ES2337041T3 - Procedimiento para disminuir los niveles de agregacion de proteina pegilada. - Google Patents
Procedimiento para disminuir los niveles de agregacion de proteina pegilada. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2337041T3 ES2337041T3 ES03754774T ES03754774T ES2337041T3 ES 2337041 T3 ES2337041 T3 ES 2337041T3 ES 03754774 T ES03754774 T ES 03754774T ES 03754774 T ES03754774 T ES 03754774T ES 2337041 T3 ES2337041 T3 ES 2337041T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- peg
- pegylated
- protein
- procedure
- approximately
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 294
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 title claims description 136
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 title claims description 136
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 95
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 94
- 230000007423 decrease Effects 0.000 title claims description 73
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 claims abstract description 210
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 claims abstract description 179
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 191
- IIRDTKBZINWQAW-UHFFFAOYSA-N hexaethylene glycol Chemical compound OCCOCCOCCOCCOCCOCCO IIRDTKBZINWQAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 101
- UWHCKJMYHZGTIT-UHFFFAOYSA-N tetraethylene glycol Chemical compound OCCOCCOCCOCCO UWHCKJMYHZGTIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 100
- -1 PEG-5 Proteins 0.000 claims description 96
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 claims description 68
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 claims description 68
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 claims description 62
- 101000611641 Rattus norvegicus Protein phosphatase 1 regulatory subunit 15A Proteins 0.000 claims description 60
- ZIBGPFATKBEMQZ-UHFFFAOYSA-N triethylene glycol Chemical compound OCCOCCOCCO ZIBGPFATKBEMQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 60
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 claims description 54
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 claims description 46
- YZUUTMGDONTGTN-UHFFFAOYSA-N nonaethylene glycol Chemical compound OCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO YZUUTMGDONTGTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 45
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 claims description 42
- 229940122853 Growth hormone antagonist Drugs 0.000 claims description 35
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 32
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 32
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 31
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 26
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 26
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 claims description 21
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 14
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 14
- 239000003667 hormone antagonist Substances 0.000 claims description 13
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 13
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 claims description 12
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 12
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 12
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 claims description 10
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims description 8
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 8
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 8
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims description 7
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 claims description 7
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 7
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 6
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 claims description 6
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 claims description 5
- 102100034612 Annexin A4 Human genes 0.000 claims description 4
- 101000924461 Homo sapiens Annexin A4 Proteins 0.000 claims description 4
- MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N dodecyl hydrogen sulfate Chemical compound CCCCCCCCCCCCOS(O)(=O)=O MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229940043264 dodecyl sulfate Drugs 0.000 claims description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N phenylalanine group Chemical group N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 3
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108091006006 PEGylated Proteins Proteins 0.000 abstract description 174
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 abstract description 19
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 18
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 abstract description 13
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 abstract description 6
- 238000011176 pooling Methods 0.000 abstract 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 abstract 1
- 108700030081 B 2036 Proteins 0.000 description 208
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 106
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 105
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 91
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 85
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 82
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 67
- 108700037519 pegvisomant Proteins 0.000 description 63
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 57
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 52
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 52
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 34
- 229960002995 pegvisomant Drugs 0.000 description 33
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 26
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 26
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 25
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 22
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 22
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 20
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 20
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Inorganic materials [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 20
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 19
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 17
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 17
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 16
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 16
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 15
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 15
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 15
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 15
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 15
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 15
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 14
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 14
- 239000000463 material Substances 0.000 description 14
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 13
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 12
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 11
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 11
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 11
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 11
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 10
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 10
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 10
- 238000011161 development Methods 0.000 description 10
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 10
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 10
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 10
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 10
- 241000894007 species Species 0.000 description 10
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 9
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 9
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 9
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 9
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 9
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 8
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 8
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 7
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 7
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 7
- 102100020948 Growth hormone receptor Human genes 0.000 description 6
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 6
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 6
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 6
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N L-cystine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CSSC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 5
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 5
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 5
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 5
- 239000008240 homogeneous mixture Substances 0.000 description 5
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 5
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 5
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 description 5
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 5
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 5
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 108010068542 Somatotropin Receptors Proteins 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 4
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 4
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 4
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 4
- 229940124274 edetate disodium Drugs 0.000 description 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 4
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 4
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N N,N-bis{2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl}glycine Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(=O)O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N [CH2]CN(CC)CC Chemical group [CH2]CN(CC)CC MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 3
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 3
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 3
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 3
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 108020001775 protein parts Proteins 0.000 description 3
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 3
- 229940037001 sodium edetate Drugs 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LJRDOKAZOAKLDU-UDXJMMFXSA-N (2s,3s,4r,5r,6r)-5-amino-2-(aminomethyl)-6-[(2r,3s,4r,5s)-5-[(1r,2r,3s,5r,6s)-3,5-diamino-2-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-amino-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-hydroxycyclohexyl]oxy-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl]oxyoxane-3,4-diol;sulfuric ac Chemical compound OS(O)(=O)=O.N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](N)C[C@@H](N)[C@@H]2O)O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)N)O[C@@H]1CO LJRDOKAZOAKLDU-UDXJMMFXSA-N 0.000 description 2
- CHRJZRDFSQHIFI-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.C=CC1=CC=CC=C1C=C CHRJZRDFSQHIFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VILCJCGEZXAXTO-UHFFFAOYSA-N 2,2,2-tetramine Chemical compound NCCNCCNCCN VILCJCGEZXAXTO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N Dodecane Natural products CCCCCCCCCCCC SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QZKRHPLGUJDVAR-UHFFFAOYSA-K EDTA trisodium salt Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC([O-])=O)CC([O-])=O QZKRHPLGUJDVAR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 2
- 101710099093 Growth hormone receptor Proteins 0.000 description 2
- 229940124013 Growth hormone receptor antagonist Drugs 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- UBQYURCVBFRUQT-UHFFFAOYSA-N N-benzoyl-Ferrioxamine B Chemical compound CC(=O)N(O)CCCCCNC(=O)CCC(=O)N(O)CCCCCNC(=O)CCC(=O)N(O)CCCCCN UBQYURCVBFRUQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UEEJHVSXFDXPFK-UHFFFAOYSA-N N-dimethylaminoethanol Chemical compound CN(C)CCO UEEJHVSXFDXPFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004721 Polyphenylene oxide Substances 0.000 description 2
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 2
- IOEJYZSZYUROLN-UHFFFAOYSA-M Sodium diethyldithiocarbamate Chemical compound [Na+].CCN(CC)C([S-])=S IOEJYZSZYUROLN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N acrylic acid group Chemical group C(C=C)(=O)O NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001342 alkaline earth metals Chemical class 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical group 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002585 base Substances 0.000 description 2
- YOUGRGFIHBUKRS-UHFFFAOYSA-N benzyl(trimethyl)azanium Chemical compound C[N+](C)(C)CC1=CC=CC=C1 YOUGRGFIHBUKRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 150000003841 chloride salts Chemical group 0.000 description 2
- 239000012539 chromatography resin Substances 0.000 description 2
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 2
- 229960002887 deanol Drugs 0.000 description 2
- 229960000958 deferoxamine Drugs 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ACYGYJFTZSAZKR-UHFFFAOYSA-J dicalcium;2-[2-[bis(carboxylatomethyl)amino]ethyl-(carboxylatomethyl)amino]acetate Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[O-]C(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC([O-])=O)CC([O-])=O ACYGYJFTZSAZKR-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 2
- 239000012972 dimethylethanolamine Substances 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N dithioerythritol Chemical compound SC[C@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 2
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 125000005395 methacrylic acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 229960001639 penicillamine Drugs 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 2
- 229920000570 polyether Polymers 0.000 description 2
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 2
- GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L sodium sulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])=O GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229940099077 somavert Drugs 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 229960001124 trientine Drugs 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 2
- WFCSWCVEJLETKA-UHFFFAOYSA-N 2-piperazin-1-ylethanol Chemical compound OCCN1CCNCC1 WFCSWCVEJLETKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PBVAJRFEEOIAGW-UHFFFAOYSA-N 3-[bis(2-carboxyethyl)phosphanyl]propanoic acid;hydrochloride Chemical compound Cl.OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PBVAJRFEEOIAGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010000599 Acromegaly Diseases 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PQUCIEFHOVEZAU-UHFFFAOYSA-N Diammonium sulfite Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S([O-])=O PQUCIEFHOVEZAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940103526 Growth hormone receptor agonist Drugs 0.000 description 1
- 229940123486 Hormone receptor agonist Drugs 0.000 description 1
- 229940123502 Hormone receptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N Methylamine Chemical compound NC BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102220587327 NEDD8-activating enzyme E1 catalytic subunit_H21N_mutation Human genes 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 108010002519 Prolactin Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100029000 Prolactin receptor Human genes 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N Sulfurous acid Chemical class OS(O)=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 1
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 1
- HFNVACONKMSOTH-UHFFFAOYSA-K [Na+].[Na+].[Na+].OC(=O)CN(CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O)CCN(CC([O-])=O)CC([O-])=O Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].OC(=O)CN(CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O)CCN(CC([O-])=O)CC([O-])=O HFNVACONKMSOTH-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- GIEAQDPIWWODTH-UHFFFAOYSA-N [Na].[Na].[Na].[Ca] Chemical compound [Na].[Na].[Na].[Ca] GIEAQDPIWWODTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229960005069 calcium Drugs 0.000 description 1
- GBAOBIBJACZTNA-UHFFFAOYSA-L calcium sulfite Chemical compound [Ca+2].[O-]S([O-])=O GBAOBIBJACZTNA-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000004295 calcium sulphite Substances 0.000 description 1
- 235000010261 calcium sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N cysteamine Chemical compound NCCS UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001945 cysteines Chemical group 0.000 description 1
- 108010005905 delta-hGHR Proteins 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003292 diminished effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000003689 hormone receptor blocking agent Substances 0.000 description 1
- 239000000698 hormone receptor stimulating agent Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000013160 medical therapy Methods 0.000 description 1
- 229960003151 mercaptamine Drugs 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229940067082 pentetate Drugs 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- BHZRJJOHZFYXTO-UHFFFAOYSA-L potassium sulfite Chemical compound [K+].[K+].[O-]S([O-])=O BHZRJJOHZFYXTO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000019252 potassium sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 235000010265 sodium sulphite Nutrition 0.000 description 1
- WGRULTCAYDOGQK-UHFFFAOYSA-M sodium;sodium;hydroxide Chemical compound [OH-].[Na].[Na+] WGRULTCAYDOGQK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- ACTRVOBWPAIOHC-XIXRPRMCSA-N succimer Chemical compound OC(=O)[C@@H](S)[C@@H](S)C(O)=O ACTRVOBWPAIOHC-XIXRPRMCSA-N 0.000 description 1
- 229960005346 succimer Drugs 0.000 description 1
- PXQLVRUNWNTZOS-UHFFFAOYSA-N sulfanyl Chemical class [SH] PXQLVRUNWNTZOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-L sulfite Chemical compound [O-]S([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- UEUXEKPTXMALOB-UHFFFAOYSA-J tetrasodium;2-[2-[bis(carboxylatomethyl)amino]ethyl-(carboxylatomethyl)amino]acetate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC([O-])=O)CC([O-])=O UEUXEKPTXMALOB-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 229910052723 transition metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003624 transition metals Chemical class 0.000 description 1
- 229960005066 trisodium edetate Drugs 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/18—Ion-exchange chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/30—Extraction; Separation; Purification by precipitation
- C07K1/32—Extraction; Separation; Purification by precipitation as complexes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Un procedimiento para disminuir un nivel de agregación de un antagonista de hormona del crecimiento (GH) pegilado e isoformas del mismo, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de: (a) proporcionar dicho antagonista de la hormona del crecimiento (GH) pegilado e isoformas del mismo; (b) cargar dicho antagonista de la hormona del crecimiento (GH) pegilado e isoformas del mismo incluyendo cualquier impureza y cualquier agregación del mismo en una resina de intercambio aniónico (AEX), en el que la carga se conduce a una conductividad de menos de o igual a aproximadamente 10 mS/cm, a un pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 y a una concentración de proteína de menos de o igual a aproximadamente 10 g de proteína/l de volumen de lecho cargado de resina de AEX; y (c) separar dicho antagonista de la hormona del crecimiento (GH) pegilada e isoformas del mismo mediante cromatografía de AEX.
Description
Procedimiento para disminuir los niveles de
agregación de proteína pegilada.
\global\parskip0.900000\baselineskip
La presente invención se refiere en general a
procedimientos recombinantes para preparar un polipéptido pegilado
deseado. Este procedimiento o procedimientos producen un producto de
polipéptido pegilado que contiene niveles reducidos de agregación
y/o determinadas impurezas de isoformas de los mismos. En
particular, la presente invención también se refiere a un
procedimiento recombinante para preparar un antagonista de la
hormona del crecimiento (por ejemplo, tal como pegvisomant y su
proteína intermedia) con agregación y/o impurezas de isoformas de
las mismas disminuidas. Más específicamente, las impurezas de
isoformas que se disminuyen mediante los procedimientos de la
presente invención son las impurezas de isoforma trisulfuro y
des-phe del antagonista de la hormona del
crecimiento (o su intermedio). También, la agregación es la
agregación indeseada del antagonista de la hormona del crecimiento
pegilado.
Pegvisomant (Somavert®; Pharmacia Corp.) es un
antagonista del receptor de la hormona del crecimiento humana. Es
un análogo de la hormona del crecimiento humana ("hGH") que se
ha alterado estructuralmente. La secuencia de aminoácidos del
componente proteico/intermedio (B-2036) de
pegvisomant difiere de la secuencia de aminoácidos de hGH en nueve
posiciones. Las sustituciones de aminoácidos específicas son las
siguientes: H18D, H21N, G120K, R167N, K168A, D171S, K172R, B174S e
I179T. Como se reconoce bien en la técnica, la primera letra (es
decir, H18D) representa el aminoácido en la secuencia de hGH en la
posición numerada (es decir, 18^{va} posición de aminoácido
indicada por H18D) que se sustituye con el aminoácido indicado por
la segunda letra (es decir, H18D). Por lo tanto, H18D indica una
sustitución del aminoácido his por el aminoácido asp
en la 18^{va} posición de aminoácido de la secuencia de
aminoácidos de hGH de tipo silvestre.
La Figura 1A muestra esquemáticamente la
estructura de la secuencia de aminoácidos del componente
proteico/intermedio (B-2036) de pegvisomant (PEG
B-2036 o B-2036 PEG) con asteriscos
que indican los sitios potenciales de unión del polímero
polietilenglicol (unidad "PEG"). Adicionalmente, la lista de
secuencias de aminoácidos del componente proteico/intermedio
(B-2036 - sin unión de unidad PEG) de pegvisomant se
identifica en este documento como SEC ID Nº 1. Para comparación, la
lista de secuencias de aminoácidos de la hormona del crecimiento
humana se identifica en este documento como SEC ID Nº 2. Ambas
listas de secuencias se proporcionan juntas en este documento.
Véase también Jorgensen y col., "Quantifying biosynthetic human
growth hormone in Escherichia coli with electrophoresis
under hydrophobic conditions", J. Chromatography A 817:
205-214 (1998) para la secuencia de hGH.
Estructuralmente, pegvisomant es una proteína
(que contiene 191 restos aminoacídicos) a la cual están unidas
covalentemente principalmente de 4 a 6 unidades de PEG. El peso
molecular del componente proteico/intermedio
(B-2036) de pegvisomant es 21.998 Daltons. El peso
molecular de cada unidad de PEG de pegvisomant es aproximadamente
5000 Daltons. Por lo tanto, los pesos moleculares predominantes de
pegvisomant son aproximadamente 42.000 (4 unidades de
PEG/molécula), 47.000 (5 unidades de PEG/molécula) y 52.000 (6
unidades de PEG/molécula) Daltons.
Con referencia al agonista y sin estar limitado
por la teoría, se cree que la hGH endógena activa sus receptores
cuando una molécula única de hGH se une a dos de sus moléculas
receptoras adyacentes (e idénticas), induciendo la homodimerización
de receptor mediada por hormona. Véanse, las Patentes de Estados
Unidos Nº 5.849.535 y 6.057.292. La actividad de hGH depende de su
capacidad de unirse a dos de sus receptores adyacentes (e idénticos)
a través de dos sitios de unión separados (sitio 1 y sitio 2) en la
misma molécula de hGH. Estos sitios de unión de hGH, denominados
sitio 1 y sitio 2, se numeran 1 y 2 para reflejar el orden de su
unión a dos receptores de hGH adyacentes (e idénticos) que median la
homodimerización dependiente de hGH.
Además, sin estar limitado por la teoría, se
cree que pegvisomant se une selectivamente a receptores de la
hormona del crecimiento humana ("receptores de GH") sobre las
superficies celulares, donde el mismo bloquea la unión de la
hormona del crecimiento humana endógena, interfiriendo de ese modo
con la transducción de señal de la hormona del crecimiento humana.
Las modificaciones estructurales a la parte proteica (también
denominada "componente" o "intermedio") de pegvisomant
(con relación a hGH) permiten que pegvisomant bloquee
competitivamente la interacción entre una molécula de hGH y un
receptor de hGH. Pegvisomant se une al receptor de GH, bloqueando
de este modo la unión de GH ya que el receptor está ocupado. Las
modificaciones estructurales evitan la dimerización de receptor y
como resultado no ocurre la transducción de señal. Bloqueando de
este modo la interacción cercana necesaria entre una molécula de
hGH y un receptor de hGH, pegvisomant bloquea la homodimerización
mediada por hGH de los receptores de hGH, lo cual proporciona a
pegvisomant su actividad antagonista.
Este antagonista se usa para tratar afecciones,
que incluyen, pero sin limitación, acromegalia en pacientes que no
responden de forma adecuada a cirugía, terapia de radiación y/u
otras terapias médicas convencionales o que de otra manera no
pueden tolerar estas terapias. Además, las modificaciones
estructurales a la parte proteica (B-2036) de
pegvisomant provocan que el mismo muestre una afinidad de unión por
el receptor de prolactina que es inferior a la de hGH, minimizando
de ese modo los efectos secundarios indeseados relacionados con la
lactancia asociados con el uso de pegvisomant.
\global\parskip1.000000\baselineskip
La parte de intermedio proteico
(B-2036) de pegvisomant se sintetiza mediante una
cepa de bacterias Escherichia coli que se ha modificado
genéticamente mediante la adición de un plásmido que porta un gen
para el antagonista del receptor de la hormona del crecimiento
(B-2036). B-2036 después se recupera
a partir de las células microbianas y se purifica. Después, el
B-2036 purificado se pegila para producir
pegvisomant (PEG B-2036). Las Patentes de Estados
Unidos Nº 5.849.535 y 6.057.292 describen procedimientos para
preparar B-2036 y procedimientos para conjugar una
o más unidades de PEG a B-2036, aunque sin detalles
con referencia a cómo disminuir, reducir, eliminar, invertir y/o
evitar la formación de niveles inaceptablemente altos de las
impurezas de isoformas trisulfuro y des-phe de las
mismas.
Uno de los problemas encontrados usando
procedimientos de preparación recombinantes convencionales para
preparar B-2036 es la formación de sus impurezas de
isoformas, tales como sus isoformas des-phe y
trisulfuro. Otro de los problemas encontrados usando procedimientos
de preparación y purificación convencionales para preparar
B-2036 PEG (es decir, B-2036
pegilado tal como pegvisomant) a partir de B-2036 es
la formación de una "agregación" indeseable de
B-2036 PEG como se analiza adicionalmente más
adelante.
La impureza de isoforma des-phe
es una en la que a la molécula de B-2036 le falta su
fenilalanina amino-terminal. Véase la Figura 1A que
representa el resto de fenilalanina amino-terminal
objeto (es decir, indicado por la letra "F") adyacente al
extremo NH_{2} de B-2036. La impureza de isoforma
trisulfuro es una en la que la molécula de B-2036
contiene un átomo de azufre adicional que forma un "puente
trisulfuro" dentro de la molécula. Véase el recuadro en la
Figura 1B. También, véase Andersson y col, "Isolation and
characterization of a trisulfide variant of recombinant human
growth hormone formed during expression in Escherichia
coli", Int. J. Peptide Protein Res. 47:
311-321 (1996) y A. Jesperson y col.,
"Characterisation of a trisulphide derivative of biosynthetic
human growth hormone produced in Escherichia coli", Eur.
J. Biochem. 219: 365-373 (1994). Sin estar limitado
por la teoría, se cree que estas impurezas de isoforma típicamente
se generan durante el crecimiento (por ejemplo, fermentación) y
expresión (síntesis y secreción) celular de B-2036
en células huésped modificadas genéticamente y/o durante la
extracción y purificación de la proteína de
B-2036.
Con relación al problema con la
"agregación", la formación de tal "agregación" conduce a
una producción disminuida de la proteína deseada y a un coste
aumentado para producir la misma. También, si el nivel de
"agregación" es demasiado alto, la proteína final puede ser de
una pureza tan baja que se vuelva inadecuada para uso
terapéutico.
Con relación a determinadas impurezas, la
Solicitud Internacional WO 94/24157 (publicada el 27 de octubre de
1994) describe un derivado hidrófobo de hGH que comprende un átomo
de azufre adicional en comparación con el hGH nativo. Véase el
documento WO 94/24157 en la página 3, líneas 3-10.
El átomo de azufre adicional del derivado hidrófobo de hGh forma un
"puente trisulfuro" que produce una variante trisulfuro de hGH.
Véase el documento WO 94/2157 en la página 7, líneas
11-16. La referencia WO 94/24157 indica además que
esta variante trisulfuro de hGH se puede convertir de nuevo en su
forma de hGH nativa tratando la variante trisulfuro de hGH con un
compuesto mercapto tal como cisteína, glutatión,
2-mercapto etanol o ditiotreitol. Véase el documento
WO 94/24157 en las páginas
4 y 5.
4 y 5.
La Solicitud Internacional WO 96/02570
(publicada el 1 de febrero de 1996) describe otro procedimiento para
convertir la variante trisulfuro de hGH de nuevo su forma nativa
usando sulfito de sodio, sulfito de potasio, sulfito de amonio o un
sulfito de metal alcalinotérreo tal como sulfato de magnesio o
sulfito de calcio. Véase el documento WO 94/24157 en la página 4,
líneas 17-21.
La Solicitud Internacional WO 00/02900
(publicada el 20 enero de 2000) titulada "Method for the
production of recombinant peptides with a low amount of
trisulfides" analiza "un procedimiento para la reducción de la
cantidad de trisulfuros en la producción de péptidos recombinantes,
por ejemplo, tanto proteínas como péptidos más pequeños". La
invención se basa en el hallazgo novedoso e inesperado de que la
cantidad de trisulfuros en la producción de péptidos recombinantes
se podía reducir mediante la adición de una sal metálica,
preferiblemente en exceso, durante o después de la fermentación y
no, como se ha sugerido anteriormente, mediante la conversión de
los trisulfuros formados de la hormona del crecimiento en la forma
nativa''. Véase el documento WO 00/02900 en la página 2, líneas
21-27. La referencia WO 00/02900 indica además
"[l]a proteína puede ser cualquier proteína recombinante
pero preferiblemente es una hormona del crecimiento recombinante que
puede ser tanto humana como animal tal como hormona del crecimiento
humana (hGH), hormona del crecimiento bovina (bHG) y hormona del
crecimiento 0porcina (pGH)". Véase el documento WO 00/02900 en la
página 3, líneas 4-6.
La Solicitud Internacional Nº WO 02/057478
(publicada el 25 de julio de 2002) titulada "Methods and
Composition For Extracting Proteins From Cells" se refiere a un
procedimiento para liberar una proteína a partir de una célula
huésped poniendo en contacto la célula huésped con un agente
reductor y un detergente. La referencia indica que el propósito del
agente reductor es "facilitar la recuperación de proteínas en sus
conformaciones nativas". Véase el documento WO 02/057478 en la
página 2, líneas 16-18. Adicionalmente, el documento
WO 02/057478 describe que el "uno o más agentes reductores son
agentes...que reducen los enlaces disulfuro y/o mantienen los
restos sulfihidrilo en la(su) forma reducida. Cualquier
agente o agentes reductores de este tipo se pueden usar. En una
realización preferida, el uno o más agentes reductores usados se
seleccionan entre el grupo constituido por ditiotrietol (DTT);
ditioeritritol (DTB); Cisteína (Cys) y Tris
2-carboxietifosfina (TCEP)". Véase el documento
WO 02/057478 de la página 3, línea 24 a la página 4, línea 4.
Para otras referencias con respecto a
purificación, véase la Patente de Estados Unidos 6.265.542 B1
(Fahmer y col. titulada "purification of Molecules"); la
Patente de Estados Unidos Nº 6.333.399 B1 (Blank titulada
"Protein Purification"); la Patente de Estados Unidos Nº
5.747.639 (Seely titulada "Use of Hydrophobic Interaction
Chromatography to Parify Polyethylene Glycols"); Solicitud
Internacional Nº PCT/US96/19459 (Ibrahim y col. titulada
"Activated Linkers and Methods for Making and Purifying the
Same"); y Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 2002/002271
A1 (Rinderknecht y col. titulada "Antibody Purification").
