JPWO2008111526A1 - 糖オキサゾリン誘導体の製造方法 - Google Patents

Abstract

無保護糖よりオキサゾリン誘導体の簡便な製造方法並びにその生成物を使用した配糖体の製造法を提供する。ハロホルムアミジニウム誘導体を脱水縮合剤として用いて、遊離のヘミアセタール性ヒドロキシ基とアミド基を持つ糖からその糖オキサゾリン誘導体を水溶液中における一段階の工程で合成し、さらに該オキサゾリン誘導体を糖供与体とし、糖質加水分解酵素を使用して配糖体を製造する。本法は長い糖鎖に適用でき、生理活性オリゴ糖、ドラックデリバリーシステムのキャリア、界面活性剤、糖鎖医薬、糖ペプチド、糖タンパク質、糖鎖高分子などの製造に有用である。

Description

本発明は、無保護糖鎖を出発原料としてオキサゾリン誘導体を合成する方法及びそれによって得られた新規化合物、さらに該オキサゾリン誘導体を糖供与体として得られる配糖体の合成法に関するものである。

近年の科学技術の進歩により糖鎖がさまざまな生命現象を担うことが明らかになり、糖鎖化合物の重要性がますます強く認識されてきた。糖鎖化合物の合成法の一つとして、酵素触媒による配糖化反応が用いられている。酵素触媒による配糖化反応のうち糖供与体として糖オキサゾリン誘導体を用いる配糖化反応は付加反応で配糖化反応し、酸や水などの脱離を伴うことなく進行するために、非常に有用な配糖体の合成法である。糖鎖を付加した化合物やオリゴ糖鎖は、例えば、生理活性オリゴ糖、ドラックデリバリーシステムのキャリア、界面活性剤、糖鎖医薬、糖ペプチド、糖タンパク質、糖鎖高分子など、様々な用途に用いられて有用である。

アノマー炭素を活性化した糖誘導体は、糖加水分解酵素を用いるグリコシル化反応の糖供与体として知られ、その中でも、糖オキサゾリン誘導体は脱離基を持たない糖供与体として有用な基質である。しかし、従来、糖オキサゾリン誘導体の合成法は、有機溶媒の使用が不可欠であり、糖に存在するヒドロキシ基の保護と脱保護を含む多段階のステップを経て合成されてきた〔S. Shoda et al. Helv. Chim. Acta, 85, 3919 (2002) (非特許文献１)〕。とりわけ、オリゴ糖のオキサゾリン誘導体の合成は難しく〔Bing Li et al. J. AM. CHEM. SOC., 127, 9692 (2005) (非特許文献２)〕、ほとんど行われていないのが現状である。なお、従来の糖オキサゾリン誘導体の合成法としては、特開平9-3088号公報（特許文献１）、特開2003-12683号公報（特許文献２）なども知られている。こうした従来の化学合成法ではヒドロキシ基の保護・脱保護を伴うなどの多段階ステップを必要とするため操作が煩雑であり、長い糖鎖に適用するのは困難であることから、糖鎖合成において、保護・脱保護といったステップを使用することなく、糖オキサゾリン誘導体を簡便且つ穏和に合成する技術の開発が求められている。

こうした観点から、脱水縮合剤に水溶性カルボジイミドを用いて、無保護の糖から糖オキサゾリン誘導体を一段階で合成する方法が開発された〔J. Kadokawa et al., Heterocycles, 63(7), (2004), pp.1531-1535(非特許文献３)及び瘧師英利ほか、第２回東北大学バイオサイエンスシンポジウム要旨、「水溶性カルボジイミドを用いる糖オキサゾリン誘導体の一段階合成」、2005.5(非特許文献４)〕。また、脱水縮合剤にトリアジン誘導体を用いて水溶媒中で無保護の糖から糖オキサゾリン誘導体を直接合成する手法も開発されている〔第55回 高分子討論会、タイトル：「脱水縮合剤-酵素系による無保護糖のワンポット重合反応」、著者名：野口真人・三澤卓也・石原正規・小林厚志・正田晋一郎、雑誌名：Polymer Preprints, Japan Vol. 55, No. 2 (2006) pp 4826(非特許文献５); 2006 高分子学会東北支部研究発表会、タイトル：「酵素重合反応を利用する無保護糖から多糖のワンポット合成」、著者名：野口真人・三澤卓也・石原正規・小林厚志・正田晋一郎、雑誌名：2006 高分子学会東北支部研究発表会予稿集 pp 21(非特許文献６); 瘧師英利ほか、第3回東北大学バイオサイエンスシンポジウム要旨、「無保護糖のワンポット配糖化反応」、2006.5(非特許文献７)〕。

特開平9-3088号公報 特開2003-12683号公報 S. Shoda et al. Helv. Chim. Acta, 85, 3919 (2002) Bing Li et al. J. AM. CHEM. SOC., 127, 9692 (2005) J. Kadokawa, M. Mito, S. Takahashi, M. Noguchi, S. Shoda, "Direct Conversion of 2-Acetamido-2-Deoxysugars to 1,2-Oxazoline Derivatives by Dehydrative Cyclization", Heterocycles, 63(7), (2004), pp.1531-1535 瘧師英利、高橋智史、白鳥正人、野口真人、小林厚志、正田晋一郎、第２回東北大学バイオサイエンスシンポジウム要旨、「水溶性カルボジイミドを用いる糖オキサゾリン誘導体の一段階合成」、2005.5 第55回 高分子討論会、タイトル：「脱水縮合剤-酵素系による無保護糖のワンポット重合反応」、著者名：野口真人・三澤卓也・石原正規・小林厚志・正田晋一郎、雑誌名：Polymer Preprints, Japan Vol. 55, No. 2 (2006) pp 4826 2006 高分子学会東北支部研究発表会、タイトル：「酵素重合反応を利用する無保護糖から多糖のワンポット合成」、著者名：野口真人・三澤卓也・石原正規・小林厚志・正田晋一郎、雑誌名：2006 高分子学会東北支部研究発表会予稿集 pp 21 瘧師英利、三澤卓也、山本憲司、桑折道済、野口真人、小林厚志、正田晋一郎、第3回東北大学バイオサイエンスシンポジウム要旨、「無保護糖のワンポット配糖化反応」、2006.5

配糖体を酵素的に合成する場合の糖供与体として有用なオキサゾリン誘導体を合成するのに、ヒドロキシ基の保護・脱保護を伴うなどの多段階ステップを必要とする従来の合成法を適用したのでは、操作が煩雑であり、さらに、長い糖鎖に適用するのは困難であるといった問題がある。また、ルイス酸を使用して合成する方法もあるが、この方法ではオリゴ糖に存在するグリコシド結合の開裂が生起して低収率となってしまうなどの問題がある。こうした理由から、糖鎖合成において、保護・脱保護といったステップを使用することなく、糖オキサゾリン誘導体を簡便且つ穏和に合成する技術の開発が求められている。
ところで、糖オキサゾリン誘導体の構造を検討してみると、糖の還元末端の１位のヒドロキシ基と２位のデオキシ部位のアミド基との間での脱水縮合生成物であることがわかる。すなわち、分子内で脱水縮合反応が可能であれば、オキサゾリン誘導体の一段階での合成が可能となる。脱水縮合剤は、カルボン酸のカルボニル炭素の活性化剤として用いられており、これと同様に糖の還元末端のアノマー位炭素を活性化してアミド基のカルボニル酸素をアノマー位炭素に求核攻撃をさせれば、オキサゾリン誘導体が生成することになる。
この観点から、本発明者らのグループは、これまで脱水縮合剤として上記したように水溶性カルボジイミドやトリアジン誘導体を使用した方法を提案してきたが、依然として、より操作が簡単で且つより高い収率で目的オキサゾリン誘導体を合成する方法、さらに水性媒質中でより好適に反応を行うことができ、より長い糖鎖に適用することができる方法の開発が求められている。

本発明者らは糖供与体として有用なオキサゾリン誘導体合成法につき鋭意研究の結果、脱水縮合剤としてハロホルムアミジニウム誘導体を使用して、無保護糖鎖を出発原料として直接オキサゾリン誘導体を合成できることを見出し、さらに、こうしたオキサゾリン誘導体を糖供与体として使用して配糖体を簡単な手法で合成することにも成功し、本発明を完成した。

本発明では、次なる態様が提供される。
〔１〕一般式(1):

（上式中、R¹はアルキル基、R²、R³及びR⁴は、それぞれ同一でも異なっていてもよく、互いに独立に、水素原子、ヒドロキシ基、ヒドロキシメチル基、アセトアミド基、カルボキシ基、硫酸基、リン酸基または糖残基およびそれらの修飾物残基からなる群から選択されたものである）
のヘミアセタール性のヒドロキシ基とアミド基をもつ糖を一般式(2):

（上式中、R⁵、R⁶、R⁷及びR⁸は、それぞれ同一でも異なっていてもよく、互いに独立に、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアルケニル基及び置換されていてもよいアリール基からなる群から選択されたもので、R⁵とR⁷あるいはR⁶とR⁸で環を形成していてよいし、あるいはR⁵とR⁶あるいはR⁷とR⁸で環を形成していてよく、Xはハロゲン原子であり、そしてY^-は陰イオンである）
のハロホルムアミジニウム誘導体で処理することを特徴とする、一般式(3):

（上式中、R¹、R²、R³及びR⁴は、上記と同様の意味を有するものである）
で示されるオキサゾリン誘導体の合成方法。
〔２〕Yが、ハロゲン原子、OH、BF₄、またはPF₆であり、一般式(1)の糖と一般式(2)のハロホルムアミジニウム誘導体との反応を水を含む溶媒中で行うことを特徴とする上記〔１〕記載の合成方法。
〔３〕(1)一般式(1)の糖が、N-アセチルグルコサミン、N-アセチルガラクトサミン及びN-アセチルマンノサミンからなる群から選択されたもの、
(2)一般式(1)の糖が、N-アセチルラクトサミン、N,N'-ジアセチルキトビオース、ヒアルロン酸二糖及びグリコサミノグリカン二糖からなる群から選択されたもの、あるいは
(3)一般式(1)の糖が、N結合型糖タンパク質糖鎖、O結合型糖タンパク質糖鎖及びキトオリゴ糖からなる群から選択されたもの、
であることを特徴とする上記〔１〕又は〔２〕記載の合成方法。

