JP4105872B2 - Ｎ−アセチルラクトサミニル−セロオリゴ糖誘導体及びその製造方法 - Google Patents
Ｎ−アセチルラクトサミニル−セロオリゴ糖誘導体及びその製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4105872B2 JP4105872B2 JP2002011601A JP2002011601A JP4105872B2 JP 4105872 B2 JP4105872 B2 JP 4105872B2 JP 2002011601 A JP2002011601 A JP 2002011601A JP 2002011601 A JP2002011601 A JP 2002011601A JP 4105872 B2 JP4105872 B2 JP 4105872B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cellooligosaccharide
- derivative
- acetyllactosaminyl
- chitinase
- sugar
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なＮ−アセチルラクトサミニル−セロオリゴ糖誘導体及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
分離精製技術や解析技術の進歩によって、複雑な糖鎖の構造やその機能が解明されつつある。糖鎖は、様々な生命現象に関与しており、糖鎖を利用した新たな医薬品等の開発が期待されている。
【０００３】
糖鎖の持つ情報量は、構成単位である糖の種類、数、結合位置、及び立体等に依存しており、とてつもなく膨大となるため、未だ知られていない配列や結合等を有する糖鎖が存在する可能性は否定できない。
【０００４】
糖鎖を利用した新たな医薬品等を開発研究する上で、非天然型糖鎖を構築することは、新たな発見をもたらす可能性を秘めていると共に、糖鎖の機能を向上させたり、新たな機能を付与したりできる可能性もある。
【０００５】
これまで、糖鎖を合成する方法としては、有機合成化学的な方法と、酵素法によるトランスフェラーゼを用いた方法が知られている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、有機合成化学的な合成方法は、官能基の保護・脱保護等の繰り返しによる多段階の反応工程及び複数回の精製操作が必要であり、工業的規模での実施は極めて困難であった。
【０００７】
一方、トランスフェラーゼを用いた糖鎖合成方法は、上記のような化学合成法に比べて非常に簡便であり、また、異性体の生成を伴わないので、構造の明確な糖鎖を効率良く得ることができるが、トランスフェラーゼを大量に入手することが困難であり、また、基質となる糖ヌクレオチドも不安定で高価であることから、工業的規模での実施はコスト的に難しかった。また、トランスフェラーゼは、糖の認識が極めて厳密で、ある決まった糖鎖しか合成できないという弱点があり、修飾された糖鎖や非天然型糖鎖の合成には適さないという問題があった。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、非天然型の新規なセロオリゴ糖誘導体及びその製造方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、糖加水分解酵素を用いて糖鎖を構築する研究の過程で、アルカリ性条件下において、キチンを分解する酵素であるキチナーゼの受容体特異性が、比較的寛容であり、糖受容体として二位のアセトアミド基が存在しないセロビオースやセロトリオースを認識することを見出し、この知見に基いて本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明の一つは、下記一般式（１）で表されるＮ−アセチルラクトサミニル−セロオリゴ糖誘導体である。
【００１１】
【化３】
【００１２】
また、本発明のもう一つは、糖受容体となる下記一般式（２）で表されるセロオリゴ糖又はセロオリゴ糖誘導体と、糖供与体となるＮ−アセチルラクトサミンのオキサゾリン誘導体に、アルカリ性条件下でファミリー１８に属するキチナーゼを作用させることを特徴とするＮ−アセチルラクトサミニル−セロオリゴ糖誘導体の製造方法である。
【化４】
【００１３】
上記製造方法においては、前記糖受容体と前記糖供与体に、ｐＨ８〜１０の条件下で前記キチナーゼを作用させることが好ましい。
また、前記キチナーゼが、Bacillus属由来のキチナーゼであることが好ましい。
【００１４】
本発明によれば、糖受容体としてセロオリゴ糖又はセロオリゴ糖誘導体、糖供与体としてＮ−アセチルラクトサミンのオキサゾリン誘導体を用い、これらにキチナーゼをアルカリ性条件下で作用させることにより、セロオリゴ糖又はセロオリゴ糖誘導体の非還元末端にＮ−アセチルラクトサミンがβ−１，４結合で転移した非天然型のセロオリゴ糖誘導体（Ｎ−アセチルラクトサミニル−セロオリゴ糖誘導体）を簡単かつ安価に調製することができる。このＮ−アセチルラクトサミニル−セロオリゴ糖誘導体は、新規生理活性物質として、医薬品、診断薬、化粧品、食品、農薬、肥料等としての利用が期待できる。また、上記セロオリゴ糖誘導体の還元末端には、固定化のための重合基や検出のための官能基等を付与することができるので、例えば、セルラーゼの活性測定用の基質やカラム充填剤としての利用も期待できる。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明のＮ−アセチルラクトサミニル−セロオリゴ糖誘導体の合成方法の基本は、糖供与体であるＮ−アセチルラクトサミンのオキサゾリン誘導体に、アルカリ性条件下でキチナーゼを作用させることにより、糖受容体となるセロオリゴ糖又はセロオリゴ糖誘導体の非還元末端側へβ−１，４結合で転移させるものである。
【００１６】
本発明において、Ｎ−アセチルラクトサミンのオキサゾリン誘導体（以下、単にオキサゾリン誘導体という）とは、Ｎ−アセチルラクトサミンから誘導された下記式（３）に示される構造を有する化合物をいう。
【００１７】
【化５】
【００１８】