Sin embargo, las referencias indicadas
anteriormente, no se pronuncian con respecto a la prevención,
inversión, reducción o eliminación de formación de impurezas de
isoforma asociadas con un antagonista de la hormona del crecimiento
tal como pegvisomant o su parte proteica, B-2036 y/o
la formación de agregación de proteína pegilada, por ejemplo,
pegvisomant. Por consiguiente, existe una necesidad de
procedimientos mejorados para preparar B-2036 que
disminuya, atenúe, evite, minimice, invierta y/o elimine la
formación de sus impurezas de isoformas (trisulfuro y/o
des-phe) y/o la formación de agregación de proteína
pegilada. Análogamente, estas referencias tampoco se pronuncian con
respecto a la detección, atenuación, minimización, inversión,
reducción o eliminación de la formación, de la impureza de isoforma
des-phe de la hormona del crecimiento y/o la
formación de agregación de proteína pegilada, por ejemplo, hormona
del crecimiento pegilada u hormona del crecimiento humana
pegilada.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 1A representa la secuencia de
aminoácidos de B-2036 que corresponde a la SEC ID Nº
1. Los asteriscos (*) en la Figura 1A indican nueve (9) sitios
potenciales para unión covalente de unidades de PEG a cada molécula
de B-2036. Obsérvese que se identifican nueve (9)
sitios posibles blancos, no todos los 9 sitios se tienen que unir
covalentemente a unidades de PEG. Preferiblemente, existen
4-6 unidades de PEG por molécula de
B-2036.
La Figura 1B representa la estructura de la
impureza de isoforma trisulfuro de B-2036
(denominada "Trisulfuro (+32 amu")) en comparación con su forma
deseable (denominada "GHA Nativa").
La Figura 2 es una comparación gráfica de los
porcentajes de especies de B-2036 PEG 4 encontradas
dentro de las fracciones 7 a 18 de Q-Sefarosa FF
determinados por electroforesis capilar y HPLC de fase inversa.
La Figura 3 es una comparación gráfica de los
porcentajes de especies de B-2036 PEG 5 encontradas
dentro de las fracciones 7 a 18 de Q-Sefarosa FF
determinados por electroforesis capilar y HPLC de fase inversa.
La Figura 4 es una comparación gráfica de los
porcentajes de especies de B-2036 PEG 6 encontradas
dentro de las fracciones 7 a 18 de Q-Sefarosa FF
determinados por electroforesis capilar y HPLC de fase inversa.
\vskip1.000000\baselineskip
Considerando la necesidad anterior de
proporcionar un procedimiento mejorado para preparar un antagonista
de la hormona del crecimiento polipeptídico pegilado recombinante
y/o un antagonista de la hormona del crecimiento humana
polipeptídico pegilado recombinante, con niveles disminuidos de
agregación indeseable y/o impurezas de isoforma de las mismas, la
presente invención se refiere a procedimientos mejorados para
producir antagonistas de la hormona del crecimiento polipeptídicos
pegilados recombinantes (incluyendo, pero sin limitación,
antagonistas de la hormona del crecimiento humana) con
niveles disminuidos de su agregación, impurezas de isoforma
des-phe y/o trisulfuro.
Con respecto al antagonista de la Hormona del
crecimiento recombinante (incluyendo, antagonista de la hormona del
crecimiento humana), su impureza de isoforma trisulfuro se
disminuye mediante contacto suficiente entre la impureza de
isoforma trisulfuro y (1) un compuesto mercapto, (2) un
agente quelante, (3) una sal metálica, (4) un compuesto mercapto
junto con una sal metálica o (5) un compuesto mercapto después del
contacto con un agente quelante pero en ausencia del agente
quelante, respectivamente.
Con respecto al antagonista de la hormona del
crecimiento recombinante (incluyendo, antagonista de la hormona del
crecimiento humana), la formación de su impureza de isoforma
des-phe se disminuye mediante la adición de
(1) un agente quelante o (2) una sal metálica, respectivamente.
Con respecto a un antagonista de la hormona del
crecimiento pegilado recombinante y/o antagonista de la hormona del
crecimiento humana pegilado, el nivel de agregación se mantiene o se
disminuye en o por debajo de un nivel deseado mediante cromatografía
de intercambio aniónico durante la separación de las isoformas
pegiladas de los mismos.
\newpage
En esta solicitud se usan las siguientes
abreviaturas.
- AC
- cromatografía de afinidad
- AEX
- intercambio aniónico
- API
- ingrediente farmacéutico activo
- BI
- intermedio voluminoso; B-2036 (sin pegilación)
- B-2036 PEG
- B-2036 pegilado
- PEG B-2036
- B-2036 pegilado
- CE
- electroforesis capilar
- CEX
- intercambio catiónico
- cm
- centímetro
- CV
- volumen de columna
- DEAE
- dietilaminoetilo
- HEPES
- ácido N-(2-hidroxietil) piperazina N-(2-etano) sulfónico
- HIC
- cromatografía de interacción hidrófoba
- IEX
- intercambio iónico
- kDa
- kiloDaltons
- l
- litros
- LPM
- litros por minuto
- ml o ml
- mililitro
- mM
- miliMolar
- mS
- miliSiemen
- MWCO
- peso molecular de corte
- \mum
- micrómetro
- N
- Normalidad
- NaCl
- cloruro de sodio
- NaOH
- hidróxido de sodio
- NWP
- permeabilidad de agua normalizada
- PEG
- molécula de polietilenglicol o variante de la misma
- PEG-1
- una molécula de B-2036 pegilado con 1 molécula de PEG o variante del mismo
- PEG-2
- una molécula de B-2036 pegilado con 2 moléculas de PEG o variante del mismo
- PEG-3
- una molécula de B-2036 pegilado con 3 moléculas de PEG o variante del mismo
- Peg
- una molécula de B-2036 pegilado con 4 moléculas de PEG o variante del mismo
- PEG-5
- una molécula de B-2036 pegilado con 5 moléculas de PEG o variante del mismo
- PEG-6
- una molécula de B-2036 pegilado con 6 moléculas de PEG o variante del mismo
- PEG-7
- una molécula de B-2036 pegilado con 7 moléculas de PEG o variante del mismo
- PEG-8
- una molécula de B-2036 pegilado con 8 moléculas de PEG o variante del mismo
- PEG-9
- una molécula de B-2036 pegilado con 9 moléculas de PEG o variante del mismo
- RPHPLC
- cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa
- DT
- desviación típica
- SDS-PAGE
- electroforesis en gel de dodecilsulfato sódico poliacrilamida
- SEHPLC
- cromatografía líquida de alto rendimiento de exclusión por tamaño
- TMP
- rendimiento transmembrana
- TRIS
- tris-(2-hidroximetil) aminometano
- UF/DF
- ultrafiltración/diafiltración
- UV
- ultravioleta
- WFI
- agua para inyección
\vskip1.000000\baselineskip
La expresión "proteína pegilada" incluye
una hormona, hormona del crecimiento, hormona del crecimiento
humana, antagonista de la hormona del crecimiento, antagonista de
la hormona del crecimiento humana, un anticuerpo (o fragmentos del
mismo) y B-2036 PEG. "Proteína pegilada"
también incluye una o más proteínas de interés pegiladas en uno o
más sitios.
A menos que se indique de otra manera, el
término "agregación" se refiere a un grupo similar a espagueti
de una o más proteínas de interés, pegiladas o no pegiladas. Una
"agregación" es una multiplicidad de moléculas de proteína que
se han agrupado a través de una integración estérica o de otra
manera la una con la otra. Los ejemplos de "agregación"
incluyen enmarañamiento entre (1) una multiplicidad de moléculas de
proteína pegilada, (2) una multiplicidad de moléculas de proteína
no pegilada y/o (3) al menos una molécula de proteína pegilada y al
menos una molécula de proteína no pegilada.
A menos que se indique de otra manera,
"impureza de proteína no pegilada" incluye, proteínas no
pegiladas, es decir, proteínas sin una molécula de PEG unida o
variante de la misma.
A menos que se indique de otra manera,
"proporción en peso estequiométrica" se refiere a la cantidad
de moléculas de PEG libres a la cantidad de moléculas de proteína
no pegilada de interés.
A menos que se indique de otra manera, la
expresión "isoforma o isoformas de proteína pegilada" se
refiere a una proteína de interés que tiene uno o más restos de PEG
unidos a la misma, preferiblemente mediante unión covalente. Por
ejemplo, el término "PEG-1" se refiere a
B-2036 que tiene una molécula de PEG unida al mismo,
preferiblemente en una posición tal como un resto de aminoácido
lisina y/o el extremo amino. Análogamente, PEG-2,
PEG-3, PEG-4, PEG-5,
PEG-6, PEG-7, PEG-8
y PEG-9 se refieren al número de moléculas de PEG
unidas a una molécula de B-2036. Por tanto,
PEG-2 se refiere a un B-2036 que
tiene dos moléculas de PEG unidas al mismo y PEG-3
se refiere a tres moléculas de PEG unidas a una molécula de
B-2036 y así sucesivamente.
A menos que se indique de otra manera, la
expresión "volumen de lecho cargado" se refiere a un volumen de
lecho cargado de una resina particular cargada de acuerdo con las
condiciones de funcionamiento sugeridas por el fabricante.
A menos que se indique de otra manera, la
expresión "impureza de isoforma" se refiere a al menos a la
impureza de isoforma trisulfuro o la impureza de isoforma
des-phe descritas en este documento. La expresión
"impureza de isoforma" también puede incluir otras impurezas
reconocidas en la técnica.
La expresión "conductividad de conjunto de
CE" se refiere a la medición de conductividad de la fracción de
CV recogida que se está sometiendo a CE.
Las expresiones "antagonista de la hormona del
crecimiento" y "antagonista del receptor de la hormona del
crecimiento" incluyen polipéptidos pegilados y polipéptidos que
inhiben o, de otra manera, antagonizan la unión de la hormona del
crecimiento a su receptor de la hormona del crecimiento para
bloquear el efecto o los efectos biológicos de la hormona del
crecimiento. Preferiblemente, el "antagonista de la hormona del
crecimiento" pegilado o "el antagonista del receptor de la
hormona del crecimiento" pegilado es B-2036
pegilado, B-2036 o una variante de los mismos.
"Variantes" incluye homólogos (particularmente homólogos con
sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácidos conservativas
con relación a B-2036), análogos, fragmentos, etc.
de los mismos (respectivamente) que tienen actividad antagonista del
receptor de la hormona del crecimiento.
Las expresiones "agonista de la hormona del
crecimiento" y "agonista del receptor de la hormona del
crecimiento" incluyen polipéptidos pegilados y polipéptidos que
se unen y activan a su receptor de la hormona del crecimiento.
Preferiblemente, el "agonista de la hormona del crecimiento" o
el "agonista del receptor de la hormona del crecimiento" es
hormona del crecimiento humana pegilada, hormona del crecimiento
humana o una variante de las mismas. "Variantes" incluye
homólogos (particularmente homólogos con sustituciones, adiciones o
supresiones de aminoácidos conservativas con relación a la hormona
del crecimiento humana), análogos, fragmentos, pseudopéptidos,
anticuerpos, etc. (respectivamente) que tienen actividad agonista
del receptor de la hormona del crecimiento.
El término "y" puede significar "y" u
"o" según sea apropiado o necesario para describir un
procedimiento para producir la disminución deseada en el nivel de la
impureza pertinente (por ejemplo, impureza de isoforma y/o
agregación trisulfuro o des-phe).
El término "o" puede significar "y" u
"o" según sea apropiado o necesario para describir un
procedimiento para producir la disminución deseada en el nivel de la
impureza pertinente (por ejemplo, impureza de isoforma y/o
agregación trisulfuro o des-phe).
Como se usa en este documento, a menos que se
indique de otra manera, el término "disminución" (o variaciones
evidentes de la misma) se refiere a mantener, eliminar, minimizar,
reducir, evitar, invertir y/o atenuar la cantidad del nivel de
"agregación" de la proteína pegilada de interés y/o de la
impureza de isoforma pertinente, bien sea la impureza de isoforma
trisulfuro o la impureza de isoforma des-phe.
A menos que se indique de otra manera, la
expresión "célula huésped" (o variaciones evidentes de la
misma) se refiere a cualquier célula huésped en la que se puede
formar B-2036 recombinante o hGH recombinante. Por
consiguiente, la célula huésped puede ser una célula huésped de
mamífero, una célula de huésped vegetal o una célula huésped
microbiana tal como E. coli o incluso células de levadura. Es
importante indicar que la célula huésped es una que sea suficiente
para desarrollar el componente proteico de B-2036
recombinante o hGH recombinante deseados en la misma. Como tal, no
existe limitación con respecto a cuál puede ser la célula huésped
excepto que sea una capaz de producir de forma recombinante el
componente proteico de B-2036 o hGH recombinante de
interés o "variantes" de los mismos.
Adicionalmente, como se usa en este documento, a
menos que se indique de otra manera, el término "crecer" (o
variaciones evidentes del mismo, por ejemplo, crecimiento) incluye,
fermentar y cultivar o de otra manera provocar que la célula o las
células huésped proliferen de forma suficiente para producir
cantidades deseadas del componente proteico de
B-2036 recombinante o hGH recombinante.
Además, aunque la presente invención se describe
con respecto a B-2036 recombinante y
B-2036 PEG recombinante, a menos que se indique de
otra manera, se aprecia que la invención objeto se puede usar con
cualquier antagonista de la hormona del crecimiento recombinante,
ya sea antagonista de la hormona del crecimiento de mamífero,
antagonista de la hormona del crecimiento humana o antagonista de la
hormona del crecimiento bovina, etc.
Pegvisomant (denominado en este documento PEG
B-2036 o B-2036 PEG) es la forma
pegilada de proteína recombinante (B-2036)
producida en células huésped recombinantes (por ejemplo, células
huésped de E. coli recombinantes modificadas genéticamente).
La proteína de B-2036 se produce durante el
crecimiento (por ejemplo, mediante fermentación) y expresión
(síntesis y secreción) celular. Después de su producción,
B-2036 se aísla (por ejemplo, mediante
homogenización) seguido por purificación (por ejemplo, mediante
extracción, centrifugación, cromatografía de fase inversa e
intercambio aniónico e intercambio de tampón). Sin embargo, como se
ha observado durante la producción recombinante de la proteína de
B-2036, se forman impurezas de isoforma de
B-2036 indeseables, las cuales son las impurezas de
isoforma trisulfuro y des-phe de
B-2036.
Como se observa, la Figura 1A ilustra la
secuencia de aminoácidos de B-2036 con las
abreviaturas de 1 letra convencionales que indican qué aminoácidos
están presentes en qué posición de cada letra. Para referencia,
véase la Tabla 1 más adelante que indica la correspondencia entre la
letra y su aminoácido asociado.
Adicionalmente, la secuencia de aminoácidos de
B-2036 se proporciona en este documento como SEC ID
Nº 1 y la secuencia de aminoácidos de hGH se proporciona en este
documento como SEC ID Nº 2.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 1B ilustra la estructura de la
secuencia de aminoácidos de la impureza de isoforma trisulfuro de
B-2036. En particular, la impureza de isoforma
trisulfuro contiene un átomo de azufre adicional en el puente entre
las cisteínas en las posiciones 182 y 189 del componente proteico de
B-2036.
\vskip1.000000\baselineskip
Sin estar limitado por la teoría, se cree que el
contacto entre compuesto o compuestos mercapto seleccionados y la
impureza de isoforma trisulfuro del antagonista de la hormona del
crecimiento recombinante B-2036 da como resultado
la conversión del puente trisulfuro
cisteína-S-S-S-cisteína
de nuevo en su forma nativa
cisteína-S-S-cisteína.
Adicionalmente, también sin estar limitado por la teoría, es
posible que la presencia del compuesto o los compuestos mercapto
evite la formación adicional del mismo puente trisulfuro.
Típicamente, el compuesto o los compuestos
mercapto se añaden a la célula o las células huésped sintetizando
el componente proteico de B-2036 recombinante
deseado durante o después (o durante y después) del
crecimiento de la célula o células huésped. Además, después de que
se han conducido las etapas de crecimiento y contacto, es
preferible purificar la proteína de B-2036. A partir
de entonces, la proteína purificada preferiblemente se pegila para
producir PEG B-2036 (pegvisomant). Para
procedimientos de pegilación véase la Patente de Estados Unidos Nº
5.849.535 y la Patente de Estados Unidos Nº 5.672.662.
Se puede usar cualquier compuesto mercapto en
relación con la presente invención que, cuando se ponga en contacto
(preferiblemente con mezcla adecuada) con el componente proteico de
B-2036 junto con su impureza de isoforma
trisulfuro, sea uno que sea suficiente para disminuir el nivel de la
impureza de isoforma trisulfuro, (preferiblemente sin degradar (o
degradar sustancialmente) la producción de B-2036).
Los compuestos mercapto preferidos adecuados para uso con la
presente invención incluyen sulfitos, glutatión,
beta-mercaptoetanol, ditiotreitol,
mercaptoetilamina, ditioeritriol, clorhidrato de
tris(2-carboxietil)fosfina, cisteína y
cisteína en combinación con cistina.
Otros compuestos mercapto adecuados para uso con
la presente invención se indican en las siguientes referencias: (1)
J. Houk y G. M. Whitesides, "Structure-Reactivity
Relations for Thiol-Disulfide Interchange", J. M.
Chem. Soc, 109: 6825-6836 (1987); (2) Sigmund, M.,
The Chemistry & Biochemistry of the Sulfhydro Group in Amino
Acids, Peptides and Proteins, 1ª Ed. Pergamon, Nueva York (1973).
En particular, véase la Tabla II de Houk y col. identificada en el
artículo (1) anteriormente para una lista de compuestos mercapto
ejemplares adecuados para uso con la presente invención.
De los compuestos mercapto adecuados, cisteína o
cisteína en combinación con cistina (cisteína dimerizada), es la
más preferida. La cantidad de cisteína o combinación de cisteína y
cistina (cisteína dimerizada, si existe alguna) que es adecuada
para uso con la presente invención debe ser esa cantidad que sea
suficiente para disminuir la impureza de isoforma trisulfuro en al
menos aproximadamente el 10% de su concentración de equilibrio más
alta (o su concentración de equilibrio promedio más alta, cuando se
promedian múltiples lotes) formada. Preferiblemente, la disminución
en la cantidad de la impureza de isoforma trisulfuro es al menos
aproximadamente el 20%, el 30%, el 40% o el 50% respectivamente, de
su concentración de equilibrio más alta (o su concentración de
equilibrio promedio más alta) formada. La concentración combinada
inicial de cisteína y cualquier cistina adecuada para uso con la
presente invención preferiblemente es al menos aproximadamente 0,1
mM, de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 10 mM o de
aproximadamente 1 mM a aproximadamente 5 mM, respectivamente.
Es preferible proporcionar el compuesto mercapto
en un tampón. Preferiblemente, el tampón es uno que es adecuado
para uso con la presente invención, es decir, que no evita la
formación del componente proteico de B-2036 o lo
degrada una vez que se ha formado. Los tampones adecuados para uso
en relación con la presente invención incluyen, pero sin
limitación, Tris, fosfato, HEPES, ácido cítrico, trietilamina e
histidina. El tampón preferido es Tris. La concentración de tampón
inicial preferida es de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 200
mM, más preferiblemente de aproximadamente 5 mM a aproximadamente
100 mM, incluso más preferiblemente de aproximadamente 8 mM a
aproximadamente 70 mM y lo más preferible es que sea de
aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM. Se pueden usar otros
tampones adecuados. Preferiblemente, estos tampones son suficientes
para mantener el pH del medio de cultivo en el intervalo de
aproximadamente 4 a aproximadamente 9, de aproximadamente 7,5 a
aproximadamente 8,5 o de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,0,
respectivamente. En particular, cuando se usan concentraciones
altas de compuesto mercapto, se pueden tolerar niveles de pH más
altos, por ejemplo, tan altos como aproximadamente 9,5. Por tanto,
por ejemplo, si se usa un exceso grande de cisteína a
B-2036, entonces el pH del tampón puede ser tan alto
como aproximadamente 9,5.
Como se ha indicado anteriormente, es preferible
proporcionar el compuesto mercapto en un tampón. Adicionalmente, la
cantidad del compuesto mercapto en el tampón debe ser tal que la
proporción molar de los moles de compuesto mercapto a los moles de
proteína de B-2036 sea de aproximadamente 0,5 a
aproximadamente 1.000. Esto es especialmente cierto cuando el
compuesto mercapto que se está usando es una combinación de cisteína
y, opcionalmente, cisteína en combinación con cistina. Como
alternativa, la proporción molar de los moles de compuesto mercapto
a los moles de proteína de B-2036 puede ser de
aproximadamente 1 a aproximadamente 1.000, de aproximadamente 1 a
aproximadamente 500 o de aproximadamente 1 a aproximadamente 10,
respectivamente.
Típicamente, después del contacto suficiente
(para disminuir el nivel de impureza de isoforma trisulfuro) entre
el compuesto mercapto y el componente proteico de
B-2036 (dentro o partir de la célula o células
huésped) se ha completado, el componente proteico de
B-2036 en el tampón tiene una concentración de
aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml, de
aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml o de
aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml,
respectivamente.
Además, el intervalo de temperatura del medio de
cultivo junto con el tampón, el compuesto o los compuestos mercapto
y sus otros contenidos incluyendo, pero sin limitación,
B-2036, se debe mantener a una temperatura
preferiblemente de aproximadamente 0ºC a aproximadamente 25ºC
después de que el compuesto mercapto se ha añadido a la célula o
células huésped o lisado de las mismas que contiene el componente
proteico de B-2036. También, preferiblemente, la
temperatura de la célula o células huésped y/o el lisado a partir de
las mismas que contiene el componente de B-2036 se
mantiene de aproximadamente 1ºC a aproximadamente 15ºC, de
aproximadamente 2ºC a aproximadamente 10ºC o de aproximadamente 2ºC
a aproximadamente 8ºC, respectivamente. Es importante observar que
la desnaturalización de la proteína de B-2036 ocurre
a aproximadamente 40+ºC. Como tal, es deseable mantener la
temperatura del homogenado (es decir, que contiene células huésped,
medio de cultivo, tampón, compuestos mercapto y
B-2036, etc.) en una temperatura inferior a la
temperatura de desnaturalización de la proteína
de B-2036.
de B-2036.
Adicionalmente, el tiempo de contacto entre el
componente de B-2036 y el compuesto mercapto debe
ser durante un tipo suficiente para disminuir el nivel de la
impureza de isoforma trisulfuro. Los tiempos de contacto adecuados
ejemplares para disminuir el nivel de la impureza de isoforma
trisulfuro deben ser durante al menos aproximadamente 30 minutos,
de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 24 horas o de
aproximadamente 1 hora a aproximadamente 4 horas,
respectivamente.
Típicamente, después del contacto suficiente
entre el compuesto o los compuestos mercapto y el componente de
B-2036, el tampón que contiene el mismo tiene un
volumen de aproximadamente 1 litro a aproximadamente 5.000 litros,
de aproximadamente 10 litros a aproximadamente 500 litros o de
aproximadamente 100 litros a aproximadamente 300 litros,
respectivamente. Otros volúmenes ejemplares adecuados pueden ser
cualquiera de 160 litros a aproximadamente 500 litros.
Otros parámetros que pueden ser de interés
durante el contacto entre el compuesto o los compuestos mercapto y
el componente de B-2036 incluyen cosas tales como la
velocidad de la mezcla. La velocidad de la mezcla debe ser aquella
que sea suficiente para formar una mezcla homogénea (de la célula o
células huésped, lisado de las mismas, tampón, compuesto o
compuestos mercapto, el componente de B-2036 y
cualquier otro componente en un medio de cultivo) a la vez que
minimiza la cantidad de espuma que se puede formar. Los
especialistas en la técnica pueden determinar fácilmente cuál debe
ser una velocidad de mezcla suficiente. Obviamente, la velocidad de
mezcla debe ser tal que la temperatura se mantenga en los intervalos
indicados anteriormente y se minimice cualquier degradación del
componente proteico de B-2036.
\vskip1.000000\baselineskip
Sin estar limitado por la teoría, se cree que el
contacto entre agente o agentes quelantes seleccionados y (1) la
impureza de isoforma trisulfuro, (2) el antagonista de la hormona
del crecimiento recombinante B-2036, (3) componente
o componentes celulares de células huésped (para producción
recombinante del antagonista) y (4) todas las combinaciones de
(1)-(3) da como resultado la conversión del puente trisulfuro de
cisteína-S-S-S-cisteína
de nuevo en su forma nativa de
cisteína-S-S-cisteína
o la disminución de los niveles de la impureza. Adicionalmente,
también sin estar limitado por la teoría, es posible que la
presencia del agente o agentes quelantes evite la formación
adicional del mismo puente trisulfuro.
Típicamente, el agente o los agentes quelantes
se añaden a la célula o células huésped que sintetizan el componente
proteico de B-2036 recombinante deseado durante o
después (o durante y después) del cultivo de la célula o células
huésped. Además, después de que se han conducido las etapas de
cultivo y contacto, es preferible purificar la proteína de
B-2036. A partir de entonces, la proteína purificada
preferiblemente se pegila para producir PEG B-2036
(pegvisomant). Para procedimientos de pegilación véase la Patente de
Estados Unidos Nº 5.849.535.
Se puede usar cualquier agente quelante en
relación con la presente invención que, cuando se ponga en contacto
(preferiblemente con mezcla adecuada) con el componente proteico de
B-2036 junto con su impureza de isoforma
trisulfuro, sea uno que sea suficiente para disminuir el nivel de la
impureza de isoforma trisulfuro, preferiblemente sin degradar (o
degradar sustancialmente) la producción de B-2036.
