CN108344661B - 一种评价微生物降解饲料黄曲霉毒素效率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了黄曲霉毒素降解技术领域的一种评价微生物降解饲料黄曲霉毒素效率的方法。该方法包括：饲料用仿生消化法进行消化；将降解黄曲霉毒素的微生物和相应的培养基加到上述消化后饲料中作为试验组，并以未加微生物和培养基的作为对照组，于培养箱中进行降解培养；测定试验组和对照组中黄曲霉毒素的含量；计算黄曲霉毒素的降解率。该方法符合动物实际的消化生理状态，能真实反映微生物对饲料中黄曲霉毒素的降解效率，是一种切实可行的体外评价微生物降解饲料中黄曲霉毒素效率的方法，操作简单、成本低、耗时短，可广泛应用于食品、粮食及农副产品中黄曲霉毒素的降解效果的评价。
Description
技术领域
本发明属于黄曲霉毒素降解技术领域，具体涉及一种评价微生物降解饲料黄曲霉毒素效率的方法。
背景技术
黄曲霉毒素是一种致癌、致畸、致突变的剧毒物质，黄曲霉菌侵染花生饲料而引起的花生黄曲霉毒素含量超标事件在世界各地均广泛存在，在国际贸易中黄曲霉毒素含量是关键的卫生安全指标，而且这一指标越来越严格。开展黄曲霉毒素降解技术研究对于减少黄曲霉毒素污染、保障农产品质量与食物安全有重要意义。目前关于黄曲霉毒素去毒方法的研究有很多。理想的去毒方法是微生物降解法，该方法去毒效率高，毒素被破坏或转化为无毒产物，价格低廉、易于实施，且不影响食品感官和理化品质。国内外研究者已报到多株降解黄曲霉毒素的微生物，但各菌株对毒素的降解效率高低有别，且大部分研究结果报道的是所筛选到的菌对黄曲霉毒素标准品的降级效果，而没有关于菌对发霉饲料中黄曲霉毒素的降解效果和评价方法。
通过动物试验进行体内评价成本高、耗时长。如何快速有效的体外评价微生物对饲料及原料中黄曲霉毒素的降解效果是目前生产实际所迫切需求的。
发明内容
本发明为了解决上述技术问题，提出一种评价微生物降解饲料黄曲霉毒素效率的方法。具体技术方案如下：
一种评价微生物降解饲料黄曲霉毒素效率的方法，包括如下步骤：
(1)饲料用仿生消化法进行消化，并测定其干物质消化率；
(2)将降解黄曲霉毒素的微生物和相应的培养基加到上述消化后饲料中作为试验组，并以未加微生物和培养基的上述消化后饲料作为对照组，将试验组和对照组置于培养箱中进行降解培养；
(3)培养结束后，测定试验组和对照组中黄曲霉毒素的含量；
(4)计算黄曲霉毒素的降解率；
黄曲霉毒素的降解率＝[(对照组中黄曲霉毒素含量-试验组中黄曲霉毒素含量)/对照组中黄曲霉毒素含量×100％]/干物质消化率。
上述方法还包括：在步骤(1)之前，设置不同的肠道外源酶混悬液用于仿生消化法，测定用不同肠道外源酶混悬液的仿生消化法消化后的饲料的干物质消化率，通过最高干物质消化率，确定仿生消化法中使用的最优肠道外源酶混悬液。
上述方法中，所述仿生消化法的具体步骤为：
a)口腔模拟：将饲料加入缓冲溶液中，混合均匀，调节pH到6.8，然后加入淀粉酶溶液，得到口腔模拟体系，37℃-39℃，150r/min消化1-3h；
b)胃模拟：消化结束后，向上述消化后的口腔模拟体系中加入HCl溶液，混合均匀，并调节pH至2.0，然后加入酸性外源酶混悬液，得到胃模拟体系，37℃-39℃，150r/min消化4-9h；
c)小肠模拟：向消化后的胃模拟体系中加入NaOH溶液，并调节pH至6.8，然后加入肠道外源酶混悬液，得到肠道模拟体系，37℃-39℃，150r/min消化16-20h。
上述仿生消化法中饲料、缓冲溶液、淀粉酶溶液、HCl溶液、酸性外源酶混悬液、NaOH溶液、肠道外源酶混悬液的加入量比值为：2g：20-30mL：1-1.5mL：8-12mL：1-1.5mL：3-7mL：2-3mL。
所述缓冲溶液为0.1M、pH6.0的PBS缓冲溶液；所述HCl溶液为0.2M的HCl溶液；所述NaOH溶液为0.6M的NaOH溶液。
所述淀粉酶溶液浓度为4-10mg/mL；所述酸性外源酶混悬液浓度为10-25mg/mL；所述肠道外源酶混悬液包括蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、甘露聚糖酶和木聚糖酶；其中，蛋白酶:淀粉酶:脂肪酶的质量比＝(1～4):1:1，蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶三者的总浓度为8-15mg/mL；蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶三者的总质量与果胶酶、纤维素酶、甘露聚糖酶和木聚糖酶酶四者的总质量之比为(5-15):1。