〔４〕一般式(1)のヘミアセタール性のヒドロキシ基とアミド基をもつ糖（式中、R¹、R²、R³及びR⁴は、上記と同様の意味を有するものである）を一般式(2)のハロホルムアミジニウム誘導体（式中、R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、X及びY^-は、上記と同様の意味を有するものである）で処理して一般式(3)で示されるオキサゾリン誘導体（式中、R¹、R²、R³及びR⁴は、上記と同様の意味を有するものである）を合成し、次に得られた一般式(3)のオキサゾリン誘導体を糖供与体とし、糖受容体存在下に、糖転移酵素又は糖質加水分解酵素と接触せしめ、糖鎖付加生成物を得ることを特徴とする配糖体の合成方法。
〔５〕糖転移酵素又は糖質加水分解酵素が、キチナーゼ、変異型キチナーゼ、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼM、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼA、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼからなる群から選択されたものであることを特徴とする上記〔４〕記載の合成方法。
〔６〕(1)一般式(1)の糖が、N-アセチルグルコサミン、N-アセチルガラクトサミン及びN-アセチルマンノサミンからなる群から選択されたもの、
(2)一般式(1)の糖が、N-アセチルラクトサミン、N,N'-ジアセチルキトビオース、ヒアルロン酸二糖及びグリコサミノグリカン二糖からなる群から選択されたもの、あるいは
(3)一般式(1)の糖が、N結合型糖タンパク質糖鎖、O結合型糖タンパク質糖鎖及びキトオリゴ糖からなる群から選択されたもの、
であることを特徴とする上記〔４〕又は〔５〕記載の合成方法。

〔７〕一般式(4):

（上式中、R⁹はアルキル基で、R¹⁰〜R¹⁹は、それぞれ同一でも異なっていてもよく、互いに独立に、水素原子、ヒドロキシ基、アセトアミド基、カルボキシ基、硫酸基、リン酸基または糖残基及びそれらの修飾物残基からなる群から選択されたものである、但し、R¹⁰〜R¹⁹のうちの少なくとも一つは、糖残基である）
で表されるオキサゾリン誘導体。
〔８〕一般式(4)のオキサゾリン誘導体（式中、R⁹〜R¹⁹は、上記と同様の意味を有するものである）を糖供与体とし、糖受容体存在下に、糖転移酵素又は糖質加水分解酵素と接触せしめ、糖鎖付加生成物を得ることを特徴とする配糖体の合成方法。

本発明では、簡便且つ穏和な手法で、そして一段階の工程で、しかも良好な収率で、無保護糖より糖供与体であるオキサゾリン誘導体を合成でき、長い糖鎖に適用可能で、種々、様々な糖鎖（オリゴ糖鎖及びポリ糖鎖、さらに分岐した糖鎖を含む）を、各種の化合物や糖に対して配糖化できる技術となるので、例えば、生理活性オリゴ糖、ドラックデリバリーシステムのキャリア、界面活性剤、糖鎖医薬、糖ペプチド、糖タンパク質、糖鎖高分子など、様々な用途の物質製造に用いられて有用である。
本発明のその他の目的、特徴、優秀性及びその有する観点は、以下の記載より当業者にとっては明白であろう。しかしながら、以下の記載及び具体的な実施例等の記載を含めた本件明細書の記載は本発明の好ましい態様を示すものであり、説明のためにのみ示されているものであることを理解されたい。本明細書に開示した本発明の意図及び範囲内で、種々の変化及び／又は改変（あるいは修飾）をなすことは、以下の記載及び本明細書のその他の部分からの知識により、当業者には容易に明らかであろう。本明細書で引用されている全ての特許文献及び参考文献は、説明の目的で引用されているもので、それらは本明細書の一部としてその内容はここに含めて解釈されるべきものである。

実施例1において得られた、目的物を含む反応液の¹H NMRスペクトルである。図中のDMIは1,3-ジメチル-2-イミダゾリジノン、Et₃Nはトリエチルアミン、PhSO₃Naはベンゼンスルホン酸ナトリウムを表す。 実施例1において得られた、目的物を含む反応液の¹³C NMRスペクトルである。図中のDMIは1,3-ジメチル-2-イミダゾリジノン、Et₃Nはトリエチルアミン、PhSO₃Naはベンゼンスルホン酸ナトリウムを表す。 実施例2において得られた、目的物を含む反応液の¹H NMRスペクトルである。図中のDMIは1,3-ジメチル-2-イミダゾリジノン、Et₃Nはトリエチルアミン、PhSO₃Naはベンゼンスルホン酸ナトリウムを表す。 実施例2において得られた、目的物を含む反応液の¹³C NMRスペクトルである。図中のDMIは1,3-ジメチル-2-イミダゾリジノン、Et₃Nはトリエチルアミン、PhSO₃Naはベンゼンスルホン酸ナトリウムを表す 実施例3において得られた、目的物を含む反応液の¹H NMRスペクトルである。図中のDMIは1,3-ジメチル-2-イミダゾリジノン、Et₃Nはトリエチルアミン、PhSO₃Naはベンゼンスルホン酸ナトリウムを表す。 実施例3において得られた、目的物を含む反応液の¹³C NMRスペクトルである。図中のDMIは1,3-ジメチル-2-イミダゾリジノン、Et₃Nはトリエチルアミン、PhSO₃Naはベンゼンスルホン酸ナトリウムを表す。 実施例4において得られた、目的物を含む反応液の¹H NMRスペクトルである。図中のDMIは1,3-ジメチル-2-イミダゾリジノン、Et₃Nはトリエチルアミン、PhSO₃Naはベンゼンスルホン酸ナトリウムを表す。 実施例4において得られた、目的物を含む反応液の¹³C NMRスペクトルである。図中のDMIは1,3-ジメチル-2-イミダゾリジノン、Et₃Nはトリエチルアミン、PhSO₃Naはベンゼンスルホン酸ナトリウム、EtOHはエタノールを表す。 実施例5において得られた、目的物を含む反応液の¹H NMRスペクトルである。図中のDMIは1,3-ジメチル-2-イミダゾリジノン、Et₃Nはトリエチルアミン、PhSO₃Naはベンゼンスルホン酸ナトリウムを表す。 実施例6において得られた、目的物を含む反応液の¹H NMRスペクトルである。図中のDMIは1,3-ジメチル-2-イミダゾリジノン、Et₃Nはトリエチルアミン、PhSO₃Naはベンゼンスルホン酸ナトリウムを表す。 実施例7において得られた、目的物を含む反応液の¹H NMRスペクトルである。図中のDMIは1,3-ジメチル-2-イミダゾリジノン、Et₃Nはトリエチルアミン、PhSO₃Naはベンゼンスルホン酸ナトリウムを表す。 実施例9において得られた、目的物を含む反応液の¹H NMRスペクトルである。図中のDMIは1,3-ジメチル-2-イミダゾリジノン、Et₃Nはトリエチルアミンを表す。 実施例10において得られた、目的物を含む反応液の¹H NMRスペクトルである。図中のDMIは1,3-ジメチル-2-イミダゾリジノン、Et₃Nはトリエチルアミンを表す。 実施例11において得られた、目的物を含む反応液の¹H NMRスペクトルである。図中のDMIは1,3-ジメチル-2-イミダゾリジノン、Et₃Nはトリエチルアミン、PhSO₃Naはベンゼンスルホン酸ナトリウムを表す。 実施例12において得られた、目的物を含む反応液の¹H NMRスペクトルである。図中のDMIは1,3-ジメチル-2-イミダゾリジノン、Me₃Nはトリメチルアミン、PhSO₃Naはベンゼンスルホン酸ナトリウムを表す。 実施例13において得られた、目的物を含む反応液の¹H NMRスペクトルである。図中のDMIは1,3-ジメチル-2-イミダゾリジノン、DMCは2-クロロ-1,3-ジメチルイミダゾリニウムクロリド、Me₂EtNはN,N-ジメチルエチルアミン、PhSO₃Naはベンゼンスルホン酸ナトリウムを表す。 実施例14において得られた、目的物を含む反応液の¹H NMRスペクトルである。図中のDMIは1,3-ジメチル-2-イミダゾリジノン、DMCは2-クロロ-1,3-ジメチルイミダゾリニウムクロリド、n-Bu(Me)₂NはN-n-ブチルジメチルアミン、PhSO₃Naはベンゼンスルホン酸ナトリウムを表す。 実施例15において得られた、目的物を含む反応液の¹H NMRスペクトルである。図中のDMIは1,3-ジメチル-2-イミダゾリジノン、DMCは2-クロロ-1,3-ジメチルイミダゾリニウムクロリド、(i-Pr)₂EtNはN,N-ジイソプロピルエチルアミン、PhSO₃Naはベンゼンスルホン酸ナトリウムを表す。 実施例16において得られた、目的物を含む反応液の¹H NMRスペクトルである。図中のDMIは1,3-ジメチル-2-イミダゾリジノン、DMCは2-クロロ-1,3-ジメチルイミダゾリニウムクロリド、TMEDAはN,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン、PhSO₃Naはベンゼンスルホン酸ナトリウムを表す。 実施例20において得られた、生成物2-メチル(1,2-ジデオキシ-α-D-グルコピラノ)[2,1-d]-2-オキサゾリン-6-硫酸ナトリウム塩を含む反応液の¹H NMRスペクトルである。図中のDMIは1,3-ジメチル-2-イミダゾリジノン、Et₃Nはトリエチルアミン、PhSO₃Naはベンゼンスルホン酸ナトリウムを表す。 実施例21において得られた、生成物2-メチル(1,2-ジデオキシ-α-D-グルコピラノ)[2,1-d]-2-オキサゾリン-6-リン酸二ナトリウム塩を含む反応液の¹H NMRスペクトルである。図中のDMIは1,3-ジメチル-2-イミダゾリジノン、Et₃Nはトリエチルアミン、PhSO₃Naはベンゼンスルホン酸ナトリウムを表す。 実施例22において得られた、生成物2-メチル(1,2-ジデオキシ-α-D-グルコピラノ)[2,1-d]-2-オキサゾリンを含む反応液の¹H NMRスペクトルである。図中のDMIは1,3-ジメチル-2-イミダゾリジノン、Et₃Nはトリエチルアミン、PhSO₃Naはベンゼンスルホン酸ナトリウムを表す。 実施例23において得られた、生成物2-メチル(1,2-ジデオキシ-α-D-グルコピラノ)[2,1-d]-2-オキサゾリンを含む反応液の¹H NMRスペクトルである。図中のDMPは1,3-ジメチル-3,4,5,6-テトラヒドロ-2(1H)-ピリミジノン、Et₃Nはトリエチルアミン、PhSO₃Naはベンゼンスルホン酸ナトリウム、GlcNAcは原料のN-アセチルグルコサミンを表す。 実施例24において得られた、生成物2-メチル[3-O-[4-O-[3-O-(β-D-グルクロノピラノシル)-2-アセトアミド-2-デオキシ-β-D-グルコピラノシル]-β-D-グルクロノピラノシル]-1,2-ジデオキシ-α-D-グルコピラノ][2,1-d]-2-オキサゾリンを含む反応液の¹H NMRスペクトルである。図中のDMIは1,3-ジメチル-2-イミダゾリジノン、Et₃Nはトリエチルアミンを表す。 実施例25において得られた生成物を含む反応液の¹H NMRスペクトルである。 実施例26において得られた生成物を含む反応液の¹H NMRスペクトルである。

