CN101492664B - 酸性蛋白酶 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种酸性蛋白酶，所述酸性蛋白酶能在酸性条件下水解蛋白质，具有特定的物理化学特性，其水解率高。

Description

酸性蛋白酶

技术领域

本发明涉及一种酸性蛋白酶，特别涉及一种水解效率高的酸性蛋白酶。

背景技术

大豆中含有40％的蛋白质，它可以提供动物所需要的8种必需氨基酸、多种维生素和矿物质。大豆蛋白资源十分丰富，原料成本低廉，具有乳化性、起泡性等功能特性。但同时，大豆蛋白含有一些引起过敏反应的抗原物质——致敏因子，大豆蛋白引起过敏反应的主要抗原成分为大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白。解决的主要方法就是将其酶解，大豆蛋白经水解后其酶解物比氨基酸和蛋白质更易于消化吸收，还能改变其溶解性、降低粘度。

水解大豆蛋白的方法有3种，酸法、碱法和酶法。酸碱法是用酸、碱等化学试剂在一定温度下促使蛋白质分子的肽链断裂形成小分子物质。但由于碱法水解使氨基酸大多消旋，无生物利用价值，因此不宜采用；而酸法多采用盐酸、硫酸等强酸在高温下反应，反应强烈，设备腐蚀严重，水解彻底，多生成氨基酸混合物，同时在高温下色氨酸完全被破坏，目前渐被淘汰。酶法水解大豆蛋白的研究，最初是始于利用酶部分降解蛋白质，增加其分子内或分子间交联或连接特殊功能基团，改变蛋白质的功能性质，以获得良好加工特性的研究。到了80年代，随着酶制剂工业和食品工业的迅猛发展，人们逐渐发现，利用酶法改性，不仅反应条件温和，安全可靠，产品色浅，而且水解产物在营养、风味、工艺等方面均优于酸、碱水解法，因而人们的注意力集中在蛋白水解产物多肽上。酶法选择性较强，但水解率偏低。

因此，需要发明一种新的酸性蛋白酶以解决上述问题。

发明内容

本发明的主要目的之一在于基于现有技术的不足而提供一种水解率高的酸性蛋白酶。

本发明提供一种酸性蛋白酶，能在酸性条件下水解蛋白质，其特征在于，所述酸性蛋白酶具有以下物理化学特性：

a)所述的酸性蛋白酶通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳确定的估测分子量为33kDa；

b)所述的酸性蛋白酶的N端序列为GTGTVPVTDV；

c)所述的酸性蛋白酶最适作用温度为50℃；所述的酸性蛋白酶在温度低于45℃时有很好的热稳定性；

d)所述的酸性蛋白酶最适作用pH为pH5.5，在pH4.0～7.0能保持很好的稳定性；

e)胃蛋白酶抑制剂(Pepstatin A)对所述的酸性蛋白酶有非常显著的抑制作用，所述的酸性蛋白酶属于天冬氨酸蛋白酶家族；

f)所述的酸性蛋白酶在胰岛素B链上拥有强弱不等的12个酶切位点；

g)所述的酸性蛋白酶由雅致放射毛霉AS3.2778分离提纯得到。

毛霉是我国传统豆类发酵食品的主要生产菌种之一，有着悠久的应用历史。由于长期受到环境条件(高蛋白培养基)的驯化，毛霉具有分泌多种胞外蛋白酶的能力；而且，其胞外蛋白酶系对大豆蛋白有相对较强的适应性，显示出很强的水解能力；其水解大豆蛋白得到的产物主要以小肽为主，有很高的水解度，且不会产生苦味。本发明的酸性蛋白酶(命名为Pa2)能够解决大豆蛋白水解中的主要技术难题，水解效率高，水解产物没有强烈的苦味。

作为本发明的优选实施方式，所述的酸性蛋白酶对三种底物的水解活性为酪蛋白(Casein)＞大豆分离蛋白(soy protein isolated，SPI)＞牛血清白蛋白(BSA)。