Los agentes quelantes preferidos adecuados para uso con la presente
invención incluyen, pero sin limitación, EDTA, EGTA y DTPA. Los
agentes quelantes ejemplares adicionales incluyen, pero sin
limitación, Deferoxamina, Ditiocarb Sódico, Edetato de Calcio
Disódico, Edetato Disódico, Edetato Sódico, Edetato Trisódico,
Penicilamina, Pentetato de Calcio Trisódico, Ácido Pentético,
Succímero y Trientina. Se ha de observar que el Edetato Sódico es la
forma de sal de EDTA.
Otros agentes quelantes adecuados para uso con
la presente invención se indican en las siguientes referencias: (1)
The Merck Index, 12ª Edición, S. Budavari (Editor), Merck & Co.,
Inc., Therapeutic Category and Biological Activity Index, pág.
THER-19 (bajo "CHELATING AGENT"), Whitehouse
Station, NJ (1996) y todas y cada una de las ediciones posteriores
a la fecha de la misma; (2) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª
Ed., Arthur Osol (Editor), Mack Publishing Co., Easton,
Pennsylvania (1980) y todas y cada una de las ediciones posteriores
a la fecha de la misma; (3) "The United States Pharmacopeia,
Revisión 21" (16ª Edición), United States Pharmacopeial
Convention, Inc., Rockville, Maryland (1985) y todas y cada una de
las ediciones posteriores a la fecha de la misma; (4) SIGMA,
Biochemicals and Reagents for Life Science Research Catalogue, St.
Louis, Missouri (2002-2003); y (5) Aldrich,
Handbook of Fine Chemicals and Laboratory Equipment, Milwaukee,
Wisconsin ediciones (2000-2001) y
(2002-2003) de la misma.
De los agentes quelantes adecuados, EDTA es el
más preferido. La cantidad de agente quelante que es adecuada para
uso con la presente invención debe ser esa cantidad que sea
suficiente para disminuir la impureza de isoforma trisulfuro en al
menos aproximadamente el 10% de su concentración de equilibrio más
alta (o su concentración de equilibrio promedio más alta, cuando se
promedian múltiples lotes) formada. Preferiblemente, la disminución
en la cantidad de la impureza de isoforma trisulfuro es al menos
aproximadamente el 20%, el 30%, el 40% o el 50% respectivamente, de
su concentración de equilibrio más alta (o su concentración de
equilibrio promedio más alta) formada. La concentración inicial de
EDTA adecuada para uso con la presente invención preferiblemente es
al menos aproximadamente 0,01 mM, de aproximadamente 0,01 mM a
aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente
20 mM, de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 10 mM o de
aproximadamente 2 a aproximadamente 5 mM, respectivamente.
Se prefiere proporcionar el agente quelante en
un tampón. Preferiblemente, el tampón es uno que sea adecuado para
uso con la presente invención, es decir, que no evite la formación
del componente proteico de B-2036 o lo degrade una
vez que se ha formado. Los tampones adecuados para uso en relación
con la presente invención incluyen, Tris, fosfato, HEPES, ácido
cítrico, trietilamina e histidina. El tampón preferido es Tris. La
concentración de tampón inicial preferida es de aproximadamente 1
mM a aproximadamente 200 mM, más preferiblemente de aproximadamente
5 mM a aproximadamente 100 mM, aún más preferiblemente de
aproximadamente 8 mM a aproximadamente 70 mM y lo más preferible es
que sea de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM. Se pueden
usar otros tampones adecuados. Preferiblemente, estos tampones son
suficientes para mantener el pH del medio de cultivo en el
intervalo de aproximadamente 6 a aproximadamente 9, de
aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,5 o de aproximadamente 7,2 a
aproximadamente 7,5, respectivamente.
Como se ha indicado anteriormente, se prefiere
proporcionar el agente quelante en un tampón. Además, la cantidad
del agente quelante en el tampón debe ser tal que la proporción
molar de los moles de agente quelante a los moles de proteína de
B-2036 sea de aproximadamente 1 a aproximadamente
1.000. Como alternativa, la proporción molar de los moles de agente
quelante a los moles de proteína de B-2036 puede ser
de aproximadamente 20 a aproximadamente 1.000, de aproximadamente
50 a aproximadamente 250 o de aproximadamente 60 a aproximadamente
110, respectivamente.
Típicamente, después del contacto suficiente
(para disminuir el nivel de la impureza de isoforma trisulfuro)
entre el agente quelante y el componente proteico de
B-2036 (dentro o a partir de la célula o células
huésped se ha completado), el componente proteico de
B-2036 en el tampón tiene una concentración de
aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml, de
aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml o de
aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml,
respectivamente.
Además, el intervalo de temperatura del medio de
cultivo junto con el tampón, el agente o los agentes quelantes y
sus otros contenidos incluyendo, pero sin limitación,
B-2036, se debe mantener a una temperatura
preferiblemente de aproximadamente 0ºC a aproximadamente 35ºC
después de que el agente quelante se ha añadido a la célula o
células huésped o el lisado de las mismas que contiene el componente
proteico de B-2036. También, preferiblemente, la
temperatura de la célula o células huésped y/o el lisado a partir de
las mismas que contiene el componente de B-2036 se
mantiene de aproximadamente 1ºC a aproximadamente 15ºC, de
aproximadamente 2ºC a aproximadamente 10ºC o de aproximadamente 2ºC
a aproximadamente 15ºC, respectivamente. Se observa que,
preferiblemente, tras la adición del agente quelante (por ejemplo,
EDTA), cuya temperatura es de aproximadamente 4ºC, la temperatura
del homogenado que contiene el B-2036 aumenta hasta
aproximadamente 30ºC tras la homogeneización. Es importante
observar que la desnaturalización de la proteína de
B-2036 ocurre a aproximadamente 40ºC. Como tal, es
deseable mantener la temperatura del homogenado (es decir, que
contiene células huésped, medio de cultivo, tampón, agentes
quelantes y B-2036, etc.) en una temperatura
inferior a la temperatura de desnaturalización de la proteína
de B-2036.
de B-2036.
Adicionalmente, el tiempo de contacto entre el
componente de B-2036 y el agente quelante debe ser
durante un tiempo suficiente para disminuir el nivel de la impureza
de isoforma trisulfuro. Los tiempos de contacto adecuados
ejemplares para disminuir el nivel de impureza de isoforma
trisulfuro deben ser de al menos aproximadamente 30 minutos, desde
aproximadamente 1 hora hasta aproximadamente 48 horas o desde
aproximadamente 5 horas hasta aproximadamente 15 horas,
respectivamente.
Típicamente, después del contacto suficiente
entre el agente o los agentes quelantes y el componente de
B-2036, el tampón que contiene el mismo tiene un
volumen de aproximadamente 1 litro a aproximadamente 5.000 litros,
de aproximadamente 10 litros a aproximadamente 500 litros o de
aproximadamente 100 litros a aproximadamente 300 litros,
respectivamente. Otros volúmenes ejemplares adecuados pueden ser de
160 litros a aproximadamente
500 litros.
500 litros.
Otros parámetros que pueden ser de interés
durante el contacto entre el agente o los agentes quelantes y el
componente de B-2036 incluyen cosas tales como la
velocidad de mezcla. La velocidad de mezcla debe ser aquella que
sea suficiente para formar una mezcla homogénea (de la célula o
células huésped, el lisado de las mismas, tampón, agente o agentes
quelantes, el componente de B-2036 y cualquier otro
componente en el medio de cultivo) mientras minimiza la cantidad de
espuma que se puede formar. Los especialistas en la técnica pueden
determinar fácilmente cuál debe ser una velocidad de mezcla
suficiente. Obviamente, la velocidad de mezcla debe ser tal que la
temperatura se mantenga en los intervalos indicados anteriormente y
se minimice cualquier degradación del componente proteico
de B-2036.
de B-2036.
\vskip1.000000\baselineskip
Sin estar limitado por la teoría, se cree que el
contacto entre la sal o sales metálicas seleccionadas y (1) la
impureza de isoforma trisulfuro, (2) el antagonista de la hormona
del crecimiento recombinante B-2036, (3) componente
o componentes celulares de células huésped (para producción
recombinante del antagonista) y (4) todas las combinaciones de (1)
- (3) da como resultado la conversión del puente trisulfuro
cisteína-S-S-S-cisteína
de nuevo en su forma nativa
cisteína-S-S-cisteína
o la disminución de los niveles de la impureza. Adicionalmente,
también sin estar limitado por la teoría, es posible que la
presencia de la sal o sales metálicas evite la formación adicional
del mismo puente trisulfuro.
\newpage
Típicamente, se añade la sal o las sales
metálicas a la célula o células huésped que sintetizan el componente
proteico de B-2036 recombinante deseado durante
o después (o durante y después) el cultivo de la
célula o células huésped. Además, después de que se han conducido
las etapas de cultivo y contacto, es preferible purificar la
proteína de B-2036. A partir de entonces, la
proteína purificada preferiblemente se pegila para producir PEG
B-2036 (pegvisomant). Para procedimientos de
pegilación véase la Patente de Estados Unidos Nº 5.849.535.
Se puede usar cualquier sal metálica en relación
con la presente invención que, cuando se ponga en contacto
(preferiblemente con mezcla adecuada) con el componente proteico de
B-2036 junto con su impureza de isoforma
trisulfuro, sea una que sea suficiente para disminuir el nivel de la
impureza de isoforma trisulfuro, preferiblemente sin degradar (o
degradar sustancialmente) la producción de B-2036.
La sal o sales metálicas adecuadas para uso con la presente
invención incluyen, pero sin limitación, sal o sales de metales
alcalinos, sal o sales de metales alcalino-térreos,
sal o sales de metales de transición y combinaciones de los mismos.
Las sales metálicas preferidas adecuadas para uso con la presente
invención incluyen, pero sin limitación, fosfato potásico, acetato
potásico, fosfato sódico, acetato sódico, cloruro de cinc y
combinaciones de los mismos.
Otras sales metálicas adecuadas se indican en
las siguientes referencias: (1) The Merck Index, 12ª Edición, S.
Budavari (Editor), Merck & Co., Inc., Therapeutic Category and
Biological Activity Index, pág. THER-19 (bajo
"CHELATING AGENT"), Whitehouse Station, NJ (1996) y todas y
cada una de las ediciones posteriores a la fecha de la misma; (2)
Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª Ed., Arthur Osol (Editor),
Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania (1980) y todas y cada una
de las ediciones posteriores a la fecha de la misma; (3) "The
United States Pharmacopeia, Revisión 21" (16ª Edición), United
States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, Maryland (1985) y
todas y cada una de las ediciones posteriores a la fecha de la
misma; (4) SIGMA, Biochemicals and Reagents for Life Science
Research Catalogue, St. Louis, Missouri (2002-2003);
y (5) Aldrich, Handbook of Fine Chemicals and Laboratory Equipment,
Milwaukee, Wisconsin ediciones (2000-2001) y
(2002-2003) de la misma.
De las sales metálicas adecuadas para uso con la
presente invención el fosfato sódico, ZnCl_{2} y las combinaciones
de los mismos también son preferidos. La cantidad de sal o sales
metálicas adecuada para uso con la presente invención debe ser esa
cantidad que sea suficiente para disminuir la impureza de isoforma
trisulfuro en al menos aproximadamente el 10% de su concentración
más alta (o su concentración promedio más alta, cuando se promedian
múltiples lotes) formada. Preferiblemente, la disminución en la
cantidad de la impureza de la isoforma trisulfuro es al menos
aproximadamente el 20%, el 30%, el 40% o el 50%, respectivamente, de
su concentración más alta (o su concentración promedio más alta)
formada. La concentración inicial de sal metálica (por ejemplo,
fosfato sódico) adecuada para uso con la presente invención
preferiblemente es al menos aproximadamente 0,1 mM, de
aproximadamente 1 mM a aproximadamente 500 mM, de aproximadamente 1
mM a aproximadamente 200 mM, de aproximadamente 5 mM a
aproximadamente 175 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente
150 mM o de aproximadamente 25 a aproximadamente 100 mM,
respectivamente.
Es preferible proporcionar la sal metálica en un
tampón. Sin embargo, el fosfato sódico puede actuar tanto como un
tampón como una sal metálica adecuada. Sin embargo, se pueden añadir
sal o sales metálicas adecuadas adicionales al tampón de fosfato
sódico. Preferiblemente, el tampón es uno que sea adecuado para uso
con la presente invención, es decir, que no evite la formación del
componente proteico de B-2036 o que lo degrade una
vez que se ha formado. Los tampones adecuados para uso en relación
con la presente invención incluyen, pero sin limitación, Tris,
fosfato, HEPES, ácido cítrico, trietilamina e histidina. La
concentración de tampón inicial preferida es de aproximadamente 1
mM a aproximadamente 200 mM, más preferiblemente de aproximadamente
5 mM a aproximadamente 100 mM, aún más preferiblemente de
aproximadamente 8 mM a aproximadamente 70 mM y lo más preferible es
que sea de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM. Se pueden
usar otros tampones adecuados. Preferiblemente, estos tampones son
suficientes para mantener el pH del medio de cultivo en el
intervalo de aproximadamente 4 a aproximadamente 9, de
aproximadamente 4,5 a aproximadamente 7,5 o de aproximadamente 5,5 a
aproximadamente 7,5, respectivamente.
Después de que la sal metálica se proporciona en
un tampón (o en el caso de NaP, donde la solución de NaP actúa
tanto como la sal metálica como el tampón), la cantidad de la sal
metálica en el tampón (o solución de NaP que también actúa como
tampón) debe ser tal que la proporción molar de los moles de sal
metálica a los moles de proteína de B-2036 sea de
aproximadamente 1 a aproximadamente 10.000. Como alternativa, la
proporción molar de los moles de la sal metálica a los moles de la
proteína de B-2036 puede ser de aproximadamente 300
a aproximadamente 10.000, de aproximadamente 500 a aproximadamente
5.000 o de aproximadamente 500 a aproximadamente 2500,
respectivamente.
Típicamente, después del contacto suficiente
(para disminuir el nivel de la impureza de isoforma trisulfuro)
entre la sal o sales metálicas y el componente proteico de
B-2036 (dentro o a partir de que la célula o células
huésped se han completado), el componente proteico de
B-2036 en el tampón tiene una concentración de
aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml, de
aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml o de
aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml,
respectivamente.
Además, el intervalo de temperatura del medio de
cultivo junto con el tampón, la sal o sales metálicas y sus otros
contenidos incluyendo, pero sin limitación, B-2036,
preferiblemente se debe mantener en una temperatura de
aproximadamente 0ºC a aproximadamente 35ºC después de que la sal
metálica se ha añadido a la célula o células huésped o lisado de
las mismas que contienen el componente proteico de
B-2036. También, preferiblemente, la temperatura de
la célula o células huésped y/o el lisado a partir de las mismas que
contiene el componente de B-2036 se mantiene de
aproximadamente 1ºC a aproximadamente 15ºC, de aproximadamente 2ºC a
aproximadamente 10ºC o de aproximadamente 2ºC a aproximadamente
15ºC, respectivamente. Se observa que tras la homogenización con la
sal metálica (por ejemplo, NaP) la temperatura del homogenado puede
aumentar. Es importante observar que la desnaturalización de la
proteína de B-2036 ocurre a aproximadamente 40+ºC.
Como tal, es deseable mantener la temperatura del homogenado (es
decir, que contiene células huésped, medio de cultivo, tampón, sal
metálica, B-2036 y opcionalmente compuesto
mercapto, etc.) en una temperatura inferior a la temperatura de
desnaturalización de la proteína de B-2036.
Adicionalmente, el tiempo de contacto entre el
componente de B-2036 y el agente quelante debe ser
durante un tiempo suficiente para disminuir el nivel de la impureza
de isoforma trisulfuro. Los tiempos de contacto adecuados
ejemplares para disminuir el nivel de impureza de isoforma
trisulfuro deben ser durante al menos aproximadamente 30 minutos,
desde aproximadamente 1 hora hasta aproximadamente 48 horas o desde
aproximadamente 5 horas hasta aproximadamente 15 horas,
respectivamente.
Típicamente, después del contacto suficiente
entre la sal o sales metálicas y el componente de
B-2036, el tampón que contiene el mismo tiene un
volumen de aproximadamente 1 litro a aproximadamente 5.000 litros,
de aproximadamente 100 litros a aproximadamente 2.000 litros o de
aproximadamente 200 litros a aproximadamente 1.500 litros,
respectivamente.
Otros parámetros que pueden ser de interés
durante el contacto entre la sal o sales metálicas y el componente
de B-2036 incluyen cosas tales como la velocidad de
mezcla. La velocidad de mezcla debe ser aquella que sea suficiente
para formar una mezcla homogénea (de la célula o células huésped, el
lisado de las mismas, tampón, sal o sales metálicas, el componente
de B-2036 y cualquier otro componente en el medio de
cultivo) mientras que minimiza la cantidad de espuma que se puede
formar. Los especialistas en la técnica pueden determinar
fácilmente cuál debe ser una velocidad de mezcla suficiente.
Obviamente, la velocidad de mezcla debe ser tal que la temperatura
se mantenga en los intervalos indicados anteriormente y se minimice
cualquier degradación del componente proteico de
B-2036.
\vskip1.000000\baselineskip
Sin estar limitado por la teoría, se cree que la
adición de agente o agentes quelantes al antagonista de la hormona
del crecimiento recombinante B-2036 da como
resultado una disminución del nivel de la impureza de isoforma
des-phe mediante una reducción real del nivel de la
misma y/o la prevención de formación de des-phe
adicional.
Típicamente, el agente o los agentes quelantes
se añaden a la célula o células huésped que sintetizan el componente
proteico de B-2036 recombinante deseado durante o
después (o durante y después) del cultivo de la célula o
células huésped. Además, después de que se han conducido las etapas
de cultivo y contacto, es preferible purificar la proteína de
B-2036. A partir de entonces, la proteína purificada
preferiblemente se pegila para producir PEG B-2036
(pegvisomant). Para procedimientos de pegilación véase la Patente de
Estados Unidos Nº 5.849.535.
Se puede usar cualquier agente quelante en
relación con la presente invención el cual, cuando se pone en
contacto (preferiblemente con mezcla adecuada) con el componente
proteico de B-2036 junto con su impureza de isoforma
des-phe, es uno que es suficiente para disminuir el
nivel de la impureza de isoforma des-phe,
preferiblemente sin degradar (o degradar sustancialmente) la
producción de B-2036. Los agentes quelantes
preferidos adecuados para uso con la presente invención incluyen,
pero sin limitación, EDTA, EGTA y DTPA. Los agentes quelantes
ejemplares adicionales incluyen, pero sin limitación, Deferoxamina,
Ditiocarb Sódico, Edetato de Calcio Disódico, Edetato Disódico,
Edetato Sódico, Edetato Trisódico, Penicilamina, Pentetato de Calcio
Trisódico, Ácido Pentético, Succímero y Trientina. Se ha de
observar que el Edetato Sódico es la forma de sal de EDTA.
Otros agentes quelantes adecuados para uso
adecuado con la presente invención se indican en las siguientes
referencias: (1) The Merck Index, 12ª Edición, S. Budavari (Editor),
Merck & Co., Inc., Therapeutic Category and Biological Activity
Index, pág. THER-19 (bajo "CHELATING AGENT"),
Whitehouse Station, NJ (1996) y todas y cada una de las ediciones
posteriores a la fecha de la misma; (2) Remington's Pharmaceutical
Sciences, 16ª Ed., Arthur Osol (Editor), Mack Publishing Co.,
Easton, Pennsylvania (1980) y todas y cada una de las ediciones
posteriores a la fecha de la misma; (3) "The United States
Pharmacopeia, Revisión 21" (16ª Edición), United States
Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, Maryland (1985) y todas y
cada una de las ediciones posteriores a la fecha de la misma; (4)
SIGMA, Biochemicals and Reagents for Life Science Research
Catalogue, St. Louis, Missouri (2002-2003); y (5)
Aldrich, Handbook of Fine Chemicals and Laboratory Equipment,
Milwaukee, Wisconsin ediciones (2000-2001) y
(2002-2003) de la misma.
De los agentes quelantes adecuados, EDTA es el
más preferido. La cantidad de agente quelante que es adecuada para
uso con la presente invención debe ser esa cantidad que sea
suficiente para disminuir la impureza de isoforma
des-phe en al menos aproximadamente el 10% de su
concentración de equilibrio más alta (o su concentración de
equilibrio promedio más alta, cuando se promedian múltiples lotes)
formada. Preferiblemente, la disminución en la cantidad de la
impureza de isoforma des-phe es al menos
aproximadamente el 20%, el 30%, el 40% o el 50% respectivamente, de
su concentración de equilibrio más alta (o su concentración de
equilibrio promedio más alta) formada. La concentración inicial de
EDTA adecuada para uso con la presente invención preferiblemente es
al menos de aproximadamente 0,01 mM, de aproximadamente 0,01 mM a
aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente
20 mM, de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 10 mM o de
aproximadamente 2 a aproximadamente 5 mM, respectivamente.
Se prefiere proporcionar el agente quelante en
un tampón. Preferiblemente, el tampón es uno que es adecuado para
uso con la presente invención, es decir, que no evita la formación
del componente proteico de B-2036 o lo degrada una
vez que se ha formado. Los tampones adecuados para uso en relación
con la presente invención incluyen, pero sin limitación, Tris,
fosfato, HEPES, ácido cítrico, trietilamina e histidina. El tampón
preferido es Tris. La concentración de tampón inicial preferida es
de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 200 mM, más
preferiblemente de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 100 mM,
aún más preferiblemente de aproximadamente 8 mM a aproximadamente
70 mM y lo más preferible es que sea de aproximadamente 10 mM a
aproximadamente 50 mM. Se pueden usar otros tampones adecuados.
Preferiblemente, estos tampones son suficientes para mantener el pH
del medio de cultivo en el intervalo de aproximadamente 6 a
aproximadamente 9, de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,5 o
de aproximadamente 7,2 a aproximadamente 7,5, respectivamente.
Como se ha indicado anteriormente, se prefiere
proporcionar el agente quelante en un tampón. Además, la cantidad
del agente quelante en el tampón debe ser tal que la proporción
molar de los moles de agente quelante a los moles de proteína de
B-2036 sea de aproximadamente 1 a aproximadamente
1.000. Como alternativa, la proporción molar de los moles de agente
quelante a los moles de proteína de B-2036 puede ser
de aproximadamente 20 a aproximadamente 1.000, de aproximadamente
50 a aproximadamente 250 o de aproximadamente 60 a aproximadamente
110, respectivamente.
Típicamente, después del contacto suficiente
(para disminuir el nivel de la impureza de isoforma
des-phe) entre el agente quelante y el componente
proteico de B-2036 (dentro o a partir de que la
célula o células huésped se han completado), el componente proteico
de B-2036 en el tampón tiene una concentración de
aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml, de
aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml o de
aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml,
respectivamente.
Además, el intervalo de temperatura del medio de
cultivo junto con el tampón, el agente o los agentes quelantes y
sus otros contenidos incluyendo, pero sin limitación,
B-2036, se debe mantener a una temperatura
preferiblemente de aproximadamente 0ºC a aproximadamente 35ºC
después de que el agente quelante se ha añadido a la célula o
células huésped o lisado de las mismas que contiene el componente
proteico de B-2036. También, preferiblemente, la
temperatura de la célula o células huésped y/o el lisado a partir de
las mismas que contiene el componente de B-2036 se
mantiene de aproximadamente 1ºC a aproximadamente 15ºC, de
aproximadamente 2ºC a aproximadamente 10ºC o de aproximadamente 2ºC
a aproximadamente 15ºC, respectivamente. Se observa que,
preferiblemente, tras la adición del agente quelante (por ejemplo,
EDTA), cuya temperatura es de aproximadamente 4ºC, la temperatura
del homogenado que contiene el B-2036 aumenta hasta
aproximadamente 30ºC tras la homogeneización. Es importante
observar que la desnaturalización de la proteína de
B-2036 ocurre a aproximadamente 40+ºC. Como tal, es
deseable mantener la temperatura del homogenado (es decir, que
contiene células huésped, medio de cultivo, tampón, agentes
quelantes y B-2036, etc.) en una temperatura
inferior a la temperatura de desnaturalización de la proteína de
B-2036.
Adicionalmente, el tiempo de contacto entre el
componente de B-2036 y el agente quelante debe ser
durante un tiempo suficiente para disminuir el nivel de la impureza
de isoforma des-phe. Los tiempos de contacto
adecuados ejemplares para disminuir el nivel de impureza de
isoforma des-phe deben ser de al menos
aproximadamente 30 minutos, desde aproximadamente 1 hora hasta
aproximadamente 48 horas o desde aproximadamente 5 horas hasta
aproximadamente 15 horas, respectivamente.
Típicamente, después del contacto suficiente
entre el agente o los agentes quelantes y el componente de
B-2036, el tampón que contiene el mismo tiene un
volumen de aproximadamente 1 litro a aproximadamente 5.000 litros,
de aproximadamente 10 litros a aproximadamente 500 litros o de
aproximadamente 100 litros a aproximadamente 300 litros,
respectivamente. Otros volúmenes ejemplares adecuados pueden ser de
160 litros a aproximadamente
500 litros.
500 litros.
Otros parámetros que pueden ser de interés
durante el contacto entre el agente o los agentes quelantes y el
componente de B-2036 incluyen cosas tales como la
velocidad de mezcla. La velocidad de mezcla debe ser aquella que
sea suficiente para formar una mezcla homogénea (de la célula o
células huésped, el lisado de las mismas, tampón, agente o agentes
quelantes, el componente de B-2036 y cualquier otro
componente en el medio de cultivo) mientras minimiza la cantidad de
espuma que se puede formar. Los especialistas en la técnica pueden
determinar fácilmente cuál debe ser una velocidad de mezcla
suficiente. Obviamente, la velocidad de mezcla debe ser tal que la
temperatura se mantenga en los intervalos indicados anteriormente y
se minimice cualquier degradación del componente proteico de
B-2036.