本発明により、無保護糖鎖を出発原料としてオキサゾリン誘導体を合成する方法及びそれによって得られた新規化合物、さらに該オキサゾリン誘導体を糖供与体として得られる配糖体の合成法が提供される。
該オキサゾリン誘導体としては、糖から誘導されたもの、糖供与体として機能する活性を有するものであれば特に限定されないが、好ましくは、無保護糖や無保護糖鎖などであるヘミアセタール性のヒドロキシ基とアミド基をもつ糖から合成されたもので、例えば、上記一般式(3)で示されるオキサゾリン誘導体が挙げられる。
一般式(3)で示されるオキサゾリン誘導体は、次の反応式で示されるようにして、一般式(1)のヘミアセタール性のヒドロキシ基とアミド基をもつ糖を脱水縮合剤である一般式(2)のハロホルムアミジニウム誘導体で処理して製造できる。

（上式中、R¹はアルキル基、R²、R³及びR⁴は、それぞれ同一でも異なっていてもよく、互いに独立に、水素原子、ヒドロキシ基、ヒドロキシメチル基、アセトアミド基、カルボキシ基、硫酸基、リン酸基または糖残基およびそれらの修飾物残基からなる群から選択されたもので、R⁵、R⁶、R⁷及びR⁸は、それぞれ同一でも異なっていてもよく、互いに独立に、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアルケニル基及び置換されていてもよいアリール基からなる群から選択されたもので、R⁵とR⁷あるいはR⁶とR⁸で環を形成していてよいし、あるいはR⁵とR⁶あるいはR⁷とR⁸で環を形成していてよく、Xはハロゲン原子であり、そしてY^-は陰イオンである）

本明細書中、「アルキル基」としては、直鎖又は分岐鎖のいずれであってもよく、例えばC_1-22アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、イソペンチル、tert-ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デカニル、ヘキサデカニル、エイコサニル等）等が挙げられ、好ましくは、C_1-6アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、tert-ブチル、ペンチル等）が挙げられ、さらに好ましくは、C_1-4アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、tert-ブチル等）が挙げられる。

本明細書中、糖残基とは糖から誘導されるものを指してよい。本明細書で「糖」とは、糖類、糖質、複合糖質などを含む意味と理解してよく、「糖類」とは、単糖類、単糖類が複数個縮合した小糖類（二糖類、オリゴ糖を含む）、多糖類を指すものである。糖類は、炭素原子とほぼ同数の酸素原子をもつポリヒドロキシアルデヒド、ポリヒドロキシケトン、及びこれらの誘導体（例えば、アミノ基をもつアミノ糖、アルデヒド基又は第一級ヒドロキシ基の部分がカルボキシル基となっているカルボン酸、アルデヒド基やケトン基がヒドロキシ基となっている多価アルコールなど）など、並びに、それらの縮重合体を指すものであってよい。「糖質」とは、糖類を主要な成分としてもつ物質を指すと理解してよく、糖のみから成るものを単純糖質、その他の物質（タンパク質、脂質、合成高分子などを含む）を含むものを複合糖質と考えてよい。

本発明の糖は、当該物質の起源、由来によって特に限定されることなく、天然から得られるもの、遺伝子工学的に動物細胞、植物細胞、微生物などにより合成したもの、酵素的に製造されたもの、醗酵により製造されたもの、あるいは人工的に化学合成されたものなどが包含されてよい。糖には、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖が包含されてよく、単糖ではグルコース、ガラクトース、マンノース、グルコサミン、N-アセチルグルコサミン、ガラクトサミン、N-アセチルガラクトサミン、マンノサミン、N-アセチルマンノサミン、フルクトース、グルクロン酸、イズロン酸などが挙げられ、二糖ではマルトース、イソマルトース、ラクトース、ラクトサミン、N-アセチルラクトサミン、セロビオース、メリビオース、N,N'-ジアセチルキトビオース、ヒアルロン酸二糖、グリコサミノグリカン二糖などが挙げられる。オリゴ糖としては、２個以上の単糖から構成される通常の意味でのオリゴ糖が包含され、通常２〜30個の単糖から構成されるもの、代表的には、２〜20個の単糖から構成されるものが挙げられ、グルコース、ガラクトース、マンノース、グルコサミン、N-アセチルグルコサミン、フルクトースなどから構成されるホモオリゴマー、あるいは、グルコース、ガラクトース、マンノース、グルコサミン、N-アセチルグルコサミン、フルクトース、シアル酸などの２成分以上より構成されるヘテロオリゴマーが挙げられ、例えば、マルトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、ラクトオリゴ糖、ラクトサミンオリゴ糖、N-アセチルラクトサミンオリゴ糖、セロオリゴ糖、メリビオオリゴ糖、N-アセチルキトトリオース、N-アセチルキトテトラオース、N-アセチルキトペンタオースなどが挙げられる。またグリコサミノグリカンオリゴ糖、例えば、ヒアルロン酸オリゴ糖（例えば、前記したヒアルロン酸二糖や、ヒアルロン酸四糖など）、コンドロイチン硫酸オリゴ糖（例えば、コンドロイチン硫酸Ａオリゴ糖、コンドロイチン硫酸Ｃオリゴ糖など）、ケラタン硫酸オリゴ糖、ヘパリンオリゴ糖、ヘパラン硫酸オリゴ糖なども挙げられる。多糖としては、動物、植物（海藻を含む）、昆虫、微生物など広範囲な生物で見いだされているものが挙げられ、例えば、シアロ複合型糖鎖、N結合型糖鎖、O結合型糖鎖、グリコサミノグリカン、澱粉、アミロース、アミロペクチン、セルロース、キチン、グリコーゲン、アガロース、アルギン酸、ヒアルロン酸、イヌリン、グルコマンナンなどが挙げられる。

糖残基及びそれらの修飾物残基は、通常、単糖の１位又はオリゴ糖の還元末端の１位で残基となっているものが挙げられる。本発明で糖の修飾物とは、天然に存在するものから単離・精製する過程で修飾されたもの、酵素的に修飾されたもの、化学的に修飾されたもの、微生物を含めて生物学的な手法で修飾されたものであってよく、糖科学の分野で知られた修飾が含まれ、例えば、加水分解、酸化還元、エステル化、アシル化、アミノ化、エーテル化、ニトロ化、脱水反応、配糖化などによる修飾が包含されていてよい。
本発明を実施するに当たり、出発物質として使用されるヘミアセタール性のヒドロキシ基とアミド基をもつ糖としては、通常、還元末端の2位にアミド基を持つ糖が適応可能であるが、好ましくは還元末端の2位にアセトアミド基を持つ糖、例えば、単糖ではN-アセチルグルコサミン、N-アセチルガラクトサミン、N-アセチルマンノサミンなどが挙げられ、二糖、オリゴ糖、多糖などでは、還元末端がN-アセチルグルコサミン、N-アセチルガラクトサミンなどである糖で行うことが望ましい。出発物質である糖の好適なものの例としては、例えば、N-アセチルグルコサミン、N-アセチルガラクトサミン、N-アセチルマンノサミンなど、さらに、N-アセチルラクトサミン、N,N'-ジアセチルキトビオース、ヒアルロン酸二糖、グリコサミノグリカン二糖など、そして、N結合型糖タンパク質糖鎖、O結合型糖タンパク質糖鎖、キトオリゴ糖などが包含される。

本明細書中、「置換されていてもよいアルキル基」中の「アルキル基」としては、上記と同様なものが挙げられる。「置換されていてもよいアルケニル基」中の「アルケニル基」としては、直鎖又は分岐鎖のいずれであってもよく、例えばC_2-24アルケニル（例えば、ビニル、アリル、イソプロペニル、1-ブテニル、2-ブテニル、3-ブテニル、2-メチル-2-プロペニル、1-メチル-2-プロペニル、2-メチル-1-プロペニル等）が挙げられる。「置換されていてもよいアリール基」中の「アリール基」としては、例えばC_6-14アリール（例えば、フェニル、1-ナフチル、2-ナフチル、2-ビフェニリル、3-ビフェニリル、4-ビフェニリル、2-アンスリル、3-インデニル、5-フルオレニル等）等が挙げられ、好ましくは、フェニル基である。

また、「置換されていてもよいアルキル基」、「置換されていてもよいアルケニル基」及び「置換されていてもよいアリール基」における「アルキル基」、「アルケニル基」及び「アリール基」は、任意に、１個又はそれ以上の置換基で置換されていてもよく、その置換されている場合の「置換基」としては、当該分野で知られた置換基であってよく、例えばオキソ、チオキソ、置換基を有していてもよいイミノ、ハロゲン原子（例、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素等）、C_1-3アルキレンジオキシ（例、メチレンジオキシ、エチレンジオキシ等）、ニトロ、シアノ、C_1-6アルキル、C_2-6アルケニル、カルボキシC_2-6アルケニル（例、2-カルボキシエテニル、2-カルボキシ-2-メチルエテニル等）、C_2-6アルキニル、C_3-6シクロアルキル、C_6-14アリール（例、フェニル、1-ナフチル、4-ビフェニリル、2-アンスリル等）、C_1-8アルコキシ、C_1-6アルコキシ−カルボニル-C_1-6アルコキシ（例、エトキシカルボニルメチルオキシ等）、ヒドロキシ、C_6-14アリールオキシ（例、フェニルオキシ等）、C_7-16アラルキルオキシ（例えば、ベンジルオキシ等）、メルカプト、C_1-6アルキルチオ、C_6-14アリールチオ（例、フェニルチオ等）、C_7-16アラルキルチオ（例えば、ベンジルチオ等）、アミノ、モノ-C_1-6アルキルアミノ（例、メチルアミノ、エチルアミノ等）、モノ-C_6-14アリールアミノ（例、フェニルアミノ等）、ジ-C_1-6アルキルアミノ（例、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ等）、ジ-C_6-14アリールアミノ（例、ジフェニルアミノ等）、ホルミル、カルボキシ、C_1-6アルキル−カルボニル（例、アセチル、プロピオニル等）、C_3-6シクロアルキル−カルボニル（例、シクロプロピルカルボニル等）、C_1-6アルコキシ−カルボニル（例、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、tert-ブトキシカルボニル等）、C_6-14アリール−カルボニル（例、ベンゾイル等）、C_7-16アラルキル−カルボニル（例、フェニルアセチル等）、C_6-14アリールオキシ-カルボニル（例、フェノキシカルボニル等）、C_7-16アラルキルオキシ-カルボニル（例、ベンジルオキシカルボニル等）、５又は６員複素環カルボニル（例、ニコチノイル、テノイル、フロイル、モルホリノカルボニル、チオモルホリノカルボニル、ピペラジン-1-イルカルボニル、ピロリジン-1-イルカルボニル等）、カルバモイル、チオカルバモイル、モノ-C_1-6アルキル-カルバモイル（例、メチルカルバモイル等）、ジ-C_1-6アルキル-カルバモイル（例、ジメチルカルバモイル等）、C_6-14アリール-カルバモイル（例、フェニルカルバモイル等）、５又は６員複素環カルバモイル（例、3-ピリジルカルバモイル、2-チエニルカルバモイル等）、C_1-6アルキルスルホニル（例、メチルスルホニル等）、C_6-14アリールスルホニル（例、フェニルスルホニル等）、C_1-6アルキルスルフィニル（例、メチルスルフィニル等）、C_6-14アリールスルフィニル（例、フェニルスルフィニル等）、ホルミルアミノ、C_1-6アルキル−カルボニルアミノ（例、アセチルアミノ等）、C_6-14アリール-カルボニルアミノ（例、ベンゾイルアミノ等）、C_1-6アルコキシ−カルボニルアミノ（例、メトキシカルボニルアミノ等）、C_1-6アルキルスルホニルアミノ（例、メチルスルホニルアミノ等）、C_6-14アリールスルホニルアミノ（例、フェニルスルホニルアミノ等）、C_1-6アルキル−カルボニルオキシ（例、アセトキシ等）、C_6-14アリール−カルボニルオキシ（例、ベンゾイルオキシ等）、C_1-6アルコキシ−カルボニルオキシ（例、メトキシカルボニルオキシ等）、モノ-C_1-6アルキル-カルバモイルオキシ（例、メチルカルバモイルオキシ等）、ジ-C_1-6アルキル-カルバモイルオキシ（例、ジメチルカルバモイルオキシ等）、C_6-14アリール-カルバモイルオキシ（例、フェニルカルバモイルオキシ等）、ニコチノイルオキシ、置換基を有していてもよい５ないし７員飽和環状アミノ、５ないし10員芳香族複素環基（例、2-チエニル、2-ピリジル、3-ピリジル、4-ピリジル、2-キノリル、4-キノリル、8-キノリル、4-イソキノリル、1-インドリル、3-インドリル、2-ベンゾチアゾリル、2-ベンゾ[b]チエニル、2-ベンゾ[b]フラニル、3-ベンゾ[b]フラニル等）、スルホ、スルファモイル、スルフィナモイル、スルフェナモイル等が挙げられる。ここに挙げられた置換基において「アルキル部」（アルコキシ中のアルキル部を含む）、「アルキレン部」、「アルケニル部」、「アルキニル部」、「アリール部」、及び「複素環部」は、任意に、１個又はそれ以上の置換基で置換されていてもよく、その場合の置換基としては上記で説明したような基であってよい。上記「置換基」の説明で「置換基を有していてもよい」場合の置換基は、同様に、上記で説明したような基である。

「R⁵とR⁷あるいはR⁶とR⁸で環を形成」の場合の「環」としては、R⁵やR⁷が結合している窒素原子、あるいは、R⁶やR⁸が結合している窒素原子、と一緒になり、さらに酸素原子、窒素原子及び／又は硫黄原子を任意に１個又はそれ以上含んでいてよい炭素鎖により形成される５〜７員環であってよく、例えば、イミダゾリン環、ベンゾイミダゾリン環、ヒドロピリミジン環などであってよい。「R⁵とR⁶あるいはR⁷とR⁸で環を形成」の場合の「環」としては、R⁵やR⁶が結合している窒素原子、あるいは、R⁷やR⁸が結合している窒素原子、と一緒になり、さらに酸素原子、窒素原子及び／又は硫黄原子を任意に１個又はそれ以上含んでいてよい炭素鎖により形成される５〜７員環であってよく、例えば、ピロリジン環、ピペリジン環、ピペラジン環、モルホリン環、チオモルホリン環などであってよい。Xはハロゲン原子で、例えば、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子などである。
Y^-は、陰イオンであれば特に限定されるものではないが、適当なYとしては、例えば、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子などのハロゲン原子、OH、BF₄、PF₆などが挙げられる。

該ハロホルムアミジニウム誘導体(2)は、対応する尿素誘導体を適当なハロゲン化剤、例えば、クロル化剤などで処理することにより得られる。該ハロゲン化剤としては、例えば、ホスゲン、塩化オキザリル、五塩化リン、三塩化リン、オキシ塩化リン、それらに相当する臭化物などが挙げられる。化合物(2)の具体例としては、2-クロロ-1,3-ジメチルイミダゾリニウムクロライド(2-chloro-1,3-dimethylimidazolinium chloride; DMC)

、2-クロロ-1,3-ジメチルイミダゾリニウムヘキサフルオロフォスフェート、N,N,N',N'-テトラメチルクロロフォルムアミジニウムクロライド(N,N,N',N'-tetramethylchloroformamidinium chloride)、クロロ-N,N,N',N'-ビス（テトラメチレン）フォルムアミジニウムヘキサフルオロフォスフェート(chloro- N,N,N',N'-bis(tetramethylene)formamidinium hexafluorophosphate)、2-クロロ-1,3-ジメチル-3,4,5,6-テトラヒドロ-2(1H)-ピリミジニウムクロリドなどが挙げられる。

化合物(2)を使用しての化合物(3)の合成反応は、当該反応に悪影響を与えない限り、当該分野で知られた溶媒などの媒体中で行うことができる。当該反応は、無溶媒（反応原料が溶媒を兼ねる場合を含んでよい）中又は反応に不活性な溶媒存在下にて行うのが有利である。該溶媒は、反応が進行する限り特に限定されないが、好適には水性溶媒を使用でき、例えば、水、メタノール、エタノール、n-プロパノール、イソプロパノール、シクロヘキサノール、フルフリルアルコール、エチレングリコール、ベンジルアルコールなどのアルコール類、例えば、テトラヒドロフラン(THF)、ジオキサン、テトラヒドロフルフリルアルコール、ジエチレングリコール、シクロヘキシルメチルエーテル、メチルセロソルブ、セロソルブ、ブチルセロソルブ、メチルtert-ブタノール等のエーテル類、例えば、メチルエチルケトン、フルフラール、メチルイソブチルケトン、メシチルオキシド、ジアセトンアルコール、シクロヘキサノン等のケトン類、例えば、アセトニトリル、ベンゾニトリル等のニトリル類、例えば、ジメチルスルホキシド(DMSO)、スルホラン等のスルホキシド類、例えば、ホルムアミド、N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)、N,N-ジメチルアセトアミド等のアミド類、例えば、ギ酸メチル、ギ酸エチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、酢酸メトキシブチル、酢酸セロソルブ、炭酸ジエチル、炭酸グリコール等のエステル類、例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、無水酢酸等の有機酸類、ヘキサメチルホスホロトリアミド、ピリジン、キノリン等の複素環化合物、アニリン、N-メチルアニリン等の芳香族アミン類、ニトロ化合物等が挙げられる。これらの溶媒は単独で用いることもできるし、また必要に応じて二種又はそれ以上の多種類を適当な割合、例えば、1:1〜1:1000の割合で混合して用いてもよい。

当該反応の反応媒体は水ならびに通常使用される有機溶媒が利用可能であるが、水または水を含む有機溶媒が好ましく、アミンを有する塩溶液がより好ましい。また、緩衝能を有する塩水溶液を使用することもできる。緩衝剤としては、当該反応に悪影響を与えない限り、当該分野で知られたものの中から選択することができる。
典型的な場合、当該アミン溶液が示す水素イオン濃度pHは1.0〜13であって、より好ましくは7.5〜11の範囲である。また、反応温度は、好ましくは-80℃〜80℃であって、より好ましくは0℃〜40℃の範囲で実施することが望まれる。反応時間は、特に限定されず、所望の生成物が得られる限り、適宜適切な時間とすることができるが、例えば、1分間〜24時間であってよく、通常は、15分間〜5時間であってよく、代表的な場合には、15分間〜2時間が挙げられる。脱水縮合剤の量は特に制限は無いが、用いる糖に対して1当量〜5当量で行うことが望ましい。アミンの濃度は用いる脱水縮合剤に対して0.1当量〜100当量までであって、より好ましくは1当量〜4当量で実施することが望ましい。添加する糖の濃度は好ましくは0.1mM〜5Mであって、より好ましくは10mM〜１Mで実施することが望まれる。
該アミンとしては、第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン、第四級アミンのいずれであってもよいが、例えば、脂肪族炭化水素残基、芳香族炭化水素残基、複素環残基などを有するものが挙げられ、該脂肪族炭化水素残基としては、直鎖であっても分岐鎖のものであってよく、飽和又は不飽和のものであってよく、例えば、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アラルキル基、シクロアルキルアルキル基などが挙げられ、芳香族炭化水素残基としては、単環式のものあるいは二環又はそれ以上が縮合したものであってもよく、例えば、フェニル基、ナフチル基などが挙げられ、複素環残基としては、硫黄原子、酸素原子、窒素原子からなる群から選択されたものを１個以上有するものであってよく、ピリジル基、イミダゾリル基、チアゾリル基、キノリニル基などが包含されてよく、当該アミンとしては、ピペリジン、モルホリン、チオモルホリン、ピペラジン、ピロリジンなども包含されてよい。該アミンの代表的なものとしては、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジエチルメチルアミン、ジメチルエチルアミン、n-ブチルジメチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、テトラメチルエチレンジアミンなどの脂肪族炭化水素残基を有する第三級アミン類又はジアミン類が挙げられる。

生成物は反応液のまま、あるいは粗製物として次の反応に用いることもできるが、常法に従って反応混合物から単離することもでき、濃縮、減圧濃縮、蒸留、分留、溶媒抽出、液性変換、転溶、例えば、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、薄層クロマトグラフィー(TLC)、カラムクロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー、結晶化、再結晶等により、単離精製することができる。
本発明で得られたオキサゾリン誘導体(3)の中でも、一般式(4)で表されるオキサゾリン誘導体（式中、R⁹はアルキル基で、R¹⁰〜R¹⁹は、それぞれ同一でも異なっていてもよく、互いに独立に、水素原子、ヒドロキシ基、アセトアミド基、カルボキシ基、硫酸基、リン酸基または糖残基及びそれらの修飾物残基からなる群から選択されたものである、但し、R¹⁰〜R¹⁹のうちの少なくとも一つは、糖残基である）は、新規であり、糖供与体として有用である。ここで、置換基R⁹〜R¹⁹は、R¹〜R⁴並びに関連して上記で説明したと同様の基である。本オキサゾリン誘導体(4)は、糖鎖を付加した化合物やオリゴ糖鎖を合成する場合の糖供与体として有用であり、例えば、生理活性オリゴ糖、ドラックデリバリーシステムのキャリア、界面活性剤、糖鎖医薬、糖ペプチド、糖タンパク質、糖鎖高分子などの合成用など、様々な用途に用いられて有用である。代表的な一般式(4)のオキサゾリン誘導体としては、式中、R⁹はアルキル基で、R¹⁰〜R¹⁹は、それぞれ同一でも異なっていてもよく、互いに独立に、ヒドロキシ基、アセトアミド基または糖残基及びそれらの修飾物残基からなる群から選択されたもの、但し、R¹⁰〜R¹⁹のうちの少なくとも一つは、糖残基であるものが挙げられる。

本発明で得られたオキサゾリン誘導体(3)は、それを糖供与体（ドナー）として使用し、糖受容体（アクセプター）存在下に糖転移反応を行い、糖鎖の導入された有機化合物、すなわち、配糖体を合成することができる。当該糖転移反応は、酵素を使用した手法を好適に使用できる。当該酵素としては、所要の反応を行うことができる限り特には限定されないが、例えば、糖転移反応触媒酵素として知られたもののうちから選択してそれを使用できる。当該酵素は、単独で用いることもできるし、また必要に応じて二種又はそれ以上の多種類を適当な割合で混合して用いてもよい。糖転移反応に用いる糖転移反応触媒酵素としては特に制限はないが、代表的な糖転移反応触媒酵素としては、糖転移酵素、糖加水分解酵素（又は糖質加水分解酵素）を使用できる。該オキサゾリン誘導体(3)は、糖加水分解酵素を使用して好適に配糖体を与える。

糖加水分解酵素としては、ヒトを含めた動物、植物、微生物から得られたもの、遺伝子工学的手法で産生されたリコンビナント酵素、変異型酵素、固定化酵素などが包含される。代表的な糖加水分解酵素としては、キチナーゼ、変異型キチナーゼ、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼなどのエンドグリコシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼなどが挙げられる。キチナーゼ及び変異型キチナーゼとしては、Bacillus属菌由来のキチナーゼ(chitinases)が包含され、S. Shoda et al., Helvetica Chemic Acta, Vol. 85, pp.3919-3936 (2002)に開示されているものが挙げられ、例えば、Bacillus circulans WL-12由来のキチナーゼA1及びその変異型キチナーゼ、すなわち、E204Q, D202N, D200N, Y279F, D280N, W433Fなどであってよい。エンドグリコシダーゼ(endoglycosidases)としては、代表的には、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ(endo-β-N-acetylglucosaminidases)が挙げられ、例えば、Mucor hiemalis由来のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼM(endo-β-N-acetylglucosaminidase M; Endo M) (Yamamoto, K. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 203, pp.244-252 (1994))、Arthrobacter protophormiae由来のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼA(endo-β-N-acetylglucosaminidase A; Endo A) (Takegawa, K. et al., Biochem. Int., 24, pp.849-855 (1991))などが包含される。ヒアルロニダーゼとしては、哺乳動物由来のもの、例えば、高等動物の睾丸、精液、皮膚、脾臓から得られたもの、ヒル、ハチ毒液、蛇毒から得られたもの、肺炎球菌、連鎖球菌、ブドウ球菌、ガス壊疽菌などの微生物から得られたものであってもよく、代表的には、牛精巣ヒアルロニダーゼ、羊精巣ヒアルロニダーゼなどが挙げられる。コンドロイチナーゼとしては、例えば、Flavobacterium heparinum由来のもの、Proteus vulgaris由来のもの、Arthrobacter aurescens由来のものなどが挙げられ、Chondroitinase ABC (Proteus vulgaris), Chondroitinase AC II Arthro (Arthrobacter aurescens), Chondroitinase B (Flavobacterium heparinum)（生化学工業）などを市場から入手できる。

該酵素は、そのままか、或いは固定化した形で使用することができる。固定化は、当業者に周知の方法（例えば、架橋法、物理的吸着法、包括法等）で行い得る。固定化担体としては、一般に用いられているものであれば何れでもよく、例えば、セルロース、アガロース、デキストラン、κ-カラギナン、アルギン酸、ゼラチン、酢酸セルロース等の多糖類；例えばグルテン等の天然高分子；例えば活性炭、ガラス、白土、カオリナイト、アルミナ、シリカゲル、ベントナイト、ヒドロキシアパタイト、リン酸カルシウム等の無機物；ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリプロピレングリコール、ウレタン等の合成高分子などが挙げられる。該担体は、交差結合型のもの、ジエチルアミノエチル基、カルボキシメチル基などのイオン交換型の基を結合せしめてあるもの、BrCN処理、エポキシ化、N-ヒドロキシコハク酸イミド化などの手法で予め活性化されているものなども包含されてよく、さらに、酵素の固定化及びリガンドの固定化用に市販されているものの中から選択して使用することもできる。また、酵素を産生する微生物を使用してもよいが、その場合菌体は、マイクロカプセルに封入した形で使用することもでき、固定化菌体も使用でき、当該分野で知られた方法から適宜選択して使用できる。

本発明に係る配糖化反応の方法としては、前記糖供与体のオキサゾリン誘導体(3)を糖受容体存在下、糖加水分解酵素などの糖転移反応を触媒する酵素を作用させて、配糖体を生成する方法であれば特に限定されず、原料化合物の水溶液に、酵素を含有する緩衝液または水溶液を混合することで反応を開始する。反応は、通常、水中、或いは水と水混和性の有機溶媒との混合系、さらには、水に実質的に不溶性ないし難溶解性の有機溶媒と水との液体二相系で行うことができるが、一般的には水性系で行うことが好ましい。また、出発原料は、必要に応じて、適当な有機溶媒、例えばエタノール、メタノール、ジオキサン、ジメチルスルホキシド等に溶解した後に、該溶解液を水性溶液にして用いることもできる。また、反応条件は、配糖化生成物の生成を損なわない範囲で選択できる。基質である糖供与体並びに糖受容体の濃度は、好ましくは0.001〜20%、より好ましくは0.01〜10%である。さらに、反応液のpHは、好ましくは５〜13、より好ましくは６〜10であり、反応温度は好ましくは10〜50℃、より好ましくは20〜40℃である。pHを安定させるために緩衝液（例えば、リン酸塩緩衝液、クエン酸塩緩衝液、Tris緩衝液など）を使用することもできる。さらに、pHを調節するために、酸、塩基を使用して調節することもできる。また、反応時間は、１分間〜200時間、好ましくは20分間〜150時間であるが、それぞれの酵素濃度や使用糖供与体並びに糖受容体により適宜決められるべきである。

酵素産生生物（例えば、形質転換体など）を使用する場合、反応をより効率的に進行させるために、グルコースなどの糖類、酢酸などの有機酸、エタノール、グリセロールなどのエネルギー物質を添加することができる。これらは、各々単独で用いてもよく、それらの混合物の形態で用いてもよい。添加量は、基質に対して好ましくは100分の１〜10倍量である。さらに、グルコースなどの糖類、酢酸などの有機酸、グリセロールなどのエネルギー物質、補酵素、補酵素再生酵素および補酵素再生酵素の基質をそれぞれ組み合わせて用いてもよい。これらは、本来、菌体中に蓄積されているが、必要に応じてこれら物質を添加することにより、反応速度、収率等を上昇させることができる場合があり、適宜選択され得る。必要に応じて反応系内には、基質、当該酵素、酵素産生微生物の菌体、その培養物、それらの処理物並びに抽出物から成る群から選ばれたもの、さらにはその他のものを、逐次添加したり、連続的に添加することも可能である。生成物を連続的に取り出しながら反応を行うことにより、反応速度を高めることなどもできる。

反応はバッチ式又は連続方式で行いうるし、膜リアクターなども使用できる。反応によって生成した配糖体は、慣用の分離精製手段によって単離精製できる。例えば、反応液から直接または、菌体を使用した場合には菌体を分離した後、膜分離、有機溶媒（例えば、トルエン、クロロホルムなど）による抽出、濃縮、減圧濃縮、蒸溜、分留、晶析、再結晶、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、薄層クロマトグラフィー(TLC)、カラムクロマトグラフィーなどの通常の精製方法に供することができる。例えば、反応終了後、酢酸ブチル、酢酸エチル、トルエン、クロロホルム等の有機溶媒で反応液から生成物を抽出し、溶媒を留去することにより粗生成物を得ることができる。該粗生成物は、それをそのまま使用してもよいが、必要によりシリカゲルカラムクロマトグラフィー等の手段により精製した後、さらにセルロース誘導体等の担体（光学活性担体を含む）を使用した高速液体クロマトグラフィー等の手段により精製してもよい。酵素を反応溶液と接触させることにより、目的とする酵素反応を行わせることができるが、酵素と反応溶液の接触形態はこれらの具体例に限定されるものではない。反応溶液は、基質や酵素反応に必要なものを、酵素活性の発現に望ましい環境を与える適当な溶媒に溶解したものである。

本配糖化反応で、酵素と、糖供与体及び糖受容体を含有する基質溶液とは、回分法、あるいは連続法で接触せしめてその配糖化反応させることができ、工業的に実施するに適した方法を適宜選択して行うことができる。該糖受容体と該糖供与体とを併せた基質濃度は、約 1〜50 w/v% が適している。より好適な態様では、オキサゾリン誘導体(3)の濃度が、約 5〜20 w/v% 、そして糖受容体の濃度が、約 0.001〜0.4 mol/L である。基質溶液に、酵素を安定化するのに有用な金属塩などを添加しておくこともできる。
上記配糖化反応条件としては、酵素が安定で、しかも充分に作用し得る条件、例えば pH 約 3〜10、より好ましくは pH 約 5〜10、温度約 20 〜80℃、より好ましくは約 30 〜70℃の範囲で選ばれる。キチナーゼA1及びその変異型キチナーゼ、Endo A 、Endo Mなどでは、その酵素が安定であるpHを採用でき、例えば pH 約４〜７、望ましくはpH 5.5〜６であり、温度は、例えば50℃以下の温度、好ましくは37℃付近で配糖化を行えば良い。

本発明の好ましい実施態様に従うと、バイオリアクターは、酵素担持された担体が反応させるべき流体と接触できるようにする装置を有しているものである。有利には、該装置は、撹拌型リアクター、バスケット型リアクター、流動床式リアクター、バックベッド式リアクター、フィルター式リアクターなどから選ばれたものである。ごく一般的な固定化酵素の使用形式としては、充填カラムによる連続式のものでも、あるいは固定化酵素の回収が容易なバッチ式でもよい。バイオリアクターは、同様にして、１本のカラムあるいは有利には複数のカラムを有する装置で構成されていてよい。処理されるべき基質は、好ましくは、カラムの中を重力の働く方向に流れるものである。バイオリアクターの別の有利な実施態様としては、該装置に加えて、処理すべき基質の入った槽、バイオリアクターからの流出物を後処理するための後処理槽、及び生成物の貯蔵用槽を含むものである。

