CN109444313B - 基于液质联用技术分析蛋白-多糖复合体消化率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于液质联用技术分析蛋白‑多糖复合体消化率的方法。所述方法为：将蛋白溶液以及蛋白‑多糖复合体溶液在模拟胃液中体外消化；接着对消化后的蛋白以及蛋白‑多糖复合体变性处理、用超滤管去掉低分子量多肽碎片，截留在超滤管中的大片段多肽使用除胃蛋白酶之外第二种酶切位点明确的内切蛋白酶进一步完全水解，得到若干多肽片段；最后使用液相色谱‑质谱联用技术检测多肽的组成和丰度。根据第二种蛋白酶切和胃蛋白酶切肽段的多肽丰度，确定胃蛋白酶消化率。进一步根据两种肽段中蛋白‑多糖复合体组别中高丰度的多肽推断蛋白和多糖的结合位点。
Description
技术领域
本发明属于分析方法技术领域，具体涉及一种基于液相色谱-质谱联用技术分析蛋白-多糖复合体消化率的方法。
背景技术
蛋白饮料类是我国国标GB/T 10789-2015饮料通则中规定的一大类饮料产品。是指以乳或乳制品，或其他动物来源的可食用蛋白，或含有一定蛋白含量的植物的果实、种子或种仁等为原料，添加或不添加其他事物原辅料和(或)食品添加剂，经加工活发酵制成的液体饮料。
蛋白饮料具有热量低、富含蛋白质等特点，近年来已成为大众关注的健康饮品，是新兴饮料市场的主角。以乳清蛋白饮料为例，因其有利于减脂、增肌受到了广泛的关注。蛋白类饮料制备过程中，尤其是在蛋白质浓度较高的情况下易产生沉淀的现象。其解决思路之一是加入可食用多糖，使其与蛋白形成可溶性复合体。以乳清蛋白饮料为例，食用菌多糖、卡拉胶、果胶以及壳聚糖等多糖与蛋白形成的可溶性复合体溶液中。
对于蛋白饮料来说，适当降低蛋白的消化速率有助于提高饱腹感和满足感，因此对于蛋白-多糖饮料的消化率的研究非常重要。目前该领域的研究并没有充分开展，少数的研究使用的分析方式较为单一，主要以体外模拟消化后结合SDS-PAGE电泳分析添加多糖对蛋白-多糖饮料的消化率的影响。采用的研究技术的局限性在于：1.SDS-PAGE的只能显示全部蛋白的消化速率的快慢，不能显示蛋白饮料中每一种蛋白质的消化速率；2.SDS-PAGE只能做到蛋白质的半定量，用于消化率的动力学研究则不够准确；3.无法提供蛋白-多糖结合位点等额外信息。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于液相色谱-质谱联用技术分析蛋白-多糖复合体消化率的方法。其主要操作思路为蛋白以及蛋白-多糖复合体在模拟胃液中体外消化；接着对消化后的蛋白以及蛋白-多糖复合体变性处理、用超滤管去掉低分子量多肽碎片，截留在超滤管中的大片段多肽使用除胃蛋白酶之外第二种酶切位点明确的内切蛋白酶水解；最后使用液相色谱-质谱联用技术结合生物信息学分析技术检测多肽的组成、序列和丰度；根据第二种蛋白酶切和胃蛋白酶切肽段的多肽丰度，确定胃蛋白酶消化率。
本发明中的技术可以实现：1.通过比较蛋白以及蛋白-多糖复合体的第二种蛋白酶水解多肽片段中两端均为第二种蛋白酶切肽段，两端分别为第二种蛋白酶切和胃蛋白酶切肽段的丰度，以确定胃蛋白酶消化率；2.通过上述两种肽段的序列，确定混合的蛋白溶液中不同蛋白的胃蛋白酶消化效率；3.上述两种肽段中蛋白-多糖复合体组别中高丰度的多肽推断蛋白和多糖的结合位点。
本发明为实现上述目的所采用的技术方案如下：
一种基于液质联用技术分析蛋白-多糖复合体消化率的方法，该方法为：
步骤1，配制蛋白溶液和多糖溶液，将多糖溶液和蛋白溶液混合，调节pH值至2-6之间，得到蛋白-多糖复合体溶液；所述pH值为蛋白和多糖形成复合体的区域，蛋白和多糖种类不同时，对应的pH值会有不同。
步骤2，配制模拟胃液，对前述配制的蛋白溶液以及蛋白-多糖复合体溶液进行消化；
