 31520法相比的提取率结果如表1所示。
表1不同材质微孔板提取虾青素的含量
材质 聚苯乙烯 聚丙烯 聚四氟乙烯 聚氯乙烯
虾青素含量(mg/L) 46.79±0.62 56.97±0.76 42.15±0.85 40.42±0.72
提取比率 80.48％ 97.99％ 72.50％ 69.52％
实施例9
本实施例所用雨生红球藻(Haematococcus pluvialis UTEX 2505)培养同实施例8，收集部分培养液离心，藻体清洗后冷冻干燥获得藻粉。
酸法：称取10mg干燥藻粉，加入2ml浓度为2mol/L的HCl，在温度为40℃条件下水浴30分钟，冷却后于转速为6000转/分钟的条件下离心3分钟弃上清。藻体沉淀用2ml蒸馏水洗涤两次后加入DMSO：丙酮＝1:5的混合溶剂8ml左右，将离心管涡旋震荡1分钟。于转速为6000转/分钟的条件下离心3分钟使细胞物质沉淀，将上清液转入25ml容量瓶中。沉淀用DMSO：丙酮溶液抽提3次，合并至25ml容量瓶中，于490nm处测定吸光值。
机械破壁法：称取10mg干燥藻粉，放入研钵内研磨5分钟，用DMSO：丙酮＝1:5清洗研磨后的藻粉，反复清洗研钵3-4次，并将溶剂与藻细胞全部转移至离心管中，离心管中的总体积在8ml左右，将离心管涡旋震荡1分钟。于转速为6000转/分钟的条件下离心5分钟使细胞物质沉淀，将上清液转入25mL容量瓶中。沉淀用DMSO：丙酮溶液抽提3次，合并至25ml容量瓶中，于490nm处测定吸光值。
碱法：取出10ml藻液于转速为5000转/分钟的条件下离心5分钟弃上清，加入5％氢氧化钠+30％甲醇的混合液，放置于温度为70℃的条件下水浴5分钟，离心弃去上清液收集到藻体，重复一次上述步骤。含虾青素的藻细胞保留在离心管中，之后再加入10ml二甲基亚砜(DMSO)在温度为70℃的条件下恒温水浴保温5分钟，离心后将上清液转移至容量瓶中，重复抽提3次。合并至25ml容量瓶中，于490nm处测定吸光值。
微孔板一步超声提取法：取2ml培养液于12孔的聚丙烯材质的微孔板中(孔容积为6.9ml)，于转速为3000转/分钟的条件下离心3分钟弃上清。向孔板中加入2.5倍培养液体积的二甲基亚砜(5ml)，混匀藻体，于温度为60℃、频率为28KHz、功率为300W的条件下超声60分钟，超声完后将孔板在于转速为5000转/分钟的条件下离心3分钟，将上清转至另一微孔板中并稀释，酶标仪中测定490nm处的吸光度值。
微孔板提取虾青素的方法同实施例8。不同提取方法与GB/T 31520法相比的提取比率及虾青素含量如表2所示。
表2不同方法提取雨生红球藻虾青素的含量
实施例10
本实施例所用藻株为雨生红球藻(Haematococcus pluvialis UTEX 2505)。
种子液培养基包括如下含量的原料：
硝酸钠150mg/L；磷酸二氢钾100mg/L；磷酸氢二钾75mg/L；七水合硫酸镁75mg/L；二水合氯化钙20mg/L；乙二胺四乙酸二钠20mg/L；柠檬酸铁铵4mg/L及微量元素，微量元素含量及pH值同实施例1。另外加入0.2g/L的异抗坏血酸钠，0.8g/L的半胱氨酸盐酸盐和0.8g/L的抗坏血酸钠。
发酵培养基包括如下含量的原料：
三水合醋酸钠1.5g/L；硝酸钠0.7g/L；谷氨酸钠0.2g/L；六水合氯化镁0.1g/L；柠檬酸铁铵4mg/L；二水合氯化钙0.02g/L；碳酸钠0.8g/L及微量元素，微量元素含量及pH值同实施例1。另外加入0.4g/L的异抗坏血酸钠，1.0g/L的半胱氨酸盐酸盐和0.8g/L的抗坏血酸钠。