上記オキサゾリン誘導体は、例えばＮ−アセチルラクトサミンに塩化アセチルを作用させてアノマー位の塩素化及び水酸基の保護を行い、塩化テトラエチルアンモニウムと炭酸水素ナトリウムによりオキサゾリン環を形成し、最後にナトリウムメトキシドによる脱アセチル化を行なうことにより得ることができる（K. Sasaki, S. Ahlfors, T. Frejd, J. Kihlberg, G. Magnusson, J. Org. Chem., 53, 5629 (1988)、S. Nishimura, H. Kuzuhara, Y. Takiguchi, K. Shimahara, Carbohydr. Res., 194, 223 (1989)）。
【００１９】
糖受容体となるセロオリゴ糖又はセロオリゴ糖誘導体としては、二糖から六糖のセロオリゴ糖及びそれらの還元末端をメチル基、アクリルアミド基、パラニトロフェニル基等で修飾したもの等が好ましく用いられる。
【００２０】
キチナーゼとしては、Henrissatらによる糖質加水分解酵素の分類（Henrissat, B., Biochem. J., 280, 309 (1991)、Henrissat, B., A. Bairoch., Biochem. J., 293, 781 (1993)）において、ファミリー１８に属するキチナーゼが用いられ、特に、Bacillus属由来のキチナーゼが好ましく用いられる。
【００２１】
キチナーゼは、Bacillus属の菌体（例えばBacillus circulans（ＩＦＯ１３６２７）等）の培養液から、例えば硫安沈殿により粗酵素を調製し、必要に応じて更にキチンカラム等を用いて精製することにより調製できる（T. Watanabe, K. Suzuki, W. Oyanagi, K. Ohnishi, H. Tanaka, J. Biol. Chem., 265, 15659 (1990)）。なお、キチナーゼは、精製されたものを用いてもよく、粗酵素を用いてもよい。また、市販のキチナーゼを用いてもよく、例えば商品名「キチナーゼ」（Bacillus sp．由来、和光純薬工業社製）等を用いることができる。
【００２２】
本発明においては、安価に入手できることから、Bacillus sp．由来のキチナーゼが特に好ましく用いられる。
【００２３】
上記緩衝液としては、例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液等を使用することができる。
【００２４】
本発明において一般式（１）で表されるＮ−アセチルラクトサミニル−セロオリゴ糖誘導体は、例えば以下のようにして調製することができる。
【００２５】
すなわち、上記オキサゾリン誘導体と、セロオリゴ糖又はセロオリゴ糖誘導体を、アルカリ性（好ましくはｐＨ７〜１１、より好ましくはｐＨ８〜１０）に調整した緩衝液に溶解し、これにキチナーゼを添加して２０〜４０℃で反応を行なう。反応中は、反応液を経時的にサンプリングして高速液体クロマトグラフィーでオキサゾリン誘導体のピークの消失を確認した後、酵素を失活させ、高速液体クロマトグラフィー等により目的物を単離する。
【００２６】
キチナーゼを用いた酵素反応を、上記のようなアルカリ性条件下で行なうことにより、糖受容体となるセロオリゴ糖又はセロオリゴ糖誘導体の非還元末端側へ糖供与体であるＮ−アセチルラクトサミンのオキサゾリン誘導体をβ−１，４結合で効率よく転移させることができる。
【００２７】
本発明においては、上記オキサゾリン誘導体と、セロオリゴ糖又はセロオリゴ糖誘導体をモル比で０．３〜３：１となるように用いることが好ましい。
【００２８】
また、キチナーゼの添加量は、転移反応が充分に進行する量であれば特に制限はないが、例えば上記オキサゾリン誘導体を０．１ｍｏｌ／Ｌ含む反応系においては、キチナーゼの添加量は５０〜５００ｍＵ／ｍＬが好ましく、７０〜１５０ｍＵ／ｍＬがより好ましい。なお、本発明において、キチナーゼ１Ｕ（ユニット）とは、ｐＨ６．８、３７℃の条件下で酵素をＮ−アセチルキトサンに作用させた際に、１分間にＮ−アセチルキトサンから１μｍｏｌのＮ−アセチルグルコサミンに相当する還元糖を生成する酵素量を意味する。
【００２９】
また、高速液体クロマトグラフィーの条件は、例えば「TSK-gel Amide-80」（商品名、トーソー社製）、「Asahipak NH2P-50 4E」（商品名、昭和電工社製）等のカラムを用い、溶媒としてアセトニトリル／水混合溶媒（アセトニトリル／水（ｖ／ｖ）＝８０／２０〜６０／４０）等を用いて行なうことができる。
【００３０】
【実施例】
以下、本発明を実施例を挙げてさらに具体的に説明する。
製造例
Ｎ−アセチルラクトサミン４．０ｇに塩化アセチル２０ｍＬを加え、撹拌しながら室温で４日間反応を行なった。なお、反応中は、ＴＬＣ（酢酸エチル／ヘキサン（ｖ／ｖ）＝４／１）により反応を追跡した。
【００３１】
この反応液をエバポレートによって濃縮し、過剰量の塩化メチレンで希釈後、ｐＨが中性になるまで冷水及び飽和炭酸水素ナトリウム溶液で分液し、得られた有機溶媒相を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濾過して硫酸ナトリウムを除去した。
【００３２】
得られた濾液をエバポレートにより濃縮し、更に減圧乾燥して溶媒を完全に除去して、塩化Ｎ−アセチル−3,6,2',3',4',6'−ヘキサ−O−アセチル−α−ラクトサミニル（以下、化合物（Ｉ）という）６．８０ｇを得た。精製は行なわずにそのまま次の反応を行なった。
【００３３】
上記化合物（Ｉ）３．０１ｇをアセトニトリル２５ｍＬに溶解し、この溶液を、塩化カルシウムによって一時間半乾燥させた塩化テトラエチルアンモニウム１．０ｇと炭酸水素ナトリウム１．０ｇに加え、５５℃で１時間４０分還流させた。ＴＬＣ（酢酸エチル／ヘキサン（ｖ／ｖ）＝４／１）にて反応終了を確認し、ガラスフィルターＧ４（商品名、柴田科学社製）で固形物を除去し、得られた濾液を減圧下で濃縮した後、過剰量の塩化メチレンで希釈し、水相のｐＨが中性になるまで冷水及び飽和炭酸水素ナトリウム溶液で分液し、得られた有機溶媒相を無水硫酸ナトリウムにより乾燥後、濾過して硫酸ナトリウムを除去した。
【００３４】