步骤3，经模拟胃液消化后的蛋白溶液组以及蛋白-多糖复合体溶液组，分别加入蛋白变性剂进行变性处理，然后采用除胃蛋白酶外的第二种蛋白酶分别进一步水解所述蛋白溶液组以及蛋白-多糖复合体溶液组，得到若干多肽片段；
步骤4，采用液相色谱-质谱联用分析前述水解后获得的若干多肽片段，根据蛋白数据库中乳清蛋白所包含的各种蛋白质的序列数据，获得所述多肽片段的质谱响应强度和序列信息；
步骤5，分别将蛋白-多糖复合体溶液组以及蛋白溶液组获得的多肽片段的质谱响应强度相除后取以2为底的对数作为定量数值，每组重复三次实验并进行双样本t检验，并将FDR 0.05设定为确定两组显著性差异的阈值；定量数值大于等于1，同时p值小于0.05，则蛋白-多糖复合体溶液组中的二次水解肽段显著多于蛋白溶液组；定量数值小于等于-1，同时p值小于0.05，则蛋白-多糖复合体溶液组中的二次水解肽段显著少于蛋白溶液组；若定量数值小于1且大于-1，则该肽段在不同组别无显著性差异。
优选地，所述步骤1中，蛋白溶液中蛋白质与水的质量比为15％-25％，多糖溶液中多糖与水的质量比为2-5％。
优选地，所述多糖溶液和蛋白溶液以1:1体积比混合。
优选地，所述步骤2的具体过程为：
1)模拟胃液的配制：在水中添加HCl和胃蛋白酶，HCl的浓度为0.04-0.06M，胃蛋白酶的浓度为0.4-0.6μg/L，溶液体系的pH值为1.4-1.6；
2)含有模拟胃液的离心管置于恒温振荡器中，在35-38℃水浴，振荡5-10分钟，然后分别加入蛋白溶液、蛋白-多糖复合体溶液5-15毫升，在35-38℃水浴，振荡10-180分钟，用NaOH溶液调节反应液的pH至6-8，结束消化反应。
优选地，所述步骤3的具体过程为：
1)经模拟胃液消化后的蛋白溶液组以及蛋白-多糖复合体溶液组，分别加入蛋白变性剂，80-95℃加热4-6分钟，置于冰上冷却；
2)将变性后的蛋白碎片使用膜孔径为3-15kDa的超滤管，离心过滤分级，离心条件为3000-5000g，30-50分钟；保留截留在超滤管中的大片段多肽；
3)所述截留在超滤管中的大片段多肽，加入碳酸氢铵溶液，离心洗涤，离心条件为3000-5000g，30-50分钟，重复2-3次；
4)所述离心洗涤处理后的大片段多肽，加入除胃蛋白酶外的第二种蛋白酶进行水解；多肽与蛋白酶的质量比为20-100:1，使用的蛋白酶水解缓冲液根据选用的蛋白酶类型确定，水解温度为25-45℃，水解时间为10-24小时。
优选地，所述蛋白变性剂的配方选自以下其中之一：
1)6M盐酸胍,100mM三羟甲基氨基甲烷,10mM三(2-羧乙基)膦和40mM氯代乙酰胺；
2)8M尿素，150mM氯化钠，1mM乙二胺四乙酸，50mM三羟甲基氨基甲烷，65mM二硫苏糖醇，1mM乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸，1mM苯甲基磺酰氟。
优选地，所述第二种蛋白酶选自：胰蛋白酶、糜蛋白酶、赖氨酸蛋白酶Lys-C、重组Asp-N酶、蛋白内切酶Glu-C中的一种。
优选地，所述蛋白酶适用的水解缓冲液为：
胰蛋白酶水解缓冲液：100mM碳酸氢铵，pH 8.0；
糜蛋白酶水解缓冲液：100mM Tris，2mM氯化钙，pH 8.0；
赖氨酸蛋白酶Lys-C水解缓冲液：100mM碳酸氢铵，pH 8.0；
蛋白内切酶Glu-C水解缓冲液：100mM碳酸氢铵，pH 8.0；
重组Asp-N酶水解缓冲液：50mM Tris-盐酸，2.5mM乙酸锌，pH 8.0。
优选地，所述步骤4的具体过程为：
液相色谱-质谱联用分析多肽片段：液相色谱使用毛细管柱分离，毛细管柱内径50-150微米，柱长10-20厘米，Reprosil-Pur AQ C18填料；流动相A是含0.1％甲酸的水溶液，流动相B是0.1％甲酸的乙腈；
