BRPI0314120B1 - processo para diminuição de um nível de agregado de um antagonista de hormônio do crescimento (gh) peguilado e isoformas do mesmo - Google Patents
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Abstract
PROCESSO PARA A DIMINUIÇÃO DOS NÍVEIS DE AGREGADO DE PROTEÍNA PEGUILADA. A presente invenção refere-se a métodos recombinantes para fabricação de uma proteína peguilada desejada e agrupamento da mesma. Esse(s) método(s) fornece(m) um produto de polipeptídeo contendo níveis reduzidos de seu agregado agrupado para prover as suas isoformas peguiladas desejadas.
Description
[0001] O presente pedido é um pedido não-provisório que reivindi- ca prioridade para seu pedido provisório correspondente n° 60/412.227 depositado em 20 de setembro de 2002. Este pedido é uma continua- ção-em-parte do pedido U.S. não-provisório n° de série interino P- 107.891 depositado em 25 de agosto de 2003. Ambos pedidos provi- sório e não-provisório acima mencionados são incorporados aqui a título de referência em sua totalidade.
[0002] A presente invenção refere-se em geral a métodos recom- binantes para a fabricação de um polipeptídeo peguilado desejado. Esse(s) método(s) fornece(m) um produto de polipeptídeo peguilado contendo níveis reduzidos de agregado e/ou certas impurezas de iso- forma dele. Em particular, a presente invenção refere-se também a (1) um método recombinante para a preparação de hormônio do cresci- mento com menos agregado e/ou suas impurezas de isoforma e (2) um método recombinante para preparação de um antagonista de hor- mônio do crescimento (por exemplo, tal como pegvisomant, e seu in- termediário de proteína) com menos agregado e/ou suas impurezas de isoforma. Mais especificamente, as impurezas da isoforma que são diminuídas através dos métodos da presente invenção são as impure- zas das isoformas trissulfeto e des-phe de hormônio do crescimento e antagonista de hormônio do crescimento (ou seu intermediário), res- pectivamente. Também, o agregado é o agregado indesejado de hor- mônio do crescimento peguilado, antagonista de hormônio do cresci- mento peguilado ou uma proteína peguilada, em geral.
[0003] Pegvisomant (Somavert®; Pharmacia Corp.) é um antago- nista de receptor de hormônio do crescimento humano. Ele é um aná- logo de hormônio do crescimento humano (‘hGH") que foi estrutural- mente alterado. A seqüência de aminoácido do componen- te/intermediário de proteína (B-2036) do pegvisomant difere da se- qüência de aminoácido de hGH em nove posições. As substituições de aminoácido específicas são como segue: H18D, H21N, G120K, R167N, K168A, D171S, K172R, E174S e I179T. Como é bem conhe- cido na técnica, a primeira letra (isto é, H18D) representa o aminoáci- do na seqüência de hGH na posição numerada (isto é, posição do 18° aminoácido conforme indicado por H18D) que é substituído com o aminoácido designado pela segunda letra (isto é, H18D). Desse modo, H18D designa uma substituição do aminoácido his pelo aminoácido asp na posição do 18° aminoácido da seqüência de aminoácido de hGh do tipo selvagem.
[0004] A Figura 1A mostra esquematicamente a estrutura da se- qüência de aminoácido do componente/intermediário de proteína (B- 2036) de pegvisomant (PEG B-2036 ou B-2036 PEG) com asteriscos indicando os locais potenciais de ligação de polímero de polietileno glicol (unidade "PEG"). Ainda, a listagem de seqüência de aminoácido do componente/intermediário de proteína (B-2036 - sem ligação de unidade PEG) de pegvisomant é identificada aqui como SEQ ID N° 1. Para comparação, a listagem de seqüência de aminoácido de hormô- nio do crescimento humano é identificada aqui como SEQ ID N° 2. Ambas listagens de seqüência são providas abaixo. Vide também Jor- gensen e outros, "Quantifying biosynthetic human growth hormone in Escherichia coli with electrophoresis under hydrophobic conditions", J. Chromatography A. 817:205-214 (1998) quanto à seqüência de hGH.
[0005] Estruturalmente, o pegvisomant é uma proteína (contendo 191 resíduos de aminoácido) à qual predominantemente 4 a 6 unida- des de PEG estão covalentemente ligadas. O peso molecular do com- ponente/intermediário da proteína (B-2036) de pegvisomant é 21.998 Dáltons. O peso molecular de cada unidade de PEG de pegvisomant é aproximadamente 500 Dáltons. Desse modo, os pesos moleculares predominantes de pegvisomant são aproximadamente 42.000 (4 uni- dades de PEG/molécula), 47.000 (5 unidades de PEG/molécula) e 52.000 (6 unidades de PEG/molécula) Dáltons.
[0006] Com referência ao agonista, e sem ser limitado pela teoria, acredita-se que o hGH endógeno ative seus receptores quando uma única molécula de hGH se liga a duas de suas moléculas receptoras adjacentes (e idênticas), induzindo homodimerização de receptor me- diada por hormônio. Vide Patentes U.S. Nos 5.849.535 e 6.057.292. A atividade do hGH depende de sua habilidade em se ligar a dois de seus receptores adjacentes (e idênticos) através de dois locais de liga- ção separados (local 1 e local 2) na mesma molécula de hGH. Esses locais de ligação de hGH, chamados local 1 e local 2, são numerados 1 e 2 para refletir a ordem de sua ligação a dois receptores de hGH adjacentes (e idênticos) que fazem a mediação de homodimerização dependente de hGH.
[0007] Ainda, sem ser limitado pela teoria, acredita-se que pegvi- somant seletivamente se ligue a receptores de hormônio do cresci- mento humano ("receptores de hGH") nas superfícies celulares, onde ele bloqueia a ligação de hormônio do crescimento humano endógeno, desse modo interferindo com a transdução de sinal de hormônio do crescimento humano. As modificações estruturais para a porção de proteína (também chamada "componente" ou "intermediário) de pegvi- somant (relativo a hGH) permitem que o pegvisomant bloqueie compe- titivamente a interação entre uma molécula de hGH e um receptor de hGH. O pegvisomant se liga ao receptor de GH, desse modo bloque- ando a ligação de GH uma vez que o receptor é ocupado. As modifi- cações estruturais previnem a dimerização do receptor, como um re- sultado transdução de sinal não acontece. Ao bloquear a interação ín- tima requerida entre uma molécula de hGH e um receptor de hGH, o pegvisomant bloqueia a homodimerização mediada por hGH dos re- ceptores de hGH, dando ao pegvisomant sua atividade antagonista.
[0008] Este antagonista é usado para tratar condições, incluindo, mas não limitado a, acromegalia em pacientes que não respondem adequadamente à cirurgia, terapia de radiação e/ou outras terapias médicas convencionais, ou que não podem de outra maneira tolerar essas terapias. Ainda, as modificações estruturais da porção de prote- ína (B-2036) de pegvisomant fazem com que ele exiba uma afinidade de ligação para o receptor de prolactina que é menor do que aquela de hGH, desse modo minimizando os efeitos colaterais relacionados à lactação indesejáveis associados com o uso de pegvisomant.
[0009] A porção intermediária de proteína (B-2036) de pegviso- mant é sintetizada por uma cepa de bactérias Escherichia coli que foi geneticamente modificada pela adição de um plasmídeo que carrega um gene para o antagonista de receptor de hormônio do crescimento (B-2036). B-2036 é então recuperado das células microbianas e purifi- cado. B-2036 purificado é então peguilado para produzir pegvisomant (PEG B-2036). As Patentes U.S. 5.849.535 e 6.057.292 descrevem métodos de fabricação de B-2036 e métodos para conjugação de uma ou mais unidades de PEG a B-2036, embora sem detalhes de como diminuir, reduzir, eliminar, reverter e/ou prevenir a formação de níveis inaceitavelmente altos de suas impurezas de isoforma trissulfeto e des-phe.
[00010] Um dos problemas encontrados usando métodos de fabri- cação recombinantes convencionais para fazer B-2036 é a formação de suas impurezas de isoforma, tal como suas isoformas des-phe e trissulfeto. Um outro dos problemas encontrados usando métodos de fabricação e purificação convencionais para fazer PEG B-2036 (isto é, B-2036 peguilado, tal como pegvisomant) a partir de B-2036 é a for- mação de "agregado" indesejável de PEG B-2036 como discutido mais abaixo.
[00011] A impureza da isoforma des-phe é uma onde a molécula de B-2036 está sem sua fenilalanina amino-terminal. Vide Figura 1A mos- trando o resíduo de fenilalanina amino-terminal objeto (isto é, indicado pela letra "F") adjacente à extremidade -NH2 de B-2036. A impureza da isoforma trissulfeto é uma onde a molécula de B-2036 contém um átomo de enxofre extra que forma uma "ponte trissulfeto" dentro da molécula. Vide caixa na Figura 1B. Também, vide Andersson e outros, "Isolation and Characterization of a trisulfide variant of recombinant human growth hormone formed during expression in Escherichia coli", Int. J. Peptide Protein Res., 47:311-321 (1996) e A. Jesperson e out- ros, "Characterisation of a trisulphide derivative of biosynthetic human growth hormone produced Escherichia coli", Eur. J. Biochem., 219:365-373 (1994). Sem desejar ser limitado pela teoria, acredita-se que essas impurezas de isoforma sejam tipicamente geradas durante o crescimento celular (por exemplo, fermentação) e expressão (síntese e secreção) de B-2036 em células hospedeiras geneticamente modifi- cadas e/ou durante a extração e purificação da proteína B-2036.
[00012] Com relação ao problema com "agregado", formação de tal "agregado" leva a um rendimento menor da proteína desejada e a um custo maior de produção da mesma. Também, se o nível de agregado for muito alto, a proteína final pode ser de pureza tão baixa que ela se torna inadequada para uso terapêutico.
[00013] Com relação a certas impurezas, o Pedido de Patente In- ternacional WO 94/24157 (publicado em 27 de outubro de 1994) des- creve um derivado hidrofóbico de hGH compreendendo um átomo de enxofre extra conforme comparado com o hGH nativo. Vide WO 94/24157 na página 3, linhas 3-10. O átomo de enxofre extra do deri- vado hidrofóbico de hGH forma uma "ponte trissulfeto" dando uma va- riante trissulfeto de hGH. Vide WO 94/24157 na página 7, linhas 11-16. A referência ao WO 94/24157 ainda declara que esta variante trissulfe- to de hGH pode ser convertida de volta para sua forma de hGH nativa através de tratamento da variante trissulfeto de hGH com um compos- to mercapto tal como cisteína, glutationa, 2-mercapto etanol e ditiotrei- tol. Vide WO 94/24157 nas páginas 4 e 5.
[00014] O Pedido de Patente Internacional WO 96/02570 (publicado em 1 de fevereiro de 1996) descreve um outro método para conversão de variante trissulfeto de hGH de volta para sua forma nativa usando ou sulfeto de sódio, sulfeto de potássio, sulfeto de amônio, ou um sul- feto de metal alcalino-terroso tal como sulfeto de magnésio ou sulfeto de cálcio. Vide WO 94/24157 na página 4, linhas 17-21.
[00015] O Pedido de Patente Internacional WO 00/02900 (publicado em 20 de janeiro de 2000) intitulado "Method for the production of re- combinante peptides with a low amount of trisulfides" discute "um mé- todo para a redução da quantidade de trissulfetos na produção de pep- tídeos recombinantes, por exemplo, ambos proteínas e peptídeos me- nores. A invenção é baseada na constatação nova e inesperada de que a quantidade de trissulfetos na produção de peptídeos recombi- nantes poderia ser reduzida através da adição de um sal de metal, de preferência um excesso, já durante ou após a fermentação e não co- mo antes sugerido, através de conversão dos trissulfetos formados de hormônio de crescimento para sua forma nativa". Vide WO 00/02900 na página 2, linhas 21-27. A referência ao WO 00/02900 ainda declara " [a] proteína pode ser qualquer proteína recombinante, mas ela é de preferência hormônio de crescimento humano recombinante que pode ser ambos humano e animal tal como hormônio do crescimento huma- no (hGH), hormônio do crescimento bovino (bGH) e hormônio do cres- cimento de porco (pGH). Vide WO 00/02900 na página 3, linhas 4-6.
[00016] O Pedido de Patente Internacional N° WO 02/057478 (pu- blicado em 25 de julho de 2002) intitulado "Methods and Composition For Extracting Proteins From Cells" refere-se a um método de libera- ção de proteína a partir de uma célula hospedeira através de contato da célula hospedeira com um agente de redução e um detergente. A referência declara que o propósito do agente de redução é "facilitar a recuperação de proteínas em suas conformações nativas". Vide WO 02/057478 na página 2, linhas 16-18. Ainda, o WO 02/057478 descre- ve que o "um ou mais agentes de redução são agentes que reduzem as ligações dissulfeto e/ou mantêm os resíduos sulfidrila na/em sua forma reduzida. Quaisquer agentes ou agentes de redução podem ser usados. Em uma modalidade preferida, um ou mais agentes de redu- ção usados são selecionados do grupo consistido em ditiotreitol (DTT); ditioeritritol (DTE); cisteína (Cys) e tris 2-carboxietilfosfina (TCEP)". Vide também WO 02/057478 da página 3, linha 24 até página 4 linha 4.
[00017] Quanto a outras referências com relação à purificação vide Patente U.S. N° 6.265.542 B1 (Fahrner e outros, intitulado "Purification of Molecules"); Patente U.S. N° 6.333.398 B1 (Blank intitulado "Protein Purification"); Patente U.S. N° 5. 747.639 (Seely intitulado "Use of Hydrophobic Interaction Chromatography to Purify Polyethylene Glycols"); Pedido de Patente Internacional N° PCT/US96/19459 (Ibra- him e outros, intitulado "Activated Linkers and Methods for Making and Purifying the Same"); e Pedido de Patente U.S. N° U.S. 2002/002271 A1 (Rinderknecht e outros intitulado "Antibody Purification").
[00018] As referências acima mencionadas, no entanto, são silenci- osas com relação à prevenção, reversão, redução ou eliminação de formação de impureza de isoforma associada com um antagonista de hormônio do crescimento tal como pegvisomant ou sua porção de pro- teína, B-2036 e/ou formação de agregado de proteína peguilada, por exemplo, pegvisomant. Desse modo, há a necessidade de métodos aperfeiçoados de fabricação de B-2036 que diminuam, atenuem, pre- vinam, minimizem, revertam e/ou eliminem a formação de suas impu- rezas de isoforma (trissulfeto e/ou des-phe) e/ou formação de agrega- do de proteína peguilada. Da mesma maneira, essas referências são também silenciosas quanto à detecção, atenuação, minimização, re- versão, redução ou eliminação da formação de impureza de isoforma des-phe de hormônio do crescimento e/ou formação de agregado de proteína peguilada, por exemplo, hormônio do crescimento peguilado ou hormônio do crescimento humano peguilado. Desse modo, há a necessidade de métodos aperfeiçoados de fabricação de hormônio do crescimento que diminuam, atenuem, previnam, minimizem ou rever- tam e/ou eliminem a formação de sua impureza de isoforma des-phe e/ou formação de agregado de proteína peguilada, por exemplo, hor- mônio do crescimento peguilado ou hormônio do crescimento humano peguilado.
[00019] A Figura 1 mostra a seqüência de aminoácido de B-2036 que corresponde à SEQ ID N° 1. Os asteriscos (*) na Figura 1 indicam nove (9) locais potenciais para ligação covalente de unidades de PEG para cada molécula de B-2036. Nota-se que embora nove (9) locais possíveis sejam identificados, nem todos os 9 locais têm que ser cova- lentemente ligados a unidades de PEG. De preferência, há 4-6 unida- des de PEG por molécula de B-2036.
[00020] A Figura 1B mostra a estrutura da impureza da isoforma trissulfeto de B-2036 (designada ("Trissulfeto (+32amu")) conforme comparado com sua forma desejável (designada "GHA nativa").
[00021] A Figura 2 é uma comparação gráfica da porcentagem de espécies de B-2036 PEG 4 encontradas dentro das frações de Q- Sepharose FF 7 a 18 conforme determinado através de eletroforese capilar e HPLC de fase reversa.
[00022] A Figura 3 é uma comparação gráfica das porcentagens de espécies B-2036 PEG 5 encontradas dentro de frações Q-Sepharose FF 7 a 18 conforme determinado através de eletroforese capilar e HPLC de fase reversa.
[00023] A Figura 4 é uma comparação gráfica das porcentagens de espécies B-2036 PEG 6 encontradas dentro de frações de Q- Sepharose FF 7 a 18 conforme determinado através de eletroforese capilar e HPLC de fase reversa.
[00024] Em vista da necessidade acima de se prover um processo aperfeiçoado para fabricação de um agonista de hormônio do cresci- mento de polipeptídeo peguilado recombinante, um agonista de hor- mônio do crescimento humano de polipeptídeo peguilado recombinan- te, um antagonista de hormônio do crescimento de polipeptídeo pegui- lado recombinante e/ou um antagonista de hormônio do crescimento humano de polipeptídeo peguilado recombinante, com níveis menores de agregado indesejado e/ou suas impurezas de isoforma, a presente invenção refere-se a processos aperfeiçoados para produção de hor- mônio do crescimento de polipeptídeo peguilado recombinante (inclu- indo, mas não limitado a, hormônio do crescimento humano) e antago- nista de hormônio do crescimento de polipeptídeo peguilado recombi- nante (incluindo, mas não limitado a, antagonista de hormônio do crescimento humano) com níveis menores de suas impurezas na(s) isoforma des-phe e/ou trissulfeto, agregadas.
[00025] Com relação ao hormônio do crescimento recombinante (incluindo, mas não limitado a hGH), a formação de sua impureza na isoforma des-phe é diminuída através de adição suficiente de (1) um agente de quelação e (2) um sal de metal, respectivamente.
[00026] Com relação ao antagonista de hormônio do crescimento recombinante (incluindo, mas não limitado a, antagonista de hormônio do crescimento humano), sua impureza da isoforma trissulfeto é dimi- nuída através de contato suficiente entre a impureza da isoforma tris- sulfeto e (1) um composto mercapto, (2) um agente de quelação, (3) um sal de metal, (4) um composto mercapto junto com um sal de metal ou (5) um composto mercapto após contato com um agente de quela- ção, mas na ausência do agente de quelação, respectivamente.
[00027] Com relação ao antagonista de hormônio do crescimento recombinante (incluindo, mas não limitado a, antagonista de hormônio do crescimento humano), formação de sua impureza da isoforma des- phe é diminuída através da adição de (1) um agente de quelação ou (2) um sal de metal, respectivamente.
[00028] Com relação a uma proteína peguilada recombinante (inclu- indo, mas não limitado a, hormônio peguilado, antagonista de hormô- nio do crescimento peguilado, antagonista de hormônio do crescimen- to humano peguilado, hormônio do crescimento peguilado e/ou hor- mônio do crescimento humano peguilado), o nível de agregado é man- tido ou diminuído para ou abaixo de um nível desejado através de cromatografia de troca de ânion durante a separação de suas isofor- mas peguiladas.
[00029] As abreviações que seguem são usadas neste pedido. AC cromatografia de afinidade AEX troca de ânion API ingrediente farmacêutico ativo BI intermediário bruto; B-2036 (sem peguilação) B-2036 PEG B-2036 peguilada PEG B-2036 B-2036 peguilada CE eletroforese capilar CEX troca de cátion cm centímetro CV volume da coluna DEAE dietilaminoetila HEPES ácido N-(2-hidroxietil) piperazina N-(2-etano)sulfônico HIC cromatografia de interação hidrofóbica IEX troca de íon kDa kiloDáltons L litros LPM litros por minuto mL ou ml mililitro mM miliMolar mS miliSiemen MWCO corte de peso molecular μm micrômetro N Normalidade NaCl cloreto de sódio NaOH hidróxido de sódio NWP permeabilidade à água normalizada PEG molécula de polietileno glicol ou sua variante PEG-1 uma molécula de B-2036 peguilada com 1 molécula de PEG ou sua variante PEG-2 uma molécula de B-2036 peguilada com 2 moléculas de PEG ou sua variante PEG-3 uma molécula de B-2036 peguilada com 3 moléculas de PEG ou sua variante PEG-4 uma molécula de B-2036 peguilada com 4 moléculas de PEG ou sua variante PEG-5 uma molécula de B-2036 peguilada com 5 moléculas de PEG ou sua variante PEG-6 uma molécula de B-2036 peguilada com 6 moléculas de PEG ou sua variante PEG-7 uma molécula de B-2036 peguilada com 7 moléculas de PEG ou sua variante PEG-8 uma molécula de B-2036 peguilada com 8 moléculas de PEG ou sua variante PEG-9 uma molécula de B-2036 peguilada com 9 moléculas de PEG ou sua variante RPHPLC cromatografia líquida de alto desempenho de fase rever- sa SD desvio padrão SDS-PAGE eletroforese de dodecil sulfato de sódio-gel de poliacri- SEHPLC lamina cromatografia líquida de alto desempenho de exclusão de tamanho TMP desempenho de transmembrana TRIS tris-(2-hidroximetil)aminometano UF/DF ultrafiltragem/diafiltragem UV ultravioleta WFI água para injeção
[00030] O termo "proteína peguilada" inclui, mas não está limitado a, um hormônio, hormônio do crescimento, hormônio do crescimento humano, antagonista de hormônio do crescimento, antagonista de hormônio do crescimento humano, um anticorpo (ou seu fragmento) e B-2036 PEG. "Proteína peguilada" também inclui, mas não está limita- da a, uma ou mais proteínas de interesse peguiladas em um ou mais locais.
[00031] A menos que de outro modo indicado, o termo "agregado" refere-se a um grumo do tipo espaguete de uma ou mais proteínas de interesse, sejam peguiladas ou não-peguiladas. Um "agregado" é uma multiplicidade de moléculas de proteína que se agruparam através de interação estérica ou de outra maneira umas com as outras. Exemplos de "agregado" incluem, mas não estão limitados a, ligação entre (1) uma multiplicidade de moléculas de proteína peguilada, (2) uma multi- plicidade de moléculas de proteína não-peguilada e/ou (3) pelo menos uma molécula de proteína peguilada e pelo menos uma molécula de proteína não-peguilada.
[00032] A menos que de outro modo indicado, "impureza de proteí- na não-peguilada" inclui, mas não está limitada a, proteínas não- peguiladas, isto é, proteínas sem uma molécula de PEG ligada ou uma variante dela.
[00033] A menos que de outro modo indicado, "razão de peso este- quiométrica" refere-se à quantidade de moléculas de PEG livres para a quantidade de moléculas de proteína não-peguilada de interesse.
[00034] A menos que de outro modo indicado, o termo "isoforma(s) de proteína peguilada" refere-se a uma proteína de interesse tendo uma ou mais porções de PEG ligadas a ela, de preferência através de ligação covalente. Por exemplo, o termo "PEG-1" refere-se a B-2036 tendo uma molécula de PEG ligada a ela, de preferência em uma po- sição tal como um resíduo de aminoácido lisina e/ou o terminal amino. Da mesma maneira, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9 referem-se ao número de moléculas de PEG ligadas a uma molécula de B-2036. Desse modo, PEG-2 refere-se a B-2036 tendo duas moléculas de PEG ligadas a ela e PEG-3 refere-se a três moléculas de PEG ligadas a uma molécula de B-2036 e assim por di- ante.
[00035] A menos que de outro modo indicado, o termo "volume de leito embalado" refere-se a um volume de leito embalado de uma resi- na particular embalada de acordo com as condições de operação su- geridas pelo fabricante.