作为本发明的优选实施方式，所述的酸性蛋白酶米氏常数Km为2.126g/L，活化能Ea为42.31kJ。

本发明以雅致放射毛霉AS3.2778为对象，采用了多种层析操作相结合的方法，包括离子交换、疏水层析等，从蛋白质性质的不同角度对毛霉酸性蛋白酶组分进行纯化，通过这些手段得到电泳纯的酸性蛋白酶Pa2，然后检测该酶的酶学参数、水解蛋白的酶切位点、N端序列鉴定，及其对大豆蛋白的水解效率等，为其蛋白水解的应用提供具体参数。

附图说明

图1为盐析沉淀的电泳分析图，泳道1为蛋白质marker，泳道2为80S蛋白沉淀，泳道3为75S蛋白沉淀，泳道4为70S蛋白沉淀，泳道5为65S蛋白沉淀，泳道6为60S蛋白沉淀，泳道7为50S蛋白沉淀，泳道8为45S蛋白沉淀，泳道9为40S蛋白沉淀，泳道10为35S蛋白沉淀；

图2为酸性组分Pa2 CM-Sepharose离子交换洗脱曲线图，左起第三个峰为Pa2活性峰；

图3为酸性组分Pa2 Phenyl-Sepharose疏水层析洗脱曲线图，左起第二个峰为Pa2活性峰；

图4为酸性蛋白酶Pa2的电泳分析图，泳道1为蛋白marker，泳道2为盐析后酶液，泳道4为CM-Sepharose收集样，泳道6为Phenyl-Sepharose收集样。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。

实施例1毛酶的发酵及粗酶的提取

1.1菌种

雅致放射毛霉AS3.2778，购于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

1.2种子培养基及种子活化

250ml三角瓶中加入麸皮10g，水10ml，用玻棒搅拌混合均匀，并捣散较大的团块(尽量做到颗粒均一)。121℃灭菌30min，乘热取出后摇散，冷却后备用。

灭菌好的种子培养基每瓶接种一环试管斜面孢子，混合均匀，并尽量使培养基表面平整，培养基层厚度一致，然后置于28℃生化培养箱中培养3天。

1.3孢子悬浮液制备

在无菌条件下，向活化好的三角瓶种子加入100ml无菌水，振荡，洗脱培养基表面的孢子，得到孢子悬浮液。

1.4固体发酵

灭菌好的发酵培养基接种1ml孢子悬浮液，混和均匀后于设定的条件下培养。发酵培养基及条件：每只250ml三角瓶装8g麸皮，其中添加1.23％麦芽糖，1.56％蛋白胨，0.74％KH₂PO₄，0.06％FeSO₄·7H₂O作为辅助营养物，培养基的起始含水量为每克麸皮添加0.79ml水，发酵温度24.1℃，时间48h。

1.5粗酶的提取

称取一定量的干麸曲加入10倍重量的0.3M氯化钠溶液，混匀后于40℃水浴中抽提1.5h，纱布过滤后在7000g/min，4℃离心10min，取上清即得到粗酶液。

盐析结果表明目标蛋白(即酶蛋白)主要是在45S～80S这一区间析出，毛霉内肽酶的电泳条带主要位于32kDa与35kDa之间的主蛋白条带(电泳图见附图1)。

1.6蛋白酶活性测定

采用改良Anson法。1ml稀释酶液与2ml 1.5％酪蛋白(溶于0.02M，pH7.0PBS)混和后在40℃反应10min，加入5ml 10％的三氯乙酸终止反应，静置15min后过滤，取滤液测定280nm吸光度。

酶活单位定义：在测定条件下，水解酪蛋白产生的吸光度变化量与1μg酪氨酸相当时所需要的酶量为一个活力单位。

实施例2酸性蛋白酶的分离纯化

2.1硫酸铵分段盐析

取一定体积的粗酶液，在冰水浴上缓慢加入固体硫酸铵到40％饱和度，充分溶解后在4℃冰箱中静置3h，于4℃，12000g/min离心20min，取上清液继续加入固体硫酸铵至85％饱和度，4℃冰箱中静置过夜，然后于4℃，12000g/min离心20min，蛋白沉淀用0.02M，pH7.5的Tris-HCl缓冲液溶解，并透析脱盐。

