CN103980351A

CN103980351A - 加压素、加压素鞣酸盐的制备方法

Info

Publication number: CN103980351A
Application number: CN201410229108.8A
Authority: CN
Inventors: 洪勇; 江锡铭; 丁金国; 黄臻辉
Original assignee: Shanghai No1 Biochemical & Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Add medicine to the first biochemical pharmaceutcal corporation, Ltd in Shanghai
Priority date: 2014-05-27
Filing date: 2014-05-27
Publication date: 2014-08-13
Anticipated expiration: 2034-05-27
Also published as: CN103980351B

Abstract

本发明公开了加压素、加压素鞣酸盐的制备方法。该加压素的制备方法包括下述步骤：采用高效液相反相色谱法将加压素粗品溶液依次进行反相纯化、反相脱盐，即可；高效液相反相色谱法的填料为苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)共聚物。本发明将反相纯化和反相脱盐联用，设计出聚合物填料苯乙烯-二乙烯基苯的最新应用，可以大批量制备加压素和加压素鞣酸盐。

Description

加压素、加压素鞣酸盐的制备方法

技术领域

本发明涉及生物制药领域。更具体地，本发明涉及加压素、加压素鞣酸盐的制备方法。

背景技术

血管紧张素(或血管紧张素胺)为增血压药，英文名angiotensinamide或[Asn¹，Val⁵]-angiotensinⅡ，化学结构为L-Asn-L-Arg-L-Val-L-Tyr-L-Val-L-His-L-Pro-L-Phe，是由八个氨基酸残基组成的合成多肽，理论分子量1031.18。血管紧张素用于外伤或手术后休克和全身麻醉或腰椎麻醉时所致的低血压症等，可预防或治疗围手术期低血压，作为急救用药治疗休克期低血压，也可用于治疗血管紧张素转换酶抑制剂用药过量且常规治疗无效时。

鞣酸加压素，是由九个氨基酸残基组成的合成多肽，其化学结构为L-Cys-L-Tyr-L-Phe-L-Gln-L-Asn-L-Cys-L-Pro-L-Arg-L-Gly(1→6)-二硫键鞣酸盐，加压素的理论分子量1084.24。鞣酸加压素为抗利尿激素药，能促进远端肾小管及集合管对水分的重吸收而具有抗利尿作用，其制剂临床用于治疗尿崩症。

醋酸奥曲肽(Octreotide acetate)，是由七个氨基酸残基和一个苏氨醇组成的合成多肽，化学结构为D-苯丙氨酰-L-半胱氨酰-L-苯丙氨酰-D-色氨酰-L-赖氨酰-L-苏氨酰-N-[2R-羟基-1R-(羟甲基)丙基]-L-半胱氨酰胺环(2→7)-二硫键醋酸盐，奥曲肽的理论分子量为1019.26，其原料药冻干粉中醋酸含量为5％～12％。醋酸奥曲肽可抑制生长激素，抑制胃肠胰脏分泌多肽等，其制剂临床用于需要长期奥曲肽治疗的活动性肢端肥大症，如术后生长激素残留致血清生长激素水平增高，垂体外照射放射治疗后尚未达到充分疗效的血清生长激素水平升高，部分不适合手术治疗及新诊断生长激素分泌腺瘤患者的术前治疗。

