PL212726B1 - Sposób obnizenia poziomu agregatu polietylenoglikolowanego antagonisty hormonu wzrostu B-2036 i jego izoform - Google Patents
Sposób obnizenia poziomu agregatu polietylenoglikolowanego antagonisty hormonu wzrostu B-2036 i jego izoformInfo
- Publication number
- PL212726B1 PL212726B1 PL375443A PL37544303A PL212726B1 PL 212726 B1 PL212726 B1 PL 212726B1 PL 375443 A PL375443 A PL 375443A PL 37544303 A PL37544303 A PL 37544303A PL 212726 B1 PL212726 B1 PL 212726B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- peg
- growth hormone
- protein
- antagonist
- polyethylene glycol
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 74
- 108091006006 PEGylated Proteins Proteins 0.000 title abstract 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 title description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 claims abstract description 173
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 claims abstract description 173
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 213
- -1 PEG-5 Chemical compound 0.000 claims description 194
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 167
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 166
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 claims description 146
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 claims description 146
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 claims description 123
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 121
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 88
- 238000011109 contamination Methods 0.000 claims description 68
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 claims description 51
- UWHCKJMYHZGTIT-UHFFFAOYSA-N tetraethylene glycol Chemical compound OCCOCCOCCOCCO UWHCKJMYHZGTIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 51
- IIRDTKBZINWQAW-UHFFFAOYSA-N hexaethylene glycol Chemical compound OCCOCCOCCOCCOCCOCCO IIRDTKBZINWQAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 50
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 claims description 48
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 claims description 43
- 101000611641 Rattus norvegicus Protein phosphatase 1 regulatory subunit 15A Proteins 0.000 claims description 35
- ZIBGPFATKBEMQZ-UHFFFAOYSA-N triethylene glycol Chemical compound OCCOCCOCCO ZIBGPFATKBEMQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 35
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 claims description 33
- 229940122853 Growth hormone antagonist Drugs 0.000 claims description 31
- YZUUTMGDONTGTN-UHFFFAOYSA-N nonaethylene glycol Chemical compound OCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO YZUUTMGDONTGTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 23
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 20
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 claims description 16
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 11
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 claims description 8
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 8
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 claims description 8
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims description 8
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 8
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 claims description 6
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims description 4
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 4
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 claims description 3
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 claims description 2
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 claims description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 abstract description 20
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 19
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 abstract description 14
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 abstract description 14
- 238000011176 pooling Methods 0.000 abstract description 4
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 abstract 1
- 108700030081 B 2036 Proteins 0.000 description 216
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 164
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 101
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 91
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 85
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 85
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 82
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 73
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 65
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 65
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 65
- 108700037519 pegvisomant Proteins 0.000 description 60
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 48
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 44
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 44
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 38
- 229960002995 pegvisomant Drugs 0.000 description 32
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 28
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 28
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 26
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 26
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 26
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 26
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 24
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 22
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 22
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 21
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 20
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 19
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 17
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 17
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 16
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 16
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 15
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 15
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 15
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 15
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 15
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 14
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 13
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 13
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 13
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 13
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 13
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 13
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 12
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 12
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 12
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 12
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 11
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 11
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 10
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 10
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 10
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 10
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 10
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 9
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 9
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 9
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 9
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 9
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 8
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 8
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 8
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 8
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 8
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 7
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 7
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 7
- 239000008240 homogeneous mixture Substances 0.000 description 7
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 7
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 7
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N N,N-bis{2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl}glycine Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(=O)O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 6
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 6
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 6
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 6
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 6
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 6
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 6
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 6
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 6
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 6
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 6
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N L-cystine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CSSC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 5
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N Methanethiol Chemical class SC LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 5
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 5
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 5
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 5
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100020948 Growth hormone receptor Human genes 0.000 description 4
- 229940124013 Growth hormone receptor antagonist Drugs 0.000 description 4
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 4
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 4
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 4
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 4
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 4
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- LJRDOKAZOAKLDU-UDXJMMFXSA-N (2s,3s,4r,5r,6r)-5-amino-2-(aminomethyl)-6-[(2r,3s,4r,5s)-5-[(1r,2r,3s,5r,6s)-3,5-diamino-2-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-amino-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-hydroxycyclohexyl]oxy-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl]oxyoxane-3,4-diol;sulfuric ac Chemical compound OS(O)(=O)=O.N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](N)C[C@@H](N)[C@@H]2O)O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)N)O[C@@H]1CO LJRDOKAZOAKLDU-UDXJMMFXSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RPNUMPOLZDHAAY-UHFFFAOYSA-N Diethylenetriamine Chemical compound NCCNCCN RPNUMPOLZDHAAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003109 Disodium ethylene diamine tetraacetate Substances 0.000 description 3
- SHWNNYZBHZIQQV-UHFFFAOYSA-J EDTA monocalcium diisodium salt Chemical compound [Na+].[Na+].[Ca+2].[O-]C(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC([O-])=O)CC([O-])=O SHWNNYZBHZIQQV-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 3
- QZKRHPLGUJDVAR-UHFFFAOYSA-K EDTA trisodium salt Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC([O-])=O)CC([O-])=O QZKRHPLGUJDVAR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940103526 Growth hormone receptor agonist Drugs 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UBQYURCVBFRUQT-UHFFFAOYSA-N N-benzoyl-Ferrioxamine B Chemical compound CC(=O)N(O)CCCCCNC(=O)CCC(=O)N(O)CCCCCNC(=O)CCC(=O)N(O)CCCCCN UBQYURCVBFRUQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 3
- 229920000388 Polyphosphate Polymers 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BVEYFFFHQUSUKP-UHFFFAOYSA-N [Na].[Na].[Ca].[Na].[Na].[Na].[Na] Chemical compound [Na].[Na].[Ca].[Na].[Na].[Na].[Na] BVEYFFFHQUSUKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 239000001201 calcium disodium ethylene diamine tetra-acetate Substances 0.000 description 3
- 235000011188 calcium disodium ethylene diamine tetraacetate Nutrition 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 3
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 3
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 3
- 229960000958 deferoxamine Drugs 0.000 description 3
- 235000019301 disodium ethylene diamine tetraacetate Nutrition 0.000 description 3
- VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N dithioerythritol Chemical compound SC[C@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N 0.000 description 3
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 229960001639 penicillamine Drugs 0.000 description 3
- 239000001205 polyphosphate Substances 0.000 description 3
- 235000011176 polyphosphates Nutrition 0.000 description 3
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- GWQWBFBJCRDINE-UHFFFAOYSA-M sodium;carbamodithioate Chemical compound [Na+].NC([S-])=S GWQWBFBJCRDINE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 3
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 229910052723 transition metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ALBODLTZUXKBGZ-JUUVMNCLSA-N (2s)-2-amino-3-phenylpropanoic acid;(2s)-2,6-diaminohexanoic acid Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 ALBODLTZUXKBGZ-JUUVMNCLSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IIAXFBUTKIDDIP-ULQDDVLXSA-N Arg-Leu-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O IIAXFBUTKIDDIP-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 2
- NPDLYUOYAGBHFB-WDSKDSINSA-N Asn-Arg Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N NPDLYUOYAGBHFB-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- HDHZCEDPLTVHFZ-GUBZILKMSA-N Asn-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HDHZCEDPLTVHFZ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- GADKFYNESXNRLC-WDSKDSINSA-N Asn-Pro Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O GADKFYNESXNRLC-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- HBUJSDCLZCXXCW-YDHLFZDLSA-N Asn-Val-Tyr Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 HBUJSDCLZCXXCW-YDHLFZDLSA-N 0.000 description 2
- PBVLJOIPOGUQQP-CIUDSAMLSA-N Asp-Ala-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O PBVLJOIPOGUQQP-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- YNQIDCRRTWGHJD-ZLUOBGJFSA-N Asp-Asn-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O YNQIDCRRTWGHJD-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 2
- DWOGMPWRQQWPPF-GUBZILKMSA-N Asp-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O DWOGMPWRQQWPPF-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- JDDYEZGPYBBPBN-JRQIVUDYSA-N Asp-Thr-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O JDDYEZGPYBBPBN-JRQIVUDYSA-N 0.000 description 2
- RGTVXXNMOGHRAY-WDSKDSINSA-N Cys-Arg Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N RGTVXXNMOGHRAY-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- PQHYZJPCYRDYNE-QWRGUYRKSA-N Cys-Gly-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O PQHYZJPCYRDYNE-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- KBKGRMNVKPSQIF-XDTLVQLUSA-N Glu-Ala-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O KBKGRMNVKPSQIF-XDTLVQLUSA-N 0.000 description 2
- DSPQRJXOIXHOHK-WDSKDSINSA-N Glu-Asp-Gly Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O DSPQRJXOIXHOHK-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- PHONAZGUEGIOEM-GLLZPBPUSA-N Glu-Glu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O PHONAZGUEGIOEM-GLLZPBPUSA-N 0.000 description 2
- JDUKCSSHWNIQQZ-IHRRRGAJSA-N Glu-Phe-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O JDUKCSSHWNIQQZ-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 2
- OVSKVOOUFAKODB-UWVGGRQHSA-N Gly-Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCN=C(N)N OVSKVOOUFAKODB-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- UHPAZODVFFYEEL-QWRGUYRKSA-N Gly-Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CN UHPAZODVFFYEEL-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- 101710099093 Growth hormone receptor Proteins 0.000 description 2
- OMNVOTCFQQLEQU-CIUDSAMLSA-N His-Asn-Asp Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N OMNVOTCFQQLEQU-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N L-Phenylalanyl-L-lysin Natural products NCCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XIRYQRLFHWWWTC-QEJZJMRPSA-N Leu-Ala-Phe Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XIRYQRLFHWWWTC-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 2
- YORLGJINWYYIMX-KKUMJFAQSA-N Leu-Cys-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O YORLGJINWYYIMX-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- DSFYPIUSAMSERP-IHRRRGAJSA-N Leu-Leu-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N DSFYPIUSAMSERP-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- LXKNSJLSGPNHSK-KKUMJFAQSA-N Leu-Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N LXKNSJLSGPNHSK-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- WXUOJXIGOPMDJM-SRVKXCTJSA-N Leu-Lys-Asn Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O WXUOJXIGOPMDJM-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- TWPCWKVOZDUYAA-KKUMJFAQSA-N Lys-Phe-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O TWPCWKVOZDUYAA-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- MYTOTTSMVMWVJN-STQMWFEESA-N Lys-Tyr Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 MYTOTTSMVMWVJN-STQMWFEESA-N 0.000 description 2
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 2
- WSXKXSBOJXEZDV-DLOVCJGASA-N Phe-Ala-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]([NH3+])CC1=CC=CC=C1 WSXKXSBOJXEZDV-DLOVCJGASA-N 0.000 description 2
- RFCVXVPWSPOMFJ-STQMWFEESA-N Phe-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 RFCVXVPWSPOMFJ-STQMWFEESA-N 0.000 description 2
- XOHJOMKCRLHGCY-UNQGMJICSA-N Phe-Pro-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O XOHJOMKCRLHGCY-UNQGMJICSA-N 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- ZSKJPKFTPQCPIH-RCWTZXSCSA-N Pro-Arg-Thr Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O ZSKJPKFTPQCPIH-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 2
- ZKQOUHVVXABNDG-IUCAKERBSA-N Pro-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 ZKQOUHVVXABNDG-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- XQPHBAKJJJZOBX-SRVKXCTJSA-N Pro-Lys-Glu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O XQPHBAKJJJZOBX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- AIOWVDNPESPXRB-YTWAJWBKSA-N Pro-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@@H]2CCCN2)O AIOWVDNPESPXRB-YTWAJWBKSA-N 0.000 description 2
- 108010068542 Somatotropin Receptors Proteins 0.000 description 2
- 101000868144 Sus scrofa Somatotropin Proteins 0.000 description 2
- BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N Thr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]([NH3+])[C@@H](C)O BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 2
- WCRFXRIWBFRZBR-GGVZMXCHSA-N Thr-Tyr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 WCRFXRIWBFRZBR-GGVZMXCHSA-N 0.000 description 2
- VPRHDRKAPYZMHL-SZMVWBNQSA-N Trp-Leu-Glu Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)=CNC2=C1 VPRHDRKAPYZMHL-SZMVWBNQSA-N 0.000 description 2
- BVDHHLMIZFCAAU-BZSNNMDCSA-N Tyr-Cys-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O BVDHHLMIZFCAAU-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 2
- VVZDBPBZHLQPPB-XVKPBYJWSA-N Val-Glu-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O VVZDBPBZHLQPPB-XVKPBYJWSA-N 0.000 description 2
- GUIYPEKUEMQBIK-JSGCOSHPSA-N Val-Tyr-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)NCC(O)=O GUIYPEKUEMQBIK-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 2
- MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N [CH2]CN(CC)CC Chemical group [CH2]CN(CC)CC MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 108010077245 asparaginyl-proline Proteins 0.000 description 2
- 108010040443 aspartyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 108010042598 glutamyl-aspartyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 2
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010076756 leucyl-alanyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 108010073101 phenylalanylleucine Proteins 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical class [H]N([H])* 0.000 description 2
- 108010090894 prolylleucine Proteins 0.000 description 2
- 108010053725 prolylvaline Proteins 0.000 description 2
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 description 2
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L sodium sulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])=O GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229940099077 somavert Drugs 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 108010015666 tryptophyl-leucyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 2
- AASBXERNXVFUEJ-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) propanoate Chemical compound CCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O AASBXERNXVFUEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000954 2-hydroxyethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 1
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 1
- PBVAJRFEEOIAGW-UHFFFAOYSA-N 3-[bis(2-carboxyethyl)phosphanyl]propanoic acid;hydrochloride Chemical compound Cl.OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PBVAJRFEEOIAGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010000599 Acromegaly Diseases 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- PBAMJJXWDQXOJA-FXQIFTODSA-N Ala-Asp-Arg Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N PBAMJJXWDQXOJA-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- ZPXCNXMJEZKRLU-LSJOCFKGSA-N Ala-His-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C)CC1=CN=CN1 ZPXCNXMJEZKRLU-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- MJINRRBEMOLJAK-DCAQKATOSA-N Arg-Lys-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N MJINRRBEMOLJAK-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- RZVVKNIACROXRM-ZLUOBGJFSA-N Asn-Ala-Asp Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N RZVVKNIACROXRM-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- MYLZFUMPZCPJCJ-NHCYSSNCSA-N Asp-Lys-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O MYLZFUMPZCPJCJ-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- PQUCIEFHOVEZAU-UHFFFAOYSA-N Diammonium sulfite Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S([O-])=O PQUCIEFHOVEZAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M Formate Chemical compound [O-]C=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- CQGBSALYGOXQPE-HTUGSXCWSA-N Glu-Thr-Phe Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)O CQGBSALYGOXQPE-HTUGSXCWSA-N 0.000 description 1
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-M Glycolate Chemical compound OCC([O-])=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- STAVRDQLZOTNKJ-RHYQMDGZSA-N Leu-Arg-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O STAVRDQLZOTNKJ-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical group [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- UEEJHVSXFDXPFK-UHFFFAOYSA-N N-dimethylaminoethanol Chemical group CN(C)CCO UEEJHVSXFDXPFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102220587327 NEDD8-activating enzyme E1 catalytic subunit_H21N_mutation Human genes 0.000 description 1
- 229920002562 Polyethylene Glycol 3350 Polymers 0.000 description 1
- 239000004721 Polyphenylene oxide Substances 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 108010002519 Prolactin Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100029000 Prolactin receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010003201 RGH 0205 Proteins 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 1
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 1
- IQHUITKNHOKGFC-MIMYLULJSA-N Thr-Phe Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 IQHUITKNHOKGFC-MIMYLULJSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N acrylic acid group Chemical group C(C=C)(=O)O NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- VVUBWCWVDFCEOP-UHFFFAOYSA-N benzene;styrene Chemical compound C1=CC=CC=C1.C=CC1=CC=CC=C1 VVUBWCWVDFCEOP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YOUGRGFIHBUKRS-UHFFFAOYSA-N benzyl(trimethyl)azanium Chemical compound C[N+](C)(C)CC1=CC=CC=C1 YOUGRGFIHBUKRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GBAOBIBJACZTNA-UHFFFAOYSA-L calcium sulfite Chemical compound [Ca+2].[O-]S([O-])=O GBAOBIBJACZTNA-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000010261 calcium sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 150000003841 chloride salts Chemical group 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 239000012539 chromatography resin Substances 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000013329 compounding Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N cysteamine Chemical compound NCCS UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002887 deanol Drugs 0.000 description 1
- 108010005905 delta-hGHR Proteins 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012972 dimethylethanolamine Chemical group 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 108091005996 glycated proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000003667 hormone antagonist Substances 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 230000006651 lactation Effects 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- JESHZQPNPCJVNG-UHFFFAOYSA-L magnesium;sulfite Chemical compound [Mg+2].[O-]S([O-])=O JESHZQPNPCJVNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229960003151 mercaptamine Drugs 0.000 description 1
- 125000005395 methacrylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 239000012450 pharmaceutical intermediate Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 1
- 229920000570 polyether Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- BHZRJJOHZFYXTO-UHFFFAOYSA-L potassium sulfite Chemical compound [K+].[K+].[O-]S([O-])=O BHZRJJOHZFYXTO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000019252 potassium sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 235000010265 sodium sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 150000004763 sulfides Chemical class 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-L sulfite Chemical class [O-]S([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical group 0.000 description 1
- ZSDSQXJSNMTJDA-UHFFFAOYSA-N trifluralin Chemical compound CCCN(CCC)C1=C([N+]([O-])=O)C=C(C(F)(F)F)C=C1[N+]([O-])=O ZSDSQXJSNMTJDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/18—Ion-exchange chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/30—Extraction; Separation; Purification by precipitation
- C07K1/32—Extraction; Separation; Purification by precipitation as complexes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Description
Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu rekombinacyjnego wytwarzania żądanego polietylenoglikolowanego polipeptydu. Sposób ten dostarcza polietylenoglikolowany produkt polipeptydowy zawierający obniżone poziomy zanieczyszczeń agregatami i/lub określonymi izoformami. W szczególności wynalazek dotyczy także (1) sposobu rekombinacyjnego wytwarzania hormonu wzrostu B-2036 o obniżonej zawartości zanieczyszczeń agregatami i/lub izoformami oraz (2) sposobu rekombinacyjnego wytwarzania antagonisty hormonu wzrostu B-2036 (np. takiego jak pegwisomant i jego pośredniego produktu białkowego) o obniżonej zawartości zanieczyszczeń agregatami i/lub izoformami. Ściślej biorąc zanieczyszczenia izoformami, których zawartości są obniżane za pomocą sposobu według wynalazku, stanowią odpowiednio zanieczyszczenia izoformą trisiarczkową i des-phe hormonu wzrostu oraz antagonisty hormonu wzrostu (lub jego pośredniego produktu). Także i agregat stanowi niepożądany agregat polietylenoglikolowanego hormonu wzrostu, polietylenoglikolowanego antagonisty hormonu wzrostu lub ogólnie polietylenoglikolowanego białka.
Stan techniki
Pegwisomant (Somavert®, Pharmacia Corp.) jest antagonistą receptora ludzkiego hormonu wzrostu. Jest analogiem ludzkiego hormonu wzrostu (hGH), który został strukturalnie zmodyfikowany. Sekwencja aminokwasów białkowego składnika/produktu pośredniego (B-2036) pegwisomantu różni się od sekwencji aminokwasów w hGH w dziewięciu miejscach. Określone podstawienia aminokwasów są następujące: H18D, H21N, G120K, R167N, K168A, D171S, K172R, E174S i I179T. W dziedzinie techniki powszechnie przyjmuje się, że pierwszy symbol (tj. „H”18D) oznacza aminokwas w sekwencji hGH w danym miejscu numerowanym (tj. w 18. miejscu aminokwasu, jak na to wskazuje symbol H„18”D), który jest podstawiony aminokwasem oznaczonym drugim symbolem (tj. H18„D”). A zatem H18D oznacza podstawienie aminokwasu his aminokwasem asp w 18. miejscu aminokwasowym sekwencji aminokwasów hGH typu dzikiego.
Na fig. 1A przedstawiono schematycznie strukturę sekwencji aminokwasów białkowego składnika/produktu pośredniego (B-2036) pegwisomantu (PEG B-2036 lub B-2036 PEG)) z gwiazdkami wskazującymi możliwe miejsca przyłączenia polimeru glikolu polietylenowego (jednostki PEG). Ponadto sekwencję aminokwasów opisującą białkowy składnik/produkt pośredni (B-2036 bez przyłączenia jednostek PEG) pegwisomantu identyfikuje się tu jako SEK ID NR 1. Dla porównania sekwencję aminokwasów opisującą ludzki hormon wzrostu identyfikuje się tu jako SEK ID NR 2. Niniejszym podaje się obydwa opisy sekwencji. Patrz także Jorgensen i współpr., „Quantifying biosynthetic human growth hormone in Escherichia coli with electrophoresis under hydrophobic conditions”, J. Chromatography A, 817, 205-214 (1998) co do sekwencji hGH.
Strukturalnie pegwisomant jest białkiem (zawierającym 191 reszt aminokwasowych), z którym związane są kowalencyjnie jednostki PEG w liczbie od 4 do 6. Masa cząsteczkowa białkowego składnika/produktu pośredniego (B-2036) pegwisomantu wynosi 21.998 D. Masa cząsteczkowa każdej jednostki PEG pegwisomantu wynosi około 5000 D. Wskutek tego masy cząsteczkowe pegwisomantu wynoszą najczęściej około 42.000 (4 jednostki PEG w cząsteczce), 47.000 (5 jednostek PEG w cząsteczce) i 52.000 (6 jednostek PEG w cząsteczce) D.
W odniesieniu do agonisty, nie ograniczają c zakresu teorią, uważ a się, że endogenny hGH aktywuje swoje receptory wówczas, gdy pojedyncza cząsteczka hGH wiąże się z dwiema sąsiadującymi z nią (i jednakowymi) cząsteczkami receptorów, powodują c homodimeryzację receptorów za po średnictwem hormonu. Patrz opisy patentowe USA nr 5.849.535 i 6.057.292. Aktywność hGH zależy od jego zdolności do wiązania dwóch sąsiadujących z nim (i jednakowych) receptorów w dwóch osobnych miejscach (miejscu 1 i miejscu 2) w tej samej cząsteczce hGH. Te miejsca wiązania hGH, oznaczone jako miejsce 1 i miejsce 2, otrzymują numer 1 i 2 po to, aby odzwierciedlić kolejność ich wiązań z dwoma sąsiednimi (i jednakowymi) receptorami hGH, które pośredniczą w homodimeryzacji zależnej od hGH.
Ponadto uważa się, nie ograniczając zakresu teorią, że pegwisomant selektywnie wiąże receptory ludzkich hormonów wzrostu (receptory GH) na powierzchni komórek, gdzie blokuje on wiązanie endogennego ludzkiego hormonu wzrostu, przeszkadzając w ten sposób transdukcji sygnału ludzkiego hormonu wzrostu. Strukturalne modyfikacje części białkowej (zwanej również „składnikiem” lub „produktem pośrednim”) pegwisomantu (w odniesieniu do hGH) umożliwiają pegwisomantowi konkurencyjne blokowanie oddziaływania między cząsteczką hGH i receptorem hGH. Pegwisomant wiąże receptor GH, blokując w ten sposób wiązanie GH, ponieważ receptor jest zajmowany. Te strukturalne
PL 212 726 B1 modyfikacje zapobiegają dimeryzacji receptorów, wskutek czego nie następuje transdukcja sygnału. Przez takie blokowanie bliskiego oddziaływania między cząsteczką hGH i receptorem hGH, pegwisomant blokuje homodimeryzację receptorów hGH odbywającą się za pośrednictwem hGH, dzięki czemu pegwisomant wykazuje działanie antagonistyczne.
Tego antagonistę stosuje się do leczenia stanów obejmujących, nie ograniczając zakresu, akromegalię u pacjentów, którzy niewystarczająco reagują na zabiegi chirurgiczne, radioterapię i/lub inne konwencjonalne metody leczenia, albo którzy skądinąd nie są w stanie tolerować tych metod leczenia. Ponadto strukturalne modyfikacje białkowej części (B-2036) pegwisomantu powodują, że wykazuje on skłonność do wiązania receptora prolaktyny, która jest mniejsza niż w przypadku hGH, minimalizując w ten sposób niepożądane skutki uboczne odnoszące się do laktacji, związane ze stosowaniem pegwisomantu.
Białkowy produkt pośredni (B-2036) pegwisomantu syntezuje się z użyciem szczepu bakterii Escherichia coli zmodyfikowanego genetycznie przez dodanie plazmidu, który przenosi gen dla antagonisty receptora hormonu wzrostu (B-2036). Następnie B-2036 odzyskuje się z komórek bakteryjnych i oczyszcza. Oczyszczony B-2036 następnie jest polietylenoglikolowany w celu wytworzenia pegwisomantu (PEG B-2036). Opisy patentowe USA 5.849.535 i 6.057.292 ujawniają sposoby wytwarzania B-2036 i sposoby sprzęgania jednej lub większej liczby jednostek PEG z B-2036, aczkolwiek bez szczegółów o tym, jak obniżać, zmniejszać, eliminować, odwracać i/lub uniemożliwiać powstawanie w nim niedopuszczalnie wysokich poziomów zanieczyszczeń izoformami trisiarczkowymi i des-phe.
Jednym z problemów, napotykanych podczas konwencjonalnych rekombinacyjnych sposobów wytwarzania B-2036, jest powstawanie zanieczyszczeń izoformami, takich jak izoformy des-phe i trisiarczkowe. Innym problemem napotykanym podczas konwencjonalnych metod wytwarzania i oczyszczania, prowadzących do B-2036 PEG (tj. polietylenoglikolowanego B-2036, takiego jak pegwisomant) z B-2036, jest tworzenie niepożądanego agregatu B-2036 PEG, szczegółowo omawianego poniż ej.