2.2 CM-Sepharose阳离子交换

用0.05M，pH5.0醋酸缓冲液平衡CM-Sepharose阳离子交换柱，取上一步收集的浓缩酶液加样阳离子交换柱。用平衡缓冲液充分洗柱后，用0.5M的NaCl溶液(溶于0.05M，pH5.0醋酸缓冲液)进行梯度洗脱。收集第一个洗脱峰(即目标蛋白峰)，用超滤离心管浓缩收集的酶液。

2.3 Phenyl-Sepharose疏水层析

用1.2M硫酸铵溶液(溶于0.05M，pH5.0的PBS缓冲液)平衡Phenyl-Sepharose疏水层析柱。将上一步收集的浓缩酶液与2.4M硫酸铵溶液(溶于0.1M，pH5.0的PBS缓冲液)等体积混和后加样Phenyl-Sepharose疏水层析柱，用平衡缓冲液充分冲洗疏水柱，然后进行梯度洗脱。收集梯度洗脱的第二个蛋白峰，即为目标蛋白峰。用超滤离心管浓缩收集的酶液。

毛霉粗酶液经过多次层析纯化，得到了一株酸性蛋白酶Pa2，酸性蛋白酶的层析过程及纯化倍数见表1，层析洗脱曲线图详见附图2～4。

表1毛霉酸性内肽酶组分Pa2的纯化步骤

2.4聚丙烯酰胺凝胶电泳

利用SDS-PAGE检测纯化后的蛋白酶纯度，并初步确定目标蛋白的分子量范围。采用14％分离胶，5％浓缩胶。

通过一系列的层析使得目标蛋白纯度达到了电泳纯。电泳的结果显示(见附图2)，Pa2分子量约为33kDa。

2.5酸性蛋白酶N端序列测定

纯化后的样品Pa2以溶液的形式送上海基康生物技术有限公司，经电泳及转膜后对目标蛋白条带进行N端测序分析。

测序的实验结果显示，毛霉酸性内肽酶组分Pa2的N端序列为GTGTVPVTDV。

2.6串联质谱分析

纯化的蛋白酶样品Pa2进行SDS-PAGE电泳分析，经考马斯亮蓝染色后，分别从胶片上切取对应的目标蛋白条带，置于1.5mlEP管中，送香港大学基因研究中心做串联质谱分析。

与其它天冬氨酸蛋白酶的比较，雅致放射毛霉AS3.2778的酸性蛋白酶Pa2与同属的Rhizopus niveus(得氏根霉)，M.105，Rhizopus microsporus var.chinensis(小孢根霉)有很高的N端同源性；但是与Rhizomucor miehei(米黑根霉)，Rhizomucor pusillus(微小根毛霉)及来源于其它真菌，如P.janthinellum(微紫青霉菌)，Aspergillus fumigatus(烟曲霉)，Aspergillus Oryzae(米曲霉)，Aspergillus niger(黑曲霉)的天冬氨酸蛋白酶的N端序列有非常大的差异。

对串联质谱谱图分析发现，在现有数据库中找不到与Pa2具有较高同源性的蛋白(显著性指标C.I.％值均极低)，这进一步说明Pa2是未曾报道的新蛋白酶。

实施例3毛霉酸性蛋白酶Pa2催化性质的测定

3.1酸性蛋白酶的最适作用温度

按照酶活测定方法分别于不同的温度(30～70℃范围)下测定毛霉酸性蛋白酶的活性，考察温度对毛霉酸性蛋白酶活性的影响。根据实验结果绘制温度-活力曲线，并由此确定毛霉酸性蛋白酶的最适作用温度。