进一步地：
所述淀粉酶溶液制备方法为：将淀粉酶溶于PBS(0.1M、pH6.8)缓冲溶液中，制备得到4-8mg/mL的淀粉酶溶液，其中淀粉酶的规格为30-50U/mg；
所述酸性外源酶混悬液的制备方法为：将酸性外源酶(优选的，为胃蛋白酶)溶于0.2M HCl溶液中，制备得到15-25mg/mL的酸性外源酶混悬液；优选，规格为30-70U/mg胃蛋白酶；
所述肠道外源酶混悬液的制备方法为：将蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶溶于PBS缓冲溶液中，总浓度为5-10mg/mL，其中，蛋白酶：淀粉：脂肪酶质量比为＝(1～3):1:1，将其他四种酶按比例溶液PBS缓冲溶液中，然后将两者混合。
其中，蛋白酶，优选中性蛋白酶，其中各种酶规格为：中性蛋白酶(100000U/g)、淀粉酶(≥7000U/g)、脂肪酶(100000U/g)、果胶酶(≥30000U/g)、纤维素酶(≥20000U/g)、甘露聚糖酶(≥50000U/g)、木聚糖酶(≥20000U/g)。
上述方法中，所述降解培养的条件为：37℃避光培养48h。
上述方法中，所述降解黄曲霉毒素的微生物为枯草芽孢杆菌，或由降解黄曲霉毒素的微生物生产制备的微生态制剂。优选的，所述微生物为枯草芽孢杆菌ANSB060，其保藏号为CGMCC No.3440。
所述试验组和对照组中黄曲霉毒素的含量采用免疫亲和柱-高效液相色谱法测定。
上述方法中，所述饲料干物质消化率测定方法为：
a)先将称量铝盒揭盖1/3放入烘箱内烘干至恒重(105℃，1h)，然后盖紧盒盖放入干燥器中冷却30min后称重；将饲料置于恒重的称量铝盒中，然后揭盖1/3放入100℃～105℃±2℃烘箱内烘干3～4h，盖紧盒盖移入干燥器中冷却30min，称重，为消化前干物质重；
b)饲料进行仿生消化结束之后，5000r/min离心20min，收集沉淀置于恒重的称量铝盒中，放入65℃烘干箱烘干12h，移到室外冷却3～4h回潮，然后置于105℃烘箱中烘4h，置于干燥器中冷却30min后称重，为消化后干物质重；
所述干物质消化率的计算公式为：干物质的消化率＝(消化前干物质重-消化后干物质重)/消化前干物质重×100％。
上述方法中，所述试验组和对照组中黄曲霉毒素的测定方法为：
培养结束后，烘干试验组和对照组体系中水分，然后按25g饲料计算，加入100mL的甲醇水溶液(v/v＝6:4)，然后高速搅拌提取3min，静置，过滤。取10mL滤液用40mL PBS缓冲液稀释滤液，使甲醇含量低于10％，然后过滤。免疫亲和柱接于10mL玻璃注射器筒下。去掉亲和柱下方堵头，排空亲和柱中保护液。加入10mL滤液于免疫亲和柱中，调节滤液以1mL/min左右流速通过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中。然后加入10％的甲醇水10mL于免疫亲和柱中冲洗2次，控制流速为3mL/min左右。弃去流出液。最后分两次各加入0.5mL甲醇，分别孵育2min，流速为1mL/min左右，收集洗脱液，洗脱液用于HPLC分析。
本发明的有益效果为：本发明评价微生物对霉变饲料中黄曲霉毒素降解效率的方法基于仿生消化法，在干物质消化率最高的条件下测定符合动物实际的消化生理状态，能真实反映微生物对饲料中黄曲霉毒素的降解效率，是一种切实可行的体外评价微生物降解饲料中黄曲霉毒素效率的方法，操作简单、成本低、耗时短。本发明方法可广泛应用于食品、粮食及农副产品中黄曲霉毒素的降解效果的评价。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1：评价微生物对霉变花生粕中黄曲霉毒素AFB1降解效率的方法
(1)霉变花生粕用仿生消化法进行消化，并测定干物质消化率；
仿生消化法的具体步骤为：
口腔模拟：准确称取霉变花生粕2g，放入100mL锥形瓶中，加入25mL PBS(0.1MpH6.0)缓冲液，混匀，并调pH到6.8。加入1mL配制好的淀粉酶溶液，39℃、150r/min消化2h。