Zanieczyszczenie izoformą des-phe jest to zanieczyszczenie, w którym cząsteczka B-2036 jest pozbawiona aminowej końcówki fenyloalaninowej. Patrz fig. 1A, na której przedstawiono tę aminową końcówkę z resztą fenyloalaninową (tj. oznaczoną literą „F”), sąsiadującą z zakończeniem -NH2 w B-2036. Zanieczyszczenie izoformą trisiarczkową jest to zanieczyszczenie, w którym cząsteczka B-2036 zawiera dodatkowy atom siarki, który tworzy „trisiarczkowy mostek” w tej cząsteczce. Patrz wstawkę na fig. 1B. Patrz również: Andersson i współpr., „Isolation and characterization of a trisulfide variant of recombinat human growth hormone formed during expression in Escherichia coli”, Int. J. Peptide Protein Res., 47, 311-321 (1996), oraz A. Jesperson i współpr., „Characterization of a trisulphide derivative of biosynthetic human growth hormone produced in Escherichia coli” Eur. J. Biochem., 219, 365-373 (1994). Nie ograniczając zakresu przez teorię, uważa się, że te zanieczyszczenia izoformami powstają najczęściej podczas wzrostu komórek (np. fermentacji) oraz ekspresji (syntezy i wydzielania) B-2036 w genetycznie modyfikowanych komórkach-gospodarzach i/lub podczas wydzielania i oczyszczania białka B-2036.
Rozważając problem agregatu, tworzenie takiego agregatu powoduje zmniejszenie wydajności żądanego białka i zwiększony koszt jego wytwarzania. A także jeśli poziom agregatu jest zbyt wysoki, to finalna proteina może mieć tak niską czystość, że staje się nieodpowiednia do użytku terapeutycznego.
Biorąc pod uwagę określone zanieczyszczenia, międzynarodowe zgłoszenie WO 94/24157 (opublikowane 27 października 1994) ujawnia hydrofobową pochodną hGH, zawierającą dodatkowy atom siarki w porównaniu z naturalnym hGH. Patrz WO 94/24157 na stronie 3, wiersze 3-10. Dodatkowy atom siarki hydrofobowej pochodnej hGH tworzy „trisiarczkowy mostek”, dając trisiarczkową odmianę hGH. Patrz WO 94/24157 na stronie 7, wiersze 11-16. Dokument WO 94/24157 stwierdza ponadto, że tę trisiarczkową odmianę hGH można z powrotem przekształcić w naturalną postać hGH przez poddanie tej trisiarczkowej odmiany hGH działaniu związku merkaptanowego, takiego jak cysteina, glutation, 2-merkaptoetanol lub ditiotreitol. Patrz WO 94/24157 na stronach 4 i 5.
Międzynarodowe zgłoszenie WO 96/02570 (opublikowane 1 lutego 1996) ujawnia inny sposób przekształcenia trisiarczkowej odmiany hGH z powrotem w naturalną postać z zastosowaniem albo siarczynu sodu, siarczynu potasu, siarczynu amonu, albo siarczynu metalu ziem alkalicznych, takiego jak siarczyn magnezu lub siarczyn wapnia. Patrz WO 94/24157 na stronie 4, wiersze 17-21.
Międzynarodowe zgłoszenie WO 00/02900 (opublikowane 20 stycznia 2000), zatytułowane „Method for the production of recombinant peptides with a Iow amount of trisulfides” omawia „sposób obniżania zawartości trisiarczków podczas wytwarzania rekombinacyjnych peptydów, np. białek i mniejszych peptydów. Wynalazek polega na nowym i nieoczekiwanym odkryciu, ż e zawartość tri4
PL 212 726 B1 siarczków podczas wytwarzania rekombinacyjnych peptydów można obniżyć przez dodanie soli metalu, korzystnie w nadmiarze, w trakcie albo po fermentacji, a nie, jak wcześniej sugerowano, przez przemianę utworzonych trisiarczków hormonu wzrostu w postać naturalną”. Patrz WO 00/02900 na stronie 2, wiersze 21-27. Dokument WO 00/02900 stwierdza ponadto, że „białkiem może być dowolne białko rekombinacyjne, ale korzystnie jest rekombinacyjnym hormonem wzrostu, który może być zarówno ludzki, jak i zwierzęcy, taki jak ludzki hormon wzrostu (hGH), wołowy hormon wzrostu (bGH) i ś wiń ski hormon wzrostu (pGH)”. Patrz WO 00/02900 na stronie 3, wiersze 4-6.
Międzynarodowe zgłoszenie nr WO 02/057478 (opublikowane 25 Iipca 2002), zatytułowane „Methods and Composition for Extracting Proteins from Cells”, dotyczy sposobu uwalniania białka z komórki gospodarza przez kontaktowanie tej komórki gospodarza ze środkiem redukującym i detergentem. To źródło literaturowe stwierdza, że celem tego środka redukującego jest „ułatwienie odzysku białek w ich naturalnych konformacjach”. Patrz WO 02/057478 na stronie 2, wiersze 16-18. Ponadto WO 02/057478 ujawnia, że „jeden lub większa liczba środków redukujących oznacza środki..., które redukują wiązania disiarczkowe i/lub utrzymują reszty tiolowe w zredukowanej postaci. Można stosować dowolny środek redukujący/dowolne środki redukujące. W korzystnej realizacji jeden lub większa liczba stosowanych środków redukujących jest wybrana z grupy obejmującej ditiotreitol (DTT), ditioerytrytol (DTE), cysteinę (Cys) i tris-2-karboksyetylofosfinę (TCEP)”. Patrz WO 02/057478 od strony 3, wiersz 24, do strony 4, wiersz 4.
Co do innych odnośników dotyczących oczyszczania, patrz opis patentowy USA nr 6.265.542 B1 (Fahrner i współpr., zatytułowany „Purification of Molecules”); opis patentowy USA nr 6.333.398 B1 (Blank, zatytułowany „Protein Purification”); opis patentowy USA nr 5.747.639 (Seely, zatytułowany „Use of Hydrophobic Interaction Chromatography to Purify Polyethylene Glycols”); międzynarodowe zgłoszenie nr PCT/US96/19459 (Ibrahim i współpr., zatytułowane “Activated Linkers and Methods for Making and Purifying the Same”); oraz zgłoszenie patentowe USA nr 2002/002271 A1 (Rinderknecht i współ pr., zatytuł owane „Antibody Purification”).
Jednakże podane wyżej źródła literaturowe nie mówią nic odnośnie zapobiegania, odwracania, zmniejszania lub eliminacji powstawania zanieczyszczeń izoformami, związanych z antagonistą hormonu wzrostu, takim jak pegwisomant lub jego część białkowa, B-2036 i/lub powstawaniem agregatu polietylenoglikolowanego białka, np. pegwisomantu. W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na ulepszone sposoby wytwarzania B-2036, które obniżają, osłabiają, uniemożliwiają, minimalizują, odwracają i/lub eliminują powstawanie zanieczyszczeń izoformami (trisiarczkowymi i/lub des-phe) i/lub powstawanie agregatu polietylenoglikolowanego białka. Podobnie, te źródła literaturowe nie wypowiadają się w kwestii wykrywania, osłabiania, minimalizacji, odwracania, zmniejszania lub eliminacji powstawania zanieczyszczeń izoformą des-phe hormonu wzrostu i/lub powstawania agregatu polietylenoglikolowanego białka, np. polietylenoglikolowanego hormonu wzrostu lub polietylenoglikolowanego ludzkiego hormonu wzrostu. W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na ulepszone sposoby wytwarzania hormonu wzrostu, które obniżają, osłabiają, uniemożliwiają, minimalizują, odwracają i/lub eliminują powstawanie zanieczyszczenia izoformą des-phe i/lub powstawanie agregatu polietylenoglikolowanego białka, np. polietylenoglikolowanego hormonu wzrostu lub polietylenoglikolowanego ludzkiego hormonu wzrostu.
Krótki opis rysunków
Fig. 1A przedstawia sekwencję aminokwasów w B-2036, która odpowiada SEK ID NR 1. Gwiazdki na fig. 1A (*) wskazują dziewięć (9) możliwych miejsc kowalencyjnego przyłączenia jednostek PEG do każdej cząsteczki B-2036. Należy zauważyć, że wprawdzie zidentyfikowano dziewięć (9) możliwych miejsc, ale nie wszystkie 9 miejsc muszą być kowalencyjnie związane z jednostkami PEG. Korzystnie występuje 4-6 jednostek PEG na cząsteczkę B-2036.
Fig. 1B przedstawia strukturę zanieczyszczenia B-2036 - izoformy trisiarczkowej (oznaczonej jako „Trisiarczkowy (+32 amu”)), w porównaniu z pożądaną postacią (oznaczoną jako „Natywny GHA”).
Fig. 2 jest graficznym porównaniem procentu substancji B-2036 PEG 4 znalezionych we frakcjach 7-18 z Q-Sepharose FF, oznaczonych przez elektroforezę kapilarną i HPLC w fazach odwróconych.
Fig. 3 jest graficznym porównaniem procentu substancji B-2036 PEG 5 znalezionych we frakcjach
7-18 z Q-Sepharose FF, oznaczonych przez elektroforezę kapilarną i HPLC w fazach odwróconych.
Fig. 4 jest graficznym porównaniem procentu substancji B-2036 PEG 6 znalezionych we frakcjach
7-18 z Q-Sepharose FF, oznaczonych przez elektroforezę kapilarną i HPLC w fazach odwróconych.
PL 212 726 B1
Istota wynalazku
W zwią zku z powyż szym zapotrzebowaniem na ulepszony sposób wytwarzania rekombinacyjnego polietylenoglikolowanego polipeptydowego agonisty hormonu wzrostu, rekombinacyjnego polietylenoglikolowanego polipeptydowego agonisty ludzkiego hormonu wzrostu, rekombinacyjnego polietylenoglikolowanego polipeptydowego antagonisty hormonu wzrostu i/lub rekombinacyjnego polietylenoglikolowanego polipeptydowego antagonisty ludzkiego hormonu wzrostu, o obniżonych poziomach niepożądanych agregatów i/lub zanieczyszczeń izoformami, niniejszy wynalazek jest nakierowany na ulepszenie sposobów wytwarzania rekombinacyjnego polietylenoglikolowanego polipeptydowego hormonu wzrostu (włącznie z ludzkim hormonem wzrostu, ale nie ograniczając zakresu) oraz rekombinacyjnego polietylenoglikolowanego polipeptydowego antagonisty hormonu wzrostu (włącznie z ludzkim antagonistą hormonu wzrostu, ale nie ograniczają c zakresu) o obniż onych poziomach zanieczyszczeń agregatami, izoformami des-phe i/lub trisiarczkowymi.
W odniesieniu do rekombinacyjnego hormonu wzrostu (włącznie z hGH, ale nie ograniczają c zakresu) powstawanie zanieczyszczenia izoformą des-phe obniża się dodając, odpowiednio, dostateczną ilość (1) czynnika chelatującego lub (2) soli metalu.
W odniesieniu do rekombinacyjnego antagonisty hormonu wzrostu (w łącznie z ludzkim antagonistą hormonu wzrostu, ale nie ograniczając zakresu) zanieczyszczenie izoformą trisiarczkową obniża się, odpowiednio, przez dostateczny kontakt między tym zanieczyszczeniem izoformą trisiarczkową i (1) związkiem merkaptanowym, (2) czynnikiem chelatującym, (3) solą metalu, (4) związkiem merkaptanowym wraz z solą metalu lub (5) związkiem merkaptanowym po kontaktowaniu z czynnikiem chelatującym, ale w nieobecności tego czynnika chelatującego.
W odniesieniu do rekombinacyjnego antagonisty hormonu wzrostu (włącznie z ludzkim antagonistą hormonu wzrostu, ale nie ograniczając zakresu) powstawanie zanieczyszczenia izoformą des-phe obniża się przez dodawanie, odpowiednio, (1) czynnika chelatującego lub (2) soli metalu.
W odniesieniu do rekombinacyjnego polietylenoglikolowanego biał ka (a w tym, ale nie ograniczając zakresu, polietylenoglikolowanego hormonu, polietylenoglikolowanego antagonisty hormonu wzrostu, polietylenoglikolowanego antagonisty ludzkiego hormonu wzrostu, polietylenoglikolowanego hormonu wzrostu i/lub polietylenoglikolowanego ludzkiego hormonu wzrostu), poziom agregatu jest utrzymywany lub obniżony do lub poniżej wymaganego poziomu za pomocą chromatografii anionowymiennej, w trakcie wydzielania polietylenoglikolowanych izoform tego białka.
Szczegółowy opis korzystnych realizacji
W zgłoszeniu uż yto następujące skróty:
AC
AEX
API
BI
B-2036 PEG PEG B-2036 CE
CEX cm
CV
DEAE
HEPES
HIC
IEX kDa
I
LPM ml mM mS
MWCO μm
N
NaCI chromatografia powinowactwa wymiana anionowa czynny składnik farmaceutyczny półprodukt luzem; B-2036 (nie-polietylenoglikolowany) polietylenoglikolowany B-2036 polietylenoglikolowany B-2036 elektroforeza kapilarna wymiana kationowa centymetry pojemność kolumny dietyloaminoetyl kwas N-(2-hydroksyetylo)piperazyno-N-(2-etano)sulfonowy chromatografia oddziaływania hydrofobowego wymiana jonowa kilodaltony litry litry na minutę mililitry milimolowy milisimensy próg odcięcia masy cząsteczkowej mikrometry normalność chlorek sodu
PL 212 726 B1
NaOH wodorotlenek sodu
NWP znormalizowana przenikalność wody
PEG cząsteczka glikolu polietylenowego lub jej odmiana
PEG-1 jedna cząsteczka B-2036 polietylenoglikolowana czą steczką PEG lub jej odmiana
PEG-2 jedna cząsteczka B-2036 polietylenoglikolowana czą steczkami PEG lub jej odmiana
PEG-3 jedna cząsteczka B-2036 polietylenoglikolowana czą steczkami PEG lub jej odmiana
PEG-4 jedna cząsteczka B-2036 polietylenoglikolowana czą steczkami PEG lub jej odmiana
PEG-5 jedna cząsteczka B-2036 polietylenoglikolowana czą steczkami PEG lub jej odmiana
PEG-6 jedna cząsteczka B-2036 polietylenoglikolowana czą steczkami PEG lub jej odmiana
PEG-7 jedna cząsteczka B-2036 polietylenoglikolowana czą steczkami PEG lub jej odmiana
PEG-8 jedna cząsteczka B-2036 polietylenoglikolowana czą steczkami PEG lub jej odmiana
PEG-9 jedna cząsteczka B-2036 polietylenoglikolowana czą steczkami PEG lub jej odmiana
RPHPLC wysokosprawna chromatografia cieczowa w fazach odwróconych
SD odchylenie standardowe
SDS-PAGE elektroforeza w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu
SEHPLC wykluczeniowa wysokosprawna chromatografia cieczowa
TMP sprawność trans-membranowa
TRIS tris-(2-hydroksymetylo)-aminometan
UF/DF ultrafiltracja/diafiltracja
UV ultrafiolet
WFI woda do iniekcji
Termin „polietylenoglikolowane białko” obejmuje, nie ograniczając zakresu, hormon, hormon wzrostu, ludzki hormon wzrostu, antagonistę hormonu wzrostu, antagonistę ludzkiego hormonu wzrostu, przeciwciało (lub jego fragment) i B-2036 PEG. „Polietylenoglikolowane białko” obejmuje także, nie ograniczając zakresu, jedno lub więcej przedmiotowych białek, polietylenoglikolowanych w jednym lub większej liczbie miejsc.
Jeśli nie zaznaczono inaczej, termin „agregat” odnosi się do przypominających spaghetti skupisk jednej lub większej liczby przedmiotowych białek, czy polietylenoglikowanych czy nie-polietylenoglikolowanych. „Agregat” stanowi wielokrotność cząsteczek białka, które zgrupowały się ze sobą wskutek oddziaływań sferycznych lub w inny sposób. Przykłady „agregatu” obejmują, nie ograniczają zakresu, zaplątanie (1) wielu polietylenoglikolowanych cząsteczek białka (2) wielu nie-polietyIenoglikolowanych cząsteczek białka i/lub (3) co najmniej jednej polietyIenoglikolowanej cząsteczki białka i co najmniej jednej nie-polietylenoglikolowanej cząsteczki białka.
O ile nie zaznaczono inaczej, „zanieczyszczenie nie-polietylenoglikolowanego białka” obejmuje, nie ograniczając zakresu, nie-polietylenoglikolowane białka, tj. białka, bez dołączonej cząsteczki PEG lub jej odmiany.
O ile nie zaznaczono inaczej, „stechiometryczna proporcja wagowa” odnosi się do iloś ci wolnych cząsteczek PEG do ilości nie-polietylenoglikolowanych cząsteczek przedmiotowego białka.
O ile nie zaznaczono inaczej, termin „izoforma/y polietylenoglikolowanego białka” odnosi się do przedmiotowego białka mającego dołączony jeden lub więcej fragmentów PEG, korzystnie poprzez wiązanie kowalencyjne. Na przykład termin PEG-1 odnosi się do B-2036 mającego dołączoną jedną cząsteczkę PEG, korzystnie w takim jak miejscu, jak reszta aminokwasowa lizyny i/lub zakończenie aminowe. Podobnie, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 i PEG-9 odnoszą się do liczby cząsteczek PEG dołączonych do jednej cząsteczki B-2036. Zatem PEG-2 odnosi się do jednej B-2036 mającej dwie cząsteczki PEG dołączone doń, a PEG-3 odnosi się do trzech cząsteczek PEG dołączonych do jednej cząsteczki B-2036 itd.
PL 212 726 B1
O ile nie zaznaczono inaczej, termin „objętość upakowanego złoża” odnosi się do objętości upakowanego złoża konkretnej żywicy upakowanej w warunkach procesowych według zalecenia wytwórcy.
O ile nie zaznaczono inaczej, termin „zanieczyszczenie izoformą ” odnosi się do co najmniej zanieczyszczenia izoformą trisiarczkową, lub izoformą des-phe, niniejszym opisaną. Termin „zanieczyszczenie izoformą” może także obejmować inne zanieczyszczenia znane w dziedzinie.
Termin „przewodnictwo zbioru CE” odnosi się do pomiaru przewodnictwa zebranej frakcji CV poddanej CE.
Terminy „antagonista hormonu wzrostu” i „antagonista receptora hormonu wzrostu” obejmują (nie ograniczając zakresu) polietylenoglikoIowane polipeptydy i polipeptydy, które powstrzymują lub w inny sposób przeciwdziałają wią zaniu hormonu wzrostu z jego receptorem hormonu wzrostu w celu zablokowania biologicznego skutku/biologicznych skutków działania hormonu wzrostu. Korzystnie polietylenoglikolowanym „antagonistą hormonu wzrostu” lub polietylenoglikolowanym „antagonistą receptora hormonu wzrostu” jest polietylenoglikolowany B-2036, B-2036 lub jego odmiana. „Odmiany” obejmują, nie ograniczając zakresu, homologi (zwłaszcza homologi z zachowawczymi podstawieniami aminokwasowymi, dodatkami lub delecjami, względem B-2036), analogi, fragmenty, pseudopeptydy, przeciwciała itd. (odpowiednio), wykazujące działanie antagonisty receptora hormonu wzrostu.
Terminy „agonista hormonu wzrostu” i „agonista receptora hormonu wzrostu” obejmują (nie ograniczając zakresu) polietylenoglikolowane polipeptydy i polipeptydy, które wiążą i aktywują receptor hormonu wzrostu. Korzystnie „agonista hormonu wzrostu” lub „agonista receptora hormonu wzrostu” stanowi polietylenoglikolowany ludzki hormon wzrostu, ludzki hormon wzrostu lub jego odmianę. „Odmiany” obejmują (nie ograniczając zakresu) homologi (zwłaszcza homologi z zachowawczymi podstawieniami aminokwasowymi, dodatkami lub delecjami względem ludzkiego hormonu wzrostu), analogi, fragmenty, pseudopeptydy, przeciwciała itd. (odpowiednio), wykazujące działanie agonisty receptora hormonu wzrostu.
Wyrażenie „i” może oznaczać „i” albo „lub”, jeśli to potrzebne lub konieczne dla zrelacjonowania sposobu w celu uzyskania żądanego obniżenia poziomu istotnego zanieczyszczenia (np. zanieczyszczenia izoformą trisiarczkową lub des-phe i/lub agregatem).
Wyrażenie „lub” może oznaczać „i” albo „lub”, jeśli to potrzebne lub konieczne dla zrelacjonowania sposobu w celu uzyskania żądanego obniżenia poziomu istotnego zanieczyszczenia (np. zanieczyszczenia izoformą trisiarczkową lub des-phe i/lub agregatem).
Stosowany tu termin „obniżenie” (lub jego oczywiste odmiany), jeśli nie wskazano inaczej, oznacza utrzymanie, eliminację, minimalizację, zmniejszenie, zapobieganie i/lub osłabianie ilości agregatu w przedmiotowym białku i/lub relewantnego zanieczyszczenia izoformą, zarówno zanieczyszczenia izoformą trisiarczkową, jak i zanieczyszczenia izoformą des-phe.
Jeśli nie wskazano inaczej, to termin „komórka gospodarz” (lub jego oczywiste odmiany) oznacza dowolną komórkę gospodarza, w której można rekombinacyjnie wytworzyć B-2036 lub hGH. Zgodnie z tym komórka gospodarz może oznaczać komórkę gospodarza ssaka, roślinną komórkę gospodarza albo bakteryjną komórkę gospodarza, taką jak Escherichia coli, a nawet komórki drożdży. Należy wziąć pod uwagę, aby komórka gospodarz była wystarczająca dla wzrostu żądanego rekombinacyjnego białkowego składnika B-2036 lub rekombinacyjnego hGH. W związku z tym nie ma ograniczeń, jaka to może być komórka, z wyjątkiem tego, aby była ona zdolna do rekombinacyjnego wytwarzania białkowego składnika B-2036 lub rekombinacyjnego hGH, będących przedmiotem zainteresowania, albo ich „odmian”.
Ponadto używany tutaj termin „wzrost” (lub jego oczywiste odmiany), jeśli nie wskazano inaczej, obejmuje (ale nie ograniczając zakresu) fermentację i hodowlę, albo inne sposoby powodujące, że komórka-gospodarz/komórki-gospodarze, rozrasta się dostatecznie do wytwarzania żądanych ilości rekombinacyjnego białkowego składnika B-2036 lub rekombinacyjnego hGH.
Wprawdzie niniejszy wynalazek jest przedstawiony w odniesieniu do rekombinacyjnego B-2036 i rekombinacyjnego PEG B-2036, ale jeśli nie wskazano inaczej, to jest rzeczą zrozumiałą, że ten wynalazek można stosować w odniesieniu do dowolnego rekombinacyjnego agonisty hormonu wzrostu i rekombinacyjnego antagonisty hormonu wzrostu, niezależnie od tego, czy jest to hormon wzrostu ssaka lub jego antagonista, ludzki hormon wzrostu lub jego antagonista, czy też wołowy hormon wzrostu Iub jego antagonista itd.
Pegwisomant (powoływany tu jako PEG B-2036 lub B-2036 PEG) jest polietylenoglikolowaną postacią rekombinacyjnego białka (B-2036), wytworzonego w rekombinacyjnych komórkach gospodarzach (np. rekombinacyjnych, genetycznie modyfikowanych komórkach gospodarzach Escherichia
PL 212 726 B1 coli). Białko B-2036 jest wytwarzane podczas wzrostu komórek (np. przez fermentację) i ekspresji (synteza i wydzielanie). B-2036 po jego wytworzeniu jest wydzielane (np. przez homogenizację), a nastę pnie oczyszczane (np. przez ekstrakcję , odwirowywanie, chromatografię w odwróconych fazach i anionowymienną oraz wymianę buforową). Zauważono jednak, iż podczas rekombinacyjnego wytwarzania białka B-2036 powstają niepożądane zanieczyszczenia izoformami w B-2036, którymi są zanieczyszczenia izoformą trisiarczkową i des-phe B-2036.
Wskazano powyżej, że fig. 1A ilustruje sekwencję aminokwasów B-2036 ze standardowymi jednoliterowymi skrótami wskazującymi, jaki aminokwas występuje w danym miejscu oznaczonym literą. Dla zorientowania się należy zajrzeć do poniższej tablicy 1, wskazującej, jakie litery odpowiadają podanym aminokwasom.
T a b l i c a 1
Polipeptyd
Aminokwas
Ala (A)
Glu (E)
Gln (Q)
Asp (D)
Asn (N)
Leu (L)
Gly (G)
Lys (K)
Ser (S)
Val (V)
Arg (R)
Thr (T)
Pro (P)
Ile (I)
Met (M)
Phe (F)
Tyr (Y)
Cys (C)
Trp (W)
His (H)
Ponadto sekwencja aminokwasów B-2036 jest podana jako SEK ID NR 1, a sekwencja aminokwasów w hGH jest podana jako SEK ID NR 2.
1. Rekombinacyjny antagonista hormonu wzrostu i jego zanieczyszczenie izoformą trisiarczkową
Fig. 1B ilustruje strukturę sekwencji aminokwasów zanieczyszczenia izoformą trisiarczkową B-2036. W szczególności, zanieczyszczenie izoformą trisiarczkową zawiera dodatkowy atom siarki w mostku między cysteinami w miejscach 182 oraz 189 białkowego składnika B-2036.
a. Obniżanie zawartości zanieczyszczenia izoformą trisiarczkową z zastosowaniem związku (związków) merkaptanowego
Nie ograniczając zakresu do teorii, uważa się, że kontakt między wybranym związkiem (związkami) merkaptanowym i zanieczyszczeniem izoformą trisiarczkową rekombinacyjnego antagonisty hormonu wzrostu B-2036 powoduje przekształcenie trisiarczkowego mostka cysteina-S-S-S-cysteina z powrotem do naturalnej postaci cysteina-S-S-cysteina. Ponadto, również nie ograniczając zakresu do teorii, jest możliwe, że obecność związku (związków) merkaptanowego zapobiega dalszemu powstawaniu mostka trisiarczkowego.