3.2毛霉酸性蛋白酶的最适作用pH

按照酶活测定方法分别于不同pH缓冲条件下(pH 3.0～5.0，0.05M乙酸缓冲盐；pH6.0-7.0，0.05M磷酸缓冲盐；pH 8.0-9.0，0.02M Tris-HCl；pH 9.5-10.5，0.02M glycine-NaOH)测定毛霉酸性蛋白酶的活性，考察pH对毛霉酸性蛋白酶活性的影响。根据实验结果绘制pH-活力曲线，并由此确定毛霉酸性蛋白酶的最适作用pH范围。

3.3毛霉酸性蛋白酶的热稳定性

在酸性蛋白酶的稳定pH条件下，将酶液分别于不同温度(30～70℃范围)下保温30min，测定保温前后酸性蛋白酶活性的变化，考察温度对酸性蛋白酶稳定性的影响。以酶活残留率对温度作图，绘制酸性蛋白酶的热失活曲线。

毛霉酸性内肽酶Pa2最适作用温度相对偏低，在55℃；在温度低于45℃时有很好的热稳定性，保温30min几乎没有活性损失，当温度高于50℃时会缓慢的失活，55℃保温30min，Pa2活性损失达90％以上。综合来看，毛霉酸性内肽酶Pa2的使用温度不宜高于50℃。

3.4 pH对酸性蛋白酶稳定性的影响

用不同的缓冲液分别调节酶液的pH到pH3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，于室温(25℃)放置约1h，然后酸性蛋白酶组分的最适作用pH测定酸性蛋白酶活性，计算酶活残留率。以酶活残留率对pH作图，绘制酸性蛋白酶的pH稳定性曲线。

酸性蛋白酶Pa2最适作用pH在pH5.5。稳定性实验结果显示，毛霉酸性内肽酶在弱酸性的环境(pH4.0～7.0)能保持很好的稳定性，在室温中放置1h活性无明显损失；但是，该内肽酶在弱碱性的环境中极不稳定，会迅速的变性失活，例如，在pH8.0室温中放置仅1h，其酶活损失高达70％左右。另外，毛霉酸性内肽酶在碱性条件下的变性失活速度随着pH的升高呈现不断加快的变化趋势。

3.5抑制剂对毛霉酸性蛋白酶活性的影响

在酸性蛋白酶的稳定pH条件下，将酶液与不同类型的抑制剂混和，然后在室温中放置约30min，测定加入抑制剂保温后酸性蛋白酶的活性。考察蛋白酶抑制剂对酸性蛋白酶活性的影响。所用抑制剂购于Roche公司，结果如表2所示。

表2抑制剂对毛霉酸性内肽酶Pa2活性的影响

(^a终浓度  ^b酶活采用紫外测定法)

在所考察的四大类蛋白酶抑制剂中，仅胃蛋白酶抑制剂(Pepstatin A)对毛霉酸性内肽酶Pa2有非常显著的抑制作用，终浓度10μM的Pepstatin A可以完全抑制Pa2的活性。由此可以确定，毛霉酸性内肽酶组分Pa2属于天冬氨酸蛋白酶家族。

3.6金属离子对酸性蛋白酶活性的影响

在酸性蛋白酶的稳定pH条件下，将酶液与不同的金属无机盐混和，于室温中放置30min后测定酶活，比较各种金属离子对酸性蛋白酶活性的影响。

常见金属离子对毛霉酸性内肽酶活性并无显著的促进或抑制作用。

3.7毛霉酸性蛋白酶的底物选择性

按照酸性蛋白酶的活性测定方法，分别以Casein(酪蛋白)、SPI(大豆分离蛋白)和BSA(牛血清蛋白)为底物测定酸性蛋白酶的活性，考察毛霉酸性蛋白酶对不同底物的水解活性。

