CN108344816B - 一种基于仿生消化评价饲料玉米赤霉烯酮降解效率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了玉米赤霉烯酮降解技术领域的一种基于仿生消化评价饲料玉米赤霉烯酮降解效率的方法。该方法包括：饲料用仿生消化法进行消化；将降解玉米赤霉烯酮的微生物和相应的培养基加到上述消化后饲料中作为试验组，并设置对照组，于培养箱中培养；测定试验组和对照组中玉米赤霉烯酮的含量，计算其降解率。该方法符合动物实际的消化生理状态，能真实反映微生物对饲料中玉米赤霉烯酮的降解效率，是一种切实可行的体外评价微生物降解饲料中玉米赤霉烯酮效率的方法，操作简单、成本低、耗时短，可广泛应用于食品、粮食及农副产品中玉米赤霉烯酮的降解效果的评价。

Description

一种基于仿生消化评价饲料玉米赤霉烯酮降解效率的方法

技术领域

本发明属于玉米赤霉烯酮降解技术领域，具体涉及一种基于仿生消化评价饲料玉米赤霉烯酮降解效率的方法。

背景技术

霉菌毒素是真菌在生长过程中产生的有毒的次级代谢产物。目前己经报道的对人类和动物具有毒害作用的霉菌代谢产物大约有300多种，其中黄曲霉毒素、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素及烟曲霉毒素等是对畜牧业威胁最大的几种霉菌毒素。随着酒精工业及玉米深加工的快速发展，产生了大量的DDGS等玉米加工副产品，而玉米酒精发酵的过程在浓缩了3倍玉米营养成分的同时，霉菌毒素的浓度也得到了浓缩。故而，与玉米原料和全价饲料样品相比，DDGS中霉菌毒素的污染不但普遍，而且检出水平更高。中国农业大学动物营养学国家重点实验室长期致力于霉菌毒素生物降解的研究。筛选到一株可以高效降解黄曲霉毒素的枯草芽抱杆菌(Bacillus subtillis)(霉立解ANSB01G菌)，其发酵上清液对玉米赤霉烯酮(ZEA)的降解率可达到88％。用该株菌生产的霉菌毒素生物降解剂“霉立解”，经动物试验验证可有效缓解青年母猪玉米赤霉烯酮中毒症。

国内外研究者已报到多株降解玉米赤霉烯酮的微生物，但各菌株对毒素的降解效率高低有别，且大部分研究结果报道的是所筛选到的菌对玉米赤霉烯酮标准品的降级效果，而没有关于菌对发霉饲料中玉米赤霉烯酮的降解效果和评价方法。通过动物试验进行体内评价成本高、耗时长。如何进行快速有效的体外评价微生物对饲料及原料中玉米赤霉烯酮的降解效果是目前生产实际所迫切需求的。

发明内容

本发明为了解决上述技术问题，提出一种基于仿生消化评价饲料玉米赤霉烯酮降解效率的方法。具体技术方案如下：

一种基于仿生消化评价饲料玉米赤霉烯酮降解效率的方法，包括如下步骤：

(1)饲料用仿生消化法进行消化，并测定其干物质消化率；

(2)将降解玉米赤霉烯酮的微生物和相应的培养基加到上述消化后饲料中作为试验组，并以未加微生物和培养基的上述消化后饲料作为对照组，将试验组和对照组置于培养箱中进行降解培养；

(3)培养结束后，测定试验组和对照组中玉米赤霉烯酮的含量，计算玉米赤霉烯酮的降解率；

玉米赤霉烯酮的降解率＝[(对照组中玉米赤霉烯酮含量-试验组中玉米赤霉烯酮含量)/对照组中玉米赤霉烯酮含量×100％]/干物质消化率。

上述方法还包括：在步骤(1)之前，设置不同的肠道外源酶混悬液用于仿生消化法，测定用不同肠道外源酶混悬液的仿生消化法消化后的饲料的干物质消化率，通过最高干物质消化率，确定仿生消化法中使用的最优肠道外源酶混悬液。

上述方法中，所述仿生消化法的具体步骤为：

a)口腔模拟：将饲料加入缓冲溶液中，混合均匀，调节pH到6.8，然后加入淀粉酶溶液，得到口腔模拟体系，37℃-39℃，150r/min消化1-3h；

b)胃模拟：消化结束后，向上述消化后的口腔模拟体系中加入HCl溶液，混合均匀，并调节pH至2.0，然后加入酸性外源酶混悬液，得到胃模拟体系，37℃-39℃，150r/min消化4-9h；

c)小肠模拟：向消化后的胃模拟体系中加入NaOH溶液，并调节pH至6.8，然后加入肠道外源酶混悬液，得到肠道模拟体系，37℃-39℃，150r/min消化16-20h。