本発明の実施態様では、得られた配糖化された配糖体生成物を液体クロマトグラフィーにより所望のグルコシド含有配糖体に分離及び／又は精製することを特徴とする方法も構築できる。また、液体クロマトグラフィーでは、ODS 逆相カラムを使用して、効率良く且つ工業的に有利に所望製品を取得することができる。
糖受容体としては、当該分野で知られたものが使用でき、適宜、適切なものを選択して使用できる。該糖受容体としては、当該物質の起源、由来によって特に限定されることなく、天然から得られるもの、遺伝子工学的に動物細胞、植物細胞、微生物などにより合成したもの、酵素的に製造されたもの、醗酵により製造されたもの、あるいは人工的に化学合成されたものなどが包含されてよい。それらは、タンパク質、ペプチド、脂質、糖又は糖質、有機化合物、天然又は合成高分子化合物など、さらには、糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質などを含めたものが挙げられる。糖受容体は、単独の物質であっても、混合物であってもよい。
得られた配糖体、すなわち、糖鎖を付加した化合物やオリゴ糖は、例えば、生理活性オリゴ糖、ドラックデリバリーシステムのキャリア、界面活性剤、糖鎖医薬、糖ペプチド、糖タンパク質、糖鎖高分子など、様々な用途に用いられて有用である。生成物配糖体は、細胞認識、免疫、細胞分化、細胞移動、受精、成熟、組織形態形成、炎症、創傷治癒、ガン転移、腫瘍化などの研究に有用である。
本発明の技術を使用して、高度にregioselective and/or stereoselective配糖化を行うことができ、また、長い糖鎖にも適用できることから、配糖化のバライエティを高めることが可能であり、新たなオリゴ糖鎖及び／又はポリ糖鎖(oligosaccharides and/or polysaccharides)をペプチド、タンパク質、脂質、糖質などに導入することを可能にする。本発明技術で、構造の明らかにされているオリゴ糖鎖などを使用して糖供与体である糖オキサゾリン誘導体及び配糖体を合成できるので、医薬、農薬、化粧品などの様々な分野での応用に利点がある。本発明で、糖鎖マイクロアレイ（糖鎖チップ）の作製技術が提供できる。
以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。本発明では、本明細書の思想に基づく様々な実施形態が可能であることは理解されるべきである。
全ての実施例は、他に詳細に記載するもの以外は、標準的な技術を用いて実施したもの、又は実施することのできるものであり、これは当業者にとり周知で慣用的なものである。

2-クロロ-1,3-ジメチルイミダゾリニウムクロリド83.9mg(0.496mmol)に対し、N-アセチルグルコサミン27.7mg(0.125mmol)、トリエチルアミン208μl(1.50mmol)、及び重水500μlを加え、室温で1時間攪拌せしめた。この反応液をNMRで分析したところ、下記式で表されるN-アセチルグルコサミンのオキサゾリン誘導体が得られており、その収率は83%であった。

目的物の収率は反応液に標準物質としてベンゼンスルホン酸ナトリウムを添加し、¹H NMRスペクトルの積分比から算出した。目的物を含む反応液の¹H NMRスペクトルを図1、¹³C NMRスペクトルを図2に、それぞれ示す。

2-クロロ-1,3-ジメチルイミダゾリニウムクロリド41.6mg(0.246mmol)に対し、N-アセチルマンノサミン5.5mg(24.9μmol)、トリエチルアミン104μl(0.750mmol)、及び重水500μlを加え、室温で1時間攪拌せしめた。この反応液をNMRで分析したところ、下記式で表されるN-アセチルマンノサミンのオキサゾリン誘導体が得られており、その収率は76%であった。

目的物の収率は反応液に標準物質としてベンゼンスルホン酸ナトリウムを添加し、¹H NMRスペクトルの積分比から算出した。目的物を含む反応液の¹H NMRスペクトルを図3、¹³C NMRスペクトルを図4に、それぞれ示す。

2-クロロ-1,3-ジメチルイミダゾリニウムクロリド42.2mg(0.250mmol)に対し、N,N'-ジアセチルキトビオース10.4mg(24.5μmol)、トリエチルアミン104μl(0.750mmol)、及び重水500μlを加え、室温で1時間撹拌せしめた。この反応液をNMRで分析したところ、下記式で表されるN,N'-ジアセチルキトビオースのオキサゾリン誘導体が得られており、その収率は77%であった。

目的物の収率は反応液に標準物質としてベンゼンスルホン酸ナトリウムを添加し、¹H NMRスペクトルの積分比から算出した。目的物を含む反応液の¹H NMRスペクトルを図5、¹³C NMRスペクトルを図6に、それぞれ示す。

2-クロロ-1,3-ジメチルイミダゾリニウムクロリド42.5mg(0.251mmol)に対し、N-アセチルラクトサミン9.8mg(25.6μmol)、トリエチルアミン104μl(0.750mmol)、及び重水500μlを加え、室温で1時間撹拌せしめた。この反応液をNMRで分析したところ、下記式で表されるN-アセチルラクトサミンのオキサゾリン誘導体が得られており、その収率は90%であった。

目的物の収率は反応液に標準物質としてベンゼンスルホン酸ナトリウムを添加し、¹H NMRスペクトルの積分比から算出した。目的物を含む反応液の¹H NMRスペクトルを図7、¹³C NMRスペクトルを図8に、それぞれ示す。¹³C NMRスペクトルでは原料のN-アセチルラクトサミンに含まれているエタノール由来のピークが確認できるが、反応には全く関与していない。

2-クロロ-1,3-ジメチルイミダゾリニウムクロリド12.2mg(72.2μmol)に対し、N,N',N''-トリアセチルキトトリオース3.1mg(4.9μmol)、トリエチルアミン31.0μl(0.224mmol)、及び重水500μlを加え、室温で1時間撹拌せしめた。この反応液をNMRで分析したところ、下記式で表されるN,N',N''-トリアセチルキトトリオースのオキサゾリン誘導体が得られており、その収率は75%であった。

目的物の収率は反応液に標準物質としてベンゼンスルホン酸ナトリウムを添加し、¹H NMRスペクトルの積分比から算出した。目的物を含む反応液の¹H NMRスペクトルを図9に示す。

2-クロロ-1,3-ジメチルイミダゾリニウムクロリド13.8mg(81.6μmol)に対し、N,N',N'',N'''-テトラアセチルキトテトラオース4.2mg(5.06μmol)、トリエチルアミン31.0μl(0.224mmol)、及び重水500μlを加え、室温で1時間撹拌せしめた。この反応液をNMRで分析したところ、下記式で表されるN,N',N'',N'''-テトラアセチルキトテトラオースのオキサゾリン誘導体が得られており、その収率は83%であった。

目的物の収率は反応液に標準物質としてベンゼンスルホン酸ナトリウムを添加し、¹H NMRスペクトルの積分比から算出した。目的物を含む反応液の¹H NMRスペクトルを図10に示す。

2-クロロ-1,3-ジメチルイミダゾリニウムクロリド13.7mg(81.0μmol)に対し、N,N',N'',N''',N''''-ペンタアセチルキトペンタオース5.2mg(4.93μmol)、トリエチルアミン31.0μl(0.224mmol)、及び重水500μlを加え、室温で1時間撹拌せしめた。この反応液をNMRで分析したところ、下記式で表されるN,N',N'',N''',N''''-ペンタアセチルキトペンタオースのオキサゾリン誘導体が得られており、その収率は69%であった。

目的物の収率は反応液に標準物質としてベンゼンスルホン酸ナトリウムを添加し、¹H NMRスペクトルの積分比から算出した。目的物を含む反応液の¹H NMRスペクトルを図11に示す。

2-クロロ-1,3-ジメチルイミダゾリニウムクロリド45.2mg(0.267mmol)に対し、N,N'-ジアセチルキトビオース26.4mg(62.2μmol)、トリエチルアミン104μl(0.750mmol)、及び水250μlを加え、0℃で1時間撹拌せしめた。次いで、得られた反応液を用いて、以下の条件で高速液体クロマトグラフィーを行い、目的物の画分を回収した。
カラム：「Inertsil ODS-3(10.0×250mm)」(商品名、GL Sciences社製)
溶媒：水100%
温度：30℃
流速：4.8ml/min
検出器：UV(214nm)
そして、得られた画分の凍結乾燥を行い、下記式で表されるN,N'-ジアセチルキトビオースのオキサゾリン誘導体23.3mgを得た。収率は92%であった。

なお、上記のN,N'-ジアセチルキトビオースのオキサゾリン誘導体は¹H NMRにより、その構造を確認した。

2-クロロ-1,3-ジメチルイミダゾリニウムクロリド16.6mg(98.2μmol)に対し、高マンノース型糖鎖10.2mg、トリエチルアミン40.4μl(0.291mmol)、及び重水194μlを加え、0℃で1時間攪拌せしめた。この反応液をNMRで分析したところ、高マンノース型糖鎖のオキサゾリン誘導体が得られており、その収率は64%であった。目的物の代表的な構造を下記式に表す。

目的物の収率は¹H NMRスペクトルの積分比から算出した。目的物を含む反応液の¹H NMRスペクトルを図12に示す。高マンノース型糖鎖は卵白アルブミンを原料としてArthrobacter protophormiae由来Endo-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ処理により得られる糖鎖をゲル濾過カラムクロマトグラフィーを用いて精製したものを使用した。

2-クロロ-1,3-ジメチルイミダゾリニウムクロリド17.6mg(0.104mmol)に対し、シアロ複合型糖鎖20.0mg(9.9 μmol)、トリエチルアミン42.0μl(0.303mmol)、及び重水200μlを加え、0℃で1時間攪拌せしめた。この反応液をNMRで分析したところ、下記式で表されるシアロ複合型糖鎖のオキサゾリン誘導体が得られており、その収率は92%であった。

目的物の収率は¹H NMRスペクトルの積分比から算出した。目的物を含む反応液の¹H NMRスペクトルを図13に示す。シアロ複合型糖鎖はFmoc-アスパラギンに結合した糖鎖を原料として、Mucor hiemalis由来Endo-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ処理により得られる糖鎖を、高速液体クロマトグラフィーを用いて精製したものを使用した。
同様にして、他のシアロ複合型糖のオキサゾリン誘導体を合成できる。シアロ複合型糖鎖は、非還元末端にシアル酸を二個有するオリゴ糖で、糖鎖チップの作成などさまざな目的に利用できる。本発明の方法によれば、シアル酸部分に存在するカルボン酸があっても、それを保護することなく、オキサゾリン化がほぼ定量的に進行することが示された。