质谱分析参数：使用美国赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)的LTQ Orbitrap Velos质谱分析，参数如下：喷雾电压2千伏，质谱采集范围350–1750m/z，分辨率为60000，使用数据相关的采集模式选择20种最强的前体用于随后的碎裂(CID)；用于碎裂的归一化碰撞能量设定为35％；动态排除设置：重复计数1，重复持续时间30秒，排除持续时间30秒；Orbitrap的目标离子设置为5e5，最大进样时间为250ms；LTQ获得MS/MS扫描，目标离子设置为3e4，最大进样时间为50ms。
优选地，所述方法还包括：通过所述定量数值中显著增加或减少的肽段序列确定蛋白与多糖的结合位点。
具体地，基于液质联用技术分析蛋白-多糖复合体消化率的操作方法如下：
一、蛋白溶液以及蛋白-多糖复合体溶液的制备方法如下：
步骤1，蛋白溶液以及多糖溶液配制步骤如下：将蛋白溶解水中，室温下以200-400rpm搅拌2-4小时，其中蛋白质与水的质量比为15-25％，然后在5-15℃过夜使蛋白充分水合，制得蛋白溶液，备用；将多糖溶解水中，其中多糖与水的质量比为2-5％，然后在5-15℃过夜使多糖充分水合，制得多糖溶液，备用。
步骤2，蛋白-多糖复合体溶液配制步骤：将前述配制的多糖溶液与蛋白溶液以体积比1:1混合，调节pH值至蛋白和多糖形成复合体的区域，pH范围在2-6之间。最后在2-5℃下储存过夜，制得蛋白-多糖复合体溶液，备用。
二、体外模拟胃液消化蛋白溶液以及蛋白-多糖复合体溶液的方法，包括如下步骤：
步骤1，配置模拟胃液：含0.05M的HCl以及0.5μg/L的胃蛋白酶，pH1.5；
步骤2，含有25mL的模拟胃液的离心管置于恒温振荡器中，在37℃水浴，95rpm条件下振荡5-10分钟，分成两组，分别加入蛋白溶液和蛋白-多糖复合体溶液5-15毫升，在37℃水浴，95rpm条件下振荡10-180分钟，消化结束后，用1M的NaOH溶液调节反应液的pH至7，消化处理后的两组溶液以下分别称为蛋白溶液组和蛋白-多糖复合体溶液组。
三、采用除胃蛋白酶外的第二种蛋白酶分别进一步水解上述模拟胃液消化后的蛋白溶液组以及蛋白-多糖复合体溶液组，具体步骤如下：
S1、上述经模拟胃液消化后的蛋白溶液组以及蛋白-多糖复合体溶液组，分别加入蛋白变性剂，所述蛋白变性剂配方是：6M盐酸胍,100mM三羟甲基氨基甲烷,10mM三(2-羧乙基)膦和40mM氯代乙酰胺；或者，蛋白变性剂配方还可以是：8M尿素,150mM氯化钠,1mM乙二胺四乙酸,50mM三羟甲基氨基甲烷,65mM二硫苏糖醇,1mM乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸,1mM苯甲基磺酰氟；随后80-95℃加热5分钟，置于冰上冷却。
S2、将上述变性处理后的蛋白溶液组以及蛋白-多糖复合体溶液组分别使用超滤管(膜孔径可能为3kDa、5kDa、10kDa或者15kDa)离心过滤分级，离心条件为4000g，40分钟；未通过超滤管膜的大片段多肽则留在超滤管中。
S3、留在超滤管的大片段多肽进行洗涤处理：加入碳酸氢铵溶液至截留在S2步骤超滤管中的大片段多肽，离心洗涤，离心条件为4000g，40分钟；重复两次。
S4、处理后的大片段多肽进行完全酶解，酶解步骤为：纯度为质谱级的水解位点明确的蛋白酶(包括胰蛋白酶、糜蛋白酶、赖氨酸蛋白酶Lys-C、重组Asp-N酶、蛋白内切酶Glu-C中的一种)，蛋白与蛋白酶的质量比为20-100:1，使用的水解缓冲液根据所选的蛋白酶类型确定；水解温度为25-45℃，水解时间为10-24小时。所述蛋白酶水解缓冲液如下：
胰蛋白酶水解缓冲液：100mM碳酸氢铵(pH 8.0)；
糜蛋白酶水解缓冲液：100mM Tris，2mM氯化钙(pH 8.0)；