以不同的天然蛋白为底物，考察了毛霉酸性内肽酶对不同蛋白底物的水解活性，结果如表2所示。

表2毛霉酸性内肽酶Pa2对不同蛋白底物的水解活性

毛霉酸性内肽酶对不同蛋白底物的作用效果有很大的差异，在所选用的3种蛋白底物中，毛霉酸性内肽酶Pa2对Casein的水解活性最高，其次为SPI，最差的是BSA。

3.8毛霉酸性蛋白酶的肽键选择性

取牛胰岛素氧化B链(Insulin Chain B Oxidized from bovine pancreas)100μg，用1ml缓冲液溶解(0.02M pH5.0乙酸-乙酸铵缓冲液)，加入一定量酶液(约30u)，混和后放置于40℃水浴酶解1h，沸水浴5min灭活。用0.1％甲酸溶液10倍稀释上述水解液，然后利用质谱测定稀释水解液中小肽片断的分子量，将所得的结果与胰岛素B链随机片断的分子量比对，据此确定毛霉酸性蛋白酶在胰岛素B链上的酶切位点。

以牛胰岛素氧化B链为模型底物，利用质谱对胰岛素B链酶解片断进行了分析，并通过此方法确定了毛霉酸性内肽酶在胰岛素B链上的酶切位点，结果如表3所示。

表3毛霉酸性蛋白酶Pa2在胰岛素B链上的切割位点

(表中箭头指示酶切位点，其粗细表示水解强度的大小：

已报道的天冬氨酸蛋白酶^]：1：Aspartic proteinase from Rhiozopus hanochow；2：R.chinensis aspartic proteinase；3：Asperoillus saitoi aspartic proteinase；4：A.sojaeaspartic proteinase；5：Pencillium janthinellum aspartic proteinase；6：Cryphonectoria parasitica(Endothia parasitica)aspartic proteinase；7：Rhizomucorpusillus(Mucorpusillus)aspartic proteinase；8：human pepsin 3；9：human pepsin5；10：human non-pepsin proteinase)

毛霉酸性内肽酶组分Pa2在牛胰岛素B链上具有12个不同的酶切位点分布。从酶切位点的分布来看，毛霉酸性内肽酶与其它来源的天冬氨酸蛋白酶相同，均对肽键15-Leu-|-Tyr-16、16-Tyr-|-Leu-17和24-Phe-|-Phe-25有非常强的水解活性；与其它绝大多数酸性蛋白酶不同的是，毛霉酸性内肽酶对胰岛素B链上4-Gln-|-His-5肽键也有很强的水解活性，这一点与Pencillium janthinellum天冬氨酸蛋白酶相同。从酶切位点的特性来看，毛霉酸性内肽酶与其它蛋白酶相似，也是对疏水性肽键显示出相对较强的水解活性。

实施例4毛霉酸性蛋白酶Pa2动力学特性测定

4.1米氏常数测定

配制一系列不同浓度的酪蛋白溶液：0g/L、0.5g/L、1g/L、2g/L、4g/L、6g/L、8g/L、10g/L、12g/L、16g/L、20g/L。分别在酸性蛋白酶最适作用pH条件下，用不同浓度酪蛋白溶液为底物测定酸性蛋白酶活性，考察底物浓度与酸性蛋白酶活性的关系。根据实验数据采用双倒数作图或曲线拟合的方法确定米氏方程中的参数(V_m和K_m)。

曲线拟合法求解Pa2米氏常数，可直接确定出模型参数Vm＝12.67μg/ml·min，Km＝2.126g/L。

4.2活化能的测定

根据化学反应动力学理论，在酶的稳定性不受影响的前提下，温度对酶促反应速度的影响符合阿累尼乌斯(Arrhenius)方程。根据上述实验结果，毛霉酸性蛋白酶在45℃内有较好的热稳定性，在此温度范围内酸性蛋白酶的失活速度很低，可以忽略，其酶促反应速率符合Arrhenius方程。另外，在通常情况下，酶活测定时其底物浓度Cs是远远过量的，Cs的微小变化对酶促反应速率的影响可以忽略，即反应速度不受底物浓度Cs的影响，此时的酶促反应遵循零级化学反应规律，对于反应：

$S\stackrel{k}{\→}P---(4-1)$

则有速率方程： $r=\frac{d{C}_s}{\mathrm{dt}}=k---(4-2)$

根据Arrhenius方程： $k=\mathrm{Aexp}(-\frac{\mathrm{Ea}}{\mathrm{RT}})---(4-3)$

式中，A为指前因子；Ea为反应活化能；R为气体常数，8.31J/mol·K；T为绝对温度。由此可以看出，在酶的稳定性温度范围内，酶促反应速率lnr与温度1/T成线性关系，其斜率为