\vskip1.000000\baselineskip
Sin estar limitado por la teoría, se cree que la
adición de sal o sales metálicas al antagonista de la hormona del
crecimiento humana recombinante B-2036 da como
resultado una disminución en el nivel de la impureza de isoforma
des-phe mediante una reducción real en el nivel de
la misma y/o la prevención de formación adicional de
des-phe.
Típicamente, se añade la sal o las sales
metálicas a la célula o células huésped que sintetizan el componente
proteico de B-2036 recombinante deseado durante
o después (o durante y después) del cultivo de la
célula o células huésped. Además, después de que se han conducido
las etapas de cultivo y contacto, es preferible purificar la
proteína de B-2036. A partir de entonces, la
proteína purificada preferiblemente se pegila para producir PEG
B-2036 (pegvisomant). Para procedimientos de
pegilación véase la Patente de Estados Unidos Nº 5.849.535.
Se puede usar cualquier sal metálica en relación
con la presente invención que, cuando se ponga en contacto
(preferiblemente con mezcla adecuada) con el componente proteico de
B-2036 junto con su impureza de isoforma
des-phe, sea una que sea suficiente para disminuir
el nivel de la impureza de isoforma des-phe,
preferiblemente sin degradar (o degradar sustancialmente) la
producción de B-2036. La sal o sales metálicas
adecuadas para uso con la presente invención incluyen, pero sin
limitación, sal o sales de metales alcalinos, sal o sales de
metales alcalino-térreos, sal o sales de metales de
transición y combinaciones de los mismos. Las sales metálicas
preferidas adecuadas para uso con la presente invención incluyen,
pero sin limitación, fosfato potásico, acetato potásico, fosfato
sódico, acetato sódico, cloruro de cinc y combinaciones de los
mismos.
Otras sales metálicas adecuadas se indican en
las siguientes referencias: (1) The Merck Index, 12ª Edición, S.
Budavari (Editor), Merck & Co., Inc., Therapeutic Category and
Biological Activity Index, pág. THER-19 (bajo
"CHELATING AGENT"), Whitehouse Station, NJ (1996) y todas y
cada una de las ediciones posteriores a la fecha de la misma; (2)
Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª Ed., Arthur Osol (Editor),
Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania (1980) y todas y cada una
de las ediciones posteriores a la fecha de la misma; (3) The United
States Pharmacopeia, 21ª Revisión (16ª Edición), United States
Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, Maryland (1985) y todas
y cada una de las ediciones posteriores a la fecha de la misma; (4)
SIGMA, Biochemicals and Reagents for Life Science Research
Catalogue, St. Louis, Missouri (2002-2003); y (5)
Aldrich, Handbook of Fine Chemicals and Laboratory Equipment,
Milwaukee, Wisconsin ediciones (2000-2001) y
(2002-2003) de la misma.
De las sales metálicas adecuadas para uso con la
presente invención el fosfato sódico, ZnCl_{2} y las combinaciones
de los mismos también son preferidos. La cantidad de sal o sales
metálicas adecuada para uso con la presente invención debe ser esa
cantidad que sea suficiente para disminuir la impureza de isoforma
des-phe en al menos aproximadamente el 10% de su
concentración más alta (o su concentración promedio más alta, cuando
se promedian múltiples lotes) formada. Preferiblemente, la
disminución en la cantidad de la impureza de la isoforma
des-phe es al menos aproximadamente el 20%, el 30%,
el 40% o el 50% respectivamente, de su concentración más alta (o su
concentración promedio más alta) formada. La concentración inicial
de sal metálica (por ejemplo, fosfato sódico) adecuada para uso con
la presente invención preferiblemente es al menos aproximadamente
0,1 mM, de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 500 mM, de
aproximadamente 1 mM a aproximadamente 200 mM, de aproximadamente 5
mM a aproximadamente 175 mM, de aproximadamente 10 mM a
aproximadamente 150 mM o de aproximadamente 25 a aproximadamente 100
mM, respectivamente.
Es preferible proporcionar la sal metálica en un
tampón. Sin embargo, el fosfato sódico puede actuar tanto como un
tampón como una sal metálica adecuada. Sin embargo, se pueden añadir
sal o sales metálicas adecuadas adicionales al tampón de fosfato
sódico. Preferiblemente, el tampón es uno que sea adecuado para uso
con la presente invención, es decir, que no degrade la formación
del componente proteico de B-2036. Los tampones
adecuados para uso en relación con la presente invención incluyen,
pero sin limitación, Tris, fosfato, HEPES, ácido cítrico,
trietilamina e histidina. La concentración de tampón inicial
preferida es de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 200 mM, más
preferiblemente de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 100 mM;
aún más preferiblemente de aproximadamente 8 mM a aproximadamente
70 mM y lo más preferible es que sea de aproximadamente 10 mM a
aproximadamente 50 mM. Se pueden usar otros tampones adecuados.
Preferiblemente, estos tampones son suficientes para mantener el pH
del medio de cultivo en el intervalo de aproximadamente 4 a
aproximadamente 9, de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 7,5 o de
aproximadamente 5,5 a aproximadamente 7,5, respectivamente.
Después de que la sal metálica se proporciona en
un tampón (o en el caso de NaP, donde la solución de NaP actúa
tanto como la sal metálica como el tampón), la cantidad de la sal
metálica en el tampón (o solución de NaP que también actúa como
tampón) debe ser tal que la proporción molar de los moles de sal
metálica a los moles de proteína de B-2036 sea de
aproximadamente 1 a aproximadamente 10.000. Como alternativa, la
proporción molar de los moles de la sal metálica a los moles de la
proteína de B-2036 puede ser de aproximadamente 300
a aproximadamente 10.000, de aproximadamente 500 a aproximadamente
5.000 o de aproximadamente 500 a aproximadamente 2500,
respectivamente.
Típicamente, después del contacto suficiente
(para disminuir el nivel de la impureza de isoforma
des-phe) entre la sal o sales metálicas y el
componente proteico de B-2036 (dentro o a partir de
que la célula o células huésped se han completado), el componente
proteico de B-2036 en el tampón tiene una
concentración de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 20
mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml o de
aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml,
respectivamente.
Además, el intervalo de temperatura del medio de
cultivo junto con el tampón, la sal o sales metálicas y sus otros
contenidos incluyendo, pero sin limitación, B-2036,
preferiblemente se debe mantener en una temperatura de
aproximadamente 0ºC a aproximadamente 35ºC después de que la sal
metálica se ha añadido a la célula o células huésped o lisado de
las mismas que contienen el componente proteico de
B-2036. También, preferiblemente, la temperatura de
la célula o células huésped y/o el lisado a partir de las mismas que
contiene el componente de B-2036 se mantiene desde
aproximadamente 1ºC hasta aproximadamente 15ºC, desde
aproximadamente 2ºC hasta aproximadamente 10ºC o desde
aproximadamente 2ºC hasta aproximadamente 15ºC, respectivamente. Se
observa que tras la homogenización con la sal metálica (por
ejemplo, NaP) la temperatura del homogenado puede aumentar. Es
importante observar que la desnaturalización de la proteína de
B-2036 ocurre a aproximadamente 40+ºC. Como tal, es
deseable mantener la temperatura del homogenado (es decir, que
contiene células huésped, medio de cultivo, tampón, sal metálica,
B-2036 y opcionalmente compuesto mercapto, etc.) en
una temperatura inferior a la temperatura de desnaturalización de la
proteína de B-2036.
Adicionalmente, el tiempo de contacto entre el
componente de B-2036 y la sal metálica debe ser
durante un tiempo suficiente para disminuir el nivel de la impureza
de isoforma des-phe. Los tiempos de contacto
adecuados ejemplares para disminuir el nivel de impureza de
isoforma des-phe deben ser durante al menos
aproximadamente 30 minutos, desde aproximadamente 1 hora hasta
aproximadamente 48 horas o desde aproximadamente 5 horas hasta
aproximadamente 15 horas, respectivamente.
Típicamente, después del contacto suficiente
entre la sal o sales metálicas y el componente de
B-2036, el tampón que contiene el mismo tiene un
volumen de aproximadamente 1 litro a aproximadamente 3.000 litros,
de aproximadamente 100 litros a aproximadamente 2.000 litros o de
aproximadamente 200 litros a aproximadamente 1.500 litros,
respectivamente.
Otros parámetros que pueden ser de interés
durante el contacto entre la sal o sales metálicas y el componente
de B-2036 incluyen cosas tales como la velocidad de
mezcla. La velocidad de mezcla debe ser aquella que sea suficiente
para formar una mezcla homogénea (de la célula o células huésped,
del lisado de las mismas, tampón, sal o sales metálicas, el
componente de B-2036 y cualquier otro componente en
el medio de cultivo) mientras que minimiza la cantidad de espuma
que se puede formar. Los especialistas en la técnica pueden
determinar fácilmente cuál debe ser una velocidad de mezcla
suficiente. Obviamente, la velocidad de mezcla debe ser tal que la
temperatura se mantenga en los intervalos indicados anteriormente y
se minimice cualquier degradación del componente proteico de
B-2036.
\vskip1.000000\baselineskip
En la preparación y purificación de
B-2036 PEG, el intermedio voluminoso o molécula de
B-2036 se prepara como se ha indicado anteriormente.
A partir de entonces, la molécula de B-2036 se
procesa de acuerdo con las siguientes seis etapas para producir API
final que es la proteína B-2036 PEG de interés.
Estas seis etapas son las siguientes:
- 1.
- pegilación para producir B-2036 pegilado,
- 2.
- cromatografía de HIC (etapa opcional) para producir una combinación de HIC,
- 3.
- ultrafiltración/diafiltración (etapa opcional) para producir una combinación de diafiltración,
- 4.
- cromatografía de AEX junto con combinación para producir una combinación de AEX,
- 5.
- diafiltración de la combinación de AEX para producir una combinación de diafiltración y
- 6.
- filtración de API (con propósitos de esterilización, preferiblemente, a través de un filtro de 0,22 micrómetros en botellas de recolección para congelamiento) para producir un API final.
\vskip1.000000\baselineskip
Las etapas 1-6 indicadas
anteriormente son ejemplares y se describen en el diagrama de flujo
1 en el Ejemplo 1.
Con referencia a la etapa 1, la etapa de
pegilación consigue la primera etapa de la invención indicada de
proporcionar isoformas de proteína pegilada de interés. A partir de
entonces, la etapa 2 de HIC y la etapa 3 posterior de
diafiltración, las cuales se consideran opcionales, preferiblemente
se conducen para retirar cualquier proteína no pegilada, moléculas
de PEG libres o cualquiera de otras impurezas que se puedan retirar
durante la etapa 2. Después de la etapa 3, la combinación de
diafiltración de la etapa 3 se somete después a cromatografía de
intercambio aniónico de la etapa 4 para separar las isoformas
PEG-1, PEG-2, PEG-3,
PEG-4, PEG-5,
PEG-6, PEG-7, PEG-8
y PEG-9 que después posteriormente se combinan para
enriquecer preferiblemente el nivel de isoformas
PEG-4, PEG-5 y PEG-6
en un producto final para procesamiento adicional en la etapa 5 de
la diafiltración que vendrá seguida por la filtración de
esterilización de la etapa 6 para producir un producto final
API.
Ahora, con referencia de nuevo a la etapa 1 de
pegilación, la molécula de B-2036 se somete a
condiciones suficientes para pegilar la misma molécula de
B-2036 en B-2036 PEG incluyendo las
isoformas PEG-1, PEG-2,
PEG-3, PEG-4,
PEG-5, PEG-6, PEG-7,
PEG-8 y PEG-9. Los parámetros de
pegilación preferidos se proporcionan en el diagrama de flujo 1 y
Ejemplo 1. La molécula de B-2036 y cualquier otra
molécula a la cual se puedan unir las moléculas de PEG,
preferiblemente, mediante unión covalente son moléculas de PEG
seleccionadas entre el grupo constituido por
PEG-N-hidrosuccinimida-5K,
PEG-succinimidil carbonato-5K,
PEG-succinimidil propionato-5K,
PEG2-maleimida-40K (2 x 20K),
PEG2-N-hidrosuccinimida-40K
(2 x 20K) y PEG2-aldehído-40K (2 x
20K). La cantidad de la molécula de PEG añadida a la molécula de
B-2036 para la pegilación (o cualquier otra proteína
de interés que se necesite pegilar) debe ser tal que la proporción
en peso estequiométrica de la cantidad de moléculas de PEG libres
(no unidas) a la cantidad de moléculas de proteína no pegiladas sea
de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 100, preferiblemente de
aproximadamente 1,5 a aproximadamente 2,5, más preferiblemente de
aproximadamente 1,9 a aproximadamente 2 y lo más preferible es que
sea de aproximadamente 1,95 a aproximadamente 2,05. Durante la
pegilación, la molécula de B-2036 (o cualquier otra
proteína de interés que se tenga que pegilar) se pegila a un pH de
pegilación de aproximadamente 3 a aproximadamente 10,
preferiblemente de aproximadamente 7,2 a aproximadamente 7,8, más
preferiblemente de aproximadamente 7,4 a aproximadamente 7,8 y lo
más preferible es que sea de aproximadamente 7,40 a aproximadamente
7,80. La temperatura a la cual se conduce la etapa de pegilación se
denomina la temperatura de pegilación. La temperatura de pegilación
es de aproximadamente 0ºC a aproximadamente 40ºC, preferiblemente
desde aproximadamente 10ºC a aproximadamente 30ºC y más
preferiblemente de aproximadamente 18ºC a aproximadamente 25ºC.
Con referencia ahora a la etapa 2 opcional de
HIC, los parámetros preferidos para conducir esta etapa se
proporcionan en el Ejemplo 1 y en el diagrama de flujo 1. Durante
la etapa 2 de cromatografía de HIC opcional, la proteína pegilada y
cualquier proteína no pegilada se carga en la resina de HIC a una
carga de HIC de \leq aproximadamente 10 g de proteína por litro
de volumen de lecho cargado de resina de HIC, preferiblemente \leq
aproximadamente 5 gramos de proteína por litro de volumen de lecho
cargado de resina HIC o S de aproximadamente 4,1 g de proteína por
litro de volumen de lecho cargado de resina HIC. También, la
conductividad de carga de HIC es desde aproximadamente 30 a
aproximadamente 60 mS/cm, preferiblemente de aproximadamente 40 a
aproximadamente 52 mS/cm o más preferiblemente de aproximadamente
45 a aproximadamente 51 mS/cm. Además, la etapa de HIC se conduce a
una temperatura de HIC de aproximadamente 10 a aproximadamente
40ºC, preferiblemente de aproximadamente 15 a aproximadamente 30ºC
y más preferiblemente de aproximadamente 18 a aproximadamente 25ºC.
La etapa 2 de HIC opcional retira al menos algún PEG libre, proteína
no pegilada y agregación, respectivamente, presente en la carga de
HIC.
A continuación de la etapa 2 de HIC, se obtiene
una combinación de HIC. La combinación de HIC después se somete a
una etapa 3 de ultrafiltración/diafiltración que es opcional en el
sentido de que si la etapa 2 de HIC se conduce, entonces las etapas
de ultrafiltración/diafiltración también se conducen. Sin embargo,
si la etapa 2 de HIC no se conduce, entonces no existe necesidad de
conducir la etapa 3 de ultrafiltración/diafiltración. Como
alternativa, la etapa 3 de ultrafiltración/diafiltración todavía se
puede conducir en ausencia de la etapa 2 de HIC opcional. Las
condiciones preferidas en las cuales la etapa 3 de
ultrafiltración/diafiltración se conduce se indican en el Ejemplo 1
y en el diagrama de flujo 1. En este documento, se denomina a esta
etapa UF/DF #3. La etapa UF/DF #3 se conduce con una membrana de
UF/DF #3 que tiene un peso molecular de corte (MWCO) de
aproximadamente 3 kDa a aproximadamente 20 kDa, preferiblemente de
aproximadamente 8 kDa a aproximadamente 15 kDa, más preferiblemente
de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 12 kDa y lo más
preferible es que sea aproximadamente 10 kDa.
Después de la etapa 3, el producto obtenido en
este punto se denomina la combinación de diafiltración. Esta
combinación de diafiltración después se somete a la etapa 4 que es
la etapa de cromatografía de intercambio aniónico y de combinación.
Las condiciones preferidas para realizar esta etapa de cromatografía
del AEX y combinación se proporcionan en el Ejemplo 1 y en el
diagrama de flujo 1. La combinación de diafiltración de la etapa
anterior (es decir, etapa 3) o la proteína pegilada (por ejemplo,
B-2036 PEG de la etapa 1, si no se han conducido
las etapas 2 y 3) se somete a la etapa 4. De hecho, sin el
procesamiento de HIC de la etapa 2, la combinación de diafiltración
de la etapa 3 que contiene B-2036 PEG o el
B-2036 PEG de la etapa 1 se carga en una resina de
intercambio aniónico junto con cualquier PEG libre, cualquier
proteína pegilada, proteína no pegilada, proteína parcialmente
pegilada y cualquier impureza (tal como la impureza de trisulfuro o
la impureza de des-phe) y cualquier agregación de
los mismos.
Preferiblemente, la resina usada es una resina
de intercambio aniónico (AEX). Las resinas de AEX preferidas
incluyen, pero sin limitación, ANX4, DEAE,
Q-Sefarosa, Q-Sefarosa FF,
Q-Sefarosa HP y Q-Sefarosa XL. La
resina de AEX preferida es Q-Sefarosa FF.
Preferiblemente, la resina de AEX comprende
grupos funcionales seleccionados entre el grupo constituido por
aminas primarias, secundarias, terciarias y cuaternarias y
combinaciones de las mismas. Adicionalmente, la resina de AEX
comprende grupos funcionales seleccionados entre grupos constituidos
por grupos funcionales de dietilaminoetilo, dietilaminopropilo,
dimetiletanolamina, trimetilamonio-etilo,
trimetilbenzil amonio, dimetiletanol bencilo y poliamina. Además,
la resina de AEX preferiblemente comprende un material de soporte
seleccionado entre el grupo constituido por poliéter hidrófilo,
divinil benceno poliestireno reticulado, agarosa reticulada,
polipropileno, acrilamidovinil hidrófilo, metacrílico, hidrogel
polimerizado con una base de perla cerámica, material de
sílice-dextrano compuesto, sílice injertado con
polímero, divinil benceno estireno, divinil benceno poliacrílico,
celulosa reticulada, copolímero de metacrilato, poliestireno,
acrílico, gel hidrófilo G5000 y celulosa. También, se prefiere usar
una resina de AEX que comprenda una resina macroporosa o una resina
de gel. Típicamente, el material de soporte tiene un diámetro de
aproximadamente 10 a aproximadamente 500 \mum y preferiblemente
aproximadamente 30 \mum.
La carga de AEX se conduce a una conductividad
de carga de AEX que es \leq aproximadamente 10 mS/cm,
preferiblemente \leq aproximadamente 5 mS/cm y más
preferiblemente \leq aproximadamente 2,4 mS/cm. La resina de AEX
se carga a un pH de carga de AEX de aproximadamente 5 a
aproximadamente 10, preferiblemente de aproximadamente 6,6 a
aproximadamente 9, más preferiblemente de aproximadamente 6,9 a
aproximadamente 7,1.
La carga de la proteína pegilada incluyendo
cualquier impureza tal como la impureza trisulfuro o impureza
des-phe o agregación de las mismas es tal que la
carga de AEX es \leq 10 g de proteína/l de volumen del lecho
cargado de resina de AEX, preferiblemente \leq 5,5 g de proteína/l
de volumen del lecho cargado de resina de AEX, más preferiblemente
S a aproximadamente 4,1 g de proteína/l de volumen del lecho cargado
de resina de AEX.
De acuerdo con una realización, la proteína
pegilada que se carga en la resina de AEX o que se proporciona en
la primera etapa de proporción de una proteína pegilada incluye una
o más isoformas de proteína pegilada, PEG-1,
PEG-2, PEG-3, PEG-4,
PEG-5, PEG-6, PEG-7,
PEG-8, PEG-9 y cualquier agregación,
impureza trisulfuro e impureza des-phe de las
mismas y cualquier impureza no pegilada de la proteína pegilada y
cualquier molécula de PEG libre.
De acuerdo con otra realización, la proteína
pegilada que se carga en la resina de AEX o que se proporciona en
la primera etapa de proporcionar una proteína pegilada incluye una o
más isoformas de proteína pegilada, PEG-2,
PEG-3, PEG-4, PEG-5,
PEG-6, PEG-7, PEG-8
y cualquier agregación, impureza trisulfuro e impureza
des-phe de las mismas y cualquier impureza no
pegilada de la proteína pegilada y cualquier molécula de PEG
libre.
De acuerdo con otra realización, la proteína
pegilada que se carga en la resina de AEX o que se proporciona en
la primera etapa de proporcionar una proteína pegilada incluye una o
más isoformas de proteína pegilada, PEG-2,
PEG-3, PEG-4, PEG-5,
PEG-6, PEG-7, PEG-8
y cualquier agregación, impureza trisulfuro e impureza
des-phe de las mismas y cualquier impureza no
pegilada de la proteína pegilada y cualquier molécula de PEG
libre.
De acuerdo con otra realización, la proteína
pegilada que se carga en la resina de AEX o que se proporciona en
la primera etapa de proporcionar de una proteína pegilada incluye
una o más isoformas de proteína pegilada, PEG-3,
PEG-4, PEG-5, PEG-6,
PEG-7, PEG-8 y cualquier agregación,
impureza trisulfuro e impureza des-phe de las mismas
y cualquier impureza no pegilada de la proteína pegilada y cualquier
molécula de PEG libre.
De acuerdo con otra realización, la proteína
pegilada que se carga en la resina de AEX o que se proporciona en
la primera etapa de proporcionar una proteína pegilada incluye una o
más isoformas de proteína pegilada, PEG-4,
PEG-5, PEG-6, PEG-7,
PEG-8 y cualquier agregación, impureza trisulfuro e
impureza des-phe de las mismas y cualquier impureza
no pegilada de la proteína pegilada y cualquier molécula de PEG
libre.
De acuerdo con otra realización, la proteína
pegilada que se carga en la resina de AEX o que se proporciona en
la primera etapa de proporcionar una proteína pegilada incluye una o
más isoformas de proteína pegilada, PEG-4,
PEG-5, PEG-6, PEG-7
y cualquier agregación, impureza trisulfuro e impureza
des-phe de las mismas y cualquier impureza no
pegilada de la proteína pegilada y cualquier molécula de PEG
libre.
De acuerdo con otra realización, la proteína
pegilada que se carga en la resina de AEX o que se proporciona en
la primera etapa de proporcionar de una proteína pegilada incluye
una o más isoformas de proteína pegilada, PEG-4,
PEG-5, PEG-6 y cualquier agregación,
impureza trisulfuro e impureza des-phe de las mismas
y cualquier impureza no pegilada de la proteína pegilada y cualquier
molécula de PEG libre.
De acuerdo con otra realización, la proteína
pegilada que se carga en la resina de AEX o que se proporciona en
la primera etapa de proporcionar una proteína pegilada incluye una o
más isoformas de proteína pegilada, PEG-4,
PEG-5, PEG-6 y cualquier agregación,
impureza trisulfuro e impureza des-phe de las mismas
y cualquier impureza no pegilada de la proteína pegilada.
De acuerdo con otra realización, la proteína
pegilada que se carga en la resina de AEX o que se proporciona en
la primera etapa de proporcionar una proteína pegilada incluye una o
más isoformas de proteína pegilada, PEG-1,
PEG-2, PEG-3, PEG-4,
PEG-5, PEG-6, PEG-7,
PEG-8 y PEG-9 y cualquier
agregación, impureza trisulfuro e impureza des-phe
de las mismas.
De acuerdo con otra realización, la proteína
pegilada que se carga en la resina de AEX o que se proporciona en
la primera etapa de proporcionar una proteína pegilada incluye una o
más isoformas de proteína pegilada, PEG-1,
PEG-2, PEG-3, PEG-4,
PEG-5, PEG-6, PEG-7,
PEG-8 y PEG-9 y cualquier
agregación, impureza trisulfuro de las mismas.
De acuerdo con otra realización, la proteína
pegilada que se carga en la resina de AEX o que se proporciona en la
primera etapa de proporcionar una proteína pegilada incluye una o
más isoformas de proteína pegilada, PEG-1,
PEG-2, PEG-3, PEG-4,
PEG-5, PEG-6, PEG-7,
PEG-8 y PEG-9 y cualquier agregación
de las mismas.
La proteína pegilada junto con cualquier
agregación, impureza trisulfuro y/o des-phe de la
misma, cualquier proteína no pegilada o parcialmente pegilada y
cualquier PEG libre, después de la carga en la resina de AEX se
somete a eluirse con una solución eluyente durante una etapa de
elución seguida por la recogida del eluyente en múltiples
fracciones. Las fracciones son fracciones de volumen de volumen de
columna. La etapa de elución se puede conducir mediante un
gradiente de pH o un gradiente de fuerza iónica. Si la elución se
conduce con un gradiente de fuerza iónica, la elución se realiza
con una solución salina en un tampón de elución que contiene una
sal iónica a una concentración de sal suficiente para eluir la
proteína pegilada cargada a partir de la resina de AEX.