目前已上市多肽药物常见的纯化方法大都采用了制备型高效液相色谱法，该法是获得高纯度多肽目标分子的最有效的方法，也是我们固相合成血管紧张素纯化和脱盐的主要技术手段。一般多肽药物纯化制备工艺设计是先中低压色谱富集目标多肽，然后高压色谱精制，但是考虑到我们目标多肽血管紧张素分子量约1kD，无合适的分子筛凝胶柱(其上样量小，流速低，处理量小，比较适合分子量大于10kD蛋白的脱盐)或超滤膜选择。而且中低压色谱中常用的分离方法有分子筛色谱法、离子交换色谱法和疏水相互作用色谱法，这些色谱方法中用到的填料的粒径通常从几十微米到几百微米不等，空隙尺寸多为几百纳米不等，无法得到高纯度的目标多肽。如果采用高盐洗脱，后期处理无法找到合适的脱盐方案，分离纯化效果也有限，样品损失很大，回收率计算也较复杂，对于后期反相制备很不利。现在还缺乏一种有效的制备多肽盐原料药的方法，因此仍然迫切需要开发新的多肽盐的纯化工艺。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于为了克服现有技术中多肽盐的制备工艺复杂、收率低的缺陷，而提供了一种多肽、多肽盐的制备方法。本发明的多肽盐的制备方法以多肽为起始原料，经过高压反相色谱纯化和脱盐步骤，制备高纯度的多肽盐、特别是血管紧张素醋酸盐、鞣酸加压素和醋酸奥曲肽的方法。

发明人经过反复的研究发现，目前高压反相色谱法经典纯化的填料是硅胶基质，其柱效好，分辨率高，但色谱条件pH2-7耐受较窄；而安捷伦聚合物填料PLRP-S为苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)共聚物，可耐受较宽阔的pH范围(pH范围可达1-14)，并且可用1M NaOH溶液再生，也可以精准控制孔径大小与孔径形态，使得溶质分子无障碍扩散，相对于硅胶基质，其增加了有效表面积，能保持很好的柱效和分辨率，且提升了填料的载样量。

本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：

本发明提供了一种多肽的制备方法，其包括下述步骤：采用高效液相反相色谱法将多肽粗品溶液依次进行反相纯化、反相脱盐，即可；高效液相反相色谱法的填料为苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)共聚物。

其中，所述的多肽粗品可为本领域的各种多肽粗品，较佳地为碱性多肽粗品，更佳地为血管紧张素粗品、加压素粗品或奥曲肽粗品。所述的血管紧张素粗品较佳地为专利申请CN201210131066.5公开的采用固相法合成的血管紧张素粗品，HPLC纯度为80～90％；所述的加压素粗品较佳地为专利申请CN201210131067.X公开的采用固相法合成的加压素粗品，HPLC纯度为80～90％；所述的奥曲肽粗品较佳地为采用固相法合成制得的奥曲肽粗品，HPLC纯度为80～90％。

所述的多肽粗品溶液较佳地为多肽粗品溶于体积百分比浓度为5％的乙腈水溶液形成的10g/L溶液。

其中，所述的反相纯化的条件优选如下：流动相A为体积百分比为0.1％的三氟乙酸水溶液，流动相B为体积百分比为0.1％的三氟乙酸乙腈溶液，流动相C为所述的多肽粗品溶液，流速为180～220mL/min(较佳地为200mL/min)，检测波长为220nm；

按照下表的条件进行在线上样、洗脱，百分比为体积百分比；

洗脱步骤	洗脱时间	洗脱液
			1	0～2min	95％A+5％B
2	2～22min	100％C
			3	22～40min	95％A+5％B
4	40～100min	95％A+5％B→65％A+35％B
			5	100～110min	40％A+60％B
6	110～120min	95％A+5％B

收集保留时间为45～95min的洗脱液得到多肽-三氟乙酸溶液。

其中，所述的反相脱盐的条件优选如下：流动相A为水，流动相B为乙腈，流动相C为0.1mol/L NaOH溶液，流速为180～220mL/min(较佳地为200mL/min)，检测波长为220nm；

洗脱步骤	洗脱时间	洗脱液
			1	0～5min	95％A+5％B
2	5～45min	75％A+25％多肽-三氟乙酸溶液
			3	45～55min	95％A+5％B
4	55～75min	75％A+5％B+20％C
			5	75～95min	95％A+5％B
6	95～155min	95％A+5％B→65％A+35％B
			7	155～175min	40％A+60％B
8	175～180min	95％A+5％B

收集保留时间为100～155min的洗脱液即可得到多肽溶液。

其中，所述的高效液相反相色谱法的装填条件优选如下：填料为安捷伦PLRP-S苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)共聚物，孔径10nm，粒径10μm，装柱密度0.33g/mL，柱压为650psi。

