JP4061415B2 - 固定化用担体、固定化酵素製剤及びその製造方法 - Google Patents
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Description
【発明が属する技術分野】
本発明は、固定化用担体、固定化酵素製剤及びその製造方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
従来、生理活性物質、とりわけ酵素、例えば、コレステロールをコレスト−5−エン−3−オン(コレステノン)に変換する際に使用する、コレステロールオキシダーゼ(以下「COD」ともいう)は、例えば Sepharose 4B のようなポリマーに固定化された形態で使用されている。このような固定化酵素製剤は、水系の反応系ではCOD活性を発揮するが、非水系有機溶剤中では酵素活性を殆ど又は全く発揮しない。CODの基質であるコレステロールは、本来脂溶性であるため、水系での反応効率は悪い。従って、酵素等の生理活性物質を固定化して、有機溶剤中でもその生理活性を充分に発揮させることができる生理活性物質固定化用担体、それを利用した生理活性物質固定化製剤の開発が望まれている。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、有機溶剤中でもその生理活性を充分に発揮させることができる生理活性物質固定化用担体、それを利用した固定化製剤、特に固定化酵素製剤、及びその製造方法を提供することである。
【0004】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ノニオン界面活性剤で処理されてなることを特徴とする生理活性物質固定化用担体を提供するものである。
好ましい担体は、アルキル化シリカゲルであり、好ましいノニオン界面活性剤は、ショ糖脂肪酸エステルである。また好ましい生理活性物質は、酵素、抗体、レクチン、およびレセプターからなる群から選ばれる少なくとも1種である。
本発明はまた、酵素が、上記生理活性物質固定化用担体に吸着保持されていることを特徴とする固定化酵素製剤を提供するものである。
好ましい酵素としては、コレステロールオキシダーゼが挙げられる。
本発明はまた、担体を酵素吸着剤処理し、該酵素吸着剤処理された担体に酵素を吸着保持せしめることを特徴とする固定化酵素製剤の製造方法を提供するものである。
本発明の方法において、好ましくは、酵素吸着剤処理された担体の懸濁液と、酵素溶液を混合することにより酵素を担体に吸着保持せしめる。
また、担体の懸濁液と酵素吸着剤の溶液とを混合し、加圧下で攪拌処理することにより、担体を酵素吸着剤で処理することも好ましい。
【0005】
【発明の実施の形態】
本発明に使用する担体としては、固定化酵素製剤の担体として使用されているもの、例えば、シリカゲル、けいそう土、セライト、ゼオライト、多孔性ガラス、イオン交換樹脂等が挙げられる。これらのうち、シリカゲル、とりわけアルキル化シリカゲル、特に長鎖アルキル化シリカゲル、又はシクロデキストリン結合アルキル化シリカゲルが好ましい。アルキル基としては、炭素数8〜18程度のもの、例えば、オクタデシル基やオクチル基等が好適である。
【0006】
本発明に使用する酵素吸着剤としては、ノニオン界面活性剤が好ましく、例えば、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、脂肪酸モノグリセリド、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、マンニトールジアルキルエーテル、ソルビトールジアルキルエーテル、グリセリンモノアルキルエーテル等が挙げられる。これらのうち、ショ糖脂肪酸エステル、特に炭素数12〜18の脂肪酸のエステル、例えば、ショ糖パルミチン酸エステル、ショ糖ステアリン酸エステル、ショ糖ラウリン酸エステル等が好ましい。
【0007】
本発明の、酵素吸着剤で処理した担体は、処理前の担体100重量部に対して好ましくは10〜50重量部、さらに好ましくは20〜40重量部の酵素吸着剤を含むものである。本発明の、酵素吸着剤で処理した担体は、例えば、処理前の担体の懸濁液(例えば、メタノール水懸濁液)と酵素吸着剤の溶液(例えば、水溶液)を混合し、加圧下(例えば、100〜500kg/cm2、好ましくは300〜400kg/cm2)で、10〜40℃で、10〜20時間、好ましくは12時間〜16時間攪拌混合することにより製造できる。
【0008】
本発明の固定化酵素製剤の酵素としては、任意の酵素が使用できるが、好ましいものとしては、COD(例えば、微生物由来の東洋紡(株)製造のCOD)及びリパーゼが挙げられる。
酵素吸着剤で処理した担体に酵素を吸着保持させるには、例えば、酵素吸着剤で処理した担体を、リン酸緩衝液等に懸濁し、リン酸緩衝液や酢酸アンモニウム緩衝液等に溶解した酵素(例えば、CODのリン酸緩衝液、リパーゼの酢酸アンモニウム緩衝液)と接触させ、吸着させる。接触は、通常は液温0〜10℃、好ましくは0〜4℃で、12時間以上、好ましくは15時間以上攪拌混合すればよい。酵素吸着剤で処理した担体に対する酵素の担持量は、担体100重量部に対して5〜20重量部程度が好ましく、酵素の量が20重量部を越えると、吸着率が低下する。
【0009】
こうして得られた本発明のCOD固定化酵素製剤を使用して、非水系有機溶剤中でコレステロールをコレスト−5−エン−3−オン(コレステノン)に変換する際に使用する溶剤としては、ヘキサン、イソオクタン等の炭化水素系溶剤、酢酸エチル、クロロホルム、アルコール系の溶剤等が挙げられる。しかし、ショ糖脂肪酸エステルで被覆した長鎖アルキル化シリカゲルから調製したCOD固定化酵素製剤を、非水系有機溶剤中で反応させる際には、ヘキサン、イソオクタン等の炭化水素系溶剤が好ましく、酢酸エチル、クロロホルム、及びアルコール系の溶剤は、酵素吸着剤としてのショ糖脂肪酸エステルの脱着が起こるため好ましくない。
また、こうして得られた本発明のリパーゼ固定化酵素製剤を使用して、非水系有機溶剤中でエステル分解またはエステル合成を行う際に使用する溶剤としては、ヘキサン、イソオクタン等の炭化水素系溶剤、酢酸エチル、クロロホルム、アルコール系の溶剤等が挙げられる。
【0010】
【発明の効果】
本発明の固定化酵素製剤は、酵素を、酵素吸着剤で処理した担体(例えば、ショ糖脂肪酸エステルで被覆した長鎖アルキル化シリカゲル、又はシクロデキストリン結合アルキル化シリカゲル)と共に時間をかけて充分接触させ、吸着させているため、非水系有機溶剤中で使用しても酵素活性を充分に発揮させることができる。
【0011】
実施例1、2、比較例1
担体(オクタデシルシリカゲル)(以下「ODS」と略す)10gを、50%メタノール水溶液中に懸濁し、これに酵素吸着剤(ショ糖パルミチン酸エステル)2.5gを水50mlに溶解したものを加え振とうした。これをパッカー(内容積15mlのステンレス製の筒)内に入れ、50%メタノール水溶液を用いて、表1に示す圧力下、温度20℃で16時間定圧通液(リサイクル)した。ろ過して懸濁物を回収し、50%メタノール水溶液で洗浄後、乾燥し、生成したショ糖脂肪酸エステルを吸着させたODSの重量(A)を求めた。ろ液から回収したショ糖パルミチン酸エステルの重量から、吸着したショ糖パルミチン酸エステルの重量(B)を求め、ショ糖パルミチン酸エステルの吸着率を次式より求めた。
吸着率(%)=B/A×100
更に、酵素吸着剤を吸着させたODS0.1 gをヘキサン5ml中に懸濁し、温度20℃で6時間攪拌した後、溶出したショ糖パルミチン酸エステルの重量(C)を測定し、吸着しているショ糖パルミチン酸エステルが溶出してくる割合(C/B×100)を求め、脱着率とした。結果を表1に示す。
【0012】
【表1】
比較例1に示すように、1kg/cm2 の圧力下では、ショ糖パルミチン酸エステルの吸着率は低く、脱着率は高いのに対して、実施例1及び2に示すように、400kg/cm2 以上の圧力下では、ショ糖パルミチン酸エステルの吸着率は高く、脱着率は極めて低くなる。
【0013】
実施例3〜6
実施例1で得られた、酵素吸着剤を吸着させたODS0.56gをリン酸緩衝液(pH7.0)10ml中に分散し、氷冷下で、リン酸緩衝液3mlに溶解したCODを0.05g、0.1g、0.25g、0.5g加え、一昼夜(15時間)攪拌した。生成物(固定化酵素製剤)をろ過し、同一溶媒で洗浄後、乾燥して秤量した。ろ液中のCOD量を分光学的に求め、CODの吸着率を求めた。結果を表2に示す。
【0014】
【表2】
【0015】
試験例1〜7
基質であるコレステロール(10μ mol)に、実施例5で得られた本発明の固定化酵素製剤0.1gを添加し、溶媒としてメタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトニトリル、酢酸エチル、又はヘキサンを用いて、40℃で10分間反応させた。また、固定化していないCODを用いて、同様にヘキサン中で反応を行った(試験例7)。生成するコレステノンをHPLCにより定量し、収率を求めた。結果を表3に示す。
【0016】
【表3】
実施例5で得られた本発明の固定化酵素製剤は、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトニトリル中では酵素活性が低いが、酢酸エチル、又はヘキサン中では酵素活性が高い。しかし、固定化していないCODは、ヘキサン中で酵素活性を全く発揮しないことがわかる。
【0017】
試験例8〜12
試験例6で使用した固定化酵素製剤を、濾過、又は吸引濾過で回収し、試験例6と同一の条件で、酵素反応に用いる操作を繰り返し、生成するコレステノンを同様に定量した。結果を表4に示す。
【表4】
本発明の固定化酵素製剤は、繰返し使用しても、高い酵素活性を維持することがわかる。
【0018】
実施例7〜9
実施例1で得られた、酵素吸着剤を吸着させたODS0.4 gを酢酸アンモニウム緩衝液(pH5.6)10ml中に分散し、氷冷下で、酢酸アンモニウム緩衝液10mlに溶解したリパーゼ( 東洋紡績株式会社製、商品名LPL−311) を0.05g、0.1 g、0.2 g加え、一昼夜 (20時間) 攪拌した。濾過にて回収し、洗浄後乾燥して秤量した。回収したリパーゼ量を分光学的に求め、吸着したリパーゼ量を吸着率として算出した。結果を表5に示す。
【0019】
【表5】
【0020】
試験例13〜19
基質である(±)−フェニルエタノール(50mM/0.1ml=5μmol)に、実施例7で得られた本発明の固定化酵素製剤0.02gを添加し、溶媒としてエメタノール、イソプロパノール、クロロホルム、酢酸エチル、ヘキサン、又はイソオクタンを用いて、40℃で10分間反応させ、生成するエステルをHPLCにより定量して、反応率を求めた。また、固定化していないリパーゼを用いて、同様にイソオクタン中で反応を行った(試験例19)。結果を表6に示す。
【0021】
【表6】
実施例7で得られた本発明の固定化リパーゼ製剤は、すべての溶剤中で高い酵素活性を示すのに対して、固定化していないリパーゼはイソオクタン中で酵素活性を全く発揮しないことがわかる。
【0022】
試験例20〜24
試験例18で使用した固定化リパーゼ製剤を、濾過、又は吸引濾過で回収し、試験例18と同一の条件で、酵素反応に用いる操作を繰り返し、生成するエステルを同様に定量した。結果を表7に示す。
【表7】
本発明の固定化酵素製剤は、繰返し使用しても、高い酵素活性を維持することがわかる。
Claims (12)
- 100〜500 kg/cm 2 の加圧下でノニオン界面活性剤と混合し、攪拌処理されてなることを特徴とする生理活性物質固定化用担体。
- 担体がアルキル化シリカゲルである請求項1記載の生理活性物質固定化用担体。
- ノニオン界面活性剤がショ糖脂肪酸エステルである請求項1又は2記載の生理活性物質固定化用担体。
- 生理活性物質が、酵素、抗体、レクチン、およびレセプターからなる群から選ばれる少なくとも1種である請求項1〜3のいずれか1項記載の生理活性物質固定化用担体。
- 担体を、100〜500 kg/cm 2 の加圧下でノニオン界面活性剤と混合し、攪拌処理することを特徴とする生理活性物質固定化用担体の製造法。
- 担体がアルキル化シリカゲルである請求項5記載の生理活性物質固定化用担体の製造法。
- ノニオン界面活性剤がショ糖脂肪酸エステルである請求項5又は6記載の生理活性物質固定化用担体の製造法。
- 生理活性物質が、酵素、抗体、レクチン、およびレセプターからなる群から選ばれる少なくとも1種である請求項5〜7のいずれか1項記載の生理活性物質固定化用担体の製造法。
- 請求項1〜4のいずれか1項記載の生理活性物質固定化用担体に酵素が吸着保持されていることを特徴とする固定化酵素製剤。
- 酵素がコレステロールオキシダーゼまたはリパーゼである請求項9記載の固定化酵素製剤。
- 請求項1〜4のいずれか1項記載の生理活性物質固定化用担体の懸濁液と、酵素溶液を混合することにより酵素を担体に吸着保持せしめることを特徴とする請求項10記載の固定化酵素製剤の製造方法。
- 酵素がコレステロールオキシダーゼまたはリパーゼである請求項11記載の固定化酵素製剤の製造方法。
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