CN104672308A

CN104672308A - 一种鞣酸加压素的方法

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Publication number: CN104672308A
Application number: CN201410817217.1A
Authority: CN
Inventors: 刘冠男; 李静洁; 孙延年
Original assignee: QINGDAO KANGYUAN PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: QINGDAO KANGYUAN PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2014-12-23
Filing date: 2014-12-23
Publication date: 2015-06-03

Abstract

本发明阐述一种鞣酸加压素制备方法。该加压素的制备方法包括下述步骤：采用高效液相反相色谱法将加压素粗品溶液依次进行反相纯化、反相脱盐，即可；高效液相反相色谱法的填料为苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)共聚物。本发明将反相纯化和反相脱盐联用，设计出聚合物填料苯乙烯-二乙烯基苯的最新应用，可以大批量制备鞣酸加压素。

Description

一种鞣酸加压素的方法

技术领域

本发明涉及生物制药领域。更具体地，本发明涉及鞣酸加压素的制备方法。

背景技术

鞣酸加压素，是由九个氨基酸残基组成的合成多肽，其化学结构为L-Cys-L-Tyr-L-Phe-L-Gln-L-Asn-L-Cys-L-Pro-L-Arg-L-Gly(1→6)-二硫键鞣酸盐，加压素的理论分子量1084.24。鞣酸加压素为抗利尿激素药，能促进远端肾小管及集合管对水分的重吸收而具有抗利尿作用，其制剂临床用于治疗尿崩症。

目前已上市多肽药物常见的纯化方法大都采用了制备型高效液相色谱法，该法是获得高纯度多肽目标分子的最有效的方法。一般多肽药物纯化制备工艺设计是先中低压色谱富集目标多肽，然后高压色谱精制，但是考虑到我们目标多肽血管紧张素分子量约1kD，无合适的分子筛凝胶柱(其上样量小，流速低，处理量小，比较适合分子量大于10kD蛋白的脱盐)或超滤膜选择。而且中低压色谱中常用的分离方法有分子筛色谱法、离子交换色谱法和疏水相互作用色谱法，这些色谱方法中用到的填料的粒径通常从几十微米到几百微米不等，空隙尺寸多为几百纳米不等，无法得到高纯度的目标多肽。如果采用高盐洗脱，后期处理无法找到合适的脱盐方案，分离纯化效果也有限，样品损失很大，回收率计算也较复杂，对于后期反相制备很不利。

现在还缺乏一种有效的制备多肽盐原料药的方法，因此仍然迫切需要开发新的多肽盐的纯化工艺。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于为了克服现有技术中鞣酸加压素的制备工艺复杂、收率低的缺陷，而提供了一种鞣酸加压素的制备方法。本发明的鞣酸加压素的制备方法以鞣酸加压素粗品为起始原料，经过高压反相色谱纯化和脱盐步骤，制备高纯度的鞣酸加压素的方法。

发明人经过反复的研究发现，目前高压反相色谱法经典纯化的填料是硅胶基质，其柱效好，分辨率高，但色谱条件pH2-7耐受较窄；而安捷伦聚合物填料PLRP-S为苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)共聚物，可耐受较宽阔的pH范围(pH范围可达1-14)，并且可用1M NaOH溶液再生，也可以精准控制孔径大小与孔径形态，使得溶质分子无障碍扩散，相对于硅胶基质，其增加了有效表面积，能保持很好的柱效和分辨率，且提升了填料的载样量。

本发明提供了一种鞣酸加压素的制备方法，其包括下述步骤：采用高效液相反相色谱法将加压素粗品溶液依次进行反相纯化、反相脱盐，即可；高效液相反相色谱法的填料为苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)共聚物。

所述的加压素粗品溶液较佳地为加压素粗品溶于体积百分比浓度为5％的乙腈水溶液形成的10g/L溶液。

其中，所述的反相纯化的条件优选如下：流动相A为体积百分比为0.1％的三氟乙酸水溶液，流动相B为体积百分比为0.1％的三氟乙酸乙腈溶液，流动相C为所述的加压素粗品溶液，流速为180～220mL/min(较佳地为200mL/min)，检测波长为220nm；

按照下表的条件进行在线上样、洗脱，百分比为体积百分比；

洗脱步骤	洗脱时间	洗脱液
			1	0～2min	95％A+5％B
2	2～22min	100％C
			3	22～40min	95％A+5％B
4	40～100min	95％A+5％B→65％A+35％B
			5	100～110min	40％A+60％B
6	110～120min	95％A+5％B