得られた溶液をエバポレートによって濃縮した後、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（Gel：商品名「Silica Gel 60」、Merck社製、particle size:0.04−0.063mm、展開溶媒：酢酸エチル／ヘキサン（ｖ／ｖ）＝４／１）により精製して、固体状の2−メチル｛3,6ジ−O−アセチル−4−O−(2,3,4,6−テトラ−O−アセチル−β−D−ガラクトピラノシル)1,2−ジデオキシ−α−グルコピラノ｝［2,1−d］−2−オキサゾリン（以下、化合物（ＩＩ）という）１．４０ｇを得た。
【００３５】
アルゴン雰囲気下、上記化合物（ＩＩ）１．４０ｇを無水メタノール２７０ｍＬに溶解させ、０．０１Ｍの濃度になるようにナトリウムメトキシドのメタノール溶液を添加し、室温で２時間反応させた。ＴＬＣ（酢酸エチル／ヘキサン（ｖ／ｖ）＝４／１）により反応終了を確認した後、反応溶液が中性になるまでイオン交換樹脂Amberlite IR-120(H+)（商品名、オルガノ社製）を加えた後、濾過してイオン交換樹脂を除去した。
【００３６】
得られた濾液をエバポレートによって濃縮し、更に減圧乾燥して、2−メチル｛4−O−（β−D−ガラクトピラノシル）1,2−ジデオキシ−α−D−グルコピラノ｝［2,1−d］−2−オキサゾリン（以下、オキサゾリン誘導体（Ｉ）という）０．８０ｇを得た。なお、オキサゾリン誘導体（Ｉ）は、ＮＭＲにより構造を確認した。
【００３７】
実施例１
上記オキサゾリン誘導体（Ｉ）３６．５ｍｇをエッペンドルフチューブに入れ、セロビオース１０３ｍｇと市販キチナーゼ（Bacillus sp．由来キチナーゼ、商品名「キチナーゼ」、和光純薬工業社製、以下同じ。）１４６ｍＵを溶解した５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ９．０）１ｍＬを添加し、４０℃の恒温槽に入れて反応を行なった。
【００３８】
反応中、高速液体クロマトグラフィーにより反応を追跡し、オキサゾリン誘導体（Ｉ）のピークが完全に消失したのを確認した後、９０℃で２０分間熱失活を行なった。なお、高速液体クロマトグラフィーは、以下の条件（１）で行なった。
【００３９】
・条件（１）
カラム：「TSK-gel Amide-80 (4.6×25mm)」（商品名、トーソー社製）
溶媒：アセトニトリル／水（ｖ／ｖ）＝６０／４０
温度：４０℃
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＲＩ
次いで、得られた反応液を用いて、以下の条件（２）で高速液体クロマトグラフィーを行ない、目的物の画分を回収した。
【００４０】
・条件（２）
カラム：「TSK-gel Amide-80 (21.5×30mm)」（商品名、トーソー社製）
溶媒：アセトニトリル／水（ｖ／ｖ）＝６５／３５
温度：４０℃
流速：６．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＲＩ
そして、回収した画分をエバポレートで濃縮、凍結乾燥して、下記式で表されるＮ−アセチルラクトサミニル−セロオリゴ糖誘導体９．９ｍｇを得た。
【００４１】
【化６】
【００４２】
なお、上記のＮ−アセチルラクトサミニル−セロオリゴ糖誘導体は、1Ｈ、13ＣＮＭＲ及びMALDI TOF MASSにより、その構造を確認した。
【００４３】
実施例２〜５
上記オキサゾリン誘導体（Ｉ）１．４６ｍｇをエッペンドルフチューブに入れ、セロトリオース０．６７１ｍｇと市販キチナーゼ１３ｍＵを溶解した５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ９．０）４０μＬを添加し、４０℃の恒温槽に入れて反応を行なった。
【００４４】
反応中、高速液体クロマトグラフィーにより反応を追跡し、オキサゾリン誘導体（Ｉ）のピークが完全に消失したのを確認した後、９０℃で２０分間熱失活を行なった。なお、高速液体クロマトグラフィーは、実施例１と同じ条件（１）で行なった。
【００４５】
得られた反応液を用いて、実施例１と同じ条件（２）で高速液体クロマトグラフィーを行ない、目的物の画分を回収し、エバポレートで濃縮、凍結乾燥して、上記一般式（１）において、ｎ＝２で表されるＮ−アセチルラクトサミニル−セロオリゴ糖誘導体を得た。
【００４６】
また、セロトリオースの代わりに、セロテトラオース（０．８８７ｍｇ）、セロペンタオース（１．１０ｍｇ）又はセロヘキサオース（０．６５９ｍｇ）を用いて上記と同様の条件で反応を行ない、上記一般式（１）において、Ｘ−ＲがＯＨ、ｎ＝３〜５で表される各Ｎ−アセチルラクトサミニル−セロオリゴ糖誘導体を得た。
【００４７】
なお、上記の各Ｎ−アセチルラクトサミニル−セロオリゴ糖誘導体は、1Ｈ、13ＣＮＭＲ及びMALDI TOF MASSにより、その構造を確認した。
【００４８】
実施例６
上記オキサゾリン誘導体（Ｉ）３６．５ｍｇをエッペンドルフチューブに入れ、メチルβ−D−セロビオシド１７．８ｍｇと市販キチナーゼ３２５ｍＵを溶解した５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ９．０）１ｍＬを添加し、４０℃の恒温槽に入れて反応を行なった。
【００４９】
反応中、高速液体クロマトグラフィーにより反応を追跡し、オキサゾリン誘導体（Ｉ）のピークが完全に消失したのを確認した後、９０℃で２０分間熱失活を行なった。なお、高速液体クロマトグラフィーは、以下の条件（３）で行なった。
【００５０】
・条件（３）
カラム：「TSK-gel Amide-80 (4.6×25mm)」（商品名、トーソー社製）
溶媒：アセトニトリル／水（ｖ／ｖ）＝７５／２５
温度：４０℃
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＲＩ
次いで、得られた反応液を用いて、以下の条件（４）で高速液体クロマトグラフィーを行ない、目的物の画分を回収した。
【００５１】
・条件（４）
カラム：「TSK-gel Amide-80 (21.5×30mm)」（商品名、トーソー社製）
溶媒：アセトニトリル／水（ｖ／ｖ）＝６０／４０
温度：３０℃
流速：６．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＲＩ
そして、回収した画分をエバポレートで濃縮、凍結乾燥して、下記式で表されるＮ−アセチルラクトサミニル−セロオリゴ糖誘導体８．９ｍｇを得た。