所述仿生消化法中饲料、缓冲溶液、淀粉酶溶液、HCl溶液、酸性外源酶混悬液、NaOH溶液、肠道外源酶混悬液的加入量比值为：2g：20-30mL：1-1.5mL：8-12mL：1-1.5mL：3-7mL：2-3mL。

所述缓冲溶液为0.1M、pH6.0的PBS缓冲溶液；所述HCl溶液为0.2M的HCl溶液；所述NaOH溶液为0.6M的NaOH溶液。

所述淀粉酶溶液浓度为4-10mg/mL；所述酸性外源酶混悬液浓度为15-30mg/mL；所述肠道外源酶混悬液包括蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、甘露聚糖酶和木聚糖酶；其中，蛋白酶:淀粉酶:脂肪酶的质量比＝(1～5):1:1，蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶三者的总浓度为5-15mg/mL；蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶三者的总质量与果胶酶、纤维素酶、甘露聚糖酶和木聚糖酶酶四者的总质量之比为(5-12):1。

进一步地：

所述淀粉酶溶液制备方法为：将淀粉酶溶于PBS(0.1M、pH6.8)缓冲溶液中，制备得到4-10mg/mL的淀粉酶溶液，其中淀粉酶的规格为30-50U/mg；

所述酸性外源酶混悬液的制备方法为：将酸性外源酶(优选的，为胃蛋白酶)溶于0.2M HCl溶液中，制备得到15-30mg/mL的酸性外源酶混悬液；优选，规格为30-70U/mg胃蛋白酶；

所述肠道外源酶混悬液的制备方法为：将蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶溶于PBS缓冲溶液中，总浓度为5-15mg/mL，其中，蛋白酶：淀粉：脂肪酶质量比为＝(1～5):1:1，将其他四种酶按比例溶液PBS缓冲溶液中，然后将两者混合。

其中，蛋白酶，优选中性蛋白酶，其中各种酶规格为：中性蛋白酶(100000U/g)、淀粉酶(≥7000U/g)、脂肪酶(100000U/g)、果胶酶(≥30000U/g)、纤维素酶(≥20000U/g)、甘露聚糖酶(≥50000U/g)、木聚糖酶(≥20000U/g)。

上述方法中，所述降解培养的条件为：37℃避光培养48h。

所述降解玉米赤霉烯酮的微生物为枯草芽孢杆菌，或由降解玉米赤霉烯酮的微生物生产制备的微生态制剂。优选的，所述微生物为枯草芽孢杆菌ANSB01G，其保藏号为CGMCCNo.4297。

所述试验组和对照组中玉米赤霉烯酮的含量采用免疫亲和柱-高效液相色谱法测定。

上述方法中，所述饲料干物质消化率测定方法为：

a)先将称量铝盒揭盖1/3放入烘箱内烘干至恒重(105℃，1h)，然后盖紧盒盖放入干燥器中冷却30min后称重；将饲料置于恒重的称量铝盒中，然后揭盖1/3放入100℃～105℃±2℃烘箱内烘干3～4h，盖紧盒盖移入干燥器中冷却30min，称重，为消化前干物质重；

b)饲料进行仿生消化结束之后，5000r/min离心20min，收集沉淀置于恒重的称量铝盒中，放入65℃烘干箱烘干12h，移到室外冷却3～4h回潮，然后置于105℃烘箱中烘4h，置于干燥器中冷却30min后称重，为消化后干物质重；

所述干物质消化率的计算公式为：干物质的消化率＝(消化前干物质重-消化后干物质重)/消化前干物质重×100％。

上述方法中，所述试验组和对照组中黄曲霉毒素的测定方法为：

培养结束后，烘干试验组和对照组体系中水分，然后按25g饲料计算，加入100mL的甲醇水溶液(v/v＝6:4)，然后高速搅拌提取3min，静置，过滤。取10mL滤液用40mL PBS缓冲液稀释滤液，使甲醇含量低于10％，然后过滤。免疫亲和柱接于10mL玻璃注射器筒下。去掉亲和柱下方堵头，排空亲和柱中保护液。加入10mL滤液于免疫亲和柱中，调节滤液以1mL/min左右流速通过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中。然后加入10％的甲醇水10mL于免疫亲和柱中冲洗2次，控制流速为3mL/min左右。弃去流出液。最后分两次各加入0.5mL甲醇，分别孵育2min，流速为1mL/min左右，收集洗脱液，洗脱液用于HPLC分析。