Zwykle związek (związki) merkaptanowy dodaje się do komórki (komórek) gospodarza w syntezie żądanego rekombinacyjnego białkowego składnika B-2036 podczas wzrostu lub po wzroście (albo podczas wzrostu i po wzroście) komórki (komórek) gospodarza. Ponadto po przeprowadzeniu etapów wzrostu i kontaktowania, korzystne jest oczyszczanie białka B-2036. Następnie, oczyszczone białko korzystnie poddaje się polietylenoglikolowaniu, dostarczając PEG B-2036 (pegwisomant). Co do procedur polietylenoglikolowania patrz opis patentowy USA nr 5.849.535 i opis patentowy USA 5.672.662.
W niniejszym wynalazku można stosować dowolny związek merkaptanowy, który podczas kontaktu (korzystnie z zastosowaniem odpowiedniego mieszania) z białkowym składnikiem B-2036 wraz
PL 212 726 B1 z jego zanieczyszczeniem izoformą trisiarczkową, wystarcza do obniżenia poziomu tego zanieczyszczenia izoformą trisiarczkową, korzystnie bez degradacji (lub znacznej degradacji) uzysku B-2036. Korzystne związki merkaptanowe, nadające się do stosowania w wynalazku, obejmują (nie ograniczając zakresu) siarczyny, glutation, beta-merkaptoetanol, ditiotreitol, merkaptoetyloaminę, ditioerytrytol, chlorowodorek tris(2-karboksyetylo)fosfiny, cysteinę oraz cysteinę w mieszaninie z cystyną.
Inne związki merkaptanowe, nadające się do stosowania w wynalazku, są podane w następujących źródłach literaturowych: (1) J. Houk i G. M. Whitesides, „Structure-Reactivity Relations for Thiol-Disulfide Interchange”, J. M. Chem. Soc., 109, 6825-6836 (1987); (2) Sigmund, M., The Chemistry & Biochemistry of the Sulfhydro Group in Amino Acids, Peptides and Proteins, 1. wydanie, Pergamon, Nowy Jork (1973). W szczególności zobacz tablicę Il w powyższej pozycji (1) (Houk i współpr.) przedstawiającą przykładowe związki merkaptanowe nadające się do stosowania w niniejszym wynalazku.
Spośród odpowiednich związków merkaptanowych najkorzystniejsza jest cysteina albo cysteina w mieszaninie z cystyną (dimeryzowana cysteina). Ilość cysteiny lub mieszaniny cysteiny i cystyny (dimeryzowanej cysteiny, jeśli się ją stosuje), która jest odpowiednia do stosowania w wynalazku, powinna wystarczać do obniżenia zawartości powstałego zanieczyszczenia izoformą trisiarczkową co najmniej o około 10% jego najwyższego stężenia równowagowego (albo jego najwyższego średniego stężenia równowagowego, gdy uśrednia się szereg szarż wytwórczych). Korzystnie obniżenie zawartości powstałego zanieczyszczenia izoformą trisiarczkową wynosi odpowiednio co najmniej około 20%, 30%, 40% lub 50% jego najwyższego stężenia równowagowego (albo jego najwyższego średniego stężenia równowagowego). Początkowe łączne stężenie cysteiny i ewentualnie cystyny, odpowiednie do stosowania w wynalazku, korzystnie wynosi odpowiednio co najmniej około 0,1 mM, od około 0,1 mM do około 10 mM lub od około 1 mM do około 5 mM.
Korzystne jest dostarczenie związku merkaptanowego w roztworze buforowym. Korzystnie roztwór buforowy jest roztworem, który nadaje się do stosowania w wynalazku, tj. nie uniemożliwia wytwarzania białkowego składnika B-2036 ani nie rozkłada już wytworzonego. Roztwory buforowe, odpowiednie do stosowania w wynalazku, obejmują (nie ograniczając zakresu) roztwory Tris, fosforanowe, HEPES, kwasu cytrynowego, trietyloaminy i histydyny. Korzystnym roztworem buforowym jest Tris. Korzystne początkowe stężenie roztworu buforowego wynosi od około 1 mM do około 200 mM, bardziej korzystnie od około 5 mM do około 100 mM, jeszcze korzystniej od około 8 mM do około 70 mM, a najkorzystniej od około 10 mM do okoł o 50 mM. Moż na stosować inne odpowiednie roztwory buforowe. Korzystnie te roztwory wystarczają do utrzymywania wartości pH środowiska wzrostu wszędzie w zakresie odpowiednio od około 4 do około 9, od około 7,5 do około 8,5 lub od około 7,5 do około 8,0. W szczególności, gdy stosuje się związek merkaptanowy w wyższych stężeniach, to można dopuszczać wyższe wartości pH, np. nawet około 9,5. Jeśli więc np. stosuje się duży nadmiar cysteiny w stosunku do B-2036, to wartość pH roztworu buforowego moż e wynosić nawet okoł o 9,5.
Jak podano wyżej, korzystne jest wprowadzanie związku merkaptanowego w roztworze buforowym. Ponadto zawartość związku merkaptanowego w roztworze buforowym powinna być taka, aby proporcja moIowa liczby moli związku merkaptanowego do liczby moli białka B-2036 wynosiła od około 0,5 do około 1000. W szczególności występuje to wówczas, gdy stosowany związek merkaptanowy znajduje się w mieszaninie z cysteiną, a ewentualnie cysteina znajduje się w mieszaninie z cystyną. Alternatywnie proporcja molowa liczby moli związku merkaptanowego do liczby moli białka B-2036 może wynosić odpowiednio od około 1 do około 1000, od około 1 do około 500 lub od około 1 do około 10.
Zwykle po dostatecznym kontakcie (w celu obniżenia poziomu zanieczyszczenia izoformą trisiarczkową) między związkiem merkaptanowym i białkowym składnikiem B-2036 (wewnątrz komórki (komórek) gospodarza lub po zebraniu z tej komórki (tych komórek)) stężenie białkowego składnika B-2036 w roztworze buforowym wynosi odpowiednio od około 0,1 mg/ml do około 30 mg/ml, od około 0,5 mg/ml do około 20 mg/ml lub od około 1 mg/ml do około 10 mg/ml.
Ponadto zakres temperatur środowiska wzrostu, zawierającego roztwór buforowy, związek (związki) merkaptanowe i inne składniki, obejmujące B-2036 (nie ograniczając zakresu), powinien być utrzymywany korzystnie w granicach od około 0°C do około 25°C po dodaniu związku merkaptanowego do komórki (komórek) gospodarza lub jej Iizatu zawierającego białkowy składnik B-2036. Korzystnie także temperaturę komórki (komórek) gospodarza i/lub jej Iizatu zawierającego składnik B-2036 utrzymuje się odpowiednio w zakresie od około 1°C do około 15°C, od około 2°C do około 10°C lub od około 2°C do około 8°C. Należy zauważyć, że denaturacja białka B-2036 następuje w temperaturze około +40°C. W związku z tym jest pożądane utrzymywanie temperatury homogenatu (tj. zawierające10
PL 212 726 B1 go komórki gospodarzy, środowisko wzrostu, roztwór buforowy, związki merkaptanowe i B-2036 itd.) poniżej temperatury denaturacji białka B-2036.
Oprócz tego czas kontaktu między składnikiem B-2036 i związkiem merkaptanowym powinien być dostateczny do obniżenia poziomu zanieczyszczenia izoformą trisiarczkową. Przykładowe czasy kontaktu, odpowiednie dla obniżenia poziomu zanieczyszczenia izoformą trisiarczkową, powinny wynosić odpowiednio co najmniej około 30 minut, od około 1 godziny do około 24 godzin lub od około 1 godziny do okoł o 4 godzin.
Najczęściej po dostatecznym kontakcie między związkiem (związkami) merkaptanowym i skł adnikiem B-2036, roztwór buforowy, który je zawiera, ma obję tość odpowiednio od okoł o 1 I do około 5000 I, od około 10 I do około 500 I lub od około 100 I do około 300 I. Inne odpowiednie przykładowe objętości mogą wszędzie wynosić od 160 I do około 500 I.
Inne parametry, które mogą być istotne podczas kontaktu między związkiem (związkami) merkaptanowym i składnikiem B-2036 obejmują takie parametry, jak prędkość mieszania. Prędkość mieszania powinna być dostateczna do utworzenia jednorodnej mieszaniny (komórki (komórek) gospodarza, jej lizatu, roztworu buforowego, związku (związków) merkaptanowego, składnika B-2036 i wszystkich innych składników tworzących jedno środowisko wzrostu), minimalizując wielkość pienienia się, które może powstawać. Specjaliści w dziedzinie mogą z łatwością określić, jaka powinna być dostateczna prędkość mieszania. Oczywiście prędkość mieszania powinna być taka, aby temperatura była utrzymywana w wyżej podanych zakresach, oraz aby zminimalizować każdą degradację białkowego składnika B-2036.
b. Obniżanie zawartości zanieczyszczenia izoformą trisiarczkową z zastosowaniem czynnika (czynników) chelatującego
Nie ograniczając zakresu do teorii, uważa się, że kontakt między wybranym czynnikiem (czynnikami) chelatującym i (1) zanieczyszczeniem izoformą trisiarczkową, (2) rekombinacyjnym antagonistą hormonu wzrostu B-2036, (3) komórkowym składnikiem (składnikami) komórek gospodarzy (dla rekombinacyjnego wytwarzania tego antagonisty) i (4) wszelkimi kombinacjami (1)-(3) powoduje przekształcanie trisiarczkowego mostka cysteina-S-S-S-cysteina z powrotem do naturalnej postaci cysteina-S-S-cysteina, albo obniżanie poziomów tego zanieczyszczenia. Ponadto, również nie ograniczając zakresu do teorii, jest możliwe, że obecność czynnika (czynników) chelatującego zapobiega dalszemu powstawaniu mostka trisiarczkowego.
Najczęściej czynnik (czynniki) chelatujący dodaje się do komórki (komórek) gospodarza w syntezie żądanego rekombinacyjnego białkowego składnika B-2036 podczas wzrostu lub po wzroście (albo podczas wzrostu i po wzroście) komórki (komórek) gospodarza. Ponadto, po przeprowadzeniu etapów wzrostu i kontaktowania, korzystne jest oczyszczenie białka B-2036. Następnie oczyszczone białko korzystnie poddaje się polietylenoglikolowaniu, uzyskując PEG B-2036 (pegwisomant). Co do procedur polietylenoglikolowania zobacz opis patentowy USA nr 5.849.535.
W niniejszym wynalazku można stosować dowolny czynnik chelatujący, który podczas kontaktu (korzystnie z zastosowaniem odpowiedniego mieszania) z białkowym składnikiem B-2036 wraz z jego zanieczyszczeniem izoformą trisiarczkową, wystarcza do obniżenia poziomu tego zanieczyszczenia izoformą trisiarczkową, korzystnie bez degradacji (lub znacznej degradacji) uzysku B-2036. Korzystne czynniki chelatujące, nadające się do stosowania w wynalazku, obejmują (nie ograniczając zakresu) EDTA, EGTA i DTPA. Dalsze przykładowe czynniki chelatujące obejmują (nie ograniczając zakresu) deferoksaminę, ditiokarbaminian sodu, etylenodiaminotetraoctan wapnio-disodu, etylenodiaminotetraoctan disodu, etylenodiaminotetraoctan sodu, etylenodiaminotetraoctan trisodu, penicylaminę, dietylenotriaminopentaoctan wapnio-trisodu, kwas dietylenotriaminopentaoctowy, sukcymer i trientynę. Należy zwrócić uwagę, że etylenodiaminotetraoctan sodu to sól EDTA.
Inne czynniki chelatujące, nadające się do stosowania w wynalazku, są podane w następujących źródłach literaturowych: (I) The Merck Index, 12. wydanie, S. Budavari (wydawca), Merck & Co.,
Inc., Therapeutic Category and Biological Activity Index, strona THER-19 (pod „Chelating Agents”), Whitehouse Station, NJ (1996) oraz każde następne jego wydanie do chwili obecnej; (2) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. wydanie, Arthur Osol (wydawca), Mack Publishing Co., Easton, Pensylwania (1980) oraz każde następne jego wydanie do chwili obecnej; (3) The United States Pharmacopeia, 21. wydanie poprawione (16. wydanie), United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, Maryland (1985) oraz każde następne jego wydanie do chwili obecnej; (4) SIGMA, Biochemicals and Reagents for Life Science Research Catalogue, St. Louis, Missouri (2002-2003); oraz (5)
PL 212 726 B1
Aldrich, Handbook for Fine Chemicals and Laboratory Equipment, Milwaukee, Wisconsin, wydania (2000-2001) i (2002-2003).
Spośród odpowiednich czynników chelatujących najkorzystniejszym jest EDTA. Ilość czynnika chelatującego, która jest odpowiednia do stosowania w wynalazku, powinna wystarczać do obniżenia zawartości powstałego zanieczyszczenia izoformą trisiarczkową co najmniej o około 10% jego najwyższego stężenia równowagowego (albo jego najwyższego średniego stężenia równowagowego, gdy uśrednia się szereg szarż wytwórczych). Korzystnie obniżenie zawartości powstałego zanieczyszczenia izoformą trisiarczkową wynosi odpowiednio co najmniej około 20%, 30%, 40% lub 50% jego najwyższego stężenia równowagowego (albo jego najwyższego średniego stężenia równowagowego). Początkowe stężenie EDTA, odpowiednie do stosowania w wynalazku, korzystnie wynosi odpowiednio co najmniej około 0,01 mM, od około 0,01 mM do około 100 mM, od około 0,1 mM do około 20 mM, od około 2 mM do około 10 mM lub od około 2 mM do około 5 mM.
Korzystne jest dostarczenie czynnika chelatującego w roztworze buforowym. Korzystnie roztwór buforowy jest roztworem, który nadaje się do stosowania w wynalazku, tj. nie uniemożliwia wytwarzania białkowego składnika B-2036 ani nie rozkłada już wytworzonego. Roztwory buforowe odpowiednie do stosowania w wynalazku, obejmują (nie ograniczając zakresu) roztwory Tris, fosforanowe, HEPES, kwasu cytrynowego, trietyIoaminy i histydyny. Korzystnym roztworem buforowym jest roztwór Tris. Korzystne początkowe stężenie roztworu buforowego wynosi od około 1 mM do około 200 mM, bardziej korzystnie od około 5 mM do około 100 mM, jeszcze korzystniej od około 8 mM do około 70 mM, a najkorzystniej od około 10 mM do około 50 mM. Można stosować inne odpowiednie roztwory buforowe. Korzystnie te roztwory buforowe wystarczają do utrzymywania wartości pH środowiska wzrostu wszędzie w zakresie odpowiednio od około 6 do około 9, od około 6,5 do około 7,5 lub od około 7,2 do około 7,5.
Jak podano wyżej, korzystne jest dostarczenie czynnika chelatującego w roztworze buforowym. Ponadto zawartość czynnika chelatującego w roztworze buforowym powinna być taka, aby molowa proporcja liczby moli czynnika chelatującego do liczby moli białka B-2036 wynosiła od około 1 do około 1000. Alternatywnie molowa proporcja liczby moli czynnika chelatującego do liczby moli białka B-2036 może wynosić odpowiednio od około 20 do około 1000, od około 50 do około 250 lub od około 60 do około 110.
Najczęściej po dostatecznym kontakcie (w celu obniżenia poziomu zanieczyszczenia izoformą trisiarczkową) między czynnikiem chelatującym i białkowym składnikiem B-2036 (wewnątrz komórki (komórek) gospodarza lub po zebraniu z tej komórki (tych komórek)), stężenie białkowego składnika B-2036 w roztworze buforowym wynosi odpowiednio od około 0,1 mg/ml do około 20 mg/ml, od około 0,5 mg/ml do około 5 mg/ml lub od około 1 mg/ml do około 5 mg/ml.
Ponadto zakres temperatur środowiska wzrostu zawierającego roztwór buforowy, czynnik (czynniki) chelatujący i inne składniki, obejmujące B-2036 (nie ograniczając zakresu), powinien być utrzymywany korzystnie w granicach od około 0°C do około 35°C po dodaniu czynnika chelatującego do komórki (komórek) gospodarza lub jej Iizatu zawierającego białkowy składnik B-2036. Korzystnie także temperaturę komórki (komórek) gospodarza i/lub jej Iizatu zawierającego składnik B-2036 utrzymuje się odpowiednio w zakresie od około 1°C do około 15°C, od około 2°C do około 10°C lub od około 2°C do około 15°C. Należy zauważyć, że korzystnie po dodaniu czynnika chelatującego (np. EDTA), którego temperatura wynosi około 4°C, temperatura homogenatu zawierającego B-2036 wzrasta do około 30°C po homogenizacji. Ważne jest zwrócenie uwagi, że denaturacja białka B-2036 następuje w temperaturze około +40°C. W związku z tym wskazane jest utrzymywanie temperatury homogenatu (tj. zawierającego komórki gospodarzy, środowisko wzrostu, roztwór buforowy, czynnik chelatujący i B-2036 itd.) poniżej temperatury denaturacji białka B-2036.
Ponadto, czas kontaktu między składnikiem B-2036 i czynnikiem chelatującym powinien być dostateczny do obniżenia poziomu zanieczyszczenia izoformą trisiarczkową. Przykładowe czasy kontaktu, odpowiednie dla obniżenia poziomu zanieczyszczenia izoformą trisiarczkową, powinny wynosić odpowiednio co najmniej 30 minut, od około 1 godziny do około 48 godzin lub od około 5 godzin do około 15 godzin.
Zwykle po dostatecznym kontakcie między czynnikiem (czynnikami) chelatującym i składnikiem
B-2036, roztwór buforowy, który je zawiera, ma objętość odpowiednio od około 1 I do około 5000 I, od około 10 I do około 500 I lub od około 100 I do około 300 I. Inne odpowiednie przykładowe objętości mogą wynosić od 160 I do około 500 I.
PL 212 726 B1
Inne parametry, które mogą być istotne podczas kontaktu między czynnikiem (czynnikami) chelatującymi i składnikiem B-2036, obejmują takie parametry jak prędkość mieszania. Prędkość mieszania powinna być dostateczna do utworzenia jednorodnej mieszaniny (komórki (komórek) gospodarza, jej lizatu, roztworu buforowego, czynnika (czynników) chelatującego, składnika B-2036 i wszystkich innych składników tworzących środowisko wzrostu), minimalizując wielkość pienienia się, które może powstawać. Specjaliści w dziedzinie mogą z łatwością określić, jaka powinna być dostateczna prędkość mieszania. Oczywiście prędkość mieszania powinna być taka, aby temperatura utrzymywała się w wyżej podanych zakresach i aby zminimalizować każdą degradację białkowego składnika B-2036.
c. Obniżanie zawartości zanieczyszczenia izoformą trisiarczkową z zastosowaniem soli metali
Nie ograniczając zakresu do teorii, uważa się, że kontakt między wybraną solą metalu (solami metali) i (1) zanieczyszczeniem izoformą trisiarczkową, (2) rekombinacyjnym antagonistą hormonu wzrostu B-2036, (3) komórkowym składnikiem (składnikami) komórek gospodarzy (dla rekombinacyjnego wytwarzania tego antagonisty) i (4) wszelkimi kombinacjami (1)-(3) powoduje przekształcanie trisiarczkowego mostka cysteina-S-S-S-cysteina z powrotem do naturalnej postaci cysteina-S-S-cysteina albo obniżanie poziomów tego zanieczyszczenia. Ponadto, również nie ograniczając zakresu do teorii, jest możliwe, że obecność soli metali zapobiega dalszemu powstawaniu mostka trisiarczkowego.
Najczęściej sól metalu (sole metali) dodaje się do komórki (komórek) gospodarza w syntezie żądanego rekombinacyjnego białkowego składnika B-2036 podczas wzrostu lub po wzroście (albo podczas wzrostu i po wzroście) komórki (komórek) gospodarza. Ponadto po przeprowadzeniu etapów wzrostu i kontaktowania, korzystne jest oczyszczenie białka B-2036. Następnie oczyszczone białko korzystnie poddaje się polietylenoglikolowaniu uzyskując PEG B-2036 (pegwisomant). Co do procedury polietylenoglikolowania zobacz opis patentowy USA nr 5.849.535.
W wynalazku można stosować dowolną sól metalu, która podczas kontaktu (korzystnie z zastosowaniem odpowiedniego mieszania) z białkowym składnikiem B-2036 wraz z jego zanieczyszczeniem izoformą trisiarczkową wystarcza do obniżenia poziomu tego zanieczyszczenia izoformą trisiarczkową, korzystnie bez degradacji (lub znacznej degradacji) uzysku B-2036. Sól metalu (sole metali), nadająca się do stosowania w wynalazku, obejmuje (ale nie ogranicza się do niej) sól (sole) metali alkalicznych, sól (sole) metali ziem alkalicznych, sól (sole) metali przejściowych i ich mieszaniny. Korzystne sole metali, nadające się do stosowania w wynalazku, obejmują (nie ograniczając zakresu) fosforan potasu, octan potasu, fosforan sodu, octan sodu, chlorek cynku i ich mieszaniny.
Inne odpowiednie sole metali są podane w następujących źródłach literaturowych: (I) The Merck Index, 12. wydanie, S. Budavari (wydawca), Merck & Co., Inc., Therapeutic Category and Biological Activity Index, strona THER-19 (pod „Chelating Agents”), Whitehouse Station, NJ (1996) oraz każde następne jego wydanie do chwili obecnej; (2) Remington Pharmaceutical Sciences, 16. wydanie, Arthur Osol (wydawca), Mack Publishing Co., Easton, Pensylwania (1980) oraz każde następne jego wydanie do chwili obecnej; (3) The United States Pharmacopeia, 21. wydanie poprawione (16. wydanie), United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, Maryland (1985) oraz każde następne jego wydanie do chwili obecnej; (4) SIGMA, Biochemicals and Reagents for Life Science Research Catalogue, St. Louis, Missouri (2002-2003); oraz (5) Aldrich, Handbook for Fine Chemicals and Laboratory Equipment, Milwaukee, Wisconsin, wydania (2000-2001) i (2002-2003).
Spośród soli metali, nadających się do stosowania w wynalazku, korzystne są również fosforan sodu, ZnCl2 i ich mieszaniny. Ilość soli metalu (metali), odpowiednia do stosowania w wynalazku, powinna wystarczać do obniżenia zawartości powstałego zanieczyszczenia izoformą trisiarczkową co najmniej o około 10% jego najwyższego stężenia (albo jego najwyższego średniego stężenia, gdy uśrednia się szereg szarż wytwórczych). Korzystnie obniżenie zawartości powstałego zanieczyszczenia izoformą trisiarczkową wynosi odpowiednio co najmniej około 20%, 30%, 40% lub 50% jego najwyższego stężenia (albo jego najwyższego średniego stężenia). Początkowe stężenie soli metalu (np. fosforanu sodu), odpowiednie do stosowania w wynalazku, korzystnie wynosi odpowiednio co najmniej około 0,1 mM, od około 1 mM do około 500 mM, od około 1 mM do około 200 mM, od około 5 mM do około 175 mM, od oko ło 10 mM do około 150 mM lub od około 25 mM do około 100 mM.
Korzystne jest dostarczenie soli metalu w roztworze buforowym. Jednakże fosforan sodu może działać zarówno jako składnik roztworu buforowego, jak i odpowiednia sól metalu. Do buforowego roztworu fosforanu sodu można natomiast dodawać dodatkową odpowiednią sól metalu (sole metali). Korzystnie roztwór buforowy jest roztworem, który nadaje się do stosowania w wynalazku, tj. nie uniemożliwia wytwarzania białkowego składnika B-2036 ani nie rozkłada już wytworzonego. Roztwory buforowe, odpowiednie do stosowania w wynalazku, obejmują (nie ograniczając zakresu) roztwory
PL 212 726 B1
Tris, fosforanowe, HEPES, kwasu cytrynowego, trietyloaminy i histydyny. Korzystne początkowe stężenie roztworu buforowego wynosi od około 1 mM do około 200 mM, bardziej korzystnie od około 5 mM do około 100 mM, jeszcze korzystniej od około 8 mM do około 70 mM, a najkorzystniej od około 10 mM do około 50 mM. Można stosować inne odpowiednie roztwory buforowe. Korzystnie te roztwory buforowe wystarczają do utrzymania wartości pH środowiska wzrostu wszędzie w zakresie odpowiednio od około 4 do około 9, od około 4,5 do około 7,5 lub od około 5,5 do około 7,5.
Po wprowadzeniu soli metalu w roztworze buforowym (w przypadku fosforanu sodu jego roztwór działa zarówno jako roztwór soli, jak i roztwór buforowy) zawartość soli metalu w roztworze buforowym (lub fosforanu sodu w roztworze działającym również jako roztwór buforowy) powinna być taka, aby molowa proporcja liczby moli soli metalu do liczby moli białka B-2036 wynosiła od około 1 do około 10000. Alternatywnie molowa proporcja liczby moli soli metalu do liczby moli białka B-2036 może wynosić odpowiednio od około 300 do około 10000, od około 500 do około 5000 lub od około 500 do około 2500.