本发明还提供了多肽盐的制备方法，其包括下述步骤：将上述制备方法得到的多肽溶液与酸混合，即可。

其中，所述的酸较佳地为冰醋酸或鞣酸。

本发明中，在所述的混合结束后，优选还进行减压浓缩，冷冻干燥，即可得到多肽盐冻干粉体。所述的减压浓缩的压力较佳地为-0.15～-0.05MPa，所述的减压浓缩的温度较佳地为25～35℃。

其中，所述的多肽较佳地为血管紧张素、加压素或奥曲肽。

其中，所述的多肽盐较佳地为血管紧张素醋酸盐、加压素鞣酸盐或奥曲肽醋酸盐。

血管紧张素、加压素和奥曲肽都是一种多肽物质，在碱性条件下不稳定，易降解，尤其是强碱环境下，本发明综合考察了碱洗脱的浓度和时间，以保证减少脱盐过程中样品的破坏及损失。

本发明创新点在于将反相纯化和反相脱盐联用，血管紧张素中含有一个碱性精氨酸残基(其胍基侧链pKa值为12.48)和一个碱性组氨酸残基，加压素中含有一个碱性精氨酸残基，而奥曲肽中则含有一个碱性赖氨酸的残基，该多肽在强酸性条件下结合TFA(三氟乙酸)能力很强，并且可能有多个碱性残基位点可以结合，需强碱才能将TFA中和置换除去，为了大批量制备和脱盐工艺，设计出聚合物填料PLRP-S的最新应用。本发明创新性运用了反相吸附法脱盐，采用在线稀释上样解决了反相纯化和反相脱盐联用的问题。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

(1)本发明利用了酸碱中和的方法，先用强碱中和强酸，利用多肽和反相填料的疏水结合，在色谱柱上中性洗脱游离的强酸根，并采用碱性洗脱中和结合的强酸根，制备除酸的多肽溶液。

(2)本发明采用在线上样，不用稀释样品溶液，直接在液相系统管路里混合样品溶液和流动相A、流动相B，上样到色谱柱上，避免了稀释后，样品体积过大，浓度被稀释的问题，适合连续的生产。

(3)本发明创新性地运用了反相吸附法脱盐，采用在线稀释上样解决了反相纯化和反相脱盐联用的问题，优化了生产工艺，适合工业化连续生产。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1(HPLC法检测血管紧张素粗品原料和纯化中间体溶液纯度及定量)

仪器：Waters2695/2489高效液相色谱仪

分离柱：Waters XBridge-C18，4.6×150mm，5μm

流动相：A为20mM NaH₂PO₄-H₃PO₄(pH3.0)，B为体积百分比为50％的乙腈水溶液

流速为1.0mL/min，检测波长为220nm，室温检测，

洗脱梯度见下表1所示，百分比为体积百分比。

表1流动相洗脱梯度

洗脱步骤	洗脱时间	洗脱液
			1	0～7min	90％A+10％B→60％A+40％B
2	7～13min	60％A+40％B→50％A+50％B
			3	13～35min	50％A+50％B→100％B
4	35～40min	100％B
			5	40～45min	90％A+10％B

实施例2(75mm内径L&L4003制备柱装填)

运用Load&Lock动态轴向压缩和静态锁紧技术，填料为苯乙烯-二乙烯苯共聚物(反相填料安捷伦PLRP-S)，孔径10nm，粒径10μm，装柱密度0.33g/mL，装填至柱床压力650psi，采用Varian色谱装填系统，370g干粉填料，2L甲醇搅拌匀浆后，倒入75mm内径L&L4003制备柱，压缩比为3:1，载气为N2，调节载气压力使得油压表压力为2000psi，动态轴向压缩至柱床高度26cm，作为反相纯化和反相脱盐方案所用的制备柱。