赖氨酸蛋白酶Lys-C水解缓冲液：100mM碳酸氢铵(pH 8.0)；
蛋白内切酶Glu-C水解缓冲液：100mM碳酸氢铵(pH 8.0)；
重组Asp-N酶水解缓冲液：50mM Tris-盐酸，2.5mM乙酸锌(pH 8.0)。
S5、液相色谱-质谱联用分析多肽片段：液相色谱使用毛细管柱分离，毛细管柱内径50-150微米，柱长10-20厘米，Reprosil-Pur AQ C18填料。流动相A是含0.1％甲酸的水溶液，流动相B是0.1％甲酸的乙腈。流速为每分钟200纳升，流动相B在30分钟中，从4％升至25％，样品进样量4微升。
S6、使用美国赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)的LTQOrbitrapVelos质谱分析，参数如下：质谱分析参数：喷雾电压2千伏，质谱采集范围350–1,750m/z，分辨率为60000，使用数据相关的采集模式选择20种最强的前体用于随后的碎裂(CID)。用于碎裂的归一化碰撞能量设定为35％。动态排除设置：重复计数1，重复持续时间30秒，排除持续时间30秒。Orbitrap的目标离子设置为5e5，最大进样时间为250ms。LTQ获得MS/MS扫描，目标离子设置为3e4，最大进样时间为50ms。
S7、数据分析：使用DTASupercharge(v2.0a7)将所有获取的原始文件转换为*.mgf文件；然后，从UniProt数据库(http://www.uniprot.org/)下载乳清蛋白中各种蛋白质的序列(包括β-乳球蛋白，α-乳清蛋白，血清白蛋白，乳转铁蛋白，乳过氧化物酶，转化生长因子β-1和转化生长因子β-2，UniProt ID分别为P02754，P00711，P02769，P24627，P80025，P18341和P21214)建立数据库，搜索*.mgf文件，获得多肽片段的质谱响应强度和序列信息。
使用Perseus 21软件进行数据分析。MaxQuant生成的'Peptides.txt'文件用于定量数据分析。具体定量步骤：蛋白-多糖复合体溶液组以及蛋白溶液组获得的第二次水解多肽中，均能鉴定到的序列相同肽段的质谱响应强度相除后取以2为底的对数作为定量数值。
例如，肽段a在蛋白-多糖复合体溶液组的质谱响应强度为A1，在蛋白溶液组的质谱响应强度为A2，则所述定量数值的计算公式是：
每组重复三次实验并进行双样本t检验，并将FDR 0.05，设定为确定两组均鉴定到的序列相同肽段的显著性差异的阈值。若鉴定到的序列相同肽段的定量数值大于等于1，同时p值小于0.05，则认为是蛋白-多糖复合体溶液组中的二次水解后其中鉴定到的某条序列相同肽段的量显著多于其在蛋白溶液组的量；定量数值小于等于-1，同时p值小于0.05，则认为是蛋白-多糖复合体溶液组中的二次水解后其中鉴定到的某条序列相同肽段的量显著少于其在蛋白溶液组的量肽段显著少于蛋白-多糖复合体溶液组；若定量数值小于1且大于-1，则该肽段在不同组别无显著性差异。
S8、蛋白-多糖复合体的结合位点：使用PyMol软件(https://pymol.org/2/)的试用版获得蛋白质与多糖结合位点的3D结构模型。
与现有技术相比，本发明的优点如下：
1、现有的蛋白消化率研究中，消化出的多肽的定量主要依赖于电泳或者液相色谱峰面积积分的方法，不足之处在于无法区分消化的多肽片段属于哪个蛋白。因此，以乳清蛋白为例，其中含有大约十个不同的蛋白组成，现有技术无法区分每种蛋白的消化速率。而本发明通过二次酶解结合液相色谱串联质谱技术的使用，可以精确的鉴定出消化产物中的蛋白质序列和丰度，进一步通过生物信息学的方法精确计算出定量数值中显著增加或减少的肽段序列，进而确定混合蛋白体外消化后，不同蛋白的消化利用速率的差异；本发明可以通过二次水解多肽的质谱响应强度精确描述蛋白体外消化动力学。