将灭菌后的种子液培养基加入聚丙烯材质的微孔板中，微孔板选用(孔数/单孔容积ml)6/16、12/7、24/3、48/2、48/5、24/10的规格，每孔中装入的培养液体积为单孔容积的1/4-2/3。按8％接种量将藻种接种于微孔板中，于温度为20-28℃、光照强度为600-900lux、湿度为98％的条件下培养，每隔8小时在转速为100转/分钟的条件下振荡2分钟或用移液器吸打混匀培养液，将混匀后的微孔板放入酶标仪中测定培养液的OD600吸光度，培养至藻种处于对数期获得种子液。按8％接种量将种子液接种至装有灭菌发酵培养基的同等规格的微孔板中，于温度为20-28℃、光照强度为600-900lux、湿度为98％的条件下培养，每隔8小时在100转/分钟的条件下振荡2分钟或用移液器吸打混匀培养液，将混匀后的微孔板放入酶标仪中测定培养液的OD600吸光度，培养至藻种处于对数末期。向每个孔中加入终浓度为3g/L的醋酸钠、0.6g/L的七水合硫酸亚铁和7g/L氯化钠，置于温度为20℃-28℃，光照强度为8000-10000lux的条件下促使虾青素积累，10天后获得培养液。诱导完成后，在转速为3000转/分钟的条件下离心3分钟弃上清，在微孔板中加入1倍培养液体积的二甲基亚砜混匀，先在温度为50℃，频率为40KHz，功率为500W的条件下超声30分钟，再在频率为100KHz、功率为800W的条件下超声15分钟。超声后于转速为5000转/分钟的条件下离心3分钟，将上清转至另一微孔板中，于490nm测定虾青素含量。用微孔板在不同培养条件下培养雨生红球藻获得的生物量和虾青素含量见表3。
表3不同培养条件下微孔板中的生物量和虾青素含量
实施例11
本实施例所用藻株为雨生红球藻(Haematococcus pluvialis UTEX 2505)。
种子液培养基包括如下含量的原料：
硝酸钠100mg/L；磷酸二氢钾250mg/L；磷酸氢二钾50mg/L；七水合硫酸镁150mg/L；二水合氯化钙10mg/L；乙二胺四乙酸二钠100mg/L；柠檬酸铁铵2mg/L及微量元素，微量元素包括含量均为0.05μM的钴盐、铜盐、钼盐、镍盐、碘盐，含量均为0.01μM的钒盐、钨盐、铬盐，0.1μM的锌盐和1.0μM的锰盐，调节pH值＝6.8。
发酵培养基包括如下含量的原料：
三水合醋酸钠1g/L；硝酸钠1.6g/L；谷氨酸钠0.1g/L；六水合氯化镁0.8g/L；柠檬酸铁铵2mg/L；二水合氯化钙0.05g/L；碳酸钠0.2g/L及微量元素，微量元素及pH值同种子液培养基。
取两组48孔微孔板(每孔容积5ml)分别加入2/3体积的种子液培养基，其中一组板作为空白对照组，另外一组孔板中额外加入终浓度为0.4g/L的异抗坏血酸钠，1.0g/L的半胱氨酸盐酸盐和0.6g/L的抗坏血酸钠作为实验组。按15％接种量将藻种接种于微孔板中，于温度为25℃、光照强度为700lux、湿度99％的条件下培养，每隔8小时在转速为100转/分钟的条件下振荡2分钟或用移液器吸打混匀培养液，将混匀后的微孔板放入酶标仪中测定培养液的OD600吸光度，培养至对数期获得种子液。取两组相同规格的微孔板分别加入2/3体积的发酵培养基，其中一组板中额外加入终浓度为0.5g/L的异抗坏血酸钠，1.4g/L的半胱氨酸盐酸盐和0.6g/L的抗坏血酸钠。