实施例3

(一)血管紧张素粗品原料的反相纯化

仪器：Varian SD-1高压液相制备系统

色谱柱：实施例2自装的制备柱Load&Lock400375×260mm，PLRP-S10μm10nm

流动相：A为体积百分比为0.1％的三氟乙酸水溶液，B为体积百分比为0.1％三氟乙酸乙腈溶液，血管紧张素粗品(专利申请CN201210131066.5公开的采用固相法合成的血管紧张素粗品)经过体积百分比5％的乙腈水溶液为溶剂溶解配制成10g/L溶液，过滤澄清后样液为流动相C，按实施例1的方法测定其HPLC纯度为84.98％，，保留时间为10.34min，HPLC数据见表2所示。

表2血管紧张素粗品HPLC检测的峰结果

峰编号	保留时间(min)	面积(微伏*秒)	高度(微伏)	％面积
					1	5.723	114660	9972	0.68
2	6.470	13557	1592	0.08
					3	7.598	9823	899	0.06
4	8.133	76178	7881	0.45
					5	8.738	67006	7818	0.40
6	9.088	8971	1327	0.05
					7	9.631	46650	4709	0.28
8	10.335	14357014	1242791	84.98
					9	10.988	276934	44721	1.64
10	11.138	1118879	118916	6.62
					11	11.817	131299	8221	0.78
12	12.251	21447	2115	0.13
					13	12.541	30951	3707	0.18

本实施例的反相纯化条件如下：流速200mL/min，220nm检测，纯化洗脱梯度见下表3所示，对保留时间为56.5-62min目标主峰进行收集为血管紧张素-三氟乙酸溶液，按实施例1的方法测定其HPLC纯度为98.89％，保留时间为10.51min，HPLC数据见下表4。

表3反相纯化的洗脱梯度(百分比为体积百分比)

表4血管紧张素-三氟乙酸溶液HPLC检测的峰结果

峰编号	保留时间(min)	面积(微伏*秒)	高度(微伏)	％面积
					1	5.706	3447	360	0.02
2	8.863	7995	949	0.06
					3	9.808	14220	1760	0.10
4	10.514	13765923	1133552	98.89
					5	11.191	129102	13699	0.93

(二)血管紧张素-三氟乙酸溶液的反相脱盐

仪器：Varian SD-1高压液相制备系统

流动相：流动相A为纯水，流动相B为乙腈，流动相C为0.1M NaOH溶液，流速200mL/min，220nm检测，反相脱盐的洗脱梯度见表5所示，对保留时间为120-132min目标主峰进行收集为血管紧张素除TFA溶液，按实施例1中方法测定其HPLC纯度为99.51％，保留时间为10.39min，HPLC数据见表6。

表5反相脱盐所用的洗脱梯度(百分比为体积百分比)

洗脱步骤	洗脱时间	洗脱液
			1	0～5min	95％A+5％B
2	5～45min	75％A+25％血管紧张素-三氟乙酸溶液
			3	45～55min	95％A+5％B
4	55～75min	75％A+5％B+20％C
			5	75～95min	95％A+5％B
6	95～155min	95％A+5％B→65％A+35％B
			7	155～175min	40％A+60％B
8	175～180min	95％A+5％B

表6血管紧张素除TFA溶液HPLC检测的峰结果

峰编号	保留时间(min)	面积(微伏*秒)	高度(微伏)	％面积
					1	8.799	11184	1521	0.05
2	9.730	3823	557	0.02
					3	10.387	22413365	1987946	99.51
4	11.098	36099	4959	0.16
					5	11.326	53415	7451	0.24
6	11.750	6245	657	0.03

实施例4(血管紧张素成盐、浓缩及冻干)

将实施例3得到的血管紧张素除TFA溶液1L，加入2mL冰醋酸，得到血管紧张素醋酸盐溶液，在-0.1MPa、30℃条件下减压旋转浓缩除去溶液中的部分乙腈，分装入不锈钢托盘中，液面高度控制在0.5～1.0cm，盖上纱布送入真空冷冻干燥机(上海东富龙科技股份有限公司LYO-1)按照预先设计好的冻干曲线进行冷冻干燥，经冷冻干燥得到血管紧张素醋酸盐冻干粉固体13.3g，按投料40g血管紧张素粗品计算收率为33.2％，按实施例1的方法测定其HPLC纯度为99.18％，保留时间为10.53min，HPLC数据见表7所示。