Najczęściej po dostatecznym kontakcie (w celu obniżenia poziomu zanieczyszczenia izoformą trisiarczkową) między solą metalu (solami metali) i białkowym składnikiem B-2036 (wewnątrz komórki (komórek) gospodarza lub po zebraniu z tej komórki (tych komórek)) stężenie białkowego składnika B-2036 w roztworze buforowym wynosi odpowiednio od około 0,1 mg/ml do około 20 mg/ml, od około 0,5 mg/ml do około 5 mg/ml lub od około 1 mg/ml do około 5 mg/ml.
Ponadto zakres temperatur środowiska wzrostu, zawierającego roztwór buforowy, sól metalu (sole metali) i inne składniki, obejmujące B-2036 (nie ograniczając zakresu), powinien być utrzymywany korzystnie w granicach od około 0°C do około 35°C po dodaniu soli metalu do komórki (komórek) gospodarza lub jej Iizatu zawierającego białkowy składnik B-2036. Korzystnie także temperaturę komórki (komórek) gospodarza i/lub jej Iizatu zawierającego składnik B-2036 utrzymuje się odpowiednio w zakresie od okoł o 1°C do okoł o 15°C, od okoł o 2°C do okoł o 10°C lub od około 2°C do około 15°C. Należy zauważyć, że po homogenizacji z solą metalu (np. NaP) temperatura homogenatu może wzrosnąć. Należy zwrócić uwagę, że denaturacja białka B-2036 następuje w temperaturze około +40°C. W związku z tym jest pożądane utrzymywanie temperatury homogenatu (tj. zawierają cego komórki gospodarzy, środowisko wzrostu, roztwór buforowy, sól metalu, B-2036 i ewentualnie związek merkaptanowy itd.) poniżej temperatury denaturacji białka B-2036.
Oprócz tego, czas kontaktu między składnikiem B-2036 i czynnikiem chelatującym powinien być dostateczny do obniżenia poziomu zanieczyszczenia izoformą trisiarczkową. Przykładowe czasy kontaktu, odpowiednie dla obniżenia poziomu zanieczyszczenia izoformą trisiarczkową, powinny wynosić odpowiednio co najmniej 30 minut, od około 1 godziny do około 48 godzin lub od około 5 godzin do około 15 godzin.
Zwykle po dostatecznym kontakcie między solą metalu (solami metali) i składnikiem B-2036, roztwór buforowy, który je zawiera, ma objętość odpowiednio od około 1 I do około 5000 I, od około 100 I do około 2000 I lub od około 200 I do około 1500 I.
Inne parametry, które mogą być istotne podczas kontaktu między solą metalu (solami metali) i składnikiem B-2036, obejmują takie parametry, jak prędkość mieszania. Prę dkość mieszania powinna być dostateczna do utworzenia jednorodnej mieszaniny (komórki (komórek) gospodarza, jej lizatu, roztworu buforowego, soli metalu (metali), składnika B-2036 i wszystkich innych składników tworzących środowisko wzrostu), minimalizując wielkość pienienia się, które może powstawać. Specjaliści w dziedzinie mogą z łatwością określić, jaka powinna być dostateczna prędkość mieszania. Oczywiście prędkość mieszania powinna być taka, aby temperatura utrzymywała się w wyżej podanych zakresach i aby zminimalizować każdą degradację białkowego składnika B-2036.
2. Rekombinacyjny antagonista hormonu wzrostu i jego zanieczyszczenie izoformą des-phe a. Obniżanie zawartości zanieczyszczenia izoformą des-phe z zastosowaniem czynnika chelatującego
Nie ograniczając zakresu do teorii, uważa się, że dodanie czynnika (czynników) chelatującego do rekombinacyjnego antagonisty hormonu wzrostu B-2036 powoduje obniżenie poziomu zanieczyszczenia izoformą des-phe, albo przez bieżące zmniejszenie jego poziomu i/albo przez zapobieganie dalszemu powstawaniu des-phe.
Zwykle czynnik (czynniki) chelatujący dodaje się do komórki (komórek) gospodarza w syntezie żądanego rekombinacyjnego białkowego składnika B-2036 podczas wzrostu lub po wzroście (albo podczas wzrostu i po wzroście) komórki (komórek) gospodarza. Ponadto po przeprowadzeniu etapów wzrostu i kontaktowania, korzystne jest oczyszczenie białka B-2036. Następnie oczyszczone białko
PL 212 726 B1 korzystnie poddaje się polietylenoglikolowaniu, uzyskując PEG B-2036 (pegwisomant). Co do procedury polietylenoglikolowania zobacz opis patentowy USA nr 5.849.535.
W wynalazku można stosować dowolny czynnik chelatujący, który podczas kontaktu (korzystnie z zastosowaniem odpowiedniego mieszania) z białkowym składnikiem B-2036 wraz z zanieczyszczeniem izoformą des-phe wystarcza do obniżenia poziomu tego zanieczyszczenia izoformą des-phe, korzystnie bez degradacji (lub znacznej degradacji) uzysku B-2036. Korzystne czynniki chelatujące, nadające się do stosowania w wynalazku, obejmują (nie ograniczając zakresu) EDTA, EGTA i DTPA. Dalsze przykładowe czynniki chelatujące obejmują (nie ograniczając zakresu) deferoksaminę, ditiokarbaminian sodu, etylenodiaminotetraoctan wapnio-disodu, etylenodiaminotetraoctan disodu, etylenodiaminotetraoctan sodu, etylenodiaminotetraoctan trisodu, penicylaminę, dietylenotriaminopentaoctan wapnio-trisodu, kwas dietylenotriaminopentaoctowy, sukcymer i trientynę. Należy zauważyć, że etylenodiaminotetraoctan sodu to sól EDTA.
Inne czynniki chelatujące, nadające się do stosowania w wynalazku, są podane w następujących źródłach literaturowych: (I) The Merck Index, 12. wydanie, S. Budavari (wydawca), Merck & Co.,
Inc., Therapeutic Category and Biological Activity Index, strona THER-19 (pod „Chelating Agents”), Whitehouse Station, NJ (1996) oraz każde następne jego wydanie do chwili obecnej; (2) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. wydanie, Arthur Osol (wydawca), Mack Publishing Co., Easton, Pensylwania (1980) oraz każde następne jego wydanie do chwili obecnej; (3) The United States Pharmacopeia, 21. wydanie poprawione (16. wydanie), United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, Maryland (1985) oraz każde następne jego wydanie do chwili obecnej; (4) SIGMA, Biochemicals and Reagents for Life Science Research Catalogue, St. Louis, Missouri (2002-2003); oraz (5) Aldrich, Handbook for Fine Chemicals and Laboratory Equipment, Milwaukee, Wisconsin, wydania (2000-2001) i (2002-2003).
Spośród odpowiednich czynników chelatujących najkorzystniejszym jest EDTA. Ilość czynnika chelatującego, która jest odpowiednia do stosowania w wynalazku, powinna wystarczać do obniżenia zawartości powstałego zanieczyszczenia izoformą des-phe co najmniej o około 10% jego najwyższego stężenia równowagowego (albo jego najwyższego średniego stężenia równowagowego, gdy uśrednia się szereg szarż wytwórczych). Korzystnie obniżenie zawartości powstałego zanieczyszczenia izoformą des-phe wynosi odpowiednio co najmniej 20%, 30%, 40% lub 50% jego najwyższego stężenia równowagowego (albo jego najwyższego średniego stężenia równowagowego). Początkowe stężenie EDTA, odpowiednie do stosowania w wynalazku, korzystnie wynosi odpowiednio co najmniej około 0,01 mM, od około 0,01 mM do około 100 mM, od około 0,1 mM do około 20 mM, od około 2 mM do około 10 mM lub od około 2 mM do około 5 mM.
Korzystne jest dostarczenie czynnika chelatującego w roztworze buforowym. Korzystnie roztwór buforowy jest roztworem, który nadaje się do stosowania w wynalazku, tj. nie uniemożliwia wytwarzania białkowego składnika B-2036 ani nie rozkłada już wytworzonego. Roztwory buforowe, odpowiednie do stosowania w związku z wynalazkiem, obejmują (nie ograniczając zakresu) roztwory Tris, fosforanowe, HEPES, kwasu cytrynowego, trietyloaminy i histydyny. Korzystnym roztworem buforowym jest roztwór Tris. Korzystne początkowe stężenie roztworu buforowego wynosi od około 1 mM do około 200 mM, bardziej korzystnie od około 5 mM do około 100 mM, jeszcze korzystniej od około 8 mM do około 70 mM, a najkorzystniej od około 10 mM do około 50 mM. Można stosować inne odpowiednie roztwory buforowe. Korzystnie te roztwory buforowe wystarczają do utrzymywania wartości pH środowiska wzrostu wszędzie w zakresie odpowiednio od około 6 do około 9, od około 6,5 do około 7,5 lub od około 7,2 do około 7,5.
Jak podano wyżej, korzystne jest dostarczenie czynnika chelatującego w roztworze buforowym. Ponadto zawartość czynnika chelatującego w roztworze buforowym powinna być taka, aby molowa proporcja liczby moli czynnika chelatującego do liczby moli białka B-2036 wynosiła od około 1 do około 1000. Alternatywnie molowa proporcja liczby moli czynnika chelatującego do liczby moli białka B-2036 może wynosić odpowiednio od około 20 do około 1000, od około 50 do około 250 lub od około 60 do około 110.
Zwykle po dostatecznym kontakcie (w celu obniżenia poziomu zanieczyszczenia izoformą des-phe) między czynnikiem chelatującym i białkowym składnikiem B-2036 (wewnątrz komórki (komórek) gospodarza lub po zebraniu z tej komórki (tych komórek)) stężenie białkowego składnika B-2036 w roztworze buforowym wynosi odpowiednio od około 0,1 mg/ml do około 20 mg/ml, od około 0,5 mg/ml do około 5 mg/ml lub od około 1 mg/ml do około 5 mg/ml.
PL 212 726 B1
Ponadto, zakres temperatur środowiska wzrostu, zawierającego roztwór buforowy, czynnik (czynniki) chelatujący i inne składniki, obejmujące B-2036 (nie ograniczając zakresu), powinien być utrzymywany korzystnie w granicach od około 0°C do około 35°C, po dodaniu czynnika chelatującego do komórki (komórek) gospodarza lub jej Iizatu zawierającego białkowy składnik B-2036. Korzystnie także temperaturę komórki (komórek) gospodarza i/lub jej Iizatu zawierającego składnik B-2036 utrzymuje się odpowiednio w zakresie od około 1°C do około 15°C, od około 2°C do około 10°C lub od około 2°C do około 15°C. Należy zauważyć, że korzystnie po dodaniu czynnika chelatującego (np. EDTA), którego temperatura wynosi około 4°C, temperatura homogenatu zawierającego B-2036 wzrasta do około 30°C po homogenizacji. Istotne jest, aby zwrócić uwagę, że denaturacja białka B-2036 następuje w temperaturze około +40°C. W związku z tym, jest pożądane utrzymywanie temperatury homogenatu (tj. zawierającego komórki gospodarzy, środowisko wzrostu, roztwór buforowy, czynnik chelatujący i B-2036 itd.) poniżej temperatury denaturacji białka B-2036.
Oprócz tego, czas kontaktu między składnikiem B-2036 i czynnikiem chelatującym powinien być dostateczny do obniżenia poziomu zanieczyszczenia izoformą des-phe. Przykładowe czasy kontaktu, odpowiednie dla obniżenia poziomu zanieczyszczenia izoformą des-phe, powinny wynosić odpowiednio co najmniej 30 min, od około 1 godziny do około 48 godzin lub od około 5 godzin do około 15 godzin.
Najczęściej po dostatecznym kontakcie między czynnikiem (czynnikami) chelatującym i składnikiem B-2036, roztwór buforowy, który je zawiera, ma objętość odpowiednio od około 1 I do około 5000 I, od około 10 I do około 500 I lub od około 100 I do około 300 I. Inne odpowiednie przykładowe objętości mogą wynosić od 160 I do około 500 I.
Inne parametry, które mogą być istotne podczas kontaktu między czynnikiem (czynnikami) chelatującym i składnikiem B-2036, obejmują takie parametry, jak prędkość mieszania. Prędkość mieszania powinna być dostateczna do utworzenia jednorodnej mieszaniny (komórki (komórek) gospodarza, jej lizatu, roztworu buforowego, czynnika (czynników) chelatującego, składnika B-2036 i wszystkich innych składników tworzących środowisko wzrostu), minimalizując wielkość pienienia się, które może powstawać. Specjaliści w dziedzinie mogą z łatwością określić, jaka powinna być dostateczna prędkość mieszania. Oczywiście prędkość mieszania powinna być taka, aby temperatura utrzymywała się w wyżej podanych zakresach i aby zminimalizować każdą degradację białkowego składnika B-2036.
b. Obniżanie zawartości zanieczyszczenia izoformą des-phe z zastosowaniem soli metali
Nie ograniczając zakresu do teorii, uważa się, że dodanie soli metalu (soli metali) do rekombinacyjnego antagonisty hormonu wzrostu B-2036 powoduje obniżenie poziomu zanieczyszczenia izoformą des-phe, albo przez bieżące obniżenie jego poziomu i/albo przez zapobieganie dalszemu powstawaniu des-phe.
Zwykle sól metalu (sole metali) dodaje się do komórki (komórek) gospodarza w syntezie żądanego rekombinacyjnego białkowego składnika B-2036 podczas wzrostu lub po wzroście (albo podczas wzrostu i po wzroście) komórki (komórek) gospodarza. Ponadto po przeprowadzeniu etapów wzrostu i kontaktowania, korzystne jest oczyszczenie biał ka B-2036. Nastę pnie oczyszczone biał ko korzystnie poddaje się polietylenoglikolowaniu, uzyskując PEG B-2036 (pegwisomant). Co do procedury polietylenoglikolowania zobacz patent USA nr 5.849.535.
W wynalazku można stosować dowolną sól metalu, która podczas kontaktu (korzystnie z zastosowaniem odpowiedniego mieszania) z białkowym składnikiem B-2036 wraz z jego zanieczyszczeniem izoformą des-phe, wystarcza do obniżenia poziomu tego zanieczyszczenia izoformą des-phe, korzystnie bez degradacji (lub znacznej degradacji) uzysku B-2036. Sól metalu (sole metali), nadająca się do stosowania w wynalazku, obejmuje (nie ograniczając zakresu) sól (sole) metali alkalicznych, sól (sole) metali ziem alkalicznych, sól (sole) metali przejściowych i ich mieszaniny. Korzystne sole metali, nadające się do stosowania w wynalazku, obejmują (nie ograniczając zakresu) fosforan potasu, octan potasu, fosforan sodu, octan sodu, chlorek cynku i ich mieszaniny.
Inne odpowiednie sole metali są podane w następujących źródłach literaturowych: (I) The Merck Index, 12. wydanie, S. Budavari (wydawca), Merck & Co., Inc., Therapeutic Category and Biological Activity Index, strona THER-19 (pod „Chelating Agents”), Whitehouse Station, NJ (1996) oraz każde następne jego wydanie do chwili obecnej; (2) Remington Pharmaceutical Sciences, 16. wydanie, Arthur Osol (wydawca), Mack Publishing Co., Easton, Pensylwania (1980) oraz każde następne jego wydanie do chwili obecnej; (3) The United States Pharmacopeia, 21. wydanie poprawione (16. wydanie), United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, Maryland (1985) oraz każde następne jego wydanie do chwili obecnej; (4) SIGMA, Biochemicals and Reagents for Life Science
PL 212 726 B1
Research Catalogue, St. Louis, Missouri (2002-2003); oraz (5) Aldrich, Handbook for Fine Chemicals and Laboratory Equipment, Milwaukee, Wisconsin, wydania (2000-2001) i (2002-2003).
Spośród soli metali, nadających się do stosowania w wynalazku, korzystne są również fosforan sodu, ZnCI2 i ich mieszaniny. Ilość soli metalu (metali), odpowiednia do stosowania w wynalazku, powinna wystarczać do obniżenia zawartości powstałego zanieczyszczenia izoformą des-phe co najmniej o około 10% jego najwyższego stężenia (albo jego najwyższego średniego stężenia, gdy uśrednia się szereg szarż wytwórczych). Korzystnie obniżenie zawartości powstałego zanieczyszczenia izoformą des-phe wynosi odpowiednio co najmniej około 20%, 30%, 40% lub 50% jego najwyższego stężenia (lub jego najwyższego średniego stężenia). Początkowe stężenie soli metalu (np. fosforanu sodu), odpowiednie do stosowania w wynalazku, korzystnie wynosi odpowiednio co najmniej około 0,1 mM, od około 1 mM do około 500 mM, od około 1 mM do około 200 mM, od około 5 mM do około 175 mM, od około 10 mM do około 150 mM lub od około 25 mM do około 100 mM.
Korzystne jest dostarczenie soli metalu w roztworze buforowym. Jednakże, fosforan sodu może działać zarówno jako składnik roztworu buforowego, jak i odpowiednia sól metalu. Do buforowego roztworu fosforanu sodu można natomiast dodawać dodatkową sól metalu (sole metali). Korzystnie roztwór buforowy jest roztworem, który nadaje się do stosowania w wynalazku, tj. nie degraduje powstawania białkowego składnika B-2036. Roztwory buforowe, odpowiednie do stosowania w związku z wynalazkiem, obejmują (nie ograniczając zakresu) roztwory Tris, fosforanowe, HEPES, kwasu cytrynowego, trietyloaminy i histydyny. Korzystne początkowe stężenie roztworu buforowego wynosi od około 1 mM do około 200 mM, bardziej korzystnie od około 5 mM do około 100 mM, jeszcze korzystniej od około 8 mM do około 70 mM, a najkorzystniej od około 10 mM do około 50 mM. Można stosować inne odpowiednie roztwory buforowe. Korzystnie te roztwory buforowe wystarczają do utrzymywania wartości pH środowiska wzrostu wszędzie w zakresie odpowiednio od około 4 do około 9, od około 4,5 do około 7,5 lub od około 5,5 do około 7,5.
Po dostarczeniu soli metalu w roztworze buforowym (lub w przypadku NaP, gdy roztwór NaP działa zarówno jako roztwór soli, jak i roztwór buforowy) zawartość soli metalu w roztworze buforowym (lub w roztworze NaP działającym również jako roztwór buforowy) powinna być taka, aby molowa proporcja liczby moli soli metalu do liczby moli białka B-2036 wynosiła od około 1 do około 10000. Alternatywnie molowa proporcja liczby moli soli metalu do liczby moli białka B-2036 może wynosić odpowiednio od około 300 do około 10000, od około 500 do około 5000 lub od około 500 do około 2500.
Zwykle po dostatecznym kontakcie (w celu obniżenia poziomu zanieczyszczenia izoformą des-phe) między solą metalu (solami metali) i białkowym składnikiem B-2036 (wewnątrz komórki (komórek) gospodarza lub po zebraniu z tej komórki (tych komórek)) stężenie białkowego składnika B-2036 w roztworze buforowym wynosi odpowiednio od około 0,1 mg/ml do około 20 mg/ml, od około 0,5 mg/ml do około 5 mg/ml lub od około 1 mg/ml do około 5 mg/ml.
Ponadto zakres temperatur środowiska wzrostu, zawierającego roztwór buforowy, sól metalu (sole metali) i inne składniki, obejmujące B-2036 (nie ograniczając zakresu), powinien być utrzymywany korzystnie w granicach od około 0°C do około 35°C po dodaniu soli metalu do komórki (komórek) gospodarza lub jej Iizatu zawierającego składnik B-2036. Korzystnie także temperaturę komórki (komórek) gospodarza i/lub jej Iizatu zawierającego składnik B-2036 utrzymuje się odpowiednio w zakresie od około 1°C do około 15°C, od około 2°C do około 10°C lub od około 2°C do około 15°C. Należy zauważyć, że po homogenizacji z solą metalu (np. NaP) temperatura homogenatu może wzrosnąć. Należy zwrócić uwagę, że denaturacja białka B-2036 następuje w temperaturze około +40°C. W związku z tym jest pożądane utrzymywanie temperatury homogenatu (tj. zawierającego komórki gospodarzy, środowisko wzrostu, roztwór buforowy, sól metalu, B-2036 i ewentualnie związek merkaptanowy itd.) poniżej temperatury denaturacji białka B-2036.
Ponadto, czas kontaktu między składnikiem B-2036 i solą metalu powinien być dostateczny do obniżenia poziomu zanieczyszczenia izoformą des-phe. Przykładowe czasy kontaktu, odpowiednie dla obniżenia poziomu zanieczyszczenia izoformą des-phe, powinny wynosić odpowiednio co najmniej 30 minut, od około 1 godziny do około 48 godzin lub od około 5 godzin do około 15 godzin.
Zwykle po dostatecznym kontakcie między solą metalu (solami metali) i składnikiem B-2036, roztwór buforowy, który je zawiera, ma objętość odpowiednio od około 1 I do około 5000 I, od około
100 I do około 2000 I lub od około 200 I do około 1500 I.
Inne parametry, które mogą być istotne podczas kontaktu między solą metalu (solami metali) i składnikiem B-2036, obejmują takie parametry, jak prędkość mieszania. Prędkość mieszania powinPL 212 726 B1 na być dostateczna do utworzenia jednorodnej mieszaniny (komórki (komórek) gospodarza, jej lizatu, roztworu buforowego, soli metalu (metali), składnika B-2036 i wszystkich innych składników tworzących środowisko wzrostu), minimalizując wielkość pienienia się, które może powstawać. Specjaliści w dziedzinie mogą z łatwością określić, jaka powinna być dostateczna prędkość mieszania. Oczywiście prędkość mieszania powinna być taka, aby temperatura utrzymywała się w wyżej podanych zakresach i aby zminimalizować każdą degradację białkowego składnika B-2036.
3. Rekombinacyjny hormon wzrostu i jego zanieczyszczenie izoformą des-phe
a. Obniżanie zawartości zanieczyszczenia izoformą des-phe z zastosowaniem czynnika chelatującego
Nie ograniczając zakresu do teorii, uważa się, że dodanie czynnika (czynników) chelatujących do rekombinacyjnego hormonu wzrostu powoduje obniżenie poziomu zanieczyszczenia izoformą des-phe, albo przez bieżące zmniejszenie jego poziomu i/albo przez zapobieganie dalszemu powstawaniu des-phe.
Najczęściej czynnik (czynniki) chelatujący dodaje się do komórki (komórek) gospodarza w syntezie żądanego rekombinacyjnego białka hormonu wzrostu podczas wzrostu lub po wzroście (albo podczas wzrostu i po wzroście) komórki (komórek) gospodarza. Ponadto, po przeprowadzeniu etapów wzrostu i kontaktowania, korzystne jest oczyszczenie białka hormonu wzrostu.
W wynalazku moż na stosować dowolny czynnik chelatujący, który podczas kontaktu (korzystnie z zastosowaniem odpowiedniego mieszania) z białkiem hormonu wzrostu wraz z jego zanieczyszczeniem izoformą des-phe, wystarcza do obniżenia poziomu tego zanieczyszczenia izoformą des-phe, korzystnie bez degradacji (lub znacznej degradacji) uzysku hormonu wzrostu. Korzystne czynniki chelatujące, nadające się do stosowania w wynalazku, obejmują (nie ograniczając zakresu) EDTA, EGTA i DTPA. Dalsze przykładowe czynniki chelatujące obejmują (nie ograniczając zakresu) deferoksaminę, ditiokarbaminian sodu, etylenodiaminotetraoctan wapnio-disodu, etylenodiaminotetraoctan disodu, etylenodiaminotetraoctan sodu, etylenodiaminotetraoctan trisodu, penicylaminę, dietylenotriaminopentaoctan wapnio-trisodu, kwas dietylenotriaminopentaoctowy, sukcymer i trientynę. Należy zauważyć, że etylenodiaminotetraoctan sodu to sól EDTA.
Inne czynniki chelatujące, nadające się do stosowania w wynalazku, są podane w następujących źródłach literaturowych: (I) The Merck Index, 12. wydanie, S. Budavari (wydawca), Merck & Co., Inc., Therapeutic Category and Biological Activity Index, strona THER-19 (pod „Chelating Agents”), Whitehouse Station, NJ (1996) oraz każde następne jego wydanie do chwili obecnej; (2) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. wydanie, Arthur Osol (wydawca), Mack Publishing Co., Easton, Pensylwania (1980) oraz każde następne jego wydanie do chwili obecnej; (3) The United States Pharmacopeia, 21. wydanie poprawione (16. wydanie), United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, Maryland (1985) oraz każde następne jego wydanie do chwili obecnej; (4) SIGMA, Biochemicals and Reagents for Life Science Research Catalogue, St. Louis, Missouri (2002-2003); oraz (5) Aldrich, Handbook for Fine Chemicals and Laboratory Equipment, Milwaukee, Wisconsin, wydania (2000-2001) i (2002-2003).
Spośród odpowiednich czynników chelatujących najkorzystniejszym jest EDTA. Ilość czynnika chelatującego, która jest odpowiednia do stosowania w wynalazku, powinna wystarczać do obniżenia zawartości powstałego zanieczyszczenia izoformą des-phe co najmniej o około 10% jego najwyższego stężenia równowagowego (albo jego najwyższego średniego stężenia równowagowego, gdy uśrednia się szereg szarż wytwórczych). Korzystnie obniżenie zawartości powstałego zanieczyszczenia izoformą des-phe wynosi odpowiednio co najmniej 20%, 30%, 40% lub 50% jego najwyższego stężenia równowagowego (albo jego najwyższego średniego stężenia równowagowego). Początkowe stężenie EDTA, odpowiednie do stosowania w wynalazku, korzystnie wynosi odpowiednio co najmniej około 0,01 mM, od około 0,01 mM do około 100 mM, od około 0,1 mM do około 20 mM, od około 2 mM do około 10 mM lub od około 2 mM do około 5 mM.