收集保留时间为45～95min的洗脱液得到加压素-三氟乙酸溶液。

其中，所述的反相脱盐的条件优选如下：流动相A为水，流动相B为乙腈，流动相C为0.1mol/L NaOH溶液，流速为180～220mL/min(较佳地为200mL/min)，检测波长为220nm；

收集保留时间为100～155min的洗脱液即可得到加压素溶液。

其中，所述的高效液相反相色谱法的装填条件优选如下：填料为安捷伦PLRP-S苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)共聚物，孔径10nm，粒径10μm，装柱密度0.33g/mL，柱压650psi。

本发明还提供了鞣酸加压素的制备方法，其包括下述步骤：将上述制备方法得到的加压素溶液与酸混合，即可。

其中，所述的酸较佳地为鞣酸。

本发明中，在所述的混合结束后，优选还进行减压浓缩，冷冻干燥，即可得到鞣酸加压素冻干粉体。所述的减压浓缩的压力较佳地为-0.15～-0.05MPa，所述的减压浓缩的温度较佳地为25～35℃。

鞣酸加压素是一种多肽物质，在碱性条件下不稳定，易降解，尤其是强碱环境下，本发明综合考察了碱洗脱的浓度和时间，以保证减少脱盐过程中样品的破坏及损失。

本发明创新点在于将反相纯化和反相脱盐联用，血管紧张素中含有一个碱性精氨酸残基(其胍基侧链pKa值为12.48)和一个碱性组氨酸残基，加压素中含有一个碱性精氨酸残基，而奥曲肽中则含有一个碱性赖氨酸的残基，该多肽在强酸性条件下结合TFA(三氟乙酸)能力很强，并且可能有多个碱性残基位点可以结合，需强碱才能将TFA中和置换除去，为了大批量制备和脱盐工艺，设计出聚合物填料PLRP-S的最新应用。

用了反相吸附法脱盐，采用在线稀释上样解决了反相纯化和反相脱盐联用的问题。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

(1)本发明利用了酸碱中和的方法，先用强碱中和强酸，利用多肽和反相填料的疏水结合，在色谱柱上中性洗脱游离的强酸根，并采用碱性洗脱中和结合的强酸根，制备除酸的多肽溶液。

(2)本发明采用在线上样，不用稀释样品溶液，直接在液相系统管路里混合样品溶液和流动相A、流动相B，上样到色谱柱上，避免了稀释后，样品体积过大，浓度被稀释的问题，适合连续的生产。

(3)本发明创新性地运用了反相吸附法脱盐，采用在线稀释上样解决了反相纯化和反相脱盐联用的问题，优化了生产工艺，适合工业化连续生产。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1(HPLC法检测加压素粗品原料和纯化中间体溶液纯度)

仪器：Waters2695/2489高效液相色谱仪

分离柱：Agilent XDB-C184.6×250mm，5μm

流动相：A为体积百分比为0.1％TFA水溶液，B为体积百分比为0.1％TFA-50％的乙腈水溶液

流速为1.0mL/min，检测波长为214nm，室温检测，

洗脱梯度见下表1所示，百分比为体积百分比。

表1流动相洗脱梯

洗脱步骤	洗脱时间	洗脱液
			1	0～5min	95％A+5％B
2	5～25min	95％A+5％B→50％A+50％B
			3	25～30min	100％B
4	30～35min	95％A+5％B

实施例2(75mm内径L&L4003制备柱装填)

运用Load&Lock动态轴向压缩和静态锁紧技术，填料为苯乙烯-二乙烯苯共聚物(反相填料安捷伦PLRP-S)，孔径10nm，粒径10μm，装柱密度0.33g/mL，装填至柱床压力650psi，采用Varian色谱装填系统，370g干粉填料，2L甲醇搅拌匀浆后，倒入75mm内径L&L4003制备柱，压缩比为3:1，载气为N2，调节载气压力使得油压表压力为2000psi，动态轴向压缩至柱床高度26cm，作为反相纯化和反相脱盐方案所用的制备柱。

实施例3(加压素粗品原料的反相纯化)

仪器：Varian SD-1高压液相制备系统

色谱柱：实施例2自装的制备柱Load&Lock400375×260mm，PLRP-S10μm10nm

流动相：A为体积百分比为0.1％的三氟乙酸水溶液，B为体积百分比为0.1％三氟乙酸乙腈溶液，加压素粗品经过体积百分比5％的乙腈水溶液为溶剂溶解配制成10g/L溶液，过滤澄清后样液为流动相C，按实施例1的方法测定其HPLC纯度为88.13％，保留时间为14.40min。

本实施例的反相纯化条件如下：流速200mL/min，220nm检测，纯化洗脱梯度见下表所示，对保留时间为48-54min目标主峰进行收集为加压素-三氟乙酸溶液，按实施例1的方法测定其HPLC纯度为99.19％，保留时间为14.60min。