【００５２】
【化７】
【００５３】
なお、上記のＮ−アセチルラクトサミニル−セロオリゴ糖誘導体は、1Ｈ、13ＣＮＭＲ及びMALDI TOF MASSにより、その構造を確認した。
【００５４】
実施例７
上記オキサゾリン誘導体（Ｉ）３６．５ｍｇをエッペンドルフチューブに入れ、（Ｎ−アクリルアミドメチル）−アミノカルボニルエチル−１−チオ−β−D−セロビオシド１６．９ｍｇと市販キチナーゼ３２５ｍＵを溶解した５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ９．０）１ｍＬを添加し、４０℃の恒温槽に入れて反応を行なった。
【００５５】
反応中、高速液体クロマトグラフィーにより反応を追跡し、オキサゾリン誘導体のピークが完全に消失したのを確認した後、９０℃で２０分間熱失活を行なった。なお、高速液体クロマトグラフィーは、実施例６と同じ条件（３）で行なった。
【００５６】
次いで、得られた反応液を用いて、以下の条件（５）で高速液体クロマトグラフィーを行ない、目的物の画分を回収した。
【００５７】
・条件（５）
カラム：「Inertsil ODS-3 (10.0×25mm)」（商品名、GL Sciences社製）
溶媒：水／メタノール（ｖ／ｖ）＝９００／７０
温度：室温
流速：３．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ（２１０ｎｍ）
そして、回収した画分をエバポレートで濃縮、凍結乾燥して、下記式で表されるＮ−アセチルラクトサミニル−セロオリゴ糖誘導体４．７ｍｇを得た。
【００５８】
【化８】
【００５９】
なお、上記のＮ−アセチルラクトサミニル−セロオリゴ糖誘導体は、1Ｈ、13ＣＮＭＲ及びMALDI TOF MASSにより、その構造を確認した。
【００６０】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、糖受容体としてセロオリゴ糖又はセロオリゴ糖誘導体、糖供与体としてＮ−アセチルラクトサミンのオキサゾリン誘導体を用い、これらにキチナーゼをアルカリ性条件下で作用させることにより、セロオリゴ糖又はセロオリゴ糖誘導体の非還元末端にＮ−アセチルラクトサミンがβ−１，４結合した非天然型のセロオリゴ糖誘導体（Ｎ−アセチルラクトサミニル−セロオリゴ糖誘導体）を簡単かつ安価に得ることができる。
【００６１】
このＮ−アセチルラクトサミニル−セロオリゴ糖誘導体は、新規生理活性物質として、医薬品、診断薬、化粧品、食品、農薬、肥料等としての利用が期待できる。また、上記セロオリゴ糖誘導体の還元末端には、固定化のための重合基や、検出のための官能基等を付与することができるので、例えば、セルラーゼの活性測定用の基質やカラム充填剤としての利用も期待できる。
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なＮ−アセチルラクトサミニル−セロオリゴ糖誘導体及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
分離精製技術や解析技術の進歩によって、複雑な糖鎖の構造やその機能が解明されつつある。糖鎖は、様々な生命現象に関与しており、糖鎖を利用した新たな医薬品等の開発が期待されている。
【０００３】
糖鎖の持つ情報量は、構成単位である糖の種類、数、結合位置、及び立体等に依存しており、とてつもなく膨大となるため、未だ知られていない配列や結合等を有する糖鎖が存在する可能性は否定できない。
【０００４】
糖鎖を利用した新たな医薬品等を開発研究する上で、非天然型糖鎖を構築することは、新たな発見をもたらす可能性を秘めていると共に、糖鎖の機能を向上させたり、新たな機能を付与したりできる可能性もある。
【０００５】
これまで、糖鎖を合成する方法としては、有機合成化学的な方法と、酵素法によるトランスフェラーゼを用いた方法が知られている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、有機合成化学的な合成方法は、官能基の保護・脱保護等の繰り返しによる多段階の反応工程及び複数回の精製操作が必要であり、工業的規模での実施は極めて困難であった。
【０００７】
一方、トランスフェラーゼを用いた糖鎖合成方法は、上記のような化学合成法に比べて非常に簡便であり、また、異性体の生成を伴わないので、構造の明確な糖鎖を効率良く得ることができるが、トランスフェラーゼを大量に入手することが困難であり、また、基質となる糖ヌクレオチドも不安定で高価であることから、工業的規模での実施はコスト的に難しかった。また、トランスフェラーゼは、糖の認識が極めて厳密で、ある決まった糖鎖しか合成できないという弱点があり、修飾された糖鎖や非天然型糖鎖の合成には適さないという問題があった。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、非天然型の新規なセロオリゴ糖誘導体及びその製造方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、糖加水分解酵素を用いて糖鎖を構築する研究の過程で、アルカリ性条件下において、キチンを分解する酵素であるキチナーゼの受容体特異性が、比較的寛容であり、糖受容体として二位のアセトアミド基が存在しないセロビオースやセロトリオースを認識することを見出し、この知見に基いて本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明の一つは、下記一般式（１）で表されるＮ−アセチルラクトサミニル−セロオリゴ糖誘導体である。
【００１１】
【化３】
また、本発明のもう一つは、糖受容体となる下記一般式（２）で表されるセロオリゴ糖又はセロオリゴ糖誘導体と、糖供与体となるＮ−アセチルラクトサミンのオキサゾリン誘導体に、アルカリ性条件下でファミリー１８に属するキチナーゼを作用させることを特徴とするＮ−アセチルラクトサミニル−セロオリゴ糖誘導体の製造方法である。
【化４】
上記製造方法においては、前記糖受容体と前記糖供与体に、ｐＨ８〜１０の条件下で前記キチナーゼを作用させることが好ましい。
また、前記キチナーゼが、Bacillus属由来のキチナーゼであることが好ましい。
【００１４】