Preferiblemente, la sal iónica es una sal de cloruro. Más
preferiblemente, la sal iónica se selecciona entre el grupo
constituido por NaCl, cloruro de litio, fosfato de Na, sulfato de
Na, cloruro de amonio, sulfato de amonio, fosfato de amonio, Kl y
KCl. Otras sales iónicas adecuadas se reconocen para uso con
resinas de AEX y se incorporan como si se hubieran indicaron este
documento. Preferiblemente, la sal iónica es cloruro de sodio
proporcionado en un tampón. Durante la elución con una solución
salina proporcionada en un tampón de elución, el gradiente de
concentración de sal (por ejemplo, para una solución salina de NaCl)
es de aproximadamente 2 a aproximadamente 50 mM por CV,
preferiblemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 25 mM por CV
y más preferiblemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 mM
por CV y lo más preferible es que sea de 10 a aproximadamente 12,5
mM por CV. El tampón de elución en el que se proporciona la solución
salina tiene un pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 10,
preferiblemente de aproximadamente 6,6 a aproximadamente 9 y lo más
preferible es que sea de aproximadamente 6,9 a aproximadamente 7,1.
Además, la etapa de elución se conduce a una temperatura de elución
\leq aproximadamente 50ºC, preferiblemente \leq aproximadamente
35ºC, más preferiblemente de aproximadamente 2 a aproximadamente
30ºC, incluso más preferiblemente de aproximadamente 15 a
aproximadamente 30ºC y lo más preferible es que sea de
aproximadamente 18 a aproximadamente 25ºC.
El tampón de elución que contiene la solución
salina se introduce en la columna de resina de AEX y fluye a través
de la columna a una velocidad lineal de \leq 300 cm/h,
preferiblemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 150 cm/h,
más preferiblemente de aproximadamente de 30 a aproximadamente 100
cm/h, aún más preferiblemente de aproximadamente 50 a
aproximadamente 100 cm/h, incluso aún más preferiblemente de
aproximadamente 50 a aproximadamente 70 cm/h, incluso
adicionalmente aún más preferiblemente de aproximadamente 60 a
aproximadamente 65 cm/h y lo más preferible a aproximadamente 60
cm/h.
Cuando se recoge el eluyente de la resina de
AEX, preferiblemente se recoge el eluyente en fracciones de volumen
múltiples que varían de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 5
volúmenes de columna (CV), preferiblemente de aproximadamente 0,1 a
aproximadamente 1 fracciones de CV, más preferiblemente de
aproximadamente 0,1 a aproximadamente 0,5 CV y lo más preferible es
que sea de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 0,2 CV fracciones
de volumen. Por tanto, por ejemplo, se pueden recoger 100 fracciones
separadas, número que puede ser menor o mayor dependiendo de la
cantidad total de solución salina y del tampón de elución enviado a
través de la resina de AEX para recoger las diversas fracciones de
CV. Se debe apreciar que las fracciones de CV se recogen de forma
seriada a medida que el eluyente se recoge en la salida (típicamente
en la parte inferior de la columna de AEX) de la columna
de AEX.
de AEX.
Cada una de las fracciones de CV recogidas
preferiblemente contendrá una isoforma de proteína pegilada dada tal
como PEG-1, PEG-2,
PEG-3, PEG-4, PEG-5,
PEG-6, PEG-7, PEG-8
y PEG-9. Las fracciones de CV recogidas después se
someten a combinación para determinar qué fracción contiene qué
isoforma de proteína pegilada y después para permitir que se combine
selectivamente las isoformas de proteína pegilada deseadas recogida
de esa forma.
\vskip1.000000\baselineskip
Por tanto, las fracciones de CV recogidas a
partir de la resina de AEX después se someten a una etapa de
combinación para seleccionar cantidades específicas de las
isoformas de proteína pegilada tales como PEG-1,
PEG-2, PEG-3,
PEG-4, PEG-5, PEG-6,
PEG-7, PEG-8 y
PEG-9. Se pueden usar diversas técnicas analíticas
para combinar de forma selectiva las isoformas de proteína pegilada
deseadas. Estas técnicas incluyen, pero sin limitación CE,
SDS-PAGE, cromatografía de IEX, cromatografía de
HIC, cromatografía de AEX, cromatografía de CEX, RPHPLC, SEHPLC,
cromatografía de afinidad (AC) y combinaciones de las mismas. CE o
RPHPLC se prefieren por encima de SDS-PAGE. Además,
sin estar limitado por la teoría, se cree que el reactivo (por
ejemplo, dodecil sulfato sódico) usado con SDS-PAGE
oculta la medición de cualquier agregación formada. Se cree que el
dodecil sulfato sódico (SDS) usado en el ensayo de
SDS-PAGE destruye la agregación de forma que se mide
una cantidad reducida de agregación o no se mide ninguna cantidad
de agregación. Sin embargo, se puede usar SDS-PAGE
satisfactoriamente para identificar genéticamente (por ejemplo,
determinar la composición cualitativa y cuantitativa de
PEG-1, PEG-2, PEG-3,
PEG-4, PEG-5,
PEG-6, PEG-7, PEG-8
y PEG-9 de una fracción recogida) las proteínas
pegiladas individuales. Cuando se conduce el análisis por CE para
la combinación, el análisis se conduce a una temperatura de CE de
aproximadamente 5 a aproximadamente 50ºC, preferiblemente de
aproximadamente 5 a aproximadamente 45ºC, más preferiblemente de
aproximadamente 20 a aproximadamente 40ºC y lo más preferible es que
sea de aproximadamente 30 a aproximadamente 32ºC.
También, cuando se usa CE, la CE se conduce a
una conductividad de combinación de CE (se refiere a la
conductividad de la fracción de muestra) de aproximadamente 0 a
aproximadamente 60 mS/cm y más preferiblemente de aproximadamente 5
a aproximadamente 10 mS/cm. La fracción de muestra que tiene una
conductividad dentro de los intervalos de conductividad de
combinación por CE indicados anteriormente después se introduce en
el capilar de CE para identificación genética de la proteína
pegilada. La identificación genética de isoforma de proteína
pegilada obtenida de este modo de la fracción de CV pertinente se
compara frente a un patrón de referencia para identificar la
isoforma de proteína pegilada particular presente en esa
muestra.
El área por ciento obtenido por cada pico de
identificación genética es proporcional al % en peso de la isoforma
correspondiente a ese pico en esa fracción. Después, la fracción
identificada de este modo mediante CE que contiene la isoforma de
proteína pegilada deseada en el % en peso deseado de la isoforma
después se mezcla opcionalmente con otras fracciones seleccionadas
de forma similar para producir la mezcla de isoforma deseada. Este
procesamiento produce composición API.
Véase, por ejemplo, Swapan K. Chowdhury y col.,
"Fingerprinting Proteins Coupled with Polymers by Mass
Spectrometry: Investigation of Polyethylene
Glycol-Conjugated Superoxide Dismutase", American
Society for Mass Spectrometry, Vol. 6, págs.
478-487, 1995.
Para conducir el análisis de CE en la fracción
de CV recogida, la concentración de proteína pegilada en tampón es
al menos aproximadamente 0,2 mg/ml, al menos aproximadamente 0,5
mg/ml, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 100 mg/ml, de
aproximadamente 0,5 a aproximadamente 10 mg/l o de aproximadamente 2
a aproximadamente 3 mg/ml, respectivamente. Usando CE o cualquiera
de las técnicas de análisis indicadas anteriormente para
combinación, se pueden combinar diversas isoformas de proteína
pegilada para producir una combinación deseada de la proteína
pegilada. Por tanto, por ejemplo, una proteína pegilada combinada
puede comprender una o más de PEG-1 a
PEG-9, una o más de PEG-2 a
PEG-9, una o más de PEG-3 a
PEG-9, una o más de PEG-3 a
PEG-8, una o más de PEG-3 a
PEG-7, una o más de PEG-3 a
PEG-6, una o más de PEG-4 a
PEG-6, una o más de PEG-4 y
PEG-5, una o más de PEG-5 y
PEG-6 y PEG-5, respectivamente.
Entre las combinaciones indicadas anteriormente,
se prefieren diversas combinaciones de proteínas pegiladas. Por
ejemplo, con respecto a una combinación de PEG-4,
PEG-5 y PEG-6, la combinación de
PEG-4, PEG-5 y PEG-6
debe ser una que comprenda al menos el 70% en peso de
PEG-4, PEG-5 y PEG-6
basándose en un peso total de las isoformas de proteína pegilada en
esta combinación particular. Preferiblemente, la fracción de
proteína pegilada de PEG-4, PEG-5 y
PEG-6 es al menos aproximadamente el 75% en peso
basándose en un peso total de las isoformas de proteína pegilada
presentes en la combinación. Este valor es más preferiblemente al
menos aproximadamente el 80% en peso, al menos aproximadamente el
85% peso, al menos aproximadamente el 90% en peso y al menos
aproximadamente el 94% en peso, al menos aproximadamente el 95% en
peso, al menos aproximadamente el 96% en peso, al menos
aproximadamente el 97% en peso, al menos aproximadamente el 98% en
peso, al menos aproximadamente el 99% en peso, al menos
aproximadamente el 99,5% en peso y al menos aproximadamente el 99,9%
en peso, respectivamente.
Para la combinación, la combinación se conduce
en las isoformas de proteína pegilada recogidas en las fracciones
de CV en donde las isoformas de proteína pegilada se proporciona en
un tampón. Ese tampón en el que se proporcionan las isoformas de
proteína pegilada tiene un pH de aproximadamente 5 a aproximadamente
10, preferiblemente de aproximadamente 6,6 a aproximadamente 9 y
más preferiblemente de aproximadamente 6,9 a aproximadamente 7,1.
Además, ese tampón es uno que se selecciona entre el grupo
constituido por Tris, fosfato, HEPES, ácido cítrico, trietilamina e
histidina.
En este punto, las isoformas de proteína
pegilada combinada procesadas de acuerdo con la metodología indicada
anteriormente (también descrita en los Ejemplos 1, 3 y 4 descritos
más adelante) deben ser tales que el nivel de agregación del
producto combinado sea \leq aproximadamente el 10% en peso
basándose en un peso total de las isoformas de proteína pegilada y
cualquier agregación de las mismas que se sometió a las etapas
1-5 indicadas anteriormente siendo las etapas 2 y 3
opcionales. Preferiblemente, el nivel de agregación es \leq
aproximadamente el 9%, el 8%, el 7%, el 6%, el 5%, el 4%, el 3%, el
2%, el 1,5%, el 1%, el 0,9%, el 0,8%, el 0,7%, el 0,6%, el 0,5%, el
0,4%, el 0,3%, el 0,2%, el 0,1%, el 0,05% y el 0,01% en peso
basándose en el peso total indicado anteriormente,
respectivamente.
La proteína pegilada combinada de esta forma
básicamente está constituida de forma preferida por una o más de
PEG-1, PEG-2, PEG-3,
PEG-4, PEG-5, PEG-6,
PEG-7, PEG-8 y
PEG-9. La proteína pegilada combinada de esta forma
básicamente está constituida de forma preferida por uno o más de
PEG-2, PEG-3, PEG-4,
PEG-5, PEG-6,
PEG-7, PEG-8 y
PEG-9. La proteína pegilada combinada de esta forma
básicamente está constituida de forma preferida por uno o más de
PEG-3, PEG-4, PEG-5,
PEG-6, PEG-7, PEG-8
y PEG-9. La proteína pegilada combinada de esta
forma básicamente está constituida de forma preferida por uno o más
de PEG-3, PEG-4,
PEG-5, PEG-6, PEG-7
y PEG-8. La proteína pegilada combinada de ese modo
básicamente está constituida de forma preferida por uno o más de
PEG-3, PEG-4, PEG-5,
PEG-6 y PEG-7. La proteína pegilada
combinada de esta forma básicamente está constituida de forma
preferida por uno o más de PEG-3,
PEG-4, PEG-5 y
PEG-6. La proteína pegilada combinada de esta forma
básicamente está constituida de forma preferida por uno o más de
PEG-4, PEG-5 y
PEG-6. La proteína pegilada combinada de esta forma
básicamente está constituida de forma preferida por uno o más de
PEG-4 y PEG-5. La proteína pegilada
combinada de esta forma básicamente está constituida de forma
preferida por uno o más de PEG-5 y
PEG-6. La proteína pegilada combinada de esta forma
básicamente está constituida de forma preferida por uno o más de
PEG-5.
La metodología de combinación indicada
anteriormente se puede utilizar para combinar isoformas de proteína
pegilada independientemente de si tales isoformas se han sometido a
cromatografía de intercambio aniónico.
Cuando la proteína pegilada es un antagonista de
la hormona de crecimiento pegilado, se prefiere que el nivel de
agregación sea \leq el 6% en peso basándose en un peso total de
las isoformas del antagonista de la hormona del crecimiento
pegilado y cualquier agregación del mismo en la combinación o la
fracción de CV recogida. Más preferiblemente el nivel de agregación
es S aproximadamente el 5%, el 4%, el 3%, el 2% y el 1% en peso
basándose en el peso total indicado anteriormente, respectivamente.
Adicionalmente, cuando la proteína pegilada es un antagonista de la
hormona del crecimiento pegilado con diversas isoformas del mismo,
el "nivel total" de una suma de cualquier impureza trisulfuro,
cualquier impureza des-phe y cualquier agregación de
los mismos preferiblemente está en un nivel de \leq
aproximadamente el 15% en peso basándose en un peso total de las
isoformas del antagonista de la hormona del crecimiento pegilado,
cualquier impureza de trisulfuro, cualquier impureza
des-phe y cualquier agregación de las mismas en la
combinación o en la fracción de CV recogida. Preferiblemente, el
nivel total indicado anteriormente (de una suma de cualquier
impureza de trisulfuro, cualquier impureza des-phe
y cualquier agregación de los mismos) es \leq aproximadamente el
12%, el 10%, el 9%, el 8%, el 7%, el 6%, el 5%, el 4%, el 3%, el 2%
y el 1% en peso basándose en el peso total, respectivamente.
También preferiblemente, cuando el antagonista
de la hormona de crecimiento de proteína pegilada es
B-2036 PEG, su cadena principal polipeptídica es
B-2036 de SBQ ID Nº 1.
Después de la etapa 4 de cromatografía de AEX y
combinación, se conduce una etapa 5 de seguimiento de
ultrafiltración/diafiltración. Los parámetros preferidos para
conducir esta etapa 5 UF/DF se proporcionan en el Ejemplo 1 y en el
diagrama de flujo 1. Al final de la etapa 5, se recoge una
combinación de diafiltración. Esta combinación de diafiltración
después se somete a la etapa 6 que es tomar el ingrediente
farmacéutico activo obtenido de esta forma en la combinación de
diafiltración indicada anteriormente y esterilizarlo,
preferiblemente, mediante filtración a través de un filtro de 0,22
\mum. Los parámetros preferidos para conducir la etapa 6 de
filtración API se proporcionan en el Ejemplo 1 y en el diagrama de
flujo 1.
Finalmente, en el Ejemplo 1 más adelante, se
proporciona un procedimiento preferido para la invención
reivindicada que describe los detalles de cada una de las etapas
1-6 indicadas anteriormente, usando una etapa de
cromatografía de resina de intercambio aniónico. Con propósitos
comparativos, se proporciona un Ejemplo 2 comparativo en el que la
etapa de cromatografía de intercambio aniónico se reemplaza con una
etapa de cromatografía de intercambio catiónico junto con la etapa
de intercambio de tampón apropiada asociada con la misma. Los
resultados del procedimiento del Ejemplo 2 se proporcionan en la
Tabla 2 en la que el nivel de agregación varía desde tan alto como
aproximadamente el 60% hasta tan bajo como aproximadamente el 6% de
agregación en peso. El Ejemplo 3 describe una metodología de
combinación que es aplicable al procedimiento del Ejemplo 1 y del
diagrama de flujo 1 o al procedimiento del Ejemplo 2 y del diagrama
de flujo 2 donde se usa RPHPLC como las técnicas analíticas la cual
se compara con la técnica analítica de CE. Las figuras 2, 3 y 4
muestran que RPHPLC es equivalente a CE. El Ejemplo 4 proporciona
procedimientos preferidos para la técnica analítica de CE.
\vskip1.000000\baselineskip
1. Un procedimiento para disminuir un nivel de
agregación de un antagonista de la hormona del crecimiento pegilado
e isoformas del mismo, comprendiendo dicho procedimiento las etapas
de:
- (a)
- proporcionar dicho antagonista de la hormona de crecimiento pegilado e isoformas del mismo;
- (b)
- cargar dicho antagonista de la hormona de crecimiento pegilado e isoformas del mismo incluyendo cualquier impureza y cualquier agregación del mismo en una resina de intercambio aniónico (AEX), en el que la carga se conduce a una conductividad de menos de o igual a aproximadamente 10 mS/cm, a un pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 y a una concentración de proteína de menos de o igual a aproximadamente 10 g de proteína/l de volumen de lecho cargado de resina de AEX; y
- (c)
- separar dicho antagonista de la hormona del crecimiento pegilado e isoformas del mismo mediante cromatografía de AEX.
2. El procedimiento de la realización 1, en el
que dicha resina de AEX se selecciona entre el grupo constituido por
ANX4^{TM}, DEAE^{TM}, Q-Sefarosa^{TM}
Q-Sefarosa FF^{TM}, Q-Sefarosa
HP^{TM} y Q-Sefarosa XL^{TM}.
3. El procedimiento de la realización 1 o
realización 2, en el que, en la etapa (b), la carga se conduce a una
conductividad de menos de o igual a aproximadamente 5 mS/cm.
4. El procedimiento de la realización 1 o
realización 2, en el que, en la etapa (b), la carga se conduce a una
conductividad de menos de o igual a aproximadamente 2,4 mS/cm.
5. El procedimiento de una cualquiera de las
realizaciones 1 a 4, en el que dicha etapa (b), se conduce a un pH
de carga de AEX de aproximadamente 6,6 a aproximadamente 9.
6. El procedimiento de una cualquiera de las
realizaciones 1 a 4, en el que dicha etapa (b), se conduce a un pH
de carga de AEX de aproximadamente 6,9 a aproximadamente 7,1.
7. El procedimiento de la realización 1, en el
que dicho antagonista de la hormona de crecimiento pegilado
comprende uno o más de dichas isoformas del antagonista de la
hormona del crecimiento pegilado seleccionado entre el grupo
constituido por:
- PEG-1 (una molécula de antagonista de la hormona del crecimiento con una molécula de PEG o variante de la misma),
- PEG-2 (una molécula de antagonista de la hormona del crecimiento con dos moléculas de PEG o variante de las mismas),
- PEG-3 (una molécula de antagonista de la hormona del crecimiento con tres moléculas de PEG o variante de las mismas),
- PEG-4 (una molécula de antagonista de la hormona del crecimiento con cuatro moléculas de PEG o variante de las mismas),
- PEG-5 (una molécula de antagonista de la hormona del crecimiento con cinco moléculas de PEG o variante de las mismas),
- PEG-6 (una molécula de antagonista de la hormona del crecimiento con seis moléculas de PEG o variante de las mismas),
- PEG-7 (una molécula de antagonista de la hormona del crecimiento con siete moléculas de PEG o variante de las mismas),
- PEG-8 (una molécula de antagonista de la hormona del crecimiento con ocho moléculas de PEG o variante de las mismas), y
- PEG-9 (una molécula de antagonista de la hormona del crecimiento con nueve moléculas de PEG o variante de las mismas),
y cualquier agregación, impureza trisulfuro e
impureza des-phe del mismo y cualquier impureza no
pegilada de dicho antagonista de la hormona del crecimiento y
cualquier molécula de PEG libre.
8. El procedimiento de la realización 1,
comprendiendo además una etapa de combinación (d) para combinar
cantidades específicas de las isoformas del antagonista de la
hormona del crecimiento pegilada para producir un antagonista de la
hormona del crecimiento pegilado combinado mediante una técnica
seleccionada del grupo constituido de: electroforesis capilar (CE),
electroforesis en gel de dodecil sulfato
sódico-poliacrilamida (SDS-PAGE),
cromatografía de intercambio iónico (IEX), cromatografía de
interacción hidrófoba (HIC), cromatografía de intercambio aniónico
(AEX), cromatografía de intercambio catiónico (CEX), cromatografía
líquida de alta presión de fase inversa (RPHPLC), cromatografía
líquida de alta presión de exclusión por tamaño (SEHPLC),
cromatografía de afinidad (AC) y combinaciones de las mismas.
9. El procedimiento de la realización 8, en el
que dicho antagonista de la hormona del crecimiento pegilado
combinado comprende uno o más de PEG-1,
PEG-2, PEG-3, PEG-4,
PEG-5, PEG-6, PEG-7,
PEG-8 y PEG-9.
10. El procedimiento de la realización 9, en el
que una hormona de crecimiento pegilada combinada o una fracción del
antagonista de la hormona del crecimiento de PEG-4,
PEG-5 y PEG-6 comprende al menos
aproximadamente el 70% en peso basándose en un peso total de dichas
isoformas del antagonista de la hormona del crecimiento pegilada
PEG-1, PEG-2, PEG-3,
PEG-4, PEG-5, PEG-6,
PEG-7, PEG-8 y PEG-9
y cualquier agregación de las
mismas.
mismas.
11. El procedimiento de la realización 1, en el
que dicho nivel reducido de dicha agregación es menor que o igual a
aproximadamente el 10% en peso basándose en un peso total de dichas
isoformas y dicha agregación.
\vskip1.000000\baselineskip
Expuestas en lo sucesivo en este documento
existen determinadas realizaciones diferentes que se describen con
los propósitos de comprensión general de la invención
reivindicada:
1. Un procedimiento para disminuir un nivel de
agregación de isoformas de proteína pegilada, comprendiendo dicho
procedimiento las etapas de:
- (a)
- proporcionar dichas isoformas de proteína pegilada; y
- (c)
- separar dichas isoformas de proteína pegilada mediante cromatografía de intercambio aniónico usando una resina de intercambio aniónico en condiciones suficientes para disminuir dicho nivel de dicha agregación.
2. El procedimiento de la realización 1 en el
que dicha etapa (a) comprende la etapa de (a1) pegilar una forma no
pegilada o parcialmente pegilada de dicha proteína o pegilar
ambas.
3. El procedimiento de la realización 2 en el
que dicha etapa (a1) comprende pegilar con PEG libre seleccionado
entre el grupo constituido por
PEG-N-hidroxisuccinimida-5K,
PEG-succinimidil carbonato-5K,
PEG-succinimidil propionato-5K,
PEG2-maleimida-40K (2 x 20K),
PEG2-N-hidroxisuccinimida-40K
(2 x 20K) y PEG2-aldehído-40K (2 x
20K).
4. El procedimiento de la realización 3 en el
que una proporción en peso estequiométrica de dicho PEG libre a
dicha proteína no pegilada es de aproximadamente 0,5 a
aproximadamente 100.
5. El procedimiento de la realización 4 en el
que dicha proporción en peso estequiométrica es de aproximadamente
1,5 a aproximadamente 2,5.
6. El procedimiento de la realización 5 en el
que dicha proporción en peso estequiométrica es de aproximadamente
1,9 a aproximadamente 2.
7. El procedimiento de la realización 6 en el
que dicha proporción en peso estequiométrica es de aproximadamente
1,95 a aproximadamente 2,05.
8. El procedimiento de la realización 2 en el
que dicha etapa de pegilación (a1) se conduce a un pH de pegilación
de aproximadamente 3 a aproximadamente 10.
9. El procedimiento de la realización 8 en el
que dicho pH de pegilación es de aproximadamente 7,2 a
aproximadamente 7,8.
10. El procedimiento de la realización 9 en el
que dicho pH de pegilación es de aproximadamente 7,4 a
aproximadamente 7,8.
11. El procedimiento de la realización 10 en el
que dicho pH de pegilación es de aproximadamente 7,40 a
aproximadamente 7,80.
12. El procedimiento de la realización 2 en el
que dicha etapa de pegilación (a1) se conduce a una temperatura de
pegilación que es de aproximadamente 0 a aproximadamente 40ºC.
13. El procedimiento de la realización 12 en el
que dicha temperatura de pegilación es de aproximadamente 10 a
aproximadamente 30ºC.
14. El procedimiento de la realización 13 en el
que dicha temperatura de pegilación es de aproximadamente 18 a
aproximadamente 25ºC.
15. El procedimiento de la realización 1
comprendiendo además una etapa de HIC opcional (a2) de selección de
dicha proteína pegilada mediante cromatografía de interacción
hidrófoba (HIC) usando una resina de HIC.
16. El procedimiento de la realización 2
comprendiendo además una etapa de HIC opcional (a2) de selección de
dicha proteína pegilada mediante cromatografía de interacción
hidrófoba (HIC) usando una resina de HIC.
17. El procedimiento de la realización 16 en el
que dicha etapa de HIC (a2) comprende cargar dicha proteína pegilada
y cualquier proteína no pegilada en dicha resina de HIC a una carga
de HIC de menos de o igual a aproximadamente 10 g de proteína/l de
volumen de lecho cargado de resina de HIC.
18. El procedimiento de la realización 17 en el
que dicha carga de HIC es menor que o igual a aproximadamente 5 g de
proteína/l de volumen de lecho cargado de resina de HIC.
19. El procedimiento de la realización 18 en el
que dicha carga de HIC es menor que o igual a aproximadamente 4,1 g
de proteína/l de volumen de lecho cargado de resina de HIC.