2-クロロ-1,3-ジメチルイミダゾリニウムクロリド63.4mg(0.375mmol)に対し、N-アセチルグルコサミン27.7mg(0.125mmol)、トリエチルアミン156μl(1.13mmol)、及び重水500μlを加え、0℃で15分間攪拌せしめた。この反応液をNMRで分析したところ、下記式で表されるN-アセチルグルコサミンのオキサゾリン誘導体が得られており、その収率は90%であった。

目的物の収率は反応液に標準物質としてベンゼンスルホン酸ナトリウムを添加し、¹H NMRスペクトルの積分比から算出した。目的物を含む反応液の¹H NMRスペクトルを図14に示す。

2-クロロ-1,3-ジメチルイミダゾリニウムクロリド63.4mg(0.375mmol)に対し、N-アセチルグルコサミン27.7mg(0.125mmol)、4.3Mトリメチルアミン水溶液262μl(1.13mmol)、及び重水238μlを加え、0℃で15分間攪拌せしめた。この反応液をNMRで分析したところ、下記式で表されるN-アセチルグルコサミンのオキサゾリン誘導体が得られており、その収率は74%であった。

目的物の収率は反応液に標準物質としてベンゼンスルホン酸ナトリウムを添加し、¹H NMRスペクトルの積分比から算出した。目的物を含む反応液の¹H NMRスペクトルを図15に示す。

2-クロロ-1,3-ジメチルイミダゾリニウムクロリド63.4mg(0.375mmol)に対し、N-アセチルグルコサミン27.7mg(0.125mmol)、N,N-ジメチルエチルアミン121μl(1.13mmol)、及び重水500μlを加え、0℃で15分間攪拌せしめた。この反応液をNMRで分析したところ、下記式で表されるN-アセチルグルコサミンのオキサゾリン誘導体が得られており、その収率は72%であった。

目的物の収率は反応液に標準物質としてベンゼンスルホン酸ナトリウムを添加し、¹H NMRスペクトルの積分比から算出した。目的物を含む反応液の¹H NMRスペクトルを図16に示す。

2-クロロ-1,3-ジメチルイミダゾリニウムクロリド63.4mg(0.375mmol)に対し、N-アセチルグルコサミン27.7mg(0.125mmol)、N-n-ブチルジメチルアミン158μl(1.13mmol)、及び重水500μlを加え、0℃で15分間攪拌せしめた。この反応液をNMRで分析したところ、下記式で表されるN-アセチルグルコサミンのオキサゾリン誘導体が得られており、その収率は78%であった。

目的物の収率は反応液に標準物質としてベンゼンスルホン酸ナトリウムを添加し、¹H NMRスペクトルの積分比から算出した。目的物を含む反応液の¹H NMRスペクトルを図17に示す。

2-クロロ-1,3-ジメチルイミダゾリニウムクロリド63.4mg(0.375mmol)に対し、N-アセチルグルコサミン27.7mg(0.125mmol)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン192μl(1.13mmol)、及び重水500μlを加え、0℃で15分間攪拌せしめた。この反応液をNMRで分析したところ、下記式で表されるN-アセチルグルコサミンのオキサゾリン誘導体が得られており、その収率は61%であった。

目的物の収率は反応液に標準物質としてベンゼンスルホン酸ナトリウムを添加し、¹H NMRスペクトルの積分比から算出した。目的物を含む反応液の¹H NMRスペクトルを図18に示す。

2-クロロ-1,3-ジメチルイミダゾリニウムクロリド63.4mg(0.375mmol)に対し、N-アセチルグルコサミン27.7mg(0.125mmol)、N,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン173μl(1.13mmol)、及び重水500μlを加え、0℃で15分間攪拌せしめた。この反応液をNMRで分析したところ、下記式で表されるN-アセチルグルコサミンのオキサゾリン誘導体が得られており、その収率は45％であった。

目的物の収率は反応液に標準物質としてベンゼンスルホン酸ナトリウムを添加し、¹H NMRスペクトルの積分比から算出した。目的物を含む反応液の¹H NMRスペクトルを図19に示す。
〔比較例１〕

1-[3-(ジメチルアミノ)プロピル]-3-エチルカルボジイミド塩酸塩335mg(1.75mmol)に対し、N-アセチルグルコサミン55mg(0.25mmol)、トリエチルアミン35μl(0.25mmol)、重水500μlを加え、4℃で4日間攪拌せしめた。この反応液をNMRで分析したところ、目的物の2-メチル(1,2-ジデオキシ-α-D-グルコピラノ)[2,1-d]-2-オキサゾリンの収率は37%であった。目的物の収率は反応液に標準物質として安息香酸ナトリウムを添加し、¹H NMRスペクトルの積分比から算出した。1-[3-(ジメチルアミノ)プロピル]-3-エチルカルボジイミド塩酸塩は次なる化学構造式を有している。

〔比較例２〕

4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウムクロリド水和物37.0mg(0.134mmol)に対し、N-アセチルグルコサミン5.6mg(25.3μmol)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン21.8μl(0.125mmol)、重水500μlを加え、室温で6時間攪拌せしめた。この反応液をNMRで分析したところ、目的物の2-メチル(1,2-ジデオキシ-α-D-グルコピラノ)[2,1-d]-2-オキサゾリンの収率は33%であった。目的物の収率は反応液に標準物質として安息香酸ナトリウムを添加し、¹H NMRスペクトルの積分比から算出した。4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウムクロリドは次なる化学構造式を有している。

4,5-ジヒドロ-2-メチル｛1,2-ジデオキシ-4-O-(β-D-ガラクトピラノシル)-α-D-グルコピラノシル｝[2,1-d]オキサゾール(48 mg, 0.13mmol)とメチル(N-アセチル-β-D-グルコサミド)( GlcNAcβ-OMe; 92mg, 0.39mmol)とを150μlの0.05Mクエン酸塩緩衝液(pH9.0)に溶解し、得られた混合物に80μlの0.01Mクエン酸塩緩衝液(pH9.0)に溶解したキチナーゼ(Bacillus sp., 糖供与体オキサゾリン誘導体に対して10wt%)を加え、混合物を34℃で0.5時間攪拌した。得られた混合物にTHFを加えて酵素を不活性化し、溶媒を留去し、残留物を水に溶解後、HPLCにかけて分離し、Gal(β1-4)GlcNAc(β1-4)GlcNAcβ-OMeを得た。

4,5-ジヒドロ-2-メチル｛1,2-ジデオキシ-4-O-(β-D-ガラクトピラノシル)-α-D-グルコピラノシル｝[2,1-d]オキサゾール(73 mg, 0.2mmol)をマイクロチューブに入れ、そこにGlcNAcβ-SCH₂CH₂CONHCH₂NHCOCH=CH₂(26 mg, 66.7mmol)とキチナーゼ(Bacillus sp., 7.3mg, 292mU)の2.0mLの0.05M Tris緩衝液(pH9.0)溶液を添加し、得られた混合物を40℃でインキュベーション処理した。得られた混合物に過剰量のTHFを加えた後、混合物を90℃で20分間加熱して酵素を不活性化し、溶媒を留去し、残留物を水に溶解後、分取HPLC(Inertsil-ODS, H₂O/MeOH, 3.0ml/min)で精製処理し、Gal(β1-4)GlcNAc(β1-4)GlcNAcβ-SCH₂CH₂CONHCH₂NHCOCH=CH₂(35 mg, 69%)を得た。

4,5-ジヒドロ-2-メチル｛1,2-ジデオキシ-4-O-(β-D-ガラクトピラノシル)-α-D-グルコピラノシル｝[2,1-d]オキサゾール(18 mg, 48μmol)をマイクロチューブに入れ、そこにGlcNAc(β1-4)GlcNAcβ-SCH₂CH₂CONHCH₂NHCOCH=CH₂(19 mg, 32μmol)とキチナーゼ(Bacillus sp., 70.4mU)の2.0mLの0.05M炭酸塩緩衝液(pH10.4)溶液を添加し、得られた混合物を40℃で２時間インキュベーション処理した。得られた混合物を90℃で20分間加熱して酵素を不活性化し、溶媒を留去し、残留物を水に溶解後、分取HPLC(Inertsil-ODS, H₂O/MeOH=900:7, 5.0ml/min)で精製処理し、Gal(β1-4)GlcNAc(β1-4)GlcNAc(β1-4)GlcNAcβ-SCH₂CH₂CONHCH₂NHCOCH=CH₂(17 mg, 54%)を得た。
上記とほぼ同様にして、変異型キチナーゼ、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼM、及びエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼAを使用して、糖オキサゾリン誘導体から対応する配糖体を合成できる。

2-クロロ-1,3-ジメチルイミダゾリニウムクロリド3.2mg(18.75μmol)に対し、N-アセチルグルコサミン-6-硫酸ナトリウム塩2.0mg(6.25μmol)、トリエチルアミン7.8μl(56.25μmol)、及び重水50 μlを加え、0℃で15分攪拌せしめた。この反応液に重水400 μlを加えてNMRで分析したところ、生成物の2-メチル(1,2-ジデオキシ-α-D-グルコピラノ)[2,1-d]-2-オキサゾリン-6-硫酸ナトリウム塩の収率は84%であった。生成物の収率は反応液に標準物質としてベンゼンスルホン酸ナトリウムを添加し、¹H NMRスペクトルの積分比から算出した。得られた生成物2-メチル(1,2-ジデオキシ-α-D-グルコピラノ)[2,1-d]-2-オキサゾリン-6-硫酸ナトリウム塩を含む反応液の¹H NMRスペクトルを図20に示す。

2-クロロ-1,3-ジメチルイミダゾリニウムクロリド3.2mg(18.75μmol)に対し、N-アセチルグルコサミン-6-リン酸二ナトリウム塩2.2mg(6.25μmol)、トリエチルアミン7.8μl(56.25μmol)、及び重水50 μlを加え、0℃で15分攪拌せしめた。この反応液に重水400 μlを加えてNMRで分析したところ、生成物の2-メチル(1,2-ジデオキシ-α-D-グルコピラノ)[2,1-d]-2-オキサゾリン-6-リン酸二ナトリウム塩の収率は79%であった。生成物の収率は反応液に標準物質としてベンゼンスルホン酸ナトリウムを添加し、¹H NMRスペクトルの積分比から算出した。得られた生成物2-メチル(1,2-ジデオキシ-α-D-グルコピラノ)[2,1-d]-2-オキサゾリン-6-リン酸二ナトリウム塩を含む反応液の¹H NMRスペクトルを図21に示す。