按10％接种量分别对应的将种子液接种至空白组和实验组的孔板中，于温度为25℃、光照强度为850lux、湿度99％的条件下培养，每隔8小时在转速为100转/分钟的条件下振荡2分钟或用移液器吸打混匀培养液，将混匀后的微孔板放入酶标仪中测定培养液的OD600吸光度，培养至对数末期。向每个孔中加入终浓度为1.5g/L的醋酸钠、0.5g/L的七水合硫酸亚铁和10g/L氯化钠，置于温度为25℃，光照强度为10000lux的条件下促使虾青素积累，10天后获得培养液。分别测定两组微孔板的中央位置和边缘位置处培养液的生物量和虾青素含量。空白对照组中央4个孔的培养液的溶氧平均值为96.3±2.5％，虾青素平均含量为45.36±1.53mg/L，边缘位置处培养液的溶氧平均值为73.8±1.85％，虾青素平均含量为54.68±1.81mg/L，中央位置的虾青素含量是边缘位置的83.0％。加异抗坏血酸钠、抗坏血酸钠和半胱氨酸盐酸盐的实验组有利于维持和控制培养液中的溶氧浓度稳定，中央4个孔培养液的溶氧平均值为66.8±3.1％，虾青素平均含量为59.93±1.58mg/L，边缘位置处培养液的溶氧平均值为65.4±2.9％，虾青素平均含量为60.58±1.64mg/L，中央位置的生物量是边缘位置的98.9％，培养结果相近。
实施例12
本实施例所用藻株为雨生红球藻(Haematococcus pluvialis UTEX 2505)。
种子液培养基包括如下含量的原料：
硝酸钠300mg/L；磷酸二氢钾50mg/L；磷酸氢二钾150mg/L；七水合硫酸镁50mg/L；二水合氯化钙80mg/L；乙二胺四乙酸二钠10mg/L；柠檬酸铁铵10mg/L及微量元素，微量元素包括含量均为0.05μM的钴盐、铜盐、钼盐、镍盐、碘盐；含量均为0.01μM的钒盐、钨盐、铬盐；含量为0.1μM的锌盐和1.0μM的锰盐；调节pH值为6.8。
发酵培养基包括如下含量的原料：
三水合醋酸钠3g/L；硝酸钠0.4g/L；谷氨酸钠1.0g/L；六水合氯化镁0.05g/L；柠檬酸铁铵10mg/L；二水合氯化钙0.01g/L；碳酸钠0.6g/L及微量元素；微量元素同种子液培养基；调节pH值＝6.8。
将灭菌后的种子液培养基加入三组聚苯乙烯材质的微孔板中，微孔板选用24孔(每孔5ml)的规格，每孔中装入的培养液体积为单孔容积的2/3。按20％接种量将藻种接种于微孔板中，于温度为28℃、湿度为100％的条件下培养，每隔8小时在转速为100转/分钟的条件下振荡2分钟或用移液器吸打混匀培养液，将混匀后的微孔板放入酶标仪中测定培养液的OD600吸光度，培养至藻种处于对数期获得种子液。按10％接种量将种子液接种至装有灭菌发酵培养基的同等规格的微孔板中，于温度为28℃，湿度为100％的条件下培养。其中第一组微孔板的种子液和发酵培养的光照强度为600lux；第二组微孔板的种子液和发酵培养的光照强度为1800lux；第三组微孔板的种子液和发酵培养的光照强度为1800lux，并且培养基中额外加入终浓度为0.3g/L的异抗坏血酸钠，1.6g/L的半胱氨酸盐酸盐和0.4g/L的抗坏血酸钠。每隔8小时在转速为100转/分钟的条件下振荡2分钟或用移液器吸打混匀培养液，将混匀后的微孔板放入酶标仪中测定培养液的OD600吸光度，培养至藻种处于对数末期。向每个孔中加入终浓度为5g/L的醋酸钠、0.4g/L的七水合硫酸亚铁和8g/L氯化钠，置于温度为28℃，光照强度为10000lux的条件下促使虾青素积累，10天后获得培养液。将培养液对应转移到另一同等规格的聚丙烯材质的多孔板中，在转速为3000转/分钟的条件下离心3分钟弃上清，在微孔板中加入1.5倍培养液体积的二甲基亚砜混匀，先在温度为50℃、频率为40KHz、功率为500W的条件下超声30分钟，再在频率为100KHz、功率为800W的条件下超声15分钟。超声后于转速为5000转/分钟的条件下离心3分钟，将上清转至另一微孔板中，于490nm测定虾青素含量。三组微孔板的中央4孔与边缘孔获得的平均虾青素含量(mg/L)如下：
第一组 第二组 第三组
中央4孔 50.35±0.72 53.12±0.47 60.38±0.66
边缘孔 52.62±0.43 61.33±0.39 64.87±0.56
中央/边缘 95.69％ 86.61％ 93.08％
由结果看出，增加光照强度使得微孔板培养雨生红球藻的中央孔与边缘孔的结果偏差增加，而加入异抗坏血酸钠、半胱氨酸盐酸盐和抗坏血酸钠后可以缩小偏差。

Claims (23)

1.基于微孔板的雨生红球藻筛选方法，其特征在于包括如下工艺步骤：
A、种子培养：将藻种接入微孔板内灭菌后的种子液培养基中，光照静置培养至藻种处于对数期获得种子液；
B、发酵培养：将步骤A中制备的种子液接入微孔板内灭菌后的发酵培养基中，光照静置培养至藻种处于对数末期获得发酵液；
C、促使虾青素积累：调整发酵液的培养条件促使虾青素积累；
D、虾青素的提取：虾青素积累完成后向微孔板内加入虾青素提取介质后混匀进行超声处理，超声处理的条件为：先在超声频率为25KHz-50KHz的条件下处理20-60分钟，再在超声频率为70KHz-200KHz条件下处理10-40分钟；
E、雨生红球藻的筛选：测定步骤D中产物的虾青素含量，依据虾青素含量测定结果筛选高产虾青素的雨生红球藻；
各步骤中的微孔板选用透光材质制作。
2.根据权利要求1所述的基于微孔板的雨生红球藻筛选方法，其特征在于微孔板选用48孔板、24孔板、12孔板或6孔板中的一种，微孔板的材质选用聚苯乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯、聚氯乙烯中的一种。
3.根据权利要求1或2所述的基于微孔板的雨生红球藻筛选方法，其特征在于微孔板的材质选用聚丙烯。
4.根据权利要求1所述的基于微孔板的雨生红球藻筛选方法，其特征在于步骤A中藻种的接种量为体积比＝8％-20％。
5.根据权利要求1所述的基于微孔板的雨生红球藻筛选方法，其特征在于步骤A中的种子培养的级数为至少一级。
6.根据权利要求5所述的基于微孔板的雨生红球藻筛选方法，其特征在于步骤A中的种子培养的级数为两级。
7.根据权利要求1所述的基于微孔板的雨生红球藻筛选方法，其特征在于步骤A、B中光照静置培养条件为温度20℃-28℃，光照强度600lux-900lux。
8.根据权利要求7所述的基于微孔板的雨生红球藻筛选方法，其特征在于步骤A、B中光照静置培养条件为湿度不低于96％。
9.根据权利要求1所述的基于微孔板的雨生红球藻筛选方法，其特征在于步骤A中的种子液培养基包括如下原料：
硝酸钠100mg/L-300mg/L；磷酸二氢钾50mg/L-250mg/L；磷酸氢二钾50mg/L-150mg/L；七水合硫酸镁50mg/L-150mg/L；二水合氯化钙10mg/L-80mg/L；乙二胺四乙酸二钠10mg/L-100mg/L；柠檬酸铁铵2mg/L-10mg/L及微量元素；微量元素包括含量均为0.05μM的钴盐、铜盐、钼盐、镍盐、碘盐，含量均为0.01μM的钒盐、钨盐、铬盐，含量均为0.1μM的锌盐和1.0μM的锰盐；种子液培养基的pH＝6.8。