20. El procedimiento de la realización 17 en el
que en dicha etapa de HIC (a2) dicha carga se conduce a una
conductividad de carga de HIC de aproximadamente 30 a
aproximadamente 60 mS/cm.
21. El procedimiento de la realización 20 en el
que dicha conductividad de carga de HIC es de aproximadamente 40 a
aproximadamente 52 mS/cm.
22. El procedimiento de la realización 21 en el
que dicha conductividad de carga de HIC es de aproximadamente 45 a
aproximadamente 51 mS/cm.
23. El procedimiento de la realización 17 en el
que en dicha etapa de HIC (a2) se conduce a una temperatura de HIC
de aproximadamente 10 a aproximadamente 40ºC.
24. El procedimiento de la realización 23 en el
que en dicha etapa temperatura de HIC es de aproximadamente 15 a
aproximadamente 30ºC.
25. El procedimiento de la realización 24 en el
que en dicha temperatura de HIC es de aproximadamente 18 a
aproximadamente 25ºC.
26. El procedimiento de la realización 16
comprendiendo además una etapa de UF/DF#3 (a3) de
ultrafiltración/diafiltración (UF/DF#3) de un eluyente de dicha
etapa de HIC (a2).
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
27. El procedimiento de la realización 26 en el
que dicha etapa de UF/DF#3 (a3) se conduce con una membrana de
UF/DF#3 que tiene un peso molecular de corte de membrana de UF/DF#3
(MWCO) de aproximadamente 3 kDa a aproximadamente 20 kDa.
28. El procedimiento de la realización 27 en el
que dicho MWCO de membrana de UF/DF#3 es de aproximadamente 8 kDa a
aproximadamente 15 kDa.
29. El procedimiento de la realización 28 en el
que dicho MWCO de membrana de UF/DF#3 es de aproximadamente 10 kDa a
aproximadamente 12 kDa.
30. El procedimiento de la realización 29 en el
que dicho MWCO de membrana de UF/DF#3 es aproximadamente 10 kDa.
31. El procedimiento de la realización 1 en el
que dicha etapa (b) comprende además una etapa (b1) de carga de
dicha proteína pegilada incluyendo cualquier impureza y cualquier
agregación de la misma sobre dicha resina de intercambio aniónico
(AEX) para proporcionar proteína pegilada cargada.
32. El procedimiento de la realización 31 en el
que dicha resina de AEX se selecciona entre el grupo constituido por
ANX4, DEAE, Q-Sefarosa, Q-Sefarosa
FF, Q Sefarosa HP y Q-Sefarosa XL.
33. El procedimiento de la realización 32 en el
que dicha resina de AEX es Q-Sefarosa FF.
34. El procedimiento de la realización 31 en el
que dicha etapa (b1) se conduce a una conductividad de carga de AEX
de menos de o igual a aproximadamente 10 mS/cm.
35. El procedimiento de la realización 34 en el
que dicha conductividad de carga de AEX es menor que o igual a
aproximadamente 5 mS/cm.
36. El procedimiento de la realización 35 en el
que dicha conductividad de carga de AEX es menor que o igual a
aproximadamente 2,4 mS/cm.
37. El procedimiento de la realización 31 en el
que dicha etapa (b1) se conduce a un pH de carga de AEX de
aproximadamente 5 a aproximadamente 10.
38. El procedimiento de la realización 37 en el
que dicho pH de carga de AEX es de aproximadamente 6,6 a
aproximadamente 9.
39. El procedimiento de la realización 38 en el
que dicho pH de carga de AEX es de aproximadamente 6,9 a
aproximadamente 7,1.
40. El procedimiento de la realización 31 en el
que dicha etapa (b1) se conduce a una carga de AEX de proteína
pegilada incluyendo cualquier impureza o dicha agregación de las
mismas de menos de o igual a aproximadamente 10 g de proteína/l de
volumen de lecho cargado de resina de AEX.
41. El procedimiento de la realización 40 en el
que dicha carga de AEX es menor que o igual a aproximadamente 5,5 g
de proteína/l de volumen de lecho cargado de resina de AEX.
42. El procedimiento de la realización 40, en el
que dicha carga de AEX es menor que o igual a aproximadamente 4,1 g
de proteína/l de volumen de lecho cargado de resina de AEX.
43. El procedimiento de la realización 1, en el
que dicha proteína pegilada comprende una o más de dichas isoformas
de proteína pegilada PEG-1, PEG-2,
PEG-3, PEG-4, PEG-5,
PEG-6, PEG-7, PEG-8
y PEG-9 y cualquier agregación, impureza trisulfuro
e impureza des-phe de las mismas y cualquier
impureza no pegilada de dicha proteína y cualquier molécula de PEG
libre.
44. El procedimiento de la realización 1, en el
que dicha proteína pegilada comprende una o más de dichas isoformas
de proteína pegilada PEG-2, PEG-3,
PEG-4, PEG-5, PEG-6,
PEG-7, PEG-8 y PEG-9
y cualquier agregación, impureza trisulfuro e impureza
des-phe de la misma y cualquier impureza no pegilada
de dicha proteína y cualquier molécula de PEG libre.
45. El procedimiento de la realización 1, en el
que dicha proteína pegilada comprende una o más de dichas isoformas
de proteína pegilada PEG-2, PEG-3,
PEG-4, PEG-5, PEG-6,
PEG-7, PEG-8 y cualquier agregación,
impureza trisulfuro e impureza des-phe de las mismas
y cualquier impureza no pegilada de dicha proteína y cualquier
molécula de PEG libre.
46. El procedimiento de la realización 1, en el
que dicha proteína pegilada comprende una o más de dichas isoformas
de proteína pegilada PEG-3, PEG-4,
PEG-5, PEG-6, PEG-7,
PEG-8 y cualquier agregación, impureza trisulfuro e
impureza des-phe de las mismas y cualquier impureza
no pegilada de dicha proteína y cualquier molécula de PEG libre.
\global\parskip1.000000\baselineskip
47. El procedimiento de la realización 1, en el
que dicha proteína pegilada comprende una o más de dichas isoformas
de proteína pegilada PEG-4, PEG-5,
PEG-6, PEG-7, PEG-8
y cualquier agregación, impureza trisulfuro e impureza
des-phe de las mismas y cualquier impureza no
pegilada de dicha proteína y cualquier molécula de PEG libre.
48. El procedimiento de la realización 1, en el
que dicha proteína pegilada comprende una o más de dichas isoformas
de proteína pegilada PEG-4, PEG-5,
PEG-6, PEG-7 y cualquier agregación,
impureza trisulfuro e impureza des-phe de las mismas
y cualquier impureza no pegilada de dicha proteína y cualquier
molécula de PEG libre.
49. El procedimiento de la realización 1, en el
que dicha proteína pegilada comprende una o más de dichas isoformas
de proteína pegilada PEG-4, PEG-5,
PEG-6 y cualquier agregación, impureza trisulfuro e
impureza des-phe de las mismas y cualquier impureza
no pegilada de dicha proteína y cualquier molécula de PEG libre.
50. El procedimiento de la realización 1, en el
que dicha proteína pegilada comprende una o más de dichas isoformas
de proteína pegilada PEG-4, PEG-5,
PEG-6 y cualquier agregación, impureza trisulfuro e
impureza des-phe de la misma y cualquier impureza no
pegilada de dicha proteína.
51. El procedimiento de la realización 1, en el
que dicha proteína pegilada comprende una o más de dichas isoformas
de proteína pegilada PEG-1, PEG-2,
PEG-3, PEG-4, PEG-5,
PEG-6, PEG-7, PEG-8
y PEG-9 y cualquier agregación, impureza trisulfuro
e impureza des-phe de las mismas.
52. El procedimiento de la realización 1, en el
que dicha proteína pegilada comprende una o más de dichas isoformas
de proteína pegilada PEG-1, PEG-2,
PEG-3, PEG-4, PEG-5,
PEG-6, PEG-7, PEG-8
y PEG-9 y cualquier agregación e impureza trisulfuro
de las mismas.
53. El procedimiento de la realización 1, en el
que dicha proteína pegilada comprende una o más de dichas isoformas
de proteína pegilada PEG-1, PEG-2,
PEG-3, PEG-4, PEG-5,
PEG-6, PEG-7, PEG-8
y PEG-9 y cualquier agregación de las mismas.
54. El procedimiento de la realización 1,
comprendiendo además una etapa de combinación (c) para combinar
cantidades específicas de dichas isoformas de proteína pegilada para
producir una proteína pegilada combinada mediante una técnica
seleccionada entre el grupo constituido por electroforesis capilar
(CE) electroforesis en gel de dodecil sulfato
sódico-poliacrilamida (SDS-PAGE),
cromatografía de intercambio iónico (IEX), cromatografía de
interacción hidrófoba (HIC), cromatografía de intercambio aniónico
(AEX), cromatografía de intercambio catiónico (CEX), cromatografía
líquida de alta presión de fase inversa (RPHPLC), cromatografía
líquida de alta presión de exclusión por tamaño (SEHPLC),
cromatografía de afinidad (AC) y combinaciones de las mismas.
55. El procedimiento de la realización 42,
comprendiendo además una etapa de combinación (c) para combinar
cantidades específicas de dichas isoformas de proteína pegilada de
dicha proteína pegilada para producir una proteína pegilada
combinada mediante una técnica seleccionada entre el grupo
constituido por electroforesis capilar (CE) electroforesis en gel de
dodecil sulfato sódico-poliacrilamida
(SDS-PAGE), cromatografía de intercambio iónico
(IEX), cromatografía de interacción hidrófoba (HIC), cromatografía
de intercambio aniónico (AEX), cromatografía de intercambio
catiónico (CEX), cromatografía líquida de alta presión de fase
inversa (HPLC), cromatografía líquida de alta presión de exclusión
por tamaño (SEHPLC) y cromatografía de afinidad (AC) y combinaciones
de las mismas.
56. El procedimiento de la realización 54 en el
que dicha etapa de combinación (c) se conduce mediante dicha CE a
una temperatura de CE de aproximadamente 5 a aproximadamente
50ºC.
57. El procedimiento de la realización 55 en el
que dicha etapa de combinación (c) se conduce mediante dicha CE a
una temperatura de CE de aproximadamente 5 a aproximadamente
50ºC.
58. El procedimiento de la realización 56 en el
que dicha temperatura de CE es de aproximadamente 5 a
aproximadamente 45ºC.
59. El procedimiento de la realización 58 en el
que dicha temperatura de CE es de aproximadamente 20 a
aproximadamente 40ºC.
60. El procedimiento de la realización 59 en el
que dicha temperatura de CE es de aproximadamente 30 a
aproximadamente 32ºC.
61. El procedimiento de la realización 56 en el
que dicha etapa de combinación (c) se conduce mediante dicha CE a
una conductividad de combinación de CE de aproximadamente 0 a
aproximadamente 60 mS/cm.
62. El procedimiento de la realización 61 en el
que dicha conductividad de combinación de CE es de aproximadamente 5
a aproximadamente 10 mS/cm.
\newpage
63. El procedimiento de la realización 54 en el
que dicha etapa de combinación (c) se conduce en dichas isoformas de
proteína pegilada proporcionadas en un tampón a una concentración de
proteína de al menos aproximadamente 0,2 mg/ml.
64. El procedimiento de la realización 56 en el
que dicha etapa de combinación (c) se conduce en dichas isoformas de
proteína pegilada proporcionadas en un tampón a una concentración de
proteína de al menos aproximadamente 0,5 mg/ml.
65. El procedimiento de la realización 54 en el
que dicha etapa de combinación (c) se conduce en dichas isoformas de
proteína pegilada proporcionadas en un tampón a una concentración de
proteína de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 100 mg/ml.
66. El procedimiento de la realización 65 en el
que dicha concentración de proteína es de aproximadamente 0,5 a
aproximadamente 10 mg/ml.
67. El procedimiento de la realización 66 en el
que dicha concentración de proteína es de aproximadamente 2 a
aproximadamente 3 mg/ml.
68. El procedimiento de la realización 56 en el
que dicha etapa de combinación (c) se conduce en dichas isoformas de
proteína pegilada proporcionadas en un tampón a una concentración de
proteína de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 100 mg/ml.
69. El procedimiento de la realización 67 en el
que dicha concentración de proteína es de aproximadamente 0,5 a
aproximadamente 10 mg/ml.
70. El procedimiento de la realización 68 en el
que dicha concentración de proteína es de aproximadamente 2 a
aproximadamente 3 mg/ml.
71. El procedimiento de la realización 63 en el
que dicha proteína pegilada combinada comprende uno o más de
PEG-1, PEG-2, PEG-3,
PEG-4, PEG-5, PEG-6,
PEG-7, PEG-8 y
PEG-9.
72. El procedimiento de la realización 63 en el
que dicha proteína pegilada combinada comprende uno o más de
PEG-2, PEG-3, PEG-4,
PEG-5, PEG-6, PEG-7,
PEG-8 y PEG-9.
73. El procedimiento de la realización 63 en el
que dicha proteína pegilada combinada comprende uno o más de
PEG-3, PEG-4, PEG-5,
PEG-6, PEG-7, PEG-8
y PEG-9.
74. El procedimiento de la realización 63 en el
que dicha proteína pegilada combinada comprende uno o más de
PEG-3, PEG-4, PEG-5,
PEG-6, PEG-7 y
PEG-8.
75. El procedimiento de la realización 63 en el
que dicha proteína pegilada combinada comprende uno o más de
PEG-3, PEG-4, PEG-5,
PEG-6 y PEG-7.
76. El procedimiento de la realización 63 en el
que dicha proteína pegilada combinada comprende uno o más de
PEG-3, PEG-4, PEG-5
y PEG-6.
77. El procedimiento de la realización 63 en el
que dicha proteína pegilada combinada comprende uno o más de
PEG-4, PEG-5 y
PEG-6.
78. El procedimiento de la realización 63 en el
que dicha proteína pegilada combinada comprende uno o más de
PEG-4 y PEG-5.
79. El procedimiento de la realización 63 en el
que dicha proteína pegilada combinada comprende uno o más de
PEG-5 y PEG-6.
80. El procedimiento de la realización 63 en el
que dicha proteína pegilada combinada comprende
PEG-5.
81. El procedimiento de la realización 71 en el
que una fracción de proteína pegilada combinada de
PEG-4, PEG-5 y PEG-6
comprende al menos aproximadamente el 70% en peso basándose en un
peso total de dichas isoformas de proteína pegilada
PEG-1, PEG-2, PEG-3,
PEG-4, PEG-5, PEG-6,
PEG-7, PEG-8 y PEG-9
y cualquier agregación de las mismas.
82. El procedimiento de la realización 71 en el
que dicha fracción de proteína pegilada combinada de
PEG-4, PEG-5 y PEG-6
comprende al menos aproximadamente el 75% en peso basándose en un
peso total de dichas isoformas de proteína pegilada
PEG-1, PEG-2, PEG-3,
PEG-4, PEG-5, PEG-6,
PEG-7, PEG-8 y PEG-9
y cualquier agregación de las mismas.
\newpage
83. El procedimiento de la realización 71 en el
que dicha fracción de proteína pegilada combinada de
PEG-4, PEG-5 y PEG-6
comprende al menos aproximadamente el 80% en peso basándose en un
peso total de dichas isoformas de proteína pegilada
PEG-1, PEG-2, PEG-3,
PEG-4, PEG-5, PEG-6,
PEG-7, PEG-8 y PEG-9
y cualquier agregación de las mismas.
84. El procedimiento de la realización 71 en el
que dicha fracción de proteína pegilada combinada de
PEG-4, PEG-5 y PEG-6
comprende al menos aproximadamente el 90% en peso basándose en un
peso total de dichas isoformas de proteína pegilada
PEG-1, PEG-2, PEG-3,
PEG-4, PEG-5, PEG-6,
PEG-7, PEG-8 y PEG-9
y cualquier agregación de las mismas.
85. El procedimiento de la realización 71 en el
que dicha fracción de proteína pegilada combinada de
PEG-4, PEG-5 y PEG-6
comprende al menos aproximadamente el 94% en peso basándose en un
peso total de dichas isoformas de proteína pegilada
PEG-1, PEG-2, PEG-3,
PEG-4, PEG-5, PEG-6,
PEG-7, PEG-8 y PEG-9
y cualquier agregación de las mismas.
86. El procedimiento de la realización 64 en el
que dicho tampón en el que dicha proteína pegilada se proporciona
tiene un pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 10.
87. El procedimiento de la realización 86 en el
que dicho tampón tiene un pH de aproximadamente 6,6 a
aproximadamente 9.
88. El procedimiento de la realización 87 en el
que dicho tampón tiene un pH de aproximadamente 6,9 a
aproximadamente 7,1.
89. El procedimiento de la realización 64 en el
que dicho tampón en el que se proporciona dicha proteína pegilada se
selecciona entre el grupo constituido por Tris, fosfato, HEPES,
ácido cítrico, trietilamina e histidina.
90. El procedimiento de la realización 1 en el
que dicho nivel de dicha agregación es menor que o igual a
aproximadamente el 10% en peso basándose en un peso total de dichas
isoformas y dicha agregación.
91. El procedimiento de la realización 90 en el
que dicho nivel de dicha agregación es menor que o igual a
aproximadamente el 9% en peso basándose en dicho peso total.
92. El procedimiento de la realización 91 en el
que dicho nivel de dicha agregación es menor que o igual a
aproximadamente el 8% en peso basándose en dicho peso total.
93. El procedimiento de la realización 92 en el
que dicho nivel de dicha agregación es menor que o igual a
aproximadamente el 7% en peso basándose en dicho peso total.
94. El procedimiento de la realización 93 en el
que dicho nivel de dicha agregación es menor que o igual a
aproximadamente el 6% en peso basándose en dicho peso total.
95. El procedimiento de la realización 94 en el
que dicho nivel de dicha agregación es menor que o igual a
aproximadamente el 5% en peso basándose en dicho peso total.
96. El procedimiento de la realización 95 en el
que dicho nivel de dicha agregación es menor que o igual a
aproximadamente el 4% en peso basándose en dicho peso total.
97. El procedimiento de la realización 96 en el
que dicho nivel de dicha agregación es menor que o igual a
aproximadamente el 3% en peso basándose en dicho peso total.
98. El procedimiento de la realización 97 en el
que dicho nivel de dicha agregación es menor que o igual a
aproximadamente el 2% en peso basándose en dicho peso total.
99. El procedimiento de la realización 98 en el
que dicho nivel de dicha agregación es menor que o igual a
aproximadamente el 1,5% en peso basándose en dicho peso total.
100. El procedimiento de la realización 99 en el
que dicho nivel de dicha agregación es menor que o igual a
aproximadamente el 1% en peso basándose en dicho peso total.
101. El procedimiento de la realización 100 en
el que dicho nivel de dicha agregación es menor que o igual a
aproximadamente el 0,9% en peso basándose en dicho peso total.
102. El procedimiento de la realización 101 en
el que dicho nivel de dicha agregación es menor que o igual a
aproximadamente el 0,8% en peso basándose en dicho peso total.
103. El procedimiento de la realización 102 en
el que dicho nivel de dicha agregación es menor que o igual a
aproximadamente el 0,7% en peso basándose en dicho peso total.
104. El procedimiento de la realización 103 en
el que dicho nivel de dicha agregación es menor que o igual a
aproximadamente el 0,6% en peso basándose en dicho peso total.
105. El procedimiento de la realización 104 en
el que dicho nivel de dicha agregación es menor que o igual a
aproximadamente el 0,5% en peso basándose en dicho peso total.
106. El procedimiento de la realización 105 en
el que dicho nivel de dicha agregación es menor que o igual a
aproximadamente el 0,4% en peso basándose en dicho peso total.
107. El procedimiento de la realización 106 en
el que dicho nivel de dicha agregación es menor que o igual a
aproximadamente el 0,3% en peso basándose en dicho peso total.
108. El procedimiento de la realización 107 en
el que dicho nivel de dicha agregación es menor que o igual a
aproximadamente el 0,2% en peso basándose en dicho peso total.
109. El procedimiento de la realización 108 en
el que dicho nivel de dicha agregación es menor que o igual a
aproximadamente el 0,1% en peso basándose en dicho peso total.
110. El procedimiento de la realización 109 en
el que dicho nivel de dicha agregación es menor que o igual a
aproximadamente el 0,05% en peso basándose en dicho peso total.
111. El procedimiento de la realización 110 en
el que dicho nivel de dicha agregación es menor que o igual a
aproximadamente el 0,01% en peso basándose en dicho peso total.
112. El procedimiento de la realización 31 en el
que dicha etapa (b) que comprende además una etapa (b2) de lavado de
dicha proteína pegilada cargada seguido de una etapa (b3) de elución
con una solución eluyente de dicha proteína pegilada cargada
mediante un gradiente de pH o un gradiente de fuerza iónica y una
etapa (b4) de recolección de un eluyente en múltiples fracciones de
volumen.
113. El procedimiento de la realización 31 en el
que dicha etapa (b) comprende además una etapa (b2) de lavado de
dicha proteína pegilada cargada seguido de una etapa de elución (b3)
para eluir dicha proteína pegilada cargada con una solución salina
en un tampón de elución que contiene una sal iónica en un gradiente
de concentración de sal suficiente para eluir dicha proteína
pegilada cargada de dicha resina de AEX.
114. El procedimiento de la realización 113 en
el que dicha sal iónica es una sal de cloruro.
115. El procedimiento de la realización 114 en
el que dicha sal iónica es NaCl.
116. El procedimiento de la realización 115 en
el que dicha etapa (b) se conduce en una columna que tiene un
volumen de columna (CV) y en el que dicho gradiente de concentración
de sal es de aproximadamente 2 a aproximadamente 50 mM por CV.
117. El procedimiento de la realización 116 en
el que dicho gradiente de concentración de sal es de aproximadamente
5 a aproximadamente 25 mM por CV.
118. El procedimiento de la realización 117 en
el que dicho gradiente de concentración de sal es de aproximadamente
10 a aproximadamente 20 mM por CV.
119. El procedimiento de la realización 113 en
el que dicho tampón de elución tiene un pH de aproximadamente 5 a
aproximadamente 10.
120. El procedimiento de la realización 119 en
el que dicho tampón de elución tiene un pH de aproximadamente 6,6 a
aproximadamente 9.
121. El procedimiento de la realización 120 en
el que dicho tampón de elución tiene un pH de aproximadamente 6,9 a
aproximadamente 7,1.
122. El procedimiento de la realización 113 en
la que dicha etapa de elución (b) se conduce a una temperatura de
elución de menos de o igual a 50ºC.
123. El procedimiento de la realización 122 en
el que dicha temperatura de elución es menor que o igual a
aproximadamente 35ºC.
124. El procedimiento de la realización 123 en
el que dicha temperatura de elución es de aproximadamente 2 a
aproximadamente 30ºC.
125. El procedimiento de la realización 123 en
el que dicha temperatura de elución es de aproximadamente 15 a
aproximadamente 30ºC.
126. El procedimiento de la realización 123 en
el que dicha temperatura de elución es de aproximadamente 18 a
aproximadamente 25ºC.
127. El procedimiento de la realización 113 en
el que dicha etapa (b) se conduce en una columna y en el que dicho
tampón de elución tiene una velocidad lineal a través de dicha
columna de menos que o igual a aproximadamente 300 cm/h.
128. El procedimiento de la realización 127 en
el que dicha velocidad lineal es de aproximadamente 10 a
aproximadamente 150 cm/h.
129. El procedimiento de la realización 127 en
el que dicha velocidad lineal es de aproximadamente 30 a
aproximadamente 150 cm/h.
130. El procedimiento de la realización 127 en
el que dicha velocidad lineal es de aproximadamente 50 a
aproximadamente 100 cm/h.
131. El procedimiento de la realización 127 en
el que dicha velocidad lineal es de aproximadamente 50 a
aproximadamente 70 cm/h.
132. El procedimiento de la realización 127 en
el que dicha velocidad lineal es de aproximadamente 60 a
aproximadamente 65 cm/h.
133. El procedimiento de la realización 127 en
el que dicha velocidad lineal es de aproximadamente 60 cm/h.
134. El procedimiento de la realización 1 en el
que dicha proteína pegilada se selecciona entre el grupo constituido
por hormona, hormona del crecimiento, hormona del crecimiento
humana, antagonista de la hormona del crecimiento, antagonista de la
hormona del crecimiento humana, un anticuerpo y
B-2036 PEG.
135. El procedimiento de la realización 1 en el
que dicha resina de intercambio aniónico (AEX) comprende grupos
funcionales seleccionados entre el grupo constituido por aminas
primarias, secundarias, terciarias, cuaternarias y combinaciones de
las mismas.
136. El procedimiento de la realización 1 en el
que dicha resina de intercambio aniónico (AEX) comprende grupos
funcionales seleccionados entre el grupo constituido por grupos
funcionales de dietilaminoetilo, dietilaminopropilo,
dimetiletanolamina,
trimetil-amonio-etilo,
trimetilbenzil amonio, dimetiletanol benzilo y poliamina.
137. El procedimiento de la realización 1 en el
que dicha resina de intercambio aniónico (AEX) comprende un material
de soporte seleccionado entre el grupo constituido por poliéter
hidrófilo, divinil benceno poliesterieno reticulado, agarosa
reticulada, polipropileno, acrilamidovinil hidrófilo, metacrílico,
hidrogel polimerizado con una base de perla cerámica, material
compuesto de sílice-dextrano, sílice injertado con
polímero, divinil benceno estireno, divinil benceno poliacrílico,
celulosa reticulada, co-polímero de metacrilato,
poliestireno, acrílico, gel hidrófilo G5000 y celulosa.