Korzystne jest dostarczenie czynnika chelatującego w roztworze buforowym. Korzystnie roztwór buforowy jest roztworem, który nadaje się do stosowania w wynalazku, tj. nie uniemożliwia wytwarzania białkowego składnika B-2036 ani nie rozkłada już wytworzonego. Roztwory buforowe, odpowiednie do stosowania w wynalazku, obejmują (nie ograniczając zakresu) roztwory Tris, fosforanowe, HEPES, kwasu cytrynowego, trietyloaminy i histydyny. Korzystnym roztworem buforowym jest roztwór Tris. Korzystne początkowe stężenie roztworu buforowego wynosi od około 1 mM do około 200 mM, bardziej korzystnie od około 5 mM do około 100 mM, jeszcze korzystniej od około 8 mM do około 70 mM, a najkorzystniej od około 10 mM do okoł o 50 mM. Moż na stosować inne odpowiednie roztwory bufo18
PL 212 726 B1 rowe. Korzystnie te roztwory wystarczają do utrzymywania wartości pH środowiska wzrostu wszędzie w zakresie odpowiednio od około 6 do około 9, od około 6,5 do około 7,5 lub od około 7,2 do około 7,5.
Jak podano wyżej, korzystne jest dostarczenie czynnika chelatującego w roztworze buforowym. Ponadto zawartość czynnika chelatującego w roztworze buforowym powinna być taka, aby molowa proporcja liczby moli czynnika chelatującego do liczby moli białka hormonu wzrostu (np. hGH) wynosiła od około 1 do około 1000. Alternatywnie molowa proporcja liczby moli czynnika chelatującego do liczby moli białka hormonu wzrostu (hGH) może wynosić odpowiednio od około 20 do około 1000, od około 50 do około 250 lub od około 60 do około 110.
Zwykle po dostatecznym kontakcie (w celu obniżenia poziomu zanieczyszczenia izoformą des-phe) między czynnikiem chelatującym i białkiem hormonu wzrostu (np. hGH) (wewnątrz komórki (komórek) gospodarza lub po zebraniu z tej komórki (tych komórek)), stężenie białka hormonu wzrostu (np. hGH) w roztworze buforowym wynosi odpowiednio od około 0,1 mg/ml do około 20 mg/ml, od około 0,5 mg/ml do około 5 mg/ml lub od około 1 mg/ml do około 5 mg/ml.
Ponadto, zakres temperatur środowiska wzrostu zawierającego roztwór buforowy, czynnik (czynniki) chelatujący i inne składniki, obejmujące białko hormonu wzrostu (nie ograniczając zakresu), powinien być utrzymywany korzystnie w granicach od około 0°C do około 35°C, po dodaniu czynnika chelatującego do komórki (komórek) gospodarza lub jej Iizatu zawierającego białko hormonu wzrostu. Korzystnie także temperaturę komórki (komórek) gospodarza i/lub jej Iizatu zawierającego białko hormonu wzrostu utrzymuje się odpowiednio w zakresie od około 1°C do około 15°C, od około 2°C do około 10°C lub od około 2°C do około 15°C. Należy zauważyć, że korzystnie po dodaniu czynnika chelatującego (np. EDTA), którego temperatura wynosi około 4°C, temperatura homogenatu zawierającego hormon wzrostu wzrasta do około 30°C po homogenizacji. Należy zwrócić uwagę, że denaturacja białka hormonu wzrostu następuje w temperaturze około +40°C. W związku z tym jest pożądane utrzymywanie temperatury homogenatu (tj. zawierającego komórki gospodarzy, środowisko wzrostu, roztwór buforowy, czynnik chelatujący i białko hormonu wzrostu itd.) poniżej temperatury denaturacji białka hormonu wzrostu.
Ponadto, czas kontaktu między białkiem hormonu wzrostu i czynnikiem chelatującym powinien być dostateczny do obniżenia poziomu zanieczyszczenia izoformą des-phe. Przykładowe czasy kontaktu, odpowiednie dla obniżenia poziomu zanieczyszczenia izoformą des-phe, powinny wynosić odpowiednio co najmniej 30 minut, od około 1 godziny do około 48 godzin lub od około 5 godzin do około 15 godzin.
Zwykle po dostatecznym kontakcie między czynnikiem (czynnikami) chelatującym i białkiem hormonu wzrostu, roztwór buforowy, który je zawiera, ma objętość odpowiednio od około 1 I do około 5000 I, od około 10 I do około 500 I lub od około 100 I do około 300 I. Inne odpowiednie przykładowe objętości mogą wynosić od 160 I do około 500 I.
Inne parametry, które mogą być istotne podczas kontaktu między czynnikiem (czynnikami) chelatującym i białkiem hormonu wzrostu, obejmują takie parametry, jak prędkość mieszania. Prędkość mieszania powinna być dostateczna do utworzenia jednorodnej mieszaniny (komórki (komórek) gospodarza, jej lizatu, roztworu buforowego, czynnika (czynników) chelatującego, białka hormonu wzrostu i wszystkich innych składników tworzących środowisko wzrostu), minimalizując wielkość pienienia się, które może powstawać. Specjaliści w dziedzinie mogą z łatwością określić, jaka powinna być dostateczna prędkość mieszania. Oczywiście prędkość mieszania powinna być taka, aby temperatura utrzymywała się w wyżej podanych zakresach i aby zminimalizować każdą degradację białkowego składnika hormonu wzrostu.
b. Obniżenie zawartości zanieczyszczenia izoformą des-phe z zastosowaniem soli metali
Nie ograniczając zakresu do teorii, uważa się, że dodanie soli metalu (soli metali) do rekombinacyjnego hormonu wzrostu powoduje obniżenie poziomu zanieczyszczenia izoformą des-phe, albo przez bieżące obniżenie poziomu zanieczyszczenia izoformą des-phe i/albo przez zapobieganie dalszemu powstawaniu des-phe.
Zwykle sól metalu (sole metali) dodaje się do komórki (komórek) gospodarza w syntezie żądanego rekombinacyjnego białkowego składnika hormonu wzrostu podczas wzrostu lub po wzroście (albo podczas wzrostu i po wzroście) komórki (komórek) gospodarza. Ponadto po przeprowadzeniu etapów wzrostu i kontaktowania, korzystne jest oczyszczenie białka hormonu wzrostu.
W wynalazku można stosować dowolną sól metalu, która podczas kontaktu (korzystnie z zastosowaniem odpowiedniego mieszania) z białkowym składnikiem hormonu wzrostu wraz z jego zanieczyszczeniem izoformą des-phe, wystarcza do obniżenia poziomu tego zanieczyszczenia izoformą
PL 212 726 B1 des-phe, korzystnie bez degradacji (lub znacznej degradacji) uzysku hormonu wzrostu. Sól metalu (sole metali), nadająca się do stosowania w wynalazku, obejmuje (nie ograniczając zakresu) sól (sole) metali alkalicznych, sól (sole) metali ziem alkalicznych, sól (sole) metali przejściowych i ich mieszaniny. Korzystne sole metali, nadające się do stosowania w wynalazku, obejmują (nie ograniczając zakresu) fosforan potasu, octan potasu, fosforan sodu, octan sodu, chlorek cynku i ich mieszaniny.
Inne sole metali, nadające się do stosowania w wynalazku, są podane w następujących źródłach literaturowych: (I) The Merck Index, 12. wydanie, S. Budavari (wydawca), Merck & Co., Inc.,
Therapeutic Category and Biological Activity Index, strona THER-19 (pod „Chelating Agents”), Whitehouse Station, NJ (1996) oraz każde następne jego wydanie do chwili obecnej; (2) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. wydanie, Arthur Osol (wydawca), Mack Publishing Co., Easton, Pensylwania (1980) oraz każde następne jego wydanie do chwili obecnej; (3) The United States Pharmacopeia, 21. wydanie poprawione (16. wydanie), United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, Maryland (1985) oraz każde następne jego wydanie do chwili obecnej; (4) SIGMA, Biochemicals and Reagents for Life Science Research Catalogue, St. Louis, Missouri (2002-2003); oraz (5) Aldrich, Handbook for Fine Chemicals and Laboratory Equipment, Milwaukee, Wisconsin, wydania (2000-2001) i (2002-2003).
Spośród soli metali, nadających się do stosowania w wynalazku, korzystne są również fosforan sodu, ZnCI2 i ich mieszaniny. Ilość soli metalu (metali), odpowiednia do stosowania w wynalazku, powinna wystarczać do obniżenia zawartości powstałego zanieczyszczenia izoformą des-phe co najmniej o około 10% jego najwyższego stężenia (albo jego najwyższego średniego stężenia, gdy uśrednia się szereg szarż wytwórczych). Korzystnie obniżenie zawartości powstałego zanieczyszczenia izoformą des-phe wynosi odpowiednio co najmniej około 20%, 30%, 40% lub 50% jego najwyższego stężenia (albo najwyższego średniego stężenia). Początkowe stężenie soli metalu (np. fosforanu sodu), odpowiednie do stosowania w wynalazku, korzystnie wynosi odpowiednio co najmniej około 0,1 mM, od około 1 mM do około 500 mM, od około 1 mM do około 200 mM, od około 5 mM do około 175 mM, od około 10 mM do około 150 mM lub od około 25 mM do około 100 mM.
Korzystne jest dostarczenie soli metalu w roztworze buforowym. Jednakże, fosforan sodu może działać zarówno jako składnik roztworu buforowego, jak i odpowiednia sól metalu. Do buforowego roztworu fosforanu sodu można natomiast dodawać dodatkową sól metalu (sole metali). Korzystnie roztwór buforowy jest roztworem, który nadaje się do stosowania w wynalazku, tj. nie uniemożliwia wytwarzania białkowego składnika B-2036 ani nie rozkłada już wytworzonego. Roztwory buforowe, odpowiednie do stosowania w związku z wynalazkiem, obejmują (nie ograniczając zakresu) roztwory Tris, fosforanowe, HEPES, kwasu cytrynowego, trietyloaminy i histydyny. Korzystne początkowe stężenie roztworu buforowego wynosi od około 1 mM do około 200 mM, bardziej korzystnie od około 5 mM do około 100 mM, jeszcze korzystniej od około 8 mM do około 70 mM, a najkorzystniej od około 10 mM do około 50 mM. Można stosować inne odpowiednie roztwory buforowe. Korzystnie te roztwory buforowe wystarczają do utrzymania wartości pH środowiska wzrostu w zakresie odpowiednio od około 4 do około 9, od około 4,5 do około 7,5 lub od około 5,5 do około 7,5.
Po umieszczeniu soli metalu w roztworze buforowym (lub w przypadku NaP, gdy roztwór NaP działa zarówno jako roztwór soli, jak i roztwór buforowy) zawartość soli metalu w roztworze buforowym (lub NaP w roztworze działającym również jako roztwór buforowy) powinna być taka, aby molowa proporcja liczby moli soli metalu do liczby moli białka hormonu wzrostu (np. hGH) wynosiła od około 1 do około 10000. Alternatywnie molowa proporcja liczby moli soli metalu do liczby moli białka hormonu wzrostu (np. hGH) może wynosić odpowiednio od około 300 do około 10000, od około 500 do około 5000 lub od około 500 do około 2500.
Zwykle po dostatecznym kontakcie (w celu obniżenia poziomu zanieczyszczenia izoformą des--phe) między solą metalu (solami metali) i białkiem hormonu wzrostu (np. hGH) (wewnątrz komórki (komórek) gospodarza lub po zebraniu z tej komórki (tych komórek)), stężenie białka hormonu wzrostu w roztworze buforowym wynosi odpowiednio od około 0,1 mg/ml do około 20 mg/ml, od około 0,5 mg/ml do około 5 mg/ml lub od około 1 mg/ml do około 5 mg/ml.
Ponadto, zakres temperatur środowiska wzrostu, zawierającego roztwór buforowy, sól metalu (sole metali) i inne składniki, obejmujące białko hormonu wzrostu (nie ograniczając zakresu), powinien być utrzymywany korzystnie w granicach od około 0°C do około 35°C, po dodaniu soli metalu do komórki (komórek) gospodarza lub jej Iizatu zawierającego białko hormonu wzrostu. Korzystnie także temperaturę komórki (komórek) gospodarza i/lub jej Iizatu zawierającego białko hormonu wzrostu utrzymuje się odpowiednio w zakresie od około 1°C do około 15°C, od około 2°C do około 10°C lub od
PL 212 726 B1 około 2°C do około 15°C. Należy zauważyć, że po homogenizacji z solą metalu (np. fosforanem sodu) temperatura homogenatu może wzrosnąć. Ważne jest zwrócenie uwagi, że denaturacja białka hormonu wzrostu następuje w temperaturze około +40°C. W związku z tym jest pożądane utrzymywanie temperatury homogenatu (tj. zawierającego komórki gospodarzy, środowisko wzrostu, roztwór buforowy, sól metalu, białko hormonu wzrostu i ewentualnie związek merkaptanowy itd.) poniżej temperatury denaturacji białka hormonu wzrostu.
Ponadto, czas kontaktu między białkiem hormonu wzrostu i solą metalu powinien być dostateczny do obniżenia poziomu zanieczyszczenia izoformą des-phe. Przykładowe czasy kontaktu, odpowiednie dla obniżenia poziomu zanieczyszczenia izoformą des-phe, powinny wynosić odpowiednio co najmniej 30 minut, od około 1 godziny do około 48 godzin lub od około 5 do około 15 godzin.
Zwykle po dostatecznym kontakcie między solą metalu (solami metali) i białkiem hormonu wzrostu, roztwór buforowy, który je zawiera, ma objętość odpowiednio od około 1 I do około 5000 I, od około 100 I do około 2000 I lub od około 200 I do około 1500 I.
Inne parametry, które mogą być istotne podczas kontaktu między solą metalu (solami metali) i białkiem hormonu wzrostu, obejmują takie parametry, jak prędkość mieszania. Prędkość mieszania powinna być dostateczna do utworzenia jednorodnej mieszaniny (komórki (komórek) gospodarza, jej lizatu, roztworu buforowego, soli metalu (metali), białka hormonu wzrostu i wszystkich innych składników tworzących środowisko wzrostu), minimalizując wielkość pienienia się, które może powstawać. Specjaliści w dziedzinie mogą z łatwością określić, jaka powinna być dostateczna prędkość mieszania. Oczywiście prędkość mieszania powinna być taka, aby temperatura utrzymywała się w wyżej podanych zakresach i aby zminimalizować każdą degradację białkowego składnika hormonu wzrostu.
4. Polietylenoglikolowany polipeptyd i jego agregat
a. bniżenie zawartości agregatu z użyciem chromatografii anionowymiennej
Podczas wytwarzania i oczyszczania B-2036 PEG, szarża produktu pośredniego lub cząsteczka B-2036 jest otrzymywana tak, jak podano powyżej. Następnie cząsteczka B-2036 jest przetwarzana stosownie do poniższych sześciu etapów, aby dostarczyć finalny API, którym jest przedmiotowe białko B-2036 PEG. Tymi sześcioma etapami są następujące:
1. polietylenoglikolowanie z dostarczeniem polietylenoglikolowanego B-2036,
2. chromatografia HIC (etap opcjonalny) z dostarczeniem zbioru HIC,
3. ultrafiltracja/diafiltracja (etap opcjonalny) z dostarczeniem zbioru diafiltracyjnego,
4. chromatografia AEX ze zbieraniem dostarczając zbiór AEX,
5. diafiltracja zbioru AEX z dostarczeniem zbioru diafiltracyjnego, oraz
6. filtracja API (celem sterylizacji, korzystnie przez filtr 0,22 mikronowy do odbieralników-butelek do zamrożenia) z dostarczeniem finalnego API.
Powyższe etapy 1-6 są przykładowe i są przedstawione na schemacie technologicznym 1 i w przykł adzie 1.
Odnosząc się do etapu 1, etap polietylenoglikolowania stanowi pierwszy etap niniejszego wynalazku dostarczającego polietylenoglikoIowane izoformy przedmiotowego białka. Następnie etap 2 HIC i kolejny etap diafiltracji, które oba są uważ ane za opcjonalne, są korzystnie przeprowadzane celem usunięcia jakiegokolwiek nie-polietylenoglikolowanego białka, wolnych cząsteczek PEG lub jakichkolwiek innych zanieczyszczeń, które mogą być usunięte w trakcie etapu 2. Po etapie 3, zbiór diafiltracyjny z etapu 3 jest następnie poddawany chromatografii anionowymiennej w etapie 4, aby wydzielić izoformy PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 i PEG-9, które są następnie łączone, aby korzystnie wzbogacić poziom izoform PEG-4, PEG-5 i PEG-6 w finalnym produkcie do dalszego przetwarzania w etapie 5 diafiltracji, po którym następuje sterylizacja filtracyjna w etapie 6 z dostarczeniem finalnego produktu API.
Powracając do etapu polietylenoglikolowania 1, cząsteczka B-2036 jest poddawana warunkom wystarczającym do polietylenoglikolowania samej cząsteczki B-2036 do B-2036 PEG, w tym do izoform PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 i PEG-9. Korzystne parametry polietylenoglikolowania są przedstawione na schemacie technologicznym i w przykładzie 1. Cząsteczka B-2036 i jakiekolwiek inne cząsteczki, do których cząsteczki PEG mogą być dołączone, korzystnie wiązaniem kowalencyjnym, są cząsteczkami PEG wybranymi z grupy obejmującej PEG-N-hydroksysukcynimid-5K, PEG-węglan sukcynimidylu-5K, PEG-propionian sukcynimidylu-5K, PEG2-maleimid-40K (2 x 20K), PEG2-N-hydroksysukcynimid-40K (2 x 20K) i PEG2-aldehyd-40K (2 x 20K). Ilość cząsteczek PEG dodanych do cząsteczki B-2036 do polietylenoglikolowania (lub jakiegokolwiek innePL 212 726 B1 go przedmiotowego białka, które wymaga polietylenoglikolowania) powinna być taka, aby stechiometryczna proporcja wagowa ilości wolnych niezwiązanych cząsteczek PEG do ilości nie-polietylenoglikolowanych cząsteczek białka wynosiła od około 0,5 do około 100, korzystnie od około 1,5 do około 2,5, bardziej korzystnie od około 1,9 do około 2, a najbardziej korzystnie od około 1,95 do około 2,05. W trakcie polietylenoglikolowania, cząsteczka B-2036 (lub innego przedmiotowego białka wymagającego polietylenoglikolowania) jest polietylenoglikolowana przy pH polietylenoglikolowania o wartości od około 3 do około 10, korzystnie od około 7,2 do około 7,8, bardziej korzystnie od około 7,4 do około 7,8, a najbardziej korzystnie od około 7,40 do około 7,80. Temperatura, w której przeprowadzany jest etap polietylenoglikolowania jest podawana jako temperatura polietylenoglikolowania. Temperatura polietylenoglikolowania wynosi od 0°C do około 40°C, korzystnie od około 10°C do około 30°C, a bardziej korzystnie od około 18°C do około 25°C.
Obecnie odnosząc się do opcjonalnego etapu HIC, etapu 2, korzystne parametry dla przeprowadzenia tego etapu są dostarczone w przykładzie 1 i na schemacie technologicznym 1. W trakcie opcjonalnego etapu 2 chromatografii HIC, białko polietylenoglikolowane i jakiekolwiek nie-polietylenoglikolowane białko jest ładowane na żywicę HIC, przy obciążeniu HIC < około 10 g białka na litr objętości upakowanego złoża, korzystnie < około 5 gramów białka na litr objętości upakowanego złoża żywicy HIC, lub < około 4,1 g białka na litr objętości upakowanej żywicy HIC. A także, przewodnictwo wsadu HIC wynosi od około 30 do około 60 mS/cm, korzystnie od około 40 do około 52 mS/cm, lub bardziej korzystnie od około 45 do 51 mS/cm. Ponadto, etap HIC jest przeprowadzany w temperaturze HIC od około 10 do około 40°C, korzystnie od około 15 do około 30°C, a najbardziej korzystnie od około 18 do około 25°C. Opcjonalny etap HIC, etap 2, usuwa, odpowiednio, co najmniej część wolnego PEG, nie-polietylenoglikolowane białko i agregat obecne we wsadzie HIC.
Po etapie HIC, etapie 2, otrzymuje się zbiór HIC. Zbiór HIC jest następnie poddawany etapowi uItrafiItracji/diafiItracji 3, który jest opcjonalny w tym sensie, że jeśli etap 2 HIC jest przeprowadzany, to i etap ultrafiltracji/diafiltracji jest również przeprowadzany. Jednakże, jeśli etap 2 HIC nie jest przeprowadzany, to nie ma potrzeby przeprowadzania etapu ultrafiltracji/diafiltracji 3. Alternatywnie, etap ultrafiltracji/diafiltracji 3 może wciąż być przeprowadzany przy braku opcjonalnego etapu HIC 2. Korzystne warunki, w których jest przeprowadzany etap ultrafiltracji/diafiltracji 3 są podane w przykładzie 1 i na schemacie technologicznym 1. Niniejszym powołujemy ten etap jako UF/DF #3. Etap UF/DF #3 jest przeprowadzany na membranie UF/DF #3 o progu odcięcia masy cząsteczkowej (MWCO) od około 3 kDa do około 20 kDa, korzystnie od około 8 kDa do około 15 kDa, bardziej korzystnie od około 10 kDa do około 12 kDa, a najbardziej korzystnie około 10 kDa.
Po etapie 3, produkt otrzymany w tym punkcie jest powoływany jako zbiór diafiItracyjny. Zbiór diafiltracyjny jest następnie podawany do etapu 4, który jest etapem chromatografii anionowymiennej i łączenia. Korzystne warunki dla przeprowadzenia tej chromatografii AEX i etapu łączenia są przedstawione w przykładzie 1 i na schemacie technologicznym. Zbiór diafiltracyjny z poprzedniego etapu (tj. etapu 3) lub polietylenoglikolowane białko (np. B-2036 PEG z etapu 1, jeśli etapy 2 i 3 nie zostały przeprowadzone) jest podawany do etapu 4. W rezultacie, bez przeróbki HIC w etapie 2, zbiór diafiltracyjny z etapu 3 zawierający B-2036 lub B-2036 PEG z etapu 1 jest ładowany na żywicę anionowymienną łącznie z jakimkolwiek wolnym PEG, polietylenoglikolowanym białkiem, nie-polietylenoglikolowanym białkiem, częściowo polietylenoglikolowanym białkiem i zanieczyszczeniami (takimi jak zanieczyszczenie trisiarczkowe lub des-phe) oraz jakimkolwiek agregatem.
Korzystnie użyta żywica jest żywicą anionowymienną (ΑΕΧ). Korzystnymi żywicami są, nie ograniczając zakresu, ΑΝΧ4, DEAE, Q-Sepharose, Q-Sepharose FF, Q-Sepharose HP oraz Q-Sepharose XL. Korzystną żywicą AEX jest Q-Sepharose FF.
Korzystnie żywica AEX zawiera grupy funkcyjne wybrane z grupy obejmującej pierwszorzędowe, drugorzędowe, trzeciorzędowe, czwartorzędowe aminy i ich zestawienia. W dodatku, żywica AEX zawiera grupy funkcyjne wybrane z grupy obejmującej grupy funkcyjne: dietyloaminoetylową, dietyloaminopropylową, dimetyloetanoloaminową, trimetyloamonio-etylową, trimetylobenzyloamoniową, dimetyloetanolobenzylową i poliaminową. Ponadto, żywica AEX korzystnie zawiera materiał nośnikowy wybrany z grupy obejmującej hydrofilowy polieter, sieciowany diwinylobenzenem polistyren, sieciowaną agarozę, polipropylen, hydrofilowy akryloamidowinyl, metakryl, polimeryzowany hydrożel na bazie kulek ceramicznych, kompozytowy materiał krzemionko-dekstranowy, krzemionkę szczepioną polimerem, diwinylobenzeno-styren, diwinylobenzenopoliakryl, sieciowaną celulozą, kopolimer metakrylanowy, polistyren, akryl, żel hydrofilowy G5000 i celulozę. A także, korzystne jest użycie żywicy AEX,
PL 212 726 B1 która zawiera żywicę makroporowatą lub żywicę żelową. Zwykle materiał nośnikowy wykazuje średnicę od około 10 do około 500 μm, a korzystnie około 30 μm.
Ładowanie AEX jest przeprowadzane przy przewodnictwie obciążenia AEX, które wynosi < około 10 mS/cm, korzystnie < około 5 mS/cm, a najbardziej korzystnie < około 2,4 mS/cm. Żywica AEX jest ładowana przy pH ładowania AEX od około 5 do około 10, korzystnie od około 6,6 do około 9, bardziej korzystnie od około 6,9 do około 7,1.
Ładunek polietylenoglikolowanego białka zawierający wszelkie zanieczyszczenia, takie jak zanieczyszczenie trisiarczkowe lub zanieczyszczenie des-phe lub jego agregat, jest taki, że obciążenie AEX wynosi < 10 g białka/l objętości upakowanego złoża żywicy AEX, korzystnie < 5,5 g białka/l objętości upakowanego złoża żywicy AEX, bardziej korzystnie < około 4,1 g białka/l objętości upakowanego złoża żywicy AEX.
Według jednej realizacji, polietylenoglikolowane białko, które jest ładowane na żywicę AEX, lub które jest dostarczane w pierwszym etapie dostarczania polietylenoglikolowanego białka, zawiera jedną lub więcej polietylenoglikolowanych izoform białka, PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8, PEG-9 oraz jakikolwiek agregat, zanieczyszczenie trisiarczkowe oraz zanieczyszczenie des-phe oraz jakiekolwiek nie-polietylenoglikolowane zanieczyszczenie polietylenoglikolowanego białka i jakiekolwiek wolne cząsteczki PEG.