10.根据权利要求1所述的基于微孔板的雨生红球藻筛选方法，其特征在于步骤B中藻种的接种量为体积比＝8％-15％。
11.权利要求1所述的基于微孔板的雨生红球藻筛选方法，其特征在于步骤B中的发酵培养基包括如下原料：
三水合醋酸钠1g/L-3g/L；硝酸钠0.4g/L-1.6g/L；谷氨酸钠0.1g/L-1g/L；六水合氯化镁0.05g/L-0.8g/L；柠檬酸铁铵2mg/L-10mg/L；二水合氯化钙0.01g/L-0.05g/L；碳酸钠0.1g/L-0.8g/L及微量元素；微量元素包括含量均为0.05μM的钴盐、铜盐、钼盐、镍盐、碘盐；含量均为0.01μM的钒盐、钨盐、铬盐；0.1μM的锌盐和1.0μM的锰盐；发酵培养基的pH＝6.8。
12.根据权利要求9或11所述的基于微孔板的雨生红球藻筛选方法，其特征在于步骤A、B中培养基的装量为微孔板中孔容积的1/4-2/3。
13.根据权利要求1、9或11中所述的基于微孔板的雨生红球藻筛选方法，其特征在于步骤A、B中的种子液培养基及发酵培养基中含有如下原料：
异抗坏血酸钠0.1g/L-0.5g/L；半胱氨酸盐酸盐0.6g/L-1.6g/L；抗坏血酸钠0.2g/L-0.8g/L。
14.根据权利要求1所述的基于微孔板的雨生红球藻筛选方法，其特征在于所述的步骤C中调整后发酵液的培养条件为温度22℃-26℃，湿度不低于96％。
15.根据权利要求1或14所述的基于微孔板的雨生红球藻筛选方法，其特征在于所述的步骤C中调整后发酵液的培养条件是采用在微孔板的孔内加入促进剂或进行光照培养中的一种或其结合的技术手段促使虾青素积累，促进剂选用终浓度为1.5g/L-6g/L的醋酸钠、0.3g/L-0.7g/L的七水合硫酸亚铁、5g/L-10g/L的氯化钠中的一种或其结合，光照强度为8000lux-10000lux。
16.根据权利要求1所述的基于微孔板的雨生红球藻筛选方法，其特征在于步骤D中超声温度为30℃-60℃，超声功率为50W-1500W。
17.根据权利要求1所述的基于微孔板的雨生红球藻筛选方法，其特征在于步骤D中虾青素积累完成后，采用高速离心后弃上清。
18.根据权利要求17所述的基于微孔板的雨生红球藻筛选方法，其特征在于步骤D中的高速离心的条件是转速为3000转/分钟，时间为3分钟。
19.根据权利要求1、16-18任一项所述的基于微孔板的雨生红球藻筛选方法，其特征在于步骤D中的虾青素提取介质选用二甲基亚砜，二甲基亚砜的加入量为培养液体积的1-3倍。
20.根据权利要求1所述的基于微孔板的雨生红球藻筛选方法，其特征在于所述的步骤A、B中藻种生长时期的测定是将培养液混匀后的微孔板放入酶标仪中测定培养液的OD600吸光度。
21.根据权利要求1所述的基于微孔板的雨生红球藻筛选方法，其特征在于所述的步骤E中虾青素含量的测定是将步骤D中的产物高速离心后，将上清转至另一微孔板中，采用酶标仪490nm波长进行。
22.根据权利要求21所述的基于微孔板的雨生红球藻筛选方法，其特征在于步骤E中测定虾青素含量时虾青素浓度为12mg/L-160mg/L。
23.根据权利要求21或22所述的基于微孔板的雨生红球藻筛选方法，其特征在于所述的步骤E中的高速离心的条件是转速为5000转/分钟，时间为3分钟。
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