[00036] A menos que de outro modo indicado, o termo "impureza de isoforma" refere-se pelo menos à impureza de isoforma, ou a impureza da isoforma des-phe descrita aqui. O termo "impureza de isoforma" pode também incluir outras impurezas reconhecidas na técnica.
[00037] O termo "condutividade de agrupamento CE" refere-se à medição de condutividade da fração de CV coletada sendo submetida a CE.
[00038] Os termos "antagonista de hormônio do crescimento" e "an- tagonista de receptor de hormônio do crescimento" incluem (mas não estão limitados a) polipeptídeos peguilados e polipeptídeos que inibem ou de outro modo antagonizam a ligação de hormônio do crescimento a seu receptor de hormônio do crescimento para bloquear o(s) efei- to(s) biológico(s) do hormônio do crescimento. De preferência, o "an- tagonista de hormônio do crescimento" peguilado ou o "antagonista de receptor de hormônio do crescimento" peguilado é B-2036 peguilada, B-2036 ou uma variante dela. "Variantes" incluem, mas não estão limi- tados a, seus homólogos (particularmente homólogos com substitui- ções, adições ou deleções de aminoácido conservadoras relativas à B- 2036), análogos, fragmentos, pseudopeptídeos, anticorpos, etc. (res- pectivamente) tendo atividade antagonista de receptor de hormônio do crescimento.
[00039] Os termos "agonista de hormônio do crescimento" e "ago- nista de receptor de hormônio do crescimento" incluem (mas não estão limitados a) polipeptídeos peguilados e polipeptídeos que se ligam a e ativam seu receptor de hormônio do crescimento. De preferência, o "agonista de hormônio do crescimento" ou o "agonista de receptor de hormônio do crescimento" é hormônio do crescimento humano pegui- lado, hormônio do crescimento humano ou uma variante dele. "Varian- tes" incluem, mas não estão limitados a, homólogos (particularmente homólogos com substituições, adições ou deleções de aminoácido conservadoras relativas a hormônio do crescimento humano), análo- gos, fragmentos, pseudopeptídeos, anticorpos, etc. (respectivamente) tendo atividade agonista de receptor de hormônio do crescimento.
[00040] O termo "e" pode significar "e" ou "ou" conforme apropriado ou necessário para descrever um processo para dar a diminuição de- sejada no nível da impureza relevante (por exemplo, impureza da iso- forma trissulfeto ou des-phe e/ou agregado).
[00041] O termo "ou" pode significar "e" ou "ou" conforme apropria- do ou necessário para descrever um processo para dar a diminuição desejada no nível de impureza relevante (por exemplo, impureza da isoforma trissulfeto ou des-phe e/ou agregado).
[00042] Conforme aqui usado, a menos que de outro modo indica- do, o termo "diminuir" (ou suas variações aparentes) significa manter, eliminar, minimizar, reduzir, prevenir, reverter e/ou atenuar a quantida- de do nível de "agregado" da proteína peguilada de interesse e/ou a impureza da isoforma relevante, seja ela a impureza da isoforma tris- sulfeto ou a impureza da isoforma des-phe.
[00043] A menos que de outro modo indicado, o termo "célula hos- pedeira’’ (ou suas variações aparentes) refere-se a qualquer célula hospedeira na qual B-2036 recombinante ou hGH recombinante pode ser formada. Desse modo, a célula hospedeira pode ser uma célula hospedeira de mamífero, uma célula hospedeira de planta, ou uma célula hospedeira microbiana, tal como E. coli ou até mesmo células de levedura. É importante notar que a célula hospedeira pode ser uma que seja suficiente para cultivar o componente de proteína B-2036 re- combinante desejado ou hGH recombinante nela. Desse modo, não há nenhuma limitação de qual a célula hospedeira seja exceto que ela seja uma capaz de recombinantemente produzir o componente de pro- teína B-2036 ou hGH recombinante de interesse ou suas "variantes".
[00044] Ainda, conforme aqui usado, a menos que de outro modo indicado, o termo "crescer" (ou suas variações aparentes, por exem- plo, crescimento) inclui, mas não está limitado a, fermentação e cultu- ra, ou de outro modo fazendo com que a(s) célula(s) hospedeira(s) proliferem suficientemente para produzir quantidades desejadas do componente de proteína B-2036 recombinante ou hGH recombinante.
[00045] Ainda, embora a presente invenção tenha sido descrita com relação a B-2036 recombinante, e B-2036 PEG recombinante, a me- nos que de outro modo indicado, é compreendido que a presente in- venção possa ser usada com qualquer agonista de hormônio do cres- cimento recombinante, antagonista de hormônio do crescimento re- combinante, seja ele hormônio do crescimento de mamífero ou seu antagonista, hormônio do crescimento humano ou seu antagonista, ou hormônio do crescimento bovino ou seu antagonista, etc.
[00046] Pegvisomant (referido aqui ou como PEG B-2036 ou B- 2036 PEG) é a forma peguilada de proteína recombinante (B-2036) produzida em células hospedeiras recombinantes (por exemplo, célu- las hospedeiras de E. coli recombinantes, geneticamente modificadas). A proteína B-2036 é produzida durante o crescimento celular (por exemplo, através de fermentação) e expressão (síntese e secreção). Após esta produção, B-2036 é isolada (por exemplo, através de ho- mogeneização) seguido por purificação (por exemplo, através de ex- tração, centrifugação, cromatografia de fase reversa e troca de ânion, e troca de tampão). No entanto, conforme notado durante a produção recombinante da proteína B-2036, impurezas de isoforma indesejáveis de B-2036 são formadas, as quais são as impurezas das isoformas trissulfeto e des-phe de B-2036.
[00047] Conforme notado, a Figura 1A ilustra a seqüência de ami- noácido de B-2036 com as abreviações de 1 letra comuns indicando qual aminoácido está presente em cada posição identificada com letra. Quanto à referência, vide Tabela 1 abaixo indicando a correspondên- cia entre a letra e seu aminoácido associado. Tabela 1
[00048] Adicionalmente, a seqüência de aminoácido de B-2036 é provida aqui como SEQ ID N° 1 e a seqüência de aminoácido de hGH é provida aqui como SEQ ID N° 2.
[00049] A Figura 1B ilustra a estrutura da seqüência de aminoácido da impureza da isoforma trissulfeto de B-2036. Em particular, a impu- reza da isoforma trissulfeto contém um átomo de enxofre extra na pon- te entre as cisteínas nas posições 182 e 189 do componente da prote- ína B-2036.
[00050] Sem desejar ser limitado pela teoria, acredita-se que o con- tato entre composto(s) mercapto selecionado(s) e a impureza da iso- forma trissulfeto do antagonista do hormônio do crescimento recombi- nante B-2036 resulte na conversão da ponte trissulfeto cisteína-S-S-S- cisteína de volta para sua forma nativa cisteína-S-S-cisteína. Ainda, também sem desejar ser limitado pela teoria, é possível que a presen- ça do(s) composto(s) mercapto previna formação adicional da própria ponte trissulfeto.
[00051] Tipicamente, o(s) composto(s) mercapto é/são adicionados à(s) célula(s) hospedeira(s) que sintetizam o componente da proteína B-2036 recombinante desejado durante ou após (ou durante e_após) o crescimento da(s) célula(s) hospedeira(s). Ainda, após as etapas de crescimento e contato terem sido conduzidas, é preferido purificar a proteína B-2036. Em seguida, a proteína purificada é de preferência peguilada para dar PEG B-2036 (pegvisomant). Quanto a procedimen- tos de peguilação vide, por exemplo, a Patente U.S. N° 5.849.535 e a Patente U.S. N° 5.672.662.
[00052] Qualquer composto mercapto pode ser usado em conexão com a presente invenção, o qual, quando contatado (de preferência com mistura adequada) com o componente da proteína B-2036 junto com sua impureza da isoforma trissulfeto, é um que é suficiente para diminuir o nível de impureza da isoforma trissulfeto, de preferência sem degradar (ou substancialmente degradando) o rendimento da B- 2036. Os compostos mercapto preferidos adequados para uso com a presente invenção incluem, mas não estão limitados a, sulfetos, gluta- tiona, beta-mercaptoetanol, ditiotreitol, mercaptoetilamina, ditioeritritol, cloridrato de tris(2-carboxietil) fosfina, cisteína e cisteína em combina- ção com cistina.
[00053] Outros compostos mercapto adequados para uso com a presente invenção são mostrados nas referências que seguem: (1) J. Houk e G.M. Whitesides, "Structure-Reactivity Relations for Thiol- Disulfide Interchange", J.M. Chem. Soc., 109:6825-6836 (1987); (2) Sigmund, M., The Chemistry & Biochemistry of the Sulfhydro Group in Amino Acids, Peptides and Proteins, 1a Ed., Pergamon, Nova Iorque (1973). Em particular, vide Tabela II de Houk e outros identificada no item (1) acima quanto a uma listagem de compostos mercapto exem- plares adequados para uso com a presente invenção.
[00054] Dos compostos mercapto adequados, cisteína, ou cisteína em combinação com cistina (cisteína dimerizada), é a mais preferida. A quantidade de cisteína ou combinação de cisteína e cistina (cisteína dimerizada, se alguma) que é adequada para uso com a presente in- venção deve ser aquela quantidade que é suficiente para diminuir a impureza da isoforma trissulfeto em pelo menos 10% de sua concen- tração de equilíbrio mais alta (ou sua concentração de equilíbrio média mais alta, onde são tiradas médias de bateladas múltiplas) formada. De preferência, a diminuição na quantidade de impureza da isoforma de trissulfeto é pelo menos cerca de 20%, 30%, 40% ou 50%, respec- tivamente, de sua concentração de equilíbrio mais alta (ou sua con- centração de equilíbrio média mais alta) formada. A concentração combinada inicial de cisteína e qualquer cistina adequada para uso com a presente invenção é de preferência pelo menos cerca de 0,1 mM, de a partir de cerca de 0,1 mM a cerca de 10 mM, e de a partir de cerca de 1 mM a cerca de 5 mM, respectivamente.
[00055] É preferido prover o composto mercapto em um tampão. De preferência, o tampão é um que é adequado para uso com a presente invenção, isto é, não previne a formação do componente de proteína B-2036 ou o degrada assim que ele é formado. Tampões adequados para uso em conexão com a presente invenção incluem, mas não es- tão limitados a, Tris, fosfato, HEPES, ácido cítrico, trietilamina e histi- dina. O tampão preferido é Tris. A concentração de tampão inicial pre- ferida é de a partir de cerca de 1 mM a cerca de 200 mM, com mais preferência de a partir de cerca de 5 mM a cerca de 100 mM, com mais preferência ainda de a partir de cerca de 8 mM a cerca de 70 mM, e com mais preferência de a partir de cerca de 10 mM a cerca de 50 mM. Outros tampões adequados podem ser usados. De preferên- cia, esses tampões são suficientes para manter o pH do meio de cres- cimento em qualquer ponto na faixa de a partir de cerca de 4 a cerca de 9, de a partir de cerca de 7,5 a cerca de 8,5, ou de a partir de cerca de 7,5 a cerca de 8,0, respectivamente. Notavelmente, onde concen- trações mais altas de composto mercapto são usadas, níveis de pH mais altos, por exemplo, tão altos quanto cerca de 9,5, podem ser tole- rados. Desse modo, por exemplo, se um excesso grande de cisteína para B-2036 for usado, então o pH do tampão pode ser tão alto quanto cerca de 9,5.
[00056] Conforme acima mencionado, é preferido prover o compos- to mercapto em um tampão. Ainda, a quantidade do composto mer- capto no tampão deve ser tal de modo que a razão molar dos moles de composto mercapto para os moles da proteína B-2036 seja de a partir de cerca de 0,5 a cerca de 1.000. Isso é especialmente desse modo quando o composto mercapto sendo usado é uma combinação de cisteína e, opcionalmente, cisteína em combinação com cistina. Al- ternativamente, a razão molar dos moles de composto mercapto para os moles de proteína B-2036 pode ser de a partir de cerca de 1 a cer- ca de 1.000, de a partir de cerca de 1 a cerca de 500, ou de a partir de cerca de 1 a cerca de 10, respectivamente.
[00057] Tipicamente, após contato suficiente (para diminuir o nível da impureza da isoforma trissulfeto) entre o composto mercapto e o componente da proteína B-2036 (dentro ou a partir da(s) célula(s) hospedeira(s) ter sido completado), o componente da proteína B-2036 no tampão tem uma concentração de a partir de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 30 mg/ml, de a partir de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 20 mg/ml, ou de a partir de cerca de 1 mg/ml a cerca de 10 mg/ml, res- pectivamente.
[00058] Ainda, a faixa de temperatura do meio de crescimento junto com o tampão, o(s) composto(s) mercapto e seus outros conteúdos incluindo, mas não limitado a, B-2036, deve ser mantida em uma tem- peratura de preferência de a partir de cerca de 0o C a cerca de 25° C após o composto mercapto ter sido adicionado à(s) célula(s) hospedei- ra(s) ou seu lisato contendo o componente de proteína B-2036. Tam- bém, de preferência, a temperatura da(s) célula(s) hospedeira(s) e/ou do seu lisato contendo o componente de B-2036 é mantida de a partir de cerca de 1° C a cerca de 15° C, de a partir de cerca de 2° C a cerca de 10° C, ou de a partir de cerca de 2° C a cerca de 8° C, respectiva- mente. É importante notar que a desnaturação da proteína B-2036 acontece por volta de +40° C. Desse modo, é desejável manter a tem- peratura no homogenato (isto é, contendo células hospedeiras, meio de crescimento, tampão, compostos mercapto e B-2036, etc.) para uma temperatura abaixo da temperatura de desnaturação de proteína de B-2036.
[00059] Ainda, o tempo de contato entre o componente de B-2036 e o composto mercapto deve ser por um tempo suficiente para diminuir o nível da impureza da isoforma trissulfeto. Tempos de contato adequa- dos exemplares para diminuição do nível da impureza da isoforma tris- sulfeto devem ser por pelo menos cerca de 30 minutos, de a partir de cerca de 1 hora a cerca de 24 horas, ou de a partir de cerca de 1 hora a cerca de 4 horas, respectivamente.
[00060] Tipicamente, após contato suficiente entre o(s) composto(s) mercapto e o componente de B-2036, o tampão contendo o mesmo tem um volume de a partir de cerca de 1 litro a cerca de 5.000 litros, de a partir de cerca de 10 litros a cerca de 500 litros, ou de a partir de 100 litros a cerca de 300 litros, respectivamente. Outros volumes exemplares adequados podem estar em qualquer ponto a partir de 160 litros a cerca de 500 litros.
[00061] Outros parâmetros que podem ser de interesse durante contato entre o(s) composto(s) mercapto e o componente B-2036 in- cluem coisas tal como taxa de mistura. A taxa de mistura deve ser aquela que seja suficiente para formar uma mistura homogênea (da(s) célula(s) hospedeira(s), seu lisato, tampão, composto(s) mercapto, o componente de B-2036 e quaisquer outros componentes em um meio de crescimento), enquanto minimizando a quantidade de espumação que pode ser formada. Aqueles de habilidade comum na técnica po- dem prontamente determinar o quão suficiente uma taxa de mistura deve ser. Obviamente, a taxa de mistura deve ser tal de modo que a temperatura seja mantida nas faixas acima mencionadas e qualquer degradação do componente da proteína B-2036 seja minimizada.
[00062] Sem desejar ser limitado pela teoria, é acreditado que o contato entre agente(s) de quelação selecionados e (1) a impureza da isoforma trissulfeto, (2) o antagonista de hormônio do crescimento re- combinante B-2036, (3) componente(s) celulare(s) de célula hospedei- ra (para produção recombinante do antagonista) e (4) todas as combi- nações de (1)-(3) resulte na conversão da ponte trissulfeto cisteína-S- S-S-cisteína em sua forma nativa cisteína-S-S-cisteína ou diminuição dos níveis de impureza. Ainda, também sem desejar ser limitado pela teoria, é possível que a presença de agente(s) de quelação previna a formação adicional da própria ponte trissulfeto.
[00063] Tipicamente, o(s) agente(s) de quelação é/são adiciona- do(s) às células hospedeiras que sintetizam o componente da proteína B-2036 recombinante desejado durante ou após (ou durante e após) crescimento da(s) célula(s) hospedeira(s). Ainda, após as etapas de crescimento e contato terem sido realizadas, é preferido purificar a proteína B-2036. Em seguida, a proteína purificada é de preferência peguilada para dar PEG B-2036 (pegvisomant). Quanto a procedimen- tos de peguilação vide Patente U.S. N° 5.849.535.
[00064] Qualquer agente de quelação pode ser usado em conexão com a presente invenção, o qual, quando contatado (de preferência com mistura adequada) com o componente da proteína B-2036 junto com a sua impureza na isoforma trissulfeto, é um que seja suficiente para diminuir o nível de impureza da isoforma trissulfeto, de preferên- cia sem degradação (ou substancialmente degradando) do rendimento de B-2036. Os agentes de quelação preferidos adequados para uso com a presente invenção incluem, mas não estão limitados à EDTA, EGTA e DTPA. Agentes de quelação exemplares adicionais incluem, mas não está limitado à Deferoxamina, Ditiocarb de Sódio, Edetato de Cálcio Dissódico, Edetato Dissódico, Edetato de Sódio, Edetato Tris- sódico, Penicilamina, Pentetato de Cálcio Trissódico, Ácido Pentético, Succímero e Trientina. Nota-se que Edetato de Sódio é a forma de sal de EDTA.
[00065] Outros agentes de quelação adequados para uso com a presente invenção são mencionados nas referências que seguem: (1) "The Merck Index", 12a Ed., S. Budavari (Editor), Merck & Co., Inc., "Therapeutic Category and Biological Activity Index", p. THER-19 (sob "CHELATING AGENTE"), Whitehouse Station, N.J. (1996) e cada uma e toda sua edição subseqüente até agora; (2) "Remington’s Pharma- ceutical Sciences", 16a Ed., Arthur Osol (Editor), Mack Publishing Co., Easton, Pensilvânia (1980) e cada uma e toda sua edição subseqüen- te até agora; (3) "The United States Pharmacopeia", 21a Revisão (16a Edição), United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, Maryland (1985) e cada uma e toda sua edição subseqüente até ago- ra; (4) SIGMA, "Biochemicals and Reagents for Life Science Research Catalogue", St. Louis, Missouri (2002-2003); e (5) Aldrich, "Handbook of Fine Chemicals and Laboratory Equipment", Milwaukee, Wisconsin e suas edições (2000-2001) e (2002-2003).
[00066] Dos agentes de quelação adequados, EDTA é o mais pre- ferido. A quantidade de agente de quelação que é adequada para uso com a presente invenção deve ser aquela quantidade que seja sufici- ente para diminuir a impureza da isoforma trissulfeto em pelo menos cerca de 10% de sua concentração de equilíbrio mais alta (ou sua concentração de equilíbrio média mais alta, onde são tiradas médias de bateladas múltiplas) formada. De preferência, a diminuição na quantidade da impureza da isoforma trissulfeto pelo menos cerca de 20%, 30%, 40%, 50%, respectivamente, ou sua concentração de equi- líbrio mais alta (ou sua concentração de equilíbrio média mais alta) formada. A concentração inicial de EDTA adequada para uso com a presente invenção é de preferência pelo menos cerca de 0,01 mM, de a partir de cerca de 0,01 mM a cerca de 10 mM, de a partir de cerca de 0,1 mM a cerca de 20 mM, de a partir de cerca de 2 mM a cerca de 10 mM ou de a partir de cerca de 2 a cerca de 5 mM, respectivamente.
[00067] É preferido prover o agente de quelação em um tampão. De preferência, o tampão é um que é adequado para uso com a presente invenção, isto é, não previne a formação do componente de proteína B-2036 ou o degrada assim que ele é formado. Tampões adequados para uso em conexão com a presente invenção incluem, mas não es- tão limitados a, Tris, fosfato, HEPES, ácido cítrico, trietilamina e histi- dina. O tampão preferido é Tris. A concentração de tampão inicial pre- ferida é de a partir de cerca de 1 mM a cerca de 200 mM, com mais preferência de a partir de cerca de 5 mM a cerca de 100 mM, com mais preferência ainda de a partir de cerca de 8 mM a cerca de 70 mM, e com mais preferência de a partir de cerca de 10 mM a cerca de 50 mM. Outros tampões adequados podem ser usados. De preferên- cia, esses tampões são suficientes para manter o pH do meio de cres- cimento em qualquer ponto na faixa de a partir de cerca de 6 a cerca de 9, de a partir de cerca de 6,5 a cerca de 7,5 ou de a partir de cerca de 7,2 a cerca de 7,5, respectivamente.
[00068] Conforme acima mencionado, é preferido prover o agente de quelação em um tampão. Ainda, a quantidade do agente de quela- ção no tampão deve ser tal de modo que a razão molar dos moles de agente de quelação para os moles de proteína B-2036 seja de a partir de cerca de 1 a cerca de 1.000. Alternativamente, a razão molar de moles de agente de quelação para moles de proteína B-2036 pode ser de a partir de cerca de 20 a cerca de 1.000, de a partir de cerca de 50 a cerca de 250, ou de a partir de cerca de 60 a cerca de 110, respecti- vamente.
[00069] Tipicamente, após contato suficiente (para diminuir o nível da impureza da isoforma trissulfeto) entre o agente de quelação e o componente da proteína B-2036 (dentro ou a partir da(s) célula(s) hospedeira(s) ter sido completado), o componente da proteína B-2036 no tampão tem uma concentração de a partir de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 20 mg/ml, de a partir de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 5 mg/ml, ou de a partir de cerca de 1 mg/ml a cerca de 5 mg/ml, respec- tivamente.
[00070] Ainda, a faixa de temperatura do meio de crescimento junto com o tampão, o(s) agente(s) de quelação e seus outros conteúdos incluindo, mas não limitado a, B-2036, deve ser mantida em uma tem- peratura de preferência de a partir de cerca de 0o C a cerca de 35° C após o agente de quelação ter sido adicionado à(s) célula(s) hospedei- ra(s) ou seu lisato contendo o componente de proteína B-2036. Tam- bém, de preferência, a temperatura da(s) célula(s) hospedeira(s) e/ou seu lisato contendo o componente B-2036 é mantida de a partir de cerca de 1° C a cerca de 15° C, ou de a partir de cerca de 2° C a cerca de 10° C, ou de a partir de cerca de 2° C a cerca de 15° C, respecti- vamente. Nota-se que, de preferência, quando da adição do agente de quelação (por exemplo, EDTA), cuja temperatura é cerca de 4° C, a temperatura do homogenato contendo a B-2036 aumenta para cerca de 30° C quando da homogeneização. É importante notar que a des- naturação da proteína B-2036 acontece por volta de +40° C. Desse modo, é desejável manter a temperatura do homogenato (isto é, con- tendo células hospedeiras, meio de crescimento, tampão, agentes de quelação e B-2036, etc.) para uma temperatura abaixo da temperatura de desnaturação da proteína de B-2036.
[00071] Ainda, o tempo de contato entre o componente de B-2036 e o agente de quelação deve ser por um tempo suficiente para diminuir o nível da impureza da isoforma de trissulfeto. Tempos de contato ade- quados exemplares para diminuição do nível da impureza da isoforma trissulfeto devem ser por pelo menos cerca de 30 minutos, de a partir de cerca de 1 hora a cerca de 48 horas, ou de a partir de cerca de 5 horas a cerca de 15 horas, respectivamente.
[00072] Tipicamente, após contato suficiente entre o(s) agente(s) de quelação e o componente de B-2036, o tampão contendo o mesmo tem um volume de a partir de cerca de 1 litro a cerca de 5.000 litros, de a partir de cerca de 10 litros a cerca de 500 litros, ou de a partir de cerca de 100 litros a cerca de 300 litros, respectivamente. Outros vo- lumes exemplares adequados podem ser qualquer um de 160 litros a cerca de 500 litros.