Według innej realizacji, polietylenoglikolowane białko, które jest ładowane na żywicę AEX, lub które jest dostarczane w pierwszym etapie dostarczania polietylenoglikolowanego białka, zawiera jedną lub więcej polietylenoglikolowanych izoform białka, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 oraz jakikolwiek agregat, zanieczyszczenie trisiarczkowe oraz zanieczyszczenie desphe oraz jakiekolwiek nie-polietylenoglikolowane zanieczyszczenie polietylenoglikolowanego białka i jakiekolwiek wolne cząsteczki PEG.
Według innej realizacji, polietylenoglikolowane białko, które jest ładowane na żywicę AEX, lub które jest dostarczane w pierwszym etapie dostarczania polietylenoglikolowanego białka, zawiera jedną lub więcej polietylenoglikolowanych izoform białka, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 oraz jakikolwiek agregat, zanieczyszczenie trisiarczkowe oraz zanieczyszczenie des-phe oraz jakiekolwiek nie-polietylenoglikolowane zanieczyszczenie polietylenoglikolowanego białka i jakiekolwiek wolne cząsteczki PEG.
Według innej realizacji, polietylenoglikolowane białko, które jest ładowane na żywicę AEX lub które jest dostarczane w pierwszym etapie dostarczania polietylenoglikolowanego białka zawiera jedną lub więcej polietylenoglikolowanych izoform białka, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 oraz jakikolwiek agregat, zanieczyszczenie trisiarczkowe oraz zanieczyszczenie des-phe oraz jakiekolwiek nie-polietylenoglikolowane zanieczyszczenie polietylenoglikolowanego białka i jakiekolwiek wolne cząsteczki PEG.
Według innej realizacji, polietylenoglikolowane białko, które jest ładowane na żywicę AEX, lub które jest dostarczane w pierwszym etapie dostarczania polietylenoglikolowanego białka, zawiera jedną lub więcej polietylenoglikolowanych izoform białka, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 oraz jakikolwiek agregat, zanieczyszczenie trisiarczkowe oraz zanieczyszczenie des-phe oraz jakiekolwiek nie-polietylenoglikolowane zanieczyszczenie polietylenoglikolowanego białka i jakiekolwiek wolne cząsteczki PEG.
Według innej realizacji, polietylenoglikolowane białko, które jest ładowane na żywicę AEX, lub które jest dostarczane w pierwszym etapie dostarczania polietylenoglikolowanego białka, zawiera jedną lub więcej polietylenoglikolowanych izoform białka, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, oraz jakikolwiek agregat, zanieczyszczenie trisiarczkowe oraz zanieczyszczenie des-phe oraz jakiekolwiek nie-polietylenoglikolowane zanieczyszczenie polietylenoglikolowanego białka i jakiekolwiek wolne cząsteczki PEG.
Według innej realizacji, polietylenoglikolowane białko, które jest ładowane na żywicę AEX, lub które jest dostarczane w pierwszym etapie dostarczania polietylenoglikolowanego białka, zawiera jedną lub więcej polietylenoglikolowanych izoform białka, PEG-4, PEG-5, PEG-6, oraz jakikolwiek agregat, zanieczyszczenie trisiarczkowe oraz zanieczyszczenie des-phe oraz jakiekolwiek nie-polietylenoglikolowane zanieczyszczenie polietylenoglikolowanego białka i jakiekolwiek wolne cząsteczki PEG.
Według innej realizacji, polietylenoglikolowane białko, które jest ładowane na żywicę AEX, lub które jest dostarczane w pierwszym etapie dostarczania polietylenoglikolowanego białka, zawiera jedną lub więcej polietylenoglikolowanych izoform białka, PEG-4, PEG-5, PEG-6, oraz jakikolwiek
PL 212 726 B1 agregat, zanieczyszczenie trisiarczkowe oraz zanieczyszczenie des-phe oraz jakiekolwiek nie-polietylenoglikolowane zanieczyszczenie polietylenoglikolowanego białka.
Według innej realizacji, polietylenoglikolowane białko, które jest ładowane na żywicę AEX, lub które jest dostarczane w pierwszym etapie dostarczania polietylenoglikolowanego białka, zawiera jedną lub więcej polietylenoglikolowanych izoform białka, PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5,
PEG-6, PEG-7, PEG-8 i PEG-9 oraz jakikolwiek agregat, zanieczyszczenie trisiarczkowe oraz zanieczyszczenie des-phe.
Według innej realizacji, polietylenoglikolowane białko, które jest ładowane na żywicę AEX, lub które jest dostarczane w pierwszym etapie dostarczania polietylenoglikolowanego białka, zawiera jedną lub więcej polietylenoglikolowanych izoform białka, PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5,
PEG-6, PEG-7, PEG-8 i PEG-9, oraz jakikolwiek jego agregat, zanieczyszczenie trisiarczkowe.
Według innej realizacji, polietylenoglikolowane białko, które jest ładowane na żywicę AEX, lub które jest dostarczane w pierwszym etapie dostarczania polietylenoglikolowanego białka, zawiera jedną lub więcej polietylenoglikolowanych izoform białka, PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5,
PEG-6, PEG-7, PEG-8 i PEG-9 oraz jakikolwiek jego agregat.
Polietylenoglikolowane białko łącznie z jego agregatem, zanieczyszczeniem trisiarczkowym i/lub des-phe oraz nie-polietylenoglikolowanym lub częściowo polietylenoglikolowanym białkiem i wolnym PEG, po załadowaniu na żywice AEX, jest poddawane elucji roztworem eluującym w trakcie etapu elucji, po którym następuje zbieranie eluatu w wielu frakcjach. Etap elucji może być przeprowadzany z gradientem pH lub gradientem mocy jonowej. Jeśli elucja jest przeprowadzana z gradientem mocy jonowej, to elucją jest dokonywana roztworem soli w buforze elucji, zawierającym sól jonową w stężeniu soli wystarczającym do wyeluowania załadowanego na żywicę AEX polietylenoglikolowanego białka. Korzystnie solą jonową jest sól chlorkowa, bardziej korzystnie sól jonowa jest wybrana z grupy obejmującej NaCI, chlorek litu, fosforan Na, siarczan Na, chlorek amonu, siarczan amonu, fosforan amonu, Kl i KCI. Inne odpowiednie sole jonowe są uznawane za użyteczne do żywic AEX i są objęte zakresem, o ile są tu wymienione. Korzystnie solą jonową jest chlorek sodu w buforze. W trakcie elucji roztworem soli dostarczonym w buforze, gradient stężenia soli (np. w przypadku roztworu soli NaCI) wynosi od około 2 do około 50 mM na CV, korzystnie od około 5 do około 25 mM na CV, bardziej korzystnie od około 10 do około 20 mM na CV, najbardziej korzystnie od około 10 do około 12,5 mM na CV. Bufor elucji, w którym dostarczony jest roztwór soli, wykazuje pH od około 5 do około 10, korzystnie od około 6,6 do około 9, a najbardziej korzystnie od około 6,9 do około 7,1. Ponadto, etap elucji jest przeprowadzany w temperaturze elucji < około 50°C, korzystnie < około 35°C, bardziej korzystnie od około 2 do około 30°C, jeszcze bardziej korzystnie od około 15 do około 30°C, a najbardziej korzystnie od około 18 do około 25°C.
Bufor elucji zawierający roztwór soli jest wprowadzany na kolumnę z żywicą AEX i przepływa przez kolumnę z szybkością liniową < 300 cm/h, korzystnie od około 10 do około 150 cm/h, bardziej korzystnie od 30 do około 100 cm/h, jeszcze bardziej korzystnie od około 50 do około 100 cm/h, jeszcze bardziej korzystnie od około 50 do około 70 cm/h, jeszcze bardziej korzystnie od około 60 do około 65 cm/h, a najbardziej korzystnie około 60 cm/h.
Przy zbieraniu eluatu z żywicy AEX korzystne jest zbieranie w wielokrotnych frakcjach o objętościach w zakresie od około 0,1 do około 5 objętości kolumny (CV), korzystnie we frakcjach od około 0,1 do około 1 CV, bardziej korzystnie od około 0,1 do około 0,5 CV, a najbardziej korzystnie we frakcjach o objętości od około 0,1 do około 0,2 CV. A zatem na przykład można zebrać 100 oddzielnych frakcji, których liczba może być mniej lub więcej zależna od całkowitej ilości roztworu soli i buforu elucji puszczonych przez żywicę AEX do zebrania różnych frakcji CV. Jest zrozumiałe, że frakcje CV są zbierana seriami z odbieraniem eluatu u wylotu kolumny AEX (zwykle u spodu kolumny AEX).
Każda z zebranych frakcji CV korzystnie zawiera daną izoformę polietylenoglikolowanego białka, taką jak PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 i PEG-9. Zebrane frakcje CV są następnie podawane łączeniu z określaniem, która frakcja zawiera którą izoformę polietylenoglikolowanego białka, aby umożliwić selektywne połączenie zebranych izoform polietylenoglikolowanego białka.
b. Łączenie
Zatem frakcje CV zebrane z żywicy AEX są następnie podawane do etapu łączenia, aby wyselekcjonować nieciągłe ilości izoform polietylenoglikolowanego białka, takich jak PEG-1, PEG-2, PEG-3,
PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 i PEG-9. Rozmaite techniki analityczne mogą być użyte do selektywnego łączenia spodziewanych izoform polietylenoglikolowanego białka, techniki te obejmują,
PL 212 726 B1 nie ograniczając zakresu, CE, SDS-PAGE, chromatografię IEX, chromatografię HIC, chromatografię AEX, chromatografię CEX, RPHPLC, SEHPLC, chromatografię powinowactwa (AC) oraz ich zestawienia. Zarówno CE jak i RPHPLC są korzystniejsze od SDS-PAGE. Ponadto, nie ograniczając zakresu przez teorię, uważa się, że reagent (np. dodecylosiarczan sodu) stosowany w SDS-PAGE zaburza pomiar jakiegokolwiek utworzonego agregatu. Uważa się, że dodecylosiarczan sodu (SDS) stosowany w oznaczeniach SDS-PAGE rozkł ada agregat tak, ż e mierzona jest zmniejszona ilość agregatu lub agregat nie jest mierzony. Jednakże SDS-PAGE może być z powodzeniem stosowany do obszaru diagnostycznego (np. określania jakościowego i ilościowego składu mieszaniny PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 i PEG-9 w zebranej frakcji) indywidualnych polietylenoglikolowanych białek. Jeśli analiza metodą CE jest przeprowadzana dla łączenia, to analiza jest przeprowadzana w temperaturze CE od około 5 do około 50°C, korzystnie od około 5 do około 45°C, bardziej korzystnie od około 20 do około 40°C, a najbardziej korzystnie od około 30 do około 32°C.
Ponadto, gdy stosowana jest CE, to CE jest prowadzona przy przewodnictwie CE łączenia (dotyczy przewodnictwa próbki frakcji) od około 0 do około 60 mS/cm, a bardziej korzystnie od około 5 do około 10 mS/cm. Próbka frakcji wykazująca przewodnictwo w zakresie wyżej wskazanego przewodnictwa CE łączenia, jest następnie wprowadzana do kapilarnej CE celem pozyskania obszaru diagnostycznego polietylenoglikolowanego białka. Tak otrzymany obszar diagnostyczny izoformy polietylenoglikolowanego białka danej frakcji CV jest porównywany z wzorcem celem zidentyfikowania konkretnej izoformy polietylenoglikolowanego białka obecnej w próbce.
Procent obszaru powierzchni, uzyskany dla każdego piku obszaru diagnostycznego, jest proporcjonalny do % wagowego izoformy odpowiadającej temu pikowi w tej frakcji. Następnie frakcja tak zidentyfikowana przez CE, że zawiera spodziewaną izoformę polietylenoglikolowanego białka o danym % wagowym izoformy jest dalej ewentualnie mieszana z innymi frakcjami podobnie dobranymi, aby dostarczyć mieszaninę spodziewanej izoformy. Taka obróbka prowadzi do kompozycji API.
Patrz na przykład, Swapan K. Chowdhury i współpr., „Fingerprinting Proteins Coupled with Polymers by Mass Spectrometry: Investigation of Polyethylene Glycol-Conjugated Superoxide Dismutase,” American Society for Mass Spectrometry, t. 6, s. 478-487, 1995.
Do przeprowadzenia analizy CE na zebranej frakcji CV stężenie polietylenoglikolowanego białka w buforze wynosi, odpowiednio, co najmniej około 0,2 mg/ml, co najmniej około 0,5 mg/ml, od około 0,1 do około 100 mg/ml, od około 0,5 do około 10 mg/l, lub od około 2 do około 3 mg/ml. Przy użyciu CE lub którejkolwiek z wyżej podanych technik analitycznych do łączenia, można połączyć różne izoformy polietylenoglikolowanego białka dostarczając zbiór spodziewanego polietylenoglikolowanego białka. Zatem na przykład połączone polietylenoglikolowane białko może zawierać jedno lub więcej PEG-1 do PEG-9, jedno lub więcej PEG-2 do PEG-9, jedno lub więcej PEG-3 do PEG-9, jedno lub więcej PEG-3 do PEG-8, jedno lub więcej PEG-3 do PEG-7, jedno PEG-3 do PEG-6, jedno lub więcej PEG-4 do PEG-6, jedno lub więcej PEG-4 i PEG-5, jedno lub więcej PEG-5 i PEG-6, oraz PEG-5.
Wśród wyżej wymienionych zbiorów, korzystne są różne zbiory polietylenoglikolowanych białek. Na przykład w odniesieniu do zbioru PEG-4, PEG-5 i PEG-6, zbiór PEG-4, PEG-5 i PEG-6 powinien być taki, że zawiera co najmniej 70% wagowych PEG-4, PEG-5 i PEG-6 względem całkowitego ciężaru izoform polietylenoglikolowanego białka w danym zbiorze. Korzystnie udział polietylenoglikolowanego białka PEG-4, PEG-5 i PEG-6 stanowi co najmniej około 75% wagowych względem całkowitego ciężaru izoform polietylenoglikolowanego białka, obecnego w zbiorze. Wartość ta wynosi, odpowiednio, bardziej korzystnie co najmniej około 80% wagowych, co najmniej około 85% wagowych, co najmniej około 90% wagowych i co najmniej około 94% wagowych, co najmniej około 95% wagowych, co najmniej około 96% wagowych, co najmniej około 97% wagowych, co najmniej około 98% wagowych, co najmniej około 99% wagowych, co najmniej około 99,5% wagowych i co najmniej około 99,9% wagowych.
W przypadku łączenia, łączenie jest przeprowadzane na izoformach polietylenoglikolowanego białka zebranych we frakcjach CV, gdzie izoformy polietylenoglikolowanego białka są dostarczone w buforze. Bufor, w którym są dostarczone izoformy polietylenoglikolowanego biał ka wykazuje pH od około 5 do około 10, korzystnie od około 6,6 do około 9, a bardziej korzystnie od około 6,9 do około 7,1. Ponadto, buforem jest bufor wybrany z grupy obejmującej Tris, fosforan, HEPES, kwas cytrynowy, trietyloaminę i histydynę.
W tym momencie połączone izoformy polietylenoglikolowanego białka przetworzone według wyżej przedstawionej metodologii (omawianej także w przykładach 1, 3 i 4 podanych poniżej) powinny być takie, że poziom agregatu w połączonym produkcie < około 10% wagowych względem całkowitePL 212 726 B1 go ciężaru izoform polietylenoglikolowanego białka i jakiegokolwiek agregatu, które zostały poddane powyższym etapom 1-5, przy czym etapy 2 i 3 są opcjonalne. Korzystnie poziom agregatu wynosi, odpowiednio, < około 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1,5%, 1%, 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6%, 0,5%, 0,4%, 0,3%, 0,2%, 0,1%, 0,05% i 0,01% wagowych względem wyżej wskazanego całkowitego ciężaru.
Tak połączone polietylenoglikolowane białko korzystnie zasadniczo składa się z jednego lub większej liczby PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 i PEG-9. Tak połączone polietylenoglikolowane białko korzystnie zasadniczo składa się z jednego lub większej liczby PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 i PEG-9. Tak połączone polietylenoglikolowane białko korzystnie zasadniczo składa się z jednego lub większej liczby PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7,
PEG-8 i PEG-9. Tak połączone polietylenoglikolowane białko korzystnie zasadniczo składa się z jednego lub większej liczby PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7 i PEG-8. Tak połączone polietylenoglikolowane białko korzystnie zasadniczo składa się z jednego lub większej liczby PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6 i PEG-7. Tak połączone polietylenoglikolowane białko korzystnie zasadniczo składa się z jednego lub większej liczby PEG-3, PEG-4, PEG-5 i PEG-6. Tak połączone polietylenoglikolowane białko korzystnie zasadniczo składa się z jednego lub większej liczby PEG-4, PEG-5 i PEG-6. Tak połączone polietylenoglikolowane białko korzystnie zasadniczo składa się z jednego lub większej liczby PEG-4 i PEG-5. Tak połączone polietylenoglikolowane białko korzystnie zasadniczo składa się z jednego lub większej liczby PEG-5 i PEG-6. Tak połączone polietylenoglikolowane białko korzystnie zasadniczo składa się z jednego lub większej liczby PEG-5.
Wyżej przedstawiona metodologia łączenia może być wykorzystana do łączenia izoform polietylenoglikolowanego białka, niezależnie od tego, czy takie izoformy zostały poddane chromatografii anionowymiennej.
Jeśli polietylenoglikolowane białko jest polietylenoglikolowanym antagonistą hormonu wzrostu, to korzystnie poziom agregatu jest < 6% wagowych względem całkowitego ciężaru izoform polietylenoglikolowanego antagonisty hormonu wzrostu i jakiegokolwiek jego agregatu w zbiorze lub w zebranej frakcji CV. Bardziej korzystnie poziom agregatu wynosi, odpowiednio, < około 5%, 4%, 3%, 2% i 1% wagowych względem wyżej wskazanego ciężaru całkowitego. Ponadto, jeśli polietylenoglikolowane białko jest polietylenoglikolowanym antagonistą hormonu wzrostu z różnymi jego izoformami, to „całkowity poziom” sumy jakiegokolwiek zanieczyszczenia trisiarczkowego, jakiegokolwiek zanieczyszczenia des-phe i jakiegokolwiek jego agregatu jest korzystnie na poziomie < około 15% wagowych względem całkowitego ciężaru izoform polietylenoglikolowanego antagonisty hormonu wzrostu, jakiegokolwiek zanieczyszczenia trisiarczkowego, jakiegokolwiek zanieczyszczenia des-phe i jakiegokolwiek jego agregatu, w zbiorze lub zebranej frakcji CV. Korzystnie, wyżej podany całkowity poziom (sumy jakiegokolwiek zanieczyszczenia trisiarczkowego, jakiegokolwiek zanieczyszczenia des-phe i jakiegokolwiek jego agregatu) wynosi, odpowiednio, < około 12%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% i 1% wagowych, względem całkowitego ciężaru.
Korzystnie także, jeśli polietylenoglikolowanym białkiem antagonisty hormonu wzrostu jest B-2036 PEG, to jego szkielet polipeptydowy stanowi B-2036 z SEK ID NR 1. Podobnie, także korzystnie, jeśli polietylenoglikolowanym białkiem jest agonista hormonu wzrostu, jego szkielet polipeptydowy stanowi polipeptyd o SEK ID NR 2.
Po etapie 4 chromatografii AEX i łączenia, jest przeprowadzany następnie etap 5 ultrafiltracji/diafiltracji. Korzystne parametry dla przeprowadzenia tego etapu UF/DF 5 są podane w przykładzie 1 i na schemacie technologicznym. Po zakończeniu etapu 5 zbierany jest zbiór diafiltracyjny. Zbiór diafiltracyjny jest następnie podawany do etapu 6, który polega na pobraniu czynnego składnika farmaceutycznego tak otrzymanego w powyższym zbiorze diafiltracyjnym i przeprowadzeniu sterylizacji, korzystnie za pomocą filtracji przez filtr 0,22 μm. Korzystne parametry dla przeprowadzenia etapu 6 filtracji API są przedstawione w przykładzie 1 i na schemacie technologicznym.
Na zakończenie, w poniższym przykładzie 1, przedstawiona jest korzystna procedura według niniejszego wynalazku przytaczająca szczegóły każdego z etapów 1-6 wskazanych powyżej, z użyciem etapu chromatografii na żywicy anionowymiennej. Dla celów porównawczych przedstawiono przykład 2, w którym etap chromatografii anionowymiennej jest zastąpiony przez etap chromatografii kationowymiennej łącznie z towarzyszącym etapem wymiany właściwego buforu. Wyniki procedury według przykładu 2 są przytoczone w tablicy 2, w której poziomy agregatów ulegają obniżeniu z tak wysokich jak 60% do około 6% wagowych agregatu. Przykład 3 opisuje metodologię łączenia, która ma zastosowanie albo do przykładu 1 i schematu technologicznego 1 albo do przykładu 2 i schematu technologicznego 2, w której RPHPLC jest stosowana jako technika analityczna, która jest porównana
PL 212 726 B1 do techniki analitycznej CE. Fig. 2, 3 i 4 dowodzą, że RPHPLC jest równoważna CE. Przykład 4 dostarcza korzystne procedury dla techniki analitycznej CE.
Przedmiotem rozwiązania jest sposób obniżenia poziomu agregatu polietylenoglikolowanego antagonisty hormonu wzrostu (GH) B-2036 i jego izoform, który to obejmuje etapy:
(a) dostarczenia wymienionego agregatu polietylenoglikolowanego antagonisty hormonu wzrostu (GH) B-2036 i jego izoform;
(b) ładowania wymienionego agregatu polietylenoglikolowanego antagonisty hormonu wzrostu (GH) B-2036 i jego izoform łącznie z jakimkolwiek zanieczyszczeniem i jakimkolwiek jego agregatem na wymienioną żywicę anionowymienną (AEX), przy czym ładowanie przeprowadza się przy przewodnictwie mniejszym lub równym około 10 mS/cm, przy pH od około 5 do około 10 i stężeniu białka mniejszym lub równym około 10 g białka/l objętości upakowanego złoża żywicy AEX; oraz (c) oddzielenia wymienionego agregatu polietylenoglikolowanego antagonisty hormonu wzrostu (GH) B-2036 i jego izoform przy zastosowaniu chromatografii AEX.
Korzystnie, gdy wymieniona żywica AEX jest wybrana z grupy obejmującej ΑΝΧ4™, DEAE™, Q-Sepharose™, Q-Sepharose FF™, Q Sepharose HP™ i Q-Sepharose XL™.
Korzystnie w wymienionym etapie (b) ładowanie przeprowadza się przy przewodnictwie ładowania mniejszym niż lub równym około 5 mS/cm.
Korzystnie, gdy w wymienionym etapie (b) ładowanie przeprowadza się przy przewodnictwie ładowania mniejszym niż lub równym około 2,4 mS/cm.
Korzystnie wymieniony etap (b) przeprowadza się przy pH ładowania AEX od około 6,6 do około 9.
Korzystnie wymieniony etap (b) przeprowadza się przy pH ładowania AEX od około 6,9 do około 7,1.
Korzystnie, gdy wymieniony agregat polietylenoglikolowanego antagonisty hormonu wzrostu (GH) B-2036 i jego izoformy zawierają antagonistę hormonu wzrostu (GH) B-2036 i jego izoformy polietylenoglikolowane z jednego lub z wielu obszarów.
Korzystnie gdy wymieniony polietylenoglikolowany antagonista hormonu wzrostu (GH) B-2036 i jego izoformy zawierają jedną lub wię cej spośród wymienionych izoform polietylenoglikolowanego antagonisty hormonu wzrostu (GH) wybranych z grupy składającej się z:
PEG-1 (jedna cząsteczka B-2036 (SEQ ID NO: 1) z jedną cząsteczką PEG lub jego wariantu,
PEG-2 (jedna cząsteczka B-2036 (SEQ ID NO: 1) z dwiema cząsteczkami PEG Iub jego wariantu,
PEG-3 (jedna cząsteczka B-2036 (SEQ ID NO: 1) z trzema cząsteczkami PEG Iub jego wariantu,
PEG-4 (jedna cząsteczka B-2036 (SEQ ID NO: 1) z czterema cząsteczkami PEG lub jego wariantu,
PEG-5 (jedna cząsteczka B-2036 (SEQ ID NO: 1) z pięcioma cząsteczkami PEG Iub jego wariantu,
PEG-6 (jedna cząsteczka B-2036 (SEQ ID NO: 1) z sześcioma cząsteczkami PEG Iub jego wariantu,
PEG-7 (jedna cząsteczka B-2036 (SEQ ID NO: 1) z siedmioma cząsteczkami PEG lub jego wariantu,
PEG-8 (jedna cząsteczka B-2036 (SEQ ID NO: 1) z ośmioma cząsteczkami PEG Iub jego wariantu,
PEG-9 (jedna cząsteczka B-2036 (SEQ ID NO: 1) z dziewięcioma cząsteczkami PEG Iub jego wariantu, oraz jakikolwiek agregat, zanieczyszczenie trisiarczkowe (cząsteczkę antagonisty hormonu wzrostu (GH) zawierającą dodatkowy atom siarki, który tworzy mostek trisiarczkowy w obrębie wymienionej cząsteczki) i zanieczyszczenie des-phe (cząsteczkę antagonisty hormonu wzrostu (GH) pozbawioną grupy aminowej fenyloalaniny) oraz jakiekolwiek nie-polietylenoglikolowane zanieczyszczenie wymienionego antagonisty hormonu wzrostu (GH) oraz jakiekolwiek wolne cząsteczki PEG.