表2反相纯化的洗脱梯度(百分比为体积百分比)

实施例4(加压素-三氟乙酸溶液的反相脱盐)

仪器：Varian SD-1高压液相制备系统

色谱柱：实施例2自装的制备柱Load&Lock400375×260mm，PLRP-S10μm10nm。

流动相：流动相A为纯水，流动相B为乙腈，流动相C为__L婻_$范_0.1M NaOH溶液，流速200mL/min，220nm检测，反相脱盐的洗脱梯度见下表3所示，对保留时间为102-112min目标主峰进行收集为加压素除TFA溶液，按实施例1中方法测定其HPLC纯度为99.81％，保留时间为14.51min。

表3反相脱盐所用的洗脱梯度(百分比为体积百分比)

采用waters micromass ZQ单重四级杆电喷雾质谱(ESI-MS)测定其分子质量峰[M+1]+测定值1084.40，主要离子碎片峰[M+2]2+测定值542.75，都符合理论值1084.24。

实施例5(离子色谱法测定鞣酸加压素样品中TFA残留)

仪器：美国Dionex500离子色谱仪

分离柱：IonPacAS14-AG14

检测方式：电导

淋洗液：1.0mM NaHCO3+3.0mM Na2CO3

取样品100mg加入10mL淋洗液溶解后过DionexOnGuard Ⅱ RP前处理预柱，进离子色谱仪检测含量。检测结果显示，加压素除TFA溶液中TFA含量为未检出(检测限5μg/g)。

实施例6(加压素成盐、浓缩及冻干)

将实施例4得到的鞣酸加压素除TFA溶液1L，在-0.1MPa、30℃条件下减压旋转浓缩除去溶液中的部分乙腈，缓慢加入质量体积比为20％的鞣酸水溶液，鞣酸用量按每一万单位加压素加一克鞣酸计，边加搅拌，得到加压素鞣酸盐溶液，分装入不锈钢托盘中，液面高度控制在0.5～1.0cm，盖上纱布送入真空冷冻干燥机按照预先设计好的冻干曲线进行冷冻干燥，经冷冻干燥得到鞣酸加压素冻干粉固体10.2g，按投料40g加压素粗品计算收率为25.5％。

Claims

1.一种鞣酸加压素的制备方法，其包括下述步骤：采用高效液相反相色谱法将加压素粗品溶液依次进行反相纯化、反相脱盐，即可；高效液相反相色谱法的填料为苯乙烯- 二乙烯基苯共聚物。

2.如权利要求1 所述的制备方法，其特征在于，所述的加压素粗品溶液为加压素粗品溶于体积百分比浓度为5％的乙腈水溶液形成的10g/L 溶液。

3.如权利要求1 所述的制备方法，其特征在于，所述的反相纯化的条件如下：流动相A为体积百分比为0.1％的三氟乙酸水溶液，流动相B 为体积百分比为0.1％的三氟乙酸乙腈溶液，流动相C 为所述的加压素粗品溶液，流速为190 ～ 210mL/min，检测波长为220nm ；收集保留时间为45 ～ 95min 的洗脱液得到加压素- 三氟乙酸溶液。

4.如权利要求4 所述的制备方法，其特征在于，所述的反相脱盐的条件如下：流动相A为水，流动相B 为乙腈，流动相C 为0.1mol/L NaOH 溶液，流速为180 ～ 220mL/min，检测波长为220nm ；收集保留时间为100 ～ 155min 的洗脱液即可得到加压素溶液。

5.如权利要求5 所述的制备方法，其特征在于，在所述的反相纯化中，流速为200mL/min ；在所述的反相脱盐中，流速为200mL/min。

6.如权利要求1 所述的制备方法，其特征在于，所述的高效液相反相色谱法的装填条件如下：填料为安捷伦PLRP-S 苯乙烯- 二乙烯基苯共聚物，孔径10nm，粒径10μm，装柱密度0.33g/mL，柱压为650psi。

7.一种加压素鞣酸盐的制备方法，其包括下述步骤：将权利要求1 ～ 7 中任一项所述的制备方法得到的加压素与鞣酸混合，即可。

8.如权利要求8 所述的制备方法，其特征在于，在所述的混合结束后，还进行减压浓缩，冷冻干燥，即可。

9.如权利要求9 所述的制备方法，其特征在于，所述的减压浓缩的压力为-0.15 ～ -0.05MPa，所述的减压浓缩的温度为25 ～ 35℃。

10.由权利要求8 ～ 10 中任一项所述的制备方法制得的不含有三氟乙酸的鞣酸加压素。