[00073] Outros parâmetros que podem ser de interesse durante o contato entre o(s) agente(s) de quelação e o componente de B-2036 incluem coisas tal como taxa de mistura. A taxa de mistura deve ser aquela que seja suficiente para formar uma mistura homogênea (da(s) célula(s) hospedeira(s), seu lisato, tampão, agente(s) de quelação, o componente de B-2036 e quaisquer outros componentes no meio de crescimento), enquanto minimizando a quantidade de espumação que pode ser formada. Aqueles de habilidade na técnica podem pronta- mente determinar qual taxa de mistura suficiente deve ser. Obviamen- te, a taxa de mistura deve ser tal de modo que a temperatura seja mantida nas faixas acima mencionadas e qualquer degradação do componente da proteína B-2036 seja minimizada.
[00074] Sem desejar ser limitado pela teoria, acredita-se que o con- tato entre o(s) sal(is) de metal selecionado(s) e (1) a impureza na iso- forma trissulfeto, (2) o antagonista de hormônio do crescimento re- combinante B-2036, (3) o(s) componente(s) celular(es) da célula hos- pedeira (para produção recombinante do antagonista) e (4) todas as combinações de (1)-(3) resulte na conversão da ponte trissulfeto ciste- ína-S-S-S-cisteína de volta para sua forma nativa cisteína-S-S-cisteína ou níveis menores de impureza. Ainda, também sem desejar ser limi- tado pela teoria, é possível que a presença do(s) sal(is) de metal pre- vina a formação adicional da própria ponte trissulfeto.
[00075] Tipicamente, o(s) sal(ais) de metal é/são adicionado(s) às célula(s) hospedeira(s) sintetizando o componente de proteína b-2036 recombinante desejado durante ou após (ou durante e após) cresci- mento da(s) célula(s) hospedeira(s). Ainda, após as etapas de cresci- mento e contato terem sido conduzidas, é preferido purificar a proteína B-2036. Em seguida, a proteína purificada é de preferência peguilada para dar PEG B-2036 (pegvisomant). Quanto a procedimentos de pe- guilação vide Patente U.S. N° 5.849.535.
[00076] Qualquer sal de metal pode ser usado em conexão com a presente invenção que, quando contatado (de preferência com mistura adequada) com o componente da proteína B-2036 junto com a impu- reza da isoforma trissulfeto, é um que seja suficiente para diminuir o nível da impureza da isoforma trissulfeto, de preferência sem degradar (ou substancialmente degradando) o rendimento de B-2036. Sal(is) de metal adequado(s) para uso com a presente invenção incluem, mas não estão limitados a, sal(is) de metal alcalino-terroso, sal(is) de metal de transição e suas combinações. Os sais de metal preferidos ade- quados para uso com a presente invenção incluem, mas não estão limitados a, fosfato de potássio, acetato de potássio, fosfato de sódio, acetato de sódio, cloreto de zinco e suas combinações.
[00077] Outros sais de metal adequados são mencionados nas re- ferências que seguem: (1) "The Merck Index", 12a Ed., S. Budavari (Editor), Merck & Co., Inc., "Therapeutic Category and Biological Acti- vity Index", p. THER-19 (sob "CHELATING AGENTE"), Whitehouse Station, N.J. (1996) e cada uma e toda sua edição subseqüente até agora; (2) "Remington’s Pharmaceutical Sciences", 16a Ed., Arthur Osol (Editor), Mack Publishing Co., Easton, Pensilvânia (1980) e cada uma e toda sua edição subseqüente até agora; (3) "The United States Pharmacopeia", 21a Revisão (16a Edição), United States Pharmaco- peial Convention, Inc., Rockville, Maryland (1985) e cada uma e toda sua edição subseqüente até agora; (4) SIGMA, "Biochemicals and Re- agents for Life Science Research Catalogue", St. Louis, Missouri (2002-2003); e (5) Aldrich, "Handbook of Fine Chemicals and Labora- tory Equipment", Milwaukee, Wisconsin e suas edições (2000-2001) e (2002-2003).
[00078] Dos sais de metal adequados para uso com a presente in- venção fosfato de sódio, ZnCl2 e suas combinações são também pre- feridos. A quantidade de sal(is) de metal adequado(s) para uso com a presente invenção deve ser aquela quantidade que seja suficiente pa- ra diminuir a impureza da isoforma trissulfeto em pelo menos 10% de sua concentração mais alta (ou sua concentração média mais alta, on- de são feitas médias de bateladas múltiplas) formadas. De preferência, a diminuição na quantidade da impureza na isoforma trissulfeto é pelo menos cerca de 20%, 30%, 40% ou 50%, respectivamente, de sua concentração mais alta (ou sua concentração média mais alta) forma- da. A concentração inicial de sal de metal (por exemplo, fosfato de só- dio) adequada para uso com a presente invenção é de preferência pe- lo menos cerca de 0,1 mM, de a partir de cerca de 1 mM a cerca de 500 mM, de a partir de cerca de 1 mM a cerca de 200 mM, de a partir de cerca de 5 mM a cerca de 175 mM, de a partir de cerca de 10 mM a cerca de 150 mM ou de a partir de cerca de 25 a cerca de 100 mM, respectivamente.
[00079] É preferido prover o sal de metal em um tampão. No entan- to, fosfato de sódio pode agir ambos como um tampão e um sal de metal adequado. No entanto, sal(is) de metal adequado(s) adicional(is) pode(m) ser adicionado(s) ao tampão de fosfato de sódio. De prefe- rência, o tampão é um que é adequado para uso com a presente in- venção, isto é, não previne a formação do componente de proteína B- 2036 ou o degrada assim que ele é formado. Tampões adequados pa- ra uso em conexão com a presente invenção incluem, mas não estão limitados a, Tris, fosfato, HEPES, ácido cítrico, trietilamina e histidina. A concentração de tampão inicial preferida é de a partir de cerca de 1 mM a cerca de 200 mM, com mais preferência de a partir de cerca de 5 mM a cerca de 100 mM, com mais preferência ainda de a partir de cerca de 8 mM a cerca de 70 mM, e com mais preferência de a partir de cerca de 10 mM a cerca de 50 mM. Outros tampões adequados podem ser usados. De preferência, esses tampões são suficientes pa- ra manter o pH do meio de crescimento em qualquer ponto na faixa de a partir de cerca de 4 a cerca de 9, de a partir de cerca de 4,5 a cerca de 5,5 ou de a partir de cerca de 5,5 a cerca de 7,5, respectivamente.
[00080] Após o sal de metal ter sido provido em um tampão (ou no caso de NaP, onde a solução de NaP age ambos como o sal de metal e o tampão) a quantidade do sal de metal no tampão (ou solução de NaP também agindo como o tampão) deve ser tal de modo que a ra- zão molar dos moles de sal de metal para os moles de proteína B- 2036 seja de a partir de cerca de 1 a cerca de 1.000. Alternativamente, a razão molar dos moles do sal de metal para os moles da proteína B- 2036 pode ser de a partir de cerca de 300 a cerca de 10.000, de a par- tir de cerca de 500 a cerca de 5.000, ou de a partir de cerca de 500 a cerca de 2.500, respectivamente.
[00081] Tipicamente, após contato suficiente (para diminuir o nível de impureza da isoforma trissulfeto) entre o(s) sal(is) de metal e o componente da proteína B-2036 (dentro ou a partir da(s) célula(s) hospedeira(s) ter sido completado), o componente da proteína B-2036 no tampão tem uma concentração de a partir de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 20 mg/ml, de a partir de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 5 mg/ml, ou de a partir de cerca de 1 mg/ml a cerca de 5 mg/ml, respec- tivamente.
[00082] Ainda, a faixa de temperatura do meio de crescimento junto com o tampão, o(s) sal(is) de metal e seus outros conteúdos incluindo, mas não limitado a, B-2036, deve ser mantida em uma temperatura de preferência de a partir de cerca de 0o C a cerca de 35° C após o sal de metal ter sido adicionado à(s) célula(s) hospedeira(s) ou seu lisato contendo o componente de proteína B-2036. Também, de preferência, a temperatura da(s) célula(s) hospedeira(s) e/ou seu lisato contendo o componente B-2036 é mantida de a partir de cerca de 1° C a cerca de 15° C, ou de a partir de cerca de 2° C a cerca de 10° C, ou de a partir de cerca de 2° C a cerca de 15° C, respectivamente. Nota-se que, quando da homogeneização com o sal de metal (por exemplo, NaP), a temperatura do homogenato pode aumentar. É importante notar que a desnaturação da proteína B-2036 acontece por volta de +40° C. Desse modo, é desejável manter a temperatura do homogenato (isto é, con- tendo células hospedeiras, meio de crescimento, tampão, sal de metal, B-2036 e opcionalmente composto mercapto, etc.) para uma tempera- tura abaixo da temperatura de desnaturação da proteína de B-2036.
[00083] Ainda, o tempo de contato entre o componente de B-2036 e o agente de quelação deve ser por um tempo suficiente para diminuir o nível da impureza da isoforma de trissulfeto. Tempos de contato ade- quados exemplares para diminuição do nível de impureza da isoforma trissulfeto devem ser por pelo menos cerca de 30 minutos, de a partir de cerca de 1 hora a cerca de 48 horas, ou de a partir de cerca de 5 horas a cerca de 15 horas, respectivamente.
[00084] Tipicamente, após contato suficiente entre o(s) sal(is) de metal e o componente de B-2036, o tampão contendo o mesmo tem um volume de a partir de cerca de 1 litro a cerca de 5.000 litros, de a partir de cerca de 100 litros a cerca de 2.000 litros ou de a partir de cerca de 200 litros a cerca de 1.500, respectivamente.
[00085] Outros parâmetros que podem ser de interesse durante o contato entre o(s) sal(is) de metal e o componente de B-2036 incluem coisas tal como taxa de mistura. A taxa de mistura deve ser aquela que seja suficiente para formar uma mistura homogênea (da(s) célu- la(s) hospedeira(s), seu lisato, tampão, sal(is) de metal, o componente de B-2036 e quaisquer outros componentes no meio de crescimento), enquanto minimizando a quantidade de espumação que pode ser for- mada. Aqueles de habilidade na técnica podem prontamente determi- nar qual taxa de mistura suficiente deve ser. Obviamente, a taxa de mistura deve ser tal de modo que a temperatura seja mantida nas fai- xas acima mencionadas e qualquer degradação do componente da proteína B-2036 seja minimizada.
[00086] Sem desejar ser limitado pela teoria, acredita-se que a adi- ção de agente(s) de quelação ao antagonista de hormônio do cresci- mento humano B-2036 resulte em uma diminuição no nível da impure- za da isoforma des-phe ou através de uma redução atual no seu nível e/ou prevenção de formação de des-phe adicional.
[00087] Tipicamente, o(s) agente(s) de quelação é/são adiciona- do(s) à(s) célula(s) hospedeira(s) que sintetizam o componente da pro- teína B-2036 recombinante desejado durante ou após (ou durante e após) crescimento da(s) célula(s) hospedeira(s). Ainda, após as eta- pas de crescimento e contato terem sido realizadas, é preferido purifi- car a proteína B-2036. Em seguida, a proteína purificada é de prefe- rência peguilada para dar PEG B-2036 (pegvisomant). Quanto a pro- cedimentos de peguilação vide Patente U.S. N° 5.849.535.
[00088] Qualquer agente de quelação pode ser usado em conexão com a presente invenção, o qual, quando contatado (de preferência com mistura adequada) com o componente da proteína B-2036 junto com a sua impureza na isoforma des-phe, é um que é suficiente para diminuir o nível da impureza da isoforma des-phe, de preferência sem degradação (ou substancialmente degradando) do rendimento de B- 2036. Os agentes de quelação preferidos adequados para uso com a presente invenção incluem, mas não estão limitados a, EDTA, EGTA e DTPA. Agentes de quelação exemplares adicionais incluem, mas não estão limitado à Deferoxamina, Ditiocarb de Sódio, Edetato de Cálcio Dissódico, Edetato Dissódico, Edetato de Sódio, Edetato Trissódico, Penicilamina, Pentetato de Cálcio Trissódico, Ácido Pentético, Succí- mero e Trientina. Nota-se que Edetato de Sódio é a forma de sal de EDTA.
[00089] Outros agentes de quelação adequados para uso com a presente invenção são mencionados nas referências que seguem: (1) "The Merck Index", 12a Ed., S. Budavari (Editor), Merck & Co., Inc., "Therapeutic Category and Biological Activity Index", p. THER-19 (sob "CHELATING AGENTE"), Whitehouse Station, N.J. (1996) e cada uma e toda sua edição subseqüente até agora; (2) "Remington’s Pharma- ceutical Sciences", 16a Ed., Arthur Osol (Editor), Mack Publishing Co., Easton, Pensilvânia (1980) e cada uma e toda sua edição subseqüen- te até agora; (3) "The United States Pharmacopeia", 21a Revisão (16a Edição), United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, Maryland (1985) e cada uma e toda sua edição subseqüente até ago- ra; (4) SIGMA, "Biochemicals and Reagents for Life Science Research Catalogue", St. Louis, Missouri (2002-2003); e (5) Aldrich, "Handbook of Fine Chemicals and Laboratory Equipment", Milwaukee, Wisconsin e suas edições (2000-2001) e (2002-2003).
[00090] Dos agentes de quelação adequados, EDTA é o mais pre- ferido. A quantidade de agente de quelação que é adequada para uso com a presente invenção deve ser aquela quantidade que seja sufici- ente para diminuir a impureza da isoforma des-phe em pelo menos cerca de 10% de sua concentração de equilíbrio mais alta (ou sua concentração de equilíbrio média mais alta, onde são tiradas médias de bateladas múltiplas) formada. De preferência, a diminuição na quantidade da impureza da isoforma des-phe é pelo menos cerca de 20%, 30%, 40%, 50%, respectivamente, ou sua concentração de equi- líbrio mais alta (ou sua concentração de equilíbrio média mais alta) formada. A concentração inicial de EDTA adequada para uso com a presente invenção é de preferência pelo menos cerca de 0,01 mM, de a partir de cerca de 0,01 mM a cerca de 10 mM, de a partir de cerca de 0,1 mM a cerca de 20 mM, de a partir de cerca de 2 mM a cerca de 10 mM ou de a partir de cerca de 2 a cerca de 5 mM, respectivamente.
[00091] É preferido prover o agente de quelação em um tampão. De preferência, o tampão é um que é adequado para uso com a presente invenção, isto é, não previne a formação do componente de proteína B-2036 ou o degrada assim que ele é formado. Tampões adequados para uso em conexão com a presente invenção incluem, mas não es- tão limitados a, Tris, fosfato, HEPES, ácido cítrico, trietilamina e histi- dina. O tampão preferido é Tris. A concentração de tampão inicial pre- ferida é de a partir de cerca de 1 mM a cerca de 200 mM, com mais preferência de a partir de cerca de 5 mM a cerca de 100 mM, com mais preferência ainda de a partir de cerca de 8 mM a cerca de 70 mM, e com mais preferência de a partir de cerca de 10 mM a cerca de 50 mM. Outros tampões adequados podem ser usados. De preferên- cia, esses tampões são suficientes para manter o pH do meio de cres- cimento em qualquer ponto na faixa de a partir de cerca de 6 a cerca de 9, de a partir de cerca de 6,5 a cerca de 7,5 ou de a partir de cerca de 7,2 a cerca de 7,5, respectivamente.
[00092] Conforme acima mencionado, é preferido prover o agente de quelação em um tampão. Ainda, a quantidade do agente de quela- ção no tampão deve ser tal de modo que a razão molar dos moles de agente de quelação para os moles de proteína B-2036 seja de a partir de cerca de 1 a cerca de 1.000. Alternativamente, a razão molar de moles de agente de quelação para moles de proteína B-2036 pode ser de a partir de cerca de 20 a cerca de 1.000, de a partir de cerca de 50 a cerca de 250, ou de a partir de cerca de 60 a cerca de 110, respecti- vamente.
[00093] Tipicamente, após contato suficiente (para diminuir o nível de impureza da isoforma des-phe) entre o agente de quelação e o componente da proteína B-2036 (dentro ou a partir da(s) célula(s) hospedeira(s) ter sido completada(s)), o componente da proteína B- 2036 no tampão tem uma concentração de a partir de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 20 mg/ml, de a partir de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 5 mg/ml, ou de a partir de cerca de 1 mg/ml a cerca de 5 mg/ml, respectivamente.
[00094] Ainda, a faixa de temperatura do meio de crescimento junto com o tampão, o(s) agente(s) de quelação e seus outros conteúdos incluindo, mas não limitado a, B-2036, deve ser mantida em uma tem- peratura de preferência de a partir de cerca de 0o C a cerca de 35° C após o agente de quelação ter sido adicionado à(s) célula(s) hospedei- ra(s) ou seu lisato contendo o componente de proteína B-2036. Tam- bém, de preferência, a temperatura da(s) célula(s) hospedeira(s) e/ou seu lisato contendo o componente B-2036 é mantida de a partir de cerca de 1° C a cerca de 15° C, ou de a partir de cerca de 2° C a cerca de 10° C, ou de a partir de cerca de 2° C a cerca de 15° C, respecti- vamente. Nota-se que, de preferência, quando da adição do agente de quelação (por exemplo, EDTA), cuja temperatura é cerca de 4° C, a temperatura do homogenato contendo a B-2036 aumenta para cerca de 30° C quando da homogeneização. É importante notar que a des- naturação da proteína B-2036 acontece por volta de +40° C. Desse modo, é desejável manter a temperatura do homogenato (isto é, con- tendo células hospedeiras, meio de crescimento, tampão, agentes de quelação e B-2036, etc.) para uma temperatura abaixo da temperatura de desnaturação de proteína de B-2036.
[00095] Ainda, o tempo de contato entre o componente de B-2036 e o agente de quelação deve ser por um tempo suficiente para diminuir o nível de impureza da isoforma des-phe. Tempos de contato adequa- dos exemplares para diminuição do nível de impureza da isoforma des-phe devem ser por pelo menos cerca de 30 minutos, de a partir de cerca de 1 hora a cerca de 48 horas, ou de a partir de cerca de 5 ho- ras a cerca de 15 horas, respectivamente.
[00096] Tipicamente, após contato suficiente entre o(s) agente(s) de quelação e o componente de B-2036, o tampão contendo o mesmo tem um volume de a partir de cerca de 1 litro a cerca de 5.000 litros, de a partir de cerca de 10 litros a cerca de 500 litros, ou de a partir de cerca de 100 litros a cerca de 300 litros, respectivamente. Outros vo- lumes exemplares adequados podem ser qualquer um de 160 litros a cerca de 500 litros.
[00097] Outros parâmetros que podem ser de interesse durante o contato entre o(s) agente(s) de quelação e o componente de B-2036 incluem coisas tal como taxa de mistura. A taxa de mistura deve ser aquela que seja suficiente para formar uma mistura homogênea (da(s) célula(s) hospedeira(s), seu lisato, tampão, agente(s) de quelação, o componente de B-2036 e quaisquer outros componentes no meio de crescimento), enquanto minimizando a quantidade de espumação que pode ser formada. Aqueles de habilidade na técnica podem pronta- mente determinar qual taxa de mistura suficiente deve ser. Obviamen- te, a taxa de mistura deve ser tal de modo que a temperatura seja mantida nas faixas acima mencionadas e qualquer degradação do componente da proteína B-2036 seja minimizada.
[00098] Sem desejar ser limitado pela teoria, acredita-se que a adi- ção do(s) sal(is) de metal ao antagonista de hormônio do crescimento recombinante B-2036 resulte em uma diminuição do nível de impureza da isoforma des-phe ou através de uma redução real no seu nível e/ou prevenção de mais formação de des-phe.
[00099] Tipicamente, o(s) sal(ais) de metal é/são adicionado(s) às célula(s) hospedeira(s) sintetizando o componente de proteína B-2036 recombinante desejado durante ou após (ou durante e após) cresci- mento da(s) célula(s) hospedeira(s). Ainda, após as etapas de cresci- mento e contato terem sido conduzidas, é preferido purificar a proteína B-2036. Em seguida, a proteína purificada é de preferência peguilada para dar PEG B-2036 (pegvisomant). Quanto a procedimentos de pe- guilação vide Patente U.S. N° 5.849.535.
[000100] Qualquer sal de metal pode ser usado em conexão com a presente invenção, o qual, quando contatado (de preferência com mis- tura adequada) com o componente da proteína B-2036 junto com sua impureza na isoforma des-phe, seja um que seja suficiente para dimi- nuir o nível da impureza na isoforma des-phe, de preferência sem de- gradar (ou substancialmente degradando) o rendimento de B-2036. Sal(is) de metal adequado(s) para uso com a presente invenção inclu- em, mas não estão limitados a, sal(is) de metalalcalino-terroso, sal(is) de metal de transição e suas combinações. Os sais de metal preferi- dos adequados para uso com a presente invenção incluem, mas não estão limitados a, fosfato de potássio, acetato de potássio, fosfato de sódio, acetato de sódio, cloreto de zinco e suas combinações.
[000101] Outros sais de metal adequados são mencionados nas re- ferências que seguem: (1) "The Merck Index", 12a Ed., S. Budavari (Editor), Merck & Co., Inc., "Therapeutic Category and Biological Acti- vity Index", p. THER-19 (sob "CHELATING AGENT"), Whitehouse Sta- tion, N.J. (1996) e cada uma e toda sua edição subseqüente até agora; (2) "Remington’s Pharmaceutical Sciences", 16a Ed., Arthur Osol (Edi- tor), Mack Publishing Co., Easton, Pensilvânia (1980) e cada uma e toda sua edição subseqüente até agora; (3) "The United States Phar- macopeia", 21a Revisão (16a Edição), United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, Maryland (1985) e cada uma e toda sua edição subseqüente até agora; (4) SIGMA, "Biochemicals and Rea- gents for Life Science Research Catalogue", St. Louis, Missouri (2002- 2003); e (5) Aldrich, "Handbook of Fine Chemicals and Laboratory Equipment", Milwaukee, Wisconsin e suas edições (2000-2001) e (2002-2003).
[000102] Dos sais de metal adequados para uso com a presente in- venção fosfato de sódio, ZnCl2 e suas combinações são também pre- feridos. A quantidade de sal(is) de metal adequado(s) para uso com a presente invenção deve ser aquela quantidade que seja suficiente pa- ra diminuir a impureza da isoforma des-phe em pelo menos 10% de sua concentração mais alta (ou sua concentração média mais alta, on- de são feitas médias de bateladas múltiplas) formada. De preferência, a diminuição na quantidade da impureza da isoforma des-phe é pelo menos cerca de 20%, 30%, 40% ou 50%, respectivamente, de sua concentração mais alta (ou sua concentração média mais alta) forma- da. A concentração inicial de sal de metal (por exemplo, fosfato de só- dio) adequada para uso com a presente invenção é de preferência pe- lo menos cerca de 0,1 mM, de a partir de cerca de 1 mM a cerca de 500 mM, de a partir de cerca de 1 mM a cerca de 200 mM, de a partir de cerca de 5 mM a cerca de 175 mM, de a partir de cerca de 10 mM a cerca de 150 mM ou de a partir de cerca de 25 a cerca de 100 mM, respectivamente.