本发明的有益效果为：本发明基于仿生消化法评价微生物对霉变饲料中玉米赤霉烯酮的降解效率，在干物质消化率最高的条件下测定符合动物实际的消化生理状态，能真实反映微生物对饲料中玉米赤霉烯酮的降解效率，是一种切实可行的体外评价微生物降解饲料中玉米赤霉烯酮效率的方法，克服了通过动物试验进行体内评价成本高、耗时长的缺点。本发明方法可广泛应用于食品、粮食及农副产品中玉米赤霉烯酮的降解效果的评价。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1：仿生消化法

淀粉酶溶液的配制：将100mg规格40U/mg的淀粉酶溶于20mL PBS(pH6.8)中，终浓度为5mg/mL(200U/mL)。

酸性外源酶的配制：将规格50U/mg胃蛋白酶200mg溶于10mL 0.2M HCl中，所制成的混悬液的浓度为20mg/mL(1000U/mL)。

肠道外源酶混悬液的配制：分别按照蛋白酶:淀粉酶:脂肪酶质量比1:1:1，2:1:1或3:1:1制备三种肠道外源酶混悬液，三种酶总量为480mg，分别溶于30mLPBS缓冲溶液中；分别称取其他四种酶包括果胶酶(≥30 000U/g)、纤维素酶(≥20000U/g)、甘露聚糖酶(≥50 000U/g)、木聚糖酶(≥20 000U/g)，各酶量分别为10mg，溶于10mL PBS缓冲溶液中。将含有蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶的溶液和其他四种酶的溶液按体积1:1比例混合。现配现用，用前摇匀。

仿生消化法消化酒糟(DDGS)的具体步骤为：

口腔模拟：准确称取饲料2g，放入100mL锥形瓶中，加入25mL PBS(0.1MpH6.0)，调pH到6.8，混匀。加入1mL配制好的淀粉酶溶液，39℃、150r/min消化2h。

胃模拟：加10mL 0.2M HCl，用1M HCl或1M NaOH溶液调pH至2.0，加1mL新鲜配制的酸性外源酶混悬液，混匀，用parafilm封口，于39℃恒温摇床培养6h(150r/min)。

小肠模拟：再加入5mL 0.6M NaOH溶液，用1M HCl或1M NaOH将pH调到6.8后加入2mL新鲜配制的肠道外源酶混悬液，用parafilm封口，于39℃恒温摇床分别培养18h(150r/min)。

实施例2：干物质消化率测定方法

DDGS干物质消化率的测定方法具体操作为：

先将称量铝盒烘干至恒重(105℃，1h)，用坩埚钳取出放入干燥器中冷却30min后称重(称量铝盒放入烘箱时应开1/3盖，冷却和称重时应盖严)。取30g饲料与恒重的称量铝盒M1，将称量铝盒同样本一起放入100～105℃±2℃烘箱内，揭盖1/3，烘3～4h后，移入干燥器中，盖紧盒盖冷却30min。分别取烘干后的2g饲料于锥形瓶(消化前干物质重)，采用实施例1的仿生消化法进行消化。培养结束之后，5000r/min离心20min。收集沉淀并测定其干物质含量。取沉淀置于称量铝盒中，放入烘干箱(65℃)烘干12h，用坩埚钳移到室外冷却3～4h回潮，然后置于105℃烘箱中烘4h，置于干燥器中冷却30min后称重，为消化后干物质重。

干物质消化率的计算公式为：

干物质的消化率＝(消化前干物质重-消化后干物质重)/消化前干物质重×100％

肠道外源酶混悬液中蛋白酶:淀粉酶:脂肪酶＝1:1:1、2:1:1和3:1:1(质量比)的条件下对DDGS进行仿生消化，其干物质消化率结果如表1。

表1 DDGS干物质消化率测定结果

试验结果显示，肠道外源酶混悬液中蛋白酶:淀粉酶:脂肪酶＝3:1:1时，DDGS干物质消化率最高，为39.07％，仿生消化系统建立。

实施例3：解淀粉芽孢杆菌ANSB01G对DDGS中玉米赤霉烯酮的降解

当肠道外源酶混悬液中性蛋白酶:淀粉酶:脂肪酶＝3:1:1时，干物质消化率最高，为39.07％。DDGS在此仿生消化系统中被消化后，将降解玉米赤霉烯酮(ZEA)的解淀粉芽孢杆菌ANSB01G(解淀粉芽孢杆菌ANSB01G的保藏号为CGMCCNo.4297，在CN102181376A中公开)和相应的LB培养基加到消化后的DDGS中作为试验组，并以未加解淀粉芽孢杆菌ANSB01G和相应的LB培养基的上述消化后DDGS作为对照组，将试验组和对照组置于37℃培养箱中避光培养48h。培养结束后，试验组和对照组样品置于烘箱中将水分烘干至接近饲料正常含水量，采用免疫亲和柱-高效液相色谱法测定试验组和对照组中玉米赤霉烯酮的含量。