2-クロロ-1,3-ジメチルイミダゾリニウムヘキサフルオロフォスフェート104.5mg(0.375mmol)に対し、N-アセチルグルコサミン27.7mg(0.125mmol)、トリエチルアミン156μl(1.125mmol)、及び重水500 μlを加え、室温で15分攪拌せしめた。この反応液をNMRで分析したところ、生成物の2-メチル(1,2-ジデオキシ-α-D-グルコピラノ)[2,1-d]-2-オキサゾリンの収率は82%であった。生成物の収率は反応液に標準物質としてベンゼンスルホン酸ナトリウムを添加し、¹H NMRスペクトルの積分比から算出した。得られた生成物2-メチル(1,2-ジデオキシ-α-D-グルコピラノ)[2,1-d]-2-オキサゾリンを含む反応液の¹H NMRスペクトルを図22に示す。

2-クロロ-1,3-ジメチル-3,4,5,6-テトラヒドロ-2(1H)-ピリミジニウムクロリド68.7mg(0.375mmol)に対し、N-アセチルグルコサミン27.7mg(0.125mmol)、トリエチルアミン156μl(1.125mmol)、及び重水500 μlを加え、0℃で3時間攪拌せしめた。この反応液をNMRで分析したところ、生成物の2-メチル(1,2-ジデオキシ-α-D-グルコピラノ)[2,1-d]-2-オキサゾリンの収率は65%であった。生成物の収率は反応液に標準物質としてベンゼンスルホン酸ナトリウムを添加し、¹H NMRスペクトルの積分比から算出した。得られた生成物2-メチル(1,2-ジデオキシ-α-D-グルコピラノ)[2,1-d]-2-オキサゾリンを含む反応液の¹H NMRスペクトルを図23に示す。

2-クロロ-1,3-ジメチルイミダゾリニウムクロリド5.3mg(31.25μmol)に対し、ヒアルロン酸四糖4.9mg(6.25μmol)、トリエチルアミン13.9μl(93.75μmol)、及び重水50μlを加え、0℃で30分攪拌せしめた。この反応液に重水400μlを加えてNMRで分析したところ、生成物の2-メチル[3-O-[4-O-[3-O-(β-D-グルクロノピラノシル)-2-アセトアミド-2-デオキシ-β-D-グルコピラノシル]-β-D-グルクロノピラノシル]-1,2-ジデオキシ-α-D-グルコピラノ][2,1-d]-2-オキサゾリンの収率は定量的(quant.)であった。生成物の収率は反応液のNMR分析にて原料ヒアルロン酸四糖のアノマープロトンのピークが観測されないことから定量的(quant.)とした。得られた生成物2-メチル[3-O-[4-O-[3-O-(β-D-グルクロノピラノシル)-2-アセトアミド-2-デオキシ-β-D-グルコピラノシル]-β-D-グルクロノピラノシル]-1,2-ジデオキシ-α-D-グルコピラノ][2,1-d]-2-オキサゾリンを含む反応液の¹H NMRスペクトルを図24に示す。

2-クロロ-1,3-ジメチルイミダゾリニウムクロリド85.8mg(0.508mmol)に対し、下記式(5)で表されるオリゴ糖99.2mg、トリエチルアミン0.21ml(1.50mmol)、及び重水1.0mlを加え、22℃で30分間放置した。この反応液をNMRで分析したところ、実施例24と同様にNMR経験則から下記式(6)で表されるオキサゾリン誘導体が定量的に得られていることを確認した。目的物を含む反応液の¹H NMRスペクトルを図25に示す。

2-クロロ-1,3-ジメチルイミダゾリニウムクロリド84.9mg(0.502mmol)に対し、下記式(7)で表されるオリゴ糖95.9mg、トリエチルアミン0.21ml(1.50mmol)、及び重水1.0mlを加え、22℃で30分間放置した。この反応液をNMRで分析したところ、実施例24と同様にNMR経験則から下記式(8)で表されるオキサゾリン誘導体が定量的に得られていることを確認した。目的物を含む反応液の¹H NMRスペクトルを図26に示す。

実施例25の式(6)で表されるオキサゾリン誘導体(20mg)を400μlの0.05Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.3)に溶解し、得られた混合物にヒアルロニダーゼ(ウシ精巣由来, 700U)を加え、混合物を30℃で1時間、2時間、4時間、6時間又は72時間放置した。得られた混合物を煮沸して酵素を不活性化し、水で希釈後、HPLCにかけて分離した。その結果、式(6)で表されるオキサゾリン誘導体が経時的に重合し伸長することが確認された。

実施例26の式(8)で表されるオキサゾリン誘導体(20mg)を400μlの0.05Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.3)に溶解し、得られた混合物にヒアルロニダーゼ(ウシ精巣由来, 700U)を加え、混合物を30℃で1時間、2時間、4時間、6時間又は72時間放置した。得られた混合物を煮沸して酵素を不活性化し、水で希釈後、HPLCにかけて分離した。その結果、式(8)で表されるオキサゾリン誘導体が経時的に重合し伸長することが確認された。

本発明で無保護糖よりのオキサゾリン誘導体の簡便な製造方法並びにその生成物を使用した配糖体の製造法が提供されている。本発明では、ホルムアミジン誘導体を脱水縮合剤として用いて、遊離のヘミアセタール性ヒドロキシ基とアミド基を持つ糖のオキサゾリン誘導体を水溶液中における一段階の工程で合成し、そして糖質加水分解酵素を使用し、該オキサゾリン誘導体を糖供与体として配糖体を製造している。得られた配糖体、すなわち、糖鎖を付加した化合物やオリゴ糖は、例えば、生理活性オリゴ糖、ドラックデリバリーシステムのキャリア、界面活性剤、糖鎖医薬、糖ペプチド、糖タンパク質、糖鎖高分子など、様々な用途に用いられて有用であり、また、生成物配糖体は、細胞認識、免疫、細胞分化、細胞移動、受精、成熟、組織形態形成、炎症、創傷治癒、ガン転移、腫瘍化などの研究に有用である。
本発明は、前述の説明及び実施例に特に記載した以外も、実行できることは明らかである。上述の教示に鑑みて、本発明の多くの改変及び変形が可能であり、従ってそれらも本件添付の請求の範囲の範囲内のものである。

Claims (7)

1. 一般式(1):
   

   

   （上式中、R¹はアルキル基、R²、R³及びR⁴は、それぞれ同一でも異なっていてもよく、互いに独立に、水素原子、ヒドロキシ基、ヒドロキシメチル基、アセトアミド基、カルボキシ基、硫酸基、リン酸基または糖残基およびそれらの修飾物残基からなる群から選択されたものである）
   のヘミアセタール性のヒドロキシ基とアミド基をもつ糖を一般式(2):
   

   

   （上式中、R⁵、R⁶、R⁷及びR⁸は、それぞれ同一でも異なっていてもよく、互いに独立に、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアルケニル基及び置換されていてもよいアリール基からなる群から選択されたもので、R⁵とR⁷あるいはR⁶とR⁸で環を形成していてよいし、あるいはR⁵とR⁶あるいはR⁷とR⁸で環を形成していてよく、Xはハロゲン原子であり、そしてY^-は陰イオンである）
   のハロホルムアミジニウム誘導体で処理することを特徴とする、一般式(3):
   

   

   （上式中、R¹、R²、R³及びR⁴は、上記と同様の意味を有するものである）
   で示されるオキサゾリン誘導体の合成方法。
2. Yが、ハロゲン原子、OH、BF₄、またはPF₆であり、一般式(1)の糖と一般式(2)のハロホルムアミジニウム誘導体との反応を水を含む溶媒中で行うことを特徴とする請求項１記載の合成方法。
3. (1)一般式(1)の糖が、N-アセチルグルコサミン、N-アセチルガラクトサミン及びN-アセチルマンノサミンからなる群から選択されたもの、
   (2)一般式(1)の糖が、N-アセチルラクトサミン、N,N'-ジアセチルキトビオース、ヒアルロン酸二糖及びグリコサミノグリカン二糖からなる群から選択されたもの、あるいは
   (3)一般式(1)の糖が、N結合型糖タンパク質糖鎖、O結合型糖タンパク質糖鎖及びキトオリゴ糖からなる群から選択されたもの、
   であることを特徴とする請求項１又は２記載の合成方法。
4. 一般式(1):
   

   

   （上式中、R¹はアルキル基、R²、R³及びR⁴は、それぞれ同一でも異なっていてもよく、互いに独立に、水素原子、ヒドロキシ基、ヒドロキシメチル基、アセトアミド基、カルボキシ基、硫酸基、リン酸基または糖残基およびそれらの修飾物残基からなる群から選択されたものである）
   のヘミアセタール性のヒドロキシ基とアミド基をもつ糖を一般式(2):
   

   

   （上式中、R⁵、R⁶、R⁷及びR⁸は、それぞれ同一でも異なっていてもよく、互いに独立に、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアルケニル基及び置換されていてもよいアリール基からなる群から選択されたもので、R⁵とR⁷あるいはR⁶とR⁸で環を形成していてよいし、あるいはR⁵とR⁶あるいはR⁷とR⁸で環を形成していてよく、Xはハロゲン原子であり、そしてY^-は陰イオンである）
   のハロホルムアミジニウム誘導体で処理して一般式(3):
   

   

   （上式中、R¹、R²、R³及びR⁴は、上記と同様の意味を有するものである）
   で示されるオキサゾリン誘導体を合成し、次に得られた一般式(3)のオキサゾリン誘導体を糖供与体とし、糖受容体存在下に、糖転移酵素又は糖質加水分解酵素と接触せしめ、糖鎖付加生成物を得ることを特徴とする配糖体の合成方法。
5. 糖転移酵素又は糖質加水分解酵素が、キチナーゼ、変異型キチナーゼ、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼM、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼA、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼからなる群から選択されたものであることを特徴とする請求項４記載の合成方法。
6. (1)一般式(1)の糖が、N-アセチルグルコサミン、N-アセチルガラクトサミン及びN-アセチルマンノサミンからなる群から選択されたもの、
   (2)一般式(1)の糖が、N-アセチルラクトサミン、N,N'-ジアセチルキトビオース、ヒアルロン酸二糖及びグリコサミノグリカン二糖からなる群から選択されたもの、あるいは
   (3)一般式(1)の糖が、N結合型糖タンパク質糖鎖、O結合型糖タンパク質糖鎖及びキトオリゴ糖からなる群から選択されたもの、
   であることを特徴とする請求項４又は５記載の合成方法。
7. 一般式(4):
   

   

   （上式中、R⁹はアルキル基で、R¹⁰〜R¹⁹は、それぞれ同一でも異なっていてもよく、互いに独立に、水素原子、ヒドロキシ基、アセトアミド基、カルボキシ基、硫酸基、リン酸基または糖残基及びそれらの修飾物残基からなる群から選択されたものである、但し、R¹⁰〜R¹⁹のうちの少なくとも一つは、糖残基である）
   で表されるオキサゾリン誘導体。
   

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