淀粉酶溶液的配制：将100mg规格40U/mg的淀粉酶溶于20mL PBS(pH6.8)中，终浓度为5mg/mL(200U/mL)。
胃模拟：向上述锥形瓶中加10mL 0.2M HCl，用1M HCl或1M NaOH溶液调pH至2.0，加1mL新鲜配制的酸性外源酶混悬液，混匀，用parafilm封口，于39℃恒温摇床培养6h(150r/min)。
酸性外源酶的配制：将规格50U/mg胃蛋白酶200mg溶于10mL 0.2M HCl中，所制成的混悬液的浓度为20mg/mL(1000U/mL)。
小肠模拟：再加入5mL 0.6M NaOH溶液，用1M HCl或1M NaOH将pH调到6.8，然后加入2mL新鲜配制的肠道外源酶混悬液，用parafilm封口，于39℃恒温摇床培养18h(150r/min)。
肠道外源酶混悬液的配制：分别按照蛋白酶:淀粉酶:脂肪酶质量比1:1:1，2:1:1，3:1:1或4:1:1制备三种肠道外源酶混悬液，三种酶总量为480mg，分别溶于30Ml PBS缓冲溶液中；分别称取其他四种酶包括果胶酶(≥30 000U/g)、纤维素酶(≥20 000U/g)、甘露聚糖酶(≥50 000U/g)、木聚糖酶(≥20 000U/g)，各酶量分别为10mg，溶于10Ml PBS缓冲溶液中。将含有蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶的溶液和其他四种酶的溶液按体积1:1比例混合。现配现用，用前摇匀。
干物质消化率的测定方法为：先将称量铝盒烘干至恒重(105℃，1h)，用坩埚钳取出放入干燥器中冷却30min后称重(称量铝盒放入烘箱时应开1/3盖，冷却和称重时应盖严)。取30g霉变花生粕装入恒重的称量铝盒中，然后一起放入100℃～105℃(±2℃)烘箱内，揭盖1/3，烘3～4h后，移入干燥器中，盖紧盒盖冷却30min。取烘干后的2g霉变花生粕于锥形瓶(消化前干物质重)，仿生消化法进行消化。结束之后，5000r/min离心20min，收集沉淀置于恒重的称量铝盒中，放入烘干箱(65℃)烘干12h，用坩埚钳移到室外冷却3～4h回潮，然后置于105℃烘箱中烘4h，置于干燥器中冷却30min后称重，为消化后干物质重。
干物质消化率的计算公式为：
干物质消化率＝(消化前干物质重-消化后干物质重)/消化前干物质重×100％
肠道外源酶混悬液中蛋白酶:淀粉酶:脂肪酶＝1:1:1、2:1:1和3:1:1(质量比)的条件下对霉变花生粕进行仿生消化，其干物质消化率结果如表1。
表1霉变花生粕干物质消化率测定结果
肠道外源酶混悬液中的蛋白酶:淀粉酶:脂肪酶＝3:1:1(质量比)时，霉变花生粕的干物质消化率最高，为53.03％。确定蛋白酶:淀粉酶:脂肪酶质量比为3:1:1的肠道外源酶混悬液来建立仿生消化系统。
(2)当肠道外源酶混悬液中蛋白酶:淀粉酶:脂肪酶质量比为3:1:1时，对霉变花生粕进行仿生消化，将降解AFB1的枯草芽孢杆菌ANSB060(枯草芽孢杆菌ANSB060的保藏号为CGMCC No.3440，在CN 101822321A中公开)和相应的培养基加到消化后霉变花生粕中作为试验组，并以未加枯草芽孢杆菌ANSB060和培养基的上述消化后霉变花生粕作为对照组，将试验组和对照组置于37℃培养箱中避光培养48h。
相应的培养基配方为：蛋白胨7g、葡萄糖6、磷酸氢二钾0.1g、磷酸二氢钾1.0g、一水硫酸锰1.0、七水硫酸镁1.0g、蒸馏水1000mL，pH值为6.5-7.5。
(3)培养结束后，采用免疫亲和柱-高效液相色谱法测定试验组和对照组中AFB1的含量。
培养结束后，烘干试验组和对照组体系中水分，按25g饲料或饲料原料样品，加入100mL的甲醇水溶液(v/v＝6:4)，然后高速搅拌提取3min，静置，过滤。取10mL滤液用40mLPBS缓冲液稀释滤液，使甲醇含量低于10％，然后过滤。免疫亲和柱接于10mL玻璃注射器筒下。去掉亲和柱下方堵头，排空亲和柱中保护液。加入10mL滤液于免疫亲和柱中，调节滤液以1mL/min左右流速通过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中。然后加入10％的甲醇水10mL于免疫亲和柱中冲洗2次，控制流速为3mL/min左右。弃去流出液。最后分两次各加入0.5mL甲醇，分别孵育2min，流速为1mL/min左右，收集洗脱液，洗脱液用于HPLC分析，其中试验组和对照组中AFB1含量如表2。