2、除了蛋白消化率的精确分析，本方法还可以确定出蛋白-多糖复合体的结合位点，通过液质联用分析，本发明可以通过定量数值中显著增加或减少的肽段序列确定蛋白与多糖的结合位点，这一信息是现有的检测方法无法获取的。
附图说明
图1是本发明方法原理的流程图。其中，第一步酶解是使用胃蛋白酶体外模拟胃液消化处理，第二步酶解是蛋白变性后使用除胃蛋白酶之外第二种酶切位点明确的内切蛋白酶进一步酶解处理。图中的Pt—Pp或者Pp—Pt为一端为胃蛋白酶切位点，另一端为第二种蛋白酶切位点的多肽片段(下简称P1)；图中Pt—Pt为双端均是第二种蛋白酶切位点的多肽片段(下简称P2)；图中的曲线指多糖，圆点表示不同的氨基酸。
图2是本发明实施例中蛋白溶液以及蛋白-多糖复合体溶液经模拟胃液消化2小时后大片段多肽经由胰蛋白酶彻底水解后肽段的丰度差异图，图中菱形为一端为胃蛋白酶切位点，另一端为胰蛋白酶切位点的多肽片段(P1)；方形为双端均是胰蛋白酶切位点的多肽片段(P2)；其他类型的肽段用圆点表示(下简称P3)。
图3是本发明实施例中乳铁蛋白与银耳多糖的结合位点，图中圈出部分为结合位点。
图4是本发明实施例中β-乳球蛋白与银耳多糖的结合位点，图中圈出部分为结合位点。
图5是本发明实施例中血清白蛋白与银耳多糖的结合位点，图中圈出部分为结合位点。
图6是本发明实施例中乳过氧化物酶与银耳多糖的结合位点，图中圈出部分为结合位点。
图7是本发明实施例中α-乳清蛋白与银耳多糖的结合位点，图中圈出部分为结合位点。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1蛋白溶液以及蛋白-多糖复合体溶液的制备：
乳清分离蛋白溶液以及乳清分离蛋白-银耳多糖复合体溶液配制步骤如下：将乳清分离蛋白溶解水中，室温下以200rpm搅拌4小时，其中蛋白质与水的质量比为20％，然后在5℃过夜使蛋白充分水合，制得乳清分离蛋白溶液，备用；将银耳多糖溶解水中，其中多糖与水的质量比为2％，然后在5℃过夜使多糖充分水合，制得银耳多糖溶液，备用。
乳清分离蛋白-银耳多糖复合体溶液配制步骤：银耳多糖溶液添加至前述配制的乳清分离蛋白溶液中，体积比1:1，控制合适加水量，调节pH值至4.5，在5℃下储存过夜。
实施例2体外模拟胃液消化乳清分离蛋白溶液以及乳清分离蛋白-银耳多糖溶液：
含有25mL模拟胃液(含0.05M的HCl以及0.5μg/L的胃蛋白酶)的离心管置于恒温振荡器中，在37℃水浴，95r/min条件下振荡5分钟，分为两组，分别加入乳清分离蛋白溶液、乳清分离蛋白-银耳多糖复合体溶液10mL，在37℃水浴，95r/min条件下振荡120分钟，消化结束后，用1M的NaOH溶液调节反应液的pH至7。消化处理后的两组溶液以下分别称为乳清蛋白溶液组和乳清蛋白-银耳多糖复合体溶液组。
实施例3乳清分离蛋白溶液以及乳清分离蛋白-银耳多糖溶液的变性和第二步酶解，具体步骤如下：
上述经模拟胃液降解的乳清分离蛋白溶液组以及乳清分离蛋白-银耳多糖溶液组，分别加入蛋白变性剂(变性剂配方是6M盐酸胍,100mM三羟甲基氨基甲烷,10mM三(2-羧乙基)膦和40mM氯代乙酰胺)，随后95℃加热5分钟，置于冰上冷却。将变性后的蛋白碎片使用膜孔径10kDa的超滤管离心过滤分级，离心条件为4000g，40分钟。留在超滤管中的大片段多肽中加入碳酸氢铵溶液离心洗涤，离心条件为4000g，40分钟。重复两次。
使用纯度为质谱级的水解位点明确的胰蛋白酶对上述处理后的大片段多肽进一步完全酶解，蛋白与蛋白酶的质量比为40:1，使用的水解缓冲液为50mM碳酸氢铵溶液，水解温度为37℃，水解时间为16小时。
液相色谱-质谱联用分析多肽片段：液相色谱使用毛细管柱分离，毛细管柱内径150微米，柱长15厘米，Reprosil-Pur AQ C18填料。流动相A是含0.1％甲酸的水溶液，流动相B是0.1％甲酸的乙腈。流速为每分钟200纳升，流动相B在30分钟中，从4％升至25％，样品进样量4微升。