Korzystnie, gdy sposób ponadto zawiera etap łączenia (d) polegający na łączeniu nieciągłych ilości wymienionych izoform polietylenoglikolowanego antagonisty hormonu wzrostu (GH) B-2036 i jego izoform, aby dostarczyć zbiór polietylenoglikolowanego antagonisty hormonu wzrostu (GH), za pomocą techniki wybranej z grupy obejmującej elektroforezę kapilarną (CE), elektroforezę w żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE), chromatografię jonowymienną (ΙΕΧ), chromatografię oddziaływania hydrofobowego (HIC), chromatografię anionowymienną (ΑΕΧ), chromatografię kationowymienną (CEX), wysokociśnieniową chromatografię cieczową w fazach odwróconych (RPHPLC), wykluczeniową wysokociśnieniową chromatografię cieczową (SEHPLC), chromatografię powinowactwa (AC) i ich zestawienia.
PL 212 726 B1
Korzystnie, gdy wymieniony zebrany agregat polietylenoglikolowanego antagonisty hormonu wzrostu (GH) zawiera jedno lub więcej spośród PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7,
PEG-8 i PEG-9.
Korzystnie, sposób charakteryzuje się tym, że udział zebranego polietylenoglikolowanego antagonisty hormonu wzrostu (GH) PEG-4, PEG-5 i PEG-6 stanowi co najmniej około 70% wagowych względem całkowitego ciężaru wymienionych PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 i PEG-9 izoform zebranego polietylenoglikolowanego antagonisty hormonu wzrostu (GH) i jakiegokolwiek jego agregatu.
Korzystnie, gdy wymieniony obniżony poziom wymienionego agregatu jest mniejszy lub równy około 10% wagowych względem całkowitego ciężaru wymienionych izoform i wymienionego agregatu.
Wszystkie liczbowe wartości i zidentyfikowane cząsteczki w niniejszym zgłoszeniu są przykładowe i nie jest zamierzone, aby były interpretowane jako ograniczające zastrzeżenie. Dalszą część opisu zilustrowano przykładami i nie należy jej traktować jako ograniczenie zakresu wynalazku. Wszystkie cytaty z książek, periodyków, artykułów w czasopismach, opisów patentowych lub wszelkich innych publikacji itd., przytoczone w tym zgłoszeniu, włącza się do niego formalnie przez powołanie się na nie.
P r z y k ł a d 1
Utrzymanie lub obniżenie poziomu agregatu antagonisty polietylenoglikolowanego hormonu wzrostu (B-2036-PEG) za pomocą chromatografii anionowymiennej
Utrzymanie (poniżej żądanego poziomu - np. < 6% wagowych całkowitej wagi) lub obniżenie poziomów agregatu B-2036 PEG uzyskano stosując BI (półprodukt B-2036 luzem) jako materiał wyjściowy, otrzymany jak wskazano w nie-tymczasowym amerykańskim zgłoszeniu patentowym numer seryjny P-107891, zatytułowanym Method for the Production Of Growth Hormone And Antagonist Thereof Having Lower Levels Of Isoform Impurities Thereof (Sposób wytwarzania hormonu wzrostu i jego antagonisty, posiadających obniżone poziomy zanieczyszczeń izoformami), zarejestrowanym 25 sierpnia, 2003 w U.S. Patent i Trademark Office (amerykańskim urzędem patentowym i znaków towarowych). Fermentację (celem dostarczenie B-2036) w układzie ekspresyjnym rekombinacyjnego E. coli przeprowadzono jak opisane przez Cunningham i inni, w amerykańskim opisie patentowym nr 5849535. Oczyszczanie B-2036 BI przeprowadzono jak opisano w powyżej zidentyfikowanym nietymczasowym amerykańskim zgłoszeniu patentowym nr (P-107891). Ten materiał poddano następnie obróbce, stosując wstępne etapy polietylenoglikolowania i chromatografię hydrofobowego oddziaływania, jak odnotowane w schemacie technologicznym 1 poniżej, wytwarzając B-2036 PEG. Następnie po chromatografii hydrofobowego oddziaływania (etap 2), B-2036 PEG poddano UF/DF do 25 mM TRIS buforu pH 7, (zamiast buforu octanu sodu pH 4, jak w sposobie z przykładu 2, etap 3, schemat technologiczny 2). Retentat następnie poddano chromatografii mocno-anionowymiennej na kolumnie Q Sepharose FF. Ten etap rozdziela różnorodnie polietylenoglikolowane substancje na frakcje do łączenia tak, aby osiągnąć dystrybucję polietylenoglikolowanych substancji, wymaganą do uwolnienia API. Ta kolumna wzbogaca w PEG-4, PEG-5 i PEG-6 produkty polietylenoglikolowanego BI (B-2036 PEG). Produkt jest eluowany z 20 CV liniowym gradientem od 0-250 mM NaCI w 25 mM Tris, pH 7,0, z następnymi etapami równowagowania i 2 CV przemywania z 25 mM Tris, pH 7,0. Analizy frakcji dokonuje się stosując CE zamiast SDS-PAGE jak odnotowano w przykładzie 2, schemat technologiczny 2. Zobacz poprzednie dyskusje dotyczące tego samego. Pegwisomant (Somavert®; Pharmacia) zbiera się z profilu chromatografii jako zbiór z frakcji analizowanych przez CE z kryterium łączenia > 75% PEG4+5+6 (pierwsza frakcja) i > 94% PEG4+5+6 (ostatnia frakcja) i >0,5 mg/ml. Uzyskany produkt poddano następnie dalszemu procesowi oczyszczania B-2036 PEG, jak opisano w schemacie technologicznym 1. Po wyborze i połączeniu frakcji, analiza zebranego materiału i finalnego API przez SEHPLC nie wykazała wykrywalnych agregatów. Zobacz tablica 1, wskazująca to samo poniżej.
P r z y k ł a d 2
Procedura w małej skali do oceny wpływu dodatków na agregację na S-Sepharose FF (żywica do chromat. kationowymiennej) B-2036 PEG
Do 15 ml probówki wirówkowej dodano 1,5 ml żywicy S-Sepharose FF (objętość osadzonego złoża). Żywicę przygotowano do związania białka przemywając dwukrotnie 10 ml 1% roztworu substancji dodatkowej, poddanej ocenie w 25 mM octanie sodu, pH 4. Po każdym przemyciu zebrano supernatant (przez odwirowanie), zdekantowano i odrzucono. Do przemytej tabletki żywicy dodano 2,5 ml 1% roztworu substancji dodatkowej poddanej ocenie w 25 mM octanie sodu, pH 4 i dodano ilość UF/DF retentatu, zawierającego około 5 mg B-2036 PEG z etapu 3 (otrzymanego sposobem ze
PL 212 726 B1 schematu technologicznego 2, etapy 1 do 3). Żywicę ponownie zawieszono w roztworze i inkubowano, delikatnie mieszając przez 2 do 24 godzin. Po inkubacji roztwór odwirowano, i supernatant zdekantowano i odrzucono. B-2036 PEG następnie eluowano z żywicy dodając do tabletki żywicy 2,5 ml 1% roztworu substancji dodatkowej poddanej ocenie w 25 mM octanie sodu, pH 4 i 0,25 ml 2,5 M chlorku sodu. Żywicę w uzyskanym roztworze ponownie zawieszono i inkubowano delikatnie mieszając przez 20 minut. Po inkubacji supernatant zachowano przez odwirowanie, i zdekantowano do analizy na drodze chromatografii wykluczeniowej (np. SEHPLC (HPLC wykluczeniowej). Następnie odrzucono zużytą tabletkę żywicy. Powyższą procedurę powtarzano dla każdej substancji dodatkowej poddanej ocenie, stosując żywicę do chromatografii kationowymiennej do określenia czy tworzenie agregatu można wyeliminować lub znacząco zmniejszyć. Stosując powyżej wspomnianą procedurę, otrzymano wyniki z tablicy 2 poniżej. Jak odzwierciedlone w tablicy 2, żadna z badanych substancji dodatkowych z zastosowaniem żywicy kationowej nie była tak skuteczna, jak była zmiana na żywicę anionową celem zmniejszenia poziomu tworzonego agregatu.
T a b l i c a 2 (Wyniki otrzymane z zastosowaniem żywicy kationowymiennej) Procedura w małej skali dla przykładu 2
| Sposób Napełnianie żywicą przy 3,3 g/l 1,5 ml ż ywicy na próbę Równowagowanie żywicy z substancją dodatkową przed załadowaniem białka Elucja przez dodawanie 2,5 M NaCl/octan pH 4, 1:10 obj./obj 24 godz. inkubacja cał ości, z wyjątkiem 1%, jak odnotowano | |
| Substancja dodatkowa/warunek | % Agregatu |
| Kontrola | 21,5 |
| 6M mocznik | 6,0 |
| CHAPS | 18,7 |
| Sarkozyl | 9,3 |
| PEG 3350 | 20,3 |
| izopropanol | 19,3 |
| n propanol | 24,7 |
| n butanol | 27,1 |
| pH 7,7 50 mM TRIS | 30,3 |
| kontrola | 32,2 przetrzymane przez noc |
| 7,5 M mocznik | 10,7 |
| 6 M mocznik | 8,1 |
| 3 M mocznik | 32,3 |
| 1,5 M mocznik | 35,0 |
| tween 20 | 19,3 |
| metanol | 33,7 |
| etanol | 33,5 |
| 5% sacharoza | 31,6 |
| mannitol | 30,8 |
| 1% polifosforan | 61,2 |
| 0,1% polifosforan | 42,5 |
| 0,01% polifosforan | 33,6 |
| 25 mm fosforan pH 2,2 | 19,7 |
| 25 mm fosforan pH 3 | 22,3 |
| 25 mm fosforan pH 5,5 | 63,1 |
| 25 mm fosforan pH 6,5 | 42,9 |
| 25 mm mrówczan pH 4 | 29,0 |
| kontrola 1 | 31,8 |
| kontrola 2 | 31,1 |
P r z y k ł a d 3
Technika analityczna RPHPLC
RPHPLC zastosowano tutaj do monitorowania i obliczenia procentowości substancji polietylenoglikolowanych (np. PEG-4, PEG-5 i PEG-6) znajdujących się we frakcjach z kolumny Q-Sepharose z oczyszczania anionowymiennego pegwisomantu.
μΐ każdej frakcji z kolumny Q-Sepharose (etap wymiany anionu, zobacz przykład 1 powyżej) (stężenia białka wahające się od 0,5 do 1,3 mg/ml) zastosowano na kolumnę Zorbax 300SB-CN (4,6 mm x
PL 212 726 B1
150 mm; 3,5 μm; numer części 863973-905; numer seryjny USMJ001205). Fazą ruchomą A jest 0,1% kwas trifluorooctowy, podczas gdy faza ruchoma B składa się z 0,085% kwasu trifluorooctowego w acetonitrylu. Zastosowano gradient liniowy od 40 do 50 procent buforu B w czasie 20 minut dla szybkości przepływu 1,0 ml/min w temperaturze otoczenia do rozdziału różnych polietylenoglikolowanych postaci pegwisomantu. Absorbancję monitorowano dla 214 nm.
Wyniki uzyskane w RPHPLC są podobne do tych otrzymanych na drodze elektroforezy kapilarnej (CE), jak wskazano poniżej na fig. 2-4. Zobacz także poniższy przykład 4, przykładowa procedura techniki analitycznej CE.
T a b l i c a 3
Analiza frakcji pegwisomantu z Q-Sepharose w elektroforezie kapilarnej celem określenia procent wszystkich substancji polietylenoglikolowanych (frakcje 7 do 18 także analizowano w RPHPLC - zobacz tablica 4)
| Frakcja | Stężenie wyjściowe (mg/ml) | % PEG-2 | % PEG-3 | % PEG-4 | % PEG-5 | % PEG-6 | % PEG-7 | % PEG-8 |
| 2 | 0,59 | 0,0 | 0,0 | 2,8 | 26,3 | 39,6 | 25,3 | 6,0 |
| 3 | 0,88 | 0,0 | 0,0 | 4,6 | 28,6 | 44,8 | 18,8 | 3,2 |
| 4 | 1,04 | 0,0 | 0,0 | 5,8 | 28,1 | 48,6 | 15,9 | 1,7 |
| 5 | 1,16 | 0,0 | 0,0 | 6,2 | 28,3 | 49,8 | 14,1 | 1,6 |
| 6 | 1,23 | 0,0 | 0,0 | 5,4 | 29,9 | 54,5 | 10,2 | 0,0 |
| 7 | 1,27 | 0,0 | 0,0 | 5,2 | 33,0 | 54,1 | 7,7 | 0,0 |
| 8 | 1,27 | 0,0 | 0,0 | 5,3 | 39,3 | 50,6 | 4,8 | 0,0 |
| 9 | 1,27 | 0,0 | 0,0 | 4,5 | 49,9 | 41,8 | 3,8 | 0,0 |
| 10 | 1,24 | 0,0 | 0,0 | 5,1 | 59,5 | 33,1 | 2,3 | 0,0 |
| 11 | 1,21 | 0,0 | 0,0 | 6,2 | 65,9 | 25,4 | 2,5 | 0,0 |
| 12 | 1,17 | 0,0 | 0,0 | 7,9 | 74,4 | 17,7 | 0,0 | 0,0 |
| 13 | 1,12 | 0,0 | 0,0 | 15,3 | 72,6 | 12,2 | 0,0 | 0,0 |
| 14 | 1,09 | 0,0 | 0,0 | 21,4 | 70,7 | 8,0 | 0,0 | 0,0 |
| 15 | 1,05 | 0,0 | 0,0 | 37,3 | 57,3 | 5,4 | 0,0 | 0,0 |
| 16 | 1,01 | 0,0 | 0,0 | 48,2 | 47,0 | 4,8 | 0,0 | 0,0 |
| 17 | 0,97 | 0,0 | 0,0 | 55,8 | 40,2 | 3,9 | 0,0 | 0,0 |
| 18 | 0,91 | 0,0 | 2,1 | 62,4 | 31,8 | 3,6 | 0,0 | 0,0 |
| 19 | 0,84 | 0,0 | 0,0 | 80,8 | 19,2 | 0,0 | 0,0 | 0,0 |
| 20 | 0,77 | 0,0 | 1,2 | 78,2 | 20,7 | 0,0 | 0,0 | 0,0 |
| 21 | 0,71 | 0,0 | 6,8 | 77,3 | 15,9 | 0,0 | 0,0 | 0,0 |
| 22 | 0,65 | 0,0 | 12,3 | 75,9 | 11,9 | 0,0 | 0,0 | 0,0 |
| 23 | 0,61 | 0,0 | 18,9 | 70,3 | 10,8 | 0,0 | 0,0 | 0,0 |
| 24 | 0,56 | 0,0 | 21,5 | 69,5 | 9,0 | 0,0 | 0,0 | 0,0 |
Zakreślony region (to znaczy frakcje 7 do 18) oznacza frakcje, które były także analizowane przez RPHPLC.
PL 212 726 B1
T a b l i c a 4
Dystrybucja różnych polietylenoglikolowanych postaci pegwisomantu we frakcjach z Q-Sepharose1 jak oznaczono za pomocą CE i RPHPLC
| % PEG-4 | % PEG-5 | % PEG-6 | % PEG-7 | |||||
| Frakcja | CE | RP- HPLC | CE | RP- HPLC | CE | RP- HPLC | CE | RP- HPLC |
| 7 | 5,2 | 5,8 | 33,0 | 30,3 | 54,1 | 55,6 | 7,7 | 8,3 |
| 8 | 5,3 | 6,5 | 39,3 | 39,4 | 50,6 | 48,6 | 4,8 | 5,5 |
| 9 | 4,5 | 5,5 | 49,9 | 52,6 | 41,8 | 37,3 | 3,8 | 4,6 |
| 10 | 5,1 | 6,1 | 59,5 | 63,3 | 33,1 | 27,5 | 2,3 | 3,1 |
| 11 | 6,2 | 6,5 | 65,9 | 71,6 | 25,4 | 19,5 | 2,5 | 2,3 |
| 12 | 7,9 | 11,4 | 74,4 | 72,7 | 17,7 | 13,9 | 0,0 | 2,0 |
| 13 | 15,3 | 17,2 | 72,6 | 71,2 | 12,2 | 11,6 | 0,0 | 0,0 |
| 14 | 21,4 | 28,4 | 70,7 | 63,7 | 8,0 | 7,9 | 0,0 | 0,0 |
| 15 | 37,3 | 42,6 | 57,3 | 51,6 | 5,4 | 5,8 | 0,0 | 0,0 |
| 16 | 48,2 | 54,0 | 47,0 | 41,8 | 4,8 | 4,1 | 0,0 | 0,0 |
| 17 | 55,8 | 64,1 | 40,2 | 32,5 | 3,9 | 3,4 | 0,0 | 0,0 |
| 18 | 62,4 | 71,5 | 31,8 | 25,2 | 3,6 | 3,1 | 0,0 | 0,0 |
Porównawcze wyniki CE względem RPHPLC przedstawiono na fig. 2, 3 i 4 dla B-2036 PEG-4,
B-2036 PEG-5 i B-2036 PEG-6.
Fig. 2. Graficzne porównanie procentu substancji B-2036 PEG 4 znalezionych we frakcjach 7-18 z Q-Sepharose, oznaczonych przez elektroforezę kapilarną i HPLC w fazach odwróconych.
Fig. 3. Graficzne porównanie procentu substancji B-2036 PEG 5 znalezionych we frakcjach 7-18 z Q-Sepharose, oznaczonych przez elektroforezę kapilarną i HPLC w fazach odwróconych.
Fig. 4. Graficzne porównanie procentu substancji B-2036 PEG 6 znalezionych we frakcjach 7-18 z Q-Sepharose, oznaczonych przez elektroforezę kapilarną i HPLC w fazach odwróconych.
P r z y k ł a d 4
Technika analityczna CE
Frakcje z Q-Sepharose analizowano za pomocą elektroforezy kapilarnej w poniższy sposób. Kapilarę, o średnicy wewnętrznej 50 μm i długości efektywnej 37 cm, kondycjonowano przepłukując 1,0 N NaOH przez 10 minut, pod ciśnieniem 20 psi, następnie przepłukując 20 minut buforem bieżącym. Bufor bieżący, 40 mM kwasu fosforowego, 4 mg/ml O'O-bis-(2-aminopropylo)polietylenowego glikolu, 0,1 mg/ml tlenku polietylenu, pH 1,9-2,0, otrzymano z 10X roztworu podstawowego i przesączono przez filtr 0,22 μm celem usunięcia cząstek stałych, które mogą zapychać kapilarę.
Próbki ogrzewano do temperatury pokojowej, aby zapobiec tworzeniu agregatu, po skontaktowaniu próbki z buforem rozcieńczającym (40 mM kwasu fosforowego, 4 mg/ml O'O-bis-(2-aminopropylo)polietylenowego glikolu, pH 1,9-2,2) lub buforem bieżącym. Próbki, które wynosiły < 0,5 mg/ml nie były analizowane. Próbki > 0,5 mg/ml wstrzykiwano bez rozcieńczania, podczas gdy próbki o stężeniu > 2,0 mg/ml rozcieńczono do 2,0 mg/ml, stosując bufor do rozcieńczania. Próbki wstrzykiwano do kapilary używając ciśnienie 0,5 psi przez 10-60 sekund. Po wstrzyknięciu próbki, wstrzyknięto bufor bieżący w czasie 3 sekund przy 0,5 psi, celem zatężenia próbki. Próbki rozdzielano przez 25 minut przy 30 kV w minimum 30°C i wykrywano przy 214 nm. Kapilarę spłukiwano z 0,1 N NaOH przed każdym kolejnym wstrzyknięciem próbki, przez co najmniej jedną minutę przy 20 psi i buforem bieżącym przez dwie minuty celem usunięcia jakiejkolwiek utrzymującej się próbki ze ściany kapilary. Próbki przechowywano w 25-30°C.
Uzyskane elektroferogramy zintegrowano rozdzielając piki w najniższym punkcie pomiędzy sąsiednimi pikami i obliczono procent skorygowanej powierzchni.
Stosując wyżej opisaną procedurę łącznie z ujawnieniem etapu 4, schematu technologicznego 1, przykładu 1, wynikami uzyskanymi dzięki CE są te przedstawione na fig. 2-4 powyżej.
PL 212 726 B1
P r z y k ł a d 5
Pierwszy przykład łączenia
Frakcje z Q-Sepharose analizowano za pomocą CE następująco. Kapilarę, o średnicy wewnętrznej 50 μm i długości efektywnej 37 cm, kondycjonowano przepłukując 1,0 N NaOH przez 10 minut, pod ciśnieniem 20 psi, następnie przepłukując 20 minut buforem bieżącym. Bufor bieżący, 40 mM kwasu fosforowego, 4 mg/ml O'O-bis-(2-aminopropylo)polietylenowego glikolu, 0,1 mg/ml tlenku polietylenu, pH 1,9-2,0, otrzymano z 10Χ roztworu podstawowego i przesączono przez filtr 0,22 μm celem usunięcia cząstek stałych, które mogą zapychać kapilarę.
Próbki ogrzewano do temperatury pokojowej, aby zapobiec tworzeniu agregatu, po skontaktowaniu próbki z buforem rozcieńczającym (40 mM kwasu fosforowego, 4 mg/ml O'O-bis-(2-aminopropylo)polietylenowego glikolu, pH 1,9-2,2) lub buforem bieżącym. Próbki, które wynosiły < 0,5 mg/ml nie były analizowane. Próbki > 0,5 mg/ml wstrzykiwano bez rozcieńczania, podczas gdy próbki o stężeniu > 2,0 mg/ml rozcieńczono do 2,0 mg/ml, stosując bufor do rozcieńczania. Próbki wstrzykiwano do kapilary używając ciśnienie 0,5 psi przez 10-60 sekund. Po wstrzyknięciu próbki, wstrzyknięto bufor bieżący w czasie 3 sekund przy 0,5 psi, celem zatężenia próbki. Próbki rozdzielano przez 25 minut przy 30 kV w minimum 30°C i wykrywano przy 214 nm. Kapilarę spłukiwano z 0,1 N NaOH przed każdym kolejnym wstrzyknięciem próbki, przez co najmniej jedną minutę przy 20 psi i buforem bieżącym przez dwie minuty celem usunięcia jakiejkolwiek utrzymującej się próbki ze ściany kapilary. Próbki przechowywano w 25-30°C.
Uzyskane elektroferogramy zintegrowano rozdzielając piki w najniższym punkcie pomiędzy sąsiednimi pikami i obliczono procent skorygowanej powierzchni.
Stosując wyżej opisaną procedurę łącznie z ujawnieniem etapu 4, schematu technologicznego 1, przykładu 1, wynikami uzyskanymi dzięki CE są te przedstawione poniżej w tablicy 5a. Otrzymano zbiór wzbogaconych polietylenoglikolowanych izoform stosując kryterium akceptowania jako frakcji zebranej, tych frakcji analizowanych za pomocą CE o składzie > 74% PEG4+5+6 (frakcja pierwsza) i > 94% PEG4+5+6 (frakcja ostatnia) i > 0,5 mg/ml. Frakcje 6 do 25 (tablica 5a poniżej) wybrano i połączono w zbiór stosując te kryteria. Materiał wyjściowy UF/DF#3 i połączone frakcje połączone poddano analizie CE, jak przedstawiono powyżej. Po wyborze i połączeniu frakcji, analiza połączonego materiału wykazała wzbogacenie w izoformy PEG-4, PEG-5 i PEG-6. Zobacz tablica 5b wskazująca to samo poniżej.
T a b l i c a 5a
| Frakcja # | Białko Stęż. mg/ml | PEG-2 | PEG-3 | PEG-4 | PEG-5 | PEG-6 | PEG-7 | PEG-8 | PEG (4+5+6) |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| 1 | 0,23 | ||||||||
| 2 | 0,65 | 0 | |||||||
| 3 | 0,91 | 2 | 18 | 40 | 32 | 9 | 60 | ||
| 4 | 1,06 | 3 | 19 | 41 | 31 | 6 | 63 | ||
| 5 | 1,15 | 4 | 22 | 43 | 27 | 5 | 69 | ||
| 6 | 1,21 | 4 | 26 | 44 | 23 | 3 | 74 | ||
| 7 | 1,27 | 3 | 28 | 49 | 20 | 80 | |||
| 8 | 1,28 | 3 | 25 | 55 | 17 | 83 | |||
| 9 | 1,28 | 3 | 25 | 60 | 12 | 88 | |||
| 10 | 1,27 | 4 | 30 | 58 | 8 | 92 | |||
| 11 | 1,25 | 4 | 47 | 43 | 6 | 94 | |||
| 12 | 1,23 | 4 | 52 | 39 | 5 | 95 | |||
| 13 | 1,20 | 3 | 62 | 31 | 4 | 96 | |||
| 14 | 1,15 | 5 | 70 | 23 | 3 | 98 |
PL 212 726 B1 cd. tablicy 5a
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| 15 | 1,11 | 6 | 69 | 24 | 1 | 99 | |||
| 16 | 1,06 | 10 | 76 | 15 | 101 | ||||
| 17 | 1,02 | 23 | 70 | 7 | 100 | ||||
| 18 | 0,98 | 31 | 63 | 6 | 100 | ||||
| 19 | 0,94 | 44 | 50 | 5 | 99 | ||||
| 20 | 0,90 | 54 | 41 | 5 | 100 | ||||
| 21 | 0,84 | 60 | 35 | 5 | 100 | ||||
| 22 | 0,78 | 66 | 29 | 5 | 100 | ||||
| 23 | 0,71 | 77 | 21 | 2 | 100 | ||||
| 24 | 0,64 | 82 | 16 | 2 | 100 | ||||
| 25 | 0,58 | 2 | 83 | 13 | 2 | 98 | |||
| 26 | 0,54 | 9 | 74 | 17 | 3 | 94 | |||
| 27 | 0,50 | 18 | 68 | 14 | 0 | 82 |
T a b l i c a 5b
| Białko | |||||||||
| Frakcja # | Stęż. mg/ml | PEG-2 | PEG-3 | PEG-4 | PEG-5 | PEG-6 | PEG-7 | PEG-8 | PEG (4+5+6) |
| Zbiór UF/DF#3 | 5,86 | 5 | 21 | 33 | 30 | 9 | 1 | 84 | |
| Frakcje połączone | 1,04 | 25 | 38 | 30 | 7 | 93 |
P r z y k ł a d 6
Drugi przykład łączenia
Frakcje z Q-Sepharose analizowano za pomocą CE następująco. Kapilarę, o średnicy wewnętrznej 50 μm i długości efektywnej 37 cm, kondycjonowano przemywając 1,0 N NaOH przez 10 minut, pod ciśnieniem 20 psi, następnie przemywając 20 minut buforem bieżącym. Bufor bieżący, 40 mM kwasu fosforowego, 4 mg/ml O'O-bis-(2-aminopropylo)polietylenowego glikolu, 0,1 mg/ml tlenku polietylenu, pH 1,9-2,0, otrzymano z 10Χ roztworu podstawowego i przesączono przez filtr 0,22 μm celem usunięcia cząstek stałych, które mogą zapychać kapilarę.