玉米赤霉烯酮的含量测定的具体操作为：

按25g饲料或饲料原料样品，加入100mL的甲醇水溶液(v/v,6:4)，然后高速搅拌提取3min，静置，过滤。取10mL滤液用40mL PBS缓冲液稀释滤液，使甲醇含量低于10％，然后过滤。免疫亲和柱接于10mL玻璃注射器筒下。去掉亲和柱下方堵头，排空亲和柱中保护液。加入10mL滤液于免疫亲和柱中，调节滤液以1mL/min左右流速通过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中。然后加入10％的甲醇水10mL于免疫亲和柱中冲洗2次，控制流速为3mL/min左右。弃去流出液。最后分两次各加入0.5mL甲醇，分别孵育2min，流速为1mL/min左右，收集洗脱液，洗脱液用于HPLC分析，其中试验组和对照组中ZEA含量如表2。

ZEA的降解率＝[(对照组中ZEA含量-试验组中ZEA含量)/对照组中ZEA含量×100％]/干物质消化率(39.07％)

通过本发明的仿生消化法评价解淀粉芽孢杆菌ANSB01G对DDGS中ZEA的降解率为84.30％。

表2解淀粉芽孢杆菌ANSB01G对玉米赤霉烯酮的降解率

Claims (7)

1.一种基于仿生消化评价饲料玉米赤霉烯酮降解效率的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)饲料用仿生消化法进行消化，并测定其干物质消化率；所述玉米赤霉烯酮为发霉饲料产生；

(2)将降解玉米赤霉烯酮的微生物和相应的培养基加到上述消化后饲料中作为试验组，并以未加微生物和培养基的上述消化后饲料作为对照组，将试验组和对照组置于培养箱中进行降解培养；

(3)培养结束后，测定试验组和对照组中玉米赤霉烯酮的含量，计算玉米赤霉烯酮的降解率；

玉米赤霉烯酮的降解率＝[(对照组中玉米赤霉烯酮含量-试验组中玉米赤霉烯酮含量)/对照组中玉米赤霉烯酮含量×100％]/干物质消化率；

所述仿生消化法的具体步骤为：

a)口腔模拟：将饲料加入缓冲溶液中，混合均匀，调节pH到6.8，然后加入淀粉酶溶液，得到口腔模拟体系，37℃-39℃，150r/min消化1-3h；

b)胃模拟：消化结束后，向上述消化后的口腔模拟体系中加入HCl溶液，混合均匀，并调节pH至2.0，然后加入酸性外源酶混悬液，得到胃模拟体系，37℃-39℃，150r/min消化4-9h；

c)小肠模拟：向消化后的胃模拟体系中加入NaOH溶液，并调节pH至6.8，然后加入肠道外源酶混悬液，得到肠道模拟体系，37℃-39℃，150r/min消化16-20h。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述仿生消化法中饲料、缓冲溶液、淀粉酶溶液、HCl溶液、酸性外源酶混悬液、NaOH溶液、肠道外源酶混悬液的加入量比值为：2g：20-30mL：1-1.5mL：8-12mL：1-1.5mL：3-7mL：2-3mL。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述缓冲溶液为0.1M、pH6.0的PBS缓冲溶液；所述HCl溶液为0.2M的HCl溶液；所述NaOH溶液为0.6M的NaOH溶液。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述淀粉酶溶液浓度为4-10mg/mL；所述酸性外源酶混悬液浓度为15-30mg/mL；所述肠道外源酶混悬液包括蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、甘露聚糖酶和木聚糖酶；其中，蛋白酶:淀粉酶:脂肪酶的质量比＝(1～5):1:1，蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶三者的总浓度为5-15mg/mL；蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶三者的总质量与果胶酶、纤维素酶、甘露聚糖酶和木聚糖酶酶四者的总质量之比为(5-12):1。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述降解培养的条件为：37℃避光培养48h。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述降解玉米赤霉烯酮的微生物为枯草芽孢杆菌。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述试验组和对照组中玉米赤霉烯酮的含量采用免疫亲和柱-高效液相色谱法测定。