表7血管紧张素醋酸盐冻干粉的HPLC检测的峰结果

峰编号	保留时间(min)	面积(微伏*秒)	高度(微伏)	％面积
					1	8.864	7464	921	0.06
2	10.529	11398620	1121376	99.18
					3	11.176	23762	2733	0.21
4	11.406	51069	5939	0.44
					5	11.797	11452	642	0.10

实施例5(血管紧张素醋酸盐质谱检测)

采用waters micromass ZQ单重四级杆电喷雾质谱(ESI-MS)测定血管紧张素醋酸盐样品分子量，结果显示分子质量峰[M+1]⁺测定值1031.93，主要离子碎片峰[M+2]²⁺测定值516.65，都符合理论值1031.18。

实施例6(离子色谱法测定血管紧张素醋酸盐样品中醋酸含量及TFA残留)

仪器：美国Dionex500离子色谱仪

分离柱：IonPacAS₁₄-AG₁₄

检测方式：电导

淋洗液：1.0mM NaHCO₃+3.0mM Na₂CO₃

取样品100mg加入10mL淋洗液溶解后过DionexOnGuardⅡRP前处理预柱，进离子色谱仪检测含量。检测结果显示，醋酸含量为9.35％(质量百分比)，TFA含量为未检出(检测限5μg/g)。

实施例7(HPLC法检测加压素粗品原料和纯化中间体溶液纯度)

仪器：Waters2695/2489高效液相色谱仪

分离柱：Agilent XDB-C184.6×250mm，5μm

流动相：A为体积百分比为0.1％TFA水溶液，B为体积百分比为0.1％TFA-50％的乙腈水溶液

流速为1.0mL/min，检测波长为214nm，室温检测，

洗脱梯度见下表8所示，百分比为体积百分比。

表8流动相洗脱梯度

洗脱步骤	洗脱时间	洗脱液
			1	0～5min	95％A+5％B
2	5～25min	95％A+5％B→50％A+50％B
			3	25～30min	100％B
4	30～35min	95％A+5％B

实施例8

(一)加压素粗品原料的反相纯化

仪器：Varian SD-1高压液相制备系统

流动相：A为体积百分比为0.1％的三氟乙酸水溶液，B为体积百分比为0.1％三氟乙酸乙腈溶液，加压素粗品(专利申请CN201210131067.X公开的采用固相法合成的加压素粗品)经过体积百分比5％的乙腈水溶液为溶剂溶解配制成10g/L溶液，过滤澄清后样液为流动相C，按实施例7的方法测定其HPLC纯度为88.13％，保留时间为14.40min。

本实施例的反相纯化条件如下：流速200mL/min，220nm检测，纯化洗脱梯度见下表9所示，对保留时间为48-54min目标主峰进行收集为加压素-三氟乙酸溶液，按实施例7的方法测定其HPLC纯度为99.19％，保留时间为14.60min。

表9反相纯化的洗脱梯度(百分比为体积百分比)

洗脱步骤	洗脱时间	洗脱液
			1	0～2min	95％A+5％B
2	2～22min	100％C
			3	22～40min	95％A+5％B
4	40～100min	95％A+5％B→65％A+35％B

5	100～110min	40％A+60％B
			6	110～120min	95％A+5％B

(二)加压素-三氟乙酸溶液的反相脱盐

仪器：Varian SD-1高压液相制备系统

流动相：流动相A为纯水，流动相B为乙腈，流动相C为0.1M NaOH溶液，流速200mL/min，220nm检测，反相脱盐的洗脱梯度见下表10所示，对保留时间为102-112min目标主峰进行收集为加压素除TFA溶液，按实施例7中方法测定其HPLC纯度为99.81％，保留时间为14.51min。

表10反相脱盐所用的洗脱梯度(百分比为体积百分比)

洗脱步骤	洗脱时间	洗脱液
			1	0～5min	95％A+5％B
2	5～45min	75％A+25％加压素-三氟乙酸溶液
			3	45～55min	95％A+5％B
4	55～75min	75％A+5％B+20％C
			5	75～95min	95％A+5％B
6	95～155min	95％A+5％B→65％A+35％B
			7	155～175min	40％A+60％B
8	175～180min	95％A+5％B

采用waters micromass ZQ单重四级杆电喷雾质谱(ESI-MS)测定其分子质量峰[M+1]⁺测定值1084.40，主要离子碎片峰[M+2]²⁺测定值542.75，都符合理论值1084.24。按实施例6测得加压素除TFA溶液中TFA含量为未检出(检测限5μg/g)。

实施例9(加压素成盐、浓缩及冻干)

将实施例8得到的加压素除TFA溶液1L，在-0.1MPa、30℃条件下减压旋转浓缩除去溶液中的部分乙腈，缓慢加入质量体积比为20％的鞣酸水溶液，鞣酸用量按每一万单位加压素加一克鞣酸计，边加搅拌，得到加压素鞣酸盐溶液，分装入不锈钢托盘中，液面高度控制在0.5～1.0cm，盖上纱布送入真空冷冻干燥机(上海东富龙科技股份有限公司LYO-1)按照预先设计好的冻干曲线进行冷冻干燥，经冷冻干燥得到鞣酸加压素冻干粉固体10.2g，按投料40g加压素粗品计算收率为25.5％。

实施例10(HPLC法检测奥曲肽粗品原料和纯化中间体溶液纯度)

仪器：Waters2695/2489高效液相色谱仪

分离柱：Kromasil100-3.5C18column4.6×100mm

流动相：A为10％四甲基氢氧化铵:水:乙腈体积百分比为2:88:10的水溶液，B为10％四甲基氢氧化铵:水:乙腈体积百分比为2:38:60的水溶液。

流速为0.8mL/min，检测波长为210nm，室温检测，

洗脱梯度见下表11所示，百分比为体积百分比。

表11流动相洗脱梯度

洗脱步骤	洗脱时间	洗脱液
			1	0～30min	73％A+27％B
2	30～31min	73％A+27％B→55％A+45％B
			3	31～37min	73％A+27％B

实施例11

(一)奥曲肽粗品原料的反相纯化

仪器：Varian SD-1高压液相制备系统

流动相：A为体积百分比为0.1％的三氟乙酸水溶液，B为体积百分比为0.1％三氟乙酸乙腈溶液，奥曲肽粗品(采用固相法合成制得)经过体积百分比5％的乙腈水溶液为溶剂溶解配制成10g/L溶液，过滤澄清后样液为流动相C，按实施例10的方法测定其HPLC纯度为85.13％，保留时间为8.59min。

本实施例的反相纯化条件如下：流速200mL/min，220nm检测，纯化洗脱梯度见下表12所示，对保留时间为86-92min目标主峰进行收集为奥曲肽-三氟乙酸溶液，按实施例10的方法测定其HPLC纯度为99.49％，保留时间为8.66min。

表12反相纯化的洗脱梯度(百分比为体积百分比)

(二)奥曲肽-三氟乙酸溶液的反相脱盐

仪器：Varian SD-1高压液相制备系统

流动相：流动相A为纯水，流动相B为乙腈，流动相C为0.1M NaOH溶液，流速200mL/min，220nm检测，反相脱盐的洗脱梯度见表13所示，对保留时间为142-152min目标主峰进行收集为奥曲肽除TFA溶液，按实施例10中方法测定其HPLC纯度为99.91％，保留时间为8.62min。

表13反相脱盐所用的洗脱梯度(百分比为体积百分比)

洗脱步骤	洗脱时间	洗脱液
			1	0～5min	95％A+5％B
2	5～45min	75％A+25％奥曲肽-三氟乙酸溶液
			3	45～55min	95％A+5％B

4	55～75min	75％A+5％B+20％C
			5	75～95min	95％A+5％B
6	95～155min	95％A+5％B→65％A+35％B
			7	155～175min	40％A+60％B
8	175～180min	95％A+5％B

实施例12(奥曲肽成盐、浓缩及冻干)

将实施例11得到的奥曲肽除TFA溶液1L，加入2mL冰醋酸，得到奥曲肽醋酸盐溶液，在-0.1MPa、30℃条件下减压旋转浓缩除去溶液中的部分乙腈，分装入不锈钢托盘中，液面高度控制在0.5～1.0cm，盖上纱布送入真空冷冻干燥机(上海东富龙科技股份有限公司LYO-1)按照预先设计好的冻干曲线进行冷冻干燥，经冷冻干燥得到醋酸奥曲肽冻干粉固体12.3g，按投料40g奥曲肽粗品计算收率为30.8％，按实施例10的方法测定其HPLC纯度为99.68％，保留时间为8.60min。采用waters micromass ZQ单重四级杆电喷雾质谱(ESI-MS)测定其分子质量峰[M+1]⁺测定值1019.86，主要离子碎片峰[M+2]²⁺测定值510.67，都符合理论值1019.26。按实施例6检测醋酸奥曲肽冻干粉结果显示，醋酸含量为8.35％(质量百分比)，TFA含量为未检出(检测限5μg/g)。

Claims

1.一种加压素的制备方法，其包括下述步骤：采用高效液相反相色谱法将加压素粗品溶液依次进行反相纯化、反相脱盐，即可；高效液相反相色谱法的填料为苯乙烯-二乙烯基苯共聚物。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的加压素粗品为专利申请CN201210131067.X公开的采用固相法合成的加压素粗品，所述的加压素粗品的HPLC纯度为80～90％。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的加压素粗品溶液为加压素粗品溶于体积百分比浓度为5％的乙腈水溶液形成的10g/L溶液。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的反相纯化的条件如下：流动相A为体积百分比为0.1％的三氟乙酸水溶液，流动相B为体积百分比为0.1％的三氟乙酸乙腈溶液，流动相C为所述的加压素粗品溶液，流速为180～220mL/min，检测波长为220nm；

洗脱步骤洗脱时间洗脱液 1 0～2min 95％A+5％B 2 2～22min 100％C 3 22～40min 95％A+5％B 4 40～100min 95％A+5％B→65％A+35％B 5 100～110min 40％A+60％B 6 110～120min 95％A+5％B

收集保留时间为45～95min的洗脱液得到加压素-三氟乙酸溶液。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的反相脱盐的条件如下：流动相A为水，流动相B为乙腈，流动相C为0.1mol/L NaOH溶液，流速为180～220mL/min，检测波长为220nm；

洗脱步骤洗脱时间洗脱液

1 0～5min 95％A+5％B 2 5～45min 75％A+25％加压素-三氟乙酸溶液 3 45～55min 95％A+5％B 4 55～75min 75％A+5％B+20％C 5 75～95min 95％A+5％B 6 95～155min 95％A+5％B→65％A+35％B 7 155～175min 40％A+60％B 8 175～180min 95％A+5％B

收集保留时间为100～155min的洗脱液即可得到加压素溶液。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，在所述的反相纯化中，流速为200mL/min；在所述的反相脱盐中，流速为200mL/min。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的高效液相反相色谱法的装填条件如下：填料为安捷伦PLRP-S苯乙烯-二乙烯基苯共聚物，孔径10nm，粒径10μm，装柱密度0.33g/mL，柱压为650psi。

8.一种加压素鞣酸盐的制备方法，其包括下述步骤：将权利要求1～7中任一项所述的制备方法得到的加压素与鞣酸混合，即可。

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，在所述的混合结束后，还进行减压浓缩，冷冻干燥，即可。

10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述的减压浓缩的压力为-0.15～-0.05MPa，所述的减压浓缩的温度为25～35℃。

11.由权利要求8～10中任一项所述的制备方法制得的不含有三氟乙酸的加压素鞣酸盐。