Próbki ogrzewano do temperatury pokojowej, aby zapobiec tworzeniu agregatu, po skontaktowaniu próbki z buforem rozcieńczającym (40 mM kwasu fosforowego, 4 mg/ml O'O-bis-(2-aminopropylo)polietylenowego glikolu, pH 1,9-2,2) lub buforem bieżącym. Próbki, które wynosiły < 0,5 mg/ml nie były analizowane. Próbki > 0,5 mg/ml wstrzykiwano bez rozcieńczania, podczas gdy próbki o stężeniu > 2,0 mg/ml rozcieńczono do 2,0 mg/ml, stosując bufor do rozcieńczania. Próbki wstrzykiwano do kapilary używając ciśnienie 0,5 psi przez 10-60 sekund. Po wstrzyknięciu próbki, wstrzyknięto bufor bieżący w czasie 3 sekund przy 0,5 psi, celem zatężenia próbki. Próbki rozdzielano przez 25 minut przy 30 kV w minimum 30°C i wykrywano przy 214 nm. Kapilarę spłukiwano z 0,1 N NaOH przed każdym kolejnym wstrzyknięciem próbki, przez co najmniej jedną minutę przy 20 psi i buforem bieżącym przez dwie minuty celem usunięcia jakiejkolwiek utrzymującej się próbki ze ściany kapilary. Próbki przechowywano w 25-30°C.
Uzyskane elektroferogramy zintegrowano rozdzielając piki w najniższym punkcie pomiędzy sąsiednimi pikami i obliczono procent skorygowanej powierzchni.
Stosując wyżej opisaną procedurę łącznie z ujawnieniem etapu 4, schematu technologicznego 1, przykładu 1, wynikami uzyskanymi dzięki CE są te przedstawione poniżej w tablicy 6a. Otrzymano zbiór wzbogaconych polietylenoglikolowanych izoform stosując kryterium akceptowania jako frakcji zebranej, tych frakcji analizowanych za pomocą CE o składzie > 75% PEG4+5+6 (frakcja pierwsza)
PL 212 726 B1 i > 94% PEG4+5+6 (frakcja ostatnia) i > 0,5 mg/ml. Frakcje 3 do 20 (tablica 6a poniżej) wybrano i połączono w zbiór stosując te kryteria. Materiał wyjściowy UF/DF#3 (zmierzone jako zbiór HIC) i połączone frakcje połączone poddano analizie CE, jak przedstawiono powyżej. Po wyborze i połączeniu frakcji, analiza połączonego materiału wykazała wzbogacenie w izoformy PEG-4, PEG-5 i PEG-6. Zobacz tablica 6b wskazująca to samo poniżej.
T a b l i c a 6a
| Białko | |||||||||
| Frakcja # | Stęż. mg/ml | PEG-2 | PEG-3 | PEG-4 | PEG-5 | PEG-6 | PEG-7 | PEG-8 | PEG (4+5+6) |
| 1 | 0,17 | ||||||||
| 2 | 0,59 | 3 | 26 | 40 | 25 | 5 | 69 | ||
| 3 | 0,88 | 5 | 29 | 45 | 19 | 3 | 78 | ||
| 4 | 1,04 | 6 | 28 | 49 | 16 | 2 | 83 | ||
| 5 | 1,16 | 6 | 28 | 50 | 14 | 98 | |||
| 6 | 1,24 | 5 | 30 | 55 | 10 | 100 | |||
| 7 | 1,27 | 5 | 33 | 43 | 8 | 100 | |||
| 8 | 1,27 | 5 | 39 | 51 | 5 | 100 | |||
| 9 | 1,27 | 5 | 50 | 42 | 4 | 100 | |||
| 10 | 1,24 | 5 | 60 | 33 | 2 | 100 | |||
| 11 | 1,21 | 6 | 66 | 25 | 3 | 100 | |||
| 12 | 1,17 | 8 | 74 | 18 | 100 | ||||
| 13 | 1,13 | 15 | 73 | 12 | 100 | ||||
| 14 | 1,09 | 21 | 71 | 8 | 100 | ||||
| 15 | 1,05 | 37 | 57 | 5 | 100 | ||||
| 16 | 1,01 | 48 | 47 | 5 | 100 | ||||
| 17 | 0,97 | 56 | 40 | 4 | 100 | ||||
| 18 | 0,91 | 2 | 62 | 32 | 4 | 98 | |||
| 19 | 0,84 | 0 | 81 | 19 | 100 | ||||
| 20 | 0,77 | 1 | 78 | 21 | 99 | ||||
| 21 | 0,71 | 7 | 77 | 16 | 93 | ||||
| 22 | 0,66 | 12 | 76 | 12 | 88 | ||||
| 23 | 0,61 | 19 | 70 | 11 | 81 | ||||
| 24 | 0,57 | 22 | 70 | 9 | 79 |
T a b e l a 6b
| Białko | |||||||||
| Frakcja # | Stęż. mg/ml | PEG-2 | PEG-3 | PEG-4 | PEG-5 | PEG-6 | PEG-7 | PEG-8 | PEG (4+5+6) |
| Zbiór UF/DF#3 | 3,51 | 9 | 27 | 37 | 22 | 4 | 86 | ||
| Frakcje połączone | 1,08 | 22 | 46 | 28 | 5 | 96 | |||
| * Zmierzone na zbiorze HIC |
PL 212 726 B1
Wprawdzie niniejszy wynalazek jest przedstawiony w odniesieniu do rekombinacyjnego B-2036 i rekombinacyjnego PEG B-2036, ale jeś li nie wskazano inaczej, to jest rzeczą zrozumiałą, że ten wynalazek można stosować w odniesieniu do dowolnego polietylenoglikolowanego rekombinacyjnego agonisty hormonu wzrostu, polietylenoglikolowanego rekombinacyjnego antagonisty hormonu wzrostu, niezależnie od tego, czy jest to hormon wzrostu ssaka lub jego antagonista, polietylenoglikolowany ludzki hormon wzrostu lub jego antagonista, czy też polietylenoglikolowany wołowy hormon wzrostu lub jego antagonista, dowolne polietylenoglikolowane białko, dowolny polietylenoglikolowany hormon, dowolne polietylenoglikolowane przeciwciało (lub fragment(y)) itd.
Lista sekwencji <110> Boyle i współpr.
<120> Sposób obniżenia poziomu agregatów w polietylenoglikolowanym białku <130> 161765.00521 <150> US 60/412.227 <151> 2002-09-20 <160> 2 <170> FastSEQ dla Windows, wersja 4.0 <210> 1 <211> 191 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1
| Phe | Pro | Thr | Ile | Pro | Leu | Ser | Arg | Leu | Phe | Asp | Asn | Ala | Met | Leu | Arg |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Ala | Asp | Arg | Leu | Asn | Gin | Leu | Ala | Phe | Asp | Thr | Tyr | Gin | Glu | Phe | Glu |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Glu | Ala | Tyr | Ile | Pro | Lys | Glu | Gin | Lys | Tyr | Ser | Phe | Leu | Gin | Asn | Pro |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Gin | Thr | Ser | Leu | Cys | Phe | Ser | Glu | Ser | Ile | Pro | Thr | Pro | Ser | Asn | Arg |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Glu | Glu | Thr | Gin | Gin | Lys | Ser | Asn | Leu | Glu | Leu | Leu | Arg | I le | Ser | Leu |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Leu | Leu | Ile | Gin | Ser | Trp | Leu | Glu | Pro | Val | Gin | Phe | Leu | Arg | Ser | Val |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Phe | Ala | Asn | Ser | Leu | Val | Tyr | Gly | Ala | Ser | Asp | Ser | Asn | Val | Tyr | Asp |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Leu | Leu | Lys | Asp | Leu | Glu | Glu | Lys | Ile | Gin | Thr | Leu | Met | Gly | Arg | Leu |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Glu | Asp | Gly | Ser | Pro | Arg | Thr | Gly | Gin | Ile | Phe | Lys | Gin | Thr | Tyr | Ser |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Lys | Phe | Asp | Thr | Asn | Ser | His | Asn | Asp | Asp | Ala | Leu | Leu | Lys | Asn | Tyr |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| Gly | Leu | Leu | Tyr | Cys | Phe | Asn | Ala | Asp | Met | Ser | Arg | Val | Ser | Thr | Phe |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| Leu | Arg | Thr | Val | Gin | Cys | Arg | Ser | Val | Glu | Gly | Ser | Cys | Gly | Phe | |
| 180 | 185 | 190 |
<210> 2 <211> 191 <212> PRT <213> Homo sapiens
PL 212 726 B1 <400> 2
| Phe | Pro | Thr | Ile | Pro | Leu | Ser | Arg | Leu | Phe | Asp | Asn | Ala | Met | Leu | Arg |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Ala | His | Arg | Leu | His | Gin | Leu | Ala | Phe | Asp | Thr | Tyr | Gin | Glu | Phe | Glu |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Glu | Ala | Tyr | Ile | Pro | Lys | Glu | Gin | Lys | Tyr | Ser | Phe | Leu | Gin | Asn | Pro |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Gin | Thr | Ser | Leu | Cys | Phe | Ser | Glu | Ser | Ile | Pro | Thr | Pro | Ser | Asn | Arg |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Glu | Glu | Thr | Gin | Gin | Lys | Ser | Asn | Leu | Glu | Leu | Leu | Arg | Ile | Ser | Leu |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Leu | Leu | Ile | Gin | Ser | Trp | Leu | Glu | Pro | Val | Gin | Phe | Leu | Arg | Ser | Val |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Phe | Ala | Asn | Ser | Leu | Val | Tyr | Gly | Ala | Ser | Asp | Ser | Asn | Val | Tyr | Asp |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Leu | Leu | Lys | Asp | Leu | Glu | Glu | Gly | Ile | Gin | Thr | Leu | Met | Gly | Arg | Leu |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Glu | Asp | Gly | Ser | Pro | Arg | Thr | Gly | Gin | Ile | Phe | Lys | Gin | Thr | Tyr | Ser |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Lys | Phe | Asp | Thr | Asn | Ser | His | Asn | Asp | Asp | Ala | Leu | Leu | Lys | Asn | Tyr |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| Gly | Leu | Leu | Tyr | Cys | Phe | Arg | Lys | Asp | Met | Asp | Lys | Val | Glu | Thr | Phe |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| Leu | Arg | Ile | Val | Gin | Cys | Arg | Ser | Val | Glu | Gly | Ser | Cys | Gly | Phe | |
| 180 | 185 | 190 |
Zastrzeżenia patentowe
Claims (12)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób obniżenia poziomu agregatu polietylenoglikolowanego antagonisty hormonu wzrostu (GH) B-2036 i jego izoform, który to proces obejmuje etapy:(a) dostarczenia wymienionego agregatu polietylenoglikolowanego antagonisty hormonu wzrostu (GH) B-2036 i jego izoform;(b) ładowania wymienionego agregatu polietylenoglikolowanego antagonisty hormonu wzrostu (GH) B-2036 i jego izoform łącznie z jakimkolwiek zanieczyszczeniem i jakimkolwiek jego agregatem na wymienioną żywicę anionowymienną (ΑΕΧ), przy czym ładowanie przeprowadza się przy przewodnictwie mniejszym lub równym około 10 mS/cm, przy pH od około 5 do około 10 i stężeniu białka mniejszym lub równym około 10 g białka/l objętości upakowanego złoża żywicy AEX; oraz (c) oddzielenia wymienionego agregatu polietylenoglikolowanego antagonisty hormonu wzrostu (GH) B-2036 i jego izoform przy zastosowaniu chromatografii AEX.
- 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wymieniona żywica AEX jest wybrana z grupy obejmującej ΑΝΧ4™, DEAE™, Q-Sepharose™, Q-Sepharose FF™, Q Sepharose HP™ i Q-Sepharose XL™.
- 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że w wymienionym etapie (b) ładowanie przeprowadza się przy przewodnictwie ładowania mniejszym niż lub równym około 5 mS/cm.
- 4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że w wymienionym etapie (b) ładowanie przeprowadza się przy przewodnictwie ładowania mniejszym niż lub równym około 2,4 mS/cm.
- 5. Sposób według któregokolwiek z zastrz. od 1 do 4, znamienny tym, że wymieniony etap (b) przeprowadza się przy pH ładowania AEX od około 6,6 do około 9.
- 6. Sposób według któregokolwiek z zastrz. od 1 do 4, znamienny tym, że wymieniony etap (b) przeprowadza się przy pH ładowania AEX od około 6,9 do około 7,1.
- 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wymieniony agregat polietylenoglikolowanego antagonisty hormonu wzrostu (GH) B-2036 i jego izoformy zawierają antagonistę hormonu wzrostu (GH) B-2036 i jego izoformy polietylenoglikolowane z jednego lub z wielu obszarów.PL 212 726 B1
- 8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że wymieniony polietylenoglikolowany antagonista hormonu wzrostu (GH) B-2036 i jego izoformy zawierają jedną lub więcej spośród wymienionych izoform polietylenoglikolowanego antagonisty hormonu wzrostu (GH) wybranych z grupy składającej się z:PEG-1 (jedna cząsteczka B-2036 (SEQ ID NO: 1) z jedną cząsteczką PEG lub jego wariantu, PEG-2 (jedna cząsteczka B-2036 (SEQ ID NO: 1) z dwiema cząsteczkami PEG Iub jego wariantu, PEG-3 (jedna cząsteczka B-2036 (SEQ ID NO: 1) z trzema cząsteczkami PEG Iub jego wariantu, PEG-4 (jedna cząsteczka B-2036 (SEQ ID NO: 1) z czterema cząsteczkami PEG Iub jego wariantu,PEG-5 (jedna cząsteczka B-2036 (SEQ ID NO: 1) z pięcioma cząsteczkami PEG lub jego wariantu,PEG-6 (jedna cząsteczka B-2036 (SEQ ID NO: 1) z sześcioma cząsteczkami PEG Iub jego wariantu,PEG-7 (jedna cząsteczka B-2036 (SEQ ID NO: 1) z siedmioma cząsteczkami PEG Iub jego wariantu,PEG-8 (jedna cząsteczka B-2036 (SEQ ID NO: 1) z ośmioma cząsteczkami PEG lub jego wariantu,PEG-9 (jedna cząsteczka B-2036 (SEQ ID NO: 1) z dziewięcioma cząsteczkami PEG lub jego wariantu, oraz jakikolwiek agregat, zanieczyszczenie trisiarczkowe (cząsteczkę antagonisty hormonu wzrostu (GH) zawierającą dodatkowy atom siarki, który tworzy mostek trisiarczkowy w obrębie wymienionej cząsteczki) i zanieczyszczenie des-phe (cząsteczkę antagonisty hormonu wzrostu (GH) pozbawioną grupy aminowej fenyloalaniny) oraz jakiekolwiek nie-polietylenoglikolowane zanieczyszczenie wymienionego antagonisty hormonu wzrostu (GH) oraz jakiekolwiek wolne cząsteczki PEG.
- 9. Sposób według zastrz. 1, ponadto zawierający etap łączenia (d) polegający na łączeniu nieciągłych ilości wymienionych izoform polietylenoglikolowanego antagonisty hormonu wzrostu (GH) B2036 i jego izoform, aby dostarczyć zbiór polietylenoglikolowanego antagonisty hormonu wzrostu (GH), za pomocą techniki wybranej z grupy obejmującej elektroforezę kapilarną (CE), elektroforezę w żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE), chromatografię jonowymienną (IEX), chromatografię oddziaływania hydrofobowego (HIC), chromatografię anionowymienną (AEX), chromatografię kationowymienną (CEX), wysokociśnieniową chromatografię cieczową w fazach odwróconych (RPHPLC), wykluczeniową wysokociśnieniową chromatografię cieczową (SEHPLC), chromatografię powinowactwa (AC) i ich zestawienia.
- 10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że wymieniony zebrany agregat polietylenoglikolowanego antagonisty hormonu wzrostu (GH) zawiera jedno lub więcej spośród PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 i PEG-9.
- 11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że udział zebranego polietylenoglikolowanego antagonisty hormonu wzrostu (GH) PEG-4, PEG-5 i PEG-6 stanowi co najmniej około 70% wagowych względem całkowitego ciężaru wymienionych PEG-1, PEG-2, PEG-3, PEG-4, PEG-5, PEG-6, PEG-7, PEG-8 i PEG-9 izoform zebranego polietylenoglikolowanego antagonisty hormonu wzrostu (GH) i jakiegokolwiek jego agregatu.
- 12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wymieniony obniżony poziom wymienionego agregatu jest mniejszy lub równy około 10% wagowych względem całkowitego ciężaru wymienionych izoform i wymienionego agregatu.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US41222702P | 2002-09-20 | 2002-09-20 | |
| US10/646,798 US20040048315A1 (en) | 2002-08-28 | 2003-08-25 | Method for the preparation of growth hormone and antagonist thereof having lower levels of isoform impurities thereof |
| US66288403A | 2003-09-16 | 2003-09-16 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL375443A1 PL375443A1 (pl) | 2005-11-28 |
| PL212726B1 true PL212726B1 (pl) | 2012-11-30 |
Family
ID=32034217
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL375443A PL212726B1 (pl) | 2002-09-20 | 2003-09-22 | Sposób obnizenia poziomu agregatu polietylenoglikolowanego antagonisty hormonu wzrostu B-2036 i jego izoform |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1545428B1 (pl) |
| JP (1) | JP4633463B2 (pl) |
| KR (1) | KR101120130B1 (pl) |
| AT (1) | ATE453662T1 (pl) |
| AU (1) | AU2003272585B2 (pl) |
| BR (1) | BRPI0314120B8 (pl) |
| CA (1) | CA2498886C (pl) |
| DE (1) | DE60330787D1 (pl) |
| DK (1) | DK1545428T3 (pl) |
| ES (1) | ES2337041T3 (pl) |
| HK (1) | HK1079798B (pl) |
| IL (1) | IL167538A (pl) |
| MX (1) | MXPA05003121A (pl) |
| PL (1) | PL212726B1 (pl) |
| PT (1) | PT1545428E (pl) |
| SI (1) | SI1545428T1 (pl) |
| WO (1) | WO2004026251A2 (pl) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007522198A (ja) * | 2004-02-09 | 2007-08-09 | ファルマシア コーポレーション | 化学修飾されたヒト成長ホルモン受容体アンタゴニスト結合体 |
| GB2438760A (en) * | 2004-12-22 | 2007-12-05 | Ambrx Inc | Methods for expression and purification of recombinant human growth hormone |
| WO2011018515A1 (en) * | 2009-08-14 | 2011-02-17 | Novo Nordisk Health Care Ag | Method of purifying pegylated proteins |
| EP3388443A1 (en) * | 2011-05-13 | 2018-10-17 | Biogen MA Inc. | Methods of preventing and removing trisulfide bonds |
| CA2838814A1 (en) * | 2011-08-25 | 2013-02-28 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Cation and anion exchange chromatography method |
| SG11202006140TA (en) * | 2017-12-29 | 2020-07-29 | Hoffmann La Roche | Process for providing pegylated protein composition |
| CN112107880B (zh) * | 2020-09-16 | 2022-08-09 | 珠海中科先进技术研究院有限公司 | 一种低共熔混合物及利用其萃取鲟鱼鱼籽蛋白质的方法 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3641115A1 (de) * | 1986-12-02 | 1988-06-16 | Lentia Gmbh | Verfahren zur herstellung eines intravenoes anwendbaren und in fluessiger form stabilen immunglobulins |
| US4847325A (en) * | 1988-01-20 | 1989-07-11 | Cetus Corporation | Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1 |
| US5153265A (en) * | 1988-01-20 | 1992-10-06 | Cetus Corporation | Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1 |
| US5969109A (en) * | 1990-02-28 | 1999-10-19 | Bona; Constantin | Chimeric antibodies comprising antigen binding sites and B and T cell epitopes |
| DK44593D0 (da) * | 1993-04-20 | 1993-04-20 | Novo Nordisk As | Fremgangsmaade til fremstilling af et polypeptid |
| ZA955789B (en) * | 1994-07-15 | 1996-03-11 | Novo Nordisk As | A method of converting a hydrophobic derivative of a polypeptide into the native form |
| AU6255096A (en) * | 1995-06-07 | 1996-12-30 | Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York, The | Pegylated modified proteins |
| CA2658039A1 (en) * | 1995-09-21 | 1997-03-27 | Genentech, Inc. | Human growth hormone variants |
| SE9802454D0 (sv) * | 1998-07-08 | 1998-07-08 | Pharmacia & Upjohn Ab | Production of peptides |
| SE9904502D0 (sv) * | 1999-12-09 | 1999-12-09 | Pharmacia & Upjohn Ab | Production of peptides |
-
2003
- 2003-09-22 ES ES03754774T patent/ES2337041T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-09-22 WO PCT/US2003/029546 patent/WO2004026251A2/en active Application Filing
- 2003-09-22 SI SI200331730T patent/SI1545428T1/sl unknown
- 2003-09-22 BR BRPI0314120A patent/BRPI0314120B8/pt active IP Right Grant
- 2003-09-22 CA CA2498886A patent/CA2498886C/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-09-22 PT PT03754774T patent/PT1545428E/pt unknown
- 2003-09-22 JP JP2004538262A patent/JP4633463B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2003-09-22 EP EP03754774A patent/EP1545428B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-09-22 PL PL375443A patent/PL212726B1/pl unknown
- 2003-09-22 DK DK03754774.2T patent/DK1545428T3/da active
- 2003-09-22 KR KR1020057004785A patent/KR101120130B1/ko active IP Right Grant
- 2003-09-22 DE DE60330787T patent/DE60330787D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-09-22 MX MXPA05003121A patent/MXPA05003121A/es active IP Right Grant
- 2003-09-22 AU AU2003272585A patent/AU2003272585B2/en not_active Expired
- 2003-09-22 AT AT03754774T patent/ATE453662T1/de active
-
2005
- 2005-03-20 IL IL167538A patent/IL167538A/en not_active IP Right Cessation
- 2005-12-29 HK HK05112085.6A patent/HK1079798B/zh not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1545428B1 (en) | 2009-12-30 |
| JP4633463B2 (ja) | 2011-02-16 |
| JP2006516021A (ja) | 2006-06-15 |
| HK1079798B (zh) | 2010-11-19 |
| PL375443A1 (pl) | 2005-11-28 |
| ATE453662T1 (de) | 2010-01-15 |
| EP1545428A2 (en) | 2005-06-29 |
| CA2498886A1 (en) | 2004-04-01 |
| SI1545428T1 (sl) | 2010-03-31 |
| ES2337041T3 (es) | 2010-04-20 |
| WO2004026251A2 (en) | 2004-04-01 |
| AU2003272585A1 (en) | 2004-04-08 |
| CA2498886C (en) | 2013-06-25 |
| BR0314120A (pt) | 2005-07-12 |
| BRPI0314120B1 (pt) | 2020-12-29 |
| KR101120130B1 (ko) | 2012-04-18 |
| HK1079798A1 (en) | 2006-04-13 |
| BRPI0314120B8 (pt) | 2021-05-25 |
| DK1545428T3 (da) | 2010-05-03 |
| AU2003272585B2 (en) | 2009-12-10 |
| DE60330787D1 (de) | 2010-02-11 |
| EP1545428A4 (en) | 2006-03-01 |
| MXPA05003121A (es) | 2005-06-22 |
| IL167538A (en) | 2015-10-29 |
| KR20050046011A (ko) | 2005-05-17 |
| WO2004026251A3 (en) | 2004-09-02 |
| PT1545428E (pt) | 2010-02-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7470779B2 (en) | Process for decreasing aggregate levels of pegylated protein | |
| CN111511756B (zh) | 使用烷基糖苷类进行蛋白质纯化和病毒灭活 | |
| US8148331B2 (en) | Method for the preparation of growth hormone and antagonist thereof having lower levels of isoform impurities thereof | |
| AU777974B2 (en) | Methods for protein purification using aqueous two-phase extraction | |
| PL212726B1 (pl) | Sposób obnizenia poziomu agregatu polietylenoglikolowanego antagonisty hormonu wzrostu B-2036 i jego izoform | |
| KR0178274B1 (ko) | 재조합 소마토트로핀의 회수방법 | |
| KR100442076B1 (ko) | 에리트로포이에틴과같은당단백질의정제방법 | |
| EP2220108A2 (en) | Protein purification and endotoxin removal | |
| Lu et al. | Purification and characterization of a membrane-bound tyrosine-O-sulfate-binding protein from bovine liver | |
| CS277068B6 (cs) | Způsob isolace lidského hypofysárního prolaktinu |