本発明によれば、糖受容体としてセロオリゴ糖又はセロオリゴ糖誘導体、糖供与体としてＮ−アセチルラクトサミンのオキサゾリン誘導体を用い、これらにキチナーゼをアルカリ性条件下で作用させることにより、セロオリゴ糖又はセロオリゴ糖誘導体の非還元末端にＮ−アセチルラクトサミンがβ−１，４結合で転移した非天然型のセロオリゴ糖誘導体（Ｎ−アセチルラクトサミニル−セロオリゴ糖誘導体）を簡単かつ安価に調製することができる。このＮ−アセチルラクトサミニル−セロオリゴ糖誘導体は、新規生理活性物質として、医薬品、診断薬、化粧品、食品、農薬、肥料等としての利用が期待できる。また、上記セロオリゴ糖誘導体の還元末端には、固定化のための重合基や検出のための官能基等を付与することができるので、例えば、セルラーゼの活性測定用の基質やカラム充填剤としての利用も期待できる。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明のＮ−アセチルラクトサミニル−セロオリゴ糖誘導体の合成方法の基本は、糖供与体であるＮ−アセチルラクトサミンのオキサゾリン誘導体に、アルカリ性条件下でキチナーゼを作用させることにより、糖受容体となるセロオリゴ糖又はセロオリゴ糖誘導体の非還元末端側へβ−１，４結合で転移させるものである。
【００１６】
本発明において、Ｎ−アセチルラクトサミンのオキサゾリン誘導体（以下、単にオキサゾリン誘導体という）とは、Ｎ−アセチルラクトサミンから誘導された下記式（３）に示される構造を有する化合物をいう。
【００１７】
【化５】
上記オキサゾリン誘導体は、例えばＮ−アセチルラクトサミンに塩化アセチルを作用させてアノマー位の塩素化及び水酸基の保護を行い、塩化テトラエチルアンモニウムと炭酸水素ナトリウムによりオキサゾリン環を形成し、最後にナトリウムメトキシドによる脱アセチル化を行なうことにより得ることができる（K. Sasaki, S. Ahlfors, T. Frejd, J. Kihlberg, G. Magnusson, J. Org. Chem., 53, 5629 (1988)、S. Nishimura, H. Kuzuhara, Y. Takiguchi, K. Shimahara, Carbohydr. Res., 194, 223 (1989)）。
【００１９】
糖受容体となるセロオリゴ糖又はセロオリゴ糖誘導体としては、二糖から六糖のセロオリゴ糖及びそれらの還元末端をメチル基、アクリルアミド基、パラニトロフェニル基等で修飾したもの等が好ましく用いられる。
【００２０】
キチナーゼとしては、Henrissatらによる糖質加水分解酵素の分類（Henrissat, B., Biochem. J., 280, 309 (1991)、Henrissat, B., A. Bairoch., Biochem. J., 293, 781 (1993)）において、ファミリー１８に属するキチナーゼが用いられ、特に、Bacillus属由来のキチナーゼが好ましく用いられる。
【００２１】
キチナーゼは、Bacillus属の菌体（例えばBacillus circulans（ＩＦＯ１３６２７）等）の培養液から、例えば硫安沈殿により粗酵素を調製し、必要に応じて更にキチンカラム等を用いて精製することにより調製できる（T. Watanabe, K. Suzuki, W. Oyanagi, K. Ohnishi, H. Tanaka, J. Biol. Chem., 265, 15659 (1990)）。なお、キチナーゼは、精製されたものを用いてもよく、粗酵素を用いてもよい。また、市販のキチナーゼを用いてもよく、例えば商品名「キチナーゼ」（Bacillus sp．由来、和光純薬工業社製）等を用いることができる。
【００２２】
本発明においては、安価に入手できることから、Bacillus sp．由来のキチナーゼが特に好ましく用いられる。
【００２３】
上記緩衝液としては、例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液等を使用することができる。
【００２４】
本発明において一般式（１）で表されるＮ−アセチルラクトサミニル−セロオリゴ糖誘導体は、例えば以下のようにして調製することができる。
【００２５】
すなわち、上記オキサゾリン誘導体と、セロオリゴ糖又はセロオリゴ糖誘導体を、アルカリ性（好ましくはｐＨ７〜１１、より好ましくはｐＨ８〜１０）に調整した緩衝液に溶解し、これにキチナーゼを添加して２０〜４０℃で反応を行なう。反応中は、反応液を経時的にサンプリングして高速液体クロマトグラフィーでオキサゾリン誘導体のピークの消失を確認した後、酵素を失活させ、高速液体クロマトグラフィー等により目的物を単離する。
【００２６】
キチナーゼを用いた酵素反応を、上記のようなアルカリ性条件下で行なうことにより、糖受容体となるセロオリゴ糖又はセロオリゴ糖誘導体の非還元末端側へ糖供与体であるＮ−アセチルラクトサミンのオキサゾリン誘導体をβ−１，４結合で効率よく転移させることができる。
【００２７】
本発明においては、上記オキサゾリン誘導体と、セロオリゴ糖又はセロオリゴ糖誘導体をモル比で０．３〜３：１となるように用いることが好ましい。
【００２８】
また、キチナーゼの添加量は、転移反応が充分に進行する量であれば特に制限はないが、例えば上記オキサゾリン誘導体を０．１ｍｏｌ／Ｌ含む反応系においては、キチナーゼの添加量は５０〜５００ｍＵ／ｍＬが好ましく、７０〜１５０ｍＵ／ｍＬがより好ましい。なお、本発明において、キチナーゼ１Ｕ（ユニット）とは、ｐＨ６．８、３７℃の条件下で酵素をＮ−アセチルキトサンに作用させた際に、１分間にＮ−アセチルキトサンから１μｍｏｌのＮ−アセチルグルコサミンに相当する還元糖を生成する酵素量を意味する。
【００２９】
また、高速液体クロマトグラフィーの条件は、例えば「TSK-gel Amide-80」（商品名、トーソー社製）、「Asahipak NH2P-50 4E」（商品名、昭和電工社製）等のカラムを用い、溶媒としてアセトニトリル／水混合溶媒（アセトニトリル／水（ｖ／ｖ）＝８０／２０〜６０／４０）等を用いて行なうことができる。
【００３０】
【実施例】
以下、本発明を実施例を挙げてさらに具体的に説明する。
製造例
Ｎ−アセチルラクトサミン４．０ｇに塩化アセチル２０ｍＬを加え、撹拌しながら室温で４日間反応を行なった。なお、反応中は、ＴＬＣ（酢酸エチル／ヘキサン（ｖ／ｖ）＝４／１）により反応を追跡した。