[000103] É preferido prover o sal de metal em um tampão. No entan- to, fosfato de sódio pode agir ambos como um tampão e um sal de metal adequado. No entanto, sal(is) de metal adequado(s) adicional(is) pode(m) ser adicionado(s) ao tampão de fosfato de sódio. De prefe- rência, o tampão é um que seja adequado para uso com a presente invenção, isto é, não degrada a formação do componente de proteína B-2036. Tampões adequados para uso em conexão com a presente invenção incluem, mas não estão limitados a, Tris, fosfato, HEPES, ácido cítrico, trietilamina e histidina. A concentração de tampão inicial preferida é de a partir de cerca de 1 mM a cerca de 200 mM, com mais preferência de a partir de cerca de 5 mM a cerca de 100 mM, com mais preferência ainda de a partir de cerca de 8 mM a cerca de 70 mM, e com mais preferência de a partir de cerca de 10 mM a cerca de 50 mM. Outros tampões adequados podem ser usados. De preferên- cia, esses tampões são suficientes para manter o pH do meio de cres- cimento em qualquer ponto na faixa de a partir de cerca de 4 a cerca de 9, de a partir de cerca de 4,5 a cerca de 5,5 ou de a partir de cerca de 5,5 a cerca de 7,5, respectivamente.
[000104] Após o sal de metal ter sido provido em um tampão (ou no caso de NaP, onde a solução de NaP age ambos como o sal de metal e o tampão) a quantidade do sal de metal no tampão (ou solução de NaP também agindo como o tampão) deve ser tal de modo que a ra- zão molar dos moles de sal de metal para os moles de proteína B- 2036 seja de a partir de cerca de 1 a cerca de 1.000. Alternativamente, a razão molar dos moles do sal de metal para os moles da proteína B- 2036 pode ser de a partir de cerca de 300 a cerca de 10.000, de a par- tir de cerca de 500 a cerca de 5.000, ou de a partir de cerca de 500 a cerca de 2.500, respectivamente.
[000105] Tipicamente, após contato suficiente (para diminuir o nível de impureza da isoforma des-phe) entre o(s) sal(is) de metal e o com- ponente da proteína B-2036 (dentro ou a partir da(s) célula(s) hospe- deira(s) ter sido completado), o componente da proteína B-2036 no tampão tem uma comcentração de a partir de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 20 mg/ml, de a partir de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 5 mg/ml, ou de a partir de cerca de 1 mg/ml a cerca de 5 mg/ml, respec- tivamente.
[000106] Ainda, a faixa de temperatura do meio de crescimento junto com o tampão, o(s) sal(is) de metal e seus outros conteúdos incluindo, mas não limitado a, B-2036, deve ser mantida em uma temperatura de preferência de a partir de cerca de 0o C a cerca de 35° C após o sal de metal ter sido adicionado à(s) célula(s) hospedeira(s) ou seu lisato contendo o componente de proteína B-2036. Também, de preferência, a temperatura da(s) célula(s) hospedeira(s) e/ou seu lisato contendo o componente B-2036 é mantida de a partir de cerca de 1° C a cerca de 15° C, ou de a partir de cerca de 2° C a cerca de 10° C, ou de a partir de cerca de 2° C a cerca de 15° C, respectivamente. Nota-se que, quando da homogeneização com o sal de metal (por exemplo, NaP) a temperatura do homogenato pode aumentar. É importante notar que a desnaturação da proteína B-2036 acontece por volta de +40° C. Desse modo, é desejável manter a temperatura do homogenato (isto é, con- tendo células hospedeiras, meio de crescimento, tampão, sal de metal, B-2036 e opcionalmente composto mercapto, etc) para uma tempera- tura abaixo da temperatura de desnaturação de proteína de B-2036. Ainda, o tempo de contato entre o componente de B-2036 e o agente de quelação deve ser por um tempo suficiente para diminuir o nível de impureza da isoforma des-phe. Tempos de contato adequados exem- plares para diminuição do nível de impureza da isoforma des-phe de- vem ser por pelo menos cerca de 30 minutos, de a partir de cerca de 1 hora a cerca de 48 horas, ou de a partir de cerca de 5 horas a cerca de 15 horas, respectivamente.
[000107] Tipicamente, após contato suficiente entre o(s) sal(is) de metal e o componente de B-2036, o tampão contendo o mesmo tem um volume de a partir de cerca de 1 litro a cerca de 5.000 litros, de a partir de cerca de 100 litros a cerca de 2.000 litros ou de a partir de cerca de 200 litros a cerca de 1.500, respectivamente.
[000108] Outros parâmetros que podem ser de interesse durante o contato entre o(s) sal(is) de metal e o componente de B-2036 incluem coisas tal como taxa de mistura. A taxa de mistura deve ser aquela que seja suficiente para formar uma mistura homogênea (da(s) célu- la(s) hospedeira(s), seu lisato, tampão, sal(is) de metal, o componente de B-2036 e quaisquer outros componentes no meio de crescimento), enquanto minimizando a quantidade de espumação que pode ser for- mada. Aqueles de habilidade na técnica podem prontamente determi- nar qual taxa de mistura suficiente deve ser. Obviamente, a taxa de mistura deve ser tal de modo que a temperatura seja mantida nas fai- xas acima mencionadas e qualquer degradação do componente da proteína B-2036 seja minimizada.
[000109] Sem desejar ser limitado pela teoria, acredita-se que a adi- ção de agente(s) de quelação ao hormônio do crescimento recombi- nante resulte em uma diminuição no nível de impureza da isoforma des-phe ou através de redução real no seu nível e/ou prevenção de mais formação de des-phe.
[000110] Tipicamente, o(s) agente(s) de quelação é/são adiciona- do(s) às células hospedeiras que sintetizam a proteína de hormônio do crescimento recombinante desejado durante ou após (ou durante e após) crescimento da(s) célula(s) hospedeira(s). Ainda, após as eta- pas de crescimento e contato terem sido realizadas, é preferido purifi- car a proteína de hormônio do crescimento.
[000111] Qualquer agente de quelação pode ser usado em conexão com a presente invenção, o qual, quando contactado (de preferência com mistura adequada) com a proteína de hormônio do crescimento junto com a sua impureza da isoforma des-phe, é um que seja sufici- ente para diminuir o nível da impureza na isoforma des-phe, de prefe- rência sem degradação (ou substancialmente degradando) do rendi- mento do hormônio de crescimento. Os agentes de quelação preferi- dos adequados para uso com a presente invenção incluem, mas não estão limitados à EDTA, EGTA e DTPA. Agentes de quelação exem- plares adicionais incluem, mas não estão limitados à Deferoxamina, Ditiocarb de Sódio, Edetato de Cálcio Dissódico, Edetato Dissódico, Edetato de Sódio, Edetato Trissódico, Penicilamina, Pentetato de Cál- cio Trissódico, Ácido Pentético, Succímero e Trientina. Nota-se que Edetato de Sódio é a forma de sal de EDTA.
[000112] Outros agentes de quelação adequados para uso com a presente invenção são mencionados nas referências que seguem: (1) "The Merck Index", 12a Ed., S. Budavari (Editor), Merck & Co., Inc., "Therapeutic Category and Biological Activity Index", p. THER-19 (sob "CHELATING AGENTE"), Whitehouse Station, N.J. (1996) e cada uma e toda sua edição subseqüente até agora; (2) "Remington’s Pharma- ceutical Sciences", 16a Ed., Arthur Osol (Editor), Mack Publishing Co., Easton, Pensilvânia (1980) e cada uma e toda sua edição subseqüen- te até agora; (3) "The United States Pharmacopeia", 21a Revisão (16a Edição), United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, Maryland (1985) e cada uma e toda sua edição subseqüente até ago- ra; (4) SIGMA, "Biochemicals and Reagents for Life Science Research Catalogue", St. Louis, Missouri (2002-2003); e (5) Aldrich, "Handbook of Fine Chemicals and Laboratory Equipment", Milwaukee, Wisconsin e suas edições (2000-2001) e (2002-2003).
[000113] Dos agentes de quelação adequados, EDTA é o mais pre- ferido. A quantidade de agente de quelação que é adequada para uso com a presente invenção deve ser aquela quantidade que seja sufici- ente para diminuir a impureza da isoforma des-phe em pelo menos cerca de 10% de sua concentração de equilíbrio mais alta (ou sua concentração de equilíbrio média mais alta, onde são tiradas médias de bateladas múltiplas) formada. De preferência, a diminuição na quantidade de impureza da isoforma des-phe é pelo menos cerca de 20%, 30%, 40%, 50%, respectivamente, ou sua concentração de equi- líbrio mais alta (ou sua concentração de equilíbrio média mais alta) formada. A concentração inicial de EDTA adequada para uso com a presente invenção é de preferência pelo menos cerca de 0,01 mM, de a partir de cerca de 0,01 mM a cerca de 100 mM, de a partir de cerca de 0,1 mM a cerca de 20 mM, de a partir de cerca de 2 mM a cerca de 10 mM ou de a partir de cerca de 2 a cerca de 5 mM, respectivamente.
[000114] É preferido prover o agente de quelação em um tampão. De preferência, o tampão é um que é adequado para uso com a presente invenção, isto é, não previne a formação do componente de proteína B-2036 ou o degrada assim que ele é formado. Tampões adequados para uso em conexão com a presente invenção incluem, mas não es- tão limitados a, Tris, fosfato, HEPES, ácido cítrico, trietilamina e histi- dina. O tampão preferido é Tris. A concentração de tampão inicial pre- ferida é de a partir de cerca de 1 mM a cerca de 200 mM, com mais preferência de a partir de cerca de 5 mM a cerca de 100 mM, com mais preferência ainda de a partir de cerca de 8 mM a cerca de 70 mM, e com mais preferência de a partir de cerca de 10 mM a cerca de 50 mM. Outros tampões adequados podem ser usados. De preferên- cia, esses tampões são suficientes para manter o pH do meio de cres- cimento em qualquer ponto na faixa de a partir de cerca de 6 a cerca de 9, de a partir de cerca de 6,5 a cerca de 7,5 ou de a partir de cerca de 7,2 a cerca de 7,5, respectivamente.
[000115] Conforme acima mencionado, é preferido prover o agente de quelação em um tampão. Ainda, a quantidade do agente de quela- ção no tampão deve ser tal de modo que a razão molar dos moles de agente de quelação para os moles de proteína de hormônio do cres- cimento (por exemplo, hGH) seja de a partir de cerca de 1 a cerca de 1.000. Alternativamente, a razão molar de moles de agente de quela- ção para moles de proteína de hormônio do crescimento (por exemplo, hGH) pode ser de a partir de cerca de 20 a cerca de 1.000, de a partir de cerca de 50 a cerca de 250, ou de a partir de cerca de 60 a cerca de 110, respectivamente.
[000116] Tipicamente, após contato suficiente (para diminuir o nível de impureza da isoforma des-phe) entre o agente de quelação e a pro- teína de hormônio do crescimento (por exemplo, hGH) (dentro ou a partir da(s) célula(s) hospedeira(s) ter sido completada(s)), a proteína de hormônio do crescimento (por exemplo, hGH) no tampão tem uma concentração de a partir de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 20 mg/ml, de a partir de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 5 mg/ml, ou de a partir de cerca de 1 mg/ml a cerca de 5 mg/ml, respectivamente.
[000117] Ainda, a faixa de temperatura do meio de crescimento junto com o tampão, o(s) agente(s) de quelação e seus outros conteúdos incluindo, mas não limitado à proteína de hormônio do crescimento, deve ser mantida em uma temperatura de preferência de a partir de cerca de 0o C a cerca de 35° C após o agente de quelação ter sido adicionado à(s) célula(s) hospedeira(s) ou seu lisato contendo a prote- ína de hormônio do crescimento. Também, de preferência, a tempera- tura da(s) célula(s) hospedeira(s) e/ou seu lisato contendo o compo- nente a proteína de hormônio do crescimento é mantida de a partir de cerca de 1° C a cerca de 15° C, ou de a partir de cerca de 2° C a cerca de 10° C, ou de a partir de cerca de 2° C a cerca de 15° C, respecti- vamente. Nota-se que, de preferência, quando da adição do agente de quelação (por exemplo, EDTA), cuja temperatura é cerca de 4° C, a temperatura do homogenato contendo o hormônio do crescimento au- menta para cerca de 30° C quando da homogeneização. É importante notar que a desnaturação da proteína de hormônio do crescimento acontece por volta de +40° C. Desse modo, é desejável manter a tem- peratura do homogenato (isto é, contendo células hospedeiras, meio de crescimento, tampão, agentes de quelação e a proteína de hormô- nio do crescimento, etc.) para uma temperatura abaixo da temperatura de desnaturação da proteína da proteína de hormônio do crescimento. Ainda, o tempo de contato entre a proteína de hormônio do crescimen- to e o agente de quelação deve ser por um tempo suficiente para dimi- nuir o nível da impureza na isoforma des-phe. Tempos de contato adequados exemplares para diminuição do nível da impureza na iso- forma des-phe devem ser por pelo menos cerca de 30 minutos, de a partir de cerca de 1 hora a cerca de 48 horas, ou de a partir de cerca de 5 horas a cerca de 15 horas, respectivamente.
[000118] Tipicamente, após contato suficiente entre o(s) agente(s) de quelação e a proteína de hormônio do crescimento, o tampão conten- do o mesmo tem um volume de a partir de cerca de 1 litro a cerca de 5.000 litros, de a partir de cerca de 10 litros a cerca de 500 litros, ou de a partir de cerca de 100 litros a cerca de 300 litros, respectivamente. Outros volumes exemplares adequados podem ser qualquer um de 160 litros a cerca de 500 litros.
[000119] Outros parâmetros que podem ser de interesse durante o comtato entre o(s) agente(s) de quelação e a proteína de hormônio do crescimento incluem coisas tal como taxa de mistura. A taxa de mistu- ra deve ser aquela que seja suficiente para formar uma mistura homo- gênea (da(s) célula(s) hospedeira(s), seu lisato, tampão, agente(s) de quelação, a proteína de hormônio do crescimento e quaisquer outros componentes no meio de crescimento), enquanto minimizando a quan- tidade de espumação que pode ser formada. Aqueles de habilidade na técnica podem prontamente determinar qual taxa de mistura suficiente deve ser. Obviamente, a taxa de mistura deve ser tal de modo que a temperatura seja mantida nas faixas acima mencionadas e qualquer degradação do componente da proteína B-2036 seja minimizada.
[000120] Sem desejar ser limitado pela teoria, acredita-se que a adi- ção do(s) sal(is) de metal ao hormônio do crescimento recombinante resulte em uma diminuição no nível de impureza da isoforma des-phe através de uma redução real no seu nível e/ou prevenção de mais formação de des-phe.
[000121] Tipicamente, o(s) sal(ais) de metal é/são adicionado(s) às célula(s) hospedeira(s) sintetizando o componente de proteína de hormônio do crescimento recombinante desejado durante ou após (ou durante e após) crescimento da(s) célula(s) hospedeira(s). Ainda, após as etapas de crescimento e contato terem sido conduzidas, é preferido purificar a proteína do hormônio do crescimento.
[000122] Qualquer sal de metal pode ser usado em conexão com a presente invenção que, quando contatado (de preferência com mistura adequada) com o componente da proteína do hormônio do crescimen- to junto com a impureza da isoforma des-phe, é um que seja suficiente para diminuir o nível da impureza da isoforma des-phe, de preferência sem degradar (ou substancialmente degradando) o rendimento do hormônio do crescimento. Sal(is) de metal adequado(s) para uso com a presente invenção incluem, mas não estão limitados a, sal(is) de me- tal alcalino-terroso, sal(is) de metal de transição e suas combinações. Os sais de metal preferidos adequados para uso com a presente in- venção incluem, mas não estão limitados a, fosfato de potássio, aceta- to de potássio, fosfato de sódio, acetato de sódio, cloreto de zinco e suas combinações.
[000123] Outros sais de metal adequados são mencionados nas re- ferências que seguem: (1) "The Merck Index", 12a Ed., S. Budavari (Editor), Merck & Co., Inc., "Therapeutic Category and Biological Acti- vity Index", p. THER-19 (sob "CHELATING AGENT"), Whitehouse Sta- tion, N.J. (1996) e cada uma e toda sua edição subseqüente até agora; (2) "Remington’s Pharmaceutical Sciences", 16a Ed., Arthur Osol (Edi- tor), Mack Publishing Co., Easton, Pensilvânia (1980) e cada uma e toda sua edição subseqüente até agora; (3) "The United States Phar- macopeia", 21a Revisão (16a Edição), United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, Maryland (1985) e cada uma e toda sua edição subseqüente até agora; (4) SIGMA, "Biochemicals and Rea- gents for Life Science Research Catalogue", St. Louis, Missouri (2002- 2003); e (5) Aldrich, "Handbook of Fine Chemicals and Laboratory Equipment", Milwaukee, Wisconsin e suas edições (2000-2001) e (2002-2003).
[000124] Dos sais de metal adequados para uso com a presente in- venção fosfato de sódio, ZnCl2 e suas combinações são também pre- feridos. A quantidade de sal(is) de metal adequado(s) para uso com a presente invenção deve ser aquela quantidade que seja suficiente pa- ra diminuir a impureza da isoforma des-phe em pelo menos 10% de sua concentração mais alta (ou sua concentração média mais alta, on- de são feitas médias de bateladas múltiplas) formada. De preferência, a diminuição na quantidade da impureza na isoforma des-phe é pelo menos cerca de 20%, 30%, 40% ou 50%, respectivamente, de sua concentração mais alta (ou sua concentração média mais alta) forma- da. A concentração inicial de sal de metal (por exemplo, fosfato de só- dio) adequada para uso com a presente invenção é de preferência pe- lo menos cerca de 0,1 Mm, de a partir de cerca de 1 Mm a cerca de 500 Mm, de a partir de cerca de 1 Mm a cerca de 200 Mm, de a partir de cerca de 5 Mm a cerca de 175 Mm, de a partir de cerca de 10 Mm a cerca de 150 Mm ou de a partir de cerca de 25 a cerca de 100 Mm, respectivamente.
[000125] É preferido prover o sal de metal em um tampão. No entan- to, fosfato de sódio pode agir ambos como um tampão e um sal de metal adequando. No entanto, sal(is) de metal adequado(s) adicio- nal(is) podem ser adicionados ao tampão de fosfato de sódio. De pre- ferência, o tampão é um que seja adequado para uso com a presente invenção, isto é, não previne a formação do componente de proteína B-2036 ou o degrada assim que ele é formado. Tampões adequados para uso em conexão com a presente invenção incluem, mas não es- tão limitados a, Tris, fosfato, HEPES, ácido cítrico, trietilamina e histi- dina. A concentração de tampão inicial preferida é de a partir de cerca de 1 Mm a cerca de 200 Mm, com mais preferência de a partir de cer- ca de 5 Mm a cerca de 100 Mm, com mais preferência ainda de a par- tir de cerca de 8 Mm a cerca de 70 Mm, e com mais preferência de a partir de cerca de 10 Mm a cerca de 50 Mm. Outros tampões adequa- dos podem ser usados. De preferência, esses tampões são suficientes para manter o Ph do meio de crescimento em qualquer ponto na faixa de a partir de cerca de 4 a cerca de 9, de a partir de cerca de 4,5 a cerca de 5,5 ou de a partir de cerca de 5,5 a cerca de 7,5, respectiva- mente.
[000126] Após o sal de metal ter sido provido em um tampão (ou no caso de NaP, onde a solução de NaP age ambos como o sal de metal e o tampão), a quantidade do sal de metal no tampão (ou solução de NaP também agindo como o tampão) deve ser tal de modo que a ra- zão molar dos moles de sal de metal para os moles de proteína de hormônio do crescimento (por exemplo, Hgh) seja de a partir de cerca de 1 a cerca de 1.000. Alternativamente, a razão molar dos moles do sal de metal para os moles da proteína de hormônio do crescimento (por exemplo, Hgh) pode ser de a partir de cerca de 300 a cerca de 10.000, de a partir de cerca de 500 a cerca de 5.000, ou de a partir de cerca de 500 a cerca de 2.500, respectivamente.
[000127] Tipicamente, após contato suficiente (para diminuir o nível de impureza da isoforma des-phe) entre o(s) sal(is) de metal e o com- ponente da proteína de hormônio do crescimento (por exemplo, Hgh) (dentro ou a partir da(s) célula(s) hospedeira(s) ter sido completado), a proteína de hormônio do crescimento (por exemplo, Hgh) no tampão tem uma concentração de a partir de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 20 mg/ml, de a partir de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 5 mg/ml, ou de a partir de cerca de 1 mg/ml a cerca de 5 mg/ml, respectivamente.
[000128] Ainda, a faixa de temperatura do meio de crescimento junto com o tampão, o(s) sal(is) de metal e seus outros conteúdos incluindo, mas não limitado à proteína de hormônio do crescimento, deve ser mantida em uma temperatura de preferência de a partir de cerca de 0o C a cerca de 35° C após o sal de metal ter sido adicionado à(s) célu- la(s) hospedeira(s) ou seu lisato contendo o componente a proteína de hormônio do crescimento. Também, de preferência, a temperatura da(s) célula(s) hospedeira(s) e/ou seu lisato contendo a proteína de hormônio do crescimento é mantida de a partir de cerca de 1° C a cer- ca de 15° C, ou de a partir de cerca de 2° C a cerca de 10° C, ou de a partir de cerca de 2° C a cerca de 15° C, respectivamente. Nota-se que, quando da homogeneização com o sal de metal (por exemplo, NaP), a temperatura do homogenato pode aumentar. É importante no- tar que a desnaturação da proteína de hormônio do crescimento acon- tece por volta de +40° C. Desse modo, é desejável manter a tempera- tura do homogenato (isto é, contendo células hospedeiras, meio de crescimento, tampão, sal de metal, proteína de hormônio do cresci- mento e opcionalmente composto mercapto, etc.) para uma temperatu- ra abaixo da temperatura de desnaturação de proteína de hormônio do crescimento.
[000129] Adicionalmente, o tempo de contato entre a proteína de hormônio do crescimento e o sal de metal deve ser por um tempo sufi- ciente para diminuir o nível de impureza da isoforma des-phe. Tempos de contato adequados exemplares para diminuição do nível da impu- reza na isoforma des-phe devem ser por pelo menos cerca de 30 mi- nutos, de a partir de cerca de 1 hora a cerca de 48 horas, ou de a par- tir de cerca de 5 horas a cerca de 15 horas, respectivamente. Tipicamente, após contato suficiente entre o(s) sal(is) de metal e a pro- teína de hormônio do crescimento, o tampão contendo o mesmo tem um volume de a partir de cerca de 1 litro a cerca de 5.000 litros, de a partir de cerca de 100 litros a cerca de 2.000 litros ou de a partir de cerca de 200 litros a cerca de 1.500, respectivamente.
[000130] Outros parâmetros que podem ser de interesse durante o contato entre o(s) sal(is) de metal e a proteína de hormônio do cresci- mento incluem coisas tal como taxa de mistura. A taxa de mistura deve ser aquela que seja suficiente para formar uma mistura homogênea (da(s) célula(s) hospedeira(s), seu lisato, tampão, sal(is) de metal, a proteína de hormônio do crescimento e quaisquer outros componentes no meio de crescimento), enquanto minimizando a quantidade de es- pumação que pode ser formada. Aqueles de habilidade na técnica po- dem prontamente determinar qual taxa de mistura suficiente deve ser. Obviamente, a taxa de mistura deve ser tal de modo que a temperatu- ra seja mantida nas faixas acima mencionadas e qualquer degradação do componente da proteína de hormônio do crescimento seja minimi- zada. 4. Polipeptídeo Peguilado e seu Agregado a. Diminuição de Agregado com Cromatografia de Troca de Ânion
[000131] Na fabricação e purificação de B-2036 PEG, o intermediário bruto ou molécula de B-2036 é preparado conforme acima menciona- do. Em seguida, a molécula de B-2036 é processada de acordo com as seis etapas que seguem para dar API final que seja a proteína B- 2036 PEG de interesse. Essas seis etapas são como segue: 1. peguilação para dar B-2036 peguilada, 2. cromatografia de HIC (etapa opcional) para dar um grupo de HIC, 3. ultrafiltragem/diafiltragem (etapa opcional) para dar um grupo de diafiltragem, 4. cromatografia de AEX junto com agrupamento para dar um grupo de AEX, 5. diafiltragem do grupo de AEX para dar um grupo de dia- filtragem, e 6. filtragem de API (para propósitos de esterilização, de pre- ferência através de um filtro de 0,22 mícron em garrafas de coleta para congelamento) para dar um API final.
[000132] As etapas 1-6 acima mencionadas são exemplares e des- critas no fluxograma 1 e Exemplo 1.
[000133] Com referência à etapa 1, a etapa de peguilação realiza a primeira etapa da invenção reivindicada de provisão de isoformas de proteína peguilada de interesse. Em seguida, a etapa 2 de HIC e a etapa 3 de diafiltragem subseqüentes, ambas são consideradas opcio- nais, são de preferência conduzidas para remover qualquer proteína não-peguilada, moléculas PEG livres ou quaisquer outras impurezas que possam ser removidas durante a etapa 2. Após a etapa 3, o grupo de diafiltragem da etapa 3 é então submetido à cromatografia de troca de ânion da etapa 4 para separar as isoformas PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9 que são então subse- qüentemente agrupadas para de preferência enriquecer o nível de iso- formas PEG-4, PEG-5 e PEG-6 para um produto final para processa- mento adicional na etapa 5 da diafiltragem a ser seguida pela filtragem de esterilização da etapa 6 para dar um produto API final.
[000134] Com referência agora novamente à etapa 1 de peguilação, a molécula de B-2036 é submetida a condições eficientes para pegui- lação da própria molécula B-2036 em B-2036 PEG incluindo as iso- formas PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9. Os parâmetros de peguilação preferidos são providos no flu- xograma 1 e Exemplo 1. A molécula de B-2036 e quaisquer outras mo- léculas às quais moléculas de PEG podem ser ligadas, de preferência, através de ligação covalente são moléculas de PEG selecionadas do grupo consistindo em PEG-N-hidroxissuccinimida-5K, PEG-carbonato de succinimidila 5K-, PEG-propionato de succinimidila 5K, PEG- malemida-40K (2 x 20K), PEG2-N-hidroxissuccinimida-40K (2 x 20K) e PEG2-aldeído-40K (2x20K). A quantidade da molécula PEG adiciona- da à molécula B-2036 para peguilação (ou qualquer outra proteína de interesse que necessite ser peguilada) deve ser tal que a razão de pe- so estequiométrica da quantidade de moléculas de PEG livres (não- ligadas) para a quantidade de moléculas de proteína não-peguilada seja de a partir de cerca de 0,5 a cerca de 100, de preferência de a partir de cerca de 1,5 a cerca de 2,5, com mais preferência de a partir de cerca de 1,9 a cerca de 2, e com mais preferência de a partir de cerca de 1,95 a cerca de 2,05. Durante a peguilação, a molécula de B- 2036 (ou qualquer outra proteína de interesse a ser peguilada) é pe- guilada em um pH de peguilação de a partir de cerca de 3 a cerca de 10, de preferência de a partir de cerca de 7,2 a cerca de 7,8, com mais preferência de a partir de cerca de 7,4 a cerca de 7,8, e com mais pre- ferência de a partir de 7,40 a cerca de 7,80. A temperatura na qual a etapa de peguilação é conduzida é referida como a temperatura de peguilação. A temperatura de peguilação é de a partir de cerca de 0o C a cerca de 40° C, de preferência de a partir de cerca de 10° C a cerca de 30° C e com mais preferência de a partir de cerca de 18° C a cerca de 25° C.
[000135] Com referência agora à etapa 2 de HIC opcional, os parâ- metros preferidos para condução desta etapa são providos no Exem- plo 1 e no fluxograma 1. Durante a etapa 2 de cromatografia de HIC, a proteína peguilada e qualquer proteína peguilada são carregadas na resina de HIC em uma carga de HIC de < cerca de 10 g de proteína por litro de volume de leito embalado de resina de HIC, de preferência < cerca de 5 gramas de proteína por litro de volume de leito embalado de resina de HIC, ou < cerca de 4,1 de proteína por litro de volume embalado de resina de HIC. Também, a condutividade de carregamen- to de HIC é de a partir de cerca de 30 a cerca de 60 mS/cm, de prefe- rência de a partir de cerca de 40 a cerca de 52 mS/cm, ou com mais preferência de a partir de cerca de 45 a cerca de 51 mS/cm. Ainda, a etapa de HIC é conduzida em uma temperatura de HIC de a partir de cerca de 10 a cerca de 40° C, de preferência de a partir de cerca de 15 a cerca de 30° C e com mais preferência de a partir de cerca de 18 a cerca de 25° C. A etapa 2 de HIC opcional remove pelo menos um pouco de PEG livre, proteína não-peguilada e agregado, respectiva- mente, presente no carregamento de HIC.
[000136] Seguindo a etapa 2 de HIC, um grupo de HIC é obtido. O grupo de HIC é então submetido a uma etapa 3 de ultrafiltra- gem/diafiltragem que é opcional no sentido que se a etapa 2 de HIC for realizada, então as etapas de ultrafiltragem/diafiltragem são tam- bém realizadas. No entanto, se a etapa 2 de HIC não for realizada, en- tão não há nenhuma necessidade de realizar a etapa 3 de ultrafiltra- gem/diafiltragem. Alternativamente, a etapa 3 de ultrafiltra- gem/diafiltragem pode ser ainda realizada na ausência de etapa 2 de HIC opcional. As condições preferidas sob as quais a etapa 3 de ultra- filtragem/diafiltragem é realizada são mencionadas no Exemplo 1 e no fluxograma 1. Aqui, é referido a esta etapa como UF/DF N° 3. A etapa UF/DF N° 3 é realizada com uma membrana de UF/DF N° 3 tendo uma diminuição no peso molecular (MWCO) de a partir de cerca de 3 kDa a cerca de 20 kDa, de preferência de a partir de cerca de 8 kDa a cerca de 15 kDa, com mais preferência de a partir de cerca de 10 kDa a cer- ca de 12 kDa e com mais preferência de a partir de cerca de 10 kDa.
[000137] Após a etapa 3, o produto obtido neste ponto é referido co- mo o grupo de diafiltragem. Este grupo de diafiltragem é então subme- tido à etapa 4 que é a etapa de cromatografia de troca de ânion e de agrupamento. As condições preferidas para realização desta etapa de cromatografia de AEX e agrupamento são providas no Exemplo 1 e no fluxograma 1. O agrupamento de diafiltragem da etapa anterior (isto é, etapa 3) ou a proteína peguilada (por exemplo, B-2036 PEG da etapa 1, se as etapas 2 e 3 não tiverem sido realizadas) é submetido à etapa 4. Na realidade, sem o processamento de HIC da etapa 2, o agrupa- mento de diafiltragem da etapa 3 contendo B-2036 PEG ou a B-2036 PEG da etapa 1 é carregado em uma resina de troca de ânion junto com qualquer PEG livre, qualquer proteína peguilada, proteína não- peguilada, proteína parcialmente peguilada e qualquer impureza (tal como a impureza trissulfeto ou a impureza des-phe) e qualquer seu agregado.
[000138] De preferência, a resina usada é uma resina de troca de ânion (AEX). As resinas de AEX preferidas incluem, mas não estão limitadas a, ANX4, DEAE, Q-Sepharose, S-Sepharose FF, Q- Sepharose HP e Q-Sepharose XL. A resina de AEX preferida é Q- Sepharose FF.
[000139] De preferência, a resina de AEX compreende grupos funci- onais selecionados do grupo consistindo em aminas primárias, secun- dárias, terciárias, quaternárias e suas combinações. Adicionalmente, a resina de AEX compreende grupos funcionais selecionados do grupo consistindo em grupos dietilaminoetila, dietilaminopropila, dimetiletano- lamina, trimetil-amônio-etila, trimetilbenzil amônio, dimetiletanol benzila e poliamina funcionais. Ainda, a resina de AEX de preferência com- preende um material de apoio selecionado do grupo consistindo em poliéter hidrofóbico, poliestireno divinil benzeno ligado com cruzamen- to, agarose ligada com cruzamento, polipropileno, acrilamidovinila hi- drofílica, metacrílico, hidrogel polimerizado com uma base de conta de cerâmica, material de sílica compósita-dextrano, sílica enxertada com polímero, estireno divinil benzeno, poliacrílico divinil benzeno, celulose reticulada, metacrilato de co-polímero, poliestireno, acrílico, gel hidrofí- lico G5000 e celulose. Também, é preferido usar uma resina de AEX que compreenda uma resina macroporosa ou uma resina de gel. Tipi- camente, o material de apoio tem um diâmetro de a partir de cerca de 10 a cerca de 500 μm e de preferência cerca de 30 μm.
[000140] O carregamento de AEX é realizado em uma condutividade de carregamento de AEX que é < cerca de 10 mS/cm, de preferência < cerca de 5 mS/cm e com mais preferência < cerca de 2,4 mS/cm. A resina de AEX é carregada em um pH de carregamento de AEX de a partir de cerca de 5 a cerca de 10, de preferência de a partir de cerca de 6,6 a cerca de 9, com mais preferência de a partir de cerca de 6,9 a cerca de 7,1.
[000141] A carga da proteína peguilada incluindo qualquer impureza tal como a impureza trissulfeto ou a impureza des-phe ou seu agrega- do é tal de modo que a carga de AEX seja < 10 g de proteína/L de vo- lume de leito embalado de resina de AEX, de preferência < 5,5 g de proteína/L de volume de leito embalado de resina de AEX, com mais preferência < cerca de 4,1 de proteína/L de volume de leito embalado de resina de AEX.
[000142] De acordo com uma modalidade, a proteína peguilada que é carregada na resina de AEX ou que é provida na primeira etapa de provisão de uma proteína peguilada inclui uma ou mais isoformas de proteína peguilada, PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8, PEG-9 e qualquer agregado, impureza trissulfeto e im- pureza des-phe dela e qualquer impureza não-peguilada da proteína peguilada e quaisquer moléculas de PEG livres.
[000143] De acordo com uma outra modalidade, a proteína peguilada que é carregada na resina de AEX ou que é provida na primeira etapa de provisão de uma proteína peguilada inclui uma ou mais isoformas de proteína peguilada, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e qualquer agregado, impureza trissulfeto e impureza des-phe dela e qualquer impureza não-peguilada da proteína peguilada e quaisquer moléculas de PEG livres.
[000144] De acordo com uma outra modalidade, a proteína peguilada que é carregada na resina de AEX ou que é provida na primeira etapa de provisão de uma proteína peguilada inclui uma ou mais isoformas da proteína peguilada, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e qualquer agregado, impureza trissulfeto e impureza des-phe dela e qualquer impureza não-peguilada da proteína peguilada e quaisquer moléculas de PEG livres.
[000145] De acordo com uma outra modalidade, a proteína peguilada que é carregada na resina de AEX ou que é provida na primeira etapa de provisão de uma proteína peguilada inclui uma ou mais isoformas de proteína peguilada, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e qualquer agregado, impureza trissulfeto e impureza des-phe dela e qualquer impureza não-peguilada da proteína peguilada e quaisquer moléculas de PEG livres.
[000146] De acordo com uma outra modalidade, a proteína peguilada que é carregada na resina de AEX ou que é provida na primeira etapa de provisão de uma proteína peguilada inclui uma ou mais isoformas de proteína peguilada, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e qual- quer agregado, impureza trissulfeto e impureza des-phe dela e qual- quer impureza não-peguilada da proteína peguilada e quaisquer molé- culas de PEG livres.
[000147] De acordo com uma outra modalidade, a proteína peguilada que é carregada na resina de AEX ou que é provida na primeira etapa de provisão de uma proteína peguilada inclui uma ou mais isoformas de proteína peguilada, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7 e qualquer agregado, impureza trissulfeto e impureza des-phe dela e qualquer impureza não-peguilada da proteína peguilada e quaisquer moléculas de PEG livres.
[000148] De acordo com uma outra modalidade, a proteína peguilada que é carregada na resina de AEX ou que é provida na primeira etapa de provisão de uma proteína peguilada inclui uma ou mais isoformas de proteína peguilada, PEG-4, PEG-5, PEG-6 e qualquer agregado, impureza trissulfeto e impureza des-phe dela e qualquer impureza não-peguilada da proteína peguilada e quaisquer moléculas de PEG livres.
[000149] De acordo com uma outra modalidade, a proteína peguilada que é carregada na resina de AEX ou que é provida na primeira etapa de provisão de uma proteína peguilada inclui uma ou mais isoformas de proteína peguilada, PEG-4, PEG-5, PEG-6 e qualquer agregado, impureza trissulfeto e impureza des-phe dela e qualquer impureza não-peguilada da proteína peguilada.
[000150] De acordo com uma outra modalidade, a proteína peguilada que é carregada na resina de AEX ou que é provida na primeira etapa de provisão de uma proteína peguilada inclui uma ou mais isoformas de proteína peguilada, PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9 e qualquer agregado, impureza trissulfeto e impureza des-phe dela.
[000151] De acordo com uma outra modalidade, a proteína peguilada que é carregada na resina de AEX ou que é provida na primeira etapa de provisão de uma proteína peguilada inclui uma ou mais isoformas de proteína peguilada, PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9 e qualquer agregado, impureza trissulfeto de- la.
[000152] De acordo com uma outra modalidade, a proteína peguilada que é carregada na resina de AEX ou que é provida na primeira etapa de provisão de uma proteína peguilada inclui uma ou mais isoformas de proteína peguilada, PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9 e qualquer agregado dela.
[000153] A proteína peguilada junto com qualquer agregado, sua im- pureza trissulfeto e/ou des-phe, qualquer proteína peguilada ou parci- almente peguilada e qualquer PEG livre, após carregamento na resina de AEX, é submetida a ser eluída com uma solução de eluição durante uma etapa de eluição seguida por coleta do eluente em frações múlti- plas. As frações são frações de volume de coluna. A etapa de eluição pode ser realizada ou através de um gradiente de pH ou um gradiente de resistência iônica. Se a eluição for realizada com um gradiente de resistência iônica, a eluição é feita com uma solução de sal em um tampão de eluição contendo um sal iônico em uma concentração de sal suficiente para eluir a proteína peguilada carregada da resina de AEX. De preferência, o sal iônico é um sal de cloro. Com mais prefe- rência, o sal iônico é selecionado do grupo consistindo em NaCl, clore- to de lítio, fosfato de Na, sulfato de Na, cloreto de amônio, sulfato de amônio, fosfato de amônio, KI e KCl. Outros sais iônicos adequados são reconhecidos para uso com resinas de AEX e são incorporados como se mencionado aqui. De preferência, o sal iônico é cloreto de sódio provido em um tampão. Durante eluição com uma solução de sal provida em um tampão de eluição, o gradiente de concentração de sal (por exemplo, para uma solução de sal de NaCl) é de a partir de cerca de 2 a cerca de 50 mM por CV, de preferência de a partir de cerca de 5 a cerca de 25 mM por CV, e com mais preferência de a partir de cer- ca de 10 a cerca de 20 mM por CV e com mais preferência de a partir de cerca de 10 a cerca de 12,5 mM por CV. O tampão de eluição onde a solução de sal é provida tem um pH de a partir de cerca de 5 a cerca de 10, de preferência de a partir de cerca de 6,6 a cerca de 9, e com mais preferência de a partir de cerca de 6,9 a cerca de 7,1. Ainda, a etapa de eluição é realizada em uma temperatura < cerca de 50° C, de preferência < cerca de 35° C, com mais preferência de a partir de cer- ca de 2 a cerca de 30° C, com mais preferência ainda de a partir de cerca de 15 a cerca de 30° C e com mais preferência de a partir de cerca de 18 a cerca de 25° C.
[000154] O tampão de eluição contendo a solução de sal é introduzi- do na coluna de resina de AEX e fluido através da coluna em uma ve- locidade linear de < 300 cm/h, de preferência de a partir de cerca de 10 a cerca de 150 cm/h, com mais preferência de a partir de cerca de 30 a cerca de 100 cm/h, com mais preferência ainda de a partir de cerca de 50 a cerca de 100 cm/h, com mais preferência ainda de a partir de cerca de 50 a cerca de 70 cm/h, com mais preferência ainda de a partir de cerca de 60 a cerca de 65 cm/h e com mais preferência por volta de 60 cm/h.
[000155] Quando da coleta do eluente a partir da resina de AEX, é preferido coletar o eluente em frações de volume múltiplas variando de a partir de cerca de 0,1 a cerca de 5 volumes de coluna (CV), de prefe- rência de a partir de cerca de 0,1 a cerca de 1 CV de frações, com mais preferência de a partir de cerca de 0,1 a cerca de 0,5 CV, e com mais preferência de a partir de cerca de 0,1 a cerca de 0,2 CV de fra- ções de volume. Desse modo, por exemplo, uma pessoa pode coletar 100 frações separadas cujo número pode ser menos ou mais depen- dendo da quantidade total da solução de sal e do tampão de eluição enviado através da resina de AEX para coletar as várias frações de CV. Deve ser compreendido que as frações de CV são coletadas seri- almente conforme o eluente é coletado na saída (tipicamente no fundo da coluna de AEX) da coluna de AEX).
[000156] Cada uma das frações de CV coletadas vai de preferência conter uma dada isoforma de proteína peguilada tal como PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PRG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9. As frações de CV coletadas são então submetidas a agrupamento para determinar quais frações contêm qual isoforma de proteína peguilada e então permitir que uma pessoa seletivamente combine as isoformas de proteína peguilada desse modo coletadas. b. Agrupamento
[000157] Desse modo, as frações de CV coletadas da resina de AEX são então submetidas a uma etapa de agrupamento para selecionar quantidades diferentes das isoformas de proteína peguilada tal como PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PRG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG- 9. Várias técnicas analíticas podem ser usadas para seletivamente agrupar as isoformas de proteína peguilada desejadas. Essas técnicas incluem, mas não estão limitadas a, CE, SDS-PAGE, cromatografia de IEX, cromatografia de HIC, cromatografia de AEX, cromatografia de CEX, RPHPLC, SEHPLC, cromatografia de afinidade (AC) e suas combinações. Ou CE ou RPHPLC é preferido a SDS-PAGE. Ainda, sem desejar ser limitado pela teoria, acredita-se que o reagente (por exemplo, dodecil sulfato de sódio) usado com SDS-PAGE deixe um pouco vaga a medição de qualquer agregado formado. Acredita-se que o dodecil sulfato de sódio (SDS) usado no ensaio SDS-PAGE des- trua o agregado de modo que uma quantidade reduzida de agregado é medida ou nenhuma quantidade de agregado é medida. No entanto, SDS-PAGE pode ser usado com sucesso para tirar impressão digital (por exemplo, determinação da composição qualitativa e quantidade de PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PRG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9 de uma fração coletada) das proteínas peguiladas individuais. Quando análise através de CE é realizada para agrupamento, a análi- se é realizada em uma temperatura de CE de a partir de cerca de 5 a cerca de 50° C, de preferência de a partir de cerca de 5 a cerca de 45° C, com mais preferência de a partir de cerca de 20 a cerca de 40° e com mais preferência de a partir de cerca de 30 a cerca de 32° C.
[000158] Também, quando CE é usada, a CE é realizada em uma condutividade de agrupamento de CE (refere-se à condutividade da fração de amostra) de a partir de cerca de 0 a cerca de 60 mS/cm, e com mais preferência de a partir de cerca de 5 a cerca de 10 mS/cm. A fração da amostra tendo uma condutividade dentro das faixas de condutividade de agrupamento de CE acima mencionadas é então in- troduzida no capilar de CE para impressão digital de proteína peguila- da. A impressão digital de isoforma de proteína peguilada desse modo obtida da fração de CV relevante é comparada com um padrão de re- ferência para identificar a isoforma de proteína peguilada particular presente naquela amostra.
[000159] A porcentagem de área obtida por cada pico de impressão digital é proporcional à % em peso da isoforma correspondendo àque- le pico naquela fração. Então a fração desse modo identificada através de CE conter a isoforma de proteína peguilada desejada na % de peso desejada da isoforma é então opcionalmente misturada com outras frações similarmente selecionadas para dar a mistura de isoforma de- sejada. Esse processamento dá a composição do API.
[000160] Vide, por exemplo, Swapan, K. Chowdhury e outros, "Fin- gerprinting Protein Coupled with Polymers by Mass Spectrometry: In- vestigation of Polyethylene Glycol-Conjugated Superoxide Dismutase", American Society for Mass Spectrometry, Vol. 6, pp. 478-487, 1995.
[000161] Para condução de análise de CE na fração de CV coletada, a concentração de proteína peguilada no tampão é pelo menos cerca de 0,2 mg/ml, pelo menos cerca de 0,5 mg/ml, de a partir de cerca de 0,1 a cerca de 100 mg/ml, de a partir de cerca de 0,5 a cerca de 10 mg/ml, ou de a partir de cerca de 2 a cerca de 3 mg/ml, respectiva- mente. Usando CE, ou qualquer uma das técnicas de análise acima mencionadas para agrupamento, várias isoformas de proteína pegui- lada podem ser combinadas para dar um agrupamento desejado da proteína peguilada. Desse modo, por exemplo, uma proteína peguilada agrupada pode compreender uma ou mais de PEG-1 a PEG-9, uma ou mais de PEG-2 a PEG-9, uma ou mais de PEG-3 a PEG-9, uma ou mais de PEG-3 a PEG-8, uma ou mais de PEG-3 a PEG-7, uma de PEG-3 a PEG-6, uma ou mais de PEG-4 a PEG-6, uma ou mais de PEG-4 e PEG-5, uma ou mais de PEG-5 e PEG-6 e PEG-5, respecti- vamente.
[000162] Dentre os agrupamentos acima mencionados, vários agru- pamentos de proteínas peguiladas são preferidos. Por exemplo, com relação a um agrupamento de PEG-4, PEG-5 e PEG-6, o agrupamento de PEG-4, PEG-5 e PEG-6 deve ser um que compreenda pelo menos 70% em peso de PEG-4, PEG-5 e PEG-6 com base no peso total das isoformas de proteína peguilada naquele agrupamento em particular. De preferência, a fração de proteína peguilada de PEG-4, PEG-5 e PEG-6 é pelo menos cerca de 75% em peso com base no peso total das isoformas de proteína peguilada presentes no agrupamento. Este valor é com mais preferência pelo menos cerca de 80% em peso, pelo menos cerca de 85% em peso, pelo menos cerca de 90% em peso e pelo menos cerca de 94% em peso, pelo menos cerca de 95% em pe- so, pelo menos cerca de 96% em peso, pelo menos cerca de 97% em peso, pelo menos cerca de 98% em peso, pelo menos cerca de 99% em peso, pelo menos cerca de 99,5% em peso e pelo menos cerca de 99,9% em peso, respectivamente.
[000163] Para agrupamento, o agrupamento é realizado nas isofor- mas de proteína peguilada coletadas nas frações de CV onde as iso- formas de proteína peguilada são providas em um tampão. O tampão onde as isoformas de proteína peguilada são providas tem um pH de a partir de cerca de 5 a cerca de 10, de preferência de a partir de cerca de 6,6 a cerca de 9, e com mais preferência de a partir de cerca de 6,9 a cerca de 7,1. Ainda, esse tampão é um selecionado do grupo consis- tindo em Tris, fosfato, HEPES, ácido cítrico, trietilamina e histidina.
[000164] Neste ponto, as isoformas de proteína peguilada agrupadas processadas de acordo com a metodologia acima mencionada (tam- bém discutido nos Exemplo 1, 3 e 4 discutidos abaixo) devem ser tais de modo que o nível de agregado do produto agrupado seja < cerca de 10% em peso com base em um peso total das isoformas de proteína peguilada e qualquer um agregado dela que tenham sido submetidos às etapas 1-5 mencionadas acima com as etapas 2 e 3 sendo opcio- nais. De preferência, o nível do agregado é < cerca de 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1,5%, 1%, 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6%, 0,5%, 0,4%, 0,3%, 0,2%, 0,1%, 0,05% e 0,01% em peso com base no peso total acima mencionado, respectivamente.
[000165] A proteína peguilada desse modo agrupada consiste em preferível e essencialmente em uma ou mais de PEG-1, PEG-2, PEG- 3, PEG-4, PEG-5, PRG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9. A proteína pegui- lada desse modo agrupada de preferência consiste essencialmente em uma ou mais de PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9. A proteína peguilada desse modo agrupada de prefe- rência consiste essencialmente em uma ou mais de PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9. A proteína peguilada desse modo agrupada consiste preferível e essencialmente em uma ou mais de PEG-3, PEG-4, PEG-5, PRG-6, PEG-7 e PEG-8. A proteína pegui- lada desse modo agrupada consiste preferível e essencialmente em uma ou mais de PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6 e PEG-7. A proteína peguilada desse modo agrupada consiste preferível e essencialmente em uma ou mais de PEG-3, PEG-4, PEG-5 e PEG-6. A proteína pegui- lada desse modo agrupada consiste preferível e essencialmente em uma ou mais de PEG-4, PEG-5 e PEG-6. A proteína peguilada desse modo agrupada consiste essencialmente de preferência em uma ou mais de PEG-4 e PEG-5. A proteína peguilada desse modo agrupada consiste preferível e essencialmente em uma ou mais de PEG-5 e PEG-6. A proteína peguilada desse modo agrupada consiste preferí- vel e essencialmente em uma ou mais de PEG-5.
[000166] A metodologia de agrupamento acima mencionada pode ser utilizada para agrupamento das isoformas de proteína peguilada independente de se tais isoformas foram submetidas à cromatografia de troca de ânion.
[000167] Onde a proteína peguilada for um antagonista de hormônio do crescimento peguilado, é preferido que o nível de agregado seja < 6% em peso com base no peso total das isoformas de antagonista de hormônio do crescimento peguilado e qualquer agregado dele no agrupamento ou na fração de CV coletada. Com mais preferência, o nível de agregado é < cerca de 5%, 4%, 3%, 2% e 1% em peso com base no peso total acima mencionado, respectivamente. Ainda, onde a proteína peguilada for um antagonista de hormônio do crescimento peguilado com suas várias isoformas, o "nível total" de uma soma de qualquer impureza trissulfeto, e qualquer impureza des-phe e qualquer agregado dele é preferido em um nível para < cerca de 15% em peso com base no peso total das isoformas de antagonista de hormônio do crescimento peguilado, qualquer impureza trissulfeto, qualquer impu- reza des-phe e qualquer agregado dele no agrupamento ou na fração de CV coletada. De preferência, o nível total acima mencionado (de uma soma de qualquer impureza trissulfeto, qualquer impureza des- phe e qualquer agregado dele) é cerca de < cerca de 12%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% e 1% em peso com base no peso total, respectivamente.
[000168] Também de preferência, onde o antagonista de hormônio do crescimento de proteína peguilada for B-2036 PEG, sua estrutura principal de polipeptídeo é B-2036 da SEQ ID N° 1. Da mesma manei- ra, também de preferência, onde a proteína peguilada for agonista de hormônio do crescimento, de sua estrutura principal de polipeptídeo é um polipeptídeo da SEQ ID N° 2.
[000169] Após a etapa 4 da cromatografia de AEX e agrupamento, uma etapa 5 de ultrafiltragem/diafiltragem seguinte é realizada. Os pa- râmetros preferidos para conduzir esta etapa 5 de UF/DF são providos no Exemplo 1 e fluxograma 1. No final da etapa 5, um agrupamento de diafiltragem é coletado. Esse agrupamento de diafiltragem é então submetido à etapa 6 que é para pegar o ingrediente farmacêutico ativo desse modo obtido no agrupamento de diafiltragem acima mencionado e esterilizá-lo, de preferência, através de filtragem em um filtro de 0,22 μm. Os parâmetros preferidos para realização da etapa 6 de filtragem de API são providos no Exemplo 1 e no fluxograma 1.
[000170] Finalmente, no Exemplo 1 abaixo, um procedimento prefe- rido para a invenção reivindicada é provido relatando os detalhes de cada uma das etapas 1-6 acima mencionadas, usando uma etapa de cromatografia de resina de troca de íon. Para propósitos de compara- ção, um Exemplo comparativo 2 é provido, onde a etapa de cromato- grafia de troca de ânion substituída com uma etapa de cromatografia de troca de cátion junto com a etapa de troca de tampão apropriada associada com ela. Os resultados do procedimento do Exemplo 2 são providos na Tabela 2, onde o nível de agregado varia de tão alto quan- to cerca de 60% a tão baixo quanto 6% de agregado em peso. O Exemplo 3 descreve uma metodologia de agrupamento que é aplicável ao procedimento ou do Exemplo 1 e gráfico 1 ou ao procedimento do Exemplo 2 e gráfico 2 onde RPHPLC é usada como a técnica analítica que é comparada com uma técnica analítica de CE. As Figuras 2, 3 e 4 mostram que RPHPLC é equivalente à CE. O Exemplo 4 provê pro- cedimentos preferidos para a técnica analítica de CE.
[000171] 1. Processo para diminuição de um nível de agregado de isoformas de proteína peguilada, o dito processo compreendendo as etapas de: (a) provisão das ditas isoformas de proteína peguilada; e (b) separação das ditas isoformas de proteína peguilada através de cromatografia de troca de ânion usando uma resina de troca de ânion sob condições suficientes para diminuir o dito nível do dito agregado.
[000172] 2. Processo da modalidade 1, onde a dita etapa (a) com- preende a etapa de (a1) peguilação de uma forma não-peguilada ou parcialmente peguilada da dita proteína, ou peguilação de ambas.
[000173] 3. Processo da modalidade 2, onde a dita etapa (a1) com- preende peguilação com PEG livre selecionado do grupo consistindo em PEG-N-hidroxissuccinimida-5K, carbonato de PEG-succinimidila- 5K, PEG-propionato de succinimidila-5K, PEG2-maleimida-40K (2x20K), PEG2-N-hidroxissuccinimida-40K (2x20K) e PEG2-aldeído- 40K (2x20K).
[000174] 4. Processo da modalidade 3, onde uma razão em peso estequiométrica do dito PEG livre para a dita proteína não-peguilada é de a partir de cerca de 0,5 a cerca de 100.
[000175] 5. Processo da modalidade 4, onde a dita razão em peso estequiométrica é de a partir de cerca de 1,5 a cerca de 2,5.
[000176] 6. Processo da modalidade 5, onde a dita razão em peso estequiométrica é de a partir de cerca de 1,9 a cerca de 2.
[000177] 7. Processo da modalidade 6, onde a dita razão em peso estequiométrica é de a partir de cerca de 1,95 a cerca de 2,05.
[000178] 8. Processo da modalidade 2, onde a dita etapa de peguila- ção (a1) é realizada em um pH de peguilação de a partir de cerca de 3 a cerca de 10.
[000179] 9. Processo da modalidade 8, onde o dito pH da peguilação é de a partir de cerca de 7,2 a cerca de 7,8. 10. Processo da modalidade 9, onde o dito pH da peguilação é de a partir de cerca de 7,4 a cerca de 7,8.
[000180] 11. Processo da modalidade 10, onde o dito pH da peguila- ção é de a partir de cerca de 7,40 a cerca de 7,80.
[000181] 12. Processo da modalidade 2, onde a dita etapa de pegui- lação (a1) é realizada em uma temperatura de peguilação de a partir de cerca de 0 a cerca de 40° C.
[000182] 13. Processo da modalidade 12, onde a dita temperatura de peguilação é de a partir de cerca de 10 a cerca de 30° C.
[000183] 14. Processo da modalidade 13, onde a dita temperatura de peguilação é de a partir de cerca de 18 a cerca de 25° C.
[000184] 15. Processo da modalidade 1 compreendendo ainda uma etapa de HIC opcional (a2) de seleção da dita proteína peguilada atra- vés de cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) usando uma resi- na de HIC.
[000185] 16. Processo da modalidade 2 compreendendo ainda uma etapa de HIC opcional (a2) de seleção da dita proteína peguilada atra- vés de cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) usando uma resi- na de HIC.
[000186] 17. Processo da modalidade 16, onde a dita etapa de HIC (a2) compreende carregamento da dita proteína peguilada e qualquer proteína não-peguilada na dita resina de HIC e em uma carga de HIC de menos do que ou igual a cerca de 10 g de proteína/L de volume de leito embalado de resina de HIC.
[000187] 18. Processo da modalidade 17, onde a dita carga de HIC é menos do que ou igual a cerca de 5 g de proteína/L de volume de leito embalado de resina de HIC.
[000188] 19. Processo da modalidade 18, onde a dita carga de HIC é menos do que ou igual a cerca de 4,1 g de proteína/L de volume de leito embalado de resina de HIC.
[000189] 20. Processo da modalidade 17, onde a dita etapa de HIC (a2) do dito carregamento é realizada em uma condutividade de carre- gamento de HIC de a partir de cerca de 30 a cerca de 60 mS/cm. 21. Processo da modalidade 20, onde a dita condutividade de carre- gamento de HIC é de a partir de cerca de 40 a cerca de 52 mS/cm.
[000190] 22. Processo da modalidade 21, onde a dita condutividade de carregamento de HIC é de a partir de cerca de 45 a cerca de 51 mS/cm.
[000191] 23. Processo da modalidade 17, onde a dita etapa de HIC (a2) é realizada em uma temperatura de HIC de a partir de cerca de 10 a cerca de 40° C.
[000192] 24. Processo da modalidade 23, onde a dita temperatura de HIC é de a partir de cerca de 15 a cerca de 30° C.
[000193] 25. Processo da modalidade 24, onde a dita temperatura de HIC é de a partir de cerca de 18 a cerca de 25° C.
[000194] 26. Processo da modalidade 16 compreendendo ainda uma etapa de UF/DF N° 3 (a3) de ultrafiltragem/diafiltragem (UF/DF N° 3) de um eluente da dita etapa de HIC (a2).
[000195] 27. Processo da modalidade 26, onde a dita etapa de UF/DF N° 3 (a3) é realizada com uma membrana de UF/DF N° 3 tendo uma diminuição do peso molecular (MWCO) da membrana de UF/DF N° 3 de a partir de cerca de 3 kDa a cerca de 20 kDa.
[000196] 28. Processo da modalidade 27, onde o dito MWCO da membrana de UF/Df N° 3 é de a partir de cerca de 8 kDa a cerca de 15 kDa.
[000197] 29. Processo da modalidade 28, onde o dito MWCO da membrana de UF/DF N° 3 é de a partir de cerca de 10 kDa a cerca de 12 kDa.
[000198] 30. Processo da modalidade 29, onde o dito MWCO da membrana de UF/DF N° 3 é cerca de 10 kDa.
[000199] 31. Processo da modalidade 1, onde a dita etapa (b) com- preende ainda a etapa (b1) de carregamento da dita proteína peguila- da incluindo qualquer impureza e qualquer agregado dela na dita resi- na de troca de ânion (AEX) para prover proteína peguilada carregada.
[000200] 32. Processo da modalidade 31, onde a dita resina de AEX é selecionada do grupo consistindo em ANX4, DEAE, Q-Sepharose, Q-Sepharose FF, Q-Sepharose HP e Q-Sepharose XL.
[000201] 33. Processo da modalidade 32, onde a dita resina de AEX é Q-Sepharose FF.
[000202] 34. Processo da modalidade 31, onde a dita etapa (b1) é realizada em uma condutividade de carregamento de AEX de menos do que ou igual a cerca de 10 mS/cm.
[000203] 35. Processo da modalidade 34, onde a dita condutividade de carregamento de AEX é menos do que ou igual a cerca de 5 mS/cm.
[000204] 36. Processo da modalidade 35, onde a dita condutividade de carregamento de AEX é menos do que ou igual a cerca de 2,4 mS/cm.
[000205] 37. Processo da modalidade 31, onde a dita etapa (b1) é realizada em um pH de carregamento de AEX de a partir de cerca de 5 a cerca de 10.
[000206] 38. Processo da modalidade 37, onde o dito pH de carre- gamento de AEX é de a partir de cerca de 6,6 a cerca de 9.
[000207] 39. Processo da modalidade 38, onde o dito pH de carre- gamento de AEX é de a partir de cerca de 6,9 a cerca de 7,1.
[000208] 40. Processo da modalidade 31, onde a dita etapa (b1) é realizada em uma carga de AEX de proteína peguilada incluindo qual- quer impureza ou dito agregado dela de menos do que ou igual a cer- ca de 10 g de proteína/L de volume de leito embalado de resina de AEX.
[000209] 41. Processo da modalidade 40, onde a dita carga de AEX é menor do que ou igual a cerca de 5,5 g de proteína/L de volume de leito embalado de resina de AEX.
[000210] 42. Processo da modalidade 40, onde a dita carga de AEX é menor do que ou igual a cerca de 4,1 g de proteína/L de volume de leito embalado de resina de AEX.
[000211] 43. Processo da modalidade 1, onde a dita proteína pegui- lada compreende uma ou mais das isoformas de proteína peguilada PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG- 9 e qualquer agregado, impureza trissulfeto e impureza des-phe dela e qualquer impureza não-peguilada da dita proteína e quaisquer molécu- las de PEG livres.
[000212] 44. Processo da modalidade 1, onde a dita proteína pegui- lada compreende uma ou mais das ditas isoformas de proteína pegui- lada PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9 e qualquer agregado, impureza trissulfeto e impureza des-phe dela e qualquer impureza não-peguilada da dita proteína e quaisquer molécu- las livres de PEG.
[000213] 45. Processo da modalidade 1, onde a dita proteína pegui- lada compreende uma ou mais das ditas isoformas de proteína pegui- lada PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e qualquer agregado, impureza trissulfeto e impureza des-phe dela e qualquer impureza não-peguilada da dita proteína e quaisquer moléculas de PEG livres.
[000214] 46. Processo da modalidade 1, onde a dita proteína pegui- lada compreende uma ou mais das ditas isoformas de proteína pegui- lada PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e qualquer agre- gado, impureza trissulfeto e impureza des-phe dela e qualquer impure- za não-peguilada da dita proteína e quaisquer moléculas de PEG li- vres.
[000215] 47. Processo da modalidade 1, onde a dita proteína pegui- lada compreende uma ou mais das ditas isoformas de proteína pegui- lada PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e qualquer agregado e impurezas trissulfeto e des-phe dela e qualquer impureza não- peguilada da dita proteína e quaisquer moléculas de PEG livres.
[000216] 48. Processo da modalidade 1, onde a dita proteína pegui- lada compreende uma ou mais das ditas isoformas de proteína pegui- lada PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7 e qualquer agregado, impureza trissulfeto e impureza des-phe dela e qualquer impureza não-peguilada da dita proteína e quaisquer moléculas de PEG livres.
[000217] 49. Processo da modalidade 1, onde a dita proteína pegui- lada compreende uma ou mais das ditas isoformas de proteína pegui- lada PEG-4, PEG-5, PEG-6 e qualquer agregado, impureza trissulfeto e impureza des-phe dela e qualquer impureza não-peguilada da dita proteína e quaisquer moléculas de PEG livres.
[000218] 50. Processo da modalidade 1, onde a dita proteína pegui- lada compreende uma ou mais das ditas isoformas de proteína pegui- lada PEG-4, PEG-5, PEG-6 e qualquer agregado, impureza trissulfeto e impureza des-phe dela e qualquer impureza não-peguilada da dita proteína.
[000219] 51. Processo da modalidade 1, onde a dita proteína pegui- lada compreende uma ou mais das ditas isoformas de proteína pegui- lada PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9 e qualquer agregado, impureza trissulfeto e impureza des-phe dela.
[000220] 52. Processo da modalidade 1, onde a dita proteína pegui- lada compreende uma ou mais das ditas isoformas de proteína pegui- lada PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9 e qualquer agregado, impureza trissulfeto e impureza trissulfeto dela.
[000221] 53. Processo da modalidade 1, onde a dita proteína pegui- lada compreende uma ou mais das ditas isoformas de proteína pegui- lada PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9 e qualquer agregado dela.
[000222] 54. Processo da modalidade 1 compreendendo ainda uma etapa de agrupamento (c) de agrupamento de quantidades diferentes das ditas isoformas de proteína peguilada para dar uma proteína pe- guilada agrupada através de uma técnica selecionada do grupo con- sistindo em eletroforese capilar (CE), eletroforese de dodecil sulfato de sódio-gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), cromatografia de troca de íon (IEX), cromatografia de interação hidrofóbica (HIC), cromatografia de troca de ânion (AEX), cromatografia de troca de cátion (CEX), croma- tografia líquida de alta pressão de fase reversa (RPHLC), cromatogra- fia líquida de alta pressão de exclusão de tamanho (SEHPLC), croma- tografia de afinidade (AC) e suas combinações.
[000223] 55. Processo da modalidade 42 compreendendo ainda uma etapa de agrupamento (c) de agrupamento de quantidades diferentes das ditas isoformas de proteína peguilada da dita proteína peguilada para dar uma proteína peguilada agrupada através de uma técnica se- lecionada do grupo consistindo em eletroforese capilar (CE), eletrofo- rese de dodecil sulfato de sódio-gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), cromatografia de troca de íon (IEX), cromatografia de interação hidro- fóbica (HIC), cromatografia de troca de ânion (AEX), cromatografia de troca de cátion (CEX), cromatografia líquida de alta pressão de fase reversa (HPLC), cromatografia líquida de alta pressão de exclusão de tamanho (SEHPLC), cromatografia de afinidade (AC) e suas combina- ções.
[000224] 56. Processo da modalidade 54, onde a dita etapa de agru- pamento (c) é realizada pela dita CE em uma temperatura de CE de a partir de cerca de 5 a cerca de 50° C.
[000225] 57. Processo da modalidade 55, onde a dita etapa de agru- pamento (c) é realizada pela dita CE em uma temperatura de CE de a partir de cerca de 5 a cerca de 50° C.
[000226] 58. Processo da modalidade 56, onde a dita temperatura de CE é de a partir de cerca de 5 a cerca de 45° C.
[000227] 59. Processo da modalidade 58, onde a dita temperatura de CE é de a partir de cerca de 20 a cerca de 40° C.
[000228] 60. Processo da modalidade 59, onde a dita temperatura de CE é de a partir de cerca de 30 a cerca de 32° C.
[000229] 61. Processo da modalidade 56, onde a dita etapa de agru- pamento (c) é realizada pela dita CE em uma condutividade de agru- pamento de CE de a partir de cerca de 0 a cerca de 60 mS/cm.
[000230] 62. Processo da modalidade 61, onde a dita condutividade de agrupamento de CE é de a partir de cerca de 5 a cerca de 10 mS/cm.
[000231] 63. Processo da modalidade 54, onde a dita etapa de agru- pamento (c) é realizada nas ditas isoformas de proteína peguilada pro- vidas em um tampão em uma concentração de proteína de pelo me- nos cerca de 0,2 mg/ml.
[000232] 64. Processo da modalidade 56, onde a dita etapa de agru- pamento (c) é realizada nas ditas isoformas de proteína peguilada pro- vidas em um tampão em uma concentração de proteína de pelo me- nos cerca de 0,5 mg/ml.
[000233] 65. Processo da modalidade 54, onde a dita etapa de agru- pamento (c) é realizada nas ditas isoformas de proteína peguilada pro- vidas em um tampão em uma concentração de proteína de a partir de cerca de 0,1 a cerca de 100 mg/ml.
[000234] 66. Processo da modalidade 65, onde a dita concentração de proteína é de a partir de cerca de 0,5 a cerca de 10 mg/ml.
[000235] 67. Processo da modalidade 66, onde a dita concentração de proteína é de a partir de cerca de 2 a cerca de 3 mg/ml.
[000236] 68. Processo da modalidade 56, onde a dita etapa de agru- pamento (c) é realizada nas ditas isoformas de proteína peguilada pro- vidas em um tampão em uma concentração de proteína de a partir de cerca de 0,1 a cerca de 100 mg/ml.
[000237] 69. Processo da modalidade 67, onde a dita concentração de proteína é de a partir de cerca de 0,5 a cerca de 10 mg/ml.
[000238] 70. Processo da modalidade 68, onde a dita concentração de proteína é de a partir de cerca de 2 a cerca de 3 mg/ml.
[000239] 71. Processo da modalidade 63, onde a dita proteína pegui- lada agrupada compreende uma ou mais de PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9.
[000240] 72. Processo da modalidade 63, onde a dita proteína pegui- lada agrupada compreende uma ou mais de PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9.
[000241] 73. Processo da modalidade 63, onde a dita proteína pegui- lada agrupada compreende uma ou mais de PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9.
[000242] 74. Processo da modalidade 63, onde a dita proteína pegui- lada agrupada compreende uma ou mais de PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7 e PEG-8.
[000243] 75. Processo da modalidade 63, onde a dita proteína pegui- lada agrupada compreende uma ou mais de PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6 e PEG-7.
[000244] 76. Processo da modalidade 63, onde a dita proteína pegui- lada agrupada compreende uma ou mais de PEG-3, PEG-4, PEG-5 e PEG-6.
[000245] 77. Processo da modalidade 63, onde a dita proteína pegui- lada agrupada compreende uma ou mais de PEG-4, PEG-5 e PEG-6.
[000246] 78. Processo da modalidade 63, onde a dita proteína pegui- lada agrupada compreende uma ou mais de PEG-4 e PEG-5.
[000247] 79. Processo da modalidade 63, onde a dita proteína pegui- lada agrupada compreende uma ou mais de PEG-5 e PEG-6.
[000248] 80. Processo da modalidade 63, onde a dita proteína pegui- lada agrupada compreende PEG-5.
[000249] 81. Processo da modalidade 71, onde a dita fração de pro- teína peguilada agrupada de PEG-4, PEG-5 e PEG-6 compreende pe- lo menos cerca de 70% em peso com base no peso total das ditas iso- formas de proteína peguilada PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9 e qualquer agregado dela.
[000250] 82. Processo da modalidade 71, onde a dita fração de pro- teína peguilada agrupada de PEG-4, PEG-5 e PEG-6 compreende pe- lo menos cerca de 70% em peso com base no peso total das ditas iso- formas de proteína peguilada PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9 e qualquer agregado dela.
[000251] 83. Processo da modalidade 71, onde a dita fração de pro- teína peguilada agrupada de PEG-4, PEG-5 e PEG-6 compreende pe- lo menos cerca de 80% em peso com base no peso total das ditas iso- formas de proteína peguilada PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9 e qualquer agregado dela.
[000252] 84. Processo da modalidade 71, onde a dita fração de pro- teína peguilada agrupada de PEG-4, PEG-5 e PEG-6 compreende pe- lo menos cerca de 90% em peso com base no peso total das ditas iso- formas de proteína peguilada PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9 e qualquer agregado dela.
[000253] 85. Processo da modalidade 71, onde a dita fração de pro- teína peguilada agrupada de PEG-4, PEG-5 e PEG-6 compreende pe- lo menos cerca de 94% em peso com base no peso total das ditas iso- formas de proteína peguilada PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9 e qualquer agregado dela.
[000254] 86. Processo da modalidade 64, onde o dito tampão onde a dita proteína peguilada é provida tem um pH de a partir de cerca de 5 a cerca de 10.
[000255] 87. Processo da modalidade 86, onde o dito tampão tem um pH de a partir de cerca de 6,6 a cerca de 9.
[000256] 88. Processo da modalidade 87, onde o dito tampão tem um pH de a partir de cerca de 6,9 a cerca de 7,1.
[000257] 89. Processo da modalidade 64, onde o dito tampão onde a dita proteína peguilada é provida é selecionado do grupo consistindo em Tris, fosfato, HEPES, ácido cítrico, trietilamina e histidina.
[000258] 90. Processo da modalidade 1, onde o dito nível do dito agregado é menos do que ou igual a cerca de 10% em peso com base no peso total das ditas isoformas e dito agregado.
[000259] 91. Processo da modalidade 90, onde o dito nível do dito agregado é menos do que ou igual a cerca de 9% em peso com base no dito peso total.
[000260] 92. Processo da modalidade 91, onde o dito nível do dito agregado é menos do que ou igual a cerca de 8% em peso com base no dito peso total.
[000261] 93. Processo da modalidade 92, onde o dito nível do dito agregado é menos do que ou igual a cerca de 7% em peso com base no dito peso total.
[000262] 94. Processo da modalidade 93, onde o dito nível do dito agregado é menos do que ou igual a cerca de 6% em peso com base no dito peso total.
[000263] 95. Processo da modalidade 94, onde o dito nível do dito agregado é menos do que ou igual a cerca de 5% em peso com base no dito peso total.
[000264] 96. Processo da modalidade 95, onde o dito nível do dito agregado é menos do que ou igual a cerca de 4% em peso com base no dito peso total.
[000265] 97. Processo da modalidade 96, onde o dito nível do dito agregado é menos do que ou igual a cerca de 3% em peso com base no dito peso total.
[000266] 98. Processo da modalidade 97, onde o dito nível do dito agregado é menos do que ou igual a cerca de 2% em peso com base no dito peso total.
[000267] 99. Processo da modalidade 98, onde o dito nível do dito agregado é menos do que ou igual a cerca de 1,5% em peso com ba- se no dito peso total.
[000268] 100. Processo da modalidade 99, onde o dito nível do dito agregado é menos do que ou igual a cerca de 1% em peso com base no dito peso total.
[000269] 101. Processo da modalidade 100, onde o dito nível do dito agregado é menos do que ou igual a cerca de 0,9% em peso com ba- se no dito peso total.
[000270] 102. Processo da modalidade 101, onde o dito nível do dito agregado é menos do que ou igual a cerca de 0,8% em peso com ba- se no dito peso total.
[000271] 103. Processo da modalidade 102, onde o dito nível do dito agregado é menos do que ou igual a cerca de 0,7% em peso com ba- se no dito peso total.
[000272] 104. Processo da modalidade 103, onde o dito nível do dito agregado é menos do que ou igual a cerca de 0,6% em peso com ba- se no dito peso total.
[000273] 105. Processo da modalidade 104, onde o dito nível do dito agregado é menos do que ou igual a cerca de 0,5% em peso com ba- se no dito peso total.
[000274] 106. Processo da modalidade 105, onde o dito nível do dito agregado é menos do que ou igual a cerca de 0,4% em peso com ba- se no dito peso total.
[000275] 107. Processo da modalidade 106, onde o dito nível do dito agregado é menos do que ou igual a cerca de 0,3% em peso com ba- se no dito peso total.
[000276] 108. Processo da modalidade 107, onde o dito nível do dito agregado é menos do que ou igual a cerca de 0,2% em peso com ba- se no dito peso total.
[000277] 109. Processo da modalidade 108, onde o dito nível do dito agregado é menos do que ou igual a cerca de 0,1% em peso com ba- se no dito peso total.
[000278] 110. Processo da modalidade 109, onde o dito nível do dito agregado é menos do que ou igual a cerca de 0,05% em peso com base no dito peso total.
[000279] 111. Processo da modalidade 110, onde o dito nível do dito agregado é menos do que ou igual a cerca de 0,01% em peso com base no dito peso total.
[000280] 112. Processo da modalidade 31, onde a dita etapa (b) compreende ainda a etapa (b2) de lavagem da dita proteína peguilada carregada seguido por uma etapa (b3) de eluição com uma solução de eluição da dita proteína peguilada carregada através de um gradiente de pH ou um gradiente de resistência iônica e uma etapa (b4) de cole- ta de um eluente em frações de volume múltiplas.
[000281] 113. Processo da modalidade 31, onde a dita etapa (b) compreende ainda a etapa (b2) de lavagem da dita proteína peguilada carregada seguido por uma etapa de eluição (b3) de eluição da dita proteína peguilada carregada com uma solução de sal em um tampão de eluição contendo um sal iônico em um gradiente de concentração de sal suficiente para eluir a dita proteína peguilada carregada a partir da dita resina de AEX.
[000282] 114. Processo da modalidade 113, onde a o dito sal iônico é um sal de cloro.
[000283] 115. Processo da modalidade 114, onde o dito sal iônico é NaCl.
[000284] 116. Processo da modalidade 115, onde a dita etapa (b) é realizada em uma coluna tendo um volume de coluna (CV) e onde o dito gradiente de concentração de sal é de a partir de cerca de 2 a cerca de 50 mM por CV.
[000285] 117. Processo da modalidade 16, onde o dito gradiente de concentração de sal é de a partir de cerca de 5 a cerca de 25 mM por CV.
[000286] 118. Processo da modalidade 117, onde o dito gradiente de concentração de sal é de a partir de cerca de 10 a cerca de 20 mM por CV.
[000287] 119. Processo da modalidade 113, onde o dito tampão de eluição tem um pH de a partir de cerca de 5 a cerca de 10.
[000288] 120. Processo da modalidade 119, onde o dito tampão de eluição tem um pH de a partir de cerca de 6,6 a cerca de 9.
[000289] 121. Processo da modalidade 120, onde o dito tampão de eluição tem um pH de a partir de cerca de 6,9 a cerca de 7,1.
[000290] 122. Processo da modalidade 113, onde a dita etapa de eluição (b3) é realizada em uma temperatura de eluição de menos do que ou igual a 50° C.
[000291] 123. Processo da modalidade 122, onde a dita temperatura de eluição é menos do que ou igual a cerca de 35° C.
[000292] 124. Processo da modalidade 123, onde a dita temperatura de eluição é de a partir de cerca de 2 a cerca de 30° C.
[000293] 125. Processo da modalidade 123, onde a dita temperatura de eluição é de a partir de cerca de 15 a cerca de 30° C.
[000294] 126. Processo da modalidade 123, onde a dita temperatura de eluição é de a partir de cerca de 18 a cerca de 25° C.
[000295] 127. Processo da modalidade 113, onde a dita etapa (b) é realizada em uma coluna e onde o dito tampão de eluição tem uma velocidade linear através da dita coluna de menos do que ou igual a cerca de 300 cm/h.
[000296] 128. Processo da modalidade 127, onde a dita velocidade linear é de a partir de cerca de 10 a cerca de 150 cm/h.
[000297] 129. Processo da modalidade 127, onde a dita velocidade linear é de a partir de cerca de 30 a cerca de 150 cm/h.
[000298] 130. Processo da modalidade 127, onde a dita velocidade linear é de a partir de cerca de 50 a cerca de 100 cm/h.
[000299] 131. Processo da modalidade 127, onde a dita velocidade linear é de a partir de cerca de 50 a cerca de 70 cm/h.
[000300] 132. Processo da modalidade 127, onde a dita velocidade linear é de a partir de cerca de 60 a cerca de 65 cm/h.
[000301] 133. Processo da modalidade 127, onde a dita velocidade linear é cerca de 60 cm/h.
[000302] 134. Processo da modalidade 1, onde a dita proteína pegui- lada é selecionada do grupo consistindo em hormônio, hormônio do crescimento, hormônio do crescimento humano, antagonista de hor- mônio do crescimento, antagonista do hormônio do crescimento hu- mano, um anticorpo e B-2036 PEG.
[000303] 135. Processo da modalidade 1, onde a dita resina de troca de ânion (AEX) compreende grupos funcionais selecionados do grupo consistindo em aminas primárias, secundárias, terciárias, quaternárias e suas combinações.
[000304] 136. Processo da modalidade 1, onde a dita resina de troca de ânion (AEX) compreende grupos funcionais selecionados do grupo consistindo em grupos dietilaminoetila, dietilaminopropila, dimetiletano- lamina, trimetil-amônio-etila, trimetilbenzil amônio, dimetiletanol benzila e poliamina funcionais.
[000305] 137. Processo da modalidade 1, onde a dita resina de troca de ânion (AEX) compreende um material de apoio selecionado do gru- po consistindo em poliéter hidrofílico, poliestireno divinil benzeno liga- do com cruzamento, agarose ligada com cruzamento, polipropileno, acrilamidovinila hidrofílica, metacrílico, hidrogel polimerizado com uma base de conta de cerâmica, material de sílica compósita-dextrano, síli- ca enxertada com polímero, estireno divinil benzeno, poliacrílico divinil benzeno, celulose reticulada, metacrilato de co-polímero, poliestireno, acrílico, gel hidrofílico G5000 e celulose.
[000306] 138. Processo da modalidade 1, onde a dita resina de troca de ânion (AEX) compreende uma resina macroporosa.
[000307] 139. Processo da modalidade 1, onde a dita resina de troca de ânion (AEX) compreende uma resina de gel.
[000308] 140. Processo da modalidade 63, onde a dita proteína pe- guilada agrupada consiste essencialmente em uma ou mais de PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9.
[000309] 141. Processo da modalidade 63, onde a dita proteína pe- guilada agrupada consiste essencialmente em uma ou mais de PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9.
[000310] 142. Processo da modalidade 63, onde a dita proteína pe- guilada agrupada consiste essencialmente em uma ou mais de PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9.
[000311] 143. Processo da modalidade 63, onde a dita proteína pe- guilada agrupada consiste essencialmente em uma ou mais de PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7 e PEG-8.
[000312] 144. Processo da modalidade 63, onde a dita proteína pe- guilada agrupada consiste essencialmente em uma ou mais de PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6 e PEG-7.
[000313] 145. Processo da modalidade 63, onde a dita proteína pe- guilada agrupada consiste essencialmente em uma ou mais de PEG-3, PEG-4, PEG-5 e PEG-6.
[000314] 146. Processo da modalidade 63, onde a dita proteína pe- guilada agrupada consiste essencialmente em uma ou mais de PEG-4, PEG-5 e PEG-6.
[000315] 147. Processo da modalidade 63, onde a dita proteína pe- guilada agrupada consiste essencialmente em uma ou mais de PEG-4 e PEG-5.
[000316] 148. Processo da modalidade 63, onde a dita proteína pe- guilada agrupada consiste essencialmente em uma ou mais de PEG-5 e PEG-6.
[000317] 149. Processo da modalidade 63, onde a dita proteína pe- guilada agrupada consiste essencialmente em PEG-5.
[000318] 150. Processo da modalidade 31, onde a dita etapa (b) é realizada em uma coluna tendo um volume de coluna (CV) e onde a etapa (b) compreende ainda uma etapa (b2) de lavagem da dita prote- ína peguilada carregada seguido por uma etapa (b3) de eluição com uma solução de eluição da dita proteína peguilada carregada por um gradiente de pH ou um gradiente de resistência iônica e uma etapa (b4) de coleta de um eluente em frações de volume múltiplas a partir de cerca de 0,1 a cerca de 5 do dito volume de coluna (CV).
[000319] 151. Processo da modalidade 31, onde a dita etapa (b) é realizada em uma coluna tendo um volume de coluna (CV) e onde a etapa (b) compreende ainda uma etapa (b2) de lavagem da dita prote- ína peguilada carregada seguido por uma etapa (b3) de eluição com uma solução de eluição da dita proteína peguilada carregada por um gradiente de pH ou um gradiente de resistência iônica e uma etapa (b4) de coleta de um eluente em frações de volume múltiplas a partir de cerca de 0,1 a cerca de 1 do dito volume de coluna (CV).
[000320] 152. Processo da modalidade 31, onde a dita etapa (b) é realizada em uma coluna tendo um volume de coluna (CV) e onde a dita etapa (b) compreende ainda uma etapa (b2) de lavagem da dita proteína peguilada carregada seguido por uma etapa (b3) de eluição com uma solução de eluição da dita proteína peguilada carregada por um gradiente de pH ou um gradiente de resistência iônica e uma etapa (b4) de coleta de um eluente em frações de volume múltiplas a partir de cerca de 0,1 a cerca de 0,5 do dito volume de coluna (CV).
[000321] 153. Processo da modalidade 31, onde a dita etapa (b) é realizada em uma coluna tendo um volume de coluna (CV) e onde a dita etapa (b) compreende ainda uma etapa (b2) de lavagem da dita proteína peguilada carregada seguido por uma etapa (b3) de eluição com uma solução de eluição da dita proteína peguilada carregada por um gradiente de pH ou um gradiente de resistência iônica e uma etapa (b4) de coleta de um eluente em frações de volume múltiplas a partir de cerca de 0,1 a cerca de 0,2 do dito volume de coluna (CV).
[000322] 154. Processo da modalidade 113, onde o dito sal iônico é selecionado do grupo consistindo em NaCl, cloreto de lítio, fosfato de Na, sulfato de Na, cloreto de amônio, sulfato de amônio, fosfato de amônio, KI e KCl.
[000323] 155. Processo da modalidade 118, onde o dito gradiente de concentração de sal é de a partir de cerca de 10 a cerca de 12,5 mM por CV.
[000324] 156. Processo para agrupamento de isoformas de proteína peguilada, o dito processo compreendendo a etapa de: (a) separação e coleta das ditas isoformas de proteína pe- guilada através de uma técnica selecionada do grupo consistindo em eletroforese capilar (CE), eletroforese de dodecil sulfato de sódio-gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), cromatografia de troca de íon (IEX), cromatografia de interação hidrofóbica (HIC), cromatografia de troca de ânion (AEX), cromatografia de troca de cátion (CEX), cromatografia líquida de alta pressão de fase reversa (RPHLC), cromatografia líquida de alta pressão de exclusão de tamanho (SEHPLC), cromatografia de afinidade (AC) e suas combinações.
[000325] 157. Processo da modalidade 140, onde a dita técnica é RPHLC ou CE.
[000326] 158. Processo de diminuição de um nível de agregado de isoformas de antagonista de hormônio do crescimento peguilado tendo um peso total das ditas isoformas e dito agregado, o dito processo compreendendo as etapas de: (a) provisão das ditas isoformas de antagonista de hormô- nio do crescimento peguilado; e (b) separação das ditas isoformas de antagonista de hor- mônio do crescimento peguilado em uma resina de troca de ânion (AEX) através de cromatografia de troca de ânion sob condições sufi- cientes para diminuir o dito nível do dito agregado para menos do que ou igual a cerca de 6% em peso com base no dito peso total.
[000327] 159. Processo da modalidade 158, onde as ditas condições são suficientes para diminuir o dito nível do dito agregado para menos do que ou igual a cerca de 5% em peso com base no dito peso total.
[000328] 160. Processo da modalidade 158, onde as condições são suficientes para diminuir o dito nível do dito agregado para menos do que ou igual a cerca de 4% em peso com base no dito peso total.
[000329] 161. Processo da modalidade 158, onde as condições são suficientes para diminuir o dito nível do dito agregado para menos do que ou igual a cerca de 3% em peso com base no dito peso total.
[000330] 162. Processo da modalidade 158, onde as condições são suficientes para diminuir o dito nível do dito agregado para menos do que ou igual a cerca de 2% em peso com base no dito peso total.
[000331] 163. Processo da modalidade 158, onde as condições são suficientes para diminuir o dito nível do dito agregado para menos do que ou igual a cerca de 1% em peso com base no dito peso total.
[000332] 164. Processo para diminuição de um nível total de uma soma de qualquer impureza trissulfeto, qualquer impureza des-phe e qualquer agregado de isoformas de antagonista de hormônio do cres- cimento peguilado tendo um peso total das ditas isoformas, ditas impu- rezas e dito agregado, o dito processo compreendendo as etapas de: (a) provisão das ditas isoformas de antagonista de hormô- nio do crescimento peguilado; e (b) separação das ditas isoformas de antagonista de hor- mônio do crescimento peguilado em uma resina de troca de ânion (AEX) através de cromatografia de troca de ânion sob condições sufi- cientes para diminuir o dito nível total de qualquer impureza trissulfeto, qualquer uma da impureza des-phe e qualquer um do dito agregado para menos do que ou igual a cerca de 15% em peso com base no dito peso total.
[000333] 165. Processo da modalidade 164, onde as condições são suficientes para diminuir o dito nível total de qualquer uma da dita im- pureza trissulfeto, qualquer uma da dita impureza des-phe e qualquer um do dito agregado para menos do que ou igual a cerca de 12% em peso com base no dito peso total.
[000334] 166. Processo da modalidade 164, onde as condições são suficientes para diminuir o dito nível total de qualquer uma da dita im- pureza trissulfeto, qualquer uma da dita impureza des-phe e qualquer um do dito agregado para menos do que ou igual a cerca de 10% em peso com base no dito peso total.
[000335] 167. Processo da modalidade 164, onde as condições são suficientes para diminuir o dito nível total de qualquer uma da dita im- pureza trissulfeto, qualquer uma da dita impureza des-phe e qualquer um do dito agregado para menos do que ou igual a cerca de 9% em peso com base no dito peso total.
[000336] 168. Processo da modalidade 164, onde as condições são suficientes para diminuir o dito nível total de qualquer uma da dita im- pureza trissulfeto, qualquer uma da dita impureza des-phe e qualquer um do dito agregado para menos do que ou igual a cerca de 8% em peso com base no dito peso total.
[000337] 169. Processo da modalidade 164, onde as condições são suficientes para diminuir o dito nível total de qualquer uma da dita im- pureza trissulfeto, qualquer uma da dita impureza des-phe e qualquer um do dito agregado para menos do que ou igual a cerca de 7% em peso com base no dito peso total.
[000338] 170. Processo da modalidade 164, onde as condições são suficientes para diminuir o dito nível total de qualquer uma da dita im- pureza trissulfeto, qualquer uma da dita impureza des-phe e qualquer um do dito agregado para menos do que ou igual a cerca de 6% em peso com base no dito peso total.
[000339] 171. Processo da modalidade 164, onde as condições são suficientes para diminuir o dito nível total de qualquer uma da dita im- pureza trissulfeto, qualquer uma da dita impureza des-phe e qualquer um do dito agregado para menos do que ou igual a cerca de 5% em peso com base no dito peso total.
[000340] 172. Processo da modalidade 164, onde as condições são suficientes para diminuir o dito nível total de qualquer uma da dita im- pureza trissulfeto, qualquer uma da dita impureza des-phe e qualquer um do dito agregado para menos do que ou igual a cerca de 4% em peso com base no dito peso total.
[000341] 173. Processo da modalidade 164, onde as condições são suficientes para diminuir o dito nível total de qualquer uma da dita im- pureza trissulfeto, qualquer uma da dita impureza des-phe e qualquer um do dito agregado para menos do que ou igual a cerca de 3% em peso com base no dito peso total.
[000342] 174. Processo da modalidade 164, onde as condições são suficientes para diminuir o dito nível total de qualquer uma da dita im- pureza trissulfeto, qualquer uma da dita impureza des-phe e qualquer um do dito agregado para menos do que ou igual a cerca de 2% em peso com base no dito peso total.
[000343] 175. Processo da modalidade 164, onde as condições são suficientes para diminuir o dito nível total de qualquer uma da dita im- pureza trissulfeto, qualquer uma da dita impureza des-phe e qualquer um do dito agregado para menos do que ou igual a cerca de 1% em peso com base no dito peso total.
[000344] 176. Processo da modalidade 134, onde o dito antagonista de hormônio do crescimento é B-2036 PEG onde o dito B-2036 PEG compreende uma estrutura principal de polipeptídeo de antagonista de hormônio do crescimento de B-2036 [SEQ ID N° 1].
[000345] 177. Processo da modalidade 134, onde o dito hormônio do crescimento é uma forma peguilada de um polipeptídeo da [SEQ ID N° 2].
[000346] 178. Processo da modalidade 137, onde o dito material de apoio tem um diâmetro de a partir de cerca de 10 a cerca de 500 μm. 179. Processo da modalidade 178, onde o dito diâmetro tem uma mé- dia de 90 μm.
[000347] 180. Processo para agrupamento de isoformas de proteína peguilada, o dito processo compreendendo as etapas de: (a) separação das ditas isoformas de proteína peguilada em isoformas selecionadas; e (b) combinação das ditas isoformas selecionadas para dar um agrupamento enriquecido das ditas isoformas selecionadas.
[000348] 181. Processo da modalidade 180, onde as ditas isoformas selecionadas são PEG-4, PEG-5 e PEG-6 com uma razão em peso de agrupamento de ((um primeiro peso de PEG-4 + PEG-5 + PEG-6)/(um segundo peso de qualquer um de PEG-1 + PEG-2 + PEG-3 + PEG-4 + PEG-5 + PEG-6 + PEG-7 + PEG-8 + PEG-9 presente no dito agrupa- mento enriquecido)) razão em peso de agrupamento que é maior do que ou igual a cerca de 70% em peso.
[000349] 182. Processo da modalidade 181, onde a dita razão em peso do agrupamento é maior do que ou igual a cerca de 75% em peso.
[000350] 183. Processo da modalidade 181, onde a dita razão em peso do agrupamento é maior do que ou igual a cerca de 80% em peso.
[000351] 184. Processo da modalidade 181, onde a dita razão em peso do agrupamento é maior do que ou igual a cerca de 85% em peso.
[000352] 185. Processo da modalidade 181, onde a dita razão em peso do agrupamento é maior do que ou igual a cerca de 90% em peso.
[000353] 186. Processo da modalidade 181, onde a dita razão em peso do agrupamento é maior do que ou igual a cerca de 94% em peso.
[000354] 187. Processo da modalidade 181, onde a dita razão em peso do agrupamento é maior do que ou igual a cerca de 95% em peso.
[000355] 188. Processo da modalidade 181, onde a dita razão em peso do agrupamento é maior do que ou igual a cerca de 96% em peso.
[000356] 189. Processo da modalidade 181, onde a dita razão em peso do agrupamento é maior do que ou igual a cerca de 97% em peso.
[000357] 190. Processo da modalidade 181, onde a dita razão em peso do agrupamento é maior do que ou igual a cerca de 98% em peso.
[000358] 191. Processo da modalidade 181, onde a dita razão em peso do agrupamento é maior do que ou igual a cerca de 99% em peso.
[000359] 192. Processo da modalidade 181, onde a dita razão em peso do agrupamento é maior do que ou igual a cerca de 99,5% em peso.
[000360] 193. Processo da modalidade 181, onde a dita razão em peso do agrupamento é maior do que ou igual a cerca de 99,9% em peso.
[000361] 194. Processo da modalidade 180, onde as ditas isoformas selecionadas são uma ou mais de PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9.
[000362] 195. Processo da modalidade 180, onde as ditas isoformas selecionadas são uma ou mais de PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9.
[000363] 196. Processo da modalidade 180, onde as ditas isoformas selecionadas são uma ou mais de PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9.
[000364] 197. Processo da modalidade 180, onde as ditas isoformas selecionadas são uma ou mais de PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9.
[000365] 198. Processo da modalidade 180, onde as ditas isoformas selecionadas são uma ou mais de PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7 e PEG-8.
[000366] 199. Processo da modalidade 180, onde as ditas isoformas selecionadas são uma ou mais de PEG-4, PEG-5, PEG-6 e PEG-7.