138. El procedimiento de la realización 1 en el
que dicha resina de intercambio aniónico (AEX) comprende una resina
macroporosa.
139. El procedimiento de la realización 1 en el
que dicha resina de intercambio aniónico (AEX) comprende una resina
en gel.
140. El procedimiento de la realización 63 en el
que dicha proteína pegilada combinada está constituida esencialmente
por uno o más de PEG-1, PEG-2,
PEG-3, PEG-4, PEG-5,
PEG-6, PEG-7, PEG-8
y PEG-9.
141. El procedimiento de la realización 63 en el
que dicha proteína pegilada combinada está constituida esencialmente
por uno o más de PEG-2, PEG-3,
PEG-4, PEG-5, PEG-6,
PEG-7, PEG-8 y
PEG-9.
142. El procedimiento de la realización 63 en el
que dicha proteína pegilada combinada está constituida esencialmente
por uno o más de PEG-3, PEG-4,
PEG-5, PEG-6, PEG-7,
PEG-8 y PEG-9.
143. El procedimiento de la realización 63 en el
que dicha proteína pegilada combinada está constituida esencialmente
por uno o más de PEG-3, PEG-4,
PEG-5, PEG-6, PEG-7
y PEG-8.
144. El procedimiento de la realización 63 en el
que dicha proteína pegilada combinada está constituida esencialmente
por uno o más de PEG-3, PEG-4,
PEG-5, PEG-6 y
PEG-7
145. El procedimiento de la realización 63 en el
que dicha proteína pegilada combinada está constituida esencialmente
por uno o más de PEG-3, PEG-4,
PEG-5 y PEG-6.
\newpage
146. El procedimiento de la realización 63 en el
que dicha proteína pegilada combinada está constituida esencialmente
por uno o más de PEG-4, PEG-5 y
PEG-6.
147. El procedimiento de la realización 63 en el
que dicha proteína pegilada combinada está constituida esencialmente
por uno o más de PEG-4 y PEG-5.
148. El procedimiento de la realización 63 en el
que dicha proteína pegilada combinada está constituida esencialmente
por uno o más de PEG-5 y PEG-6.
149. El procedimiento de la realización 63 en el
que dicha proteína pegilada combinada está constituida esencialmente
por PEG-5.
150. El procedimiento de la realización 31 en el
que dicha etapa (b) se conduce en una columna que tiene un volumen
de columna (CV) y en el que dicha etapa (b) comprende además una
etapa (b2) de lavado de dicha proteína pegilada cargada seguido por
una etapa (b3) de elución con una solución eluyente de dicha
proteína pegilada cargada mediante un gradiente de pH o un gradiente
de fuerza iónica y una etapa (b4) de recolección de un eluyente en
múltiples fracciones de volumen de aproximadamente 0,1 a
aproximadamente 5 de dicho volumen de
columna (CV).
columna (CV).
151. El procedimiento de la realización 31 en el
que dicha etapa (b) se conduce en una columna que tiene un volumen
de columna (CV) y en el que dicha etapa (b) comprende además una
etapa (b2) de lavado de dicha proteína pegilada cargada seguido por
una etapa (b3) de elución con una solución eluyente de dicha
proteína pegilada cargada mediante un gradiente de pH o un gradiente
de fuerza iónica y una etapa (b4) de recolección de un eluyente en
múltiples fracciones de volumen de aproximadamente 0,1 a
aproximadamente 1 de dicho volumen de
columna (CV).
columna (CV).
152. El procedimiento de la realización 31 en el
que dicha etapa (b) se conduce en una columna que tiene un volumen
de columna (CV) y en el que dicha etapa (b) comprende además una
etapa (b2) de lavado de dicha proteína pegilada cargada seguido por
una etapa (b3) de elución con una solución eluyente de dicha
proteína pegilada cargada mediante un gradiente de pH o un gradiente
de fuerza iónica y una etapa (b4) de recolección de un eluyente en
múltiples fracciones de volumen de aproximadamente 0,1 a
aproximadamente 0,5 de dicho volumen de columna (CV).
153. El procedimiento de la realización 31 en el
que dicha etapa (b) se conduce en una columna que tiene un volumen
de columna (CV) y en el que dicha etapa (b) comprende además una
etapa (b2) de lavado de dicha proteína pegilada cargada seguido por
una etapa (b3) de elución con una solución eluyente de dicha
proteína pegilada cargada mediante un gradiente de pH o un gradiente
de fuerza iónica y una etapa (b4) de recolección de un eluyente en
múltiples fracciones de volumen de aproximadamente 0,1 a
aproximadamente 0,2 de dicho volumen de columna (CV).
154. El procedimiento de la realización 113 en
el que dicha sal iónica se selecciona entre el grupo constituido por
NaCl, cloruro de litio, fosfato de Na, sulfato de Na, cloruro de
amonio, sulfato de amonio, fosfato de amonio, Kl y KCl.
155. El procedimiento de la realización 118 en
el que dicho gradiente de concentración de sal es de aproximadamente
10 a aproximadamente 12,5 mM por CV.
156. Un procedimiento para combinar isoformas de
proteína pegilada, comprendiendo dicho procedimiento la etapa
de:
- (a)
- separar y recoger dichas isoformas de proteína pegilada mediante una técnica seleccionada entre el grupo constituido por electroforesis capilar (CE), electroforesis en gel de dodecil sulfato sódico-poliacrilamida (SDS-PAGE), cromatografía de intercambio iónico (IEX), cromatografía de interacción hidrófoba (HIC), cromatografía de intercambio aniónico (AEX), cromatografía de intercambio catiónico (CEX), cromatografía líquida de alta presión de fase inversa (RPHPLC), cromatografía líquida de alta presión de exclusión por tamaño (SEHPLC), cromatografía de afinidad (AC) y combinaciones de las mismas.
157. El procedimiento de la realización 140 en
el que dicha técnica es RPHPLC o CE.
158. Un procedimiento para disminuir un nivel de
agregación de isoformas de antagonista de la hormona del crecimiento
pegiladas que tienen un peso total de dichas isoformas y dicha
agregación, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
- a)
- proporcionar dichas isoformas de antagonista de la hormona del crecimiento pegiladas; y
- b)
- separar dichas isoformas de antagonista de la hormona del crecimiento pegiladas en una resina de intercambio aniónico (AEX) mediante cromatografía de intercambio aniónico en condiciones suficientes para disminuir dicho nivel de dicha agregación hasta menos de o igual a aproximadamente el 6% en peso basándose en dicho peso total.
159. El procedimiento de la realización 158 en
el que las condiciones son suficientes para disminuir dicho nivel de
dicha agregación hasta menos de o igual a aproximadamente el 5% en
peso basándose en dicho peso total.
160. El procedimiento de la realización 158 en
el que las condiciones son suficientes para disminuir dicho nivel de
dicha agregación hasta menos de o igual a aproximadamente el 4% en
peso basándose en dicho peso total.
161. El procedimiento de la realización 158 en
el que las condiciones son suficientes para disminuir dicho nivel de
dicha agregación hasta menos de o igual a aproximadamente el 3% en
peso basándose en dicho peso total.
162. El procedimiento de la realización 158 en
el que las condiciones son suficientes para disminuir dicho nivel de
dicha agregación hasta menos de o igual a aproximadamente el 2% en
peso basándose en dicho peso total.
163. El procedimiento de la realización 158 en
el que las condiciones son suficientes para disminuir dicho nivel de
dicha agregación hasta menos de o igual a aproximadamente el 1% en
peso basándose en dicho peso total.
164. Un procedimiento para disminuir un nivel
total de una suma de cualquier impureza trisulfuro, cualquier
impureza des-phe y cualquier agregación de isoformas
de antagonista de la hormona del crecimiento pegiladas que tienen un
peso total de dichas isoformas, dichas impurezas y dicha agregación,
comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
- a)
- proporcionar dichas isoformas de antagonista de la hormona del crecimiento pegiladas; y
- b)
- separar dichas isoformas de antagonista de la hormona del crecimiento pegiladas en una resina de intercambio aniónico (AEX) mediante cromatografía de intercambio aniónico en condiciones suficientes para disminuir dicho nivel total de cualquiera de dicha impureza trisulfuro, cualquiera de dicha impureza des-phe y cualquiera de dicha agregación hasta menos de o igual a aproximadamente el 15% en peso basándose en dicho peso total.
165. El procedimiento de la realización 164 en
el que las condiciones son suficientes para disminuir dicho nivel
total de cualquier dicha impureza trisulfuro, cualquier dicha
impureza des-phe y cualquier dicha agregación hasta
menos de o igual a aproximadamente el 12% en peso basándose en dicho
peso total.
166. El procedimiento de la realización 164 en
el que las condiciones son suficientes para disminuir dicho nivel
total de cualquier dicha impureza trisulfuro, cualquier dicha
impureza des-phe y cualquier dicha agregación hasta
menos de o igual a aproximadamente el 10% en peso basándose en dicho
peso total.
167. El procedimiento de la realización 164 en
el que las condiciones son suficientes para disminuir dicho nivel
total de cualquier dicha impureza trisulfuro, cualquier dicha
impureza des-phe y cualquier dicha agregación hasta
menos de o igual a aproximadamente el 9% en peso basándose en dicho
peso total.
168. El procedimiento de la realización 164 en
el que las condiciones son suficientes para disminuir dicho nivel
total de cualquier dicha impureza trisulfuro, cualquier dicha
impureza des-phe y cualquier dicha agregación hasta
menos de o igual a aproximadamente el 8% en peso basándose en dicho
peso total.
169. El procedimiento de la realización 164 en
el que las condiciones son suficientes para disminuir dicho nivel
total de cualquier dicha impureza trisulfuro, cualquier dicha
impureza des-phe y cualquier dicha agregación hasta
menos de o igual a aproximadamente el 7% en peso basándose en dicho
peso total.
170. El procedimiento de la realización 164 en
el que las condiciones son suficientes para disminuir dicho nivel
total de cualquier dicha impureza trisulfuro, cualquier dicha
impureza des-phe y cualquier dicha agregación hasta
menos de o igual a aproximadamente el 6% en peso basándose en dicho
peso total.
171. El procedimiento de la realización 164 en
el que las condiciones son suficientes para disminuir dicho nivel
total de cualquier dicha impureza trisulfuro, cualquier dicha
impureza des-phe y cualquier dicha agregación hasta
menos de o igual a aproximadamente el 5% en peso basándose en dicho
peso total.
172. El procedimiento de la realización 164 en
el que las condiciones son suficientes para disminuir dicho nivel
total de cualquier dicha impureza trisulfuro, cualquier dicha
impureza des-phe y cualquier dicha agregación hasta
menos de o igual a aproximadamente el 4% en peso basándose en dicho
peso total.
173. El procedimiento de la realización 164 en
el que las condiciones son suficientes para disminuir dicho nivel
total de cualquier dicha impureza trisulfuro, cualquier dicha
impureza des-phe y cualquier dicha agregación hasta
menos de o igual a aproximadamente el 3% en peso basándose en dicho
peso total.
174. El procedimiento de la realización 164 en
el que las condiciones son suficientes para disminuir dicho nivel
total de cualquier dicha impureza trisulfuro, cualquier dicha
impureza des-phe y cualquier dicha agregación hasta
menos de o igual a aproximadamente el 2% en peso basándose en dicho
peso total.
175. El procedimiento de la realización 164 en
el que las condiciones son suficientes para disminuir dicho nivel
total de cualquier dicha impureza trisulfuro, cualquier dicha
impureza des-phe y cualquier dicha agregación hasta
menos de o igual a aproximadamente el 1% en peso basándose en dicho
peso total.
176. El procedimiento de la realización 134 en
el que dicho antagonista de la hormona del crecimiento es
B-2036 PEG en el que dicho B-2036
PEG comprende una cadena principal de polipéptido antagonista de la
hormona del crecimiento de B-2036 de [SEC ID Nº
1].
177. El procedimiento de la realización 134 en
el que dicha hormona del crecimiento es una forma pegilada de un
polipéptido de [SEC ID Nº 2]
178. El procedimiento de la realización 137 en
el que dicho material de soporte tiene un diámetro de
aproximadamente 10 a aproximadamente 500 \mum.
179. El procedimiento de la realización 178 en
el que dicho diámetro tiene un promedio de 90 \mum.
180. Un procedimiento para combinar isoformas de
proteína pegilada, comprendiendo dicho procedimiento las etapas
de:
- (a)
- separar dichas isoformas de proteína pegilada en isoformas seleccionadas; y
- (b)
- combinar dichas isoformas seleccionadas para producir una combinación enriquecida de dichas isoformas seleccionadas.
181. El procedimiento de la realización 180 en
el que dichas isoformas seleccionadas son PEG-4,
PEG-5 y PEG-6 con una proporción en
peso combinada de ((un primer peso de PEG-4 +
PEG-5 + PEG-6)/(un segundo peso de
cualquier PEG-1 + PEG-2 +
PEG-3 + PEG-4 +
PEG-5 + PEG-6 +
PEG-7 + PEG-8 +
PEG-9 presente en dicha combinación enriquecida)),
proporción en peso combinada que es mayor que o igual a
aproximadamente el 70% en peso.
182. El procedimiento de la realización 181 en
el que dicha proporción en peso combinada es mayor que o igual a
aproximadamente el 75% en peso.
183. El procedimiento de la realización 181 en
el que dicha proporción en peso combinada es mayor que o igual a
aproximadamente el 80% en peso.
184. El procedimiento de la realización 181 en
el que dicha proporción en peso combinada es mayor que o igual a
aproximadamente el 85% en peso.
185. El procedimiento de la realización 181 en
el que dicha proporción en peso combinada es mayor que o igual a
aproximadamente el 90% en peso.
186. El procedimiento de la realización 181 en
el que dicha proporción en peso combinada es mayor que o igual a
aproximadamente el 94% en peso.
187. El procedimiento de la realización 181 en
el que dicha proporción en peso combinada es mayor que o igual a
aproximadamente el 95% en peso.
188. El procedimiento de la realización 181 en
el que dicha proporción en peso combinada es mayor que o igual a
aproximadamente el 96% en peso.
189. El procedimiento de la realización 181 en
el que dicha proporción en peso combinada es mayor que o igual a
aproximadamente el 97% en peso.
190. El procedimiento de la realización 181 en
el que dicha proporción en peso combinada es mayor que o igual a
aproximadamente el 98% en peso.
191. El procedimiento de la realización 181 en
el que dicha proporción en peso combinada es mayor que o igual a
aproximadamente el 99% en peso.
192. El procedimiento de la realización 181 en
el que dicha proporción en peso combinada es mayor que o igual a
aproximadamente el 99,5% en peso.
193. El procedimiento de la realización 181 en
el que dicha proporción en peso combinada es mayor que o igual a
aproximadamente el 99,9% en peso.
194. El procedimiento de la realización 180 en
el que dichas isoformas seleccionadas son una o más de
PEG-1, PEG-2, PEG-3,
PEG-4, PEG-5, PEG-6,
PEG-7, PEG-8 y
PEG-9.
195. El procedimiento de la realización 180 en
el que dichas isoformas seleccionadas son una o más de
PEG-2, PEG-3, PEG-4,
PEG-5, PEG-6, PEG-7,
PEG-8 y PEG-9.
196. El procedimiento de la realización 180 en
el que dichas isoformas seleccionadas son una o más de
PEG-3, PEG-4, PEG-5,
PEG-6, PEG-7, PEG-8
y PEG-9.
197. El procedimiento de la realización 180 en
el que dichas isoformas seleccionadas son una o más de
PEG-4, PEG-5, PEG-6,
PEG-7, PEG-8 y
PEG-9.
198. El procedimiento de la realización 180 en
el que dichas isoformas seleccionadas son una o más de
PEG-4, PEG-5, PEG-6,
PEG-7 y PEG-8.
199. El procedimiento de la realización 180 en
el que dichas isoformas seleccionadas son una o más de
PEG-4, PEG-5, PEG-6
y PEG-7.
200. El procedimiento de la realización 180 en
el que dichas isoformas seleccionadas son una o más de
PEG-4, PEG-5 y
PEG-6.
201. El procedimiento de la realización 180 en
el que dichas isoformas seleccionadas son una o más de
PEG-4 y PEG-5.
202. El procedimiento de la realización 180 en
el que dichas isoformas seleccionadas son una o más de
PEG-5 y PEG-6.
203. El procedimiento de la realización 180 en
el que dichas isoformas seleccionadas son una o más de
PEG-4 y PEG-6.
204. Un procedimiento para obtener una isoforma
de proteína pegilada seleccionada a partir de una mezcla de al menos
dos isoformas de proteína pegilada, comprendiendo dicho
procedimiento la etapa de:
- (a)
- separar dicha isoforma de proteína pegilada seleccionada de dicha mezcla.
205. Un procedimiento para preparar una
composición enriquecida a partir de una composición de partida, en
el que dicha composición de partida comprende B-2036
no pegilado y una o más isoformas pegiladas de
B-2036 seleccionadas entre el grupo constituido por
PEG-1, PEG-2, PEG-3,
PEG-4, PEG-5, PEG-6,
PEG-7, PEG-8 y PEG-9
y donde dicho procedimiento comprende las etapas de:
- (a)
- separar dicha composición de partida en una pluralidad de fracciones, donde una proporción en peso de la primera fracción de las isoformas PEG-4, PEG-5 y PEG-6 a isoformas B-2036 no pegilada total y B-2036 pegilada en al menos una fracción difiere de una proporción en peso de la segunda fracción de isoformas PEG-4, PEG-5 y PEG-6 a isoformas B-2036 no pegilada y B-2036 pegilada en al menos una fracción diferente,
- (b)
- determinar una proporción en peso de isoformas PEG-4, PEG-5 y PEG-6 a isoformas B-2036 no pegilada y B-2036 pegilada de un resto de cada fracción o en un muestreo de fracciones, y
- (c)
- combinar selectivamente menos de todas dichas fracciones para producir dicha composición enriquecida, donde una proporción en peso de fracción enriquecida de isoformas PEG-4, PEG-5 y PEG-6 a isoformas B-2036 no pegilada y B-2036 pegilada totales es mayor en dicha composición enriquecida que en dicha composición de partida.
Todos los valores numéricos y moléculas
identificadas en esta solicitud son ejemplares y no tienen por
objeto interpretarse como limitantes de reivindicación. Lo siguiente
se presenta a modo de ejemplo y no se debe interpretar como una
limitación del alcance de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
El mantenimiento (por debajo de un nivel
deseado, por ejemplo, \leq 6% en peso del peso total) o la
disminución de los niveles de agregación de B-2036
PEG se consiguió usando BI (el Intermedio Voluminoso
B-2036) como el material de partida preparado como
se ha indicado en la solicitud de patente de los Estados Unidos no
provisional interim Nº de serie P-107.891 titulada
Method for the Production Of Growth Hormone And Antagonist Thereof
Having lower Levels Of Isoform Impurities Thereof, presentada el 25
de agosto de 2003 ante la Oficina de Patentes y Marcas de los
Estados Unidos. La fermentación (para producir
B-2036) en un sistema de expresión de E. coli
recombinante se realizó como se ha descrito por Cunningham y col.
en la Patente de Estados Unidos Nº 5.849.535. La purificación de
B-2036 BI se realizó como se ha descrito en la
solicitud de Patente de los Estados Unidos no provisional
identificada anteriormente Nº (P-107.891). Después,
este material se procesó usando las etapas iniciales de pegilación
y cromatografía de interacción hidrófoba como se ha indicado en el
diagrama de flujo 1 más adelante para producir
B-2036 PEG. A continuación de la cromatografía de
interacción hidrófoba (etapa 2), el B-2036 PEG se
UF/DF en tampón de pH Tris 7,25 mM (en lugar de tampón de acetato de
sodio pH 4 como en el procedimiento del Ejemplo 2, etapa 3,
diagrama de flujo 2). Después el material retenido se sometió a
cromatografía de intercambio aniónico fuerte en columna de Q
Sefarosa FF. Esta etapa separa diferencialmente especies PEGiladas
en fracciones para combinación para conseguir la distribución de
especies PEGiladas necesaria para liberación de API. Esta columna
enriquece para los productos PEG-4,
PEG-5 y PEG-6 de BI PEGilado
(B-2036 PEG). El producto se eluye con un gradiente
lineal de 20 CV de NaCl 0-250 mM en Tris 25 mM, pH
7,0 a continuación de etapas de equilibrio y un lavado de 2 CV con
Tris 25 mM, pH 7,0. El análisis de las fracciones se consigue
usando CE en lugar de SDS-PAGE como se ha indicado
en el Ejemplo 2, diagrama de flujo 2. Véase el análisis anterior
con respecto a lo mismo. Pegvisomant (Somavert®; Pharmacia) se
recoge a partir del perfil de cromatografía como una combinación a
partir de fracciones analizadas mediante CE con un criterio de
combinación de \geq 75% de PEG4+5+6 (primera fracción) y \geq
94% de PEG4+5+6 (última fracción) y \geq 0,5 mg/ml. Después, el
producto resultante después se pasó a través del resto del
procedimiento de purificación de B-2036 PEG como se
ha descrito en el diagrama de flujo 1. Después de la selección y
combinación de las fracciones, el análisis del material combinado y
API final mediante SEHPLC no demostró agregación detectable. Véase
la Tabla 1 que indica lo mismo más adelante.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Esquema pasa a página
siguiente)
\newpage
Los siguientes datos se obtuvieron usando el
procedimiento indicado anteriormente del Ejemplo 1.
A un tubo de centrífuga de 15 ml, se añadieron
1,5 ml de resina S-Sefarosa FF (volumen de lecho
depositado). La resina se preparó para unión de proteína enjuagando
dos veces con 10 ml de una solución al 1% del aditivo que se tiene
que evaluar en acetato de Sodio 25 mM, pH 4. Después de cada
enjuague, se recogió el sobrenadante (mediante centrifugación) y se
decantó y descartó. Al sedimento de resina enjuagado, se añadieron
2,5 ml de solución al 1% del aditivo que se tiene que evaluar en
acetato de Sodio 25 mM, pH 4 y se añadió una cantidad de material
retenido de UF/DF que contenía aproximadamente 5 mg de
B-2036 PEG de la etapa 3 (preparado mediante el
procedimiento del diagrama de flujo 2, etapas 1 a 3). Después la
resina se resuspendió en la solución y se incubó con mezcla
moderada durante 2 a 24 h. Después de la incubación, la solución se
centrifugó y el sobrenadante se decantó y se descartó. Después el
B-2036 PEG se eluyó a partir de la resina mediante
la adición al sedimento de resina de 2,5 ml de una solución al 1%
del aditivo que se tiene evaluar en acetato de Sodio 25 mM, pH 4 y
0,25 ml de cloruro de sodio 2,5 M. La resina en la solución
resultante se resuspendió y se incubó con mezcla moderada durante
20 minutos. Después de la incubación, el sobrenadante se conserva
mediante centrifugación y se decanta para análisis mediante
cromatografía de exclusión por tamaño (por ejemplo, SEHPLC (HPLC de
exclusión por tamaño)). Después el sedimento de resina usado se
descarta. El procedimiento anterior se repitió para cada aditivo
que se tenía que evaluar usando Resina de Cromatografía de
Intercambio Catiónico para determinar si la formación de agregación
se podría eliminar o disminuir de forma suficiente. Usando este
procedimiento indicado anteriormente, se obtuvieron los resultados
de la Tabla 2 más adelante. Como se refleja en la Tabla 2, ninguno
de los aditivos ensayados usando una resina catiónica fue tan
satisfactorio como cambiar a una resina aniónica para disminuir el
nivel de agregación formado.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Esquema pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En este documento se usa RPHPLC para supervisar
y cuantificar los porcentajes de especies pegiladas (por ejemplo,
PEG-4, PEG-5 y
PEG-6) encontrados en las fracciones de columna de
Q-Sefarosa a partir de la purificación por
intercambio aniónico de pegvisomant.
25 \mul de cada fracción de
Q-Sefarosa (etapa de intercambio aniónico, véase el
Ejemplo 1 anteriormente) (concentraciones de proteína que varían de
0,5 a 1,3 mg/ml) se aplican a una columna Zorbax
300SB-CN (4,6 mm x 150 nun; 3,5 \mum; Número de
Parte 863973-905; número de serie USMJ001205). La
fase móvil A es ácido trifluoroacético al 0,1% mientras que la fase
móvil B está constituida por ácido trifluoroacético al 0,085% en
acetonitrilo. Se usa un gradiente lineal de 40 a 50 por ciento de
Tampón B durante 20 minutos a un caudal de 1,0 ml/min a temperatura
ambiente para separación de las diferentes formas Pegiladas de
Pegvisomant. La absorbancia se supervisa a 214 nm.
Los resultados obtenidos mediante RPHPLC son
similares a los obtenidos mediante electroforesis capilar (CE) como
se ha indicado en las Figuras 2-4 más adelante.
También, véase el Ejemplo 4 más adelante para el procedimiento
ejemplar de la técnica analítica de CE.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La región sombreada (es decir, las fracciones
7 a 18) representan las fracciones que también se analizaron
mediante RPHPLC.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados comparativos de CE frente a
RPHPLC se representan en las Figuras 2, 3 y 4 para
B-2036 PEG-4, B-2036
PEG-5 y B-2036
PEG-6.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 2 Comparación gráfica de los porcentajes
de especies de B-2036 PEG-4
encontrados dentro de las fracciones de Q-Sefarosa 7
a 8 determinados por electroforesis capilar y HPLC de fase
inversa.