【００３１】
この反応液をエバポレートによって濃縮し、過剰量の塩化メチレンで希釈後、ｐＨが中性になるまで冷水及び飽和炭酸水素ナトリウム溶液で分液し、得られた有機溶媒相を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濾過して硫酸ナトリウムを除去した。
【００３２】
得られた濾液をエバポレートにより濃縮し、更に減圧乾燥して溶媒を完全に除去して、塩化Ｎ−アセチル−3,6,2',3',4',6'−ヘキサ−O−アセチル−α−ラクトサミニル（以下、化合物（Ｉ）という）６．８０ｇを得た。精製は行なわずにそのまま次の反応を行なった。
【００３３】
上記化合物（Ｉ）３．０１ｇをアセトニトリル２５ｍＬに溶解し、この溶液を、塩化カルシウムによって一時間半乾燥させた塩化テトラエチルアンモニウム１．０ｇと炭酸水素ナトリウム１．０ｇに加え、５５℃で１時間４０分還流させた。ＴＬＣ（酢酸エチル／ヘキサン（ｖ／ｖ）＝４／１）にて反応終了を確認し、ガラスフィルターＧ４（商品名、柴田科学社製）で固形物を除去し、得られた濾液を減圧下で濃縮した後、過剰量の塩化メチレンで希釈し、水相のｐＨが中性になるまで冷水及び飽和炭酸水素ナトリウム溶液で分液し、得られた有機溶媒相を無水硫酸ナトリウムにより乾燥後、濾過して硫酸ナトリウムを除去した。
【００３４】
得られた溶液をエバポレートによって濃縮した後、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（Gel：商品名「Silica Gel 60」、Merck社製、particle size:0.04−0.063mm、展開溶媒：酢酸エチル／ヘキサン（ｖ／ｖ）＝４／１）により精製して、固体状の2−メチル｛3,6ジ−O−アセチル−4−O−(2,3,4,6−テトラ−O−アセチル−β−D−ガラクトピラノシル)1,2−ジデオキシ−α−グルコピラノ｝［2,1−d］−2−オキサゾリン（以下、化合物（ＩＩ）という）１．４０ｇを得た。
【００３５】
アルゴン雰囲気下、上記化合物（ＩＩ）１．４０ｇを無水メタノール２７０ｍＬに溶解させ、０．０１Ｍの濃度になるようにナトリウムメトキシドのメタノール溶液を添加し、室温で２時間反応させた。ＴＬＣ（酢酸エチル／ヘキサン（ｖ／ｖ）＝４／１）により反応終了を確認した後、反応溶液が中性になるまでイオン交換樹脂Amberlite IR-120(H+)（商品名、オルガノ社製）を加えた後、濾過してイオン交換樹脂を除去した。
【００３６】
得られた濾液をエバポレートによって濃縮し、更に減圧乾燥して、2−メチル｛4−O−（β−D−ガラクトピラノシル）1,2−ジデオキシ−α−D−グルコピラノ｝［2,1−d］−2−オキサゾリン（以下、オキサゾリン誘導体（Ｉ）という）０．８０ｇを得た。なお、オキサゾリン誘導体（Ｉ）は、ＮＭＲにより構造を確認した。
【００３７】
実施例１
上記オキサゾリン誘導体（Ｉ）３６．５ｍｇをエッペンドルフチューブに入れ、セロビオース１０３ｍｇと市販キチナーゼ（Bacillus sp．由来キチナーゼ、商品名「キチナーゼ」、和光純薬工業社製、以下同じ。）１４６ｍＵを溶解した５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ９．０）１ｍＬを添加し、４０℃の恒温槽に入れて反応を行なった。
【００３８】
反応中、高速液体クロマトグラフィーにより反応を追跡し、オキサゾリン誘導体（Ｉ）のピークが完全に消失したのを確認した後、９０℃で２０分間熱失活を行なった。なお、高速液体クロマトグラフィーは、以下の条件（１）で行なった。
【００３９】
・条件（１）
カラム：「TSK-gel Amide-80 (4.6×25mm)」（商品名、トーソー社製）
溶媒：アセトニトリル／水（ｖ／ｖ）＝６０／４０
温度：４０℃
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＲＩ
次いで、得られた反応液を用いて、以下の条件（２）で高速液体クロマトグラフィーを行ない、目的物の画分を回収した。
【００４０】
・条件（２）
カラム：「TSK-gel Amide-80 (21.5×30mm)」（商品名、トーソー社製）
溶媒：アセトニトリル／水（ｖ／ｖ）＝６５／３５
温度：４０℃
流速：６．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＲＩ
そして、回収した画分をエバポレートで濃縮、凍結乾燥して、下記式で表されるＮ−アセチルラクトサミニル−セロオリゴ糖誘導体９．９ｍｇを得た。
【００４１】
【化６】
なお、上記のＮ−アセチルラクトサミニル−セロオリゴ糖誘導体は、1Ｈ、13ＣＮＭＲ及びMALDI TOF MASSにより、その構造を確認した。
【００４３】
実施例２〜５
上記オキサゾリン誘導体（Ｉ）１．４６ｍｇをエッペンドルフチューブに入れ、セロトリオース０．６７１ｍｇと市販キチナーゼ１３ｍＵを溶解した５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ９．０）４０μＬを添加し、４０℃の恒温槽に入れて反応を行なった。
【００４４】
反応中、高速液体クロマトグラフィーにより反応を追跡し、オキサゾリン誘導体（Ｉ）のピークが完全に消失したのを確認した後、９０℃で２０分間熱失活を行なった。なお、高速液体クロマトグラフィーは、実施例１と同じ条件（１）で行なった。
【００４５】
得られた反応液を用いて、実施例１と同じ条件（２）で高速液体クロマトグラフィーを行ない、目的物の画分を回収し、エバポレートで濃縮、凍結乾燥して、上記一般式（１）において、ｎ＝２で表されるＮ−アセチルラクトサミニル−セロオリゴ糖誘導体を得た。
【００４６】
また、セロトリオースの代わりに、セロテトラオース（０．８８７ｍｇ）、セロペンタオース（１．１０ｍｇ）又はセロヘキサオース（０．６５９ｍｇ）を用いて上記と同様の条件で反応を行ない、上記一般式（１）において、Ｘ−ＲがＯＨ、ｎ＝３〜５で表される各Ｎ−アセチルラクトサミニル−セロオリゴ糖誘導体を得た。
【００４７】
なお、上記の各Ｎ−アセチルラクトサミニル−セロオリゴ糖誘導体は、1Ｈ、13ＣＮＭＲ及びMALDI TOF MASSにより、その構造を確認した。
【００４８】