计算枯草芽孢杆菌ANSB060对霉变花生粕中AFB1的降解率：
AFB1的降解率＝[(对照组中AFB1含量-试验组中AFB1含量)/对照组中AFB1含量×100％]/干物质消化率(53.03％)
通过本发明的仿生消化法评价枯草芽孢杆菌ANSB060对霉变花生粕中AFB1的降解率为90.50％。
表2枯草芽孢杆菌ANSB060对黄曲霉毒素的降解率
Claims (5)
1.一种评价微生物降解饲料黄曲霉毒素效率的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）霉变饲料用仿生消化法进行消化，并测定其干物质消化率；
（2）将降解黄曲霉毒素的微生物和相应的培养基加到上述消化后饲料中作为试验组，并以未加微生物和培养基的上述消化后饲料作为对照组，将试验组和对照组置于培养箱中进行降解培养；
（3）培养结束后，测定试验组和对照组中黄曲霉毒素的含量，计算黄曲霉毒素的降解率；
黄曲霉毒素的降解率=[（对照组中黄曲霉毒素含量-试验组中黄曲霉毒素含量）/对照组中黄曲霉毒素含量×100%]/干物质消化率；
所述方法还包括：在步骤（1）之前，设置不同的肠道外源酶混悬液用于仿生消化法，测定用不同肠道外源酶混悬液的仿生消化法消化后的饲料的干物质消化率，通过最高干物质消化率，确定仿生消化法中使用的最优肠道外源酶混悬液；
所述仿生消化法的具体步骤为：
a）口腔模拟：将饲料加入缓冲溶液中，混合均匀，调节pH到6.8，然后加入淀粉酶溶液，得到口腔模拟体系，37℃-39℃，150r/min消化1-3h；
b）胃模拟：消化结束后，向上述消化后的口腔模拟体系中加入HCl溶液，混合均匀，并调节pH至2.0，然后加入酸性外源酶混悬液，得到胃模拟体系，37℃-39℃，150r/min消化4-9h；
c）小肠模拟：向消化后的胃模拟体系中加入NaOH溶液，并调节pH至6.8，然后加入肠道外源酶混悬液，得到肠道模拟体系，37℃-39℃，150r/min消化16-20h；
所述降解黄曲霉毒素的微生物为枯草芽孢杆菌，或由降解黄曲霉毒素的微生物生产制备的微生态制剂；
所述仿生消化法中饲料、缓冲溶液、淀粉酶溶液、HCl溶液、酸性外源酶混悬液、NaOH溶液、肠道外源酶混悬液的加入量比值为：2g：20-30mL：1-1.5mL：8-12mL：1-1.5mL：3-7mL：2-3mL。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述缓冲溶液为0.1 M、pH6.0的PBS缓冲溶液；所述HCl溶液为0.2 M的HCl溶液；所述NaOH溶液为0.6 M的NaOH溶液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述淀粉酶溶液浓度为4-10mg/mL；所述酸性外源酶混悬液浓度为10-25mg/mL；所述肠道外源酶混悬液包括蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、甘露聚糖酶和木聚糖酶；其中，蛋白酶:淀粉酶:脂肪酶的质量比=（1~4）:1:1，蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶三者的总浓度为8-15mg/mL；蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶三者的总质量与果胶酶、纤维素酶、甘露聚糖酶和木聚糖酶四者的总质量之比为（5-15）:1。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述降解培养的条件为：37℃避光培养48h 。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述试验组和对照组中黄曲霉毒素的含量采用免疫亲和柱-高效液相色谱法测定。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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