根据这一理论，分别在不同温度(20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃)下测定毛霉酸性蛋白酶的活性。然后对实验数据进行上述的线性拟合，从而可以确定毛霉酸性蛋白酶的活化能Ea。

根据Arrhenius方程，对实验数据进行线性拟合，根据以上模型中的参数可计算出毛霉酸性蛋白酶Pa2的活化能Ea＝42.31kJ。

实施例5毛霉酸性内肽酶Pa2对大豆蛋白的水解

5.1酸性条件下的水解试验

用0.05M pH6.5磷酸缓冲液配制浓度为5％的大豆分离蛋白(SPI)，在沸水浴中热处理15min。冷却后按酶与底物比1000u/g加入蛋白酶Pa2，然后置于50℃水浴条件下酶解，测定大豆蛋白水解度的变化。

5.2pH对大豆蛋白水解的影响

分别在pH4.5，5.5，6.5的条件下进行水解试验，探讨毛霉蛋白酶Pa2在不同pH条件下对大豆蛋白的水解情况。

毛霉酸性内肽酶在不同的pH条件下对大豆蛋白的水解显示出一定的差异：酸性蛋白酶Pa2在pH6.5时对大豆蛋白有相对较强的水解活性，大豆蛋白的最终水解度分别可以达到5.8％；在pH4.5和pH5.5时，酸性蛋白酶Pa2对大豆蛋白的水解活性相对较弱。

5.3温度对大豆蛋白水解的影响

分别在40℃，50℃，60℃的条件下进行水解试验，考察毛霉蛋白酶Pa2在不同温度下对大豆蛋白的水解情况。

在不同的温度下，大豆蛋白的水解度呈现出不同的变化趋势。在50℃的条件下，毛霉酸性蛋白酶Pa2对大豆蛋白具有相对较强的水解活性，水解5h后大豆蛋白的水解度分别可以达到4.8％左右；在40℃的条件下，大豆蛋白水解度的增长较平缓，显示该条件下毛霉酸性蛋白酶的活性相对较低；在60℃的条件下，大豆蛋白水解度在前30min出现了迅速增加的趋势，而之后几乎是维持变化，结果说明毛霉碱性蛋白酶在60℃也具有相当强的活性，但是该温度下毛霉酸性蛋白酶极不稳定，很快就失活了。根据以上实验结果，确定毛霉酸性蛋白酶水解大豆蛋白的合适温度在50℃左右。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (3)

1.一种酸性蛋白酶，能在酸性条件下水解蛋白质，其特征在于，所述酸性蛋白酶具有以下物理化学特性：

a)所述的酸性蛋白酶通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳确定的估测分子量为33kDa；

b)所述的酸性蛋白酶的N端序列为GTGTVPVTDV；

c)所述的酸性蛋白酶最适作用温度为50℃；所述的酸性蛋白酶在温度低于45℃时有很好的热稳定性；

d)所述的酸性蛋白酶最适作用pH为pH5.5，在pH4.0～7.0能保持很好的稳定性；

e)胃蛋白酶抑制剂对所述的酸性蛋白酶有非常显著的抑制作用，所述的酸性蛋白酶属于天冬氨酸蛋白酶家族；

f)所述的酸性蛋白酶在胰岛素B链上拥有强弱不等的12个酶切位点；

g)所述的酸性蛋白酶由雅致放射毛霉AS3.2778（Actinomucor elegans）分离提纯得到。

2.如权利要求1所述的酸性蛋白酶，其特征在于，所述的酸性蛋白酶对三种底物的水解活性为酪蛋白>大豆分离蛋白>牛血清白蛋白。

3.如权利要求1所述的酸性蛋白酶，其特征在于，所述的酸性蛋白酶米氏常数Km为2.126g/L，活化能Ea为42.31kJ。

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