実施例６
上記オキサゾリン誘導体（Ｉ）３６．５ｍｇをエッペンドルフチューブに入れ、メチルβ−D−セロビオシド１７．８ｍｇと市販キチナーゼ３２５ｍＵを溶解した５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ９．０）１ｍＬを添加し、４０℃の恒温槽に入れて反応を行なった。
【００４９】
反応中、高速液体クロマトグラフィーにより反応を追跡し、オキサゾリン誘導体（Ｉ）のピークが完全に消失したのを確認した後、９０℃で２０分間熱失活を行なった。なお、高速液体クロマトグラフィーは、以下の条件（３）で行なった。
【００５０】
・条件（３）
カラム：「TSK-gel Amide-80 (4.6×25mm)」（商品名、トーソー社製）
溶媒：アセトニトリル／水（ｖ／ｖ）＝７５／２５
温度：４０℃
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＲＩ
次いで、得られた反応液を用いて、以下の条件（４）で高速液体クロマトグラフィーを行ない、目的物の画分を回収した。
【００５１】
・条件（４）
カラム：「TSK-gel Amide-80 (21.5×30mm)」（商品名、トーソー社製）
溶媒：アセトニトリル／水（ｖ／ｖ）＝６０／４０
温度：３０℃
流速：６．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＲＩ
そして、回収した画分をエバポレートで濃縮、凍結乾燥して、下記式で表されるＮ−アセチルラクトサミニル−セロオリゴ糖誘導体８．９ｍｇを得た。
【００５２】
【化７】
なお、上記のＮ−アセチルラクトサミニル−セロオリゴ糖誘導体は、1Ｈ、13ＣＮＭＲ及びMALDI TOF MASSにより、その構造を確認した。
【００５４】
実施例７
上記オキサゾリン誘導体（Ｉ）３６．５ｍｇをエッペンドルフチューブに入れ、（Ｎ−アクリルアミドメチル）−アミノカルボニルエチル−１−チオ−β−D−セロビオシド１６．９ｍｇと市販キチナーゼ３２５ｍＵを溶解した５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ９．０）１ｍＬを添加し、４０℃の恒温槽に入れて反応を行なった。
【００５５】
反応中、高速液体クロマトグラフィーにより反応を追跡し、オキサゾリン誘導体のピークが完全に消失したのを確認した後、９０℃で２０分間熱失活を行なった。なお、高速液体クロマトグラフィーは、実施例６と同じ条件（３）で行なった。
【００５６】
次いで、得られた反応液を用いて、以下の条件（５）で高速液体クロマトグラフィーを行ない、目的物の画分を回収した。
【００５７】
・条件（５）
カラム：「Inertsil ODS-3 (10.0×25mm)」（商品名、GL Sciences社製）
溶媒：水／メタノール（ｖ／ｖ）＝９００／７０
温度：室温
流速：３．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ（２１０ｎｍ）
そして、回収した画分をエバポレートで濃縮、凍結乾燥して、下記式で表されるＮ−アセチルラクトサミニル−セロオリゴ糖誘導体４．７ｍｇを得た。
【００５８】
【化８】
なお、上記のＮ−アセチルラクトサミニル−セロオリゴ糖誘導体は、1Ｈ、13ＣＮＭＲ及びMALDI TOF MASSにより、その構造を確認した。
【００６０】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、糖受容体としてセロオリゴ糖又はセロオリゴ糖誘導体、糖供与体としてＮ−アセチルラクトサミンのオキサゾリン誘導体を用い、これらにキチナーゼをアルカリ性条件下で作用させることにより、セロオリゴ糖又はセロオリゴ糖誘導体の非還元末端にＮ−アセチルラクトサミンがβ−１，４結合した非天然型のセロオリゴ糖誘導体（Ｎ−アセチルラクトサミニル−セロオリゴ糖誘導体）を簡単かつ安価に得ることができる。
【００６１】
このＮ−アセチルラクトサミニル−セロオリゴ糖誘導体は、新規生理活性物質として、医薬品、診断薬、化粧品、食品、農薬、肥料等としての利用が期待できる。また、上記セロオリゴ糖誘導体の還元末端には、固定化のための重合基や、検出のための官能基等を付与することができるので、例えば、セルラーゼの活性測定用の基質やカラム充填剤としての利用も期待できる。
Claims (4)
- 下記一般式（１）で表されるＮ−アセチルラクトサミニル−セロオリゴ糖誘導体。
- 糖受容体となる下記一般式（２）で表されるセロオリゴ糖又はセロオリゴ糖誘導体と、糖供与体となるＮ−アセチルラクトサミンのオキサゾリン誘導体に、アルカリ性条件下でファミリー１８に属するキチナーゼを作用させることを特徴とするＮ−アセチルラクトサミニル−セロオリゴ糖誘導体の製造方法。
- 前記糖受容体と前記糖供与体に、ｐＨ８〜１０の条件下で前記キチナーゼを作用させる、請求項２に記載のＮ−アセチルラクトサミニル−セロオリゴ糖誘導体の製造方法。
- 前記キチナーゼが、Bacillus属由来のキチナーゼである、請求項２又は３に記載のＮ−アセチルラクトサミニル−セロオリゴ糖誘導体の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002011601A JP4105872B2 (ja) | 2002-01-21 | 2002-01-21 | Ｎ−アセチルラクトサミニル−セロオリゴ糖誘導体及びその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002011601A JP4105872B2 (ja) | 2002-01-21 | 2002-01-21 | Ｎ−アセチルラクトサミニル−セロオリゴ糖誘導体及びその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003212890A JP2003212890A (ja) | 2003-07-30 |
| JP4105872B2 true JP4105872B2 (ja) | 2008-06-25 |
Family
ID=27649035