[000367] 200. Processo da modalidade 180, onde as ditas isoformas selecionadas são uma ou mais de PEG-4, PEG-5 e PEG-6.
[000368] 201. Processo da modalidade 180, onde as ditas isoformas selecionadas são uma ou mais de PEG-4 e PEG-5.
[000369] 202. Processo da modalidade 180, onde as ditas isoformas selecionadas são uma ou mais de PEG-5 e PEG-6.
[000370] 203. Processo da modalidade 180, onde as ditas isoformas selecionadas são uma ou mais de PEG-4 e PEG-5.
[000371] 204. Processo para obtenção de uma isoforma de proteína peguilada selecionada de uma mistura de pelo menos duas isoformas de proteína peguilada, o dito processo compreende a etapa de: (a) separação da dita isoforma de proteína peguilada sele- cionada da dita mistura.
[000372] 205. Processo para preparação de uma composição enri- quecida a partir de uma composição de partida, onde a dita composi- ção de partida compreende B-2036 não-peguilada e uma ou mais iso- formas peguiladas de B-2036 selecionadas do grupo consistindo em PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG- 9, e onde o dito processo compreende as etapas de: (a) separação da dita composição de partida em uma plura- lidade de frações, onde a razão em peso de uma primeira fração de isoformas PEG-4, PEG-5 e PEG-6 para isoformas B-2036 não- peguiladas e B-2036 peguiladas totais em pelo menos uma fração dife- re da fração em peso de uma segunda fração de isoformas PEG-4, PEG-5 e PEG-6 para isoformas B-2036 não-peguilada e B-2036 pegui- lada em pelo menos uma outra fração, (b) determinação de uma razão em peso de isoformas PEG-4, PEG-5 e PEG-6 para isoformas de B-2036 não-peguilada e B- 2036 peguilada de um restante de cada fração ou em uma amostra- gem de frações, e (c) seletivamente combinação de menos de todas as ditas frações para dar a dita composição enriquecida, onde uma razão em peso de fração enriquecida das isoformas PEG-4, PEG-5 e PEG-6 pa- ra isoformas B-2036 não-peguilada e B-2036 peguilada totais é maior do que na dita composição enriquecida do que na dita composição de partida.
[000373] Todos os valores numéricos e moléculas identificadas neste pedido são exemplares e não pretendem ser considerados como limi- tantes das reivindicações. O que segue é apresentado a título de exemplo e não deve ser compreendido como uma limitação do escopo da invenção. Todas as citações a livros, revistas, artigos de jornal, pa- tentes ou quaisquer outras publicações, etc, mencionadas neste pedi- do, são expressamente aqui incorporados a título de referência em sua totalidade para todos os propósitos. Exemplos Exemplo 1 Manutenção ou Diminuição do Nível de Agregado de Antagonista de Hormônio do Crescimento Peguilado (B-203-PEG) através de Croma- tografia de Troca de Ânion
[000374] A manutenção (abaixo de um nível desejado - por exemplo, < 6% em peso de peso total) ou diminuição dos níveis de agregado de B-2036 PEG foi realizada usando BI (o Intermediário Bruto B-2036) como o material de partida preparado conforme indicado no pedido de patente U.S. não-provisório n° de série interino P-107.891 intitulado "Method for the Production of Growth Hormone and Antagonist Thereof Having Lower Levels of Isoform Impurities Thereof" depositado em 25 de agosto de 2003, antes do U.S. Patente and Trademark Office. Fer- mentação (para dar B-2036) em um sistema de expressão de E. coli recombinante foi realizada conforme descrito por Cunningham e outros na Patente U.S. N° 5.849.535. Purificação de B-2036 BI foi realizada conforme descrito pelo pedido de patente U.S. não-provisório acima identificado N° (P-107. 891). Este material foi então processado usan- do as etapas de cromatografia de interação hidrofóbica e peguilação iniciais conforme mencionado no fluxograma 1 abaixo para produzir B- 2036 PEG. Seguindo a cromatografia de interação hidrofóbica (etapa 2), a B-2036 PEG era UF/DF em pH 7, 25 mM de tampão TRIS (ao invés de tampão de acetato de sódio pH 4 como no processo do Exemplo 2, etapa 3, fluxograma 2). O retentato foi então submetido à cromatografia de troca de ânion forte de coluna de Q-Sepharose FF. Esta etapa separa diferencialmente espécies PEGuiladas em frações para agrupamento para atingir a distribuição de espécies PEGuiladas requeridas para liberação de API. Esta coluna enriquece os produtos de PEG-4, PEG-5 e PEG-6 de BI PEGuilado (B-2036 PEG). O produto é eluído com um gradiente linear de 20 CV de 0-250 mM de NaCl em 25 mM de Tris, pH 7,0 seguindo etapas de equilíbrio e uma lavagem de 2 CV com 25 mM de Tris, pH 7,0. Análise das frações é realizada usando CE ao invés de SDS-PAGE conforme notado no Exemplo 2, fluxograma 2. Vide discussão anterior com relação ao mesmo. Pegvi- somant (Somavert®, Pharmacia) é coletado do perfil de cromatografia como um agrupamento das frações analisadas através de CE com um critério de agrupamento de > 75% PEG4+5+6 (primeira fração) e > 94% PEG4+5+6 (última fração) e > 0,5% mg/ml. O produto resultante foi então carregado durante o restante do processo de purificação de B-2036 PEG conforme descrito no fluxograma 1. Após seleção e agru- pamento das frações, a análise do material agrupado e API final atra- vés de SEHPLC não mostrou nenhum agregado detectável. Vide Ta- bela 1 indicando o mesmo abaixo.
[000375] Os dados que seguem foram obtidos usando o procedimento acima mencionado do Exemplo 1. Tabela 1: Parâmetros de Cromatografia de Troca de Ânion e Rendimento com Dados de Agregado
[000376] A um tubo de centrífuga de 15 ml, 1,5 ml de resina S- Sepharose FF (volume de leito fixado) foi adicionado. A resina foi pre- parada para ligação de proteína através de enxágüe duas vezes com 10 ml de uma solução a 1% do aditivo a ser avaliado em 25 mM de acetato de Sódio, pH 4. Após cada enxágüe, o sobrenadante foi cole- tado (através de centrifugação) e decantado e descartado. O pélete de resina enxaguada, 2,5 ml de solução a 1% do aditivo a ser avaliado em 25 mM de acetato de Sódio, pH 4, foram adicionados e uma quan- tidade de retentato de UF/DF foi adicionada contendo aproximadamen- te 5 mg de B-2036 PEG da etapa 3 (preparada através do método de fluxograma 2, etapas 1 a 3). A resina foi então ressuspensa na solução e incubada com mistura suave por 2 a 24 horas. Após incubação, a solução foi centrifugada e o sobrenadante decantado e descartado. A B-2036 PEG foi então eluída a partir da resina através da adição ao pélete da resina de 2,5 ml de uma solução a 1% do aditivo a ser avali- ada em 25 mM de acetato de sódio, pH 4, e 0,25 ml de cloreto de só- dio 2,5M. A resina na solução resultante foi ressuspensa e incubada com mistura suave por 20 minutos. Após incubação, o sobrenadante é retido através de centrifugação e decantado para análise através de cromatografia de exclusão de tamanho (por exemplo, SEHPLC (HPLC de exclusão de tamanho). Então o pélete de resina usada é descarta- do. O procedimento acima foi repetido para cada aditivo a ser avaliado usando Resina de Cromatografia de Troca de Cátion para determinar se a formação de agregado poderia ser eliminada ou suficientemente diminuída. Usando este procedimento acima mencionado, os resulta- dos da Tabela 2 abaixo foram obtidos. Conforme refletido na Tabela 2, nenhum aditivo testado usando uma resina catiônica foi tão bem- sucedido como foi a mudança para a resina aniônica para diminuir o nível de agregado formado.
[000377] RPHPLC é usada aqui para monitorar e quantificar porcen- tagens de espécies peguiladas (por exemplo, PEG-4, PEG-5 e PEG-6) encontradas em frações de coluna de Q-Sepharose a partir da purifi- cação de troca de ânion de pegvisomant.
[000378] 25 uL de cada fração de Q-Sepharose (etapa de troca de ânion, vide Exemplo 1 acima) (concentração de proteína variando de a partir de 0,5 a 1,3 mg/mL) são aplicados a uma coluna Zorbax 300SB- CN (4,6 mm x 150 mm; 3,5 μm; Número Part 863973-905; Número se- rial USMJ001205). A fase móvel A é ácido trifluoracético a 0,1%, en- quanto a fase móvel consiste em 0,085% de ácido trifluoracético em acetonitrila. Um gradiente linear de a partir de 40 a 50 por cento de Tampão B durante 20 minutos em uma taxa de fluxo de 1,0 mL/min em temperatura ambiente é usado para separação das formas Peguiladas diferentes de Pegvisomant. A absorbância é monitorada a 214 nm.
[000379] Os resultados obtidos através de RPHPLC são similares àqueles derivados através de eletroforese capilar (CE) conforme indi- cados nas Figuras 2-4 abaixo. Vide também Exemplo 4 abaixo quanto a procedimento exemplar de técnica analítica. Tabela 3
[000380] Os resultados comparativos de CE vs RPHPLC são mos- trados nas Figuras 2, 3 e 4 para B-2036 PEG-4, B-2036 PEG-5 e B- 2036 PEG-6. (Inserir 1a figura 2 pg. 76)
[000381] Frações de Q-Sepharose foram analisadas através de Ele- troforese Capilar como segue. O capilar, tendo um Diâmetro Interior de 50 μm e comprimento eficaz de 37 cm, foi condicionado através de en- xágüe com 1,0N de NaOH por 10 minutos em pressão de137,90 kPa (20 psi) seguido por um enxágüe de 20 minutos com tampão de ope- ração. O tampão de operação, 40 mM de ácido fosfórico, 4 mg/mL de O’O-Bis-(2-aminopropil)polietileno glicol, 0,1 mg/mL de óxido de polieti- leno, pH 1,9-2,0, foi preparado a partir de 10X de solução de estoque e filtrado em um filtro de 0,22 μm a fim de remover partículas que pos- sam causar entupimentos no capilar.
[000382] As amostras foram aquecidas para temperatura ambiente de modo a prevenir formação de agregado quando entrando em conta- to com tampão de diluição de amostra (40 mM de ácido fosfórico, 4 mg/mL de O’O-Bis (2-aminopropil)polietileno glicol, pH 1,9-2,2) ou tampão de operação. As amostras que eram <0,5 mg/mL não foram analisadas. Amostras > 0,5 mg/mL foram injetadas puras, enquanto que amostras com uma concentração > 2,0 mg/mL foram diluídas com 2,0 mg/mL usando tampão de diluição de amostra. As amostras foram injetadas no capilar usando pressão de 3,45 kPa (0,5 psi) por 10-60 segundos. Seguindo a injeção da amostra, o tampão de operação foi injetado por 3 segundos a 3,45 kPa (0,5 psi) a fim de concentrar a amostra. As amostras foram separadas por 25 minutos a 30 kV em um mínimo de 30° C e detectadas a 214 nm. O capilar foi enxaguado an- tes de cada injeção de amostra subseqüente com 0,1N de NaOH por pelo menos um minuto a 137,90 kPa (20 psi) e tampão de operação por dois minutos a fim de remover qualquer amostra retida da parede capilar. Armazenamento da amostra foi mantido a 25-30° C.
[000383] Os eletroferogramas resultantes foram integrados através de divisão dos picos no ponto menor entre os picos vizinhos e a por- centagem de área corrigida foi calculada.
[000384] Usando o procedimento acima mencionado junto com a descrição da Etapa 4, o fluxograma 1, Exemplo 1, os resultados obti- dos através de CE são aqueles indicados nas Figuras 2-4 acima.
[000385] Frações de Q-Sepharose foram analisadas através de CE como segue. O capilar, tendo um diâmetro interno de 50 μM e com- primento eficaz de 37 cm, foi condicionado através de enxágüe com 1,0N de NaOH por 10 minutos em pressão de 137,90 kPa (20 psi) se- guido por um enxágüe de 20 minutos com tampão de operação. O tampão de operação, 40 mM de ácido fosfórico, 4 md/mL de O’O- Bis(2-aminopropil)polietileno glicol, 0,1 mg/mL de óxido de polietileno, pH 1,9-2,0, foi preparado a partir de 10X de solução de estoque e fil- trado em um filtro de 0,22 μm a fim de remover as partículas que pos- sam causar entupimentos no capilar.
[000386] As amostras foram aquecidas para temperatura ambiente de modo a prevenir formação de agregado quando entrando em conta- to com tampão de diluição de amostra (40 mM de ácido fosfórico, 4 mg/mL de O’O-Bis (2-aminopropil)polietileno glicol, pH 1,9-2,2) ou tampão de operação. As amostras que eram <0,5 mg/mL não foram analisadas. Amostras > 0,5 mg/mL foram injetadas puras, enquanto que amostras com uma concentração > 2,0 mg/mL foram diluídas com 2,0 mg/mL usando tampão de diluição de amostra. As amostras foram injetadas no capilar usando pressão de 3,45 kPa (0,5 psi) por 10-60 segundos. Seguindo a injeção da amostra, o tampão de operação foi injetado por 3 segundos a 3,45 kPa (0,5 psi) a fim de concentrar a amostra. As amostras foram separadas por 25 minutos a 30 kV em um mínimo de 30° C e detectadas a 214 nm. O capilar foi enxaguado an- tes de cada injeção de amostra subseqüente com 0,1N de NaOH por pelo menos um minuto a 137,90 kPa (20 psi) e tampão de operação por dois minutos a fim de remover qualquer amostra retida da parede capilar. Armazenamento da amostra foi mantido a 25-30° C.
[000387] Os eletroferogramas resultantes foram integrados através de divisão dos picos no ponto menor entre os picos vizinhos e a por- centagem de área corrigida foi calculada.
[000388] Usando o procedimento acima mencionado junto com a des- crição da Etapa 4, o fluxograma 1, Exemplo 1, os resultados obtidos atra- vés de CE são aqueles indicados na Tabela 5a abaixo. Um agrupamento de isoformas peguiladas enriquecidas foi preparado usando o critério de aceitação como frações de agrupamento, aquelas frações analisadas através de CE com uma composição de >74% de PEG4+5+6 (primeira fração) e >94% de PEG4+5+6 (última fração) e >0,5 mg/mL. As frações 6 a 25 (Tabela 5a abaixo) foram selecionadas e combinadas em um agru- pamento usando esses critérios. O material de partida de UF/DF N°3 e as frações agrupadas combinadas foram submetidos à análise de CE con- forme acima mencionado. Após seleção e agrupamento das frações, a análise do material agrupado mostra enriquecimento das isoformas PEG- 4, PEG-5 e PEG-6. Vide Tabela 5b indicando o mesmo abaixo. Tabela 5a
[000389] Frações de Q-Sepharose foram analisadas através de CE como segue. O capilar, tendo um diâmetro interno de 50 μM e com- primento eficaz de 37 cm, foi condicionado através de enxágüe com 1,0N de NaOH por 10 minutos em pressão de 137,90 kPa (20 psi) se- guido por um enxágüe de 20 minutos com tampão de operação. O tampão de operação, 40 mM de ácido fosfórico, 4 mg/mL de O’O- Bis(2-aminopropil)polietileno glicol, 0,1 mg/mL de óxido de polietileno, pH 1,9-2,0, foi preparado a partir de 10X de solução de estoque e fil- trado em um filtro de 0,22 μm a fim de remover as partículas que pos- sam causar entupimentos no capilar.
[000390] As amostras foram aquecidas para temperatura ambiente de modo a prevenir formação de agregado quando entrando em conta- to com tampão de diluição de amostra (40 mM de ácido fosfórico, 4 mg/mL de O’O-Bis (2-aminopropil)polietileno glicol, pH 1,9-2,2) ou tampão de operação. As amostras que eram <0,5 mg/mL não foram analisadas. Amostras > 0,5 mg/mL foram injetadas puras, enquanto que amostras com uma concentração > 2,0 mg/mL foram diluídas com 2,0 mg/mL usando tampão de diluição de amostra. As amostras foram injetadas no capilar usando pressão de 3,45 kPa (0,5 psi) por 10-60 segundos. Seguindo a injeção da amostra, o tampão de operação foi injetado por 3 segundos a 3,45 kPa (0,5 psi) a fim de concentrar a amostra. As amostras foram separadas por 25 minutos a 30 kV em um mínimo de 30° C e detectadas a 214 nm. O capilar foi enxaguado an- tes de cada injeção de amostra subseqüente com 0,1N de NaOH por pelo menos um minuto a 137,90 kPa (20 psi) e tampão de operação por dois minutos a fim de remover qualquer amostra retida da parede capilar. Armazenamento da amostra foi mantido a 25-30° C.
[000391] Os eletroferogramas resultantes foram integrados através de divisão dos picos no ponto menor entre os picos vizinhos e a por- centagem de área corrigida foi calculada.
[000392] Usando o procedimento acima mencionado junto com a des- crição da Etapa 4, o fluxograma 1, Exemplo 1, os resultados obtidos através de CE são aqueles indicados na Tabela 6a abaixo. Um agrupa- mento de isoformas peguiladas enriquecidas foi preparado usando o cri- tério de aceitação como frações de agrupamento, aqueles frações anali- sadas através de CE com uma composição de >75% de PEG4+5+6 (primeira fração) e >94% de PEG4+5+6 (última fração) e >0,5 mg/mL. As frações 3 a 20 (Tabela 6a abaixo) foram selecionadas e combinadas em um agrupamento usando esses critérios. O material de partida de UF/DF N° 3 (medido como agrupamento de HIC) e as frações agrupadas com- binadas foram submetidos à análise de CE conforme acima mencionado. Após seleção e agrupamento das frações, a análise do material agrupa- do mostra enriquecimento das isoformas PEG-4, PEG-5 e PEG-6. Vide Tabela 6b indicando o mesmo abaixo. Tabela 6a
[000393] Embora a presente descrição tenha sido provida com rela- ção a B-2036 recombinante e B-2036 PEG recombinante, a menos que de outro modo indicado, é compreendido que o objeto da invenção pode ser usado com qualquer agonista de hormônio do crescimento peguilado recombinante, antagonista de hormônio do crescimento pe- guilado recombinante, seja ele hormônio do crescimento de mamífero ou seu antagonista, hormônio do crescimento humano peguilado ou seu antagonista ou hormônio do crescimento bovino peguilado ou seu antagonista, qualquer proteína peguilada, qualquer hormônio peguila- do, qualquer anticorpo peguilado (ou fragmento(s)), etc.
Claims (12)
1. Processo para diminuição de um nível de agregado de um antagonista de hormônio do crescimento (GH) peguilado e isofor- mas do mesmo, o dito processo caracterizado pelo fato de que com- preende as etapas de: (a) provisão peguilada do dito antagonista de hormônio do crescimento (GH) peguilado e isoformas do mesmo; e (b) carregamento do dito antagonista de hormônio do cres- cimento (GH) peguilado e isoformas do mesmo incluindo qualquer im- pureza e qualquer agregado do mesmo na resina de troca de ânion (AEX), em que o carregamento é conduzido em uma condutividade menor do que ou igual a cerca de 10 mS/cm, em um pH de cerca de 5 a cerca de 10, e uma concentração de proteína menor ou igual a cerca de 10 g de proteína/L de volume de leito embalado de resina de AEX; e (c) separação do dito antagonista de hormônio do cresci- mento (GH) peguilado e isoformas do mesmo através de cromatografia de troca de ânion (AEX).
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita resina de AEX é selecionada do grupo consis- tindo em ANX4, DEAE, Q-Sepharose®, Q-Sepharose FF®, Q- Sepharose HP® e Q-Sepharose XL®.
3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracte- rizado pelo fato de que na etapa (b) o carregamento é realizado em uma condutividade menor do que ou igual a cerca de 5 mS/cm.
4. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracte- rizado pelo fato de que na etapa (b) o carregamento é realizado em uma condutividade menor do que ou igual a cerca de 2,4 mS/cm.
5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a dita etapa (b) é realizada em um pH de carregamento de AEX de cerca de 6,6 a cerca de 9.
6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a dita etapa (b) é realizada em um pH de carregamento de AEX de cerca de 6,9 a cerca de 7,1.
7. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito antagonista de hormônio do crescimento (GH) peguilado e isoformas do mesmo compreende antagonista de hormô- nio do crescimento (GH) peguilado e isoformas do mesmo em um ou mais sítios.
8. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o dito antagonista de hormônio do crescimento (GH) peguilado e isoformas do mesmo compreende um ou mais do dito iso- formas de antagonista de hormônio do crescimento (GH) peguilado selecionado do grupo consistindo em: PEG-1 (uma molécula de B-2036 (SEQ ID NO: 1) com uma molécula de PEG ou variante do mesmo), PEG-2 (uma molécula de B-2036 (SEQ ID NO: 1) com duas moléculas de PEG ou variante do mesmo), PEG-3 (uma molécula de B-2036 (SEQ ID NO: 1) com três moléculas de PEG ou variante do mesmo), PEG-4 (uma molécula de B-2036 (SEQ ID NO: 1) com qua- tro moléculas de PEG ou variante do mesmo), PEG-5 (uma molécula de B-2036 (SEQ ID NO: 1) com cin- co moléculas de PEG ou variante do mesmo), PEG-6 (uma molécula de B-2036 (SEQ ID NO: 1) com seis moléculas de PEG ou variante do mesmo), PEG-7 (uma molécula de B-2036 (SEQ ID NO: 1) com sete moléculas de PEG ou variante do mesmo), PEG-8 (uma molécula de B-2036 (SEQ ID NO: 1) com oito moléculas de PEG ou variante do mesmo), e PEG-9 (uma molécula de B-2036 (SEQ ID NO: 1) com nove moléculas de PEG ou variante do mesmo) e qualquer agregado, molécula antagonista da impureza trissulfeto (hormônio do crescimento (GH)) que contém um átomo de enxofre extra que forma uma "ponte trissulfeto" dentro da molécula) e impureza des-phe (molécula antagonista do hormônio do crescimento (GH) sem sua fenilalanina amino-terminal) e qualquer impureza não peguilada do dito antagonista do hormônio do crescimento (GH) e quaisquer moléculas livres de PEG.
9. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma etapa de agrupamento (d) de quantidades diferentes de agrupamento das isoformas do antagonista do hormônio do crescimento (GH) para dar um antagonista do hormô- nio do crescimento (GH) peguilado agrupado através de uma técnica selecionada do grupo consistindo em: eletroforese capilar (CE), eletroforese de dodecil sulfato de sódio-gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), cromatografia de troca de íon (IEX), cromatografia de interação hidrofóbica (HIC), cromatografia de troca de ânion (AEX), cromatografia de troca de cátion (CEX), croma- tografia líquida de alta pressão de fase reversa (RPHPLC), cromato- grafia líquida de alta pressão de exclusão de tamanho (SEHPLC), cromatografia de afinidade (AC) e suas combinações.
10. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracteriza- do pelo fato de que o dito antagonista do hormônio do crescimento (GH) peguilado agrupado compreende uma ou mais de PEG-1, PEG- 2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9.
11. Processo de acordo com a reivindicação 10, caracteri- zado pelo fato de que a fração do antagonista do hormônio do cresci- mento (GH) peguilado agrupado de PEG-4, PEG-5 e PEG-6 compre- ende pelo menos cerca de 70% em peso com base no peso total das ditas isoformas de antagonista do hormônio do crescimento (GH) pe- guilado PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 e PEG-9 e qualquer agregado dela.
12. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteriza- do pelo fato de que o dito nível do dito agregado é menos do que ou igual a cerca de 10% em peso com base em um peso total das ditas isoformas e dito agregado.
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