Figura 3 Comparación gráfica de los porcentajes
de especies de B-2036 PEG-5
encontrados dentro de las fracciones de Q-Sefarosa 7
a 8 determinados por electroforesis capilar y HPLC de fase
inversa.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 4 Comparación gráfica de los porcentajes
de especies de B-2036 PEG-6
encontrados dentro de las fracciones de Q-Sefarosa 7
a 8 determinados por electroforesis capilar y HPLC de fase
inversa.
\vskip1.000000\baselineskip
Se analizaron fracciones de
Q-Sefarosa mediante Electroforesis Capilar de la
manera siguiente. El capilar, que tiene un Diámetro Interior de 50
\mum y una longitud eficaz de 37 cm, se acondicionó mediante
enjuague con NaOH 1,0 N durante 10 minutos a 137,90 kPa (20 psi) de
presión seguido por un enjuague de 20 minutos con tampón de
desarrollo. El tampón de desarrollo, ácido Fosfórico 40 mM, 4 mg/ml
de O'O-Bis (2-aminopropil)
polietilenglicol, 0,1 mg/ml de óxido de polietileno, pH
1,9-2,0, se preparó a partir de una solución madre
10X y se filtró a través de un filtro de 0,22 \mum para retirar
las partículas que puedan provocar obstrucciones en el capilar.
\newpage
Las muestras se calentaron hasta temperatura
ambiente para evitar la formación de agregación cuando se ponían en
contacto con tampón de dilución de muestra (ácido Fosfórico 40 mM, 4
mg/ml de O'O'-Bis (2-aminopropil)
polietilenglicol, pH 1,9-2,2) o tampón de
desarrollo. Las muestras que eran <0,5 mg/ml no se analizaron.
Las muestras \geq 0,5 mg/ml se inyectaron puras mientras que las
muestras con una concentración > 2,0 mg/ml se diluyeron hasta
2,0 mg/ml usando tampón de dilución de muestra. Las muestras se
inyectaron en el capilar usando presión de 3,45 kPa (0,5 psi)
durante 10-60 segundos. A continuación de la
inyección de muestra, se inyectó tampón de desarrollo durante 3
segundos a 3,45 kPa (0,5 psi) para concentrar la muestra. Las
muestras se separaron durante 25 minutos a 30 kV a un mínimo de
30ºC y se detectaron a 214 nm. El capilar se enjuagó antes de cada
inyección de muestra posterior con NaOH 0,1 N durante al menos un
minuto a 137,90 kPa (20 psi) y tampón de desarrollo durante dos
minutos para retirar cualquier muestra retenida de la pared del
capilar. El almacenamiento de la muestra se mantuvo a
25-30ºC.
Los electroferogramas resultantes se integraron
dividiendo los picos en el punto más bajo entre picos vecinos y se
calculó el área por ciento corregida.
Usando el procedimiento indicado anteriormente
junto con la descripción de la Etapa 4, diagrama de flujo 1, Ejemplo
1, los resultados obtenidos mediante CE son los que se han indicado
en las Figuras 2-4 anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Fracciones de Q-Sefarosa se
analizaron mediante CE de la forma siguiente. Los capilares, que
tenían un diámetro interior de 50 \mum y una longitud eficaz de
37 cm, se acondicionaron enjuagándolos con NaOH 1,0 N durante 10
minutos a una presión de 137,90 kPa (20 psi) seguido por un enjuague
de 20 minutos con tampón de desarrollo. El tampón de desarrollo,
ácido fosfórico 40 mM, 4 mg/ml de O'O-Bis
(2-aminopropil) polietilenglicol, 0,1 mg/ml de
óxido de polietileno, pH 1,9-2,0, se preparó a
partir de una solución madre 10X y se filtró a través de un filtro
de 0,22 \mum para retirar las partículas que pueden causar
obstrucciones en los capilares.
Las muestras se calentaron hasta temperatura
ambiente para evitar la formación de agregación cuando se ponían en
contacto con tampón de dilución de muestra (ácido Fosfórico 40 mM, 4
mg/ml de O'O'-Bis (2-aminopropil)
polietilenglicol, pH 1,9-2,2) o tampón de
desarrollo. Las muestras que eran <0,5 mg/ml no se analizaron.
Las muestras \geq 0,5 mg/ml se inyectaron puras mientras que las
muestras con una concentración > 2,0 mg/ml se diluyeron hasta
2,0 mg/ml usando tampón de dilución de muestra. Las muestras se
inyectaron en el capilar usando presión de 3,45 kPa (0,5 psi)
durante 10-60 segundos. A continuación de la
inyección de muestra, se inyectó tampón de desarrollo durante 3
segundos a 3,45 kPa (0,5 psi) para concentrar la muestra. Las
muestras se separaron durante 25 minutos a 30 kV a un mínimo de
30ºC y se detectaron a 214 nm. El capilar se enjuagó antes de cada
inyección de muestra posterior con NaOH 0,1 N durante al menos un
minuto a 137,90 kPa (20 psi) y tampón de desarrollo durante dos
minutos para retirar cualquier muestra retenida de la pared del
capilar. El almacenamiento de la muestra se mantuvo a
25-30ºC.
Los electroferogramas resultantes se integraron
dividiendo los picos en el punto más bajo entre picos vecinos y se
calculó el área por ciento corregida.
Usando el procedimiento indicado anteriormente
junto con la descripción de la Etapa 4, diagrama de flujo 1,
Ejemplo 1, los resultados obtenidos mediante CE son los que se
indican en la Tabla 5a más adelante. Se preparó una combinación de
isoformas pegiladas enriquecidas usando los criterios de aceptar
como fracciones de combinación, las fracciones analizadas mediante
CE con una composición de \geq 74% de PEG4+5+6 (primera fracción)
y \geq 94% de PEG4+5+6 (última fracción) y \geq 0,5 mg/ml. Las
fracciones 6 a 25 (Tabla 5a más adelante) se seleccionaron y se
combinaron en un grupo usando estos criterios. El material de
partida de UF/DF#3 y las fracciones agrupadas combinadas se
sometieron a análisis de CE como se ha indicado anteriormente.
Después de la selección y combinación de las fracciones, el
análisis del material combinado muestra enriquecimiento de las
isoformas de PEG-4, PEG-5 y
PEG-6. Véase la Tabla 5b que indica lo mismo más
adelante.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Fracciones de Q-Sefarosa se
analizaron mediante CE de la forma siguiente. Los capilares, que
tenían un diámetro interior de 50 \mum y una longitud eficaz de
37 cm, se acondicionaron enjuagándolos con NaOH 1,0 N durante 10
minutos a una presión de 137,90 kPa (20 psi) seguido por un enjuague
de 20 minutos con tampón de desarrollo. El tampón de desarrollo,
ácido fosfórico 40 mM, 4 mg/ml de O'O-Bis
(2-aminopropil) polietilenglicol, 0,1 mg/ml de
óxido de polietileno, pH 1,9-2,0, se preparó a
partir de una solución madre 10X y se filtró a través de un filtro
de 0,22 \mum para retirar las partículas que pueden causar
obstrucciones en los capilares.
Las muestras se calentaron hasta temperatura
ambiente para evitar la formación de agregación cuando se ponían en
contacto con tampón de dilución de muestra (ácido Fosfórico 40 mM, 4
mg/ml de O'O'-Bis (2-aminopropil)
polietilenglicol, pH 1,9-2,2) o tampón de
desarrollo. Las muestras que eran <0,5 mg/ml no se analizaron.
Las muestras \geq 0,5 mg/ml se inyectaron puras mientras que las
muestras con una concentración > 2,0 mg/ml se diluyeron hasta
2,0 mg/ml usando tampón de dilución de muestra. Las muestras se
inyectaron en el capilar usando presión de 3,45 kPa (0,5 psi)
durante 10-60 segundos. A continuación de la
inyección de muestra, se inyectó tampón de desarrollo durante 3
segundos a 3,45 kPa (0,5 psi) para concentrar la muestra. Las
muestras se separaron durante 25 minutos a 30 kV a un mínimo de
30ºC y se detectaron a 214 nm. El capilar se enjuagó antes de cada
inyección de muestra posterior con NaOH 0,1 N durante al menos un
minuto a 137,90 kPa (20 psi) y tampón de desarrollo durante dos
minutos para retirar cualquier muestra retenida de la pared del
capilar. El almacenamiento de la muestra se mantuvo a
25-30ºC.
Los electroferogramas resultantes se integraron
dividiendo los picos en el punto más bajo entre picos vecinos y se
calculó el área por ciento corregida.
Usando el procedimiento indicado anteriormente
junto con la descripción de la Etapa 4, diagrama de flujo 1,
Ejemplo 1, los resultados obtenidos mediante CE son los que se
indican en la Tabla 6a más adelante. Se preparó una combinación de
isoformas pegiladas enriquecidas usando los criterios de aceptar
como fracciones de combinación, las fracciones analizadas mediante
CE con una composición de \geq 75% de PEG4+5+6 (primera fracción)
y \geq 94% de PEG4+5+6 (última fracción) y \geq 0,5 mg/ml. Las
fracciones 3 a 20 (Tabla 6a más adelante) se seleccionaron y se
combinaron en un grupo usando estos criterios. El material de
partida de UF/DF#3 y las fracciones agrupadas combinadas se
sometieron a análisis de CE como se ha indicado anteriormente.
Después de la selección y combinación de las fracciones, el
análisis del material combinado muestra enriquecimiento de las
isoformas de PEG-4, PEG-5 y
PEG-6. Véase la Tabla 6b que indica lo mismo más
adelante.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Aunque la descripción anterior se proporciona
con respecto a B-2036 recombinante y
B-2036 PEG recombinante, a menos que se indique de
otra manera, se aprecia que el sujeto de la invención se puede usar
con cualquier antagonista de la hormona del crecimiento pegilado
recombinante, ya sea antagonista de la hormona del crecimiento de
mamíferos, antagonista de la hormona del crecimiento humana pegilado
o antagonista de la hormona del crecimiento bovino pegilado,
etc.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Boyle y col.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento para Disminuir los
Niveles de Agregación de Proteína Pegilada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 161765.00521
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/412.227
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
02-09-2002
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 191
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 191
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (12)
1. Un procedimiento para disminuir un nivel de
agregación de un antagonista de hormona del crecimiento (GH)
pegilado e isoformas del mismo, comprendiendo dicho procedimiento
las etapas de:
- (a)
- proporcionar dicho antagonista de la hormona del crecimiento (GH) pegilado e isoformas del mismo;
- (b)
- cargar dicho antagonista de la hormona del crecimiento (GH) pegilado e isoformas del mismo incluyendo cualquier impureza y cualquier agregación del mismo en una resina de intercambio aniónico (AEX), en el que la carga se conduce a una conductividad de menos de o igual a aproximadamente 10 mS/cm, a un pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 y a una concentración de proteína de menos de o igual a aproximadamente 10 g de proteína/l de volumen de lecho cargado de resina de AEX; y
- (c)
- separar dicho antagonista de la hormona del crecimiento (GH) pegilada e isoformas del mismo mediante cromatografía de AEX.
\vskip1.000000\baselineskip
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que dicha resina de AEX se selecciona entre el grupo constituido
por ANX4^{TM}, DEAE^{TM}, Q-Sefarosa^{TM},
Q-Sefarosa FF^{TM}, Q-Sefarosa
HP^{TM} y Q-Sefarosa XL^{TM}.
3. El procedimiento de la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el que, en la etapa (b), la carga se conduce a
una conductividad de menos de o igual a aproximadamente 5 mS/cm.
4. El procedimiento de la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el que, en la etapa (b), la carga se conduce a
una conductividad de menos de o igual a aproximadamente 2,4
mS/cm.
5. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha etapa (b) se conduce a un pH
de carga de AEX de aproximadamente 6,6 a aproximadamente 9.
6. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha etapa (b) se conduce a un pH
de carga de AEX de aproximadamente 6,9 a aproximadamente 7,1.
7. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que dicho antagonista de la hormona del crecimiento (GH) pegilado
e isoformas del mismo comprenden antagonista de la hormona del
crecimiento (GH) e isoformas del mismo pegilados en uno o más
sitios.
8. El procedimiento de la reivindicación 7, en
el que dicho antagonista de la hormona del crecimiento (GH) pegilado
e isoformas del mismo comprenden una o más de dichas isoformas del
antagonista de la hormona del crecimiento (GH) pegilado
seleccionadas entre el grupo constituido por:
- PEG-1 (una molécula de B-2036 (SEC ID Nº: 1) con una molécula de PEG o variante del mismo),
- PEG-2 (una molécula de B-2036 (SEC ID Nº: 1) con dos moléculas de PEG o variante del mismo),
- PEG-3 (una molécula de B-2036 (SEC ID Nº: 1) con tres moléculas de PEG o variante del mismo),
- PEG-4 (una molécula de B-2036 (SEC ID Nº: 1) con cuatro moléculas de PEG o variante del mismo),
- PEG-5 (una molécula de B-2036 (SEC ID Nº: 1) con cinco moléculas de PEG o variante del mismo),
- PEG-6 (una molécula de B-2036 (SEC ID Nº: 1) con seis moléculas de PEG o variante del mismo),
- PEG-7 (una molécula de B-2036 (SEC ID Nº: 1) con siete moléculas de PEG o variante del mismo),
- PEG-8 (una molécula de B-2036 (SEC ID Nº: 1) con ocho moléculas de PEG o variante del mismo), y
- PEG-9 (una molécula de B-2036 (SEC ID Nº: 1) con nueve moléculas de PEG o variante del mismo),
- y cualquier agregación, impureza trisulfuro (molécula de antagonista de la hormona del crecimiento (GH) que contiene un átomo de azufre adicional que forma un "puente trisulfuro" dentro de la molécula) e impureza des-phe (molécula de antagonista de la hormona del crecimiento (GH) a la que le falta su fenilalanina amino-terminal) del mismo y cualquier impureza no pegilada de dicho antagonista de la hormona del crecimiento (GH) y cualquier molécula de PEG libre.
\vskip1.000000\baselineskip
9. El procedimiento de la reivindicación 1,
comprendiendo además una etapa de combinación (d) para combinar
cantidades específicas de las isoformas del antagonista de la
hormona del crecimiento (GH) pegilado para producir un antagonista
de la hormona del crecimiento (GH) pegilado combinado mediante una
técnica seleccionada entre el grupo constituido por:
- electroforesis capilar (CE), electroforesis en gel de dodecil sulfato sódico-poliacrilamida (SDS-PAGE), cromatografía de intercambio iónico (IEX) cromatografía de interacción hidrófoba (HIC), cromatografía de intercambio aniónico (AEX), cromatografía de intercambio catiónico (CEX), cromatografía líquida de alta presión de fase inversa (RPHPLC), cromatografía líquida de presión alta de exclusión por tamaño (SEHPLC), cromatografía de afinidad (AC) y combinaciones de las mismas.
\vskip1.000000\baselineskip
10. El procedimiento de la reivindicación 9, en
el que dicho antagonista de la hormona del crecimiento (GH) pegilado
combinado comprende uno o más de PEG-1,
PEG-2, PEG-3, PEG-4,
PEG-5, PEG-6, PEG-7,
PEG-8 y
PEG-9.
PEG-9.
11. El procedimiento de la reivindicación 10, en
el que una fracción antagonista de la hormona del crecimiento (GH)
pegilada combinada de PEG-4, PEG-5 y
PEG-6 comprende al menos aproximadamente el 70% en
peso basándose en un peso total de dichas isoformas del antagonista
de la hormona del crecimiento (GH) pegilado PEG-1,
PEG-2, PEG-3, PEG-4,
PEG-5, PEG-6, PEG-7,
PEG-8 y PEG-9 y cualquier agregación
de los mismos.
12. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que dicho nivel disminuido de dicha agregación es menor que o
igual a aproximadamente el 10% en peso basándose en un peso total de
dichas isoformas y dicha agregación.
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US41222702P | 2002-09-20 | 2002-09-20 | |
| US412227P | 2002-09-20 | ||
| US646798 | 2003-08-25 | ||
| US10/646,798 US20040048315A1 (en) | 2002-08-28 | 2003-08-25 | Method for the preparation of growth hormone and antagonist thereof having lower levels of isoform impurities thereof |
| US66288403A | 2003-09-16 | 2003-09-16 | |
| US662884 | 2003-09-16 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2337041T3 true ES2337041T3 (es) | 2010-04-20 |
Family
ID=32034217
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES03754774T Expired - Lifetime ES2337041T3 (es) | 2002-09-20 | 2003-09-22 | Procedimiento para disminuir los niveles de agregacion de proteina pegilada. |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1545428B1 (es) |
| JP (1) | JP4633463B2 (es) |
| KR (1) | KR101120130B1 (es) |
| AT (1) | ATE453662T1 (es) |
| AU (1) | AU2003272585B2 (es) |
| BR (1) | BRPI0314120B8 (es) |
| CA (1) | CA2498886C (es) |
| DE (1) | DE60330787D1 (es) |
| DK (1) | DK1545428T3 (es) |
| ES (1) | ES2337041T3 (es) |
| HK (1) | HK1079798B (es) |
| IL (1) | IL167538A (es) |
| MX (1) | MXPA05003121A (es) |
| PL (1) | PL212726B1 (es) |
| PT (1) | PT1545428E (es) |
| SI (1) | SI1545428T1 (es) |
| WO (1) | WO2004026251A2 (es) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1715895A2 (en) * | 2004-02-09 | 2006-11-02 | Pharmacia Corporation | Chemically-modified human growth hormone receptor antagonist conjugates |
| US8080391B2 (en) * | 2004-12-22 | 2011-12-20 | Ambrx, Inc. | Process of producing non-naturally encoded amino acid containing high conjugated to a water soluble polymer |
| WO2011018515A1 (en) * | 2009-08-14 | 2011-02-17 | Novo Nordisk Health Care Ag | Method of purifying pegylated proteins |
| WO2012158551A1 (en) * | 2011-05-13 | 2012-11-22 | Biogen Idec Ma Inc. | Methods of preventing and removing trisulfide bonds |
| EP2748178B1 (en) | 2011-08-25 | 2018-10-31 | F. Hoffmann-La Roche AG | Cation and anion exchange chromatography method |
| CN111801120A (zh) * | 2017-12-29 | 2020-10-20 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于提供聚乙二醇化蛋白质组合物的方法 |
| CN112107880B (zh) * | 2020-09-16 | 2022-08-09 | 珠海中科先进技术研究院有限公司 | 一种低共熔混合物及利用其萃取鲟鱼鱼籽蛋白质的方法 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3641115A1 (de) * | 1986-12-02 | 1988-06-16 | Lentia Gmbh | Verfahren zur herstellung eines intravenoes anwendbaren und in fluessiger form stabilen immunglobulins |
| US5153265A (en) * | 1988-01-20 | 1992-10-06 | Cetus Corporation | Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1 |
| US4847325A (en) * | 1988-01-20 | 1989-07-11 | Cetus Corporation | Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1 |
| US5969109A (en) * | 1990-02-28 | 1999-10-19 | Bona; Constantin | Chimeric antibodies comprising antigen binding sites and B and T cell epitopes |
| DK44593D0 (da) * | 1993-04-20 | 1993-04-20 | Novo Nordisk As | Fremgangsmaade til fremstilling af et polypeptid |
| ZA955789B (en) * | 1994-07-15 | 1996-03-11 | Novo Nordisk As | A method of converting a hydrophobic derivative of a polypeptide into the native form |
| WO1996040731A1 (en) * | 1995-06-07 | 1996-12-19 | Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York | Pegylated modified proteins |
| ES2190388T3 (es) * | 1995-09-21 | 2006-04-01 | Genentech, Inc. | Variantes de la hormona de crecimiento humana. |
| SE9802454D0 (sv) * | 1998-07-08 | 1998-07-08 | Pharmacia & Upjohn Ab | Production of peptides |
| SE9904502D0 (sv) * | 1999-12-09 | 1999-12-09 | Pharmacia & Upjohn Ab | Production of peptides |
-
2003
- 2003-09-22 AT AT03754774T patent/ATE453662T1/de active
- 2003-09-22 DE DE60330787T patent/DE60330787D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-09-22 ES ES03754774T patent/ES2337041T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-09-22 JP JP2004538262A patent/JP4633463B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2003-09-22 PT PT03754774T patent/PT1545428E/pt unknown
- 2003-09-22 DK DK03754774.2T patent/DK1545428T3/da active
- 2003-09-22 CA CA2498886A patent/CA2498886C/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-09-22 PL PL375443A patent/PL212726B1/pl unknown
- 2003-09-22 AU AU2003272585A patent/AU2003272585B2/en not_active Expired
- 2003-09-22 MX MXPA05003121A patent/MXPA05003121A/es active IP Right Grant
- 2003-09-22 BR BRPI0314120A patent/BRPI0314120B8/pt not_active IP Right Cessation
- 2003-09-22 EP EP03754774A patent/EP1545428B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-09-22 WO PCT/US2003/029546 patent/WO2004026251A2/en active Application Filing
- 2003-09-22 SI SI200331730T patent/SI1545428T1/sl unknown
- 2003-09-22 KR KR1020057004785A patent/KR101120130B1/ko active IP Right Grant
-
2005
- 2005-03-20 IL IL167538A patent/IL167538A/en not_active IP Right Cessation
- 2005-12-29 HK HK05112085.6A patent/HK1079798B/zh not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR101120130B1 (ko) | 2012-04-18 |
| DK1545428T3 (da) | 2010-05-03 |
| PL212726B1 (pl) | 2012-11-30 |
| JP4633463B2 (ja) | 2011-02-16 |
| CA2498886C (en) | 2013-06-25 |
| EP1545428B1 (en) | 2009-12-30 |
| CA2498886A1 (en) | 2004-04-01 |
| ATE453662T1 (de) | 2010-01-15 |
| HK1079798B (zh) | 2010-11-19 |
| EP1545428A2 (en) | 2005-06-29 |
| PL375443A1 (en) | 2005-11-28 |
| WO2004026251A2 (en) | 2004-04-01 |
| PT1545428E (pt) | 2010-02-25 |
| DE60330787D1 (de) | 2010-02-11 |
| AU2003272585A1 (en) | 2004-04-08 |
| BRPI0314120B8 (pt) | 2021-05-25 |
| MXPA05003121A (es) | 2005-06-22 |
| WO2004026251A3 (en) | 2004-09-02 |
| IL167538A (en) | 2015-10-29 |
| EP1545428A4 (en) | 2006-03-01 |
| AU2003272585B2 (en) | 2009-12-10 |
| SI1545428T1 (sl) | 2010-03-31 |
| KR20050046011A (ko) | 2005-05-17 |
| BR0314120A (pt) | 2005-07-12 |
| HK1079798A1 (en) | 2006-04-13 |
| BRPI0314120B1 (pt) | 2020-12-29 |
| JP2006516021A (ja) | 2006-06-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7470779B2 (en) | Process for decreasing aggregate levels of pegylated protein | |
| ES2545067T3 (es) | Purificación de proteínas basada en la no afinidad | |
| Azevedo et al. | Partitioning of human antibodies in polyethylene glycol–sodium citrate aqueous two-phase systems | |
| ES2664231T3 (es) | Métodos para replegar G-CSF a partir de cuerpos de inclusión | |
| CN103890174B (zh) | IgG结合性肽及利用其检测和纯化IgG的方法 | |
| ES2063350T5 (es) | Nuevas proteinas con efecto inhibidor del tnf y su obtencion. | |
| ES2657377T3 (es) | Etanercept plegado correctamente con alta pureza y excelente rendimiento | |
| ES2688206T3 (es) | Procedimiento de evaluación de la identidad y la estabilidad de proteínas | |
| WO2011162210A1 (ja) | アミノ酸を利用したタンパク質の精製方法 | |
| CA1341097C (en) | Factor viii binding domain of von willebrand factor | |
| EP3393486A2 (en) | Interleukin-15 compositions and uses thereof | |
| Kimura et al. | Characterization and localization of α-connectin (titin 1): an elastic protein isolated from rabbit skeletal muscle | |
| US8148331B2 (en) | Method for the preparation of growth hormone and antagonist thereof having lower levels of isoform impurities thereof | |
| CA2710841C (en) | Y-shaped polyethylene glycol modified g-csf, the preparation and use thereof | |
| ES2337041T3 (es) | Procedimiento para disminuir los niveles de agregacion de proteina pegilada. | |
| Shafir et al. | Voltage-dependent anion channel proteins in synaptosomes of the torpedo electric organ: immunolocalization, purification, and characterization | |
| BRPI0718491A2 (pt) | Conjugados poliméricos do box-a da hmgb1 e variantes do box-a da hmbg1 | |
| US9422354B2 (en) | Process for purification of recombinant granulocyte colony stimulating factor (rHu GCSF) | |
| WO2023027125A1 (ja) | ヒトトランスフェリンレセプター結合抗体－ペプチドコンジュゲート | |
| Guinet et al. | Polypeptide elongation factor Tu from Halobacterium marismortui | |
| EP2220108A2 (en) | Protein purification and endotoxin removal | |
| ES2280211T3 (es) | Metodo para eliminar residuos de alanina, situados en extremos terminales de n, a partir de polipeptidos, con una aminopeptidasa procedente de aeromonas. | |
| Si-Da Ruan et al. | Extending the in vivo Half-Life of Adalimumab Fab via Sortase A-Mediated Conjugation of Adalimumab Fab with Modified Fatty Acids | |
| CN115160434A (zh) | 人源化单域抗体及其应用和药物 | |
| ES2362244T3 (es) | Conjugados polímeros de la caja a de hmgb1 y variantes de la caja a de hmgb1. |