质谱分析参数：喷雾电压2千伏，质谱采集范围350–1,750m/z，分辨率为60000，使用数据相关的采集模式选择20种最强的前体用于随后的碎裂(CID)。用于碎裂的归一化碰撞能量设定为35％。动态排除设置：重复计数1，重复持续时间30秒，排除持续时间30秒。Orbitrap的目标离子设置为5e5，最大进样时间为250ms。LTQ获得MS/MS扫描，目标离子设置为3e4，最大进样时间为50ms。
数据分析：使用DTASupercharge(v2.0a7)将所有获取的原始文件转换为*.mgf文件。然后，从UniProt数据库(http://www.uniprot.org/)下载乳清蛋白中各种蛋白质的序列(包括β-乳球蛋白，α-乳清蛋白，血清白蛋白，乳转铁蛋白，乳过氧化物酶，转化生长因子β-1和转化生长因子β-2，UniProt ID分别为P02754，P00711，P02769，P24627，P80025，P18341和P21214)建立数据库，搜索*.mgf文件，获得多肽片段的质谱响应强度和序列信息。
使用Perseus 21软件进行数据分析。MaxQuant生成的'Peptides.txt'文件用于定量数据分析。具体定量步骤：蛋白-多糖复合体溶液组以及蛋白溶液组获得的第二次水解多肽中，均能鉴定到的序列相同肽段的质谱响应强度相除后取以2为底的对数作为定量数值。
例如，肽段a在蛋白-多糖复合体溶液组的质谱响应强度为A1，在蛋白溶液组的质谱响应强度为A2，则所述定量数值的计算公式是：
每组重复三次实验并进行双样本t检验，并将FDR 0.05，设定为确定两组均鉴定到的序列相同肽段的显著性差异的阈值。若鉴定到的序列相同肽段的定量数值大于等于1，同时p值小于0.05，则认为是蛋白-多糖复合体溶液组中的二次水解后其中鉴定到的某条序列相同肽段的量显著多于其在蛋白溶液组的量；定量数值小于等于-1，同时p值小于0.05，则认为是蛋白-多糖复合体溶液组中的二次水解后其中鉴定到的某条序列相同肽段的量显著少于其在蛋白溶液组的量肽段显著少于蛋白-多糖复合体溶液组；若定量数值小于1且大于-1，则该肽段在不同组别无显著性差异。
参见图1，为基于液相色谱-质谱联用技术分析蛋白-多糖复合体消化利用率的方法的流程图。
参见图2，是本发明实施例中蛋白溶液以及蛋白-多糖复合体溶液经模拟胃液消化2小时后大片段多肽经由胰蛋白酶彻底水解后肽段的丰度差异图。图中菱形为一端为胃蛋白酶切位点，另一端为胰蛋白酶切位点的多肽片段(P1)；方形为双端均是胰蛋白酶切位点的多肽片段(P2)；其他类型的肽段用圆点表示(下简称P3)。通过胃蛋白酶进行有限的消化，然后通过胰蛋白酶完成蛋白水解，将产生三种不同类型的肽：P1、P2和P3。如果乳清蛋白受银耳多糖的保护因此，胃蛋白酶水解的程度会更轻，则应在乳清蛋白-银耳多糖复合体溶液组中检测到更完全的P1和P2。
通过图2可以看出：乳清蛋白组和乳清蛋白-银耳多糖复合体组经胃蛋白酶消化、胰蛋白酶水解后多肽片段的定量关系。图中显示了三种类型的肽丰度变化与其概率的关系。图中菱形表示一端为胃蛋白酶切位点，另一端为胰蛋白酶切位点的肽段；方形表示两端均为胰蛋白酶切位点的肽段，圆形为其他类型肽段。在模拟胃液消化120分钟后，乳清蛋白-银耳多糖复合体组中总共9种P2和12种P1，丰度显著增加，P1和P2的丰度变化范围大约为4倍至64倍。横坐标为乳清蛋白组和乳清蛋白-银耳多糖复合体组样品肽段丰度差异，其计算方法是：质谱检测出乳清蛋白组和乳清蛋白-银耳多糖复合体组样品两次酶解后的多肽片段的强度作为定量依据，乳清蛋白-银耳多糖复合体组样品与乳清蛋白组中相同肽段强度数值相除后确定肽段之间的丰度变化，图中横坐标的定量数值为肽段强度数值相除后取以2为底的对数数值；纵坐标为每组样品的三个平行样之间t检验，对假阳性率p取以2为底的对数数值，其中p小于5％则被认为是可信度较高。