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002011601A Expired - Fee Related JP4105872B2 (ja) | 2002-01-21 | 2002-01-21 | Ｎ−アセチルラクトサミニル−セロオリゴ糖誘導体及びその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4105872B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006232779A (ja) * | 2005-02-28 | 2006-09-07 | Yaizu Suisankagaku Industry Co Ltd | 双頭型配糖体及びその製造方法 |
-
2002
- 2002-01-21 JP JP2002011601A patent/JP4105872B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2003212890A (ja) | 2003-07-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5301427B2 (ja) | 糖オキサゾリン誘導体の製造方法 | |
| Shoda et al. | Green process in glycotechnology | |
| JP4105872B2 (ja) | Ｎ−アセチルラクトサミニル−セロオリゴ糖誘導体及びその製造方法 | |
| US7105320B2 (en) | Process for producing hyaluronic acid or its derivative | |
| CN103025883B (zh) | 使用糖类和糖苷酶制备丙烯酸酯衍生物的糖苷的方法 | |
| JP4105873B2 (ja) | Ｎ−アセチルグルコサミニル−セロオリゴ糖誘導体及びその製造方法 | |
| JP2001046096A (ja) | α−グルコシダーゼによる配糖体の製造方法及び新規なα−グルコシダーゼ並びにその製造方法 | |
| CN103025882B (zh) | 使用多糖和糖苷酶或糖基转移酶制备丙烯酸酯衍生物的糖苷的方法 | |
| US6562600B1 (en) | Production of cyclic alternan tetrasaccharides from oligosaccharide substrates | |
| Khan et al. | Enzymic regioselective hydrolysis of peracetylated reducing disaccharides, specifically at the anomeric centre: Intermediates for the synthesis of oligosaccharides. | |
| Zhang et al. | An Efficient and Concise Synthesis of a β-(1→ 6)-linked D-galactofuranosyl Hexasaccharide | |
| JP4105874B2 (ja) | β−１，６結合型Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖の製造方法 | |
| EP0298438B1 (de) | Disaccharidfluoride, Verfahren zur enzymatischen Herstellung mit alpha-glycosylfluoriden als Substraten | |
| JPS623795A (ja) | 分枝状シクロデキストリンの製造方法 | |
| Hunt et al. | Synthesis of 6′-galactosyllactose, a deviant human milk oligosaccharide, with the aid of Candida antarctica lipase-B | |
| US5968783A (en) | Process for the preparation of sugar nucleotides | |
| JP4402878B2 (ja) | 新規モノアセチルキトオリゴ糖及びその製造方法、並びにキチンオリゴ糖及びキトサンオリゴ糖の製造方法 | |
| JP2008054506A (ja) | 二糖製造方法 | |
| JP5418870B2 (ja) | １−Ｏ−α−グルコピラノシルＤ−プシコースの製造方法 | |
| JP4819240B2 (ja) | 精製されたｎ−アセチルラクトサミンの製造方法 | |
| JP3045509B2 (ja) | マンノース含有オリゴ糖の製造法 | |
| JP3078377B2 (ja) | マンノシル基転移オリゴ糖の製造方法 | |
| WO2009136601A1 (ja) | α－１，４グルカングラフト化セルロース | |
| JP2558074B2 (ja) | 分枝シクロデキストリンの製造方法 | |
| JPH11246588A (ja) | ２−メチル−｛４−Ｏ−（２−アミノ−２−デオキシ−β−グルコピラノシル）−１、２−ジデオキシ−α−グルコピラノ｝（２、１−ｄ）−２−オキサゾリンおよびその塩並びに５０％脱アセチル化キチンまたはそのオリゴ糖およびそれらの塩 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050119 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20071029 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20071228 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20080304 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20080328 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110404 Year of fee payment: 3 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |