JP3809686B2 - 固定化酵素による配糖体の製造方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、固定化酵素を用いた各種配糖体の製造方法に関するものである。詳しく述べると、本発明は、有機溶媒共存下において、多孔質キトサンビーズに固定化したα−グルコシダーゼを用いて、水酸基を有する水に難溶な生理活性に優れた物質と糖とを反応させることにより、生理活性に優れた様々な水溶性配糖体を製造する方法に関するものである。また、本発明は、バチルス ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophylus,以下同様につき括弧内を省略する）由来のα−グルコシダーゼを多孔質キトサンビーズに固定化することにより、有機溶媒共存下においても長期間安定である固定化酵素を調製し、該固定化酵素を用いて、生理活性および化学的安定性に優れた水溶性配糖体を製造する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、食品や化粧品等の分野においては糖転移作用を触媒する酵素を利用して生理活性に優れた物質等を製造する技術が注目されている。
【０００３】
上記糖転移作用を有する代表的な酵素としてはα−グルコシダーゼがあるが、このα−グルコシダーゼは、α−グルコシド結合を持つ基質の非還元末端側から加水分解し、α−グルコースを生成する加水分解酵素（エキソグリコシダーゼ）の総称であるが、一方で、糖転移作用を触媒する酵素であることは既に知られている。α−グルコシダーゼの糖転移作用を利用して有用物質を製造する方法としては、例えば、α−１，６−グルコシド結合反応を触媒するα−グルコシダーゼをマルトースに作用させるとイソマルトースやパノース等の分枝オリゴ糖を生成することが知られている［澱粉科学，２６巻，頁５９〜６７（１９７９年）］。
【０００４】
一方、酵素の使い捨てによる不経済性及び酵素の安定性の確保等の観点から、水溶性の酵素を水不溶性の担体などに固定化することにより、酵素反応工程を連続化し、酵素を繰り返して使用する研究が進展し、既に実用化されているものもある。しかしながら、高い酵素活性を保ちかつ安定で、また汎用性の広い酵素の固定化法は未だ開発されていないのが現状である。
【０００５】
このような酵素の固定化法としては、これまで、担体結合法、架橋法、及び包括法等が知られている。また、担体としては、セルロース、澱粉、寒天、アルギン酸ソーダ及びゼラチンなどの天然高分子、またはそれらの誘導体、あるいはポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、ポリアミノポリスチレン及びポリビニルアルコール等の合成高分子等の有機物、さらには、粘土、アルミナ、ガラス、セラミック及びステンレス等の無機物等が用いられている。従来から、食品や化粧品等の分野においては、弱塩基性アニオン交換樹脂、弱酸性カチオン交換樹脂等のイオン交換樹脂や多孔質の合成吸着樹脂等を利用した固定化法が広く用いられていた。さらに、これらの方法に加えて、近年、キチンやキトサンが新しい素材として魅力のある天然高分子資源として期待され研究されてきたことに伴い、キトサンビーズを応用した固定化法が注目を集めている。キトサンビーズに固定化した酵素を用いて有用物質を製造する方法としては、例えば、キトサンビーズを用いて固定化したシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼをマルトース等に作用させ転移糖を製造する技術が開示されている（特公平７−７１４８９号公報）。
【０００６】
しかしながら、上記方法を始めとして、一般に糖転移作用を触媒する酵素を用いて有用な物質を製造する場合、転移率の確保や酵素の安定性等の点からその反応は水溶液中で行われ、従って、その反応の基質となる物質もほとんどが水溶性の物質であり、水に難溶な物質は上記反応には基質として用いることが困難であるという問題があった。
【０００７】
このような従来の問題点を考慮して、本発明者らは、水酸基を有する水に難溶な生理活性に優れた物質を何らかの方法で水溶性にすることができれば、その物質の用途は飛躍的に拡大すると考え、糖転移作用を触媒する酵素を用いて、水酸基を有する水に難溶な抗酸化物質と糖とを有機溶媒の存在下において反応させることにより、新規な水溶性抗酸化剤を製造する技術を開発した（特開平７−１１８２８７号公報）。上記公報は、クロマノール配糖体を製造するにあたって有機溶媒中に溶解させた、下記一般式（２）：
【０００８】
【化２】
【０００９】
（ただし、式中、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 およびＲ4 は同一または異なる水素原子または低級アルキル基、Ｒ5 は水素原子、低級アルキル基または低級アシル基を表わし、およびｎは０〜４の整数である）で表わされる２−置換アルコール（以下、単に「２−置換アルコール」と称する）と、糖溶液とを糖転移作用を触媒する酵素の存在下で反応させることにより、下記一般式（３）：
【００１０】
【化３】
【００１１】
（ただし、式中、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 およびＲ4 は同一または異なる水素原子または低級アルキル基、Ｒ5 は水素原子、低級アルキル基または低級アシル基、Ｘは単糖残基またはオリゴ残基を表わし、糖残基の水酸基の水素原子は低級アルキル基または低級アシル基で置換されていてもよく、およびｎは０〜４の整数であり、ｍは１〜６の整数である）で示されるクロマノール配糖体を製造する方法を開示するものである。
【００１２】
しかしながら、上記方法は、酵素を糖溶液と２−置換アルコール溶液との混合溶液中に直接添加する方法であり、反応液中で酵素が溶液の状態で存在しているため、酵素の再使用ができず使い捨てとなってしまい、高価な酵素の使い捨てによる経済性の面から工業的に実施するには不充分であるという欠点があった。また、実際に工業化を考えた場合、反応液中の２−置換アルコールの濃度をさらに高め、かつ、転移率を上げる必要があるが、本発明者らの調査の結果、上記特開平７−１１８２８７号公報に開示される方法で用いられる酵素は、有機溶媒の濃度の増加に伴い安定性が減少することが明らかとなった。そのため、２−置換アルコールの量を増やすために反応系における有機溶媒の濃度を高めることは困難であり、有機溶媒存在下における酵素の安定性の面からも工業的に実施するには不充分であるという欠点を有するものであった。したがって、工業化に適するだけの転移率を達成し得る水溶性クロマノール配糖体の製造方法は十分確立されているとは言えないものであった。
【００１３】
さらに、糖転移反応を触媒する酵素をキトサンビーズに固定化した例は多数報告されているが、本発明によるα−グルコシダーゼをキトサンビーズに固定化した例はいまだ報告されていなかった。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明の目的は、新規な固定化酵素を用いた配糖体の製造方法を提供することである。
【００１５】
また、本発明の他の目的は、α−グルコシダーゼを多孔質キトサンビーズに固定化し、その固定化酵素を用いて水酸基を有する水に難溶性の生理活性に優れた物質と糖とを結合させ、水溶性の生理活性に優れた配糖体を効率よく製造する技術を提供することにある。
【００１６】
また、本発明のさらなる他の目的は、バチルス ステアロサーモフィラス由来のα−グルコシダーゼを多孔質キトサンビーズに固定化することにより、有機溶媒共存下において長期間安定な固定化酵素を調製し、該固定化酵素を用いて、化学的安定性及び生理活性に優れた配糖体を効率よく製造する技術を提供することにある。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記諸目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、多孔質キトサンビーズにα−グルコシダーゼを固定化することにより、該酵素が極めて効果的に担体上に吸着され、有機溶媒との共存下においても酵素の高活性が保持および発現されることを見い出した。さらに、本発明者らは、このようにして得られた固定化酵素を用いることにより、水酸基を有する水に難溶な物質についても糖と結合させて各種配糖体を有機溶媒との共存下においても効率よく製造することが可能であることを見い出した。
【００１８】
さらにまた、本発明者らは、上記目的を達成するためにさらに鋭意研究を重ねた結果、多孔質キトサンビーズにバチルス ステアロサーモフィラス由来のα−グルコシダーゼを固定化することにより、高濃度の有機溶媒の共存下においても、酵素の高活性が長期間保持および発現されることをも発見した。
【００１９】
これらの知見に基づいて、本発明を完成するに至った。
【００２０】
すなわち、上記諸目的は下記（１）から（７）のいずれかにより達成される。
【００２１】
（１） 多孔質キトサンビーズにα−グルコシダーゼを固定化させた固定化酵素を用いて、水酸基を有する水に難溶な生理活性に優れた物質と糖とを有機溶媒共存下において反応させ、生理活性に優れた水溶性配糖体を生成することを特徴とする各種配糖体の製造方法。
【００２２】
（２） 上記固定化酵素は多孔質キトサンビーズを架橋剤で架橋処理した後に酵素を固定化させたものである前記（１）記載の方法。
【００２３】
（３） 上記多孔質キトサンビーズの粒径が０．５〜３．０ｍｍである前記（１）または（２）記載の方法。
【００２４】
（４） α−グルコシダーゼの多孔質キトサンビーズ上への固定化量が、該多孔質キトサンビーズ１ｇ（湿重量）当たり、０．０１〜１００ｍｇである前記（１）から（３）いずれかに記載の方法。
【００２５】
（５） 上記配糖体が下記一般式（１）：
【００２６】
【化４】
【００２７】
［ただし、式中、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 およびＲ4 は同一または異なる水素原子または低級アルキル基を表わし、Ｒ5 は水素原子、低級アルキル基または低級アシル基を表わし、Ｘはグルコース残基（但し、グルコース残基中の水酸基の水素原子は炭素原子数が１〜８の低級アルキル基または炭素原子数が１〜１０の低級アシル基で置換されていてもよい）を表わし、ｎは０〜４の整数である］で表わされるクロマノール配糖体である前記（１）から（４）いずれかに記載の方法。
【００２８】
（６） 上記糖がα−グルコシル糖化合物である前記（１）から（５）いずれかに記載の方法。
【００２９】
（７） 上記α−グルコシダーゼがバチルス ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophylus) 由来である前記（１）から（６）いずれかに記載の方法。
【００３０】
【発明の実施の形態】
本発明の固定化酵素による配糖体の製造方法は、固定化担体としての多孔質キトサンビーズにα−グルコシダーゼを固定化させ、得られた固定化酵素を用いて有機溶媒共存下で水酸基を有する水に難溶な生理活性に優れた物質を糖と結合させることによって、生理活性に優れた水溶性の配糖体を生成することを特徴とするものである。
【００３１】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００３２】
本発明において固定化担体として用いられる多孔質キトサンビーズは、カニやエビなどの甲殻類の殻、蚕などの昆虫の甲皮、おきあみやいかなどの軟体動物の殻や骨骼由来のキチンを４０〜５０％水酸化ナトリウム溶液中で１００〜１２０℃、４〜５時間処理することによりキチンをＮ−脱アセチル化し、このＮ−脱アセチル化物を水洗、乾燥してキトサンを得、さらにこのようにして得られたキトサンを粒状化及び多孔質化して表面積を大きくして吸着能を高めることによって得られる。このような多孔質キトサンビーズの具体例としては、例えば、キトパール ＢＣＷ−２５１０、ＢＣＷ−２６１０、ＢＣＷ−３０１０、ＢＣＷ−３５１０（商品名；富士紡績株式会社製）等が挙げられる。
【００３３】
また、本発明において使用される多孔質キトサンビーズの粒径は、特に制限されないが、圧力損失や粒子表面積等を考慮すると、０．５〜３．０ｍｍが好ましく、さらに好ましくは、０．５〜１．５ｍｍである。
【００３４】
本発明によるα−グルコシダーゼとしては、ほぼ全ての起源由来のα−グルコシダーゼを用いることができ、精製酵素や粗酵素の別を問わない。具体例としては、東洋紡株式会社製のサッカロマイセス属(Saccharomyces sp.) 由来のα−グルコシダーゼ、オリエンタル酵母工業株式会社製のサッカロマイセス セロビイシエ(Saccharomyces cerevisiae)由来のα−グルコシダーゼ、天野製薬株式会社製のアスペルギルス ニガー(Aspergillus niger) 由来のα−グルコシダーゼ、和光純薬工業株式会社製のサッカロマイセス属(Saccharomyces sp.) 由来のα−グルコシダーゼ、シグマ（ＳＩＧＭＡ）社製のベーカーズ イースト（Ｂａｋｅｒｓ ｙｅａｓｔ）由来のα−グルコシダーゼ、東洋紡績株式会社製のバチルスステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophylus) 由来のα−グルコシダーゼ等のバチルス(Bacillus)属由来のα−グルコシダーゼなどが挙げられる。上記α−グルコシダーゼのうち、有機溶媒に対する優れた安定性および強い転移活性を考慮すると、バチルス ステアロサーモフィラス由来のα−グルコシダーゼ、特に特開平５−３０８９６４号に開示されたバチルス ステアロサーモフィラス由来のα−グルコシダーゼが好ましく使用される。
【００３５】
本発明による多孔質キトサンビーズの担体にα−グルコシダーゼを固定化させることにより固定化酵素を製造する方法としては、水または適当な緩衝液中で担体と酵素とを接触させる方法を用いることができる。以下に、多孔質キトサンビーズの担体としてキトパール ＢＣＷ−２５１０を用いた際の固定化方法の一実施態様を示す。キトパール ＢＣＷ−２５１０ １ｇ（湿重量）を１０〜１００ｍＭの各種緩衝液（ｐＨ５．０〜７．０）で充分に平衡化した後、担体１ｇ（湿重量）に対して、α−グルコシダーゼ０．０１〜１００ｍｇ（比活性２０単位／ｍｇ）、好ましくは１〜１００ｍｇ、より好ましくは５〜５０ｍｇを同緩衝液１ｍｌに溶解したものを添加し、充分に混合する。次いで、４〜６０℃、好ましくは１０〜４０℃にて、１〜２４時間、好ましくは２〜１５時間静置するか、または０．５〜１０時間、好ましくは１〜５時間往復振盪処理（５０〜１８０ｒｐｍ、好ましくは１００〜１４０ｒｐｍ）した後、濾紙またはガラスフィルターで濾過し、続いて水または緩衝液で酵素が溶出しなくなるまで洗浄する。なお、上記実施態様において、特に酵素としてバチルス ステアロサーモフィラス由来のα−グルコシダーゼを用いた際には、当該α−グルコシダーゼの添加量は、担体１ｇ（湿重量）に対して、０．０１〜１０ｍｇ（比活性６６１単位／ｍｇ）、好ましくは０．１〜１ｍｇである。
【００３６】
本発明において、α−グルコシダーゼの多孔質キトサンビーズの担体上への固定化量は、多孔質キトサンビーズの架橋処理の有無、使用する多孔質キトサンビーズの種類や量及び酵素の使用量等によって異なるが、通常、多孔質キトサンビーズ１ｇ（湿重量）当たり、０．０１〜１００ｍｇ、好ましくは１〜１００ｍｇ、より好ましくは５〜５０ｍｇである。また、本発明において、バチルス ステアロサーモフィラス由来のα−グルコシダーゼを使用する際の担体への固定化量は、通常、多孔質キトサンビーズ１ｇ（湿重量）当たり、０．０１〜１０ｍｇ、好ましくは０．１〜１ｍｇである。
【００３７】
上記実施態様において使用される緩衝液としては、生化学及び生物学の分野において一般的に使用される緩衝液であればよく、具体的には、炭酸−炭酸水素塩系、リン酸第一塩−リン酸第二塩系、及び両性イオンであるタンパク質やアミノ酸などの緩衝作用による緩衝液等が挙げられ、これらを目的とするｐＨによる適宜選択して使用する。
【００３８】
本発明において、多孔質キトサンビーズを用いて上記方法により本発明による固定化酵素を得ることができるが、この際、該固定化酵素をさらに改善することを目的として、多孔質キトサンビーズを架橋剤で前処理した担体を固定化担体として用いることが好ましい。このように架橋剤で前処理した担体を用いると、さらに有機溶媒共存下においてより高い糖転移活性を示す固定化酵素を得ることができるという利点がある。
【００３９】
本発明において用いられる架橋剤としては、キトサンビーズと接触したときにキトサンビーズのアミノ基と結合する能力を有するものであれば、特に制限されずに使用することができる。この場合、使用できる架橋剤の例としては、例えば、グルタルアルデヒド、エピクロロヒドリン、ビスジアゾベンシジン、ヘキサメチレンジイソシアネート、トルエンジイソシアネート、ヘキサメチレンジイソチオシアネート及びＮ，Ｎ−エチレンビスマレインイミド等が挙げられる。これらの架橋剤は、単独であるいは２種以上を組み合わせて用いることができる。これらのうち、グルタルアルデヒド及びエピクロロヒドリンが好ましい。
【００４０】
前処理の方法としては、水または上記した緩衝液中、担体に架橋剤を接触させる方法を用いることができる。架橋剤の濃度は、担体に対して、通常、０．０１〜５（ｖ／ｖ）％の範囲が好ましい。多孔質キトサンビーズの担体としてキトパール ＢＣＷ−２５１０をおよびグルタルアルデヒドを架橋剤として用いた際の前処理方法の一実施態様を以下に示す：キトパール ＢＣＷ−２５１０ １ｇ（湿重量）を２（ｖ／ｖ）％グルタルアルデヒド（以下、「ＧＬＡ」と略す）溶液２ｍｌ中に浸透させ、４〜４０℃、好ましくは１０〜３０℃にて、０．５〜３時間、好ましくは１〜２時間静置するか、または０．５〜３時間、好ましくは１〜２時間往復振盪処理（５０〜１８０ｒｐｍ、好ましくは１００〜１４０ｒｐｍ）した後、濾紙またはガラスフィルターで濾過し、過剰のＧＬＡを除去・洗浄する方法が挙げられる。
【００４１】
また、上記実施態様におけるα−グルコシダーゼの多孔質キトサンビーズ上への固定化量は、処理条件や使用する担体の種類等によって異なるが、例えば、ＧＬＡ処理したキトパールＢＣＷ−２５１０を固定化担体として用いる場合、キトパールＢＣＷ−２５１０ １ｇ（湿重量）に対して、上記と同様に緩衝液中で、０．０１〜１００ｍｇ、好ましくは１〜１００ｍｇ、より好ましくは５〜５０ｍｇである。特に上記態様において、α−グルコシダーゼとしてバチルス ステアロサーモフィラス由来のものを使用する際には、固定化量は、キトパールＢＣＷ−２５１０ １ｇ（湿重量）に対して、０．０１〜１０ｍｇ、好ましくは０．１〜１ｍｇである。酵素の固定化担体上への固定化処理は、ＧＬＡによる架橋処理と同様の条件で静置または振盪処理によって行なうことができる。この際、未吸着の酵素は、酵素の溶出がなくなるまで、濾紙またはガラスフィルターで洗浄を行なうことにより除去することができる。
【００４２】
上記のような方法により固定化した場合の見掛け上の固定化率（％）を、次式により算出した。
【００４３】
【数１】
【００４４】
また、酵素の固定化法としては、上記に述べたほかに、多孔質キトサンビーズ担体をカラムに充填した後、２（ｖ／ｖ）％ＧＬＡ溶液を２〜３時間通液させ、滅菌蒸留水で充分洗浄した後、酵素溶液を通液させることにより固定化する方法を採用することができる。
【００４５】
本発明による糖転移反応に使用される糖は、目的とする配糖体の種類などによって異なるが、例えば、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、コージビオース、ニゲロース、トレハロース、パノース、イソマルトース、及びイソマルトトリオース等が挙げられ、これらのうち、マルトースからマルトテトラオース位の低分子のマルトオリゴ糖が好ましく、特にマルトースが好ましい。また、糖の添加濃度は、１〜７０（ｗ／ｖ）％、好ましくは３０〜６０（ｗ／ｖ）％である。
【００４６】
本発明による固定化酵素を用いて製造される配糖体としては、使用される糖及び基質の種類によって様々であるが、例えば、各種クロマノール配糖体、フラボノール配糖体、フラバノン配糖体、フラボン配糖体、サポニン配糖体、及びカテキン配糖体等が挙げられ、これらのうち、好ましくは、特開平７−１１８，２８７号公報に開示されているような、下記一般式（１）：
【００４７】
【化５】
【００４８】
［ただし、式中、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 およびＲ4 は同一または異なる水素原子または低級アルキル基を表わし、Ｒ5 は水素原子、低級アルキル基または低級アシル基を表わし、Ｘはグルコース残基（但し、グルコース残基中の水酸基の水素原子は炭素原子数が１〜８の低級アルキル基または炭素原子数が１〜１０の低級アシル基で置換されていてもよい）を表わし、およびｎは０〜４の整数である］で表わされるクロマノール配糖体が挙げられる。この際、例えば、上記一般式（１）で表わされるクロマノール配糖体を製造する際には、下記一般式（２）：
【００４９】
【化６】
【００５０】
（ただし、式中、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 およびｎは、それぞれ、上記と同様である）で表わされる２−置換アルコールが基質として使用され、上記基質とマルトースからマルトテトラオース位のマルトオリゴ糖などの上述した糖を本発明による固定化酵素の存在下で反応させることによって、上記一般式（１）で表わされるクロマノール配糖体（以下、単に「クロマノール配糖体」と称する）が製造できる。
【００５１】
上記一般式（１）及び（２）において、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 およびＲ4 は、同一または異なる水素原子または低級アルキル基を表わすものであるが、低級アルキル基を表わす際には、炭素原子数が好ましくは１〜８、より好ましくは１〜６の低級アルキル基であり、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、及びオクチル基等が挙げられ、これらのうち、メチル基及びエチル基が好ましい。同様にして、Ｒ5 は、水素原子、低級アルキル基または低級アシル基を表わすものであるが、これらのうち、低級アルキル基を表わす際には、上記Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 およびＲ4 における場合と同様であり、また、低級アシル基を表わす際には、炭素原子数が好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜８の低級アシル基であり、例えば、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、バレリル基、イソバレリル基、ピバロイル基、ヘキサノイル基、及びオクタノイル基等が挙げられ、これらのうち、アセチル基及びプロピオニル基が好ましい。さらに、上記一般式（１）において、Ｘは、グルコース、またはグルコース残基中の水酸基の水素原子が炭素原子数が１〜８の低級アルキル基または炭素原子数が１〜１０の低級アシル基で置換されたもの等が挙げられ、これらのうち、グルコースが好ましく使用される。さらに、上記一般式（１）及び（２）において、ｎは０〜４、好ましくは０〜２の整数である。
【００５２】
本発明による糖転移反応に使用される基質としては、水酸基を有する水に難溶で生理活性に優れた物質であれば特に制限されず、目的とする配糖体の種類によって異なるが、例えば、上記一般式（２）で表わされる２−置換アルコール類、フラボノール、フラバノン、フラボン、サポゲニン、及びカテキン等が挙げられる。これらのうち、水酸基を有する水に難溶な抗酸化剤である、上記一般式（２）で表わされる２−置換アルコール（以下、単に「２−置換アルコール」と称する）が基質として好ましく使用される。この２−置換アルコールは、公知物質であり、特公平１−４３７５５号公報や特公平１−４９１３５号公報等に開示された方法により得ることができる。また、例えば、一般式（２）においてＲ1 、Ｒ2 、Ｒ3 及びＲ4 がＣＨ3 であり、Ｒ5 がＨであり、ｎが１である２−置換アルコールは、トロロックスを水素化リチウムアルミニウムの存在下においてジエチルエーテル中で加熱還流処理することなどにより容易に得ることができる。
【００５３】
本発明による固定化酵素を用いてクロマノール配糖体を製造する際には、２−置換アルコールを糖溶液に溶解させることが望ましい。また、上記製造工程においては、有機溶媒を共存させることが望ましく、この際添加される有機溶媒としては、例えば、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、メタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリルなどが挙げられる。これらのうち、α−グルコシダーゼの糖転移活性を高めることを考慮すると、ジメチルスルホキシド及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドが好ましい。添加する有機溶媒の濃度は、１〜５０（ｖ／ｖ）％であり、反応効率を考慮すると、５〜３５（ｖ／ｖ）％が好ましい。
【００５４】
上記実施態様において、基質としての２−置換アルコールの濃度は、反応液中において飽和濃度若しくはそれに近い濃度にすることが望ましく、特に、０．５〜１０（ｖ／ｖ）％の範囲内であることが望ましい。
【００５５】
本発明による反応条件としては、ｐＨが、４．５〜７．５、好ましくは５．０〜６．５であり、反応温度が、１０〜７０℃、好ましくは３０〜６０℃であり、さらには、反応時間が、１〜５０時間、好ましくは１〜４０時間、より好ましくは２〜２４時間である。特に、バチルス ステアロサーモフィラス由来のα−グルコシダーゼを使用する際の反応条件としては、ｐＨが、４．５〜７．５、好ましくは５．０〜７．５であり、反応温度が、１０〜７０℃、好ましくは３０〜７０℃であり、さらには、反応時間が、１〜５０時間、好ましくは２〜４０時間である。但し、これらの反応条件は使用する固定化酵素の種類や量等により影響を受ける。
【００５６】
本発明による固定化酵素を用いてクロマノール配糖体を製造する場合の製造方法は、特に限定されないが、例えば、固定化酵素をカラムに充填し、上記したようなｐＨおよび温度の反応条件下で、基質として２−置換アルコールおよび糖溶液の混合液をカラムに連続通液することにより、クロマノール配糖体を効果的に製造することができる。
【００５７】
または、本発明において調製された固定化酵素を反応液中に直接添加し、振盪等の方法を用いて、反応液中に固定化酵素を分散させながら反応を行うことによって、クロマノール配糖体を効率的に製造してもよい。
【００５８】
さらに、本発明による固定化酵素を用いて製造されるクロマノール配糖体（一般式（１））は、下記一般式（４）で表わされるもののほかに糖残基の異なるものも含む混合物（すなわち、一般式（１）中のＸで表わされた糖残基の異なった各種クロマノール配糖体が共存する混合物）であることもあるが、このような場合には、クロマノール配糖体の混合物をグルコアミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．３）処理することにより、一般式（４）で示されるクロマノール配糖体を選択的に得ることができる。ここで、本発明におけるグルコアミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．３）処理とは、上述のクロマノール配糖体の酵素法による合成反応により得られたクロマノール配糖体の混合物を含む反応系溶液中のα−グルコシダーゼを失活させた後、該溶液中に糖化酵素の一種であるグルコアミラーゼ（＝エキソ−１，４−α−Ｄ−グルコシダーゼ、ＥＣ ３．２．１．３）を添加し、さらに反応を続けることをいう。
【００５９】
【化７】
【００６０】
グルコアミラーゼ処理に用いられる酵素としては、有機溶媒に対する安定性に優れたグルコアミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．３）があり、具体的には、東洋紡績株式会社製のリゾプス属(Rhizopus sp.,以下同様につき括弧内を省略する）由来のグルコアミラーゼ、およびナガセ生化学工業株式会社製のリゾプス属(Rhizopus sp.,以下同様につき括弧内を省略する）由来のグルコアミラーゼなどが挙げられる。添加される酵素量としては、例えば、上述した東洋紡績株式会社製のバチルス ステアロサーモフィラス由来のα−グルコシダーゼを失活させた後の反応液１５ｍｌに添加する場合には、５〜４０Ｕ、好ましくは１０〜３０Ｕである。なお、この際「１Ｕ」とは、基質に可溶性澱粉を用いて３０分間に１０ｍｇのグルコースを遊離させることのできる酵素量として定義される酵素の１単位である。
【００６１】
また、上記実施態様において、グルコアミラーゼ処理における反応温度は、２０〜７０℃、好ましくは３０〜６０℃であり、反応時間は、１〜４０時間、好ましくは１０〜３０時間である。ただし、上述したグルコアミラーゼ処理による反応を行う際の条件は、使用する酵素量により若干の影響を受ける。
【００６２】
反応終了後は、目的とするクロマノール配糖体を含む反応液をＸＡＤ（オルガノ株式会社製）を担体として用いたカラムクロマトグラフィーで処理することにより、高純度のクロマノール配糖体が得られる。
【００６３】
上述のようにして得られた本発明による固定化酵素は、固定化前の酵素と比較すると、至適温度曲線はほぼ同様の傾向を示すものの、至適ｐＨ曲線は固定化することによりやや酸性側での活性が増大する傾向があることが示された。
【００６４】
【実施例】
次に、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、これらにより本発明の範囲がなんら制限されるものでないことはいうまでもない。
【００６５】
参考例１：α−グルコシダーゼ(α-glucosidase, EC 3.2.1.20)の活性測定法
４（ｗ／ｖ）％マルトース水溶液１００μｌに１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）３００μｌを加え、３７℃で５分間インキュベートした後、酵素液４０μｌを加え、同温度条件下において２０分間反応させた後５分間の煮沸処理により反応を停止させた。次に、上記反応によるグルコースの生成量をグルコース測定キット（和光純薬工業株式会社製）を用いて測定した。なお、１Ｕは上記条件において１分間に１μｍｏｌのマルトースの加水分解を触媒する酵素量とした。
【００６６】
実施例１
多孔質キトサンビーズである、キトパール ＢＣＷ−２５１０、ＢＣＷ−２６１０、ＢＣＷ−３０１０及びＢＣＷ−３５１０（富士紡績株式会社製）、弱塩基性アニオン交換樹脂である、アンバーライト ＩＲＡ−９３ＺＵ（オルガノ株式会社製）及びＤＥＡＥ−トヨパール（東ソー株式会社製）、強塩基性アニオン交換樹脂である、Ｑ−セファロース（ファルマシア株式会社製）を、それぞれ、担体として用いた。上記各担体１ｇ（湿重量）に、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解した東洋紡績株式会社製のサッカロマイセス属(Saccharomyces sp.) 由来のα−グルコシダーゼ、１００Ｕ／ｍｌ（タンパク質濃度５ｍｇ／ｍｌ）を１ｍｌ加え、３０℃にて２時間振盪（１２０ｒｐｍ）することにより、固定化を行なった。この際、未吸着の酵素は、緩衝液にて酵素が溶出しなくなるまで振盪洗浄を行ない除去した。各担体への酵素の見掛け上の固定化率を上記「発明の実施の態様」において記載した式により計算し、その結果を表１に示す。
【００６７】
次に、このようにして得られた固定化酵素各５０ｍｇ（湿重量）を、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で調製した６０（ｗ／ｖ）％マルトース溶液１ｍｌおよびジメチルスルホキシドで（本明細書中では、「ＤＭＳＯ」ともいう）調製した５（ｗ／ｖ）％の下記式（５）で示されるＲＳ−２−置換アルコール溶液０．２ｍｌの混合溶液に加え、４０℃において２０時間（１２０ｒｐｍ）振盪することにより、反応を行なった。この時の２−置換アルコールのクロマノール配糖体への転移率を表２に示す。なお、転移率は、２−置換アルコールの減少の割合として記載した。
【００６８】
【化８】
【００６９】
実施例２
東洋紡績株式会社製のサッカロマイセス属(Saccharomyces sp.) 由来のα−グルコシダーゼ、１００Ｕ／ｍｌ（タンパク質濃度５ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌの代わりに東洋紡績株式会社製のバチルス ステアロサーモフィラス由来のα−グルコシダーゼ ＡＧＨ−２１１、１００Ｕ／ｍｌ（タンパク質濃度１ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌを使用する以外は、実施例１と同様の操作を行い、バチルス ステアロサーモフィラス由来のα−グルコシダーゼを多孔質キトサンビーズに固定化した。
【００７０】
次に、このようにして得られた固定化酵素各５０ｍｇ（湿重量）を、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で調製した４０（ｗ／ｖ）％マルトース溶液１ｍｌ及びジメチルスルホキシドで調製した５（ｗ／ｖ）％の上記式（５）で示されるＲＳ−２−置換アルコール溶液０．２ｍｌの混合溶液に加え、４０℃において２０時間（１２０ｒｐｍ）振盪することにより、反応を行った。このときの、２−置換アルコールのクロマノール配糖体への転移率を下記表２に示す。
【００７１】
【表１】
【００７２】
【表２】
【００７３】
表１及び表２に示される結果から、サッカロマイセス属由来のα−グルコシダーゼおよびバチルス ステアロサーモフィラス由来のα−グルコシダーゼ双方について、固定化率に関しては、キトパール及び各種イオン交換樹脂間で大きな相違はないものの、転移率はキトパールを使用した場合の方が各種イオン交換樹脂を使用した場合に比べて有意に大きく、これより、キトパールを固定化担体として用いた固定化酵素が酵素吸着能に対して糖転移活性に優れていることが判る。
【００７４】
実施例３
担体としてキトパール ＢＣＷ−２５１０及びＢＣＷ−３５１０、各１ｇ（湿重量）に、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解した東洋紡績株式会社製のバチルス ステアロサーモフィラス由来のα−グルコシダーゼ ＡＧＨ−２１１、１００Ｕ／ｍｌ（タンパク質濃度１ｍｇ／ｍｌ）を１ｍｌ加え、３０℃にて２時間振盪（１２０ｒｐｍ）することにより、固定化を行った。この際、未吸着の酵素は、緩衝液にて酵素が溶出しなくなるまで振盪洗浄を行うことにより、除去した。
【００７５】
次に、このようにして得られた固定化酵素各５０ｍｇ（湿重量）を、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で調製した３０（ｗ／ｖ）％マルトース溶液とＤＭＳＯで調製した５（ｗ／ｖ）％の上記式（５）で示されるＲＳ−２−置換アルコール溶液の両者の量を下記表３に示されるように変えて混合した溶液中に添加し、４０℃において２０時間振盪（１２０ｒｐｍ）することにより反応を行った。この時の、２−置換アルコールのクロマノール配糖体への転移率を下記表３に示す。
【００７６】
【表３】
【００７７】
表３に示される結果から、キトパール ＢＣＷ−２５１０を固定化担体として用いた場合、ＤＭＳＯ濃度及び２−置換アルコール濃度を高くしても、高い転移率を示すことが分かった。
【００７８】
実施例４
（１）ＧＬＡ未処理固定化酵素の調製
担体としてキトパール ＢＣＷ−２５１０、ＢＣＷ−３０１０、各１ｇ（湿重量）に、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解した東洋紡績株式会社製のサッカロマイセス属(Saccharomyces sp.) 由来のα−グルコシダーゼ、２００Ｕ／ｍｌ（タンパク質濃度１０ｍｇ／ｍｌ）を１ｍｌ加え、３０℃にて２時間振盪（１２０ｒｐｍ）することにより、固定化を行なった。未吸着の酵素は、緩衝液にて酵素が溶出しなくなるまで振盪洗浄を行ない除去した。各担体への酵素の見掛け上の固定化率を実施例１と同様にして算出し、結果を表４に示す。
【００７９】
（２）ＧＬＡ処理固定化酵素の調製
担体として、キトパール ＢＣＷ−２５１０、ＢＣＷ−３０１０、各１ｇ（湿重量）を分取し、２（ｖ／ｖ）％ＧＬＡ溶液２ｍｌ中にそれぞれ入れ、３０℃において２時間振盪処理（１２０ｒｐｍ）した。処理後、濾紙上にＧＬＡ処理した担体を集め、この濾紙を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）３０ｍｌで３回洗浄を行なった。
【００８０】
次に、このようにしてＧＬＡ処理された担体１ｇ（湿重量）に、５０ｍＭリン酸衝撃液（ｐＨ６．５）に溶解した東洋紡績株式会社製のサッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）由来のα−グルコシダーゼ、２００Ｕ／ｍｌ（タンパク質濃度１０ｍｇ／ｍｌ）を１ｍｌ加え、３０℃にて２時間振盪（１２０ｒｐｍ）し、固定化を行なった。未吸着の酵素は、緩衝液にて酵素が溶出しなくなるまで振盪洗浄を行ない除去した。各担体への酵素の見掛け上の固定化率を実施例１と同様にして算出し、結果を表４に示す。
【００８１】
【表４】
【００８２】
表４のから、キトパール ＢＣＷ−２５１０及びＢＣＷ−３０１０の両方について、ＧＬＡ処理により酵素の固定化率が改善されることが示される。
【００８３】
（３）固定化酵素の安定性の評価
上記（１）及び（２）において調製した、ＧＬＡ未処理固定化酵素およびＧＬＡ処理固定化酵素、各５０ｍｇ（湿重量）を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で調製した６０（ｗ／ｖ）％マルトース溶液１ｍｌおよびジメチルスルホキシドで調製した５（ｗ／ｖ）％の上記式（５）で示されるＲＳ−２−置換アルコール溶液０．２ｍｌの混合溶液に加え、４０℃で２０時間振盪（１２０ｒｐｍ）することにより、反応を行なった。反応終了後、この反応液を濾過して固定化酵素を回収し、同様の条件において糖転移反応をさらに２回繰り返し、それぞれの反応における転移率を求め、この結果から反応液中における各固定化酵素の安定性を評価した。その結果を表５に示す。
【００８４】
【表５】
【００８５】
表５に示される結果から、ＧＬＡ処理することにより反応液中のジメチルスルホキシドに対する、α−グルコシダーゼの安定性は飛躍的に向上することが分かった。また、キトパール ＢＣＷ−２５１０を固定化担体として用いた場合の転移率が最も高いことから、キトパール ＢＣＷ−２５１０を固定化担体として用いることが好ましいことが示された。
【００８６】
実施例５
（１）ＧＬＡ未処理固定化酵素の調製
担体としてキトパール ＢＣＷ−２５１０ １ｇ（湿重量）に、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解した東洋紡績株式会社製のバチルス ステアロサーモフィラス由来のα−グルコシダーゼ ＡＧＨ−２１１、１００Ｕ／ｍｌ（タンパク質濃度１ｍｇ／ｍｌ）を１ｍｌ加え、３０℃にて２時間振盪（１２０ｒｐｍ）することにより、固定化を行った。この際、未吸着の酵素は、緩衝液にて酵素が溶出しなくなるまで振盪洗浄を行うことにより、除去した。この結果、担体への酵素の固定化率は７５％であった。
【００８７】
（２）ＧＬＡ処理固定化酵素の調製
担体としてキトパール ＢＣＷ−２５１０を１ｇ（湿重量）を分取し、２（ｖ／ｖ）％ＧＬＡ溶液２ｍｌ中に入れ、３０℃において２時間振盪（１２０ｒｐｍ）した。処理後、濾紙上にＧＬＡ処理した担体を集め、この濾紙を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）３０ｍｌで３回洗浄を行った。
【００８８】
次に、このようにしてＧＬＡ処理された担体１ｇ（湿重量）に、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解した東洋紡績株式会社製のバチルス ステアロサーモフィラス由来のα−グルコシダーゼ ＡＧＨ−２１１、１００Ｕ／ｍｌ（タンパク質濃度１ｍｇ／ｍｌ）を１ｍｌ加え、３０℃にて２時間振盪（１２０ｒｐｍ）することにより、固定化を行った。この際、未吸着の酵素は、緩衝液にて酵素が溶出しなくなるまで振盪洗浄を行うことにより、除去した。この結果、担体への酵素の固定化率は９５％であった。
【００８９】
（３）固定化酵素の安定性の評価
上記（１）及び（２）において調製した、ＧＬＡ未処理固定化酵素及びＧＬＡ処理固定化酵素、各５０ｍｇ（湿重量）を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で調製した３０（ｗ／ｖ）％マルトース溶液０．９６ｍｌ及びジメチルスルホキシドで調製した５（ｗ／ｖ）％の上記式（５）で示されるＲＳ−２−置換アルコール溶液０．２４ｍｌの混合溶液に加え、４０℃で２０時間振盪（１２０ｒｐｍ）することにより反応を行った。反応終了後、反応液を濾過して固定化酵素を回収し、同様の条件において糖転移反応をさらに繰り返し、それぞれの反応における転移率を求め、この結果から反応液中における各固定化酵素の安定性を評価した。その結果を下記表６に示す。
【００９０】
【表６】
【００９１】
上記（１）および（２）に示される結果から、ＧＬＡ処理により酵素の固定化率が改善され、また、表６に示される結果から、ＧＬＡ処理することにより反応液中のジメチルスルホキシドに対する、α−グルコシダーゼの安定性は飛躍的に向上することが示される。
【００９２】
実施例６
（１）担体のＧＬＡ処理
固定化担体としてキトパール ＢＣＷ−２５１０を用い、この担体、１ｇ（湿重量）を分取し、２（ｖ／ｖ）％ＧＬＡ溶液２ｍｌ中に入れ、３０℃において２時間振盪処理（１２０ｒｐｍ）した。処理後、濾紙上にＧＬＡ処理された担体を集め、この濾紙について５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）３０ｍｌで３回振盪洗浄を行なった。
【００９３】
（２）α−グルコシダーゼの固定化
上記（１）によって得られたＧＬＡ処理担体１ｇ（湿重量）に、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解した東洋紡績株式会社製のサッカロマイセス属(Saccharomyces sp.) 由来のα−グルコシダーゼ、２００Ｕ／ｍｌ（タンパク質濃度１０ｍｇ／ｍｌ）を１ｍｌ加え、３０℃にて２時間振盪（１２０ｒｐｍ）し、固定化を行なった。未吸着の酵素は、緩衝液にて酵素が溶出しなくなるまで振盪洗浄を行なった。このようにして得られた固定化酵素は、担体１ｇ（湿重量）当たり、２００Ｕのα−グルコシダーゼを見かけ上固定化していた。
【００９４】
（３）クロマノール配糖体の合成
上記（２）によって得られた固定化酵素１ｇ（湿重量）を、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で調製した４０％（ｗ／ｖ）マルトース溶液２０ｍｌおよびジメチルスルホキシドで調製した５（ｗ／ｖ）％の上記式（５）で示されるＲＳ−２−置換アルコール溶液４ｍｌの混合溶液に加え、４０℃において２０時間振盪（１２０ｒｐｍ）することにより、反応を行なった。このときの２−置換アルコールのクロマノール配糖体への転移率は約４０％であった。
【００９５】
次に、この反応液を濾過することにより固定化酵素を回収した後、反応液を３０％メタノール溶液で平衡化したＸＡＤ−４（オルガノ株式会社製）カラムにのせ、非吸着物を３０％メタノールで溶出した後、さらに、８０％メタノール溶液でクロマノール配糖体を溶出させた。このようにして得られたクロマノール配糖体画分をシリカゲルクロマトグラフィー［酢酸エチル：メタノール＝５：１（ｖ／ｖ）］処理することによって、クロマノール配糖体として下記式（６）で示される２−（α−Ｄ−グルコピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール（一般式（１）のｎ＝１、Ｒ1 ＝Ｒ2 ＝Ｒ3 ＝Ｒ4 ＝ＣＨ3 、Ｒ5 ＝Ｈに相当する）が高純度で約７０ｍｇ得られた。
【００９６】
【化９】
【００９７】
このようにして得られた２−（α−Ｄ−グルコピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オールの赤外線吸収スペクトルを図１に示す。
【００９８】
また、上記化合物の 1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ−ＮＭＲ、質量分析及び比旋光度の結果は以下のとおりである。
【００９９】
1Ｈ−ＮＭＲ δ（２７０ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ6 ）：
１．２３および１．２５（ｓ，３Ｈ）
１．６９から１．７６（ｍ，１Ｈ）
１．８７から１．９２（ｍ，１Ｈ）
１．９７（ｓ，３Ｈ）
２．０２（ｓ，３Ｈ）
２．０４（ｓ，３Ｈ）
２．５１（ｂｒｏａｄ ｔ，２Ｈ）
３．０５から４．８８（ｍ，１３Ｈ）
７．３９（ｓ，１Ｈ）
13Ｃ−ＮＭＲ δ（６７．８ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6 、プロトンデカップリングスペクトル）：
１１．７
１１．７
１２．６
１９．７および１９．８
２２．２および２２．４
２８．２
６０．６および６０．８
７０．０および７０．１
７１．２および７１．５
７１．９
７２．６および７２．９
７３．１
７３．８および７３．９
９８．７および９８．８
１１６．６および１１６．７
１２０．１および１２０．２
１２０．７および１２０．８
１２２．５
１４４．２
１４５．１
質量スペクトル（ＦＡＢ）
ｍ／ｚ ３９８ （分子イオンピーク）
比旋光度
【０１００】
【外１】
【０１０１】
実施例７
（１）担体のＧＬＡ処理
固定化担体としてキトパール ＢＣＷ−２５１０を用い、この担体８０ｇ（湿重量）を分取し、２（ｖ／ｖ）％ＧＬＡ溶液１６０ｍｌ中に入れ、３０℃において２時間振盪（１２０ｒｐｍ）した。処理後、濾紙上にＧＬＡ処理された担体を集め、この濾紙について５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）２４００ｍｌで３回振盪洗浄を行った。
【０１０２】
（２）α−グルコシダーゼの固定化
上記（１）によって得られたＧＬＡ処理担体８０ｇ（湿重量）に、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解した東洋紡績株式会社製のバチルス ステアロサーモフィラス由来のα−グルコシダーゼ ＡＧＨ−２１１、１００Ｕ／ｍｌ（タンパク質濃度１ｍｇ／ｍｌ）を８０ｍｌ加え、３０℃にて２時間振盪（１２０ｒｐｍ）して、固定化を行った。未吸着の酵素は、緩衝液にて酵素が溶出しなくなるまで振盪洗浄を行った。このようにして得られた固定化酵素は、担体１ｇ（湿重量）当たり、１００Ｕのα−グルコシダーゼを見掛け上固定化していた。
【０１０３】
（３）クロマノール配糖体の合成
上記（２）によって得られた固定化酵素８０ｇ（湿重量）を、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で調製した３０（ｗ／ｖ）％マルトース溶液１５００ｍｌ及びジメチルスルホキシドで調製した５（ｗ／ｖ）％の上記式（５）で示されるＲＳ−２−置換アルコール３７５ｍｌの混合溶液に加え、４０℃において２０時間振盪（１２０ｒｐｍ）することにより反応を行った。この時の２−置換アルコールのクロマノール配糖体への転移率は約８７％であり、この反応液中のクロマノール配糖体は糖部分の構造が異なるものの混合物（すなわち、一般式（１）のｎ＝１、Ｒ1 ＝Ｒ2 ＝Ｒ3 ＝Ｒ4 ＝ＣＨ3 、Ｒ5 ＝Ｈで、かつＸで表わされる糖残基の異なった各種クロマノール配糖体が共存する混合物）であった。この反応液を１５分間煮沸処理することにより、α−グルコシダーゼを失活させ、２４，０００Ｕの東洋紡績株式会社製のリゾプス属由来のグルコアミラーゼを添加し、５０℃において２４時間反応させることにより、反応液中のクロマノール配糖体はほぼ、一般式（７）で示されるクロマノール配糖体１種類になった。この反応液を１５分間煮沸処理することにより、グルコアミラーゼを失活させた後、３０％メタノール溶液で平衡化したＸＡＤ−４（オルガノ株式会社製）カラムにアプライし、非吸着物を３０％メタノールで溶出後、８０％メタノール溶液でクロマノール配糖体を溶出させた。このようにして得られたクロマノール配糖体画分をシリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル：メタノール＝５：１（ｖ／ｖ））処理することにより、クロマノール配糖体として下記一般式（７）で示される２−（α−Ｄ−グルコピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール（一般式（１）のｎ＝１、Ｒ1 ＝Ｒ2 ＝Ｒ3 ＝Ｒ4 ＝ＣＨ3 、Ｒ5 ＝Ｈに相当する）を約２０ｇ得た。
【０１０４】
【化１０】
【０１０５】
このようにして得られた一般式（７）で示されるクロマノール配糖体の赤外線吸収スペクトルを図２に示す。
【０１０６】
また、上記化合物の 1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ−ＮＭＲ、質量分析及び比施光度の結果は以下のとおりである。
【０１０７】
1Ｈ−ＮＭＲ δ（２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6 ）：
１．２３および１．２５（ｓ，３Ｈ）
１．６９から１．７６（ｍ，１Ｈ）
１．８７から１．９２（ｍ，１Ｈ）
１．９７（ｓ，３Ｈ）
２．０２（ｓ，３Ｈ）
２．０４（ｓ，３Ｈ）
２．５１（ｂｒｏａｄ ｔ，２Ｈ）
３．０５から４．８８（ｍ，１３Ｈ）
７．３９（ｓ，１Ｈ）
13Ｃ−ＮＭＲ δ（６７．８ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6 、プロトンデカップリングスペクトル）：
１１．７
１１．７
１２．６
１９．７および１９．８
２２．２および２２．４
２８．２
６０．６および６０．８
７０．０および７０．１
７１．２および７１．５
７１．９
７２．６および７２．９
７３．１
７３．８および７３．９
９８．７および９８．８
１１６．６および１１６．７
１２０．１および１２０．２
１２０．７および１２０．８
１２２．５
１４４．２
１４５．１
質量スペクトル （ＦＡＢ）：
ｍ／ｚ ３９８ （分子イオンピーク）
比施光度
【０１０８】
【外２】
【０１０９】
【発明の効果】
上述したように、本発明の固定化酵素による配糖体の製造方法を用いて、糖転移作用を触媒する酵素を多孔質キトサンビーズに効果的に固定化することにより、（１）酵素活性を実質的に失活させることなく、安定な固定化酵素を得ることができ；（２）有機溶媒共存下においても酵素の活性を長期にわたり安定して維持でき；（３）使い捨てにすることなく、連続使用できるようになり；（４）本発明による固定化酵素を用いることにより、配糖体の生産効率を高めることができ；さらに、（５）合成された配糖体への異種タンパク質の混入を防ぎ、高品質の配糖体を収率よく合成することができるようになった。
【０１１０】
また、糖転移作用を触媒する酵素としてバチルス ステアロサーモフィラス由来のα−グルコシダーゼを用いることにより、有機溶媒共存下においても長期間安定である固定化酵素が調製でき、さらに、このようにして得られた固定化酵素を用いることにより生理活性および化学的安定性に優れた水溶性配糖体を製造できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 実施例６で得られた２−（α−Ｄ−グルコピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オールの赤外線吸収スペクトルである。
【図２】 実施例７で得られた２−（α−Ｄ−グルコピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オールの赤外線吸収スペクトルである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、固定化酵素を用いた各種配糖体の製造方法に関するものである。詳しく述べると、本発明は、有機溶媒共存下において、多孔質キトサンビーズに固定化したα−グルコシダーゼを用いて、水酸基を有する水に難溶な生理活性に優れた物質と糖とを反応させることにより、生理活性に優れた様々な水溶性配糖体を製造する方法に関するものである。また、本発明は、バチルス ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophylus,以下同様につき括弧内を省略する）由来のα−グルコシダーゼを多孔質キトサンビーズに固定化することにより、有機溶媒共存下においても長期間安定である固定化酵素を調製し、該固定化酵素を用いて、生理活性および化学的安定性に優れた水溶性配糖体を製造する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、食品や化粧品等の分野においては糖転移作用を触媒する酵素を利用して生理活性に優れた物質等を製造する技術が注目されている。
【０００３】
上記糖転移作用を有する代表的な酵素としてはα−グルコシダーゼがあるが、このα−グルコシダーゼは、α−グルコシド結合を持つ基質の非還元末端側から加水分解し、α−グルコースを生成する加水分解酵素（エキソグリコシダーゼ）の総称であるが、一方で、糖転移作用を触媒する酵素であることは既に知られている。α−グルコシダーゼの糖転移作用を利用して有用物質を製造する方法としては、例えば、α−１，６−グルコシド結合反応を触媒するα−グルコシダーゼをマルトースに作用させるとイソマルトースやパノース等の分枝オリゴ糖を生成することが知られている［澱粉科学，２６巻，頁５９〜６７（１９７９年）］。
【０００４】
一方、酵素の使い捨てによる不経済性及び酵素の安定性の確保等の観点から、水溶性の酵素を水不溶性の担体などに固定化することにより、酵素反応工程を連続化し、酵素を繰り返して使用する研究が進展し、既に実用化されているものもある。しかしながら、高い酵素活性を保ちかつ安定で、また汎用性の広い酵素の固定化法は未だ開発されていないのが現状である。
【０００５】
このような酵素の固定化法としては、これまで、担体結合法、架橋法、及び包括法等が知られている。また、担体としては、セルロース、澱粉、寒天、アルギン酸ソーダ及びゼラチンなどの天然高分子、またはそれらの誘導体、あるいはポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、ポリアミノポリスチレン及びポリビニルアルコール等の合成高分子等の有機物、さらには、粘土、アルミナ、ガラス、セラミック及びステンレス等の無機物等が用いられている。従来から、食品や化粧品等の分野においては、弱塩基性アニオン交換樹脂、弱酸性カチオン交換樹脂等のイオン交換樹脂や多孔質の合成吸着樹脂等を利用した固定化法が広く用いられていた。さらに、これらの方法に加えて、近年、キチンやキトサンが新しい素材として魅力のある天然高分子資源として期待され研究されてきたことに伴い、キトサンビーズを応用した固定化法が注目を集めている。キトサンビーズに固定化した酵素を用いて有用物質を製造する方法としては、例えば、キトサンビーズを用いて固定化したシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼをマルトース等に作用させ転移糖を製造する技術が開示されている（特公平７−７１４８９号公報）。
【０００６】
しかしながら、上記方法を始めとして、一般に糖転移作用を触媒する酵素を用いて有用な物質を製造する場合、転移率の確保や酵素の安定性等の点からその反応は水溶液中で行われ、従って、その反応の基質となる物質もほとんどが水溶性の物質であり、水に難溶な物質は上記反応には基質として用いることが困難であるという問題があった。
【０００７】
このような従来の問題点を考慮して、本発明者らは、水酸基を有する水に難溶な生理活性に優れた物質を何らかの方法で水溶性にすることができれば、その物質の用途は飛躍的に拡大すると考え、糖転移作用を触媒する酵素を用いて、水酸基を有する水に難溶な抗酸化物質と糖とを有機溶媒の存在下において反応させることにより、新規な水溶性抗酸化剤を製造する技術を開発した（特開平７−１１８２８７号公報）。上記公報は、クロマノール配糖体を製造するにあたって有機溶媒中に溶解させた、下記一般式（２）：
【０００８】
【化２】
（ただし、式中、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 およびＲ4 は同一または異なる水素原子または低級アルキル基、Ｒ5 は水素原子、低級アルキル基または低級アシル基を表わし、およびｎは０〜４の整数である）で表わされる２−置換アルコール（以下、単に「２−置換アルコール」と称する）と、糖溶液とを糖転移作用を触媒する酵素の存在下で反応させることにより、下記一般式（３）：
【００１０】
【化３】
（ただし、式中、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 およびＲ4 は同一または異なる水素原子または低級アルキル基、Ｒ5 は水素原子、低級アルキル基または低級アシル基、Ｘは単糖残基またはオリゴ残基を表わし、糖残基の水酸基の水素原子は低級アルキル基または低級アシル基で置換されていてもよく、およびｎは０〜４の整数であり、ｍは１〜６の整数である）で示されるクロマノール配糖体を製造する方法を開示するものである。
【００１２】
しかしながら、上記方法は、酵素を糖溶液と２−置換アルコール溶液との混合溶液中に直接添加する方法であり、反応液中で酵素が溶液の状態で存在しているため、酵素の再使用ができず使い捨てとなってしまい、高価な酵素の使い捨てによる経済性の面から工業的に実施するには不充分であるという欠点があった。また、実際に工業化を考えた場合、反応液中の２−置換アルコールの濃度をさらに高め、かつ、転移率を上げる必要があるが、本発明者らの調査の結果、上記特開平７−１１８２８７号公報に開示される方法で用いられる酵素は、有機溶媒の濃度の増加に伴い安定性が減少することが明らかとなった。そのため、２−置換アルコールの量を増やすために反応系における有機溶媒の濃度を高めることは困難であり、有機溶媒存在下における酵素の安定性の面からも工業的に実施するには不充分であるという欠点を有するものであった。したがって、工業化に適するだけの転移率を達成し得る水溶性クロマノール配糖体の製造方法は十分確立されているとは言えないものであった。
【００１３】
さらに、糖転移反応を触媒する酵素をキトサンビーズに固定化した例は多数報告されているが、本発明によるα−グルコシダーゼをキトサンビーズに固定化した例はいまだ報告されていなかった。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明の目的は、新規な固定化酵素を用いた配糖体の製造方法を提供することである。
【００１５】
また、本発明の他の目的は、α−グルコシダーゼを多孔質キトサンビーズに固定化し、その固定化酵素を用いて水酸基を有する水に難溶性の生理活性に優れた物質と糖とを結合させ、水溶性の生理活性に優れた配糖体を効率よく製造する技術を提供することにある。
【００１６】
また、本発明のさらなる他の目的は、バチルス ステアロサーモフィラス由来のα−グルコシダーゼを多孔質キトサンビーズに固定化することにより、有機溶媒共存下において長期間安定な固定化酵素を調製し、該固定化酵素を用いて、化学的安定性及び生理活性に優れた配糖体を効率よく製造する技術を提供することにある。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記諸目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、多孔質キトサンビーズにα−グルコシダーゼを固定化することにより、該酵素が極めて効果的に担体上に吸着され、有機溶媒との共存下においても酵素の高活性が保持および発現されることを見い出した。さらに、本発明者らは、このようにして得られた固定化酵素を用いることにより、水酸基を有する水に難溶な物質についても糖と結合させて各種配糖体を有機溶媒との共存下においても効率よく製造することが可能であることを見い出した。
【００１８】
さらにまた、本発明者らは、上記目的を達成するためにさらに鋭意研究を重ねた結果、多孔質キトサンビーズにバチルス ステアロサーモフィラス由来のα−グルコシダーゼを固定化することにより、高濃度の有機溶媒の共存下においても、酵素の高活性が長期間保持および発現されることをも発見した。
【００１９】
これらの知見に基づいて、本発明を完成するに至った。
【００２０】
すなわち、上記諸目的は下記（１）から（７）のいずれかにより達成される。
【００２１】
（１） 多孔質キトサンビーズにα−グルコシダーゼを固定化させた固定化酵素を用いて、水酸基を有する水に難溶な生理活性に優れた物質と糖とを有機溶媒共存下において反応させ、生理活性に優れた水溶性配糖体を生成することを特徴とする各種配糖体の製造方法。
【００２２】
（２） 上記固定化酵素は多孔質キトサンビーズを架橋剤で架橋処理した後に酵素を固定化させたものである前記（１）記載の方法。
【００２３】
（３） 上記多孔質キトサンビーズの粒径が０．５〜３．０ｍｍである前記（１）または（２）記載の方法。
【００２４】
（４） α−グルコシダーゼの多孔質キトサンビーズ上への固定化量が、該多孔質キトサンビーズ１ｇ（湿重量）当たり、０．０１〜１００ｍｇである前記（１）から（３）いずれかに記載の方法。
【００２５】
（５） 上記配糖体が下記一般式（１）：
【００２６】
【化４】
［ただし、式中、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 およびＲ4 は同一または異なる水素原子または低級アルキル基を表わし、Ｒ5 は水素原子、低級アルキル基または低級アシル基を表わし、Ｘはグルコース残基（但し、グルコース残基中の水酸基の水素原子は炭素原子数が１〜８の低級アルキル基または炭素原子数が１〜１０の低級アシル基で置換されていてもよい）を表わし、ｎは０〜４の整数である］で表わされるクロマノール配糖体である前記（１）から（４）いずれかに記載の方法。
【００２８】
（６） 上記糖がα−グルコシル糖化合物である前記（１）から（５）いずれかに記載の方法。
【００２９】
（７） 上記α−グルコシダーゼがバチルス ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophylus) 由来である前記（１）から（６）いずれかに記載の方法。
【００３０】
【発明の実施の形態】
本発明の固定化酵素による配糖体の製造方法は、固定化担体としての多孔質キトサンビーズにα−グルコシダーゼを固定化させ、得られた固定化酵素を用いて有機溶媒共存下で水酸基を有する水に難溶な生理活性に優れた物質を糖と結合させることによって、生理活性に優れた水溶性の配糖体を生成することを特徴とするものである。
【００３１】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００３２】
本発明において固定化担体として用いられる多孔質キトサンビーズは、カニやエビなどの甲殻類の殻、蚕などの昆虫の甲皮、おきあみやいかなどの軟体動物の殻や骨骼由来のキチンを４０〜５０％水酸化ナトリウム溶液中で１００〜１２０℃、４〜５時間処理することによりキチンをＮ−脱アセチル化し、このＮ−脱アセチル化物を水洗、乾燥してキトサンを得、さらにこのようにして得られたキトサンを粒状化及び多孔質化して表面積を大きくして吸着能を高めることによって得られる。このような多孔質キトサンビーズの具体例としては、例えば、キトパール ＢＣＷ−２５１０、ＢＣＷ−２６１０、ＢＣＷ−３０１０、ＢＣＷ−３５１０（商品名；富士紡績株式会社製）等が挙げられる。
【００３３】
また、本発明において使用される多孔質キトサンビーズの粒径は、特に制限されないが、圧力損失や粒子表面積等を考慮すると、０．５〜３．０ｍｍが好ましく、さらに好ましくは、０．５〜１．５ｍｍである。
【００３４】
本発明によるα−グルコシダーゼとしては、ほぼ全ての起源由来のα−グルコシダーゼを用いることができ、精製酵素や粗酵素の別を問わない。具体例としては、東洋紡株式会社製のサッカロマイセス属(Saccharomyces sp.) 由来のα−グルコシダーゼ、オリエンタル酵母工業株式会社製のサッカロマイセス セロビイシエ(Saccharomyces cerevisiae)由来のα−グルコシダーゼ、天野製薬株式会社製のアスペルギルス ニガー(Aspergillus niger) 由来のα−グルコシダーゼ、和光純薬工業株式会社製のサッカロマイセス属(Saccharomyces sp.) 由来のα−グルコシダーゼ、シグマ（ＳＩＧＭＡ）社製のベーカーズ イースト（Ｂａｋｅｒｓ ｙｅａｓｔ）由来のα−グルコシダーゼ、東洋紡績株式会社製のバチルスステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophylus) 由来のα−グルコシダーゼ等のバチルス(Bacillus)属由来のα−グルコシダーゼなどが挙げられる。上記α−グルコシダーゼのうち、有機溶媒に対する優れた安定性および強い転移活性を考慮すると、バチルス ステアロサーモフィラス由来のα−グルコシダーゼ、特に特開平５−３０８９６４号に開示されたバチルス ステアロサーモフィラス由来のα−グルコシダーゼが好ましく使用される。
【００３５】
本発明による多孔質キトサンビーズの担体にα−グルコシダーゼを固定化させることにより固定化酵素を製造する方法としては、水または適当な緩衝液中で担体と酵素とを接触させる方法を用いることができる。以下に、多孔質キトサンビーズの担体としてキトパール ＢＣＷ−２５１０を用いた際の固定化方法の一実施態様を示す。キトパール ＢＣＷ−２５１０ １ｇ（湿重量）を１０〜１００ｍＭの各種緩衝液（ｐＨ５．０〜７．０）で充分に平衡化した後、担体１ｇ（湿重量）に対して、α−グルコシダーゼ０．０１〜１００ｍｇ（比活性２０単位／ｍｇ）、好ましくは１〜１００ｍｇ、より好ましくは５〜５０ｍｇを同緩衝液１ｍｌに溶解したものを添加し、充分に混合する。次いで、４〜６０℃、好ましくは１０〜４０℃にて、１〜２４時間、好ましくは２〜１５時間静置するか、または０．５〜１０時間、好ましくは１〜５時間往復振盪処理（５０〜１８０ｒｐｍ、好ましくは１００〜１４０ｒｐｍ）した後、濾紙またはガラスフィルターで濾過し、続いて水または緩衝液で酵素が溶出しなくなるまで洗浄する。なお、上記実施態様において、特に酵素としてバチルス ステアロサーモフィラス由来のα−グルコシダーゼを用いた際には、当該α−グルコシダーゼの添加量は、担体１ｇ（湿重量）に対して、０．０１〜１０ｍｇ（比活性６６１単位／ｍｇ）、好ましくは０．１〜１ｍｇである。
【００３６】
本発明において、α−グルコシダーゼの多孔質キトサンビーズの担体上への固定化量は、多孔質キトサンビーズの架橋処理の有無、使用する多孔質キトサンビーズの種類や量及び酵素の使用量等によって異なるが、通常、多孔質キトサンビーズ１ｇ（湿重量）当たり、０．０１〜１００ｍｇ、好ましくは１〜１００ｍｇ、より好ましくは５〜５０ｍｇである。また、本発明において、バチルス ステアロサーモフィラス由来のα−グルコシダーゼを使用する際の担体への固定化量は、通常、多孔質キトサンビーズ１ｇ（湿重量）当たり、０．０１〜１０ｍｇ、好ましくは０．１〜１ｍｇである。
【００３７】
上記実施態様において使用される緩衝液としては、生化学及び生物学の分野において一般的に使用される緩衝液であればよく、具体的には、炭酸−炭酸水素塩系、リン酸第一塩−リン酸第二塩系、及び両性イオンであるタンパク質やアミノ酸などの緩衝作用による緩衝液等が挙げられ、これらを目的とするｐＨによる適宜選択して使用する。
【００３８】
本発明において、多孔質キトサンビーズを用いて上記方法により本発明による固定化酵素を得ることができるが、この際、該固定化酵素をさらに改善することを目的として、多孔質キトサンビーズを架橋剤で前処理した担体を固定化担体として用いることが好ましい。このように架橋剤で前処理した担体を用いると、さらに有機溶媒共存下においてより高い糖転移活性を示す固定化酵素を得ることができるという利点がある。
【００３９】
本発明において用いられる架橋剤としては、キトサンビーズと接触したときにキトサンビーズのアミノ基と結合する能力を有するものであれば、特に制限されずに使用することができる。この場合、使用できる架橋剤の例としては、例えば、グルタルアルデヒド、エピクロロヒドリン、ビスジアゾベンシジン、ヘキサメチレンジイソシアネート、トルエンジイソシアネート、ヘキサメチレンジイソチオシアネート及びＮ，Ｎ−エチレンビスマレインイミド等が挙げられる。これらの架橋剤は、単独であるいは２種以上を組み合わせて用いることができる。これらのうち、グルタルアルデヒド及びエピクロロヒドリンが好ましい。
【００４０】
前処理の方法としては、水または上記した緩衝液中、担体に架橋剤を接触させる方法を用いることができる。架橋剤の濃度は、担体に対して、通常、０．０１〜５（ｖ／ｖ）％の範囲が好ましい。多孔質キトサンビーズの担体としてキトパール ＢＣＷ−２５１０をおよびグルタルアルデヒドを架橋剤として用いた際の前処理方法の一実施態様を以下に示す：キトパール ＢＣＷ−２５１０ １ｇ（湿重量）を２（ｖ／ｖ）％グルタルアルデヒド（以下、「ＧＬＡ」と略す）溶液２ｍｌ中に浸透させ、４〜４０℃、好ましくは１０〜３０℃にて、０．５〜３時間、好ましくは１〜２時間静置するか、または０．５〜３時間、好ましくは１〜２時間往復振盪処理（５０〜１８０ｒｐｍ、好ましくは１００〜１４０ｒｐｍ）した後、濾紙またはガラスフィルターで濾過し、過剰のＧＬＡを除去・洗浄する方法が挙げられる。
【００４１】
また、上記実施態様におけるα−グルコシダーゼの多孔質キトサンビーズ上への固定化量は、処理条件や使用する担体の種類等によって異なるが、例えば、ＧＬＡ処理したキトパールＢＣＷ−２５１０を固定化担体として用いる場合、キトパールＢＣＷ−２５１０ １ｇ（湿重量）に対して、上記と同様に緩衝液中で、０．０１〜１００ｍｇ、好ましくは１〜１００ｍｇ、より好ましくは５〜５０ｍｇである。特に上記態様において、α−グルコシダーゼとしてバチルス ステアロサーモフィラス由来のものを使用する際には、固定化量は、キトパールＢＣＷ−２５１０ １ｇ（湿重量）に対して、０．０１〜１０ｍｇ、好ましくは０．１〜１ｍｇである。酵素の固定化担体上への固定化処理は、ＧＬＡによる架橋処理と同様の条件で静置または振盪処理によって行なうことができる。この際、未吸着の酵素は、酵素の溶出がなくなるまで、濾紙またはガラスフィルターで洗浄を行なうことにより除去することができる。
【００４２】
上記のような方法により固定化した場合の見掛け上の固定化率（％）を、次式により算出した。
【００４３】
【数１】
また、酵素の固定化法としては、上記に述べたほかに、多孔質キトサンビーズ担体をカラムに充填した後、２（ｖ／ｖ）％ＧＬＡ溶液を２〜３時間通液させ、滅菌蒸留水で充分洗浄した後、酵素溶液を通液させることにより固定化する方法を採用することができる。
【００４５】
本発明による糖転移反応に使用される糖は、目的とする配糖体の種類などによって異なるが、例えば、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、コージビオース、ニゲロース、トレハロース、パノース、イソマルトース、及びイソマルトトリオース等が挙げられ、これらのうち、マルトースからマルトテトラオース位の低分子のマルトオリゴ糖が好ましく、特にマルトースが好ましい。また、糖の添加濃度は、１〜７０（ｗ／ｖ）％、好ましくは３０〜６０（ｗ／ｖ）％である。
【００４６】
本発明による固定化酵素を用いて製造される配糖体としては、使用される糖及び基質の種類によって様々であるが、例えば、各種クロマノール配糖体、フラボノール配糖体、フラバノン配糖体、フラボン配糖体、サポニン配糖体、及びカテキン配糖体等が挙げられ、これらのうち、好ましくは、特開平７−１１８，２８７号公報に開示されているような、下記一般式（１）：
【００４７】
【化５】
［ただし、式中、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 およびＲ4 は同一または異なる水素原子または低級アルキル基を表わし、Ｒ5 は水素原子、低級アルキル基または低級アシル基を表わし、Ｘはグルコース残基（但し、グルコース残基中の水酸基の水素原子は炭素原子数が１〜８の低級アルキル基または炭素原子数が１〜１０の低級アシル基で置換されていてもよい）を表わし、およびｎは０〜４の整数である］で表わされるクロマノール配糖体が挙げられる。この際、例えば、上記一般式（１）で表わされるクロマノール配糖体を製造する際には、下記一般式（２）：
【００４９】
【化６】
（ただし、式中、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 およびｎは、それぞれ、上記と同様である）で表わされる２−置換アルコールが基質として使用され、上記基質とマルトースからマルトテトラオース位のマルトオリゴ糖などの上述した糖を本発明による固定化酵素の存在下で反応させることによって、上記一般式（１）で表わされるクロマノール配糖体（以下、単に「クロマノール配糖体」と称する）が製造できる。
【００５１】
上記一般式（１）及び（２）において、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 およびＲ4 は、同一または異なる水素原子または低級アルキル基を表わすものであるが、低級アルキル基を表わす際には、炭素原子数が好ましくは１〜８、より好ましくは１〜６の低級アルキル基であり、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、及びオクチル基等が挙げられ、これらのうち、メチル基及びエチル基が好ましい。同様にして、Ｒ5 は、水素原子、低級アルキル基または低級アシル基を表わすものであるが、これらのうち、低級アルキル基を表わす際には、上記Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 およびＲ4 における場合と同様であり、また、低級アシル基を表わす際には、炭素原子数が好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜８の低級アシル基であり、例えば、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、バレリル基、イソバレリル基、ピバロイル基、ヘキサノイル基、及びオクタノイル基等が挙げられ、これらのうち、アセチル基及びプロピオニル基が好ましい。さらに、上記一般式（１）において、Ｘは、グルコース、またはグルコース残基中の水酸基の水素原子が炭素原子数が１〜８の低級アルキル基または炭素原子数が１〜１０の低級アシル基で置換されたもの等が挙げられ、これらのうち、グルコースが好ましく使用される。さらに、上記一般式（１）及び（２）において、ｎは０〜４、好ましくは０〜２の整数である。
【００５２】
本発明による糖転移反応に使用される基質としては、水酸基を有する水に難溶で生理活性に優れた物質であれば特に制限されず、目的とする配糖体の種類によって異なるが、例えば、上記一般式（２）で表わされる２−置換アルコール類、フラボノール、フラバノン、フラボン、サポゲニン、及びカテキン等が挙げられる。これらのうち、水酸基を有する水に難溶な抗酸化剤である、上記一般式（２）で表わされる２−置換アルコール（以下、単に「２−置換アルコール」と称する）が基質として好ましく使用される。この２−置換アルコールは、公知物質であり、特公平１−４３７５５号公報や特公平１−４９１３５号公報等に開示された方法により得ることができる。また、例えば、一般式（２）においてＲ1 、Ｒ2 、Ｒ3 及びＲ4 がＣＨ3 であり、Ｒ5 がＨであり、ｎが１である２−置換アルコールは、トロロックスを水素化リチウムアルミニウムの存在下においてジエチルエーテル中で加熱還流処理することなどにより容易に得ることができる。
【００５３】
本発明による固定化酵素を用いてクロマノール配糖体を製造する際には、２−置換アルコールを糖溶液に溶解させることが望ましい。また、上記製造工程においては、有機溶媒を共存させることが望ましく、この際添加される有機溶媒としては、例えば、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、メタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリルなどが挙げられる。これらのうち、α−グルコシダーゼの糖転移活性を高めることを考慮すると、ジメチルスルホキシド及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドが好ましい。添加する有機溶媒の濃度は、１〜５０（ｖ／ｖ）％であり、反応効率を考慮すると、５〜３５（ｖ／ｖ）％が好ましい。
【００５４】
上記実施態様において、基質としての２−置換アルコールの濃度は、反応液中において飽和濃度若しくはそれに近い濃度にすることが望ましく、特に、０．５〜１０（ｖ／ｖ）％の範囲内であることが望ましい。
【００５５】
本発明による反応条件としては、ｐＨが、４．５〜７．５、好ましくは５．０〜６．５であり、反応温度が、１０〜７０℃、好ましくは３０〜６０℃であり、さらには、反応時間が、１〜５０時間、好ましくは１〜４０時間、より好ましくは２〜２４時間である。特に、バチルス ステアロサーモフィラス由来のα−グルコシダーゼを使用する際の反応条件としては、ｐＨが、４．５〜７．５、好ましくは５．０〜７．５であり、反応温度が、１０〜７０℃、好ましくは３０〜７０℃であり、さらには、反応時間が、１〜５０時間、好ましくは２〜４０時間である。但し、これらの反応条件は使用する固定化酵素の種類や量等により影響を受ける。
【００５６】
本発明による固定化酵素を用いてクロマノール配糖体を製造する場合の製造方法は、特に限定されないが、例えば、固定化酵素をカラムに充填し、上記したようなｐＨおよび温度の反応条件下で、基質として２−置換アルコールおよび糖溶液の混合液をカラムに連続通液することにより、クロマノール配糖体を効果的に製造することができる。
【００５７】
または、本発明において調製された固定化酵素を反応液中に直接添加し、振盪等の方法を用いて、反応液中に固定化酵素を分散させながら反応を行うことによって、クロマノール配糖体を効率的に製造してもよい。
【００５８】
さらに、本発明による固定化酵素を用いて製造されるクロマノール配糖体（一般式（１））は、下記一般式（４）で表わされるもののほかに糖残基の異なるものも含む混合物（すなわち、一般式（１）中のＸで表わされた糖残基の異なった各種クロマノール配糖体が共存する混合物）であることもあるが、このような場合には、クロマノール配糖体の混合物をグルコアミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．３）処理することにより、一般式（４）で示されるクロマノール配糖体を選択的に得ることができる。ここで、本発明におけるグルコアミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．３）処理とは、上述のクロマノール配糖体の酵素法による合成反応により得られたクロマノール配糖体の混合物を含む反応系溶液中のα−グルコシダーゼを失活させた後、該溶液中に糖化酵素の一種であるグルコアミラーゼ（＝エキソ−１，４−α−Ｄ−グルコシダーゼ、ＥＣ ３．２．１．３）を添加し、さらに反応を続けることをいう。
【００５９】
【化７】
グルコアミラーゼ処理に用いられる酵素としては、有機溶媒に対する安定性に優れたグルコアミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．３）があり、具体的には、東洋紡績株式会社製のリゾプス属(Rhizopus sp.,以下同様につき括弧内を省略する）由来のグルコアミラーゼ、およびナガセ生化学工業株式会社製のリゾプス属(Rhizopus sp.,以下同様につき括弧内を省略する）由来のグルコアミラーゼなどが挙げられる。添加される酵素量としては、例えば、上述した東洋紡績株式会社製のバチルス ステアロサーモフィラス由来のα−グルコシダーゼを失活させた後の反応液１５ｍｌに添加する場合には、５〜４０Ｕ、好ましくは１０〜３０Ｕである。なお、この際「１Ｕ」とは、基質に可溶性澱粉を用いて３０分間に１０ｍｇのグルコースを遊離させることのできる酵素量として定義される酵素の１単位である。
【００６１】
また、上記実施態様において、グルコアミラーゼ処理における反応温度は、２０〜７０℃、好ましくは３０〜６０℃であり、反応時間は、１〜４０時間、好ましくは１０〜３０時間である。ただし、上述したグルコアミラーゼ処理による反応を行う際の条件は、使用する酵素量により若干の影響を受ける。
【００６２】
反応終了後は、目的とするクロマノール配糖体を含む反応液をＸＡＤ（オルガノ株式会社製）を担体として用いたカラムクロマトグラフィーで処理することにより、高純度のクロマノール配糖体が得られる。
【００６３】
上述のようにして得られた本発明による固定化酵素は、固定化前の酵素と比較すると、至適温度曲線はほぼ同様の傾向を示すものの、至適ｐＨ曲線は固定化することによりやや酸性側での活性が増大する傾向があることが示された。
【００６４】
【実施例】
次に、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、これらにより本発明の範囲がなんら制限されるものでないことはいうまでもない。
【００６５】
参考例１：α−グルコシダーゼ(α-glucosidase, EC 3.2.1.20)の活性測定法
４（ｗ／ｖ）％マルトース水溶液１００μｌに１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）３００μｌを加え、３７℃で５分間インキュベートした後、酵素液４０μｌを加え、同温度条件下において２０分間反応させた後５分間の煮沸処理により反応を停止させた。次に、上記反応によるグルコースの生成量をグルコース測定キット（和光純薬工業株式会社製）を用いて測定した。なお、１Ｕは上記条件において１分間に１μｍｏｌのマルトースの加水分解を触媒する酵素量とした。
【００６６】
実施例１
多孔質キトサンビーズである、キトパール ＢＣＷ−２５１０、ＢＣＷ−２６１０、ＢＣＷ−３０１０及びＢＣＷ−３５１０（富士紡績株式会社製）、弱塩基性アニオン交換樹脂である、アンバーライト ＩＲＡ−９３ＺＵ（オルガノ株式会社製）及びＤＥＡＥ−トヨパール（東ソー株式会社製）、強塩基性アニオン交換樹脂である、Ｑ−セファロース（ファルマシア株式会社製）を、それぞれ、担体として用いた。上記各担体１ｇ（湿重量）に、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解した東洋紡績株式会社製のサッカロマイセス属(Saccharomyces sp.) 由来のα−グルコシダーゼ、１００Ｕ／ｍｌ（タンパク質濃度５ｍｇ／ｍｌ）を１ｍｌ加え、３０℃にて２時間振盪（１２０ｒｐｍ）することにより、固定化を行なった。この際、未吸着の酵素は、緩衝液にて酵素が溶出しなくなるまで振盪洗浄を行ない除去した。各担体への酵素の見掛け上の固定化率を上記「発明の実施の態様」において記載した式により計算し、その結果を表１に示す。
【００６７】
次に、このようにして得られた固定化酵素各５０ｍｇ（湿重量）を、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で調製した６０（ｗ／ｖ）％マルトース溶液１ｍｌおよびジメチルスルホキシドで（本明細書中では、「ＤＭＳＯ」ともいう）調製した５（ｗ／ｖ）％の下記式（５）で示されるＲＳ−２−置換アルコール溶液０．２ｍｌの混合溶液に加え、４０℃において２０時間（１２０ｒｐｍ）振盪することにより、反応を行なった。この時の２−置換アルコールのクロマノール配糖体への転移率を表２に示す。なお、転移率は、２−置換アルコールの減少の割合として記載した。
【００６８】
【化８】
実施例２
東洋紡績株式会社製のサッカロマイセス属(Saccharomyces sp.) 由来のα−グルコシダーゼ、１００Ｕ／ｍｌ（タンパク質濃度５ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌの代わりに東洋紡績株式会社製のバチルス ステアロサーモフィラス由来のα−グルコシダーゼ ＡＧＨ−２１１、１００Ｕ／ｍｌ（タンパク質濃度１ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌを使用する以外は、実施例１と同様の操作を行い、バチルス ステアロサーモフィラス由来のα−グルコシダーゼを多孔質キトサンビーズに固定化した。
【００７０】
次に、このようにして得られた固定化酵素各５０ｍｇ（湿重量）を、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で調製した４０（ｗ／ｖ）％マルトース溶液１ｍｌ及びジメチルスルホキシドで調製した５（ｗ／ｖ）％の上記式（５）で示されるＲＳ−２−置換アルコール溶液０．２ｍｌの混合溶液に加え、４０℃において２０時間（１２０ｒｐｍ）振盪することにより、反応を行った。このときの、２−置換アルコールのクロマノール配糖体への転移率を下記表２に示す。
【００７１】
【表１】
【表２】
表１及び表２に示される結果から、サッカロマイセス属由来のα−グルコシダーゼおよびバチルス ステアロサーモフィラス由来のα−グルコシダーゼ双方について、固定化率に関しては、キトパール及び各種イオン交換樹脂間で大きな相違はないものの、転移率はキトパールを使用した場合の方が各種イオン交換樹脂を使用した場合に比べて有意に大きく、これより、キトパールを固定化担体として用いた固定化酵素が酵素吸着能に対して糖転移活性に優れていることが判る。
【００７４】
実施例３
担体としてキトパール ＢＣＷ−２５１０及びＢＣＷ−３５１０、各１ｇ（湿重量）に、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解した東洋紡績株式会社製のバチルス ステアロサーモフィラス由来のα−グルコシダーゼ ＡＧＨ−２１１、１００Ｕ／ｍｌ（タンパク質濃度１ｍｇ／ｍｌ）を１ｍｌ加え、３０℃にて２時間振盪（１２０ｒｐｍ）することにより、固定化を行った。この際、未吸着の酵素は、緩衝液にて酵素が溶出しなくなるまで振盪洗浄を行うことにより、除去した。
【００７５】
次に、このようにして得られた固定化酵素各５０ｍｇ（湿重量）を、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で調製した３０（ｗ／ｖ）％マルトース溶液とＤＭＳＯで調製した５（ｗ／ｖ）％の上記式（５）で示されるＲＳ−２−置換アルコール溶液の両者の量を下記表３に示されるように変えて混合した溶液中に添加し、４０℃において２０時間振盪（１２０ｒｐｍ）することにより反応を行った。この時の、２−置換アルコールのクロマノール配糖体への転移率を下記表３に示す。
【００７６】
【表３】
表３に示される結果から、キトパール ＢＣＷ−２５１０を固定化担体として用いた場合、ＤＭＳＯ濃度及び２−置換アルコール濃度を高くしても、高い転移率を示すことが分かった。
【００７８】
実施例４
（１）ＧＬＡ未処理固定化酵素の調製
担体としてキトパール ＢＣＷ−２５１０、ＢＣＷ−３０１０、各１ｇ（湿重量）に、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解した東洋紡績株式会社製のサッカロマイセス属(Saccharomyces sp.) 由来のα−グルコシダーゼ、２００Ｕ／ｍｌ（タンパク質濃度１０ｍｇ／ｍｌ）を１ｍｌ加え、３０℃にて２時間振盪（１２０ｒｐｍ）することにより、固定化を行なった。未吸着の酵素は、緩衝液にて酵素が溶出しなくなるまで振盪洗浄を行ない除去した。各担体への酵素の見掛け上の固定化率を実施例１と同様にして算出し、結果を表４に示す。
【００７９】
（２）ＧＬＡ処理固定化酵素の調製
担体として、キトパール ＢＣＷ−２５１０、ＢＣＷ−３０１０、各１ｇ（湿重量）を分取し、２（ｖ／ｖ）％ＧＬＡ溶液２ｍｌ中にそれぞれ入れ、３０℃において２時間振盪処理（１２０ｒｐｍ）した。処理後、濾紙上にＧＬＡ処理した担体を集め、この濾紙を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）３０ｍｌで３回洗浄を行なった。
【００８０】
次に、このようにしてＧＬＡ処理された担体１ｇ（湿重量）に、５０ｍＭリン酸衝撃液（ｐＨ６．５）に溶解した東洋紡績株式会社製のサッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）由来のα−グルコシダーゼ、２００Ｕ／ｍｌ（タンパク質濃度１０ｍｇ／ｍｌ）を１ｍｌ加え、３０℃にて２時間振盪（１２０ｒｐｍ）し、固定化を行なった。未吸着の酵素は、緩衝液にて酵素が溶出しなくなるまで振盪洗浄を行ない除去した。各担体への酵素の見掛け上の固定化率を実施例１と同様にして算出し、結果を表４に示す。
【００８１】
【表４】
表４のから、キトパール ＢＣＷ−２５１０及びＢＣＷ−３０１０の両方について、ＧＬＡ処理により酵素の固定化率が改善されることが示される。
【００８３】
（３）固定化酵素の安定性の評価
上記（１）及び（２）において調製した、ＧＬＡ未処理固定化酵素およびＧＬＡ処理固定化酵素、各５０ｍｇ（湿重量）を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で調製した６０（ｗ／ｖ）％マルトース溶液１ｍｌおよびジメチルスルホキシドで調製した５（ｗ／ｖ）％の上記式（５）で示されるＲＳ−２−置換アルコール溶液０．２ｍｌの混合溶液に加え、４０℃で２０時間振盪（１２０ｒｐｍ）することにより、反応を行なった。反応終了後、この反応液を濾過して固定化酵素を回収し、同様の条件において糖転移反応をさらに２回繰り返し、それぞれの反応における転移率を求め、この結果から反応液中における各固定化酵素の安定性を評価した。その結果を表５に示す。
【００８４】
【表５】
表５に示される結果から、ＧＬＡ処理することにより反応液中のジメチルスルホキシドに対する、α−グルコシダーゼの安定性は飛躍的に向上することが分かった。また、キトパール ＢＣＷ−２５１０を固定化担体として用いた場合の転移率が最も高いことから、キトパール ＢＣＷ−２５１０を固定化担体として用いることが好ましいことが示された。
【００８６】
実施例５
（１）ＧＬＡ未処理固定化酵素の調製
担体としてキトパール ＢＣＷ−２５１０ １ｇ（湿重量）に、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解した東洋紡績株式会社製のバチルス ステアロサーモフィラス由来のα−グルコシダーゼ ＡＧＨ−２１１、１００Ｕ／ｍｌ（タンパク質濃度１ｍｇ／ｍｌ）を１ｍｌ加え、３０℃にて２時間振盪（１２０ｒｐｍ）することにより、固定化を行った。この際、未吸着の酵素は、緩衝液にて酵素が溶出しなくなるまで振盪洗浄を行うことにより、除去した。この結果、担体への酵素の固定化率は７５％であった。
【００８７】
（２）ＧＬＡ処理固定化酵素の調製
担体としてキトパール ＢＣＷ−２５１０を１ｇ（湿重量）を分取し、２（ｖ／ｖ）％ＧＬＡ溶液２ｍｌ中に入れ、３０℃において２時間振盪（１２０ｒｐｍ）した。処理後、濾紙上にＧＬＡ処理した担体を集め、この濾紙を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）３０ｍｌで３回洗浄を行った。
【００８８】
次に、このようにしてＧＬＡ処理された担体１ｇ（湿重量）に、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解した東洋紡績株式会社製のバチルス ステアロサーモフィラス由来のα−グルコシダーゼ ＡＧＨ−２１１、１００Ｕ／ｍｌ（タンパク質濃度１ｍｇ／ｍｌ）を１ｍｌ加え、３０℃にて２時間振盪（１２０ｒｐｍ）することにより、固定化を行った。この際、未吸着の酵素は、緩衝液にて酵素が溶出しなくなるまで振盪洗浄を行うことにより、除去した。この結果、担体への酵素の固定化率は９５％であった。
【００８９】
（３）固定化酵素の安定性の評価
上記（１）及び（２）において調製した、ＧＬＡ未処理固定化酵素及びＧＬＡ処理固定化酵素、各５０ｍｇ（湿重量）を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で調製した３０（ｗ／ｖ）％マルトース溶液０．９６ｍｌ及びジメチルスルホキシドで調製した５（ｗ／ｖ）％の上記式（５）で示されるＲＳ−２−置換アルコール溶液０．２４ｍｌの混合溶液に加え、４０℃で２０時間振盪（１２０ｒｐｍ）することにより反応を行った。反応終了後、反応液を濾過して固定化酵素を回収し、同様の条件において糖転移反応をさらに繰り返し、それぞれの反応における転移率を求め、この結果から反応液中における各固定化酵素の安定性を評価した。その結果を下記表６に示す。
【００９０】
【表６】
上記（１）および（２）に示される結果から、ＧＬＡ処理により酵素の固定化率が改善され、また、表６に示される結果から、ＧＬＡ処理することにより反応液中のジメチルスルホキシドに対する、α−グルコシダーゼの安定性は飛躍的に向上することが示される。
【００９２】
実施例６
（１）担体のＧＬＡ処理
固定化担体としてキトパール ＢＣＷ−２５１０を用い、この担体、１ｇ（湿重量）を分取し、２（ｖ／ｖ）％ＧＬＡ溶液２ｍｌ中に入れ、３０℃において２時間振盪処理（１２０ｒｐｍ）した。処理後、濾紙上にＧＬＡ処理された担体を集め、この濾紙について５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）３０ｍｌで３回振盪洗浄を行なった。
【００９３】
（２）α−グルコシダーゼの固定化
上記（１）によって得られたＧＬＡ処理担体１ｇ（湿重量）に、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解した東洋紡績株式会社製のサッカロマイセス属(Saccharomyces sp.) 由来のα−グルコシダーゼ、２００Ｕ／ｍｌ（タンパク質濃度１０ｍｇ／ｍｌ）を１ｍｌ加え、３０℃にて２時間振盪（１２０ｒｐｍ）し、固定化を行なった。未吸着の酵素は、緩衝液にて酵素が溶出しなくなるまで振盪洗浄を行なった。このようにして得られた固定化酵素は、担体１ｇ（湿重量）当たり、２００Ｕのα−グルコシダーゼを見かけ上固定化していた。
【００９４】
（３）クロマノール配糖体の合成
上記（２）によって得られた固定化酵素１ｇ（湿重量）を、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で調製した４０％（ｗ／ｖ）マルトース溶液２０ｍｌおよびジメチルスルホキシドで調製した５（ｗ／ｖ）％の上記式（５）で示されるＲＳ−２−置換アルコール溶液４ｍｌの混合溶液に加え、４０℃において２０時間振盪（１２０ｒｐｍ）することにより、反応を行なった。このときの２−置換アルコールのクロマノール配糖体への転移率は約４０％であった。
【００９５】
次に、この反応液を濾過することにより固定化酵素を回収した後、反応液を３０％メタノール溶液で平衡化したＸＡＤ−４（オルガノ株式会社製）カラムにのせ、非吸着物を３０％メタノールで溶出した後、さらに、８０％メタノール溶液でクロマノール配糖体を溶出させた。このようにして得られたクロマノール配糖体画分をシリカゲルクロマトグラフィー［酢酸エチル：メタノール＝５：１（ｖ／ｖ）］処理することによって、クロマノール配糖体として下記式（６）で示される２−（α−Ｄ−グルコピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール（一般式（１）のｎ＝１、Ｒ1 ＝Ｒ2 ＝Ｒ3 ＝Ｒ4 ＝ＣＨ3 、Ｒ5 ＝Ｈに相当する）が高純度で約７０ｍｇ得られた。
【００９６】
【化９】
このようにして得られた２−（α−Ｄ−グルコピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オールの赤外線吸収スペクトルを図１に示す。
【００９８】
また、上記化合物の 1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ−ＮＭＲ、質量分析及び比旋光度の結果は以下のとおりである。
【００９９】
1Ｈ−ＮＭＲ δ（２７０ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ6 ）：
１．２３および１．２５（ｓ，３Ｈ）
１．６９から１．７６（ｍ，１Ｈ）
１．８７から１．９２（ｍ，１Ｈ）
１．９７（ｓ，３Ｈ）
２．０２（ｓ，３Ｈ）
２．０４（ｓ，３Ｈ）
２．５１（ｂｒｏａｄ ｔ，２Ｈ）
３．０５から４．８８（ｍ，１３Ｈ）
７．３９（ｓ，１Ｈ）
13Ｃ−ＮＭＲ δ（６７．８ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6 、プロトンデカップリングスペクトル）：
１１．７
１１．７
１２．６
１９．７および１９．８
２２．２および２２．４
２８．２
６０．６および６０．８
７０．０および７０．１
７１．２および７１．５
７１．９
７２．６および７２．９
７３．１
７３．８および７３．９
９８．７および９８．８
１１６．６および１１６．７
１２０．１および１２０．２
１２０．７および１２０．８
１２２．５
１４４．２
１４５．１
質量スペクトル（ＦＡＢ）
ｍ／ｚ ３９８ （分子イオンピーク）
比旋光度
【０１００】
【外１】
実施例７
（１）担体のＧＬＡ処理
固定化担体としてキトパール ＢＣＷ−２５１０を用い、この担体８０ｇ（湿重量）を分取し、２（ｖ／ｖ）％ＧＬＡ溶液１６０ｍｌ中に入れ、３０℃において２時間振盪（１２０ｒｐｍ）した。処理後、濾紙上にＧＬＡ処理された担体を集め、この濾紙について５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）２４００ｍｌで３回振盪洗浄を行った。
【０１０２】
（２）α−グルコシダーゼの固定化
上記（１）によって得られたＧＬＡ処理担体８０ｇ（湿重量）に、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解した東洋紡績株式会社製のバチルス ステアロサーモフィラス由来のα−グルコシダーゼ ＡＧＨ−２１１、１００Ｕ／ｍｌ（タンパク質濃度１ｍｇ／ｍｌ）を８０ｍｌ加え、３０℃にて２時間振盪（１２０ｒｐｍ）して、固定化を行った。未吸着の酵素は、緩衝液にて酵素が溶出しなくなるまで振盪洗浄を行った。このようにして得られた固定化酵素は、担体１ｇ（湿重量）当たり、１００Ｕのα−グルコシダーゼを見掛け上固定化していた。
【０１０３】
（３）クロマノール配糖体の合成
上記（２）によって得られた固定化酵素８０ｇ（湿重量）を、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で調製した３０（ｗ／ｖ）％マルトース溶液１５００ｍｌ及びジメチルスルホキシドで調製した５（ｗ／ｖ）％の上記式（５）で示されるＲＳ−２−置換アルコール３７５ｍｌの混合溶液に加え、４０℃において２０時間振盪（１２０ｒｐｍ）することにより反応を行った。この時の２−置換アルコールのクロマノール配糖体への転移率は約８７％であり、この反応液中のクロマノール配糖体は糖部分の構造が異なるものの混合物（すなわち、一般式（１）のｎ＝１、Ｒ1 ＝Ｒ2 ＝Ｒ3 ＝Ｒ4 ＝ＣＨ3 、Ｒ5 ＝Ｈで、かつＸで表わされる糖残基の異なった各種クロマノール配糖体が共存する混合物）であった。この反応液を１５分間煮沸処理することにより、α−グルコシダーゼを失活させ、２４，０００Ｕの東洋紡績株式会社製のリゾプス属由来のグルコアミラーゼを添加し、５０℃において２４時間反応させることにより、反応液中のクロマノール配糖体はほぼ、一般式（７）で示されるクロマノール配糖体１種類になった。この反応液を１５分間煮沸処理することにより、グルコアミラーゼを失活させた後、３０％メタノール溶液で平衡化したＸＡＤ−４（オルガノ株式会社製）カラムにアプライし、非吸着物を３０％メタノールで溶出後、８０％メタノール溶液でクロマノール配糖体を溶出させた。このようにして得られたクロマノール配糖体画分をシリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル：メタノール＝５：１（ｖ／ｖ））処理することにより、クロマノール配糖体として下記一般式（７）で示される２−（α−Ｄ−グルコピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール（一般式（１）のｎ＝１、Ｒ1 ＝Ｒ2 ＝Ｒ3 ＝Ｒ4 ＝ＣＨ3 、Ｒ5 ＝Ｈに相当する）を約２０ｇ得た。
【０１０４】
【化１０】
このようにして得られた一般式（７）で示されるクロマノール配糖体の赤外線吸収スペクトルを図２に示す。
【０１０６】
また、上記化合物の 1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ−ＮＭＲ、質量分析及び比施光度の結果は以下のとおりである。
【０１０７】
1Ｈ−ＮＭＲ δ（２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6 ）：
１．２３および１．２５（ｓ，３Ｈ）
１．６９から１．７６（ｍ，１Ｈ）
１．８７から１．９２（ｍ，１Ｈ）
１．９７（ｓ，３Ｈ）
２．０２（ｓ，３Ｈ）
２．０４（ｓ，３Ｈ）
２．５１（ｂｒｏａｄ ｔ，２Ｈ）
３．０５から４．８８（ｍ，１３Ｈ）
７．３９（ｓ，１Ｈ）
13Ｃ−ＮＭＲ δ（６７．８ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6 、プロトンデカップリングスペクトル）：
１１．７
１１．７
１２．６
１９．７および１９．８
２２．２および２２．４
２８．２
６０．６および６０．８
７０．０および７０．１
７１．２および７１．５
７１．９
７２．６および７２．９
７３．１
７３．８および７３．９
９８．７および９８．８
１１６．６および１１６．７
１２０．１および１２０．２
１２０．７および１２０．８
１２２．５
１４４．２
１４５．１
質量スペクトル （ＦＡＢ）：
ｍ／ｚ ３９８ （分子イオンピーク）
比施光度
【０１０８】
【外２】
【発明の効果】
上述したように、本発明の固定化酵素による配糖体の製造方法を用いて、糖転移作用を触媒する酵素を多孔質キトサンビーズに効果的に固定化することにより、（１）酵素活性を実質的に失活させることなく、安定な固定化酵素を得ることができ；（２）有機溶媒共存下においても酵素の活性を長期にわたり安定して維持でき；（３）使い捨てにすることなく、連続使用できるようになり；（４）本発明による固定化酵素を用いることにより、配糖体の生産効率を高めることができ；さらに、（５）合成された配糖体への異種タンパク質の混入を防ぎ、高品質の配糖体を収率よく合成することができるようになった。
【０１１０】
また、糖転移作用を触媒する酵素としてバチルス ステアロサーモフィラス由来のα−グルコシダーゼを用いることにより、有機溶媒共存下においても長期間安定である固定化酵素が調製でき、さらに、このようにして得られた固定化酵素を用いることにより生理活性および化学的安定性に優れた水溶性配糖体を製造できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 実施例６で得られた２−（α−Ｄ−グルコピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オールの赤外線吸収スペクトルである。
【図２】 実施例７で得られた２−（α−Ｄ−グルコピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オールの赤外線吸収スペクトルである。
Claims (6)
- 多孔質キトサンビーズにα−グルコシダーゼを固定化させた固定化酵素を用いて、水酸基を有する水に難溶な生理活性に優れた物質と糖とを有機溶媒共存下において反応させ、生理活性に優れた水溶性配糖体を生成することを特徴とする各種配糖体の製造方法。
- 該固定化酵素は多孔質キトサンビーズを架橋剤で架橋処理した後に酵素を固定化させたものである請求項１記載の方法。
- 該多孔質キトサンビーズの粒径が０．５〜３．０ｍｍである請求項１または２記載の方法。
- α−グルコシダーゼの多孔質キトサンビーズ上への固定化量が、該多孔質キトサンビーズ１ｇ（湿重量）当たり、０．０１〜１００ｍｇである請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
- 該配糖体が下記一般式（１）：
- 該糖がα−グルコシル糖化合物である請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
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