在模拟胃液消化120分钟后，乳清蛋白-银耳多糖复合体组中总共9种P2(图中方形点)和12种P1(图中菱形点)的丰度显著增加，P1和P2的丰度增加的变化范围大约为4倍至64倍。图2中添加了银耳多糖的乳清蛋白组中P1和P2的丰度显著增加，说明第一步胃蛋白酶水解中，多糖的存在使得乳清蛋白在模拟胃液中水解的程度轻，即在乳清蛋白溶液中添加银耳多糖可降低体外胃蛋白酶消化过程中乳清蛋白的消化率。此外，与传统方法相比，本发明所用新技术的优势可以提供每种蛋白质的消化率。例如，当受银耳多糖保护时，消化120分钟后，乳清蛋白-多糖复合体组中肽段“GLFQINNK”和“RHPEYAVSVLLR”的丰度分别提高了388倍和294倍，这两段序列分别属于α-乳清蛋白和血清白蛋白。说明多糖保护使得乳清蛋白中α-乳清蛋白和血清白蛋白的消化率显著降低。
实施例3蛋白与多糖的结合位点的推断，具体步骤如下：
因受到银耳多糖的保护，上述在蛋白-多糖复合体组中高丰度的P1和P2为蛋白质与多糖的结合位点，根据质谱检测出来的P1和P2的序列以及从UniProt数据库中下载的乳清蛋白中蛋白质的序列，使用PyMol软件(https://pymol.org/2/)，获得蛋白质以及其与多糖结合位点的3D结构模型。
参见图3-图7，图中圈出部分分别为乳清蛋白中的β-乳球蛋白，α-乳清蛋白，血清白蛋白，乳铁蛋白，乳过氧化物酶与银耳多糖的结合位点。
上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。
Claims (10)
1.一种基于液质联用技术分析蛋白-多糖复合体消化率的方法，该方法为：
步骤1，配制蛋白溶液和多糖溶液，将多糖溶液和蛋白溶液混合，调节pH值至2-6之间，得到蛋白-多糖复合体溶液；
步骤2，配制模拟胃液，对前述配制的蛋白溶液以及蛋白-多糖复合体溶液进行消化；
步骤3，经模拟胃液消化后的蛋白溶液组以及蛋白-多糖复合体溶液组，分别加入蛋白变性剂进行变性处理，变性后的蛋白碎片使用膜孔径为3-15kDa的超滤管，离心过滤分级，保留截留在超滤管中的大片段多肽，向其中加入碳酸氢铵溶液，离心洗涤；所述离心洗涤处理后的大片段多肽，加入除胃蛋白酶外的第二种蛋白酶进行水解，分别得到蛋白溶液组以及蛋白-多糖复合体溶液组的若干多肽片段；
步骤4，采用液相色谱-质谱联用分析前述水解后获得的若干多肽片段，根据蛋白数据库中乳清蛋白所包含的各种蛋白质的序列数据，获得所述多肽片段的质谱响应强度和序列信息；
步骤5，分别将蛋白-多糖复合体溶液组以及蛋白溶液组获得的多肽片段的质谱响应强度相除后取以2为底的对数作为定量数值，每组重复三次实验并进行双样本t检验，并将FDR0.05定为确定两组显著性差异的阈值；对每条多肽而言，若其定量数值大于等于1，同时p值小于0.05，则蛋白-多糖复合体溶液组中的二次水解肽段显著多于蛋白溶液组；若定量数值小于等于-1，同时p值小于0.05，则蛋白-多糖复合体溶液组中的二次水解肽段显著少于蛋白溶液组；若定量数值小于1且大于-1，则该肽段在不同组别无显著性差异。
2.如权利要求1所述的一种基于液质联用技术分析蛋白-多糖复合体消化率的方法，其特征在于：所述步骤1中，蛋白溶液中蛋白质与水的质量比为15％-25％，多糖溶液中多糖与水的质量比为2-5％。
3.如权利要求2所述的一种基于液质联用技术分析蛋白-多糖复合体消化率的方法，其特征在于：所述多糖溶液和蛋白溶液以1:1体积比混合。
4.如权利要求1所述的一种基于液质联用技术分析蛋白-多糖复合体消化率的方法，其特征在于，所述步骤2的具体过程为：
1)模拟胃液的配制：在水中添加HCl和胃蛋白酶，HCl的浓度为0.04-0.06M，胃蛋白酶的浓度为0.4-0.6μg/L，溶液体系的pH值为1.4-1.6；
2)含有模拟胃液的离心管置于恒温振荡器中，在35-38℃水浴，振荡5-10分钟，然后分别加入蛋白溶液、蛋白-多糖复合体溶液5-15毫升，在35-38℃水浴，振荡10-180分钟，用NaOH溶液调节反应液的pH至6-8，结束消化反应。
5.如权利要求1所述的一种基于液质联用技术分析蛋白-多糖复合体消化率的方法，其特征在于，所述步骤3的具体过程为：
1)经模拟胃液消化后的蛋白溶液组以及蛋白-多糖复合体溶液组，分别加入蛋白变性剂，80-95℃加热4-6分钟，置于冰上冷却；
2)将变性后的蛋白碎片使用膜孔径为3-15kDa的超滤管，离心过滤分级，离心条件为3000-5000g，30-50分钟；保留截留在超滤管中的大片段多肽；
3)所述截留在超滤管中的大片段多肽，加入碳酸氢铵溶液，离心洗涤，离心条件为3000-5000g，30-50分钟，重复2-3次；
4)所述离心洗涤处理后的大片段多肽，加入除胃蛋白酶外的第二种蛋白酶进行水解；多肽与蛋白酶的质量比为20-100:1，使用的蛋白酶水解缓冲液根据选用的蛋白酶类型确定，水解温度为25-45℃，水解时间为10-24小时。
6.如权利要求5所述的一种基于液质联用技术分析蛋白-多糖复合体消化率的方法，其特征在于，所述蛋白变性剂的配方选自以下其中之一：
1)6M盐酸胍,100mM三羟甲基氨基甲烷,10mM三(2-羧乙基)膦和40mM氯代乙酰胺；
2)8M尿素，150mM氯化钠，1mM乙二胺四乙酸，50mM三羟甲基氨基甲烷，65mM二硫苏糖醇，1mM乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸，1mM苯甲基磺酰氟。
7.如权利要求5所述的一种基于液质联用技术分析蛋白-多糖复合体消化率的方法，其特征在于，所述第二种蛋白酶选自：胰蛋白酶、糜蛋白酶、赖氨酸蛋白酶Lys-C、重组Asp-N酶、蛋白内切酶Glu-C中的一种。
8.如权利要求7所述的一种基于液质联用技术分析蛋白-多糖复合体消化率的方法，其特征在于，所述蛋白酶适用的水解缓冲液为：
胰蛋白酶水解缓冲液：100mM碳酸氢铵，pH 8.0；
糜蛋白酶水解缓冲液：100mM Tris，2mM氯化钙，pH 8.0；
赖氨酸蛋白酶Lys-C水解缓冲液：100mM碳酸氢铵，pH 8.0；
蛋白内切酶Glu-C水解缓冲液：100mM碳酸氢铵，pH 8.0；
重组Asp-N酶水解缓冲液：50mM Tris-盐酸，2.5mM乙酸锌，pH 8.0。
9.如权利要求1所述的一种基于液质联用技术分析蛋白-多糖复合体消化率的方法，其特征在于，所述步骤4的具体过程为：
液相色谱-质谱联用分析多肽片段：液相色谱使用毛细管柱分离，毛细管柱内径50-150微米，柱长10-20厘米，Reprosil-Pur AQ C18填料；流动相A是含0.1％甲酸的水溶液，流动相B是0.1％甲酸的乙腈；
质谱分析参数：喷雾电压2千伏，质谱采集范围350–1750m/z，分辨率为60000，使用数据相关的采集模式选择20种最强的前体用于随后的CID碎裂；用于碎裂的归一化碰撞能量设定为35％；动态排除设置：重复计数1，重复持续时间30秒，排除持续时间30秒；Orbitrap的目标离子设置为5e5，最大进样时间为250ms；LTQ获得MS/MS扫描，目标离子设置为3e4，最大进样时间为50ms。
10.如权利要求1所述的一种基于液质联用技术分析蛋白-多糖复合体消化率的方法，其特征在于，所述方法还包括：通过所述定量数值中显著增加或减少的肽段序列确定蛋白与多糖的结合位点。
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